JP2001029097A - 穀類中のリポキシゲナーゼ活性の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 穀類粗抽出液や仕込もろみ中のＬＯＸ活性を
より簡便な方法で、しかも短時間で多検体の測定が可能
な方法を提供すること。 【解決手段】 穀類抽出液と基質溶液とを反応させたの
ち、反応生成物にＦＯＸ試薬を加えて吸光度を測定する
ことを特徴とする穀類中のリポキシゲナーゼ活性の測定
方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、穀類中のリポキシ
ゲナーゼ活性の測定方法に関し、詳しくはビール醸造の
原料などとして用いられる穀類中に存在し、脂質の酸化
反応に関与するリポキシゲナーゼ活性の測定方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】リポキシゲナーゼは、不飽和脂肪酸の二
重結合に酸素を添加して過酸化物を生ずる酸化還元酵素
としてよく知られており、多くの分野でその活性の度合
いを測定する有効な方法が研究されている。例えば、植
物の分野では、リポキシゲナーゼは特に大豆，大麦等の
穀類に多く含まれている。ビールの原料であるビール大
麦については、麦芽製造工程やビール醸造上の仕込工程
において、ビールの品質に重要な影響を与える脂質酸化
が起こるが、これはリポキシゲナーゼ（以下、ＬＯＸと
称する。）が原因であることが知られている。ＬＯＸの
働きにより、脂質は脂質ヒドロペルオキシドに変化し、
これらが泡持ち阻害活性を有するトリヒドロキシオクタ
デセン酸（藪内精三、醸造協会誌、75、273, 1980)や老
化臭の原因物質と考えられるトランス−２−ノネナール
の前駆体物質であると言われている。

【０００３】発芽大麦や麦芽中の脂質に占める各種脂質
の割合は、遊離脂肪酸が数％、中性脂肪が約７０％、リ
ン脂質が約３０％であり、これら脂質の酸化はビールの
品質に影響を与える重要なことであるにもかかわらず、
これまでのＬＯＸ研究は遊離脂肪酸を基質としたものが
大半で、脂肪酸エステルを基質とした研究は殆ど行われ
ていなかった。その理由として、脂質を基質とした場合
の簡便なＬＯＸ活性測定法が開発されていなかったこと
が挙げられる。例えば、リノール酸を基質としてリノー
ル酸ヒドロペルオキシドの生成を紫外部吸収によって測
定する方法（Baxter; j. Inst.Brew., 88, 390-396, 19
82)では、基質はリノール酸に限定される。また、酵素
センサーを用いて酵素消費をモニターする方法は、感度
が低いために、多量の脂質が基質として必要であるが、
脂肪酸エステルは非常に高価であるため、現実には使用
できない。

【０００４】さらに、従来法では、多検体を同時処理す
ることが難しく、ＬＯＸが低い植物品種や熱安定性、ｐ
Ｈ安定性等が低い植物品種をスクリーニングすることが
できなかった。大豆では、酵素標識抗体を利用したリポ
キシゲナーゼ検出法が提案されている（Evans et al.;
Crop. Sci., 34, 1529-1537, 1994)。しかし、この方法
は酵素を検出する方法であって、該酵素の活性を測定す
ることはできない。また、この方法は抗原特異性の異な
るＬＯＸは検出できない等の欠点がある。

【０００５】一方、Piazzaらは、精製大豆リポキシゲナ
ーゼを材料として、ＦＯＸ法（Ferrous oxidation/xyle
nol orange method)による脂肪酸エステルの酸化活性測
定法を報告している（JAOCS, 72(4), 463-466, 1995)。
ＦＯＸ法とは、脂質ヒドロペルオキシドが二価鉄を三価
鉄に酸化することを利用し、三価鉄とキシレノールオレ
ンジ複合体を吸光度（波長５４０ｎｍの可視光の吸光
度）を用いて定量することにより、間接的に資料中の脂
質ヒドロキシペルオキシドを定量する方法である。彼ら
は、該酵素と基質を一定時間反応させた後、クロロホル
ム・メタノール抽出し、生成したヒドロペルオキシドを
分離し、クロロホルム層を窒素を吹き付けて乾燥し、再
度メタノールに溶解し、ＦＯＸ法に使用される試薬（以
下、ＦＯＸ試薬という。）と反応させてＬＯＸ活性を測
定している。このため、この方法では、乾燥・溶解に時
間がかかり、多検体を処理するには適さない等の多くの
問題を抱えている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明の目的
は、上記の問題を解決し、穀類粗抽出液、特に大麦また
は麦芽より抽出した抽出液のＬＯＸ活性をより簡便な方
法で、しかも短時間で測定することのできるＬＯＸ活性
の測定方法を提供することである。本発明者らは、係る
課題を解決すべく検討を重ね、ＦＯＸ法を利用したＬＯ
Ｘの活性測定方法を開発し、本発明を完成した。

【０００７】

【課題を解決するための手段】請求項１記載の本発明
は、穀類抽出液と基質溶液とを反応させたのち、反応生
成物にＦＯＸ試薬を加えて吸光度を測定することを特徴
とする穀類中のリポキシゲナーゼ活性の測定方法であ
る。請求項２記載の本発明は、穀類抽出液と基質溶液と
を反応させ、該反応を遊離脂肪酸を溶解するメタノール
等の有機溶媒または中性脂肪等を抽出する１−ブタノー
ル等の有機溶媒を添加して停止させたのち、反応生成物
を含む画分を回収し、これにＦＯＸ試薬を加えて吸光度
を測定することを特徴とする穀類中のリポキシゲナーゼ
活性の測定方法である．請求項３記載の本発明は、基質
溶液が、基質として遊離脂肪酸または脂肪酸エステルを
含む溶液である請求項１または２記載の測定方法。請求
項４記載の本発明は、基質溶液が、基質としてリノール
酸、ホスファチジルコリンジリノレイル、ジリノレイン
またはトリリノレインのいずれかを含む溶液である請求
項１または２記載の測定方法である。請求項５記載の本
発明は、穀類抽出液が、大麦または麦芽の抽出液である
請求項１または２記載の測定方法である。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明は、穀類中のＬＯＸ活性の
測定方法に関するものであり、この方法は、穀類の種子
や発芽種子あるいは穀類加工品を適当な緩衝液を用いて
抽出したものに、基質として脂肪酸もしくは脂肪酸エス
テルを含む溶液を加えて反応させた後、反応生成物にＦ
ＯＸ試薬を加えて吸光度を測定するものである。詳しく
は、穀類抽出液と基質溶液を所定時間反応させたのち、
メタノールまたは１−ブタノールを添加して反応を停止
させ、反応生成物である脂質ヒドロペルオキシドを含む
画分を分離し、ＦＯＸ試薬と混合して吸光度を測定す
る。

【０００９】本発明において穀類としては、大麦が好適
であり、その種子や発芽種子またはそれらの加工品が対
象とされ、具体的には大麦の麦芽や緑麦芽等が挙げられ
る。また、基質としては、遊離脂肪酸や中性脂質または
極性脂質等の脂肪酸エステルを用いることができ、中で
もリノール酸、ホスファチジルコリンジリノレイル、ジ
リノレインおよびトリリノレインが好ましい。次に、Ｆ
ＯＸ試薬とは、キシレノールオレンジ、硫酸アンモニウ
ム鉄（II) ６水和物、硫酸および２，６−ジ−ｔ−ブチ
ルｐクレゾールをメタノールに溶解して調製したもの
で、例えばキシレノールオレンジ７．２ｍｇ、硫酸アン
モニウム鉄（II) ６水和物９．８ｍｇ、硫酸６９μＬお
よび２，６−ジ−ｔ−ブチルｐクレゾール８８ｍｇを９
０％メタノール１００ｍＬに溶解することにより調製さ
れた試薬である。

【００１０】以下に、本発明のＬＯＸ活性の測定方法に
ついて説明する。まず、原料の穀類をモルトミル等の粉
砕機で粉砕し、得られた粉砕物に緩衝液を加え、０〜５
０℃の温度、好ましくは室温（２０℃）で５〜６０分
間、好ましくは１０分間攪拌して抽出する。次いで、攪
拌物を急冷したのち、適当な手段により濾過して抽出液
を得る。必要に応じて、この抽出液を遠心分離などの固
−液分離を行い、得られた上清を再び濾過する。

【００１１】このようにして得た穀類抽出液に基質溶液
を加えて反応させる。このとき、基質は界面活性剤、乳
化剤、緩衝液などと混和して用いる。一定時間反応させ
た後、反応を停止する。反応停止は、基質としてリノー
ル酸やホスファチジルコリンジリノレイルのような遊離
脂肪酸や極性脂肪酸エステルを使用した場合は、メタノ
ールを用いて行い、ジリノレインやトリリノレインのよ
うな中性脂質を基質として用いた場合は、１−ブタノー
ルを添加して反応を停止させる。その後、反応物から反
応生成物である脂質ヒドロペルオキシド含有画分を分離
する。具体的には、遠心分離法、その他の固−液分離法
により固体と液体を分離し、遊離脂肪酸や極性脂肪酸エ
ステルを基質として用いた場合は、上清画分を回収す
る。一方、中性脂質を基質として用いた場合は、反応停
止剤である１−ブタノール画分を回収する。

【００１２】次いで、脂質ヒドロペルオキシド含有画分
にＦＯＸ試薬を加えて混合し、室温で３０〜９０分間、
好ましくは３０分間放置する。その後、５４０ｎｍにお
ける吸光度を測定する。得られた測定値を予め作成した
検量線と照合してＬＯＸ活性を求める。検量線の作成
は、クメンヒドロペルオキシドを適当な緩衝液で希釈し
て調製した標準クメンヒドロペルオキシド溶液をＦＯＸ
試薬と混合し、この混合物を上記と同様にして吸光度を
測定することによって行う。

【００１３】

【実施例】次に、実施例により本発明を詳しく説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。 実施例１ ２種類の大麦Ａ，Ｂの製麦過程の大麦（成熟種子）、緑
麦芽（発芽１，６日目）、焙燥麦芽（焙燥１，２，３，
１２時間）および麦芽を凍結乾燥したもの各２０ｇを、
ＥＢＣモルトミルで粉砕し、得られた粉砕物１ｇに対し
て１０ｍＬの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を加え、室温で
１０分間攪拌した。攪拌後、氷浴上で０℃まで急冷し、
濾布を用いて濾過した。このようにして得た穀類抽出液
を４℃で１５分間、遠心分離（３０００ｒｐｍ）し、得
られた上清を０．４５μｍのフィルターで濾過した。

【００１４】続いて、氷浴上で該抽出液５００μＬを
０．８ｍｍ厚のガラス試験管にとり、これに６７μＬの
０．１Ｍ デオキシコール酸ナトリウムと１Ｍ トリス
緩衝液（ｐＨ８．０）を加えた。次に、２５℃に設定し
たインキュベーター内で１０秒間保温後、４０ｍＭの基
質溶液を終濃度２ｍＭとなるように加えて、酸化反応を
開始した。なお、基質として、リノール酸（ＬＨ）、ホ
スファチジルコリンジリノレイル（ＰＣ）、ジレノレイ
ン、トリリノレインの４種類を用いた。このうち、リノ
ール酸を用いた場合には、リノール酸１ｇを秤量し、こ
れに４０ｍＭとなるように１％ Tween 20を加えて攪拌
し、エマルジョンを形成させたものを該基質溶液として
使用した。また、基質としてホスファチジルコリンジリ
ノレイル、ジリノレイン、トリリノレインを用いた場合
には、それぞれ４０ｍｇを秤量し、これに４０ｍＭとな
るように１％デオキシコール酸ナトリウムと１Ｍトリス
緩衝液（ｐＨ８．０）を加えて攪拌し、エマルジョンを
形成させたものを基質溶液として使用した。

【００１５】反応を開始してから３０分経過したのち、
反応を停止した。反応停止は、基質としてリノール酸ま
たはホスファチジルコリンを用いた場合は、１００％メ
タノールを６６８μＬ加えることにより行い、氷浴上で
２０分間静置した。その後、反応物を４℃で１５分間、
遠心分離（３０００ｒｐｍ）して上清を回収し、これを
サンプルとして用いた。また、基質としてジリノレイン
またはトリリノレインを用いた場合は、６６８μＬの１
−ブタノールを添加して反応を停止させた後に、６６８
μＬのクロロホルムを加えて激しく攪拌し、次いで４℃
で１５分間、遠心分離（３０００ｒｐｍ）を行って１−
ブタノール画分を回収し、これをサンプルとして用い
た。

【００１６】このようにして得た各サンプル２０μＬ
を、マイクロタイタープレートに移した後、ＦＯＸ試薬
を２００μＬ添加し、室温で３０分間放置した。その
後、５４０ｎｍにおける吸光度を、プレートリーダー
（バイオラッド社製）で測定した。なお、ＦＯＸ試薬
は、キシレノールオレンジ７．２ｍｇ、硫酸アンモニウ
ム鉄（II）６水和物９．８ｍｇ、硫酸６９μＬおよび
２，６−ジ−ｔ−ブチルｐクレゾール８８ｍｇを、９０
％メタノール１００ｍＬに溶解することにより、測定時
に随時調製した。また、標準クメンヒドロペルオキシド
溶液は、クメンヒドロペルオキシド５０ｍｇをメタノー
ルで１０ｍＭとなるように溶解し、これを上記酵素抽出
液で０．１ｍＭから１ｍＭとなるように希釈して調製し
た。予め、これを用いて、上記と同様にして５４０ｎｍ
における吸光度を測定し、検量線を作成した。各サンプ
ル中の脂質ヒドロペルオキシド量は、前記の測定値を検
量線と照合することによって求め、ＬＯＸ活性を算出し
た。

【００１７】基質としてリノール酸（ＬＨ）またはホス
ファチジルコリンジリノレイル（ＰＣ）を使用したとき
の結果を図示した。図１は大麦Ａ、図２は大麦Ｂのそれ
ぞれの製麦過程における脂質ヒドロペルオキシドの生成
量の経時的変化をを示す。なお、ジリノレイン、トリリ
ノレインを基質として使用した場合も、同様の傾向が認
められた。

【００１８】この結果、発芽前の大麦にはＬＨ酸化活性
のみ存在することが明らかとなった。さらに、発芽後、
ＬＨ酸化活性に加えてＰＣ酸化活性も誘導されることが
分かった。また、本発明によるＬＯＸ活性の測定時間
は、従来の方法と比べて、大幅に短縮された。Piazzaの
方法では、反応生成物であるヒドロペルオキシドの抽出
のためにクロロホルム層の分離（１〜２分）と窒素を吹
き付けることによる乾燥（３〜６分）と、再度メタノー
ルに溶解する操作（１〜２分）が必要であるが、これは
１検体当たり最低５〜１０分を要する。本発明によれ
ば、この操作を省略することができ、たとえば１００検
体を処理するのに約８〜１６時間短縮できる。

【００１９】実施例２ ＥＢＣディスクミルで粉砕した麦芽３．５３ｇに、５０
℃に加温しておいた水道水１０ｍＬを加え、５０℃のイ
ンキュベーター上で３０秒間攪拌した。攪拌後に氷浴上
で４℃となるまで急冷し、濾布を用いて濾過した。次い
で、濾過液を４℃で１５分間、遠心分離（３０００ｒｐ
ｍ）し、得られた上清を０．４５μｍのフィルターで濾
過し、穀類抽出液を得た。

【００２０】続いて、実施例１と同様に反応液を調製し
た。基質としてリノール酸を用い、反応温度０℃，２５
℃，５０℃におけるリノール酸ヒドロペルオキシド生成
量を実施例１と同様の方法により定量した。また、５０
℃で２０分間の熱処理による酵素失活を試験した。抽出
液を５０℃で２０分間処理した後、同様に２５℃のリノ
ール酸ヒドロペルオキシド生成量を実施例１と同様の方
法で定量した。

【００２１】結果を図３、４に示した。図３は、麦芽を
原料とし、酵素反応の温度条件を変化させた場合のリノ
ール酸ヒドロペルオキシド生成量の経時的な変化を示し
たものである。また、図４は、５０℃で２０分間の熱処
理を行った場合のリノール酸ヒドロペルオキシド生成量
の経時的な変化を示したものである。

【００２２】図３から明らかなように、０℃と２５℃で
酵素反応を行ったときは、反応時間に比例してリノール
酸ヒドロペルオキシドの生成量が増加した。これに対し
て、５０℃で酵素反応を行ったときは、反応時間の経過
とともにリノール酸ヒドロペルオキシドの生成量が徐々
に低下する傾向を示した。また、初期の酵素活性（反応
速度）は５０℃，２５℃，０℃の順に高いことが明らか
となった。さらに、０℃と２５℃で酵素反応を行ったと
きは、反応開始４０分後にはリノール酸ヒドロペルオキ
シドは、ほぼ同じレベルに達することが明らかとなっ
た。

【００２３】また、図４から明らかなように、５０℃で
２０分間の熱処理を行っても、熱処理をしていないもの
と同様に、リノール酸ヒドロペルオキシドの生成量が反
応時間に比例して増加することが明らかとなり、麦芽Ｌ
ＯＸは５０℃、２０分間の熱処理では殆ど失活しないこ
とが分かった。

【００２４】

【発明の効果】本発明の測定方法によれば、原料穀類の
品質、麦芽品質やビール品質に重要な影響を与える酵素
リポキシゲナーゼの活性測定を従来法に比べて簡便、か
つ短時間に行うことができる。また、本発明は酵素リポ
キシゲナーゼを欠失する品種のスクリーニングに応用す
ることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 基質としてリノール酸またはホスファチジル
コリンを用いたときの大麦Ａの製麦過程におけるヒドロ
ペルオキシド生成量の経時的変化を示した図である。

【図２】 基質としてリノール酸またはホスファチジル
コリンを用いたときの大麦Ｂの製麦過程におけるヒドロ
ペルオキシド生成量の経時的変化を示した図である。

【図３】 麦芽を原料として用い、酵素反応の温度条件
を変化させた場合のリノール酸ヒドロペルオキシド生成
量の経時的な変化を示した図である。

【図４】 ５０℃で２０分間の熱処理を行った場合のリ
ノール酸ヒドロペルオキシド生成量の経時的な変化を示
した図である。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 穀類抽出液と基質溶液とを反応させたの
   ち、反応生成物にＦＯＸ試薬を加えて吸光度を測定する
   ことを特徴とする穀類中のリポキシゲナーゼ活性の測定
   方法。
2. 【請求項２】 穀類抽出液と基質溶液とを反応させ、該
   反応を遊離脂肪酸を溶解するメタノール等の有機溶媒ま
   たは中性脂肪等を抽出する１−ブタノール等の有機溶媒
   を添加して停止させたのち、反応生成物を含む画分を回
   収し、これにＦＯＸ試薬を加えて吸光度を測定すること
   を特徴とする穀類中のリポキシゲナーゼ活性の測定方
   法。
3. 【請求項３】 基質溶液が、基質として遊離脂肪酸また
   は脂肪酸エステルを含む溶液である請求項１または２記
   載の測定方法。
4. 【請求項４】 基質溶液が、基質としてリノール酸、ホ
   スファチジルコリンジリノレイル、ジリノレインまたは
   トリリノレインのいずれかを含む溶液である請求項１ま
   たは２記載の測定方法。
5. 【請求項５】 穀類抽出液が、大麦または麦芽の抽出液
   である請求項１または２記載の測定方法。