JP2000516808A - Ｍｈｃ結合ペプチドオリゴマーおよび使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 可撓性分子リンカーにより結合された少なくとも２個のMHC結合ペプチドを含むオリゴマーを開示する。MHC結合ペプチドは、MHCクラスＩ結合ペプチドまたはMHCクラスII結合ペプチドであり得る。このようなオリゴマーを生成するために方向付けられたクローニング方法もまた開示される。開示されたオリゴマーは、例えば、CD4⁺T細胞またはCD8⁺T細胞を特異的に活性化するか、またはその活性化を阻害するための方法に関連して使用され得る。このような方法は、肺瘍、自己免疫障害、同種移植拒絶、およびアレルギー反応の処置のための治療的アプローチを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 MHC 結合ペプチドオリゴマーおよび使用方法 発明の分野 本発明は、免疫学の分野、より詳細には、免疫学的応答の調節、免疫学的障害 、同種移植拒絶、および腫瘍治療の処置、ならびに免疫学的応答に基づく、診断 アッセイおよびインビトロアッセイに関する。さらに、本発明は、前述における 使用のための試薬および薬学的調製物に関する。 発明の背景 いくつかの研究は、エフェクターＴ細胞上でのＴ細胞レセプターのダイマー化 またはオリゴマー化とともに、抗原提示細胞（APC）上でのクラスII MHC／ペプ チドの、およびクラスＩ MHC／ペプチド複合体のダイマー化またはオリゴマー化 が、有効な免疫応答における必須の工程であること（すなわち、有効なMHC／ペ プチド-TCR複合体は、クラスターまたは凝集体であること）を示唆してきた。こ れらのデータは、(i)Ｔ細胞レセプターまたはMHC分子を認識する二価の抗体によ るが、一価の抗体によらない、Ｔ細胞またはAPCのいずれかの活性化；(ii)クラ スII拘束TCRと相互作用するCD4のドミナントネガティブ変異体の構築、この効果 は、オリゴマー化仮説により最も容易に解釈される；(iii)MHC分子の少なくとも ２個の面が機能的単位に含まれなければならないことを示唆するクラスII MHC分 子の変異体；(iv)クラスＩ MHC／ペプチド複合体（しかしモノマーではないのダ イマー化）が、Ｔ細胞ハイブリドーマを活性化し得ることの直接証明；および(v )この物質がヘテロダイマーのダイマーとして結晶化することを明らかにしたク ラスII MHCヘテロダイマーの構造研究、ならびにこれもまたダイマーとして結晶 化したTCRのＶαドメインの類似の研究（両方の研究は、どのようにしてダイマ ー化が達成され得るかの構造モデルをもたらした（しかし、結晶化したダイマー が生理学的に適切であるか、または結晶学的人工物（artifact）であるか否かに ついてを示す証拠はいずれの場合も入手可能ではない））を含む。さらに、ク ラスII MHC分子に結合したペプチドの研究は、いくつかの場合には、これらが非 常に大きく、そしてクラスII MHC分子のペプチド結合溝の両端から突き出さなけ ればならないこと（結晶学的研究により決定的に樹立された事実）を示した。こ の構造的特徴は、オリゴマー結合により誘導される凝集が生理学的に適切である か否かを決定するために、MHCクラスII結合ペプチドを連結する機会を提供する 。 発明の要旨 本発明は、可撓性分子リンカーにより結合された、少なくとも２個のMHC結合 ペプチドを含むオリゴマーに関する。MHC結合ペプチドは、MHCクラスＩ結合ペプ チドまたはMHCクラスII結合ペプチドであり得る。好ましい実施態様では、本発 明のMHC結合ペプチドオリゴマーは、少なくとも４個、８個、16個のMHC結合ペプ チドを含む。いくつかの実施態様では、MHC結合ペプチドオリゴマーは、32個以 上のMHC結合ペプチドを含み得る。 MHCクラスＩ結合ペプチドオリゴマーの場合、結合ペプチドは、合成手段によ りＣ末端からＣ末端へと共有結合される。それゆえ、オリゴマーは、実質的に直 鎖状の可撓性分子リンカーにより結合された２個のみのMHC結合ペプチドからな り得るか、または分枝状の可撓性分子リンカーにより結合された２個より多くの MHC結合ペプチドからなり得る。このような可撓性分子リンカーは、合成化学技 術により生成され得る。 MHCクラスII結合ペプチドオリゴマーの場合、結合ペプチドは、生合成技術ま たは合成化学技術のいずれかによりＮ末端からＣ末端へと共有結合され得る。生 合成により生成されるリンカーの場合、リンカーは、天然に存在するアミノ酸を 含み、そして本明細書中に記載される組換えDNAベクターを用いて生成され得る 。従って、別の局面では、本発明はまた、このようなオリゴマーを生成するため の方向付けされたクローニング方法に関する。MHCクラスII結合ペプチドオリゴ マーはまた、Ｎ末端からＮ末端へと、またはＣ末端からＣ末端へと、合成化学技 術により共有結合され得る。このような可撓性分子リンカーはまた、分枝状また は非分枝状であり得る。 いくつかの実施態様では、本発明の可撓性分子リンカーは、好ましくは、少な くとも約50〜80Åのバックボーン長を有し、そして少なくとも約540Å以上のバ ックボーン長を有し得る。可撓性分子リンカーがアミノ酸残基を含む場合、これ らは好ましくは、少なくとも約10〜20アミノ酸残基を含み、そして少なくとも約 125以上のアミノ酸残基を含み得る。 別の局面では、可撓性分子リンカーが合成化学技術により生成される場合、こ れらは、有機酸、アルデヒド、アルコール、チオール、および／もしくはアミン のポリマーまたはコポリマー；ヒドロキシ-、アミノ-、および／もしくはジ-カ ルボン酸のポリマーまたはコポリマー（例えば、グリコール酸、乳酸、セバシン 酸、および／またはサルコシンのポリマーまたはコポリマー）；飽和もしくは不 飽和の炭化水素のポリマーまたはコポリマー（例えば、エチレングリコール、プ ロピレングリコール、またはサッカライドのポリマーまたはコポリマー）；天然 に存在するアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸（例えば、サルコシンおよ びβ-アラニン）のポリマーまたはコポリマーなどを含み得る。 本発明のオリゴマーは、例えば、CD4⁺T細胞またはCD8⁺T細胞を特異的に活性化 するかまたはその活性化を阻害するための方法に関連して用いられ得る。このよ うな方法は、例えば、腫瘍、自己免疫障害、同種移植拒絶、およびアレルギー反 応の処置のための治療的アプローチを示す。 従って、１つの局面では、本発明は、所定のMHCクラスＩ分子とともに所定の 抗原性ペプチドを提示する細胞に対してCD8⁺T細胞を特異的に活性化するための 方法を提供する。この方法は、生理学的条件下で、MHCクラスＩ分子を有する細 胞を、可撓性分子リンカーにより共有結合された少なくとも２個の作用性MHCク ラスＩ結合ペプチドを含むMHC結合ペプチドオリゴマーと接触させることによっ ており、ここで、MHCクラスＩ結合ペプチドは、所定の抗原性ペプチドに対応す る。 別の局面では、本発明は、所定のMHCクラスＩ分子とともに所定の抗原性ペプ チドを提示する細胞によるCD8⁺T細胞の活性化を特異的に阻害するための方法を 提供する。この方法は、生理学的条件下で、MHCクラスＩ分子を有する細胞を、 可撓性分子リンカーにより共有結合された少なくとも２個の非作用性MHCクラス Ｉ結合ペプチドを含むMHC結合ペプチドオリゴマーと接触させることによってお り、ここで、MHCクラスＩ結合ペプチドは、所定の抗原性ペプチドに対応する。 この方法では、非作用性ペプチドは、拮抗性ペプチド、不応答性ペプチド、ブロ ッキングペプチド、寛容化誘導ペプチド、およびアポトーシス誘導ペプチドから 選択される。 別の局面では、本発明は、所定のMHCクラスII分子とともに所定の抗原性ペプ チドを提示する細胞に対してCD4⁺T細胞を活性化するための方法を提供する。こ の方法は、生理学的条件下で、MHCクラスII分子をその細胞表面上に有する細胞 を、可撓性分子リンカーにより共有結合された少なくとも２個の作用性MHCクラ スII結合ペプチドを含むMHC結合ペプチドオリゴマーと接触させることによって おり、ここで、MHCクラスII結合ペプチドは、所定の抗原性ペプチドに対応する 。 別の局面では、本発明は、所定のMHCクラスII分子とともに所定の抗原性ペプ チドを提示する細胞に対してCD4⁺T細胞の活性化を特異的に阻害するための方法 を提供する。この方法は、生理学的条件下で、MHCクラスII分子をその細胞表面 上に有する細胞を、可撓性分子リンカーにより共有結合された少なくとも２個の 非作用性MHCクラスII結合ペプチドを含むMHC結合ペプチドオリゴマーと接触させ ることによる。これらのペプチドは、拮抗性ペプチド、不応答性ペプチド、ブロ ッキングペプチド、寛容化誘導ペプチド、およびアポトーシス誘導ペプチドから 選択され得る。 別の局面では、所定の病原体に対する遺伝的免疫のための方法が提供される。 この方法は、哺乳動物細胞において複製および発現し得る発現ベクター中の、病 原体由来の、かつ可撓性分子リンカーにより共有結合された少なくとも２個の免 疫原性MHC結合ペプチドを含むMHC結合ペプチドオリゴマーをコードするDNA配列 を、哺乳動物の細胞中に導入することによる。 別の局面では、本発明は、個体から腫瘍細胞を除去するための方法を提供する 。この方法は、生理学的条件下で、MHC分子をその細胞表面上に有する細胞を、 可撓性分子リンカーにより共有結合された、少なくとも２個の作用性の腫瘍特異 的MHC結合ペプチドを含むMHC結合ペプチドオリゴマーと接触させることによる。 この方法では、MHC分子は、MHCクラスＩ分子またはMHCクラスII分子であり得る 。 別の局面では、本発明は、所定のMHC分子とともに所定の抗原性ペプチドによ るＴ細胞の活性化を特異的に阻害するための方法を提供する。この方法は、生理 学的条件下で、MHC分子をその細胞表面上に有する細胞を、可撓性分子リンカー により共有結合された、少なくとも２個の抗原性ペプチドを含むMHC結合ペプチ ドオリゴマーと、大量域寛容の誘導に十分な濃度で接触させることによる。この 方法では、Ｔ細胞は、CD4⁺またはCD8⁺であり得る。 別の局面では、本発明は、免疫調節性組成物を製造するための方法を提供する 。この方法は、MHC結合ペプチドを同定すること、および可撓性分子リンカーに より共有結合された、少なくとも２コピーのMHC結合ペプチドを含むMHC結合ペプ チドオリゴマーを調製することによる。 特に好ましい実施熊様では、本発明のMHC結合ペプチドは、多発性硬化症の処 置のためのミエリン塩基性タンパク質（MBP）またはプロテオリピドタンパク質 （PLP）、重症筋無力症の処置のためのAChRα、慢性関節リウマチの処置のため のコラーゲンII型またはHSP70タンパク質、またはインスリン依存性糖尿病（IDD M）の処置のためのグルタミン酸デカルボシキシラーゼに由来するヒトの自己免 疫原性ペプチドを含む。 図面の簡単な説明 図１は、方向付けされたモジュールのクローニング方法を例示する模式図であ る。 図２は、方向付けされたモジュールのクローニング方法に関連して有用である 制限部位の交換可能な対を例示する模式図である。 図３は、方向付けされたモジュールのクローニング方法における増幅工程を例 示する模式図である。 図４は、方向付けされたモジュールのクローニング方法における増幅されたモ ジュールの解離およびさらなる伸長を例示する模式図である。 図５は、MHC結合ペプチドオリゴマーの模式図である。 図６は、連結部オリゴヌクレオチドの模式図である。 図７は、MHC結合ペプチドオリゴマーの構築において用いられる２個のオリゴ ヌクレオチド単位の模式図である。 発明の詳細な説明 本発明は、個体における免疫応答を調節するための組成物および方法に関する 。詳細には、本発明は、１つ以上の可撓性分子リンカーによって結合されたクラ スI MHCまたはクラスII MHC結合ペプチドを含むオリゴマーが、MHC結合ペプチド の単量体と比較した場合、免疫応答を調節する有意に増大した能力によって特徴 づけられるという知見に一部基づく。 定義。 請求される発明の主題をより明瞭かつ簡潔に記載および指摘するために、以下 の定義が、以下の説明および本明細書に添付される請求の範囲において使用され る特定の用語について提供される。 本明細書中で使用される用語「MHC分子」は、MHCクラスI分子および／またはM HCクラスII分子を意味する。 本明細書中で使用される用語「MHCクラスI」または「クラスI」は、ヒト主要 組織適合複合体クラスI分子、結合ペプチドまたは遺伝子をいう。HLAとしてもま たいわれるヒトMHC領域は、第６染色体上に見出され、そしてクラスI領域および クラスII領域を含む。MHCクラスI領域内には、クラスIα鎖遺伝子についてのHLA -A、HLA-B、またはHLA-Cサブ領域が見出されている。β₂ミクログロブリンにつ いてのヒト遺伝子は、別々の染色体上のMHC複合体の外側に位置する。本明細書 中で使用される用語「MHCクラスI分子」は、MHCクラスIα鎖およびβ₂ミクログ ロブリン鎖の複合体を意味する。MHCクラスI分子は、普通はサイトゾルにおいて 生成され、そして小胞体へ輸送されるペプチドを結合する。これらのペプチドの 結合の後、クラスI MHCペプチド複合体は、細胞表面に提示され、ここでクラスI MHCペプチド複合体はＴ細胞によって認識され得る。大多数の結合ペプチドは、 ８〜10アミノ酸の長さを有するが、それらは16のように長くてもよいし、または ２のように短くてもよい(Udakaら，(1993)Proc ．Natl．Acad．of Scl.(USA)90:1 1272-11276)。一般的には、Roittら編，Immunology(1989)Gower Medical Publi shing，Londonを参照のこと。 本明細書中で使用される用語「MHCクラスII」または「クラスII」は、ヒト主 要組織適合複合体クラスII分子、結合ペプチドまたは遺伝子をいう。HLAとして もまたいわれるヒトMHC領域は、第６染色体上に見出され、そしてクラスI領域お よびクラスII領域を含む。MHCクラスII領域内には、クラスIIα鎖およびβ鎖遺 伝子（すなわち、DPα、DPβ、DQα、DQβ、DRα、およびDRβ）についてのDP、 DQ、またはDRサブ領域が見出されている。本明細書中で使用される用語「MHCク ラスII分子」は、MHCクラスIIα鎖およびMHCクラスIIβ鎖の複合体を意味する。 MHCクラスII分子は、普通は、細胞内プロセシング区画においてペプチドに結合 し、そしてそれらのペプチドを抗原提示細胞の表面上でＴ細胞に対して提示する 。大多数の結合ペプチドは、13〜18アミノ酸の長さを有するが、MHCクラスII結 合裂け目(cleft)のポケットを占有し、そして結合の特異性を決定する約９アミ ノ酸のコアセグメントのペプチド側鎖である(Brownら，(1993)Nature 364:33-39 ;Sternら，(1994)Nature 368:215-221)。一般的には、Roittら編，Immunology(1 989)Gower Medical Publishing，Londonを参照のこと。 本明細書中で使用される用語「MHC結合ペプチド」または「結合ペプチド」は 、MHCクラスI結合ペプチドおよび／またはMHCクラスII結合ペプチドを意味する 。 本明細書中で使用される用語「MHCクラスI結合ペプチド」は、特定のMHCクラ スI分子のαおよびβ₂ミクログロブリン鎖によって形成される裂け目内に選択的 に結合してMHCクラスIペプチド抗原複合体を形成し得るポリペプチドを意味する 。MHCクラスI結合ペプチドは、プロセシングされた自己ペプチドもしくは非自己 ペプチドであり得るか、または合成ペプチドであり得る。クラスI MHC分子につ いて、ペプチドは、代表的には８〜10アミノ酸の長さであるが、それらは16のよ うに長くてもよいし、または２のように短くてもよい。詳細には、本発明のオリ ゴマーは、可撓性分子リンカーによって結合されたMHC結合ペプチドを含むので 、オリゴマーのMHC結合部分は、MHCクラス結合裂け目を占有する約８〜10アミノ 酸のコアセグメントのみを含み得る。 本明細書中で使用される用語「MHCクラスII結合ペプチド」は、特定のMHCクラ スII分子のα鎖およびβ鎖によって形成される裂け目内に選択的に結合してMHC クラスIIペプチド抗原複合体を形成し得るポリペプチドを意味する。MHCクラスI I結合ペプチドは、プロセシングされた自己ペプチドもしくは非自己ペプチドで あり得るか、または合成ペプチドであり得る。クラスII MHC分子について、ペプ チドは、代表的には10〜25アミノ酸の長さであり、より代表的には13〜18残基の 長さであるが、より長いペプチドおよびより短いペプチドは有効に結合し得る。 詳細には、本発明のオリゴマーは、可撓性分子リンカーによって結合されたMHC 結合ペプチドを含むので、オリゴマーのMHC結合部分は、MHCクラス結合裂け目を 占有する約９アミノ酸のコアセグメントのみを含み得る。 MHC結合ペプチドに関して本明細書中で使用される「オリゴマー」は、必要に 応じて可撓性分子リンカーによって共有結合される少なくとも２個のMHC結合ペ プチドを含む分子を意味する。好ましくは、本発明のオリゴマーは、共有結合さ れた、少なくとも２〜４個のMHC結合ペプチドを含み、より好ましくは少なくと も４〜16個のMHC結合ペプチドを含み、そして最も好ましくは４〜32個のMHC結合 ペプチドを含む。必要に応じて、好ましくは、MHC結合ペプチドは、MHC結合ペプ チド間に挿入される可撓性分子リンカーによって共有結合される。 本明細書中で使用される用語「可撓性分子リンカー」または「リンカー」は、 隣接するMHC結合ペプチド間で連続的接続を形成している化学的結合の骨格を有 し、そしてその骨格に沿って自由に回転する複数の結合を有する、２個のMHC結 合ペプチドを共有結合する化学的部分を意味する。好ましい実施態様において、 本発明の可撓性分子リンカーは、少なくとも約50〜60Åの骨格の長さ（すなわち 、MHC結合ペプチド間で連続的接続を形成している結合の長さの合計）を有する 。好ましくは、可撓性分子リンカーは、複数のアミノ酸残基を含むが、これは場 合によっては必要ない。 本明細書中で使用される用語「選択的に結合する」は、抗原に対する抗体、ま たはレセプターに対するリガンドの電気特異的および立体特異的様式で結合し得 ることを意味する。MHC結合ペプチドに関して、選択的に結合することは、MHCペ プチド複合体を形成するために、MHC結合裂け目に存在する結合ポケット内のペ プチドの特定の側鎖の非共有結合を必要とする(例えば、Brownら，(1993)Nature 364:33-39;Sternら，(1994)Nature 368:215-221;SternおよびWlley(1992)C ell 68:465-477を参照のこと)。 本明細書中で使用される用語「実質的に純粋」は、本発明のMHC結合ペプチド およびオリゴマーに関して、これらの分子が、それらの意図される使用のために 実用的かつ適切な程度で他の物質を本質的に含まないことを意味する。詳細には 、分子は、例えば特定の免疫応答の調節または薬学的調製物の製造に有用である ために十分に純粋で、そして他の全ての生物学的成分または免疫原性成分を十分 に含まない。本発明のオリゴマーの実質的に純粋な調製物は、他の全てのタンパ ク質または分子を絶対に含まないという必要はなく、そして投与の目的では比較 的希薄であり得る。従って、例えばオリゴマーは、種々の緩衝剤、賦形剤、また はアジュバントを含む溶液中に存在し得る。当業者は、そのような実質的に純粋 な調製物を、HPLC、親和性クロマトグラフィー、または電気泳動的分離を含むが これらに限定されない周知の方法の適用または連続的な適用によって製造し得る 。本発明の実質的に純粋な調製物はまた、種々の生物学的に活性または不活性な 成分（例えば、水、緩衝剤、賦形剤、アジュバント）を含み得るので、本発明の MHC結合ペプチドまたはオリゴマーの重量パーセントは、このような調製物中で 減少され得る。 MHC 分子および結合ペプチド MHCクラスIおよびクラスII分子は、ある点では異なるが、多くの共通の構造的 特徴を共有する細胞表面糖タンパク質である。これらの構造的特徴の１つは、細 胞外抗原結合裂け目である。ペプチドフラグメントは細胞内抗原プロセシングを 含む工程の間にこの抗原結合裂け目に結合される。抗原性ペプチドを装填したMH C分子は、細胞表面へ輸送され、ここで、結合ペプチドがＴ細胞に提示される。 Ｔ細胞はMHC分子と共同して抗原性ペプチドフラグメントを認識する特殊化した レセプターを含む。このような認識に応じて、Ｔ細胞は活性化され得、それによ って免疫反応の基礎を形成するシグナル伝達カスケードを刺激する。 ほとんどの基本的なレベルで、免疫系は、身体から病原体（例えば、ウイルス 、細菌、病原性真菌、および真核生物寄生生物）を取り除くように機能する。免 疫応答におけるＴ細胞の役割は、このような病原体を有する細胞を認識するそれ ら の能力に依存する。MHC分子の２つのクラス間の構造的および機能的な識別は、 これらの分子が、細胞の２つの主要な細胞内区画（サイトゾルおよび内部小胞） のそれぞれにおいてこのような病原体に由来する広範な抗原性ペプチドヘ結合し 、そしてこれらのペプチドを提示するのを可能にする。抗原性ペプチドがMHC分 子に結合し、そしてMHCによって提示されるこのプロセスは、MHC分子のペプチド 「装填(charging)」または「装填(loading)」といわれている。 MHCクラスII分子と対照してみると、MHCクラスI分子は、細胞のサイトゾル中 で最初に産生されたタンパク質に由来するペプチドが装填される。例えば、ウイ ルスによって感染された細胞において、ウイルスタンパク質はサイトゾル中で産 生される、ウイルスタンパク質のフラグメントは、小胞体内へ輸送され、ここで このフラグメントはMHCクラスI分子によって結合される。次いで、これらの装填 されたMHCクラスI分子は、細胞表面へ輸送される。 一方、MHCクラスII分子は、細胞内膜結合小胞内でプロセシングされたタンパ ク質由来のペプチドが最初に装填される。例えば、これらの細胞内膜結合小胞は 、マクロファージによって飲み込まれたかまたはＢ細胞によって内在化されたタ ンパク質を含む。 細胞の表面上でのその装填された形態において、これらの２つのクラスのMHC 分子は異なる機能的クラスのＴ細胞により認識される。例えば、装填されたMHC クラスI分子は、CD8+細胞傷害性Ｔ細胞によって認識される。装填されたMHCクラ スII分子は、例えば、CD4⁺ヘルパーＴ細胞によって認識される。 MHCクラスIおよびMHCクラスII分子の両方の構造は、Ｘ線結晶学によって決定 されている。MHCクラスI分子は、２つのポリペプチド鎖（MHC中にコードされる α鎖、およびMHC中にコードされないより小さい非共有的に会合された鎖である β-2ミクログロブリン）からなる。この分子は、４つのドメイン（MHCによって コードされるα鎖から形成される３つ、およびβ-2ミクログロブリンから形成さ れる１つ）を有する。α₁およびα₂ドメインは対合して、抗原結合部位である、 分子の表面上の裂け目を生じる。抗原性ペプチドがMHCクラスI分子の裂け目に結 合される場合、抗原性ペプチドのＮ末端は、裂け目内に実質的に埋め込まれる（ それゆえ近づき難い）。一方、抗原性ペプチドのＣ末端は、Ｎ末端より接近し やすい。 MHCクラスII分子は、２つの鎖（αおよびβ）の非共有的複合体からなり、そ の両方の鎖は膜を貫通する。MHCクラスII分子の結晶構造は、この分子が、MHCク ラスI分子の折り畳み構造と非常に類似した折り畳み構造を有することを明らか にする。２つの分子の折り畳み構造における最も顕著な相違は、MHCクラスII分 子において実質的により開口しているペプチド結合裂け目の末端にある。これら の相違の主要な結果は、MHCクラスI分子に結合したペプチドの末端がより包埋さ れ、一方MHCクラスII分子に結合したペプチドの末端がより露出されることであ る。 多くのMHCクラスIおよびクラスII結合ペプチドのアミノ酸配列が現在公知であ り、そして他は当業者に周知の日常的な実験を介して決定され得る(例えば、Ram menseeら，（1995）Immunogenetics 41:178-228を参照のこと)。例えば、ペプチ ド抗原が単離された場合、エドマン分解(Nelsonら，（1992）Proc ．Natl．Acad. Sci．USA 89:7380-7383)および質量分析法（例えば、Coxら，（1994）Science 2 64:716-719を参照のこと)のような技術によってその配列を同定することが可能 である。さらに、MHC結合ペプチドは、拘束するMHC分子のそれぞれのコンセンサ スモチーフを用いて目的のタンパク質の配列をスキャンすることによって同定さ れ得る（例えば、WO96/27387を参照のこと）。一般的に、MHCリガンドのコンセ ンサスモチーフは対立遺伝子特異的である（すなわち、例えば、HLA-A2.1へ結合 したペプチドのモチーフは、HLA-B2701へ結合するペプチドのモチーフとは異な る）。このようなモチーフは、例えば、不変のアミノ酸位の長さおよび位置を含 むそのようなペプチド中に含まれる不変の特性を要約する。コンセンサスモチー フは、MHCクラスIおよびクラスIIのリガンドについて同定されており、そしてそ のようなモチーフを同定するための方法が記載されている。これらは、例えば、 プール配列決定(Falkら，（1991）Nature 351:290-296;Falkら，（1994）Immuno genetics 39:230-242)、ならびに、ファージデイスプレーライブラリーの使用（ 例えば、Hammerら（1992）J ．Exp Med．179:1007-1013)を含み；選択されたモチ ーフは、Rammenseeら，（1995）Immunogenetics 41:178-228によって具体的に開 示される。MHC 結合ペプチドのオリゴマー 上記で考察したように、いくつかの研究は、エフェクターＴ細胞上のＴ細胞レ セプターのダイマー化またはオリゴマー化とともに、MHCクラスIペプチド抗原複 合体およびMHCクラスIIペプチド抗原複合体のダイマー化またはオリゴマー化（ 「クラスター形成」ともいう）が、有効な免疫応答において必須の工程のようで あることを示唆した。本発明は、１個以上の可撓性分子リンカーによって結合さ れたMHC結合ペプチドを含むオリゴマーが、オリゴマー誘導クラスター形成を介 して免疫応答を調節する有意に増大した能力によって特徴づけられるという知見 に部分的に基づく。 上記の用語、MHC結合ペプチドは、MHCクラスI分子またはMHCクラスII分子の抗 原結合裂け目内に特異的に結合するペプチドをいう。これらは、エピトープ（す なわち、抗原提示細胞によって、Ｔ細胞活性に関する作用結果を有するＴ細胞に 提示されるペプチド配列）であり得るか、またはＴ細胞関与を有さずにMHC分子 に結合しそしてAPC活性（例えば、リンホカイン分泌）を刺激するペプチド配列 、またはMHC分子へ結合しそしてMHC分子が他のエピトープに結合するのをブロッ クする（すなわち、Ｔ細胞活性に関する直接作用結果を有さない）ペプチド配列 であり得る。 本発明の組成物は、必要に応じて１個以上の可撓性分子リンカーによって結合 される２個以上のMHC結合ペプチドを含むオリゴマーである。ほとんどの適用に ついて、同一のMHC結合ペプチドは、可撓性分子リンカーによって結合される。 しかし、同じクラスの１個より多くの型のMHC結合ペプチド（すなわち、２個以 上のMHCクラスI結合ペプチド、または２個以上のMHCクラスII結合ペプチド）を 含むオリゴマーを設計することもまた可能である。異なる個性のMHC結合ペプチ ドを含むオリゴマーは、例えばMHC結合ペプチドのうちの１個がMHC分子に低親和 性で結合することが既知である場合、有用である。この場合、より高親和性でMH C分子を結合するペプチドへ低親和性結合ペプチドを連結することは、抗原提示 細胞の表面上で低親和性結合体の局所的濃度を増大するように作用する。さらに 、共通のMHC結合モチーフを共有する２個以上の同一でないMHC結合ペプチドが連 結され得る。このようなペプチドの一次配列は非同一であり得るが、それらが共 通 のMHC結合モチーフを共有する事実は、例えば、自己免疫障害と関連し得る特定 のＴ細胞サブセットの枯渇において特に有用であり得る。 上記で議論され、そして先行技術で報告されたように、MHCクラスII分子のペ プチド結合裂け目の外面的形態は、結合した抗原性ペプチドのＮ末端およびＣ末 端がMHCクラスII分子から突出する点で、比較的開口している。従って、MHCクラ スII分子によって結合される抗原性ペプチドのＮ末端およびＣ末端は接近可能で あり、そして、MHCクラスII結合ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端の修飾 は、一般的にMHCクラスII分子によるこのようなペプチドの特異的結合を立体的 に妨げるようには機能しない。 それらのＮ末端およびＣ末端が接近可能であるので、MHCクラスII結合ペプチ ドを連結するための好ましい方法は、Ｎ末端からＣ末端である。この方法は、こ のような連結が、インビボで生合成的に産生され得る事実の観点から重要な利点 を提供する。生合成的産生について、MHCクラスII結合ペプチドを結合する可撓 性分子リンカーは、天然に存在する（すなわち、Ｌアイソマーの）アミノ酸を必 然的に含む。このようなオリゴマーをコードするDNAは、従来の技術を用いて合 成され、そしてDNA発現ベクター中にクローニングされる（以下を参照のこと） 。生合成法は、MHCクラスII結合ペプチドＮ末端をＣ末端へ連結するための好ま しい方法であるが、任意の従来の化学合成技術が使用され得る（以下を参照のこ と）。 Ｎ末端をＣ末端へ連結したMHCクラスII結合ペプチドのオリゴマーに加えて、 このようなオリゴマーは、２個のペプチドをＮ末端からＮ末端へと連結すること により、または２個のペプチドをＣ末端からＣ末端へと連結することによって産 生され得る。あるいは、混合オリゴマーは、例えばＣ末端からＣ末端へ結合され た２個のペプチドを、第３のMHC結合ペプチドのＮ末端へ連結して産生され得る 。この型の混合オリゴマーストラテジーを使用して高分子量オリゴマーを生成し 得る。Ｃ末端からＣ末端へ、またはＮ末端からＮ末端へ連結されたMHCクラスII 結合ペプチドのオリゴマーに関して、生合成技術は選択可能なものではない。こ のようなオリゴマーは、以下に記載のような従来の合成技術によって連結されな ければならない。 MHCクラスI結合ペプチドのオリゴマーは、Ｃ末端をＣ末端へ連結されなければ ならない。この要件は、上記のように、MHCクラスI分子の抗原結合裂け目におい て結合された抗原性ペプチドのＮ末端が埋め込まれ、そして接近不能と推定され る事実に由来する。従って、Ｎ末端でMHCクラスI結合ペプチドへ付加された任意 のリンカーが、MHCクラスI分子を特異的に結合するその能力を妨害すると推定さ れる。しかし、Ｘ線データは、MHCクラスI分子の抗原結合裂け目中に結合された 抗原性ペプチドのＣ末端アミノ酸残基がより接近しやすいことを明らかにする。 従って、２個のMHCクラスI分子を可撓性分子リンカーを介してＣ末端からＣ末端 へと連結することは、MHCクラスI結合ペプチドのMHCクラスI分子への特異的に結 合する能力を実質的に阻害しない。１つの実験において、例えばグリシン残基を 、ノナマーペプチドエピトープのＣ末端に付加してデカマーを生じた。デカマー は、裂け目において、ペプチド結合裂け目の外側に配向されたＣ末端カルボキシ ル残基と結合し(Collinsら，（1995）Nature 371:626-629)、それゆえＣ末端は 可撓性分子リンカーの付加のために接近しやすい。それゆえ、グリシン残基また は他の化学基のいずれかを可撓性分子リンカーの末端で用いることにより、MHC クラスI結合ペプチドのダイマーが産生され得る。さらに、分枝リンカーを用い ることによって、より高次のオリゴマー（例えば、４〜32個のMHC結合ペプチド を有するオリゴマー）が、日常的な化学合成によって生成され得、そして以下の 実施例に記載の機能的アッセイのいずれかによって容易に試験され得る。 MHC結合ペプチドが可撓性ポリペプチドリンカーによってＮ末端からＣ末端へ 結合されたオリゴマーの生合成的合成のために、このオリゴマーをコードする核 酸が産生され得る。簡単には、MHC結合ペプチドをコードするDNA配列が、遺伝コ ードを参照して設計される。これらのDNA配列は、可撓性ポリペプチドリンカー 配列をコードするDNA配列へ連結され、その結果リンカー配列はMHC結合ペプチド 配列に散在する。可撓性分子リンカーの長さは可変性であり得、そして３個以上 の（２個以上の可撓性分子リンカーによって間隔を開けられる）MHCクラスII結 合ペプチドを含むオリゴマーにおいて、可撓性分子リンカーは、一様な長さまた は組成である必要はない。可撓性分子リンカーは、実質的に直鎖状であり、そし て好ましくは不活性、親水性およびプロテアーゼによって切断不可能である。可 撓性分子リンカーはまた、好ましくは、生理学的条件下で二次構造を欠くように 設計される。従って、例えば、ポリペプチドリンカー配列は、好ましくは、グリ シン、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、およびプ ロリンからなる群より選択される複数の残基から構成される。本質的に、グリシ ン、アラニン、およびプロリン残基からなるポリペプチドリンカーが特に好まし い。より大きい芳香族残基を含むポリペプチドリンカーもまた含まれ得るが、そ れらは立体的妨害を生じ得るのでそれほど好ましくない。同様に、荷電アミノ酸 が含まれ得るが、それらは相互作用して二次構造を形成し得るのでそれほど好ま しくなく、そして非極性アミノ酸が含まれ得るが、それらは溶解度を減少し得る のでそれほど好ましくない。しかし、これらの好ましい特徴の詳説は、限定的で あることを意図しない。特定された特徴が最適な活性を促進すると考えられるが 、好ましい基準を満たさない可撓性ポリペプチドリンカーは、少なくとも有効だ として分かり得る。これがその場合であるか否かは、本明細書の教示に与えられ る通常の実験によって決定され得る。 従って、上記の型のオリゴマーをコードするDNA配列は、発現ベクターに挿入 され得る。次いで本発明のオリゴマーをコードする発現ベクターは、それが発現 される適切な細胞型に導入される。原核生物細胞（例えば、E.coli）は好ましい 宿主系を示すが、オリゴマーは、真核生物系において効率的に発現され、適切な ベクター選択を与え得る。次いで、このような宿主細胞中で合成されたオリゴマ ーは、従来の技術により単離され、そして哺乳動物、好ましくはヒト、被検体へ の投与のために処方され得る。あるいは、治療方法に関連して後述するように、 本発明のオリゴマーをコードするDNAは、遺伝的免疫化に関連する使用に適切な 真核生物ベクターに挿入され得る。 可撓性分子リンカーの化学合成のために、有機合成の当業者は、上記の要求を 満たす広範な種々のリンカーを設計し得る。従って、結合される末端（すなわち 、Ｎ-および／またはＣ-末端）の性質に依存して、リンカーのための適切な末端 基が選択され、その結果、リンカーはMHC結合ペプチドの選択された末端（例え ば、天然に存在するアミノ酸、Ｄ-異性体アミノ酸、またはサルコシンもしくは β-アラニンのような改変アミノ酸を使用して、片方または両末端で）に結合さ れ得る。 好ましい可撓性分子リンカーとしては、有機酸のポリマーまたはコポリマー、ア ルデヒド、アルコール、チオール、アミンなどが挙げられる。例えば、グリコー ル酸、乳酸、セバシン酸、またはサルコシンのようなヒドロキシ-、アミノ-、も しくはジカルボン酸のポリマーまたはコポリマーが使用され得る。あるいは、エ チレングリコール、プロピレングリコール、サッカライドなどのような、飽和ま たは不飽和炭化水素のポリマーもしくはコポリマーが使用され得る。このような 可撓性分子リンカーの例の1つは、実施例２に下述するようにポリエチレングリ コール（末端に例えば、β-アラニンを有するかまたは有さない）である。他の 例としては、天然に存在しないアミノ酸（例えば、Ｄ-異性体を含む）のポリマ ーまたはコポリマーが挙げられる。特定の天然に存在しないアミノ酸は、本発明 のオリゴマーに関して有利であると推測される特性を有する。例えば、Ｎ-メチ ルグリシン（サルコシン）は、都合良い溶解特性を示す場合、水素結合および二 次構造形成を最小化することが予測され、それによりポリサルコシンリンカー（ 末端に例えば、リジンを有するかまたは有さない）が、実施例２に下述するよう に使用され得る。これらおよび多くの他の可撓性分子リンカーは、化学合成の従 来技術を使用して当業者により容易に使用され得る。 一般的な様式として、MHC結合ペプチドダイマーが使用される場合、可撓性分 子リンカーは、MHC結合ペプチドが隣接またはクラスターMHC分子のMHC結合裂け 目中で結合される場合、少なくともMHC結合ペプチドの末端間の距離にわたるの に十分に長い長さを有することが好ましい。しかし、好ましくは、それらは、隣 接しないかまたはクラスターでないMHC分子に結合し、そしてそれらのクラスタ ー形成リングを促進するように、より長い。従って、例えば、実施例２に示され るように、ポリエチレングリコール（PEG）リンカーは、約30〜40Åの末端から 末端までの長さで使用された。このようなリンカーは、約60〜80Åのバックボー ン長（すなわち、隣接したMHC結合ペプチド間の連続的な結合を形成する結合の 長さの合計）を有する（結合の長さについて例えば、CRC Handbook of Chemistr y and Physics,第76版,CRC Press(1995)を参照のこと,；化学結合は線状に配置 されないので、バックボーン長は末端から末端までの長さよりも長い）。同様に 、実施例１において、12〜13アミノ酸残基を含むポリペプチドリンカーが使用さ れ た。このような可撓性分子リンカーは、約50〜60Åのバックボーン長を有する。 従って、MHC結合ペプチドオリゴマーがダイマーである実施態様のために、可撓 性分子リンカーが少なくとも50〜80Å、そして好ましくはそれより長いバックボ ーン長を有することが好ましい。 より高度なオリゴマーについての一般的な様式として、実施例１に記載される ように、オリゴマーにおけるMHC結合ペプチドサブユニットの全てが実際にMHC分 子を結合するのではないようである。むしろ、以下に示すように、各々12アミノ 酸のスペーサーを有する各々13アミノ酸残基のMHC結合ペプチドを使用するよう であり、さらなるMHC分子がオリゴマーの5マーまたは6マーの各々に結合するよ うである。下記のように、これは結合MHC分子間の約125〜150アミノ酸残基の距 離、または約540〜645Åのバックボーン長に解釈される。この例において、MHC 分子を結合しないMHC結合ペプチド単位は、ある意味で、可撓性分子リンカーの 長さに単に寄与すると見なされ得、それゆえ、いくつかの実施態様について、54 0〜645Åまたはそれより長い可撓性分子リンカーが好ましいとされ得る。同時に 、より高度のオリゴマー（例えば、4マーから32マー）の使用は、より多くの結 合部位を提供することにより、MHC分子の結合の可能性を増加する。従って、任 意の例として、正確に６モノマー単位で分けられた３つのMHC分子を結合する16 マーを仮定すると、MHC分子は1、7、および13位；2、8、および14位；3、9、お よび15位；または4、10、および16位の相対的モノマー位置で結合され得る。そ れゆえ、どのモノマー単位がMHC分子を結合するか予測し得ず、そして、オリゴ マーが、いくつかが非結合のままである場合でさえ、高密度のMHC結合ペプチド モノマーを含むことが好ましい。さらに、いくつかのMHC結合ペプチド単位が、 事実上、可撓性分子リンカーとして使用され得る場合、これらのペプチドのバッ クボーン長が、任意の２つの隣接しないMHC結合ペプチド単位間の可撓性分子リ ンカーのバックボーン長を計算する場合に含まれ得る。 最終的に、より高度のオリゴマー（例えば、４-マー〜32-マー）について、可 撓性の分子バックボーンは減少または除去され得る。なぜなら、隣接しないMHC 結合ペプチド単位のために、介在MHC結合単位が、可撓性分子リンカーとして使 用され得るからである。別の表現では、より高度のオリゴマーについて、内部MH C結合ペプチド単位が、それらが結合するより遠位のMHC結合ペプチド単位につい ての可撓性分子リンカーと見なされ得る。 従って、好ましい実施態様において、本発明のMHC結合ペプチドオリゴマーは 、ダイマーのみが使用される場合は、少なくとも50〜60Åまたは60〜80Åのバッ クボーン長、4マー以上のオリゴマーが使用される場合は、50〜60Åから540〜64 5Åのどこかのバックボーン長を有する可撓性分子リンカーにより結合されたMHC 結合ペプチドを含む。さらに、好ましい実施態様において、オリゴマーは4マー 〜32マー、より好ましくは12マー〜24マー、そして最も好ましくは約16マーであ る。ここで、MHC結合ペプチドは約50〜60Åまたは60〜80Åのバックボーンを有 する可撓性分子リンカーにより結合される。特に好ましい実施態様において、可 撓性分子リンカーは、10〜20から125〜150アミノ酸残基のどこかを含むポリペプ チドリンカーである。 MHC 結合ペプチドのオリゴマーを使用する方法 本発明のオリゴマーは、CD8⁺またはCD4⁺Ｔ細胞を特異的に活性化または阻害す るために、種々の治療的関連において使用され得る。このようなＴ細胞を活性化 するための方法は、一般に、例えば、免疫応答を誘導するためのワクチン接種に 関して使用される。Ｔ細胞の活性化は、作用性MHC結合ペプチドにより媒介され る。従来の病原体に対するワクチン接種に加えて、このような方法はまた、弱い 免疫原性として特徴付けられ得る抗原に指向されたＴ細胞応答を刺激するために 使用され得る。例えば、腫瘍特異的抗原は、この範疇に含まれる（Boonら、（19 94）Ann.Rev.Immunol.12:337-365;Topalianら、(1996)J.Exp.Med.183:1965-1971 ）。腫瘍細胞は、多くの場合、免疫系により体から効率的に除去されない。本発 明のオリゴマーに関連するＴ細胞反応性の刺激は、実質的により効果的な応答を 誘導する方法を提供する。上記のように、特異的にMHCクラスＩまたはMHCクラス II分子に結合する抗原性ペプチドは、公知であるかまたは容易に実験的に決定さ れ得るかのいずれかである。 特定の作用性抗原性ペプチドに対するＴ細胞応答を刺激するために、上記のオ リゴマー型が産生され、そして個体に投与される。細胞表面に通常存在するMHC 分子のサブセットは、空であることが知られている（すなわち、抗原結合裂け目 はMHC結合ペプチドで満たされていない）。さらに、より弱い結合ペプチドの、 より強い結合ペプチドによる置換はまた、実験的に実証されている。従って、本 発明のオリゴマーは、インビボまたはインビトロで細胞表面のMHC分子と接触さ れる場合、空のMHC分子への結合により、またはすでに満たされたMHC分子から強 力でない結合ペプチドを置換することにより、MHC分子に結合し得る。Ｔ細胞（C D8⁺またはCD4⁺のいずれか）は適切なMHC分子に関連して結合抗原を認識する。得 られたクラスター化複合体は、下記の実験で実証されるように、超活性化（すな わち、Ｔ細胞応答を引き起こすために必要とされる抗原量が、非結合抗原を用い る他は同一の実験において引き起こされる応答と比較して一桁低い）を引き起こ す。 Ｔ細胞応答を刺激する方法に加えて、本発明の方法は免疫応答を阻害する（す なわち、免疫抑制）ために使用され得る。このような方法は、自己免疫疾患、同 種移植拒絶、またはアレルギー状態に関連して一般に示される。 自己免疫疾患は、しばしばMHC分子の1つまたは限定された数の対立遺伝子形態 の発現と相関する。ほとんどの場合、この相関は、MHCクラスII分子とともに見 られる。このクラスの例としては、例えば、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、 およびインスリン依存性糖尿病（IDDM）が挙げられる。 慢性関節リウマチは、HLA-DR1または-DR4のサブタイプ（例えば、HLA-DR0401 ）の発現と相関している。疾患表現型を担う自己抗原応答は未知であるが、コラ ーゲンII型およびHSP70は潜在的な供給源として結び付けられている（Feldmanら 、（1996）Cell 85:307-310により総説される）。 多発性硬化症（MS）は、神経系を含む最も通常の疾患である。それはHLA-DR2 の発現と相関する。自己抗原は、少なくとも２つのタンパク質、ミエリン塩基性 タンパク質（MBP）およびプロテオリピドタンパク質（PLP）（両方ともミエリン 髄鞘の主要成分である）により提供される。免疫優性T細胞エピトープは、MBP（ Otaら、（1990）Nature 346:183-187;Allegrettaら、（1990）Science 247:718- 721）；およびPLP（Pelfreyら、（1993）J.Neuroimmunol ．46:33-42）について 記載されている。マウスモデル系におけるこの自己免疫疾患の相関物は、実験 的アレルギー性脳脊髄炎（EAE）である。最近の出版物は、EAEがMBP（Brockeら 、（1996）Nature 379:343-346）；およびPLP（Nicholsonら、（1995）Immunity 3(4):397-405）の改変ペプチドアナログの適用により処置され得ることを報告 している。 インスリン依存性糖尿病（IDDM）またはＩ型糖尿病に対する罹患率は、いくつ かのHLA-DQ対立遺伝子の発現と最も強く相関する。自己抗原に対して指向される （例えば、グルタミン酸デカルボキシラーゼから誘導されて）Ｔ細胞応答が、報 告されている（Atkinsonら、（1994）J.Clin.Invest ．94:2125-2129）。非肥満 性糖尿病（NOD）マウスは通常使用される動物モデル系を示す。 特定のMHCクラスII対立遺伝子の発現に関連した自己免疫疾患に加えて、特定 のMHCクラスＩ分子の発現への関連が決定されている数種の自己免疫疾患が現在 知られている。例えば、硬直性脊椎炎はHLA-B27と相関する（BenjaminおよびPar kham（1990）P.Immunol.Today 11:137-142）。 非作用性MHC結合ペプチドを含むオリゴマーは、この免疫抑制実施態様に関連 して使用される。非作用性ペプチドは、適切なMHC分子による結合後、Ｔ細胞活 性化を生じないペプチドである。多数の型の非作用性ペプチドが記載されており 、例えば、拮抗性、不応答性、ブロッキング、寛容化誘導、およびアポトーシス 誘導ペプチドを含む。このような活性は文献において良好に特徴づけられている 。 Ｔ細胞応答（例えば、不応答的、拮抗的などで）を阻害する非作用性ペプチド は、既知の作用性ペプチドの改変、続いて適切な試験により、日常的な実験を通 して作製され得る（Setteら、（1994）Ann.Rev.Immunol ．12:413-431;Sloan-Lan caster,（1996）Ann.Rev.Immunol ．14:129）。特に、MHC結合ペプチド中の１つ 以上の外向きに（すなわち、MHC分子のペプチド結合裂け目に関して外向きに） 位置するＴ細胞接触残基の改変は、作用性ペプチドから非作用性ペプチドへ変換 し得る。例えば、赤血球凝集素ペプチドHA306-318（HLA-DR1分子に結合する）に おける残基P1、P2、P3、P5、P7およびP8は、外向きに位置するＴ細胞接触残基を 示す。任意のこれらの残基の改変は、拮抗するまたは不応答性であるペプチドを 生じ得る（Sloan-LancasterおよびAllen,(1996)Ann Rev ．of Immunol．14:129） 。天然のアミノ酸は、一般に置換のために使用されるが、合成アプローチにおい て、 誘導体化アミノ酸を含む他の有機分子が、使用される。 上記の治療的方法において、本発明のオリゴマーが産生され（宿主細胞または インビトロのいずれかで）、単離され、そして個体に投与される。しかし、最近 の進歩は、遺伝的免疫化と呼ばれる技術の開発に導いた（Ulmerら、（1993）Sci ence 259:1745）。マウス系において行われる実験において、赤血球凝集素の遺 伝子を含む裸のDNAプラスミドが直接筋肉に注射された。インフルエンザ赤血球 凝集素は、ＢおよびＴ細胞エピトープの両方を含む。この注射に応答して、抗体 および細胞傷害性Ｔ細胞の両方からなるインフルエンザ特異的免疫応答が刺激さ れた。この応答は、サイトカインをコードするプラスミドの同時注射により増強 され得る。プラスミドDNAが、注射された筋組織内のいくつかの細胞により発現 され、それにより特異的免疫応答を刺激することが推定される。 適切な発現ベクターに挿入された、本発明のオリゴマーをコードするDNAは、 このような遺伝子免疫化プロトコルにおいて使用され得る。当業者は、特定の細 胞内シグナル配列が、細胞内で合成されたオリゴマーを、MHCクラスＩまたはク ラスII分子と結合するための適切な細胞の位置に標的化するために必要とされ得 ることを認識する。 上記の方法に加えて、本発明の組成物は、大量域寛容の誘導に関して有用であ るようである。大量域寛容は、可溶性（他に作用性）MHC結合ペプチドの高濃度 の適用が免疫応答の刺激よりも寛容性を導く現象である（例えば、Weigle,（197 3）Adv.Immunol ．16:61-122;Liblauら、（1996）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:30 31-3036を参照のこと）。下記の実験において見られるように、本発明のオリゴ マーの使用は、確立されたＴ細胞株での標準的なＴ細胞アッセイ、およびまた、 血液から単離された末梢Ｔ細胞を用いるインビトロでの初回刺激アッセイにおい て、用量応答曲線をシフトするように機能する。これらの結果を考慮すると、オ リゴマー媒介クラスタリングは、比較的低い濃度で大量域寛容を誘導し得るよう である。 比較的低いMHC結合ペプチド濃度での大量域寛容を誘導する能力は、治療的利 点を提供する。大量域寛容誘導の以前の報告は、治療的意味での実際的な投与が 可能ではないような高い濃度でのペプチド濃度の投与を必要とした。しかし、本 発明のオリゴマーを使用して、非常に低い濃度が必要とされる。従って、例えば 、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症についてはMBP 84-102；または重症筋無 力症についてはAChR α144-163）に関連した作用性ペプチドを含むオリゴマーが 、このような障害に罹患した個体に、寛容化用量で投与され得る。このような用 量は、例えば、インビトロでの混合PBMCおよびインビボでの非ヒト哺乳動物動物 を用いて経験的に決定され得る。 実施例 実施例１ 12アミノ酸(G-P-G-G)₃のスペーサーまたはリンカーにより分離されたクラスII MHC-拘束Ｔ細胞エピトープHA306-318のポリペプチドオリゴマーを、新規のモジ ュラークローニング方法を使用して構築した。この方法論は、多数の比較的小さ い反復性オリゴヌクレオチド単位からなる大きなオリゴマーの生成のために特に 設計される。このストラテジーはまた、さらなる非反復単位が構築物に結合し得 る、または組み込まれ得るように、構築されるオリゴヌクレオチドに適用され得 る。古典的なクローニング方法は、同一のまたは適合性の制限酵素部位の使用に 基づく。これらの部位は、適合性末端が２つの異なるDNA間の連結を形成するよ うに生成され得るように配置されなければならない。これらの制限酵素配列は常 にコード配列の一部であり、そしてオリゴマーによりコードされる所望のアミノ 酸配列を妨害し得る。さらに、同一単位を結合するために、両端での適合性突出 を保有することが好ましい。しかし、最も標準的な制限酵素はパリンドローム切 断部位を必要とし、そして両鎖において平滑末端または適合性であるが同一の突 出のいずれかを生成し、その結果、連結は両方向（すなわち、コード鎖-コード 鎖またはコード鎖-非コード鎖）に起こり得る。さらに、同一の制限部位が個々 の単位の両末端で使用される場合、制限部位は、連結された産物の接合部ならび にその末端で、再構成される。従って、（例えば、さらなる伸長のために）この 酵素でのクローニング産物の遊離は可能ではない。ここで導入されるストラテジ ーは、モジュラーエレメントが認識部位の存在を必要としないので、これらの複 雑さを裂ける。ここで使用されるモジュラーエレメントは、両5'-または両3 '-側のいずれかにおいて適合性であるが同一ではない突出末端を有する二本鎖オ リゴヌクレオチドを示す。特に、50bpまでの小さなモジュールは、合成オリゴヌ クレオチドのアニーリングにより簡単に産生され得る。下記の例において、コー ド鎖がGGからなり、非コード鎖がCCからなる２塩基対の3'突出が選択された。こ れらの突出の同一でない性質は、配向特異的様式で（図１）、個々のモジュラー エレメントの互いへの結合を可能にする。 図１に示されるこれらのモジュールの連結は、モジュールが制御された反応条 件下で互いに直接結合する重縮合技術により、またはクローニングベクターの援 助により行われ得る。これらのモジュールをベクターに挿入するために、切断後 に、モジュラーエレメントについて選択されたものと同様のいくつかの突出をベ クターについて生成する制限部位が、確立されなければならない。これはベクタ ーのポリリンカー（その中心で制限部位の連結対（「Ａ」および「Ｂ」、図２） を含む）へ連結部を導入することにより、達せられる。これらの部位の必要な特 徴は：（ｉ）両制限部位は、同じ長さの5'-または3'-突出のいずれかを産生する ；（ii）認識部位は切断部位の外側に位置する（または少なくとも突出を伸長し ない）；（iii）２つの認識部位は、それぞれ切断部位の各側に位置する；およ び（iv）両鎖での切断後に生成される突出は、同一ではない。以下において、１ 、２、または３bp-突出を生成するこれらの制限部位の適合対について例が示さ れ、より大きな突出もまた可能である（図２）。 図２に示すように、これらの結合部位を含むベクターは、「Ａ」または「Ｂ」 のいずれかで切断することにより、開裂され得る。Ｎにより示される位置での塩 基が自由に選択され得ることに留意されたい。切断部位でのこれらの塩基の選択 は、突出の配列を決定し、そしてそれらは連結部オリゴヌクレオチドとともにベ クターに導入される。図３において、前述のモジュールの突出に適合する２塩基 対のGG/CC-突出を生成する連結部が使用される。制限部位「Ｎ」および「Ｃ」は 、連結部オリゴヌクレオチドを挿入するために使用されるポリリンカーの標準部 位である。 クローニングモジュールの増幅は、ベクターにより提供される２つのPCR-プラ イミング部位（「＋」および「−」、図３）を利用するPCRにより、または構築 物を宿主細菌に導入することにより行われ得る。増幅されたモジュール（図４に 示される）は、両方の制限酵素「Ａ」および「Ｂ」を用いることにより遊離され 得、または構築物は、さらなる伸長のために、「Ａ」または「Ｂ」のいずれかで 切断することにより、１つの側で開裂され得る。 発現ベクターが連結部を含むか含まないかにより、全長構築物は、「Ａ」およ び「Ｂ」の部位のいずれかを用いることにより、または標準的な酵素「Ｎ」およ び「Ｃ」で切断することによって構築物全体を遊離させることにより、最終的に それに導入され得る。 この方法を用いて、大きな反復オリゴヌクレオチドは、ポリ-縮合段階のいく つかの回を行い、続いて増幅のためにベクターへのクローニングによりまたはク ローニングモジュールの首尾良い伸長を行うことにより構築され得る。両方の組 合せが使用され得る。より大きければ、DNA-テンプレート（例えば、遺伝子）か らの非反復モジュールまたはDNAの断片は、融合タンパク質をコードするオリゴ ヌクレオチドを産生するために連結され、同一でない突出は、「Ａ」または「Ｂ 」の部位（所望の切断部位に隣接する）で形成され得る。これは、必要な位置に 認識配列を含むプライマーを使用して、PCRにより行われ、続いて、制限酵素消 化が行われ得る。この方法は、32までのＴ細胞エピトープリンカー単位（これは 非常に効果的なＴ細胞抗原を示すタンパク質をコードする）を含む反復オリゴヌ クレオチドを構築するためにすでに用いられている（図５）。当然、それは、構 造タンパク質をコードする遺伝子（例えば、コラーゲン、または絹）、遺伝子調 節エレメント（例えば、反復エンハンサー-エレメント）、または他の非反復DNA 構築物のような、他の反復オリゴヌクレオチドを生成するためにも使用される。HA306-318 オリゴマーをコードするオリゴヌクレオチドの構築および発現 以下において、人工的な抗原タンパク質（一次構造がほとんど全てのＴ細胞エ ピトープ-リンカー単位のタンデム反復を構成する）の生成のための手順が記載 されている。この実施例において、Ｔ細胞エピトープは、インフルエンザウイル スの赤血球凝集素タンパク質由来の短いアミノ酸配列であるHA306-318により示 される。リンカー配列（GGPGGGPGGGPGG）への結合により、それらは、図５に示 されるように互いに直接結合した32コピーまでの反復単位を形成する。 タンパク質を、E.coli発現系を用いる組換え方法論によって産生する。この技 術は、６つのヒスチジン残基からなるＣ末端タグの添加を含み、従ってNi-NTA- アガロース(Quiagen)を利用するアフィニティークロマトグラフィーによる組換 えタンパク質の精製を可能にする。２つの改変したベクターを、これらのタンパ ク質をコードするオリゴヌクレオチドの構築(pCITE3a，Novagen)および発現(pET 22b，Novagen)のために使用する。これらのベクター両方中に、非パリンドロー ム制限部位の連結(interlocking)対（BsrD IおよびBsm I）（図６）を含む連結 部-オリゴヌクレオチドを挿入した。 この連結部を、合成オリゴヌクレオチドの相補鎖をアニーリングすることによ って生成し、そしてポリ-リンカーのNdel IおよびXho I部位中に挿入した。開始 コドンをNde I部位内に配置し、そして６つのヒスチジンコドンにつなぎ、ヒス チジン-タグ（pET22b-ベクターの一部）を形成するXho I部位のすぐ後ろに配置 する。反復配列をコードするモジュールのクローニング部位を、グリシンコドン に配置する。オリゴヌクレオチドを、BsrD IまたはBsm Iのいずれかでの酵素消 化がコーディング鎖のGGおよび非コーディング鎖のCCからなる２bpの3'-突出を 生じるように設計する。pCITE3aベクターのすべての内部Bsm IおよびBsrD I部位 を、部位特異的変異誘発によって予め除去した。図７は、反復オリゴマーを構築 するために必要とされる２つのオリゴヌクレオチドを示す。これらは、Ｔ細胞エ ピトープをコードするHA-306-318モジュール、およびスペーサーまたはリンカー モジュールである。 モジュールを、合成オリゴヌクレオチドの相補対をアニーリングすることによ って生成し得る。それらの配列を、腸内細菌中の高発現遺伝子におけるそれらの 頻度に基づいてコドン使用を選択するような様式で最適化する。これらの生物体 においてまれに見出されるコドンを避ける。このことは、宿主細菌におけるタン パク質の効率的な発現を確実にする。従って、HA306-318モジュールの配列（図 ７）は、完全に人工であり、そしてインフルエンザ赤血球凝集素のそれぞれの遺 伝子領域と同一ではない。モジュールの突出末端がグリシンコドンの一部である ことに注目する。この残基は、実際、リンカー配列の一部であり、その結果、反 復HA306-318-リンカー単位は、その構築物から生じるさらなるアミノ酸を全く含 まない。 HA306-318-リンカー単位を、以下の方法で形成する。モジュールを、相補鎖の アニーリング、および続くそれらの末端の後のリン酸化によって形成した後、こ れらの２つのモジュールの各々を改変pCITEベクター中に挿入する。これを、Bsm IまたはBsrD Iのいずれかを用いて連結部を開くこと、続く標準的なクローニン グプロトコルを用いるこれらのモジュールの連結によって達成する。DNA構築物 の両方を、E.coliに形質転換し、標準的なプラスミド方法を用いて単離し、そし て最終的に挿入物を配列決定する。次いで、リンカーモジュールを、鋳型として リンカー配列を含むベクターを使用し、そしてベクター中の連結部の外に配置し た２つのプライミング部位を利用するPCRによって増幅する。PCR生成物のゲル精 製後、リンカーモジュールを、BsrD IおよびBsm Iを用いる二重消化によって解 離する。次いで、このリンカーモジュールを、Bsm I消化によってＣ末端側で開 かれている、適切なHA306-318モジュールを含むプラスミド中に挿入する。モノ マーHA306-318-リンカー単位を含むこの構築物を細菌中に移入し、続いてDNAを 単離する。ダイマー単位を、すでに１つのHA306-318-リンカー単位を含むBsm I またはBsrD Iのいずれかで開かれたベクター中にHA306-318-リンカーモジュール （上記のようにPCRによって増幅し、そしてBsm IおよびBsrD Iで消化した）をク ローニングすることによって生成する。テトラマー単位を、ダイマー挿入物を含 むベクター中にダイマーモジュールをクローニングすることによって同じ方法で 生成する。 次の工程において、より長いモジュールを、テトラマーHA306-318-リンカーモ ジュールの重縮合によって形成する。テトラマーモジュールを、上記のようなPC R-増幅およびBsm I/BsrD I二重消化によって生成する。次いで、それらを、高濃 度のモジュールを用いて、制御された条件下（16℃，30'，appr．10000U/mlのリ ガーゼ）で実行される連結によって互いに直接結合する。これらの条件下で、４ 〜32より多い反復HA306-318-リンカー単位を含む一連のモジュールを形成する。 アガロースゲル上で反応生成物のサイズによって分離した場合、反応生成物は、 バンドが漸増する長さのモジュールを示すラダーを生じる。それらは、１つのテ トラマー単位のサイズ(312bp)によって間隔をあけられる。次いで、これらのバ ンドをゲルから切り出し、精製し、そして最終的に、改変したpET22b発現ベクタ ー中にクローニングする。実際、32までの反復ペプチド-リンカ-単位を含むモジ ュールを、この方法によって単離し得る。細菌中でのこれらのオリゴマーをコー ドする核酸のDNA増幅、ならびにそれらの発現を、本質的に標準的な手順に従っ て実行する。しかし、大きなHA306-318-リンカーオリゴマーによって特に示され るように、高反復DNAは不安定である傾向にあり、そして一部の反復単位の削除 が細菌培養物の増殖の間に生じ得る。従って、これらの目的に使用される株の選 択において特別な注意を払わなければならない。本発明者らが所有している最良 の結果は、大規模なDNA産生およびタンパク質発現の両方のためにE.coli TOP10( Stratagene)を用いることによって得られた。pET22bベクター中にクローニング した遺伝子の発現がT7 RNA-ポリメラーゼ（宿主細菌によって提供されなくては ならないウイルス酵素）によって駆動されるため、T7 RNA-ポリメラーゼ遺伝子 を、予めTOP 10株中に移入した。これを、λDE3溶原化キット(Novagen)を用いて 実行した。さらに、この株をまた、pLysS-プラスミド(Novagen)で形質転換し、T 7 RNA-ポリメラーゼ発現の厳密な制御を確実にした。 オリゴマーの発現を、約OD_6oonm=0.6の密度にての培養物へIPTG（0.8mM）を添 加することによって誘導し、そして36℃にて４時間実行した。次いで、細菌を収 集し、そして６Mグアニジン／HCl、500mM NaCl、100mM Tris、100mM Na₂HPO₄(pH 8.0)を含む緩衝液中に溶解した。ポリペプチドオリゴマーを、製造業者の説明書 に従って本質的にヒスチジン-タグを利用するNTA-アガロース(Quiagen)によって 単離する。最終工程において、エンドトキシン（リポポリサッカライド）および 他の不純物を、逆相C₄-HPLC-カラム（Vydac）上で物質を分離することによって オリゴマーから除去する。 これらの物質のサイズ系列を、SDSゲル電気泳動によって分析した。37℃にて1 6時間の空のHLA-DR1分子（バキュロウイルスベース発現系を用いて生成）ととも のこれらのペプチドオリゴマーのインキュベーションは、HLA-DR1分子の効率的 なローディングを生じた。各オリゴマーはバンドのラダーを生じ、バンドの数は 、オリゴマー中のエピトープ数とともに増加した。このラダーは、最小で１つの HL A-DR分子を含むオリゴマーを示し、より大きいバンドは１つのオリゴマー当たり １つより多いHLA-DR分子を示すと考えられる。4マー(４つの連結されたHA306-31 8-リンカーサブユニットを含むポリペプチド)を有する単一の主要なバンドのみ が明らかであること、および第２の顕著なバンドが各５〜６のさらなるサブユニ ット（例えば、32マーは５つのバンドを有した）のようであるという事実に基づ いて、さらなるHLA-DRサブユニットが、その間隔をあけて付加されているようで ある。５つのバンドの最大が明らかであり、おそらく１オリゴマー当たり５つの HLA-DR分子を示す。しかし、ゲル移動における変形は明らかである。第１に、４ マーを用いる場合、45kDの見かけのMrにて観察される単一の主要なバンド(計算 サイズ57kD:11kDオリゴマー＋46kD HLA-DR)は、HLA-DR/ペプチド複合体自体(Mr 62kD、47kDと計算される)より速く移動する。さらに、個々のバンド間の間隔は 、１サブユニット当たり約32kDのみの添加に等しく、このことは各HLA-DRサブユ ニットの見かけのMrがオリゴマー化の際の構造変化によって減少されたことを示 唆する。HLA-DR自体が別々のαまたはβ鎖ではなくオリゴマーに結合されたこと を確認するために、ポリクローナルウサギ抗αβ血清、抗α血清、および抗β血 清を用いてウエスタンブロットを実行し、αβHLA-DRヘテロダイマーがオリゴマ ーに結合されたことを明らかに確認した。MHC 結合ペプチドオリゴマーのAPCへの結合は情報伝達を生じる エフェクター細胞上のＴ細胞レセプターまたは二価のモノクローナル抗体との 相互作用の際のHLA-DRの推定されるオリゴマー化またはクラスター形成は、HLA- DRの細胞質内尾部に付着したタンパク質を介する細胞内情報伝達を生じる。情報 伝達の１つの結果は、いくつかの表面分子の発現のアップレギュレーションであ る。クラスII分子の３つのアイソタイプ（HLA-DR、-DP、および-DQ）ならびに細 胞付着分子ICAM-1の発現における増加を調べた。γインターフェロンの非存在下 でのMHC結合ペプチドオリゴマーの添加の際に増加は観察されなかったが、γイ ンターフェロンの添加(１〜10ng/ml)は、γインターフェロンのみの存在下で見 られたものより５〜10倍大きい表面発現における顕著な増加を生じた。HLA-DQ発 現における増加は、このクラスII MHCタンパク質のアイソタイプが少なくとも多 くの細胞型に関して最小に誘導性であり、本研究で使用されるものを含むため、 特に顕著である。他の細胞の表面分子の増強された発現とともに、ICAM-1の発現 における類似の増加が観察され、LG-2細胞の培養物中で常に見られる弱いホモタ イプの凝集の原因となり得る。ブドウ球菌エンテロトキシンＡ(SEA)を使用してH LA-DR分子を架橋した場合、１〜10ng/mlのγインターフェロンの存在下でのICAM -1の強く増強された発現もまた観察されたが、３つのクラスIIアイソタイプの発 現のレベルにおいて変化は見られなかった。これらの実験の条件下での他のオリ ゴマーまたはSEAを用いたB7.1またはB72.2発現の増強は、観察されなかった。HA306-318 のモノマーおよびオリゴマーによるHLA-DR1-拘束Ｔ細胞の刺激 最初に、HLA-DR1によって提示されるHA306-318に応答するHA1.7 Ｔ細胞クロー ンを使用した。これらの実験のために、HLA-DR1ドナー由来の末梢血単核細胞(PB MC)を、抗原提示細胞(APC)として使用した。HA306-318モノマー／オリゴマーが 、37℃でのHA1.7の刺激間に継続的に存在するか、またはAPCをモノマー／オリゴ マーで15分間パルスし、激しく洗浄した後、Ｔ細胞の刺激のために使用したかの いずれかであった。モノマー／オリゴマーが実験の間に継続的に存在する場合、 オリゴマーは、刺激因子としてモノマーより常に効率的であり；これらの実験に おいて、オリゴマーのサイズを増加させること（4マーから32マー）は、4マーに ついて10倍(１log)から16マーについて最大500倍(ほとんど３log)の増強を生じ ；増強はオリゴマーが大きくなるにつれて減少した。赤血球凝集素タンパク質に 関連した増強はなお大きく、16マーについて５より大きいlogに達した。予想さ れるように、クロロキン（エンドソームビヒクルの酸化を妨げる薬剤）の添加は 、抗原提示に対して効果を有さなかった（すなわち、オリゴマーは、提示のため に、エンドソーム／リソソーム区画での酸性プロテアーゼによる処理を必要とし ない）。 増強がさらに大きく、（これらの条件下でペプチド自体が非常に弱い生物学的 活性を呈したため、正確に見積もることは困難だが）モノマーと比較して16マー について約４logの増加に達したことを除いて、モノマー／オリゴマーが洗浄す る前の15分間に存在するパルス実験において、類似の結果が見られた。末梢Ｔ細胞応答のプライミング インビボでのワクチン接種に有用である免疫原性のこの劇的な増強のため、こ れらのオリゴマーは、末梢Ｔ細胞をプライミングし得なければならない。この疑 問を調べるため、PBMC中のＴ細胞およびAPCをプライミングのために使用した。P BMCを、モノマーまたはオリゴマーで、５pg/ml〜５μｇ/ml（すなわち、６logの 範囲にわたる）の用量で、IL-2の存在下で４週間にわたって刺激および再刺激し た。モノマーに関して、この様式でプライミングするための最小の用量は、0.5n g/mlであった。しかし、オリゴマー（例えば、12マーまたは16マー）に関して、 最小は５pg/ml（実際に試験した最小濃度）であった（従って、より低い濃度も また、有効であり得る）。「高」用量、0.5または５μｇ/mlでの、モノマーでの プライミングはなお明らかであったが、50ng/ml以上では、12マーまたは16マー では応答は見られなかった（すなわち、この実験は、大量域寛容を示すようであ る）。従って、オリゴマーは、インビボにおいて、エピトープとして正常または 改変のいずれかのペプチド配列を用いる高用量にて、免疫（Ｔ細胞のプライミン グ）および寛容の両方のために使用され得る。さらに、５または50pg/mlのオリ ゴマー(それぞれ、12G7および16F1)に応答して生成されたこれらのプライムされ たＴ細胞由来の株は、モノマー、オリゴマー、およびインタクトなタンパク質に 応答した。重要なことに、それらはまた、効率的な様式で、ウイルス感染細胞を 認識した。これらの事実は、インビボでのワクチン接種のためのそのような物質 の利用についての必須条件を確立する。 これらのデータは、クラスII MHC分子のダイマー化またはオリゴマー化（クラ スター形成）が、有効な免疫応答の必須成分であるという仮説についての直接的 な経験的支持を提供する。Ｔ細胞エピトープがアミノ酸リンカーによって結合さ れているオリゴマーは、インフルエンザウイルス赤血球凝集素由来のペプチドに 対する免疫応答の超活性化因子(superactivator)である。感受性において生じる 増加は極度であり、モノマーと比較して３〜４log、または赤血球凝集素タンパ ク質と比較して４〜５logに達する。驚くべきことに、本実験は、クラスII MHC 分子に結合するエピトープが、約125〜150アミノ酸（すなわち、５〜６のエピト ープ-リンカーサブユニット）によって占められていることを示唆する。この一 連の実験において最も有効なオリゴマーは、16の等しく占められるHA306-318エ ピトープを含む約50,000ダルトンのポリマーであり、おそらく、可溶性HLA-DR1 とのインキュベーションの際にクラスターにおいて最大の３つのHLA-DRヘテロダ イマーが形成されるのを可能にする。より小さなオリゴマーである、２つのHLA- DRサブユニットを含む少量のクラスターを形成し得る4マーおよび8マーは、効率 的に活性化しなかった。しかし、ポリマーに添加されたHLA-DR分子の数の検出を 溶液中の空のHLA-DR分子で得たが、細胞の活性化を、細胞表面上にHLA-DR分子を 含み、そして10〜20パーセントの程度にのみ空であるAPCによって実行した。従 って、天然のＴ細胞および以前にプライムしたＴ細胞クローンの両方の有効な活 性化を提供するクラスターの性質は、直接的な経験的研究を必要とする。 実施例２ 架橋したMHC結合ペプチドダイマーの生成 架橋したMHC結合ペプチドの２つの基本型を使用した。これらの初期の研究に おいて、MHC結合ペプチドをそれらのCOOH末端を介して架橋した。なぜなら、２ つのCOOH末端間の距離は、結晶学によって明らかにされている構造において最も 短いからである。第１に、２つのペプチドを、ポリエチレングリコール(PEG)の リンカーを使用して架橋した。ここで、平均分子量は800であり、ｎ（反復エチ レングリコールエレメントの数）は16を平均とし、長さは30〜40Åである。この 基本構造の改変体をまた使用し、ここでβ-アラニン分子(NH₂-CH₂-CH₂-COOH)を 、PEGでの縮合を容易にするために、ペプチドのカルボキシ末端の各々に添加し た。最終的には、エチレングリコールではなく、第２の型のリンカーを使用し、 ここでサルコシン(N-メチルグリシン、CH₃-NH-CH₂-COOH)が、オリゴマー化した サブユニットである。次いで、２つのサルコシンエレメントを、そのεおよびα アミノ基を介してリジンの単一の分子によって結合する。しかし、任意のジアミ ンがこの目的のために有用であり得ることは認められる。架橋したMHC結合ペプチドダイマーによるHEL-特異的ハイブリドーマの刺激 ニワトリ卵白リゾチーム(HEL)は、実験免疫学において使用される標準的タン パク質抗原である。免疫優性ペプチドは、アミノ酸52-61（HEL52-61）のコアを 有する。ペプチドHEL48-61およびHEL48-63は、このタンパク質抗原に対する免疫 応答の研究において頻繁に使用されている。このペプチド抗原に応答する多くの ハイブリドーマ（組織培養物における予めの増殖を可能にするためにミエローマ パートナーと融合した免疫Ｔ細胞）が調製されており、そしてこれは当該分野に おける標準的な試薬である。 ハイブリドーマが、HEL-48-61に対してよりも有効に応答するHEL48-63を使用 して、PEG-ダイマーに対する応答は、モノマーHEL48-63の応答より１〜２log有 効であった。さらに、この実験におけるさらなるコントロールは、第２のHEL48- 63ペプチド単位の添加なしでPEGが付着するHEL48-63であった。このコントロー ルペプチドに対する応答は、モノマー単独に対するもの以下であった。 β-Ala-PEGダイマーは、PEGダイマーよりさらにより有効であった。約70ng/ml の濃度を有する１つのハイブリドーマを用いて、モノマーと比較したPEGダイマ ーの増強は、少なくとも７〜10倍であったが、β-Ala-PEGダイマーの増強は、少 なくとも25〜30倍であった。より低いペプチド濃度にて応答する第２のハイブリ ドーマを用いて、７ng/mlのPEGダイマーへの応答は約20倍増強されたが、β-Ala -PEGダイマーの増強は60〜70倍増強された。β-Ala-PEGダイマーの増強した有効 性は、低濃度にて特に明らかであった。特に、ハイブリドーマ3A9 N49-11を５ng /mlにて14時間用いた場合、モノマーに対する応答は実質的に見られなかったが 、β-Ala-PEGダイマーに対するほぼ最大の応答（50〜100倍の増強）が見られた 。インビボでの免疫では低濃度のみのペプチド抗原が得られることを強調するこ とは重要である。これらの実験は、２つのハイブリドーマ(3A9.9および3A9.N49- 11（この両方は、同じＴ細胞レセプターを発現する）)でのMHC結合ペプチドオリ ゴマーの有効性を示した。この現象が特定のＴ細胞レセプターに関連していない ことが、２つのさらなるハイブリドーマ(1C5および4G4)が調べられた実験によっ て示される。β-Ala-PEGダイマーに対する増強した応答は、再度はっきりと明ら かになった。 これらの研究をヒト系にまで広げるために、インフルエンザウイルスタンパク 質に対する免疫応答を有した２つの個体から得たヒトＴ細胞を用いて同様の実験 を実行した。すべての場合におけるβ-Ala-PEGダイマーは、増強した応答を提供 した。 リンカー（例えば、HEL48-63の２つのMHC結合ペプチドサブユニット間のポリ エチレングリコールリンカー）の性質の効果を調べるために、２つの結合ペプチ ド単位を、平均サイズ18のサルコシンエレメント＋１つのリジンを有するサルコ シンリンカーを介して架橋した結合ダイマーを調べた。増強した増殖が、この物 質に関して得られ、再度１〜２logであった。 実施例３ インビトロでの末梢血Ｔ細胞の刺激 MHC結合ペプチドオリゴマーが、末梢血Ｔ細胞の免疫応答を誘発する際に有効 であるか否かを決定するために、インビトロでの刺激実験を実行した。ここで、 PBMC（末梢血単核細胞）を、HA306-318 MHC結合ペプチドモノマーまたはHA12マ ーに、５pg/ml〜５μｇ/ml（すなわち、６logの範囲にわたる）の抗原用量で曝 露した。各濃度を、６つの別個のウェル(それぞれ約100,000個のPBMCを含む)を 調製することによって試験した。HA306-318モノマーまたはHA12マーのいずれか での２回の刺激後、これらの培養物の特異的増殖応答を、抗原負荷標的細胞でイ ンビトロ培養物をチャレンジすることによって決定した。 HA306-318エピトープについて特異的であることが見出されたすべてのＴ細胞 株は、モノマーパルス標的ならびに32マーでパルスした標的の両方を認識した。 それらのいずれも２つの抗原のうちのいずれかひとつのみにも応答しなかった。 このことは、オリゴマーでの刺激によって確立されたＴ細胞株もまた、モノマー ペプチド抗原を有効に認識し、そしてその逆もあることを示した。インビトロ培 養物の誘導についての用量応答パターンは、HAl2マーがペプチドより少なくとも ２log有効であることを示した：ペプチドに関して、HA-特異的Ｔ細胞株の確立の ために必要とされる最小用量は、0.5ng/mlであることが見出されたが、12マーで の効率的な刺激は、これらの実験において使用される最も低濃度である５pg/ml にてなお明らかであった。 これらの結果は、HAオリゴマーが、末梢血のHA-特異的Ｔ細胞を刺激し、そし てそれらの拡張を促進する強力な化合物を示すことを実証する。それらはまた、 増強した免疫原性がいくつかのＴ細胞クローンにただ限定されず、むしろすべて のHA306-318特異的Ｔ細胞に当てはまるようである一般的な現象を示すことを暗 示する。２〜３logでの感受性において観察された増加は、Ｔ細胞クローンHA1.7 での刺激実験において得られたデータを暗示し、そして類似の用量応答パターン がまた、このインビトロ刺激によって確立されたＴ細胞株を用いたいくつかのそ の後の実験において見出された。 PBMCのインビトロでの刺激はまた、HAオリゴマーの別の重要な特徴を示した： 高用量の12マーで刺激されたインビトロ培養物についての特異的応答は検出され なかった。この知見は、Ｔ細胞への極度に高用量のペプチド抗原への曝露後の抗 原特異的Ｔ細胞応答の欠失を特徴とする現象である、大量域寛容を反映するよう である。機構的に、大量域寛容は、２つの方法によって達成され得る：アネルギ ーの誘導（非応答性の状態へのＴ細胞の転移をいう）によってか、または反応性 Ｔ細胞の物理的除去による。これらの機構の両方は、おそらくインビトロ培養物 において観察される12マー誘導性大量域寛容の原因である。一方では、非応答性 CD4⁺細胞の実質的な画分は、オリゴマー処理を生存し、それらはアネルギー性細 胞（例えば、TCR^low、CD2^high、IL2R^high)の細胞表面マーカーを有する。他方で は、確立されたHA306-318-特異的Ｔ細胞株が高オリゴマー濃度に曝露される場合 、除去が特に明らかである。１つのそのような実験において、５ng/mlのモノマ ー(PD2)で本来刺激したＴ細胞株の細胞数を、HA306-318モノマーまたはHA12マー の添加の４、７、および13日後にモニターした。これらの条件下でのモノマーと のインキュベーションは、Ｔ細胞の数における増加を導くのに対して、５または 50μｇ/mlの12マーで処置したPD2細胞は、４日までに細胞数において劇的な減少 を示す。ペプチドモノマーの刺激効果とオリゴマーの寛容効果との間の差異は、 特に13日目に明らかである：その時点で、最も高いペプチド濃度でさえ、Ｔ細胞 集団は、もとの数の約６〜７倍に拡大したが、一方、５または50μｇ/mlのオリ ゴマーで処理したＴ細胞の数は、10％未満に減少した。コントロール実験は、こ の除去が抗原特異的およびMHC-拘束であることを示した。 インビトロでの刺激について、PBMCを、Ficoll Paqueクッション(Pharmacia) 上での遠心分離によってHLA-DR1-拘束ドナーの血液から単離した。細胞を、96- ウェル丸底プレート中に移し、そして滴定した量のHA306-318モノマーまたはHA1 2マーの添加によって刺激した。各濃度について、刺激を、６つの別々のウェル （それぞれ約100,000PBMCを含む）中で実行した。陰性コントロールとして12個 のウェルを保持し、ここでは抗原を添加しなかった。インビトロ培養物を、標準 的なプロトコルに従って、５％の自家ヒト血清を補充したRPMI培地中に維持した 。７日目に、５U/mlのIL2(Boehringer)を添加した。12日目に、培養物を、約100 ,000個の放射した自家PBMC(6000rad)とともにの初回刺激に使用した同じ抗原濃 度を添加することによって再刺激した。IL-2を15日目に添加した。 さらに２週間後、HA306-318エピトープに対する特異的な応答を、増殖アッセ イにおいて試験した。このアッセイのために、30μｌのインビトロ培養物の各ウ ェルを、96-ウェル丸底プレート中に移し、そして約25,000個の放射した自家EBV -形質転換Ｂ細胞(6000rad)とともにインキュベートした。EBV-形質転換Ｂ細胞は 、事前に5,000ng/mlのHA306-318モノマーまたはHA32マーで30'間パルスしたか、 または抗原なしでインキュベートした。実験をRPMI 10％ヒト血清(BioWhitaker) 中で実行した。48時間後、³H-チミジン(５μＣｉ/ml)を添加し、そしてさらに24 時間後、アッセイを収集し、そしてMicroBetaプレート-リーダー(Wallac Oy,Fin land)中で計数した。 刺激効率を、抗原負荷標的細胞によって誘発された特異的な増殖応答とEBV-細 胞自体に対して指向された非特異的応答との比を示す刺激-インデックスを計算 することによって決定した： このインビトロでの刺激（例えば、PD2)によって得たいくつかのＴ細胞株を、 維持し、そしてさらに拡大した。これらの株について、すべてのその後の回の再 刺激を、２週間ごとに、事前に５μｇ/mlのHA306-318モノマーで２時間パルスし た約25,000個の放射した自家EBV形質転換Ｂ細胞／ウェル、およびRPMI 10％ヒト 血清(BioWhitaker)中の約100,000個の放射した異種PBMCを用いて実行した。再刺 激の３日後、５U/mlのIL2(Boehringer)を添加した。 増殖アッセイのために、96-ウェル丸底プレートを、10％のウシ胎児血清(FCS) を補充したRPMIとともに使用した。放射したPBMCを、上記のように単離し、そし て標的細胞として使用した。約150,000個のPBMC／ウェルを、滴定した量の抗原 とともに37℃にて２時間インキュベートし、その後約50,000個のＴ細胞／ウェル を添加した。48時間後、５μＣｉ/mlの³H-チミジンを添加し、そして72時間後、 アッセイを収集し、そしてMicroBetaプレート-リーダー(Wallac Oy，Finland)中 で計数した。 大量域寛容アッセイのために、約25,000個の放射した自家EBV形質転換Ｂ細胞 とともに約50,000個のＴ細胞を、10U/mlのIL2を補充したRPMI/10％ヒト血清中で 、96-ウェル丸底プレート中の滴定した量の抗原とともにインキュベートした。 ５日目に、RPMI/10％ヒト血清、10U/mlのIL2を用いて、１：１スプリットを実行 した。４、７、および13日目に、生存Ｔ細胞の数をFACS分析によって決定した。 その決定のために、細胞をヨウ化プロピジウム(Boehringer)で染色し、そして培 養物の80μｌのアリコートの細胞流動を、ライフ-ゲートを通過する１分あたり の細胞の数によって決定した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 フォーク，クリステン アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02144，ソマービル，バンクス ストリー ト １エイ (72)発明者 ローツシュケ，オラフ アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02144，ソマービル，バンクス ストリー ト １エイ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．可撓性分子リンカーにより共有結合された少なくとも２個のMHC結合ペプチ ドを含む、MHC結合ペプチドオリゴマー。 ２．前記MHC結合ペプチドが、可撓性分子リンカーによりＣ末端からＣ末端へと 共有結合されたMHCクラスＩ結合ペプチドである、請求項１に記載のオリゴマー 。 ３．前記可撓性分子リンカーが、インビトロで化学合成技術により生成される、 請求項２に記載のオリゴマー。 ４．前記MHC結合ペプチドが、MHCクラスII結合ペプチドである、請求項１に記載 のオリゴマー。 ５．前記MHCクラスII結合ペプチドが、Ｎ末端からＣ末端へと共有結合される、 請求項４に記載のオリゴマー。 ６．前記可撓性分子リンカーが、天然に存在するアミノ酸を含む、請求項５に記 載のオリゴマー。 ７．前記可撓性分子リンカーが、インビボで生合成技術により生成される、請求 項６に記載のオリゴマー。 ８．前記可撓性分子リンカーが、インビトロで化学合成技術により生成される、 請求項５に記載のオリゴマー。 ９．前記MHC結合ペプチドが、Ｃ末端からＣ末端へと共有結合される、請求項４ に記載のオリゴマー。 １０．インビトロで化学合成技術により生成される、請求項９に記載のオリゴマ ー。 １１．前記MHCクラス結合ペプチドが、Ｎ末端からＮ末端へと共有結合される、 請求項４に記載のオリゴマー。 １２．インビトロで化学合成技術により生成される、請求項１１に記載のオリゴ マー。 １３．所定のMHCクラスＩ分子とともに所定の抗原性ペプチドを提示する細胞に 対してCD8⁺T細胞を特異的に活性化するための組成物におけるMHC結合ペプチドオ リゴマーの使用であって、ここで、該特異的活性化が、以下： (a)可撓性分子リンカーにより共有結合された少なくとも２個の作用性MHCクラ スＩ結合ペプチドを含むMHC結合ペプチドオリゴマーを提供する工程であって、 該MHCクラスＩ結合ペプチドは、該所定の抗原性ペプチドに対応する、工程；お よび (b)生理学的条件下で、該MHCクラスＩ分子をその細胞表面上に有する細胞を、 工程(a)のオリゴマーと接触させる工程、 により達成される、使用。 １４．前記２個のMHCクラスＩ結合ペプチドが、可撓性分子リンカーによりＣ末 端からＣ末端へと共有結合される、請求項１３に記載の使用。 １５．前記可撓性分子リンカーが、インビトロで化学合成技術により生成される 、請求項１６に記載の使用。 １６．所定のMHCクラスＩ分子とともに所定の抗原性ペプチドを提示する細胞に 対してCD8⁺T細胞の活性化を特異的に阻害するための組成物におけるMHC結合ペプ チドオリゴマーの使用であって、ここで、該特異的阻害が、以下： (a)可撓性分子リンカーによりＣ末端からＣ末端へと共有結合された少なくと も２個の非作用性MHCクラスＩ結合ペプチドを含むMHC結合ペプチドオリゴマーを 提供する工程であって、該MHCクラスＩ結合ペプチドは、該所定の抗原性ペプチ ドに対応する、工程；および (b)生理学的条件下で、該MHCクラスＩ分子をその細胞表面上に有する細胞を、 工程(a)のオリゴマーと接触させる工程、 により達成される、使用。 １７．前記非作用性ペプチドが、拮抗性ペプチド、不応答性ペプチド、ブロッキ ングペプチド、寛容化誘導ペプチド、およびアポトーシス誘導ペプチドからなる 群より選択される、請求項１６に記載の使用。 １８．前記可撓性分子リンカーが、インビトロで化学合成技術により生成される 、請求項１７に記載の使用。 １９．所定のMHCクラスII分子とともに所定の抗原性ペプチドを提示する細胞に 対してCD4⁺T細胞を活性化するための組成物におけるMHC結合ペプチドオリゴマー の使用であって、ここで、該活性化が、以下： (a)可撓性分子リンカーにより共有結合された少なくとも２個の作用性MHCクラ スII結合ペプチドを含むMHC結合ペプチドオリゴマーを提供する工程であって、 該MHCクラスII結合ペプチドは、該所定の抗原性ペプチドを含む、工程；および (b)生理学的条件下で、該MHCクラスII分子をその細胞表面上に有する細胞を、 工程(a)のオリゴマーと接触させる工程、 により達成される、使用。 ２０．前記MHC結合ペプチドが、Ｎ末端からＣ末端へと共有結合される、請求項 １９に記載の使用。 ２１．前記可撓性分子リンカーが、天然に存在するアミノ酸を含む、請求項２０ に記載の使用。 ２２．前記可撓性分子リンカーが、インビボで生合成技術により生成される、請 求項２１に記載の使用。 ２３．前記可撓性分子リンカーが、インビトロで化学合成技術により生成される 、請求項２０に記載の使用。 ２４．前記MHCクラスII結合ペプチドが、Ｃ末端からＣ末端へと共有結合される 、請求項１９に記載の使用。 ２５．前記可撓性分子リンカーが、インビトロで化学合成技術により生成される 、請求項２４に記載の使用。 ２６．前記MHC結合ペプチドが、Ｎ末端からＮ末端へと共有結合される、請求項 １９に記載の使用。 ２７．前記可撓性分子リンカーが、インビトロで化学合成技術により生成される 、請求項２６に記載の使用。 ２８．所定のMHCクラスII分子とともに所定の抗原性ペプチドを提示する細胞に 対してCD4⁺T細胞の活性化を特異的に阻害するための組成物におけるMHC結合ペプ チドオリゴマーの使用であって、ここで、該特異的阻害が、以下： (a)可撓性分子リンカーにより共有結合された少なくとも２個の非作用性MHCク ラスII結合ペプチドを含むMHC結合ペプチドオリゴマーを提供する工程；および (b)生理学的条件下で、該MHCクラスII分子をその細胞表面上に有する細胞を、 工程(a)のオリゴマーと接触させる工程、 により達成される、使用。 ２９．前記非作用性ペプチドが、拮抗性ペプチド、不応答性ペプチド、ブロッキ ングペプチド、寛容化誘導ペプチド、およびアポトーシス誘導ペプチドからなる 群より選択される、請求項２８に記載の使用。 ３０．前記MHCクラスII結合ペプチドが、Ｎ末端からＣ末端へと共有結合される 、請求項２９に記載の使用。 ３１．前記可撓性分子リンカーが、天然に存在するアミノ酸を含む、請求項３０ に記載の使用。 ３２．前記可撓性分子リンカーが、インビボで生合成技術により生成される、請 求項３１に記載の使用。 ３３．前記可撓性分子リンカーが、インビトロで化学合成技術により生成される 、請求項３０に記載の使用。 ３４．前記MHCクラスII結合ペプチドが、Ｃ末端からＣ末端へと共有結合される 、請求項２９に記載の使用。 ３５．前記可撓性分子リンカーが、インビトロで化学合成技術により生成される 、請求項３２に記載の使用。 ３６．前記MHC結合ペプチドが、Ｎ末端からＮ末端へと共有結合される、請求項 ２９に記載の使用。 ３７．前記可撓性分子リンカーが、インビトロで化学合成技術により生成される 、請求項２０に記載の使用。 ３８．所定の病原体に対する遺伝的免疫のための医薬におけるMHC結合ペプチド オリゴマーをコードするDNA配列の使用であって、ここで、該免疫が、以下： (a)哺乳動物細胞において複製および発現し得る発現ベクター中の、可撓性分 子リンカーにより共有結合された、該病原体由来の少なくとも２個の免疫原性MH C結合ペプチドを含むMHC結合ペプチドオリゴマーをコードする該DNA配列を提供 する工程；および (b)工程(a)の該発現ベクターを、免疫されるべき個体の該細胞中に導入する工 程、 により達成される、使用。 ３９．個体から腫瘍細胞を除去するための医薬におけるMHC結合ペプチドオリゴ マーの使用であって、ここで、該除去が、以下： (a)可撓性分子リンカーにより共有結合された、少なくとも２個の作用性の腫 瘍特異的MHC結合ペプチドを含むMHC結合ペプチドオリゴマーを提供する工程；お よび (b)生理学的条件下で、MHC分子をその細胞表面上に有する細胞を、工程(a)の オリゴマーと接触させる工程、 により達成される、使用。 ４０．前記MHC分子が、MHCクラスＩ分子およびMHCクラスII分子からなる群より 選択される、請求項３９に記載の使用。 ４１．所定のMHC分子を伴う所定の抗原性ペプチドによるＴ細胞の活性化を特異 的に阻害するための組成物におけるMHC結合ペプチドオリゴマーの使用であって 、ここで、該特異的阻害が、以下： (a)可撓性分子リンカーにより共有結合された、少なくとも２個の該抗原性ペ プチドを含むMHC結合ペプチドオリゴマーを提供する工程；および (b)生理学的条件下で、該MHC分子をその細胞表面上に有する細胞を、工程(a) のオリゴマーと、大量域寛容の誘導に十分な濃度で接触させる工程、 により達成される、使用。 ４２．前記Ｔ細胞が、CD4⁺である、請求項４１に記載の使用。 ４３．前記Ｔ細胞が、CD8⁺である、請求項４１に記載の使用。 ４４．免疫調節組成物を製造するためのMHC結合ペプチドオリゴマーの使用であ って、以下： (a)MHC結合ペプチドを同定する工程；および (b)可撓性分子リンカーにより共有結合された、工程(a)の少なくとも２コピー のMHC結合ペプチドを含むMHC結合ペプチドオリゴマーを調製する工程、 を包含する、使用。 ４５．前記可撓性分子リンカーが、少なくとも約50〜80Åのバックボーン長を有 する、請求項１３〜４４のいずれか１項に記載の使用。 ４６．前記可撓性分子リンカーが、少なくとも約540Åのバックボーン長を有す る、請求項１３〜４４のいずれか１項に記載の使用。 ４７．前記可撓性分子リンカーが、少なくとも約10〜20アミノ酸残基を含む、請 求項１３〜４４のいずれか１項に記載の使用。 ４８．前記可撓性分子リンカーが、少なくとも約125アミノ酸残基を含む、請求 項１３〜４４のいずれか１項に記載の使用。 ４９．前記可撓性分子リンカーが、有機酸、アルデヒド、アルコール、チオール 、またはアミンのポリマーまたはコポリマーを含む、請求項１３〜２０、２３〜 ３０、または３３〜３７、３９〜４４のいずれか１項に記載の使用。 ５０．前記可撓性分子リンカーが、ヒドロキシ-、アミノ-、またはジ-カルボン 酸のポリマーまたはコポリマーを含む、請求項１３〜２０、２３〜３０、または ３３〜３７、３９〜４４のいずれか１項に記載の使用。 ５１．前記可撓性分子リンカーが、グリコール酸、乳酸、セバシン酸、またはサ ルコシンのポリマーまたはコポリマーを含む、請求項１３〜２０、２３〜３０、 または３３〜３７、３９〜４４のいずれか１項に記載の使用。 ５２．前記可撓性分子リンカーが、飽和または不飽和の炭化水素のポリマーまた はコポリマーを含む、請求項１３〜２０、２３〜３０、または３３〜３７、３９ 〜４４のいずれか１項に記載の使用。 ５３．前記可撓性分子リンカーが、エチレングリコール、プロピレングリコール 、またはサッカライドのポリマーまたはコポリマーを含む、請求項１３〜２０、 ２３〜３０、または３３〜３７、３９〜４４のいずれか１項に記載の使用。 ５４．前記可撓性分子リンカーが、ポリエチレングリコールおよびβ-アラニン またはリジンのポリマーを含む、請求項１３〜２０、２３〜３０、または３３〜 ３７、３９〜４４のいずれか１項に記載の使用。 ５５．前記可撓性分子リンカーが、天然に存在しないアミノ酸のポリマーまたは コポリマーを含む、請求項１３〜２０、２３〜３０、または３３〜３７、３９〜 ４４のいずれか１項に記載の使用。 ５６．前記可撓性分子リンカーが、サルコシンおよびリジンまたはβ-アラニン のポリマーを含む、請求項１３〜２０、２３〜３０、または３３〜３７、３９〜 ４４のいずれか１項に記載の使用。 ５７．前記MHC結合ペプチドが、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）、プロテオリ ピドタンパク質（PLP）、AChRα、コラーゲンII型、HSP70、およびグルタミン酸 デカルボシキシラーゼからなる群より選択されるタンパク質に由来するヒトの自 己抗原性ペプチドを含む、請求項１３〜５６のいずれか１項に記載の使用。 ５８．前記MHC結合ペプチドオリゴマーが、少なくとも４個のMHC結合ペプチドを 含む、請求項１３〜５６のいずれか１項に記載の使用。 ５９．前記MHC結合ペプチドオリゴマーが、少なくとも８個のMHC結合ペプチドを 含む、請求項１３〜５６のいずれか１項に記載の使用。 ６０．前記MHC結合ペプチドオリゴマーが、少なくとも16個のMHC結合ペプチドを 含む、請求項１３〜５６のいずれか１項に記載の使用。 ６１．前記可撓性分子リンカーが、少なくとも約50〜80Åのバックボーン長を有 する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のオリゴマー。 ６２．前記可撓性分子リンカーが、少なくとも約540Åのバックボーン長を有す る、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のオリゴマー。 ６３．前記可撓性分子リンカーが、少なくとも約10〜20アミノ酸残基を含む、請 求項１〜１２のいずれか１項に記載のオリゴマー。 ６４．前記可撓性分子リンカーが、少なくとも約125アミノ酸残基を含む、請求 項１〜１２のいずれか１項に記載のオリゴマー。 ６５．前記可撓性分子リンカーが、有機酸、アルデヒド、アルコール、チオール 、またはアミンのポリマーまたはコポリマーを含む、請求項１〜１２のいずれか １項に記載のオリゴマー。 ６６．前記可撓性分子リンカーが、ヒドロキシ-、アミノ-、またはジ-カルボン 酸のポリマーまたはコポリマーを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の オリゴマー。 ６７．前記可撓性分子リンカーが、グリコール酸、乳酸、セバシン酸、またはサ ルコシンのポリマーまたはコポリマーを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に 記載のオリゴマー。 ６８．前記可撓性分子リンカーが、飽和または不飽和の炭化水素のポリマーまた はコポリマーを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のオリゴマー。 ６９．前記可撓性分子リンカーが、エチレングリコール、プロピレングリコール 、またはサッカライドのポリマーまたはコポリマーを含む、請求項１〜１２のい ずれか１項に記載のオリゴマー。 ７０．前記可撓性分子リンカーが、ポリエチレングリコールおよびβ-アラニン またはリジンのポリマーを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のオリゴ マー。 ７１．前記可撓性分子リンカーが、天然に存在しないアミノ酸のポリマーまたは コポリマーを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のオリゴマー。 ７２．前記可撓性分子リンカーが、サルコシンおよびリジンまたはβ-アラニン のポリマーを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のオリゴマー。 ７３．前記MHC結合ペプチドが、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）、プロテオリ ピドタンパク質（PLP）、AChRα、コラーゲンII型、HSP70、およびグルタミン酸 デカルボシキシラーゼからなる群より選択されるヒトの自己反応性ペプチドを含 む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のオリゴマー。 ７４．前記MHC結合ペプチドオリゴマーが、少なくとも４個のMHC結合ペプチドを 含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のオリゴマー。 ７５．前記MHC結合ペプチドオリゴマーが、少なくとも８個のMHC結合ペプチドを 含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のオリゴマー。 ７６．前記MHC結合ペプチドオリゴマーが、少なくとも16個のMHC結合ペプチドを 含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のMHCオリゴマー。 ７７．前記MHC結合ペプチドが、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）の残基57〜75 、残基81〜99、残基82〜100、残基83〜97、残基83〜99、残基84〜102、残基87〜 99、残基87〜106、残基131〜145、残基131〜159、残基139〜153、残基143〜168 、残基148〜162、残基149〜162、および残基154〜172からなる群より選択される アミノ酸配列を含む、請求項５７に記載の使用。 ７８．前記MHC結合ペプチドが、プロテオリピドタンパク質（PLP）の残基40〜60 、残基89〜106、および残基139〜151からなる群より選択されるアミノ酸残基を 含むアミノ酸配列を含む、請求項５７に記載の使用。 ７９．前記MHC結合ペプチドが、AChRαの残基48〜67、残基55〜63、残基144〜16 3、残基146〜162、残基195〜212、残基214〜234、残基259〜271、残基311〜318 、および残基387〜405からなる群より選択されるアミノ酸残基を含むアミノ酸配 列を含む、請求項５７に記載の使用。 ８０．前記MHC結合ペプチドが、コラーゲンII型の残基258〜260、残基258〜270 、残基259〜273、残基260〜267、残基261〜273、残基262〜270、および残基263 〜270からなる群より選択されるアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を含む、請求 項５７に記載の使用。 ８１．前記MHC結合ペプチドが、M．tuberculumのHSP70タンパク質の残基150〜16 9、残基221〜240、および残基261〜280からなる群より選択されるHSP70のアミノ 酸残基を含むアミノ酸配列を含む、請求項５７に記載の使用。 ８２．前記MHC結合ペプチドが、グルタミン酸デカルボキシラーゼの残基78〜97 、残基202〜211、残基217〜236、および残基247〜279からなる群より選択される アミノ酸残基を含むアミノ酸配列を含む、請求項５７に記載の使用。 ８３．前記MHC結合ペプチドが、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）の残基57〜75 、残基81〜99、残基82〜100、残基83〜97、残基83〜99、残基84〜102、残基87〜 99、残基87〜106、残基131〜145、残基131〜159、残基139〜153、残基143〜168 、残基148〜162、残基149〜162、および残基154〜172からなる群より選択される アミノ酸残基を含むアミノ酸配列を含む、請求項７３に記載の使用。 ８４．前記MHC結合ペプチドが、プロテオリピドタンパク質（PLP）の残基40〜60 、残基89〜106、および残基139〜151からなる群より選択されるアミノ酸残基を 含むアミノ酸配列を含む、請求項７３に記載の使用。 ８５．前記MHC結合ペプチドが、AChRαの残基48〜67、残基55〜63、残基144〜16 3、残基146〜162、残基195〜212、残基214〜234、残基259〜271、残基311〜318 、および残基387〜405からなる群より選択されるアミノ酸残基を含むアミノ酸配 列を含む、請求項７３に記載の使用。 ８６．前記MHC結合ペプチドが、コラーゲンII型の残基258〜260、残基258〜270 、残基259〜273、残基260〜267、残基261〜273、残基262〜270、および残基263 〜270からなる群より選択されるアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を含む、請求 項７３に記載の使用。 ８７．前記MHC結合ペプチドが、M．tuberculumのHSP70タンパク質の残基150〜16 9、残基221〜240、および残基261〜280からなる群より選択されるアミノ酸残基 を含むアミノ酸配列を含む、請求項７３に記載の使用。 ８８．前記MHC結合ペプチドが、グルタミン酸デカルボキシラーゼの残基78〜97 、残基202〜211、残基217〜236、および残基247〜279からなる群より選択される アミノ酸残基を含むアミノ酸配列を含む、請求項７３に記載の使用。