JP2001008685A

JP2001008685A - 核酸合成法

Info

Publication number: JP2001008685A
Application number: JP11180257A
Authority: JP
Inventors: Koji Sotoike; 宏司外池
Original assignee: Shimadzu Corp
Current assignee: Shimadzu Corp
Priority date: 1999-06-25
Filing date: 1999-06-25
Publication date: 2001-01-16

Abstract

(57)【要約】【課題】ＰＣＲ阻害物質の作用を抑制して、試料中のＤ
ＮＡを効率よく増幅させる新規な方法を提供することを
目的とする。【解決手段】本発明では、試料中の目的とする遺伝子を
増幅する核酸合成法において、遺伝子増幅反応液にアル
ブミンを添加することにより、ＰＣＲ阻害物質の作用を
抑制する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は核酸合成法、特に、
ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction ：
以下ＰＣＲと略す）法による核酸合成法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＰＣＲ法は、ＤＮＡ鎖の１本鎖への解
離、ＤＮＡ鎖の中の特定の領域をはさんだプライマーの
結合、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応を繰り
返すことによって、目的のＤＮＡ断片を数十万倍にも増
幅できる方法である。ＰＣＲ法は、マリス氏らの発明で
ある特開昭６１−２７４６９７号公報に述べられてい
る。ＰＣＲ法は種々の試料中の核酸の高感度分析法とし
て使用可能で、特に動物体液由来の試料中の核酸の分析
法に使用できる。従って、ＰＣＲ法は感染症や遺伝病や
ガンの診断等に利用される。さらに、ＰＣＲ法は移植や
親子鑑定の際のＤＮＡタイピングの検査にも適した方法
である。これらの場合末梢血液が検査対象に選ばれる場
合が多い。

【０００３】ＰＣＲ法の１つの欠点は色素、たんぱく、
糖類あるいは未知の夾雑物が反応を阻害することであ
る。すなわち、代表的な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであ
るThermus aquaticus 由来のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
をはじめ、多くのＤＮＡポリメラーゼは、微量の体液由
来の夾雑物がＰＣＲ反応液中に混在しても、ＰＣＲが強
く阻害されることが広く知られている。

【０００４】そこで、ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅に先立
って、被験物から細胞、細菌、ウィルス等（以下、遺伝
子包含体と称する）を分離し、次に、その遺伝子包含体
から核酸を抽出する過程が必要となる。その方法として
は、酵素、界面活性剤、カオトロピック剤等により遺伝
子包含体を分解し、その後、フェノールあるいはフェノ
ール・クロロホルム等を用いて、遺伝子包含体の分解物
から核酸を抽出する方法が従来より使用されている。最
近では核酸抽出の過程において、イオン交換樹脂、ガラ
スフィルター、ガラスビーズあるいはタンパク凝集作用
を有する試薬等が使用されている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかし、これらの方法
を用いて試料中の核酸の精製を行っても、不純物の完全
な除去は困難であり、かつ試料中の核酸の回収量が一定
しない場合も多く、このため引き続く核酸合成が、とり
わけ試料中の目的とする核酸の含量が少ない場合には、
うまくできない場合もある。また、これら精製法は操作
が煩雑で時間を要し、また操作中のコンタミネーション
の機会が高い。従って、これらの問題点を解決するため
には、より簡便で、かつ効果的な試料前処理法が望まれ
る。

【０００６】そこで、本発明は、ＰＣＲ阻害物質の作用
を抑制して、試料中のＤＮＡを効率よく増幅させる新規
な方法を提供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記課題を解
決するため、試料中の目的とする遺伝子を増幅する核酸
合成法において、遺伝子増幅反応液にアルブミンを添加
することを特徴とする。ここで、アルブミンは、動・植
物の細胞・体液中に含まれる一群の可溶性タンパク質の
総称で、代表的なものとして、卵白アルブミン、乳中の
ラクトアルブミン、血清アルブミン、コムギ・オオムギ
のロイコシン、トウゴマ（ヒマ）種子中のリシンなどを
挙げることができるが、特に血清アルブミンが好まし
く、更にはウシ血清アルブミンが好ましい。但し、これ
らアルブミンには限定されない。アルブミンは、試料に
加えてから、遺伝子増幅反応液に添加しても、遺伝子増
幅反応液に直接添加してもよい。また、アルブミンは、
遺伝子増幅反応液に均一に入っていない状態（たとえば
試料にアルブミンを加えて、この試料を反応液に攪拌せ
ずに添加した場合など）でも同様の効果がある。アルブ
ミンは遺伝子増幅反応液中に０．４ｍｇ／ｍｌ以上、好
ましくは１〜１０ｍｇ／ｍｌ添加するのがよい。これ
は、溶液全体で言えば、０．０４％以上、好ましくは、
０．１〜１％の範囲である。

【０００８】本発明において、試料は生体由来試料中の
遺伝子包含体もしくは生体由来試料そのものをいい、生
体由来試料とは、動植物組織、体液、排泄物等をいい、
遺伝子包含体とは、細胞、細菌、ウィルス等をいう。体
液には血液、唾液、髄液、尿、乳が含まれ、細胞には血
液から分離した白血球が含まれるが、これらに限定され
るものではない。生体由来試料中の遺伝子包含体もしく
は生体由来試料そのものは、特別な前処理なしに直接遺
伝子増幅反応液に添加される。

【０００９】遺伝子増幅反応液は、通常、ｐＨ緩衝液並
びにＭｇＣｌ₂、ＫＣｌ等の塩類、プライマー、デオキ
シリボヌクレオチド類及び耐熱酵素を含むものである。
また、上記の塩類は適宜他の塩類に変更して使用されて
いる。また、ゼラチン等のタンパク、ジメチルスルホキ
シド、界面活性剤等種々の物質が添加される場合があ
る。

【００１０】ｐＨ緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタンと塩酸、硝酸、硫酸等の鉱酸の組合せ
であり、鉱酸の中で望ましいものは塩酸である。また、
トリシン、ＣＡＰＳＯ（3ーNーCyclohexylamino −2 −hy
droxypropanesulfonic acid ）あるいはＣＨＥＳ（2ー
（Cyclohexylamino ）ethanesulfonic acid ）と苛性ソ
ーダ、苛性カリとの組み合わせによるｐＨ緩衝液等種々
のｐＨ緩衝液が使用され得る。ｐＨ調整された緩衝液
は、遺伝子増幅反応液の中で１０ｍＭから１００ｍＭの
間の濃度で使用される。

【００１１】プライマーは、核酸と増幅用試薬等の存在
下に合成の開始点として働くオリゴヌクレオチドをい
う。プライマーは一本鎖であることが望ましいが、二本
鎖も使用できる。もし、プライマーが二本鎖の場合に
は、増幅反応に先立って一本鎖にすることが望ましい。
プライマーは、公知の方法により合成することができる
し、また、生物界から単離することもできる。

【００１２】耐熱酵素は、プライマー付加による核酸を
合成する酵素、あるいはかような化学合成系を意味す
る。適切な耐熱酵素としては、Ｅ．coliのＤＮＡポリメ
ラーゼＩ、Ｅ．coliのＤＮＡポリメラーゼのクレノーフ
ラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼ、Ｔ.litoralisＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ
ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼそして
逆転写酵素などがあるが、これらにのみ限定されるもの
ではない。

【００１３】また、本発明では遺伝子増幅反応液のｐＨ
を調節することや、硫酸化多糖・ジチオスレトール（di
thiothreitol：略称ＤＴＴ）により、相乗効果が得られ
る。例えば、ｐＨは、２５℃の温度条件下で８．１以
上、好ましくは８．５〜９．５である。また、本発明で
は、遺伝子増幅反応液にポリアミンを添加してもよい。

【００１４】なお、本発明の核酸合成法の手順は、アル
ブミンを添加する以外、通常の方法と何ら変わらない。
すなわち、先ず、増幅しようとする目的の2本鎖ＤＮＡ
断片を熱変性により、1本鎖のＤＮＡにする（ディナチ
ュレーション工程）。次に増幅させたい領域を挟むプラ
イマーをハイブリダイズさせる（アニーリング工程）。
次に４種類のデオキシリボヌクレオチド類（ｄＡＴＰ、
ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）の共存下にＤＮＡポリ
メラーゼを作用させ、プライマーの伸長反応を行う（ポ
リメライゼーション工程）。

【００１５】

【実施例】ＰＣＲ反応液（50μｌ）にクエン酸処理した
ヒト血液を２または１μｌ添加し、ＰＣＲを行った。Ｐ
ＣＲのプライマーはヒトのβ−グロビン遺伝子領域内に
位置するplus鎖の塩基配列をもつオリゴヌクレオチド
（ＧＨ２０）及びminus 鎖の塩基配列をもつオリゴヌク
レオチド（ＧＨ２１）であり、配列は次の通りである。
この２種類のプライマーを用いたＰＣＲの結果、４０８
bp の増幅産物を得ることができる。ＧＨ２０：５’ＧＡＡＧＡＧＣＣＡＡＧＧＡＣＡＧＧＴ
ＡＣ３’ ＧＨ２１：５’ＧＧＡＡＡＡＴＡＧＡＣＣＡＡＴＡＧＧ
ＣＡＧ３’

【００１６】ＰＣＲ反応液には、pH8.3 に調節した10mM
Tris-HCl、50MKCl,1.5mMMgCl₂, 200 μM のdATP,dCTP,
dGTP及びdTTP, 各0.4 μM のprimer, 1.25units/50μl
のTaq DNA ポリメラーゼ（TaKaRa Taq: Takara shuzo,
Kyoto, Japan）反応液を用いた。ＰＣＲは、９４℃、３
分のプレヒーティングの後、９４℃ ３０秒間、５５℃
１分間、７２℃ １分間の条件で４０サイクル、最後に
７２℃ ７分間のポリメライゼーションを行った。ＰＣ
Ｒ終了後、反応液５μｌを用いて、２．５％アガロース
を含む、０．５μｇ/ ｍｌ臭化エチジウム添加ＴＡＥ
（40mM Tris-acetate, 1mM EDTA, pH8.0) 液中で電気泳
動を行い検出した。

【００１７】ウシ血清アルブミン（SIGMA社製）（以下
ＢＳＡと称す）を反応液に直接添加して、ＰＣＲを行っ
たときの増幅産物の電気泳動図を図１に示す。図中Ｍは
サイズマーカー（HincIIで切断した250ng のφ X174-RF
DNA）、１、８はＢＳＡが０％、２、９はＢＳＡを０．
０１６％添加、３、１０はＢＳＡを０．０４％添加、
４、１１はＢＳＡを０．１％添加、５、１２はＢＳＡを
０．２５％添加、６、１３はＢＳＡを０．６２５％添
加、７、１４はＢＳＡを１．５６％添加したものを示し
ている。また、１〜７は血液を２μｌ添加、８〜１４は
血液を１μｌ添加したものである。結果、ＢＳＡを添加
することによって、ＰＣＲ増幅産物が得られることがわ
かった、特にＢＳＡを０．２５％添加するのが良好であ
る。

【００１８】

【発明の効果】本発明により、核酸の分離・精製の過程
を経ずに、血液等のＰＣＲ阻害物質を多く含んだ試料か
ら、直接、目的のＤＮＡを効率よく増幅することが可能
となった。また、本発明により、簡便、迅速に核酸合成
の操作を行えるようになり、コンタミネーションの機会
の軽減が可能となった。

【配列表】

＜１１０＞shimadzu corp. ＜１２０＞Method for synthesis of nucleic acids ＜１３０＞K０９９０３２３＜１６０＞２＜２１０＞１＜２１１＞２４＜２１２＞ＤＮＡ＜２１３＞Artificial Sequence ＜４００＞ 1 ＧＡＡＧＡＧＣＣＡＡＧＧＡＣＡＧＧＴＡＣ２ＧＧＡＡＡＡＴＡＧＡＣＣＡＡＴＡＧＧＣＡＧ

【図面の簡単な説明】

【図１】ＰＣＲ反応液（50μｌ）にヒトクエン酸処理し
たヒト血液を２または１μｌ、濃度の異なるＢＳＡを添
加し、ＰＣＲを行った電気泳動図

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１２年９月２９日（２０００．９．２
９）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１８】

【配列表】＜110＞shimadzu corp. ＜120＞ Method for synthesis of nucleic acids ＜130＞ K0990323 ＜160＞ 2 ＜210＞ 1 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞ Artificial Sequence ＜400＞ 1 gaagagccaaggacaggtac ＜210＞ 2 ＜211＞ 21 ＜212＞ DNA ＜213＞ Artificial Sequence ＜400＞ 2 ggaaaatagaccaataggcag

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】試料中の目的とする遺伝子を増幅する核酸
合成法において、遺伝子増幅反応液にアルブミンを添加
することを特徴とする核酸合成法。
【請求項２】アルブミンが血清アルブミンである請求項
１記載の核酸合成法。
【請求項３】アルブミンを遺伝子増幅反応液中に０．４
ｍｇ／ｍｌ以上添加することを特徴とする請求項1記載
の核酸合成法。
【請求項４】試料が生体由来試料中の遺伝子包含体もし
くは生体由来試料そのものである請求項１〜３に記載の
核酸合成法。
【請求項５】試料である生体由来試料中の遺伝子包含体
もしくは生体由来試料そのものを直接遺伝子増幅反応液
に添加することを特徴とする請求項１〜４に記載の核酸
合成法。