JP2000516948A

JP2000516948A - カチオン性脂質―核酸複合体

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Publication number: JP2000516948A
Application number: JP10511435A
Authority: JP
Inventors: レネ、ビショフ
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Transgene SA
Priority date: 1996-08-26
Filing date: 1997-08-25
Publication date: 2000-12-19
Also published as: CA2264140A1; AU3781597A; EP0941066B1; WO1998008489A1; DK0941066T3; PT941066E; ES2208936T3; DE69725877T2; ATE252891T1; EP0941066A1; DE69725877D1; AU729077B2; US6271208B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ａ）１種類以上のカチオン性脂質、１種類以上の補助脂質、および１種類以上の安定化添加剤を組合せて脂質懸濁液を形成し、ｂ）脂質懸濁液を核酸と組合せて複合体または粒子を形成し、場合によっては、ｃ）複合体または粒子に整粒処理を施すことを含んでなる、安定な脂質−核酸複合体または粒子の均質な懸濁液の製造法に関する。本発明は、特に上記方法によって製造された均質な懸濁液にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】カチオン性脂質−核酸複合体緒論本発明は、核酸を細胞に送達し、治療を必要とするヒトの細胞へ治療分子を提供する目的で用いることができるカチオン性脂質と核酸との安定な複合体、および安定なカチオン性脂質−核酸複合体の製造法に関する。発明の背景遺伝子治療の成功は、生体の細胞に遺伝子情報を効率的に送達し、発現させることにかかっている。これまでに用いられたほとんどの送達機構は、ウイルスベクターを含んでいる。ウイルスでは、細胞膜の通過を包含するこの目的を達成するための多様でかつ極めて精巧な機構が発達しており、リソソーム分解、それらのゲノムの核への送達を免れ、従って多くの遺伝子送達用途に用いられてきた。レセプター介在機構(Perales et al.，Eur．J．Biochem．226:255-266，1994 ；Wagner et al.，Advanced Drug Delivery Reviews 14:133-135，1994)、または脂質介在トランスフェクション(Felgner et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．U. S.A．84:7413-7417，1987;Behr et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．86:69 82-6986，1989;Gao et al.，Biochem．Biophys．Res．Communic．179:280-285， 1991;Behr，Bioconjugate Chemistry 5:382-389，1994;Fahrhood et al.，Annal s New York Academy of Sciences，716:23-35，1994;Ledley，Human Gene Thera py 6:1129-1144，1995)に基づく非ウイルスベクターは、大規模生産、ウイルスベクターに関する危険性の減少、トランスフェクション可能な細胞のターゲッティング、より低い免疫原性、およびＤＮＡのより大きなフラグメントを送達する能力に関して有利であると思われる。核酸を細胞中へ送達するための非ウイルス性ベクターの開発には、核酸と結合して、これらの親水性ポリアニオンがリン脂質二重層の疎水性で負に帯電したバリヤーである細胞膜を通過することができるようにし、それらがリソソーム分解を免れやすくし、それらが核へ入りや少なくともする分子が必要である。重要な遺伝子の発現は、送達される核酸の細胞転写機構への接近の可能性によって変化し、ほとんどの場合に、複合体の解離を必要とする。細胞への送達に重要な分子をカプセル封入することができるリポソームは、１９６５年には既に報告されているが(Bangham et al.，J．Mol．Biol．13:238-25 2，1965)、１９９０年代まではヒトの注射可能な治療薬として市販されるには至らなかった(Gregoriadis，Trends in Biotechnol 13:527-537，1995)。この遅れは、許容可能な安定性を有する再現性のある処方物を得ることが困難であることによるものである。主要な進展は、ある程度のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−修飾リン脂質（ＰＥＧ−ＰＬｓ）を含む「立体的に安定化した（ステルス（ stealth））リポソーム」の開発であった(Gregoriadis，Trends in Biotechnol ．13:527-537，1995;Lasic，Angew．Chem．Int．Ed．Engl．33:1685-1698，1994 )。リポソームを含むこれらのＰＥＧ−ＰＬは、細網内皮系による検出および除去を一層良好に免れ、循環半減期が著しく向上することが明らかとなった。（ＰＥＧ）−修飾リポソームは、極めて広汎に用いられているが、リポソームの表面にグラフトしてリポソームの安定性を増加させるポリ（ビニルピロリドン）のような他の親水性ポリマーが報告されている(Torchilin，V.P．et al.，Biochim． Biophys．Acta 1195:181-184，1995)。細胞への脂質介在核酸移行の増加は、細胞への核酸の移行のためのビヒクルとしてカチオン性脂質を導入することによって促進された(Felgner et al.，Proc ．Natl．Acad．Sci．84:7413-7417，1987;Behr et al.，Proc．Natl，Acad．Sci ．86:6982-6986，1989;Gao et al.，Biochem．Biophys．Res．Communic． 179:280-285，1991;Behr，Bioconjugate Chemistry 5:382-389，1994;Fahrhood et al.，Annals New York Academy of Science 716:23-35，1994;Ledley，Human Gene Therapy 6:1129-1144 1995)。カチオン性脂質は正に帯電しているので、それらは負に帯電した核酸と複合体形成することができる。リポソームとは異なり、これらの複合体はカプセル封入段階を必要とせず、成分同志を単に攪拌することによって製造される。複合体は、本質的に脂質でコーティングした核酸を含んでなり、この複合体の正に帯電した被膜が核酸の負電荷を中和し、また、負に帯電した細胞表面に効率的に結合して、細胞中への核酸の移入を促進することができる(Farhood et al.，Annals N.Y．Acad．Sci．716:23-35，1994)。核酸のトランスフェクションを介在するためのカチオン性脂質の使用の効果としては、複合体の調製が簡単であり、脂質成分がほとんどの核酸と複合体形成することができ、トランスフェクションを行いやすい細胞の型が広汎であり、移行が極めて効率的であり、複合体が免疫原性を持たず、かつカチオン性脂質を化学合成により入手可能であることが挙げられる(Farhood et al.，Annals N.Y．Aca d．Sci．716:23-35，1994)。多種多様な細胞型への核酸のカチオン性脂質により介在される送達は、イン・ビトロおよびイン・ビボで説明されている。例えば、カチオン性脂質と複合体形成した嚢胞性繊維症膜貫通調節タンパク質(cystic fibrosis transmembrane con ductance regulator:ＣＦＴＲ）をコードする核酸を、気管内設備(intratrachea l installation)(Yoshimura et al.，Nucleic Acids Res．20:3233-3240，1992) により、またはエーロゾル送達(Stribling et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．89 :11277-11281，1992)によりマウス肺に送達した。嚢胞性繊維症（ＣＦ）のマウスモデルへのカチオン性脂質を用いるＣＦＴＲの送達により、イオンチャンネル欠陥が補正された(Hyde et al.，Nature 362:250-255，1993)。ＣＦＴＲ遺伝子のＣＦ患者へのカチオン性脂質介在送達によるヒトでの臨床的研究では、鼻上皮において遺伝子が発現し、臨床的副作用は見られないことが示された(Caplen et al.，Nature Medicine 1:39-46，1995)。カチオン性脂質−ＤＮＡ複合体の単回静脈内注射の後のリポーター遺伝子の全身性遺伝子発現が、マウスで示された(Zhu et al.，Science 261:209-211，1993 )。更に、齧歯類およびヒト以外の霊長類にカチオン性脂質−酸複合体を全身投与した場合の安全性試験では、このような複合体の投与に関連した顕著な毒性は見られなかった(Parker et al.，Human Gene Therapy 6:575-590，1995)。組織培養におけるｍＲＮＡのカチオン性脂質介在トランスフェクションでは、転写体の翻訳を生じることが示された(Malone et al.，Proc．Natl．Acad．Sci ．86:6077-6081，1989)。カチオン性脂質を用いるアンチセンスオリゴヌクレオチドのヒト内皮細胞への送達では、オリゴヌクレオチドの細胞吸収が増加し、細胞中でのその活性が増加した(Bennett et al.，Mol．Pharm．41:1023-1033，199 2)。レトロウイルス粒子に複合体形成したカチオン性脂質を使用したところ、適当なウイルスレセプターを欠く細胞がウイルスに感染し、またはウイロソームとして知られる複合体を用いてレトロウイルスの形質導入を増加することができた (Hodgson et al.，Nature Biotechnol．14:339-342，1996)。主要組織適合性（ＭＨＣ）遺伝子を含むカチオン性脂質−核酸複合体を用いる癌の免疫療法では、マウス腫瘍に誘導した免疫応答を直接注射し、腫瘍の退行を生じた(Plautz et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．90:4645-4649，1993)。ヒトでの臨床研究は、ヒト黒色腫、結腸直腸および直腸癌患者において免疫治療分子をコードするＤＮＡ配列のカチオン性脂質介在送達を用いて現在進行中である(Nabel et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．90:11307-11311，1993;Crystal， Science 270:404-410，1995)。カチオン性脂質処方物は、今日までのところは、リン脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を配合することが多い。このリン脂質は、エンドソーム膜をその二重層構造を不安定化することによって破壊し、脂質−核酸複合体がエンドソーム分解を免れて細胞質に入ることができるようにするものと考えられる(Farhood et al.，Biochem．Biophys．Acta 1235:289-295，1995) 。しかしながら、核酸を細胞へ送達するためのカチオン性脂質複合体の広汎な使用における大きな障害は、複合体が溶液中で大きな集合体を形成する傾向があることである。発明の概要本発明は、核酸を細胞に送達し、治療を必要とするヒトの細胞へ治療分子を提供する目的で用いることができるカチオン性脂質と核酸との安定な複合体に関する。本発明は、安定化添加剤を含むカチオン性脂質と核酸との安定な複合体または粒子にも関する。本発明は、１種類以上のカチオン性脂質、１種類以上の補助脂質、１種類以上の安定化添加剤、および核酸または他のリガンドを組合せることによって安定なカチオン性脂質−核酸複合体または粒子の均質な懸濁液の製造法にも関する。本発明は、場合によっては、押出しのような整粒法であって、治療目的で患者に投与するための脂質−核酸複合体の製造法における最終的な殺菌段階として用いることもできるものを用いて、安定なカチオン性脂質−核酸複合体または粒子の均質な懸濁液の製造法をも包含する。本発明は、上記の方法によって製造された安定な脂質−核酸複合体または粒子の均質な懸濁液にも関する。本発明は、以下に簡単な説明を行う図面に関して理解することができる。図面の簡単な説明図１は、プラスミドｐＣＭＶｌｕｃの模式図を示す。図２は、２００ｎｍの細孔度を介して２００μｇ／ｍｌＤＮＡに複合体形成したスペルミジン−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥを含むＤＮＡベクター複合体の押出しの後のプラスミドＤＮＡの回収率を示す。収率は、ジステアロイルホスファチジル− エタノールアミン−ポリエチレングリコール（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）のモル％および複合体の電荷比（＋／−）の関数として示される。図３は、アガロースゲル電気泳動によって測定した２００ｎｍ細孔径での脂質 −ＤＮＡ複合体の押出しの後のｐＣＭＶｌｕｃプラスミドＤＮＡの一体性を示す（レーン１：ｐＣＭＶｌｕｃ；レーン２：スペルミジン−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ（１：１、重量）に複合体形成した２００μｇ／ｍｌプラスミドＤＮＡと電荷比＋／−＝５での２モル％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を含む複合体の押出し前のｐＣＭＶｌｕｃ；レーン３：０．２μｍでの押出しの後の同じ製剤におけるｐＣＭＶｌｕｃプラスミドＤＮＡ；レーン４：複合体形成したＤＮＡを単離するために脂質の抽出の後にレーン３に示したのと同じ製剤）。ゲルの最下部におけるスポットは、プラスミドＤＮＡを同時沈澱するのに用いるキャリヤーｔＲＮＡに相当する。図４（Ａ〜Ｄ）は、押出し段階後またはなしでの光子相関分光分析法によって測定した時間の関数としての２０μｇ／ｍｌＤＮＡ濃度での様々なカチオン性脂質に対する４℃での脂質−ＤＮＡ複合体の安定性に対するＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００のモル％の効果を示す。黒柱は、押出し段階なしで調製したＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を１０％含む様々なＤＮＡ−カチオン性脂質の粒度を示し、白柱は、押出し後のＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を１０％含む様々なＤＮＡ−カチオン性脂質複合体の粒度を示し、灰色柱は、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を０％含みかつ押出し段階なしで調製した様々なＤＮＡ−カチオン性脂質複合体の粒度を示す。Ａ：ＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ；Ｂ：スペルミジン−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ；Ｃ：スペルミン−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ；Ｄ：ＤＯＧＳ／ＤＯＰＥ。図５は、時間の関数としての、押出し後の２００μｇ／ｍｌＤＮＡ濃度でスペルミジン−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥを含む脂質−ＤＮＡ複合体の安定性に対する様々な濃度のＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００および様々な＋／−電荷比の効果を示す。黒色柱は、＋／−：５電荷比の効果を示し、白色柱は、＋／−：２．５電荷比の効果を示し、灰色柱は＋／−：１電荷比の効果を示す。Ａ：１０％ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００；Ｂ：５％ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００；Ｃ：２％ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００。図６は、時間の関数としての、押出し前の２００μｇ／ｍｌＤＮＡ濃度でスペルミジン−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥを含む脂質−ＤＮＡ複合体の安定性に対する様々な濃度のＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００および様々な＋／−電荷比の効果を示す。黒色柱は、＋／−：５電荷比の効果を示し、白色柱は、＋／−：２．５電荷比の効果を示し、灰色柱は＋／−：１電荷比の効果を示す。Ａ：１０％ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００；Ｂ：５％ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００；Ｃ：２％ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００。図７は、プラスミドＤＮＡ濃度の関数としてのＡ５４９細胞中の脂質−ＤＮＡ複合体のイン・ビトロでのトランスフェクション活性に対するＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００の効果を示す。Ａ）緩衝液ブランクに関する１０モル％ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００の存在下での発現水準、およびＢ）比較用のＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００なしの製剤での発現水準。図８は、投与後の日数の関数としての、マウスに様々なカチオン性脂質−ＤＮＡ複合体を気管内投与したのルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ／ｍｇタンパク質）を、遊離ＤＮＡのみまたは組換えアデノウイルスコントロールを投与した場合と比較して示す。図９は、スペルミジンＣｈｏｌ／ＤＯＰＥ−ｐＣＭＶｌｕｃ複合体＋１０％ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００＋／−押出しをマウス気管内に投与した後のルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ／ｍｇタンパク質）を示す。それぞれの付番したマウスについてのアッセイの組織部位は、下記の通りである：（Ｔ：気管；ＰＧ：左肺；ＰＤ：右肺）。図１０は、ＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥを含むカチオン性脂質−ＤＮＡ複合体を静脈内注射した後のルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ／ｍｇタンパク質）に対する電荷比およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（ＰＥＧ−ＰＬ）の影響を、遊離ＤＮＡを投与した場合と比較して示す。アッセイの組織部位が示されている。図１１は、カチオン性グリセロ脂質ｐｃＴＧ５６の合成を模式的に示したものである。発明の詳細な説明本発明は、核酸を細胞に送達し、治療を必要とするヒトの細胞へ治療分子を提供する目的で用いることができるカチオン性脂質と核酸との安定な複合体に関する。本発明は、安定化添加剤を含むカチオン性脂質と核酸との安定な複合体または粒子にも関する。本発明は、１種類以上のカチオン性脂質または混合物、１種類以上の補助脂質、１種類以上の安定化添加剤、および核酸または他のリガンドを組合せることによって安定なカチオン性脂質−核酸複合体の均質な懸濁液の製造法にも関する。本発明は、安定な核酸複合体または粒子の均質な懸濁液の製造法であって、１種類以上のカチオン性脂質、１種類以上の補助脂質、および１種類以上の安定化添加剤を組合せて脂質懸濁液を形成し、この脂質懸濁液を核酸と組合せて複合体または粒子を形成し、場合によっては、複合体または粒子に整粒処理法を施して、均質な粒度の複合体または粒子を形成することを含んでなる方法を包含する。本発明は、押出しのような整粒処理法を用いる安定なカチオン性脂質−核酸複合体または粒子の均質な懸濁液の製造法にも関し、これは、治療目的で患者に投与するための脂質−核酸複合体の生産工程における最終的な殺菌段階として用いることもできる。本発明の複合体または粒子は、１種類以上のカチオン性脂質、１種類以上の補助脂質、１種類以上の安定化添加剤、および核酸または他のリガンドを包含する。本発明は、ａ）１種類以上のカチオン性脂質、１種類以上の補助脂質、および１種類以上の安定化添加剤を組合せて脂質懸濁液を形成し、ｂ）脂質懸濁液を核酸と組合せて複合体または粒子を形成し、場合によっては、ｃ）複合体または粒子に整粒処理を施すことによって製造される安定な脂質−核酸複合体または粒子の均質な懸濁液にも関する。本発明は、上記の均質な懸濁液であって、脂質懸濁液に更に整粒処理を施して、均質な粒度の複合体または粒子の懸濁液が生成するようにすることを特徴とするものも包含する。「安定な複合体または粒子」とは、その粒度とは独立して、これらの複合体または粒子が凝集体を形成しないことを意味する。「均質な懸濁液」は、特に非凝集複合体または粒子を含む懸濁液の成果である。本発明によれば、均質に整粒した複合体または粒子を、複合体または粒子に整粒処理を施す任意段階によって有利に得ることができる。本発明の複合体に用いることができるカチオン性脂質またはカチオン性脂質の混合物としては、Lipofectin（商品名）（ＤＭＴＭＡ（塩化＝Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム）とＤＯＰＥとの混合物、１：１、重量）GIBCO-BRL；ＤＤＡＢ（臭化ジメチル− ジオクタデシルアンモニウム）；ＤＭＲＩＥ（臭化＝１，２−ジミリスチル−オキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウム）；スペルミジン −コレステロール（スペルミジン−Ｃｈｏｌ）；スペルミン−コレステロール（スペルミン−Ｃｈｏｌ）；ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール）；Transfectam（商品名）（ＤＯＧＳ，ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン），Promega；ＤＯＳＰＥＲ（１，３−ジ−オレオイルオキシ−２−（６−カルボキシ−スペルミル）− プロピルアミド），Boehringer Mannheim；ＤＯＴＡＰ（Ｎ−［１−（２，３− ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルフェート），Boehringer Mannheim；Tfx50（商品名）（ヨウ化＝Ｎ，Ｎ，Ｎ ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｎ，Ｎ’−ビス−（２−ヒドロキシエチル）−２，３ −ジオレオイルオキシ−１，４−ブタンジアンモニウムとＤＯＰＥとの混合物），Promega；Lipofectamine（商品名）（ＤＯＳＰＡ），Lipofectace（商品名）（ＤＤＡＢとＤＯＰＥとの混合物、１：２．５、重量），GIBCO-BRLが挙げられる。好ましくは、本発明のカチオン性脂質は、スペルミジン−コレステロール、スペルミン−コレステロール、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、およびＤＯＧＳから選択される。最も好ましくは、カチオン性脂質は、スペルミジン−コレステロールの異性体のいずれかである。補助脂質は、核酸の細胞への移入を促進しまたは安定性を増加する添加剤を接合する目的で複合体に加えられる。本発明の補助脂質としては、中性、双性イオン性およびアニオン性脂質が挙げられる。複合体の細胞への移入を促進する目的で複合体に加えることができる好ましい補助脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である。好ましい態様では、補助脂質ＤＯＰＥをカチオン性脂質と複合体形成させ、細胞膜を通る複合体の輸送を促進しかつエンドソーム分解を防止する。カチオン性脂質対補助脂質の（重量対重量換算での）比は、１：０〜１：１０の範囲であることができる。好ましい態様では、比は１：０．５〜１：４の範囲である。他の補助脂質を本発明の複合体に加えて、安定化添加剤を複合体に結合することもできる。補助脂質は、安定化添加剤を本発明の複合体に配合することができる残基であることができる。脂質を添加剤と誘導体形成することにより、この残基が安定化添加剤をカチオン性脂質複合体へ固定することができる。補助脂質を添加剤に接合して、カチオン性脂質−核酸複合体の凝集および沈澱を防止することができる。このような添加剤を本発明のカチオン性脂質−ＤＮＡ複合体に配合する目的で用いることができる補助脂質としては、双性イオン性または他のリン脂質が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、安定化添加剤を接合するのに用いられる補助脂質は、本発明の複合体に配合することができる残基である。更に好ましくは、このような補助脂質は不活性であり、かつ生物学的適合性である。好ましい態様では、リン脂質ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）は安定化添加剤で誘導体形成され、本発明のカチオン性脂質−核酸複合体に配合することができる残基である。本発明のもう一つの態様では、カチオン性脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような安定化添加剤を含むように合成し、この生成物が静電相互作用により本発明の複合体中の核酸に結合するようにすることができる。安定化添加剤を本発明の複合体に加え、複合体の一体性を保持し、整粒処理の際に複合体安定性を保持し、保存寿命を増加させることもできる。これらの添加剤は、好ましくは複合体に配合しまたは結合することができる残基、例えば補助脂質に結合される。このような添加剤は、一般的にはポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチル−オキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリ酢酸、ポリグリコール酸、およびヒドロキシメチルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロースのようなセルロース誘導体などの、これらに限定されない親水性ポリマーから選択される（ＰＣＴ公表第ＷＯ９４／２２４２９号明細書、１９９４年１０月１３日公表）。本発明に有用な他の安定化添加剤としては、過フッ化または部分的にフッ素化したアルキル鎖、フッ素化リン脂質、脂肪酸、およびペルフルオロアルキル化リン脂質、およびポリグルコロン酸が挙げられる(Oku et al.，Critical Review in Therapeutic Drug Carrier Systems 11:231-270，1994)。好ましくは、リン脂質ＤＳＰＥは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と誘導体形成し、安定化添加剤ＤＳＰＥ−ＰＥＧを形成する。更に好ましくは、用いることができるＰＥＧの分子量は、３００〜２０，０００Ｄａの範囲である。更に一層好ましい態様では、ＰＥＧ２０００が安定化添加剤として用いられる。ＰＥＧ−脂質接合体は、リンカーシアヌレクロリドの使用などの幾つかの方法によって調製することができる（米国特許第５，２２５，２１２号明細書、この特許明細書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される）。カルボニルジイミダゾール（Ｃ＝Ｏ）、無水コハク酸（−ＣＯ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＯ−）、またはトシレート −（ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−）_n-1ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ−ＰＥを用いるものなどの他の活性化法を用いることもできる。添加剤の提案される-般構造は、下記の通りである（ＰＥ＝ホスファチジルエタノールアミン）：ポリマーがポリエチレングリコールである場合には、ＣＨ₃Ｏ−（ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−）_n−Ｘ−ＮＨ−ＰＥＹＯ−（ＣＨ₂−ＣＨ₂）_n−Ｘ−ＮＨ−ＰＥ平均分子量：３００〜１００００Ｄａ，（ｎ＝５〜２５０）Ｘ：リンカー（ＣＯ；シアヌレクロリド、米国特許第５，２２５，２１２号明細書を参照されたい）Ｙ：リガンド（ペプチド、炭水化物、タンパク質、ジギオヌクレオチド、ビタミン、レセプター拮抗薬または作動薬、など）。本発明のもう一つの態様では、リガンドは、遊離−ＯＨ基を用いて本発明の複合体の安定剤またはＰＥＧ残基にカップリングすることができる。このようなリガンドとしては、ペプチド、炭水化物、タンパク質、核酸、ビタミン、レセプター拮抗薬およびレセプター作動薬が挙げられるが、これらに限定されない。リガンドがジギオヌクレオチドである場合には、ＰＥＧ−ジギオヌクレオチド接合体を調製することができる。リガンドのカップリングのため−ＯＨ基を活性化する方法としては、カルボニルジイミダゾール、シアヌレクロリド、無水コハク酸、またはトシレートを用いる方法が挙げられる。好ましくは、リガンドは、カップリングに利用可能な遊離のＮＨ₂またはＳＨ基を含む。一例は、下記の通りである：リガンド−ＮＨ−ＣＯ−Ｏ−ＰＥＧ−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−ＤＳＰＥ。リガンドのカップリングは、ＳＰＥ−ＰＥＧ−ＯＨとリガンドとの間の分子濃度、脂質懸濁液の濃度、または脂質−ＤＮＡ複合体の濃度などの複合体形成の幾つかの段階のいずれかで行うことができる。好ましくは、カップリングは、複合体形成の後期段階で行われ、リガンドが複合体の表面上にあり、従って接近可能となる確率が増加する。カチオン性脂質−核酸複合体の貯蔵を増加することができる安定化添加剤を複合体に加えて、長期安定性を得るようにすることができるが、添加剤は、特により低い電荷比での核酸とカチオン性脂質の結合を妨害しないように加えなければならない。リン脂質誘導体のような安定化添加剤対補助脂質（例えば、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００／ＤＯＰＥ）のモル比は、０．０１〜１（総脂質量に０．５モル％〜５０モル％）の範囲であることができる。好ましい態様では、安定化添加剤は、カチオン性脂質と補助脂質との混合物に総脂質の１〜２０モル％の濃度で加えることができる。更に好ましい態様では、安定化添加剤対補助脂質のモル比は、０．０４〜０．２の範囲であることができる。本発明の複合体は、所望な核酸成分であって、このような分子を必要とする細胞に送達されるものをも包含する。脂質懸濁液またはカチオン性脂質と複合体形成する核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子であって、一本鎖または二本鎖であることがあるものであることができる。核酸は、特にゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、またはリボチームであることができる。核酸は、タンパク質、リボチーム、アンチセンス、または細胞へ送達するときに重要な他の分子を生成することができる核酸の発現可能な配列を含むプラスミドまたは線状核酸の形態であることもできる。核酸は、例えばアンチセンスまたはリボチーム機能のために細胞へ送達されるオリゴヌクレオチドであることもできる。カチオン性脂質または脂質懸濁液に加えて本発明の複合体を形成することができる核酸の濃度は、１０μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌの範囲である。本発明の好ましい態様では、核酸の濃度は２０μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌの範囲である。本発明のカチオン性脂質−核酸複合体は、複合体の正に帯電したカチオン性脂質成分対負に帯電した核酸成分の比であるそれらの電荷比（＋／−）を特徴とすることもできる。一般に、複合体上の過剰の正電荷により、負に帯電した細胞表面への複合体の結合が容易になる。本発明の複合体の電荷比は、複合体上の正電荷の和を負電荷で割ることによって計算することができる。正電荷／モルを特定のカチオン性脂質または補助脂質について測定して、所定重量の脂質が特定の正電荷を表すようにすることができる。同様な測定を核酸または補助脂質について行い、負電荷／モルを得て、所定重量の核酸または補助脂質が特定の負電荷を表すようにすることができる。総ての正電荷を総ての負電荷で割ることにより、複合体の真の電荷比（＋／−）を測定する。好ましくは、本発明の複合体の電荷比は、１〜２０（＋／−）である。更に好ましくは、２．５〜１０（＋／−）の範囲である。本発明は、脂質懸濁液または脂質-核酸複合体の粒度を標準化する整粒法を用いる脂質懸濁液（核酸の添加前）および／または脂質−核酸複合体の均質な整粒法にも関する。核酸の添加前の押出しにより、脂質凝集体への核酸の結合が減少することになる。複合体の均質な製剤または懸濁液を生成するのに用いることができる方法としては、押出し、音波処理、および微小流動化(microfluidization )、サイズ排除クロマトグラフィー、フィールド・フロー分別、電気泳動、および超遠心分離が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の好ましい態様では、画定された細孔径の膜を通る脂質懸濁液および／または脂質−核酸複合体の押出しを含んでなる方法を用いて、複合体形成した核酸を改質することなく本発明の複合体の均質に整粒した粒子または製剤を調製する。画定された細孔径のポリカーボネート膜を積層した押出し装置を用いて、懸濁液を加圧下で膜を通過させるようにすることができる（例えば、Lipex Biomem brances，Inc．、バンクーバー、カナダ製）。脂質懸濁液および／またはカチオン性脂質−核酸複合体を、細孔径が５０〜５００ｎｍの膜を通して押出すことができる。好ましい膜の細孔径は２００ｎｍである。複合体の押出しを、治療目的で患者に投与するためのカチオン性脂質−核酸複合体の製造工程における最終的殺菌段階として用いることもできる。本発明の好ましい態様では、カチオン性脂質−核酸複合体の粒度は、２５〜５００ｎｍの範囲であることができる。更に好ましくは、複合体の粒度は２００ｎｍである。粒度は、特定の用途に最適に用いられるように選択することができる。例えば、特定の臨床用途がカチオン性脂質−核酸複合体の浸出を含む場合には、複合体の粒度は約８０ｎｍ以下であることができる。粒度の測定は、動的レーザー光散乱（光子相関分光分析法、ＰＣＳ）、並びに当業者に知られている他の手法などの多数の手法によって行うことができる（Wa shington，製薬および他の産業における粒度分析(Particle Size Analysis in Pharmaceutics and other Industries)，Ellis Horwood,ニューヨーク，１９９２年，１３５〜１６９頁）。本発明の複合体に、押出しのような整粒処理を施した後、収率を計算して、回収率を評価することができる。この計算は、処理前および後の複合体中の核酸の濃度を測定することに基づいている。例えば、ＤＮＡを含む複合体の懸濁液を整粒膜を通して押出す場合には、懸濁液のＤＮＡ濃度は、例えば２６０ｎｍにおける吸光度の測定（Ａ２６０）のような核酸を検出する標準的手法を用いて測定することができる。１０％ＤＭＳＯが含まれていると、脂質の存在下におけるＤＮＡ濃度の測定が容易になる。押出し後の収率は、押出し前および後に測定したＤＮＡ濃度の比から計算することができる。整粒処理の後の複合体中の核酸の構造的一体性を測定するため、核酸を、例えば脂質の溶媒抽出の後にアガロースゲル電気泳動によって分析することができる。核酸の制限マッピングを用いて、例えばプラスミドの状態に関する追加の詳細を提供することができる。このような手法を用いれば、複合体中の核酸が構造的に完全であり、加圧濾過中の剪断力または整粒処理において生成した他の機械的応力によって分解しないかどうかを決定することが可能である。ＤＮＡが、複合体の脂質または脂質安定剤成分によってどの程度しっかりと結合しかつ被覆されているかについて、複合体の構造安定性を評価することも可能である。これは、アガロースゲル中でのＤＮＡ移動を評価することによって（移動なしは、ＤＮＡが脂質で被覆されていることを示す）、またはＤＮＡアーゼＩでインキュベーションした後、脂質抽出およびアガロースゲル電気泳動を行い、複合体中のＤＮＡが表面に暴露しているかどうかを評価することによって、測定することができる。本発明の複合体は、最適安定性のために４℃で貯蔵することができる。複合体の経時的安定性は、粒度測定について以前に報告された方法を用いて、粒度を定期的に評価することによって測定することができる。カチオン性脂質−核酸複合体は、核酸を細胞中に移動させ、細胞環境での核酸の挙動を監視するのにも有用である。例えば、目的とする細胞中への遺伝子のカチオン性脂質トランスフェクションを用いて、調節パラメーターであって、これらの要素を目的の遺伝子に結合させ、発現について評価することによって、遺伝子（エンハンサー、プロモーターなど）を発現させるものを決定することができる。カチオン性脂質−核酸複合体を用いて、このような分子による治療を必要とするヒトの細胞に核酸を送達することができる。投与の経路としては、直接注射（例えば、気管内）、エーロゾル投与、イン・ビボ投与のための筋肉内、腫瘍内および静脈内経路が挙げられるが、これらに限定されない。エクス・ビボでの移植処理に用いられる細胞への核酸のカチオン性脂質介在トランスフェクションを用いて、核酸を、このような分子を必要とするヒトに送達することもできる。本発明の複合体の核酸成分として用いることができる治療用導入遺伝子としては、嚢胞性繊維症に対するＣＦＴＲ、肺気腫に対するα１−アンチトリプシン、ＡＩＤＳに対する可溶性ＣＤ４、アデノシンデアミナーゼ欠損症に対するＡＤＡ、筋ジストロフィーに対するジストロフィン、癌治療に対するサイトカイン遺伝子、癌治療に対する免疫療法または腫瘍抑制遺伝子、および遺伝子療法に有用であるものとして当該技術分野で認められている任意の他の遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。リボチーム、アンチセンスＲＮＡ、またはオリゴヌクレオチドのような分子をコードするトランスジェニック核酸を、本発明の複合体の核酸成分に配合することもできる。あるいは、リボチーム、アンチセンス核酸、またはオリゴヌクレオチドを、本発明の複合体に直接配合することもできる。核酸構築物は、エンハンサーおよびプロモーターのような遺伝子の発現を支配する調節要素を含むこともできる。発現可能な核酸を含んでなる複合体を、例えば静脈内投与などの様々な投与経路によって多種多様な細胞型に送達し、脂質−核酸複合体を全身吸収する場合には、核酸の発現を、組織特異的プロモーターを用いることによって、特定の組織に限定することができる。核酸の発現は、外来刺激、例えばメタロチオニンによって活性化したＭＭＴＶプロモーター、ＨＩＶのＴＡＴ／ＲＥＶタンパク質の存在下で活性化されたプロモーターを含んでなるＴＡＲ／ＲＲＥ、またはホルモン応答プロモーターに応じて活性化される誘導プロモーターを用いて一時的に制御することもできる。複合体の核酸成分が発現可能な遺伝子を含んでなる場合には、その生物学的機能は、ノーザンブロットまたはＳ１分析によるｍＲＮＡの検出、および／またはウェスタン・ブロット法、免疫沈澱または機能タンパク質分析法を用いるタンパク質の検出などの標準的手法によって分析することができる。遺伝子が適当なマーカータンパク質、例えばルシフェラーゼまたはβ−ガラクトシダーゼをコードする場合には、後者が特に有用である。カチオン性脂質−核酸複合体は、イン・ビトロで目的とする核酸を細胞へ移動させ、このような核酸の機能を決定し、または治療効果を提供する核酸をこれらの細胞に与え、または核酸送達についての複合体の効率および特異性を測定することができる。このような細胞としては、確立された細胞系、例えばＡ５４９、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨｅＬａ、並びに当業者に知られている一次細胞または他の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。目的とする核酸は、全生体の組織への移動の効率および特異性を決定するのに用いることができる動物モデルの細胞にイン・ビボで送達することもできる。このような動物としては、マウス（例えば、Ｃ５７Ｂｌａｃｋ／１０、またはＢａｌｂ／ｃ）、ウサギ、および霊長類などが挙げられる。例えば、嚢胞性繊維症のモデルとして突然変異体ＣＦＴＲ遺伝子を発現するように操作したトランスジェニックマウスのようなヒトの疾患状態の動物モデルを用いて、治療処理のためのある種の分子の効果を試験することができる。本発明は、本発明の複合体を含む医薬組成物であって、治療上有効量を投与して治療を必要とするヒトに所望な核酸を送達することができるものも包含する。医薬組成物は、任意の適当な溶媒などの薬学上許容可能なキャリヤーを含むことができる。本明細書で用いられる「薬学上許容可能なキャリヤー」としては、任意および総ての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌約、等張および吸収遅延剤などが挙げられる。任意の通常の媒質または化合物が活性成分と適合性である限りを除き、治療組成物でのその使用が考えられる。特に断らない限り、本発明の実施では、当該技術分野の技術範囲内にある組換えＤＮＡ技術、タンパク質化学、微生物学およびウイルス学の通常の手法が用いられる。このような手法は、文献に詳細に説明されている。例えば、分子生物学の最新のプロトコール(Currenl Protocols in Molecular Biology)，Ausubel et al.監修，John wiley & Sons，Inc.，ニューヨーク，１９９５年を参照されたい。本発明を、下記の実施例について説明する。実施例１：カチオン性脂質−核酸複合体の調製カチオン性脂質ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチル−アミノエタン）カルバモイル］コレステロール）（Gao，X．and Huang，L.，Biochem． Biophys．Res．Communic．179:280-285，1991に準じて合成）、スペルミジン− コレステロール（スペルミジン−Ｃｈｏｌ）（Transgene，S.A．で合成）（Caff ey et al.，J．Biol．Chem．270:31391-31396，1995：フランス国特許出願第９６０１３４７号明細書、上記文献の内容は、いずれもその開示の一部として本明細書に引用される）、スペルミン−コレステロール（スペルミン−Ｃｈｏｌ）（Transgene，S.A．で合成）（Caffey et al.，J．Biol．Chem．270:31391- 31396，1995;フランス国特許出願第９６０１３４７号明細書）、およびジオクタデシルアミド−グリシル−スペルミン（ＤＯＧＳ）（Jean-Paul Behr博士の好意により入手(Behr et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．86:6982-6986，1989,この文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される）、および補助脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）（Sigma，Ref．P505 8，lot 75H8377）およびジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン− ＰＥＧ２０００（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００），Avanti Polar Lipids,アラバスター，アラバマ，米国，Ref 880120，lot 18OPEG2PE-21）を、それぞれのクロロホルム／エタノール（８：２）の溶液を混合し、窒素気流下で溶媒を留去して、乾燥した脂質フィルムを生成することによって所望な比率（カチオン性脂質：ＤＯＰＥの比１：１；ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００対総脂質の比２．５および１０モル％）で組合せた。残っている溶媒を、真空留去した。乾燥した脂質フィルムを、２０ｍＭＨｅｐｅｓ，ｐＨ７．８、０．９％ＮａＣｌ中で若干攪拌しながら４℃で一晩再水和し、超音波処理浴槽(Bransonic 221)中で８分間超音波処理することによって懸濁した。カチオン性脂質／補助脂質混合物を、様々な電荷比＋／−でＤＮＡと複合体形成する前に２００ｎｍで押出した。押出しは、細孔径が０．２μｍの２枚のポリカーボネート膜を重ね合わせたもの(Nucleopore，Costar Corp．Cambridge,マサチューセッツ，米国）を備えたLipex Biomembranes，Inc.（バンクーバー，カナダ）製の押出機を用いて行った。懸濁液を、５０℃で約１０バールの窒素ガス圧で膜を通過させた。特定の例では、下記の脂質を混合し、乾燥した：窒素気流下でスペルミジン− Ｃｈｏｌ（１０ｍｇ／ｍｌ）４２２μｌ、ＤＯＰＥ（１０ｍｇ／ｍｌ）４２２μ ｌ、およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（２５ｍｇ／ｍｌ）１４５μｌ、次いで、残留溶媒を真空留去。振盪機上で４℃で一晩、２０ｍＭＨｅｐｅｓ，ｐＨ７．８＋０．９％ＮａＣｌを４．３２ｍｌを加えた後、超音波処理浴槽(Bransonic22 1)中で８分間超音波処理することによって再構成し、下記の脂質濃度を得た：スペルミジン−Ｃｈｏｌ：１．７５ｍＭ，ＤＯＰＥ：１．３１ｍＭ，ＤＳＰＥ−ＰＥＧ：０．３１ｍＭ。脂質懸濁液を、細孔径が２００ｎｍの２枚の膜を重ね合わせたものを通して押出した。懸濁液を、５０℃で約１０バールの窒素ガス圧で膜を通過させた。２００μｌのｐＣＭＶｌｕｃプラスミドＤＮＡ（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１ｍＭＥＤＴＡ中１．４６ｍｇ／ｍｌ）を、脂質懸濁液の１．２６ｍｌ分量に加え、最終容積を１．４６ｍｌとした。複合体の最終調製物における成分の濃度は、スペルミジン−Ｃｈｏｌ：１．５１ｍＭ、ＤＯＰＥ：１．１３ｍＭ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ：０．２７ｍＭ、ＤＮＡ：２００μｇ／ｍｌであった。このような複合体は、１０モル％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を含み、ＤＮＡ濃度が２００μｇ／ｍｌでの電荷比は５である。脂質−ＤＮＡ複合体を、再度５０℃および約１０バールの窒素圧で２００ｎｍの細孔径のポリカーボネート膜中に伸長させた。押出したおよび非押出し脂質− ＤＮＡ複合体の安定性の比較については、図４を参照されたい。ＣＭＶプロモーターの制御下でルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＣＭＶｌｕｃを、図１に示す。得られたカチオン性脂質−核酸複合体の粒度を、光子相関分光分析法（動的光散乱とも呼ばれる）であって、レーザー光散乱に基づいた手法によって測定した。ＰＣＳにより、レーザー光の照明容積中の粒子のブラウン運動を測定し、散乱光の変動を粒子の拡散係数に連結する相関関数を計算する。次に、粒度は、ストークス−アインシュタインの関係式：Ｄ＝ｋＴ／３πηｄ（ｋ：ボルツマン定数、Ｔ：絶対温度、η：粘度、ｄ：粒径（Clive Washington，製薬および他の産業における粒度分析(Particle Size Analysis in Pharmaceutics and other Indus tries)，Ellis Horwood出版社，ニューヨーク，１９９２年，１３５〜１６９頁を参照されたい。この文献には、他の方法についての章も記載されている）を用いて拡散係数から誘導される。ＰＣＳは、押出し前の部分について行い、残りは５０℃で２００ｎｍの膜を介して押出した。押出しの後、粒径をＰＣＳによって再度測定した。カチオン性脂質−核酸複合体を４℃で様々な期間保存して、その安定性を測定した。カチオン性脂質−核酸調製物中のＤＮＡの濃度を、脂質懸濁液を１０％（容量／容量）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で透明にすることによって測定した。吸光度は、光路長１ｃｍで５０μｇ／ｍｌＤＮＡを１吸光度単位に等しいと定義する関係を用いて２６０ｎｍで測定した。様々な調製物について押出し前および後に測定を行い、複合体形成を行わないプラスミドＤＮＡの濃度と比較した。収率は、比Ａ２６０（押出し後）／Ａ２６０（押出し前）（×１００）を用いて計算する。複合体におけるＤＮＡの物理的一体性を、脂質の溶媒抽出の後アガロースゲル電気泳動によって決定した。このために、カチオン性脂質−核酸懸濁液１ｍｌを０．４ｍｌの水、２ｍｌのメタノール、および１ｍｌのクロロホルムと混合し、２分間攪拌した。３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上相を別の試験管に移し、真空乾燥した。ペレットを、３Ｍ酢酸ナトリウム２７μｌおよびトランスファーＲＮＡ５μｇを加えた水２５０μｌに再溶解した後、−２０℃に冷却した無水エタノール７００μｌを加えた。−２０℃で１時間簡単に攪拌した後、ＤＮＡペレットを４℃で１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することによって回収した。液体を傾瀉し、残りのペレットを７０％エタノール水溶液２００μｌ（−２０℃に冷却）で２回洗浄し、それぞれの洗浄の後に遠心分離によって回収した。次に、ペレットを真空乾燥し、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１ｍＭＥＤＴＡに再溶解して、最終濃度を約０．５μｇ／μｌとした。アガロースゲル電気泳動は、Ｔｒｉｓ（４．８６ｇ）、酢酸ナトリウム×３Ｈ₂Ｏ（０．６８ｇ）およびＥＤＴＡ（０．３３６ｇ、総ての重量は１リットルの最終容積についてのものであり、酢酸でｐＨ７．８に調整した）中１％アガロース(S igma，Ref．A-6877，lot 123H0552)中サブマリーン・スラブ・ゲル(submarine s lab gels）（１４×１０×０．８ｃｍ）中で、６０ボルトで２時間行った。ＤＮＡバンドを、上記緩衝液中臭化エチジウムを用いて６０μｇ／ｌで染色した。粒度分析は、３〜１０，０００ｎｍの範囲に亙ってＰＣＳ（Coulter N4 Plus ，マイアミ，フロリダ，米国）と組合せたレーザー光散乱（１０ｍＷＨｅ−Ｎｅレーザー、６３２．８ｎｍ）によって行った。散乱光を、２０ｍＭＨｅｐｅｓ，ｐＨ７．８，０．９％ＮａＣｌで希釈した試料の９０°の角度で測定し、５ ×１０⁴〜１０⁶カウント／秒を得た。最終容積は、５００μｌであった。測定は、２５℃で３分間平衡にした後、下記のパラメーター：自動プレスケール(autom atic prescale)、自動試料時間(sample time:automatic)、自動測定時間（９０ °、３分）、２５ビン(bins)を用いる３〜１０，０００ｎｍのＳＤＰ（異なる母集団を区別するアルゴリズム）分析、屈折率：１．３３２５２、粘度：０．８９０４センチポアズを用いて開始した。上記の条件下で行った最初の分析の後、窓の大きさを小さくし、ビンの数を増加することによって測定条件を向上させた。系は、画定された平均粒径のラテックスビーズで較正した（Coulter粒度コントロール：CEI NO．6602336；９０、１７０、３００および５００ｎｍ）。遅延時間の調整は自動的に行い、較正ビーズでの手動測定により精確な範囲にあることが規則的に実証された。結果１０％のモル比でＰＥＧ２０００にカップリングしたジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）のようなＰＥＧ−リン脂質（ＰＥＧ−ＰＬ）を配合することにより、押出し後のＤＮA回収率が向上し、凝集を防止することにより一体性が保持された（図２および３）。この有利な効果は、ＰＥＧ−ＰＬを加えた場合の均質な分散液である得られた複合体を目視により検査した時点で既に明らかであったが、安定化添加剤を加えない場合には速やかに羊毛状となった。安定化添加剤を含まない脂質−核酸複合体を細孔径が２００ｎｍのポリカーボネート膜を通して押出す初期の試みでは、ＤＮＡのほとんどが、恐らくは凝集体が存在するためフィルター膜上で失われた。４℃で２０μｇ／ｍｌに複合体形成した様々なカチオン性脂質を用いる安定性の検討では、ＰＣＳによって測定した複合体の平均粒径は、少なくとも２か用間安定なままであった（図４Ａ〜Ｄ；Ａ：ＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ；Ｂ：スペルミジン−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ；Ｃ：スペルミン−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ；Ｄ：ＤＯＧＳ／ＤＯＰＥ）。初期粒度を０日に示し、粒度を６３日間に亙ってＤＳＰＥ− ＰＥＧ２０００のモル％の関数として、ＤＮＡ−脂質複合体の押出しを行う（「ｅｘ」）かどうかについて測定した。データは、１０％ＤＳＰＥ−ＰＥＧを添加したところ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧを含まない調製物とは対照的に、粒子は均一な粒度に保持され、凝集は防止された。また、ＤＳＰＥ−ＰＥＧの安定化効果を、イン・ビボトランスフェクションに必要なより高濃度のプラスミドＤＮＡ（２００μｇ／ｍｌ）に複合体形成したスペルミジン−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥを含む脂質−ＤＮＡ複合体についても観察した（図５）。この結果は、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００の安定化効果が、異なる量の添加剤（２、５および１０モル％）並びに異なる＋／−電荷比について観察されることを示している。ＰＣＳによって測定した粒度の変動が微小であることは、調製物が経時的に発生するものではないので、それが不安定であることを示していない。ＰＣＳによる粒度測定では、恐らくは複合体の形状が若干変化するため、これらの変動を生じることがあるものと思われる。ＰＥＧ−ＰＬを含む脂質−ＤＮＡ複合体の粒度は、最終的な押出し段階を省いたときにも安定化した（図６）。この安定化効果は、異なる＋／−電荷比および異なるＰＥＧ−ＰＬの濃度で明らかであった。特に、＋／−電荷比が高い脂質− ＤＮＡ複合体は効率的に安定化されたが、総ての調製物は、ＰＥＧ−ＰＬを含まない場合の粒度が１０００ｎｍを上回るのと比較して、４００ｎｍ未満であり、ほとんどの場合には２００ｎｍ未満であった（図４Ａ〜Ｄ）。複合体にＰＥＧ− ＰＬが含まれていないと、プラスミドＤＮＡをカチオン性脂質に２００μｇ／ｍｌの最終濃度で添加すると、目に見える凝集および沈澱が生じ、有意なｐＣＳ測定が妨げられた。４℃での安定性検討では、押出した複合体は、平均粒径が約１７０ｎｍ（ＰＣＳ測定）で少なくとも２か月間安定なままであった。更に、このような複合体は、実施例３に示される気管内および静脈内経路でのイン・ビボでのトランスフェクションが可能である。添加剤は、カチオン性脂質と核酸との複合体を安定化し、複合体形成した核酸が改質することなく画定された細孔度の膜を通してこのような複合体を押出すことができる。ポリエチレングリコールと誘導体形成したリン脂質は、脂質−ＤＮＡ複合体の凝集および沈澱を防止するのに有効であることが分かる。実施例２：カチオン性脂質−核酸複合体を用いる細胞のトランスフェクション方法２×１０⁶個の細胞を含む細胞培養物の初期の２０ｍｌから、２×１０⁴個の細胞／ウェル（９６穴培養プレート）を、グルタミンおよび１０％ウシ胎児血清を補足した２００μｌのＤＭＥＭ培地に、１日目に接種した。２日目に、２個のマイクロタイタープレートを調製し、一方のプレートには、ウェル当たり血清を含まない７０μｌの培地中プラスミドＤＮＡの様々な希釈物を含み（出発濃度：０．１６ｍｇ／ｍｌ）、一つのプレートには、ウェル当たり６０μｌ中の脂質懸濁液を含んでいた（出発濃度：０．１８７ｍｇ／ｍｌ）。ＤＮＡおよび脂質を両方とも連続希釈し（２倍）、所要量のＤＮＡを必要量の脂質を含むウェルに移した。培地を吸引により細胞から除去し、脂質−ＤＮＡ複合体（１００μｌ）を細胞に移した。３７℃で４時間後、５％ＣＯ₂、および３０％ウシ胎児血清を含む培地５０μｌを加えた。３日目に、１０％ウシ胎児血清を含む追加の培地１００ μｌを加え、４日目に、細胞を顕微鏡法により成育可能性について検査した。培地を除去することによってトランスフェクションを停止し、細胞を１００μｌリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。５０μｌリーシス緩衝液（Promega,水で５倍に希釈）を加えた後、細胞を少なくとも１５分間−８０℃に冷凍した。生成するルシフェラーゼの量を、Berthold LB 96 Pルミノメーターの速度論モードで９６穴マイクロタイタープレート(Berthold)でLuciferase Assay System（Prome ga）を用いて、リーシス溶液２０μｌで１分間測定した。結果ＰＥＧ−ＰＬ１０モル％を配合すると、培養したＡ５４９細胞での脂質−ＤＮＡ複合体のイン・ビトロでのトランスフェクション活性が完全にブロックされた（図７ＡおよびＢ）。この効果は、ＰＥＧ−ＰＬが、培養中のベクター複合体と細胞との効率的な接触を妨げることによるものかもしれない。従って、更に一層意外なことには、これらのベクターは、気管内（ｉ．ｔ．）または静脈内（ｉ．ｖ．）の投与経路のいずれによってもイン・ビボトランスフェクションが可能であることを見出だした（下記の結果を参照されたい）。実施例３：カチオン性脂質−核酸複合体のイン・ビボ投与方法マウスへの気管内投与：５〜６周齢のマウス（Ｃ５７Ｂｌａｃｋ／１０またはＢａｌｂ／ｃ）をケタミンを用いて麻酔し、様々な電荷比でカチオン性脂質に複合体形成したｐＣＭＶｌｕｃプラスミドＤＮＡ２５μｇを含む１２５μｌのベクター製剤を気管に投与した。複合体を押出しせず、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を含んでいなかった。４８時間後、マウスを屠殺し、気管、左および右肺を取り出し、液体窒素で冷凍させ、−７０℃で保存した。マウスへの静脈内投与：５〜６周齢のマウス（Ｃ５７Ｂｌａｃｋ／１０またはＢａｌｂ／ｃ）の尾静脈に４００μｌのベクター製剤を投与した。製剤は、様々な電荷比でカチオン性脂質に複合体形成した７５μｇのｐＣＭＶｌｕｃＤＮＡを含んでいた。７日後、器官（肺、心臓、脾臓、肝臓、骨格筋）を取り出し、液体Ｎ２で冷凍し、−７０℃で保存した。タンパク質抽出物の調製およびルシフェラーゼ活性の測定：ルシフェラーゼ抽出物は、文献記載の方法(Manihorpe，Human Gene Therapy 4:419-43，1993)により、下記の改質を加えて調製した。冷凍組織を、ドライアイスで予備冷却した乳鉢で粉砕した。粉末を１．５ｍｌのエッペンドルフ試験管に移し、液体Ｎ２および３７℃で３サイクルの凍結−融解を用いて５００μｌのReporter LysisBuffer （Promega）で抽出した。溶解産物を、室温でエッペンドルフ試験管中で１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を新しい試験管に移した。ペレットは、最終的にＤＮＡ抽出に用いた。抽出物を液体Ｎ２で冷凍し、−７０℃で保存した。タンパク質濃度は、Quantify Protein Assay System（Promega）で測定した。ルシフェラーゼ活性は、Berthold LB 96 Pルミノメーターの速度論モードで９６穴マイクロタイタープレート(Berthold)でLuciferase Assay System（Promega ）を用いて、抽出物の１０μｌ分量で測定した。ルシフェラーゼ活性を、器官試料、すなわち気管、左および右肺であって、投与を行ったマウスから取り出したものについて測定した。リポーターリーシス緩衝液(Promega)中でハイブリダイゼーションおよびリーシスを行った後、１０または２０μｌの分量を基質（Luci ferase Assay System，E1501，Promega）１００μｌと混合する。製造業者のプロトコールに従って、ルミノメーター上で１分間隔の読みを記録した。ルシフェラーゼ活性を、負の組織抽出物で希釈した精製酵素(Promega)で確立したルシフェラーゼ標準曲線を用いてＲＬＵ／ｍｇタンパク質またはｆｇルシフェラーゼ／ｍｇタンパク質として計算した。結果気管内投与：図８は、電荷比５：１でｐＣＭＶｌｕｃＤＮＡと複合体形成するのに用いた補助脂質ＤＯＰＥを用いて処方した様々なカチオン性脂質（ＤＣ−Ｃｈｏｌ、スペルミジン−ｃｈｏｌ、スペルミン−ｃｈｏｌ）を用いる実験をまとめている。カチオン性脂質：ＤＯＰＥの比は、重量で１：１である。この実験における脂質−ＤＮＡ複合体を調製し、複合体のトランスフェクション効率を減少させることがある大きな凝集体の形成を回避するため、直ちに試験動物にｉ．ｔ．投与した。ルシフェラーゼ活性は、ルシフェラーゼ遺伝子を含む組換えアデノウイルスをコントロールとして用いて、ｉ．t．投与から１、２および３日後に投与を行ったマウスから取り出した器官試料、すなわち気管、右および左肺について前に記載した方法で測定した。ルシフェラーゼ活性は、２４および４８時間後にＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥまたはスペルミン−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥと複合体形成したＤＮＡについて検出することができた。遊離ＤＮＡおよびこの実験においてスペルミジン−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥと複合体形成したＤＮＡについては、活性は見られなかった。添加剤を含む押出し複合体：次の組の実験では、画定された粒度と処方後に安定性が増加した脂質−ＤＮＡ処方物を試験した。このために、平均粒度が約２００ｎｍの粒子を生成する押出しによって、複合体を調製した。これらの処方物における脂質−ＤＮＡ複合体の１成分としてのＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００の添加も、試験した。スペルミジン−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥを、１０モル％ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００の存在下で、５：１の電荷比で２５μｇのｐＣＭＶｌｕｃと複合体形成した。カチオン性脂質：ＤＯＰＥの比は、重量で１：１であった。試料を、直接気管内投与により６周齢のＣ５７Ｂｌａｃｋ／１０マウスに投与するか、または投与前に押出しにより分粒した。４８時間後に、動物を屠殺し、それぞれの動物の気管（Ｔ）、左（ＰＧ）および右（ＰＤ）肺でルシフェラーゼ活性を測定した。図９は、スペルミジン−Ｃｈｏｌ／−ＤＯＰＥ−ｐＣＭＶｌｕｃ複合体をマウスに投与した後のルシフェラーゼ活性を示す。マウス１１には、２５μｇの遊離ｐＣＭＶｌｕｃＤＮＡを投与した。４８時間後に、ルシフェラーゼ活性は検出されなかった。マウス１３および１４には、押出しを行わなかった複合体を投与し、マウス１７、１８、１９および２０には、押出し後の複合体を投与した。気管で活性を示さなかったマウス１８を除き、総てのマウスの気管および肺について１０００〜７０００ＰＬＵ／ｍｇタンパク質の範囲のルシフェラーゼ活性が測定された。電荷比および安定化添加剤の効果：スペルミジン−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ−ｐＣＭＶｌｕｃ複合体の電荷比、およびこれらの複合体のＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００の濃度の影響も検討した。電荷比が５：１、２．５：１および１：１のスペルミジン−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ−ｐＣＭＶｌｕｃ複合体を調製した。それぞれの電荷比について、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を１０、５または２モル％まで加えた。Ｃ５７Ｂｌａｃｋ／１０マウスにｉ．ｔ．投与から４８時間後に、ルシフェラーゼ活性をこれらの動物の気管および肺で測定した。表１に、この実験の結果をまとめる。表１：電荷比およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００濃度のスペルミジン−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ−ｐＣＭＶｌｕｃ複合体のｉ．ｔ．活性に対する影響 ^*少なくとも２匹の独立したマウスの少なくとも３回の独立した測定のＲＬＵ／ｍｇタンパク質ＳＤ肺でのルシフェラーゼ活性を、電荷比が５：１の複合体を投与した後に測定した。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００が１０から２モル％に減少すると、この実験内ではルシフェラーゼ活性が増加した。より低い電荷比では、ルシフェラーゼ活性は、肺では最早検出されなかった。気管では、電荷が減少すると、ルシフェラーゼ活性は増加した。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００濃度は、この活性に影響を与えるものと思われる。これに対する一つの説明は、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００が、どの程度しっかりとＤＮＡがカチオン性脂質に結合されておりかつこれによって被覆されているかについてカチオン性脂質−ＤＮＡ複合体を不安定化することがあることである。この効果は、より低い電荷比については一層重要となる。この効果により、高電荷比を有する複合体だけが、肺細胞に到達してトランスフェクションを行うのに十分な安定性を有する。より低い電荷比では、複合体は不安定になり、投与部位に隣接する気管では細胞を効率的にトランスフェクションすることができるが、肺にまで十分深く浸透して、肺組織をトランスフェクションすることはない。静脈内投与：ｉ．ｖ．送達について処方物に対する様々な電荷比の影響およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００の存在を試験するため、７５μｇのｐＣＭＶｌｕｃＤＮＡを、１０％ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００の存在および非存在下で電荷比１：２、１：４および１：６でＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥと複合体形成し、４００μｌの容積でｉ．ｖ．投与した。カチオン性脂質：ＤＯＰＥの比は、重量で１：１であった。複合体は、押出しを行わなかった。ルシフェラーゼ活性を、肺、肝臓、心臓、骨格筋、および脾臓で７日後に測定した。結果を、図１０に示す。ルシフェラーゼ活性活性は、処方物当たり４匹の独立したマウスの群についてのＲＬＵ／ｍｇタンパク質＋／−（標準偏差）として示される。ルシフェラーゼ活性は、筋肉および脾臓には見ることはできない。電荷比１：４（８００μｇの総脂質（４００μｇＤＣ−Ｃｈｏｌ）：７５μｇＤＮＡおよび１：６（１２００：７５）については、低活性が心臓および肝臓に見られる。肺では、１：２（４００：７５）の電荷比＋１０％ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００で出発して、比較的高値が得られる。脂質対ＤＮＡの比をこれらの実験で変化させ、イン・ビボでのトランスフェクションに対するこのパラメーターの影響並びにＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００の存在を評価した。脂質の量の増加の根拠は、ＤＮＡがイン・ビボで一層安定であり、かつ一層正の電荷比により複合体の向性が改質されることであった。この実験から、電荷比が高くなれば、一層ばらつきのないトランスフェクションが得られると思われる。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００が含まれることにより、添加剤を含まない総ての製剤で形成された目に見える沈澱が防止されることも重要である。実施例４：カチオン性グリセロ脂質ｐｃＴＧ５６を含むカチオン性脂質−核酸複合体の調製Ａ．カチオン性グリセロ脂質ｐｃＴＧ５６の合成ｐｃＴＧ５６を、下記のプロトコールに従って調製した（図１５も参照されたい）。シアノ酸１アクリロニトリル（９．６ｍｌ，１４６ミリモル）を１，４−ジオキサン（５０ｍｌ）に溶解したものを、グリシン（１０．０ｇ，１３２ミリモル）と１Ｎ水酸化ナトリウム（１３３ｍｌ）を水および１，４−ジオキサン（２００ｍｌ）の１／１混合物に氷冷溶解したものに滴加した。反応を０℃で１時間攪拌し、室温で更に４時間攪拌した。次に、ジ第三ブチルジカーボネート（３５．０ｇ，１５９ミリモル）を１，４−ジオキサン（１００ｍｌ）に溶解したものを滴加し、反応混合物を室温で２時間攪拌した。エーテル（２×１００ｍｌ）で抽出した後、水相を１Ｎ塩酸で酸性にし、酢酸エチル（２×１００ｍｌ）で抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空濃縮した。シアノ酸１（２４．４ｇ，収率８１％）が白色固形生成物として得られ、これを更に精製することなく用いた。融点＝８７−８９℃。 ¹ＨＮＭＲ（２００ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ）：ｄ３．８８および３．８７（２Ｓ，２Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＯ₂Ｈ），３．４８および３．４５（２ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ，−ＣＨ₂−Ｎ（ＢＯＣ）−），２．５８および２．５６（２ｔ，Ｊ＝６．３，６．４Ｈｚ，２Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＮ），１．３０および１．２４（２ｓ，９Ｈ，ｔ−Ｂｕ−）。アミノ酸２シアノ酸１（１１．５ｇ，５０．４ミリモル）を水酸化ナトリウム（４．０４ｇ，１００ミリモル）を含むエタノール（１００ｍｌ）に溶解したものを、ラネーニッケル（３．２ｇ）の存在下にて、室温で１８時間水素化した。混合物をセライト上で慎重に濾過し、触媒をメタノール（２×３０ｍｌ）で洗浄した。濾液を１０％塩酸水溶液で酸性にし、真空濃縮して白色固形生成物を得て、これをクロロホルム（５０ｍｌ）に溶解して、塩化ナトリウムのほとんどを沈澱させた。濾過を行い、濾液を真空濃縮し、四塩化炭素中で再結晶した後、アミノ酸２（１０．４ｇ，８９％）を得た。融点＝２０１〜２０２℃。 ¹ＨＮＭＲ（２００ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ）：ｄ３．５３（Ｓ，２Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＯ₂Ｈ），３．１７（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ，−ＣＨ₂−Ｎ（ＢＯＣ）−），２．８３（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ，−ＣＨ₂−ＮＨ₂），１．６９（ｑｕｉｎｔ．，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ，−ＣＨ₂−），および１．２６および１．２１（２ｓ，９Ｈ，ｔ−Ｂｕ−）。シアノ酸３１についてと同様な処理により、２からシアノ酸３を得た。 ¹ＨＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）：ｄ４．００〜３．８５（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＯ₂Ｈ），３．５５〜３．４３（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＮ），３．３１（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，４Ｈ，−ＣＨ₂−Ｎ（ＢＯＣ）−），２．６１（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＮ），１．７８（ｑｕｉｎｔ．，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ，−ＣＨ₂−），１．４７および１．４４（２ｓ，１８Ｈ，ｔ−Ｂｕ−）。アミノ酸４アミノ酸４（収率８７％；シリカゲルカラム上でクロマトグラフィーにより精製，溶離剤：メタノール／ジクロロメタン３／７，次に６／４）を、アミノ酸２と同様な処理により、３から得た。融点＝１８９〜１９０℃。 ¹ＨＮＭＲ（２００ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ）：ｄ３．５７および３．５４（２Ｓ，２Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＯ₂Ｈ），３．２〜３．０（ｍ，６Ｈ，−ＣＨ₂−Ｎ（ＢＯＣ） −），２．８０（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ，−ＣＨ₂−ＮＨ₂），１．８０〜１．５０（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ₂−），１．２７および１．２２（２ｓ，１８Ｈ，ｔ −Ｂｕ−）。シアノ酸５１についてと同様な処理により、４からシアノ酸５を得た。 ¹ＨＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）：ｄ３．８５（ｂｒｓ，２Ｈ，− ＣＨ₂−ＣＯ₂Ｈ），３．４７（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＮ），３．３５〜３．０５（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ₂−Ｎ（ＢＯＣ）−），２．６０（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＮ），１．８５〜１．６Ｏ（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ₂−），１．４６および１．４４（２Ｓ，２７Ｈ，ｔ−Ｂｕ−）。アミノ酸６アミノ酸６（収率８３％；シリカゲルカラム上でクロマトグラフィーにより精製，溶離剤：メタノール／ジクロロメタン３／７，次に６／４）を、化合物２と同様な処理により、５から得た。 ¹ＨＮＭＲ（２００ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ）：ｄ３．７６および３．７３（２ｓ，２Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＯ₂Ｈ），３．２５〜２．７５（ｍ，１２Ｈ，−ＣＨ₂−Ｎ（ＢＯＣ）−および−ＣＨ₂−ＮＨ₂），１．８５〜１．５０（ｍ，６Ｈ，−ＣＨ₂− ），１．２８および１．２３（２Ｓ，２７Ｈ，ｔ−ＢＵ−）。シアノ酸７１についてと同様な処理により、６からシアノ酸７を得た。 ¹ＨＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）：ｄ３．９５および３．８７（２ｂｒｓ，２Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＯ₂Ｈ），３．４７（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ，− ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＮ），３．４０〜３．０５（ｍ，１２Ｈ，−ＣＨ₂−Ｎ（ＢＯＣ）−），２．６１（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＮ），１．９０〜１．６０（ｍ，６Ｈ，−ＣＨ₂−），１．４７および１．４４（３ｓ，３６Ｈ，ｔ−Ｂｕ−）。アミノ酸８アミノ酸８（収率７１％；シリカゲルカラム上でクロマトグラフィーにより精製，溶離剤：メタノール／ジクロロメタン１／９，次に３／７）を、化合物２と同様な処理により、７から得た。 ¹ＨＮＭＲ（２００ＭＨｚ，Ｄ₂Ｏ）：ｄ３．７６および３．７３（２Ｓ，２Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＯ₂Ｈ），３．２５〜２．７５（ｍ，１２Ｈ，−ＣＨ₂−Ｎ（ＢＯＣ）−および−ＣＨ₂−ＮＨ₂），１．８５〜１．５０（ｍ，６Ｈ，−ＣＨ₂− ），１．２８および１．２３（２ｓ，２７Ｈ，ｔ−Ｂｕ−）。酸９ＣＨ₂Ｃｌ₂（５ｍｌ）に溶解したジ第三ブチルジカーボネート（１．１９ｇ，５．４５ミリモル）を、化合物８（３．２０ｇ，４．５５ミリモル）およびトリエチルアミン（０．９５ｍｌ，６．８３ミリモル）をＣＨ₂Ｃｌ₂（４５ｍｌ）に溶解したものに加えた。混合物を室温で１６時間攪拌した後、５％ＨＣｌで酸性にしてｐＨ３とし、ＣＨ₂Ｃｌ₂（３０ｍｌ）で抽出した。有機相を水（２０ｍｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濃縮して無色油状生成物を得て、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（メタノール／ジクロロメタン５／９５、次いで１０／９０）によって精製し、化合物９（３．３７ｇ，９２％）を得た。 ¹ＨＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）：ｄ３．８５（２Ｓ，２Ｈ，−ＣＨ₂ −ＣＯ₂Ｈ），３．４５〜３．０５（ｍ，１６Ｈ，−ＣＨ₂−Ｎ（ＢＯＣ）−），１．８５〜１．６０（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ₂−），１．４５，１．４４および１．４３（３ｓ，３６Ｈ，ｔ−Ｂｕ）。エステル１０ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．５３ｇ，２．５９ミリモル）を乾燥ジクロロメタン（１ｍｌ）に溶解したものを、酸９（１．６０ｇ，１．９９ミリモル）、（Ｓ）−（＋）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４−メタノール（０．３４ｇ，２．５９ミリモル）および４−（ジメチルアミノ）ピリジン（２４ｍｇ，０．２ミリモル）を乾燥ジクロロメタン（４ｍｌ）に溶解したものに加えた。反応混合物を、室温で１６時間攪拌した。次いで、ジシクロヘキシル尿素の沈澱を濾去し、濾液を真空濃縮し、シリカゲルカラム上でクロマトグラフィー（溶離剤：エーテル／ヘキサン５／５、次いで６／４）処理を行い、エステル１０（１．７３ｇ，９５％）を得た。 ¹ＨＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）：ｄ４．３５〜４．０４（ｍ，４Ｈ），３．９９〜３．９２（２ｓ，２Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＯ），３．７４（ｍ，１Ｈ），３．３０〜３．００（ｍ，１６Ｈ，−ＣＨ₂−Ｎ（ＢＯＣ）−），１．８５〜１．５５（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ₂−），１．４６，１．４５，１．４４および１．４２（４ｓ，４８Ｈ，ｔ−ＢｕおよびＭｅ−），１．３６（ｓ，３Ｈ，Ｍｅ− ）。ジヒドロキシエステル１１エステル１０（１．５５ｇ，１．６９ミリモル）および１Ｎ塩酸（０．６８ｍｌ）をメタノール（２９ｍｌ）に溶解したものを、室温で１６時間攪拌した。次に、トリエチルアミン（１ｍｌ）を溶液に加えて、中性とした。真空留去およびシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離剤：メタノール／ジクロロメタン５／９５）により、ジヒドロキシエステル１１（１．２３ｇ，８３％）を無色油状生成物として得た。 ¹ＨＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）：ｄ４．２５（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ₂ −ＯＣＯ−），４．００〜３．４０（ｍ，５Ｈ，ＣＨ−ＯＨ，−ＣＨ₂ＯＨおよび−ＣＨ₂−ＣＯ₂−），３．４０〜３．００（ｍ，１１６Ｈ，−ＣＨ₂−Ｎ（ＢＯＣ）−），１．９０〜１．６（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ₂−），１．４６，１．４５，１．４４および１．４２（４ｓ，４５Ｈ，ｔ−Ｂｕ−）。トリエステル１２ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．７１ｇ，３．４２ミリモル）を乾燥ジクロロメタン（１ｍｌ）に溶解したものを、ジヒドロキシエステル１１（１．００ｇ，１．１４ミリモル）、オレイン酸（０．９７ｇ，３．４２ミリモル）および４−（ジメチルアミノ）ピリジン（１４ｍｇ，０．１１ミリモル）を乾燥ジクロロメタン（３ｍｌ）に溶解したものに加えた。反応混合物を、室温で１６時間攪拌した。次いで、ジシクロヘキシル尿素の沈澱を濾去し、濾液を真空濃縮し、シリカゲルカラム上でクロマトグラフィー（溶離剤：エーテル／ヘキサン４／６）処理を行い、無色油状生成物としてトリエステル１２（７５４ｍｇ，４７％）を得た。 ¹ＨＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）：ｄ５．３４（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ＝），５．２６（ｍ，１Ｈ，ＣＨ−ＯＣＯ−），４．４０〜４．０５（ｍ，４Ｈ， −ＣＨ₂ＯＣＯ−），３．９５および３．８９（２ｍ，２Ｈ，−Ｎ（ＢＯＣ）− ＣＨ₂−ＣＯ₂−），３．３５〜３．００（ｍ，１６Ｈ，−ＣＨ₂−Ｎ（ＢＯＣ） −），２．３１（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＯ₂−），２．０１（ｍ，８Ｈ，アリルＨ），１．８５〜１．５０（ｍ，１２Ｈ，−ＣＨ₂−），１．４６，１．４４，１．４３および１．４１（４ｓ，４５Ｈ，ｔ−Ｂｕ−），１．３０および１．２７（２ｂｒｓ，４４Ｈ，−ＣＨ₂），０．８８（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，６Ｈ，Ｍｅ−）。カチオン性グリセロ脂質ｐｃＴＧ５６トリエステル１２（０．５２ｇ，０．３７ミリモル）を乾燥ジクロロメタン（１ｍｌ）に溶解したものを、トリフルオロ酢酸と乾燥ジクロロメタンとの１／１混合物（７４ｍｌ）で０℃で３時間処理した。次に、ヘキサン（１００ｍｌ）を加え、混合物を真空留去したところ、薄膜が残り、これを蒸留エーテルに懸濁（攪拌）した。濾過により、白色粉末を得て、これをエーテルで洗浄し、真空乾燥し、脂質１３（５１０ｍｇ，９３％）を得た。 ¹ＨＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃−ＣＦ₃ＣＯ₂Ｄ）：ｄ５．３６（ｍ，５Ｈ，−ＣＨ＝およびＣＨ−ＯＣＯ−），４．６０〜４．１５（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＯＣＯ−），４．００（ｓ，２Ｈ，−ＮＨ₂ ⁺−ＣＨ₂−ＣＯ₂−），３．４５〜３．１０（ｍ，１６Ｈ，−ＣＨ₂−ＮＨ₂ ⁺−），２．４１（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＯ₂−），２．２８（ｍ，８Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ₂ ⁺ −），２．０１（ｍ，８Ｈ，アリルＨ），１．６１（ｍ，４Ｈ，−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｃ０₂−），１．３０および１．２７（２ｓ，４４Ｈ，−ＣＨ₂−），０．８７（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，６Ｈ，Ｍｅ−）。Ｂ．ｐｃＴＧ５６を含むＤＮＡ−脂質複合体の処方ＤＮＡ−脂質複合体を、電荷比５（カチオン性脂質が有する正電荷とＤＮＡが有する負電荷との比）の０．５または１ｍｇ／ｍｌＤＮＡの最終濃度で、等モル量のジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を用いて調製した。添加するカチオン性脂質の量は、その分子量、分子当たりの正電荷の数、および所望な電荷比に基づいて決定した。一例として、電荷比５およびＤＮＡ最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌでｐｃＴＧ５６／ＤＯＰＥの複合体を得るには、下記の計算を適用する。０．５ｍｇ／ｍｌＤＮＡは、０．５／３３０ミリモル／ｍｌの濃度＝１．５ミリモル／ｍｌ負電荷（３３０Ｄａをヌクレオチドの平均分子量とする）に相当する。電荷比５で複合体を得るには、正電荷の濃度は、７．５ミリモル／ｍｌ（トリフルオロ酢酸塩の形態でのｐｃＴＧ５６の分子量：１４７６ｇ／モル；５正電荷／分子）または１．５ミリモル／ｍｌｐｃＴＧ５６（２．２ｍｇ／ｍｌ）でなければならない。等モル濃度を得るため、ＤＯＰＥ１．５ミリモルを加えた（分子量：７４４ｇ／モル；最終濃度１．１ｍｇ／ｍｌ）。平均分子量が５０００Ｄａのポリエチレングリコール（ＰＥＧ５０００）にカップリングしたジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）（Avanti Polar Lipids，アラバスター，アラバマ，米国；Ref．880220）（平均分子量を５７５０ｇ／モルとした）を加えて、脂質の総量に関して所要最終濃度２、５または１０モル％を得た。脂質を、クロロホルム／メタノール（１／１）中でそれぞれの溶液から混合した。脂質溶液を、攪拌（４０回転／分）（Labconco，Rapidvap，Uniequip，マルチンスリード，ドイツ国）しながら乾燥し（２００ミリバール，４５℃，４５分）、脂質フィルムをジメチルスルホキシド（ＤＭＳ０）／エタノール（１／１）に吸収させた。例えば、ｐｃＴＧ５６２．２ｍｇとＤＯＰＥ１．１ｍｇを、４５ｍｌのジメチルスルホキシド／エタノールに吸収させた。２０ｍＭの（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］）（ＨＥＰＥＳ），ｐＨ７．５１７５ｍｌを加え、カチオン性脂質の最終濃度を１０ｍｇ／ｍｌとした。プラスミドＤＮＡ（ｐＴＧ１１０３３；１ｍｇ／ｍｌ１０ｍＭ（トリス）［ヒドロキシメチル］アミノメタン）（Ｔｒｉｓ），１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ），ｐＨ７．５）５００ｍｌを、２０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５２８０ｍｌで希釈した。上記の脂質懸濁液２２０ｍｌを、迅速吸引−ピペッティング（１０回）によってこの溶液に加え、ＤＮＡ濃度０．５ｍｇ／ｍｌおよび電荷比５の最終複合体１ｍｌを得た。１ｍｇ／ｍｌのＤＮＡのＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００を含むおよび含まない製剤を、ＤＮＡ、脂質および安定剤の量を相応して調節することによって同じ方法を用いて再構成した。得られた脂質−ＤＮＡ複合体を、４℃で保存した。結果カチオン性脂質核酸複合体の粒度を光子相関分光分析法によって測定し、規格化された平均重量値として示す（実施例１を参照されたい）。表２に、この実験の結果をまとめる。表２：ＤＮＡ濃度およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００の百分率の粒度安定性に対する影響上記の結果は、ａ）脂質−ＤＮＡ複合体は、高濃度のＤＮＡ（１ｍｇ／ｍｌ）（以前は０．２ｍｇ／ｍｌ）で形成することができ、ｂ）ＤＳＰＥ−ＰＥＧは、カチオン性グリセロ脂質（ｐｃＴＧ５６）のような他の構造の種類の脂質と適合性であり、ｃ）ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００をＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００の代わりに用いることができる点で以前の知見を敷衍するものである。更に、本発明の方法は、ＤＭＳＯのような他の添加剤と適合性であり、イン・ビボでの遺伝子トランスファーを増加させることができることを示している。

Claims

【特許請求の範囲】１．ａ）１種類以上のカチオン性脂質、１種類以上の補助脂質、および１種類以上の安定化添加剤を組合せて脂質懸濁液を形成し、ｂ）脂質懸濁液を核酸と組合せて複合体または粒子を形成し、場合によっては、ｃ）複合体または粒子に整粒処理を施すことを含んでなる、安定な脂質−核酸複合体または粒子の均質な懸濁液の製造法。２．脂質懸濁液に整粒処理を施し、均質な粒度の粒子の懸濁液が形成されるようにする段階をも含んでなる、請求項１に記載の方法。３．方法が、段階ｃ）を含んでなり、整粒処理が脂質−核酸複合体または粒子の押出しを含んでなる、請求項１または２に記載の方法。４．脂質−核酸複合体または粒子を、細孔度が５０〜５００ｎｍの範囲である膜を通して押出す、請求項３に記載の方法。５．均質に整粒した懸濁液の脂質−核酸複合体または粒子の粒度が５００ｎｍ以下である、請求項１に記載の方法。６．均質に整粒した懸濁液の脂質−核酸複合体または粒子の粒度が２００ｎｍ以下である、請求項１に記載の方法。７．カチオン性脂質または脂質類が、スペルミジン−コレステロール、スペルミン−コレステロール、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン） −カルバモイル］コレステロール、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。８．補助脂質が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである、請求項１に記載の方法。９．安定化添加剤が、脂質核酸複合体に配合することができる残基にカップリングしたポリエチレングリコールである、請求項１に記載の方法。１０．安定化添加剤が、複合体に配合することができる残基にカップリングした過フッ化または部分フッ素化アルキル鎖からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。１１．安定化添加剤が、複合体に配合することができる残基にカップリングしたポリグルクロン酸である、請求項１に記載の方法。１２．安定化添加剤が、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン− ポリエチレングリコールである、請求項１に記載の方法。１３．残基がリン脂質である、請求項９に記載の方法。１４．残基が双性イオン性リン脂質である、請求項１３に記載の方法。１５．核酸が、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、リボチーム、アンチセンスＲＮＡ、およびオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。１６．核酸がプラスミドを含んでなる、請求項１５に記載の方法。１７．ａ）１種類以上のカチオン性脂質、１種類以上の補助脂質、および１種類以上の安定化添加剤を組合せて脂質懸濁液を形成し、ｂ）脂質懸濁液を核酸と組合せて複合体または粒子を形成し、場合によっては、ｃ）複合体または粒子に整粒処理を施すことによって製造される、安定な脂質−核酸複合体または粒子の均質な懸濁液。１８．脂質懸濁液に更に整粒処理を施して、均質な粒度の粒子の懸濁液が生成するようにする、請求項１７に記載の懸濁液。１９．段階ｃ）の整粒処理と追加の整粒処理都が、脂質−核酸複合体または粒子の押出しを含んでなる、請求項１７または１８に記載の懸濁液。２０．カチオン性脂質が、カチオン性脂質の混合物を包含する、請求項１７に記載の懸濁液。２１．均質に整粒した懸濁液の複合体または粒子の粒度が５００ｎｍ以下である、請求項１７に記載の懸濁液。２２．均質に整粒した懸濁液の複合体または粒子の粒度が２００ｎｍ以下である、請求項１７に記載の懸濁液。２３．１種類以上のカチオン性脂質、１種類以上の補助脂質、１種類以上の安定化添加剤、および核酸成分を含んでなる、脂質核酸複合体。２４．複合体の粒度が５００ｎｍ以下である、請求項２３に記載の複合体。２５．複合体の粒度が２００ｎｍ以下である、請求項２３に記載の複合体。２６．請求項１７に記載の懸濁液と薬学上許容可能なキャリヤーとを含んでなる、組成物。２７．請求項２３に記載の複合体と薬学上許容可能なキャリヤーとを含んでなる、組成物。２８．請求項２６または２７に記載の組成物を核酸を必要とするヒトの細胞へ投与することを含んでなる、核酸を必要とするヒトへの核酸の送達法。２９．核酸が、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、リボチーム、アンチセンスＲＮＡ、およびオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。３０．核酸がプラスミドを含んでなる、請求項２９に記載の方法。