【発明の詳細な説明】
天然原料からの結晶β−カロチンの回収方法発明の分野
本発明は、天然原料からのカロチノイドの回収の分野に関する。発明の背景
現在、高純度（９６％以上）のβ−カロチン結晶は、化学合成によって製造さ
れる。天然原料から得た場合、β−カロチンは、ほとんどが油状抽出物の形態（
パーム油、藻の油）である。植物（例えばニンジン）や微生物（例えば藻類（デ
ュナリエラ(Dunaliella)）や真菌(ブラケスレア(Blakeslea))）のような天然原
料からもβ−カロチン結晶を得ることができるが、比較的純粋な結晶をそのよう
な天然原料から得るための現在利用可能な方法には、重大な不利益がある。
β−カロチン結晶を天然原料から精製するための現在の方法は、一般的に抽出
工程及び付加的な精製工程を含む。
抽出は、種々の抽出溶媒、つまり酢酸エチル、酢酸ブチル又はヘキサンのよう
な有機溶媒、植物油、又はプロパン、エチレン、ＣＯ2のような超臨界流体で行
われる。
比較的純粋なβ−カロチン調製物を得るために、更に抽出物の精製が必要であ
る。クロマトグラフィ、吸着／脱着工程及び結晶化又は沈殿のような、いくらか
の精製工程が説明されている。
直接抽出物から結晶化するβ−カロチン結晶は、好適な天然原料の溶媒抽出後
に、例えば、溶媒を蒸発して得られるが、一般的に、例えば、合成β−カロチン
の純度に匹敵する所望の高純度を有することはない。そのような場合、再結晶が
必要である（オランダ特許第6411184号、米国特許第4439629号明細書）。再結晶
の主な欠点は、大量の溶媒がβ−カロチンを可溶化するために要求されることで
ある。加えて、β−カロチンを十分高い収率で再結晶するために、大量の反溶媒
（沈殿溶媒）が、同様に必要となる。従って、これらの方法は、大量の溶媒が
要求され、β−カロチンのかなりの損失がたいてい生じ得る。発明の概要
本発明は、少なくとも純度９０％のβ−カロチン結晶を、天然原料から調製す
る方法について開示する。当該方法は、以下の工程を有する。
(１)β−カロチンを当該天然原料から溶媒抽出してβ−カロチン抽出物を生成す
る工程、
(２)β−カロチンを当該抽出物から結晶化して粗製のβ−カロチン結晶を生成す
る工程、
(３)前記粗製のβ−カロチン結晶をβ−カロチンが低溶解性を示す溶媒からなる
群から選ばれた溶媒で処理する工程、
(４)任意に、前記溶媒処理を、β−カロチンが低溶解性を示す前記溶媒と同一又
は異なる溶媒で繰り返す工程、
(５)残りの溶媒を結晶から蒸発する工程。
任意に、天然原料の溶媒抽出後に得られたβ−カロチン抽出物は、β−カロチ
ンの結晶化前に水洗される。
好ましい態様として、本発明の方法は、結晶β−カロチン調製物を天然原料か
ら純度９５％以上で提供する。
本発明の方法は、いくらか不純な結晶β−カロチン調製物のβ−カロチン含有
量を増加するために都合よく使用され得る。発明の詳細な説明
本発明は、高純度β−カロチン結晶を天然原料から高収率で回収する方法を開
示する。本発明により、高純度β−カロチン結晶は、粗製β−カロチンから単純
かつ便利な溶媒処理を使用して回収される。本発明の方法は、粗製のβ−カロチ
ン結晶調製物を、β−カロチンが低溶解性を示す溶媒で処理することを含む。
本発明の方法に付される粗製β−カロチン結晶は、従来の抽出及び結晶化技術
によって得られる。一般的に、天然原料からのβ−カロチンの抽出は、有機溶媒
、植物油又は超臨界流体で行われる。その後の結晶化又は沈殿は、冷却、溶媒の
蒸
発、又は反溶媒の添加のような方法によって行われ、その後結晶はろ過される。
粗製結晶のβ−カロチン含有量は、主に単離に使用される天然原料に依存する
のに対し、適用された結晶化手順は、付加的に同様に作用し得る。一般的に、当
該β−カロチン含有量は、６０〜９０％の間で変化する。
驚くべきことに、本発明による粗製結晶の溶媒処理は、結晶のβ−カロチン含
有量をかなり増加する。溶媒処理後に得られた結晶は、９０％以上のβ−カロチ
ン含有量、好ましくは９２％以上のβ−カロチン含有量、より好ましくは９４％
以上のβ−カロチン含有量を有する。
本発明による方法において、粗製β−カロチン結晶は、β−カロチンが低溶解
性を示す溶媒で処理される。本発明の溶媒処理は、粗製β−カロチン結晶を当該
溶媒中で不純物が溶解できる十分な時間撹拌する工程、結晶をろ過する工程、及
び結晶を数時間新しい溶媒で洗浄する工程を含む。任意にこの処理は、１回以上
繰り返される。最洗浄工程の後、残りの溶媒を蒸発する。
本発明による処理で使用するのに好適な溶媒は、β−カロチンが低溶解性を示
すような溶媒であり、即ち多くても２５℃で１g/リットルの溶解性のものである
。好ましくは、そのような溶媒は、水又は有機溶媒である。
水を使用する場合、水のｐＨは本発明の処理に重大な要素とはならないが、ｐ
Ｈは７以下が好ましい。より好ましくは水のｐＨは４〜６である。
有機溶媒とは、好ましくは低級アルコール又はその低級アシルエステル、又は
アセトンをいい、ここで低級とは、直鎖又は分岐鎖の１〜５個の炭素原子からな
るものと理解される。より好ましくは、有機溶媒はエタノール又は酢酸エチルで
ある。
β−カロチンが低溶解性を示す溶媒は、十分な量が適用されてかなりの量の不
純物を除去する。好ましくは、溶媒と結晶との比は、結晶のグラム当たり５ml以
上の溶媒であり、より好ましくは、結晶のグラム当たり５ml〜１０mlであり、最
も好ましくは、結晶のグラム当たり２０ml〜４０mlである。溶媒体積／結晶ｇの
上限は、技術的限界ではなく、経済的基準によって決まる。
溶液中の不純物の溶解に必要な時間は、撹拌を行っている温度に依存する。一
般的に、撹拌は、溶媒の沸点より低い温度で行われる。好ましくは、撹拌は２０
〜８０℃の温度、より好ましくは３０〜６０℃、最も好ましくは５０℃で行われ
る。
使用される溶媒中におけるβ−カロチンの溶解性は、撹拌工程の温度にも影響
し得る。β−カロチンが比較的低い溶解性を示す溶媒、例えば、エタノールを使
用すると、撹拌は、上昇した温度、例えば５０℃で行うことが好ましいのに対し
、β−カロチンが比較的高い溶解性を示す溶媒、例えば、酢酸エチルを使用する
と、撹拌温度は、例えば２０〜２５℃のような低い範囲で選択されてもよい。
β−カロチンが比較的高い溶解性を示す溶媒を使用する場合、任意に撹拌温度
をより高いレベル、例えば５０℃に保持し、混合物を撹拌後に、例えば５〜２０
℃のようなより低い温度に冷却し、比較的高いβ−カロチンの損失を防止するこ
とか好ましい。
５０℃で、好適な撹拌時間は、例えば約３０分である。
本発明は、その後に粗製β−カロチン結晶を、β−カロチンが低溶解性を示す
２以上の異なる溶媒で処理することの選択肢も考慮する。
更に任意に、天然原料を水で溶媒抽出することによって得られた抽出物の洗浄
を、β−カロチンの抽出物からの結晶化に先立って行う。この態様において、使
用した水の量はそれほど重要ではないが、良好な相分離が得られるような水量を
選択することが適切だろう。
本発明は、β−カロチン結晶のβ−カロチン含有量を増加するための単純かつ
便利な方法を提供する。本発明の溶媒処理は、天然原料（植物又は微生物）から
得ることができ、純度が望むほどは高くない、いかなる結晶β−カロチン調製物
にも有利に適用される。加えて、本発明の方法は、β−カロチン以外の天然カロ
チノイドの粗製結晶調製物に適用され得る。
好ましくは、本発明の方法は、微生物原料から、より好ましくは藻類又は真菌
（イースト菌を含む）から、更により好ましくは他のムコラーレス目(the order
Mucorales)から、最も好ましくはブラケスレア・トリスポラ(Blakeslea trispo
ra）から得られ得るβ−カロチン結晶に適用される。
本発明の好ましい態様において、高純度天然β−カロチン結晶は、例えばブラ
ケスレア・トリスポラのような微生物資源から得られ得る。高純度で天然の結晶
β−カロチン調製物は９５％以上の純度、好ましくは９６％以上の純度、より好
ましくは９７％以上の純度、更により好ましくは９８％以上の純度、最も好まし
くは９９％以上の純度を有する。高純度結晶β−カロチン調製物の天然起源によ
って、当該調製物は、γ−カロチンのような少量の他のカロチノイドも含んでよ
い。γ−カロチン含有量は、それによって約０．５％〜約１．５％まで変化して
もよい。
好ましい方法は、ブラケスレア・トリスポラから得られる酢酸エチル抽出物を
結晶化の前に水洗する工程、β−カロチンを該洗浄した抽出物から結晶化して粗
製結晶を得る工程、続いて該粗製結晶を２種の異なる溶媒、即ち第１に酢酸エチ
ル、第２にエタノールで処理する工程（双方の処理は５０℃で起こる）である。
従って、本発明の方法は、天然原料からの結晶β−カロチン調製物を、極めて
高純度、即ち従来の技術では得えられない、即ち９５％以上の純度で製造可能に
する。
本発明の方法によって得られた高純度β−カロチン結晶は、食品、医薬品及び
化粧品の用途に適している。天然β−カロチン結晶は、一般的に油性懸濁液、例
えば大豆油のような植物油の３０％(w/v)懸濁液が適用される。
実施例１
酢酸エチルによるバイオマスからのβ−カロチンの抽出
β−カロチン４．３％を含むブラケスレア・トリスポラのバイオマス５４ｇを
、酢酸エチル(メルク(Merck，p.a.))６００mlに混合した。懸濁液を５０℃に温
め、この温度で２時間撹拌しながら保持した。続いて、懸濁液をろ過し、β−カ
ロチン濃度１．７g/リットルの抽出物を生成した。
結晶のβ−カロチン濃度は、分光光度的に（FCC III/Monographs）又はプロト
ンＮＭＲで分析した。
実施例２
酢酸エチル抽出物からの高純度β−カロチン結晶の分離
実施例１で得られた抽出物を、β−カロチン濃度１２g/リットルまで、溶媒を
５０℃真空下で蒸発させることによって濃縮した。濃縮物を２０℃に冷却し、２
０℃で２時間撹拌して保持した。結晶をろ過し、２ケーク量の酢酸エチルで洗浄
し、純度９１．９％の粗製結晶０．７ｇを生成した。
続いて乾燥した粗製結晶を、３０分間３５mlエタノール中で５０℃で攪拌した
。室温まで冷却した後、結晶をろ過し、２ケーク量のエタノールで洗浄し、真空
下、室温で乾燥した。純度９７．０％の結晶０．６５ｇを得た。
実施例３
酢酸エチル抽出物からの高純度β−カロチン結晶の分離
β−カロチン１．７g/リットルを含む抽出物を、実施例１に記載したように調
製した。この抽出物をβ−カロチン濃度１０g/リットルまで、溶媒を５０℃真空
下で蒸発させることによって濃縮した。濃縮物を５℃に冷却し、５℃で２時間撹
拌して保持した。結晶をろ過し、２ケーク量の酢酸エチルで洗浄し、純度９４．
１％の粗製結晶０．８ｇを生成した。
続いて乾燥した粗製結晶を、３０分間４１mlエタノール中５０℃で攪拌した。
室温に冷却した後、結晶をろ過し、２ケーク量のエタノールで洗浄し、真空下、
室温で乾燥した。純度９７．３％の結晶０．７８ｇを得た。
実施例４
ヘキサンによるバイオマスからのβ−カロチンの抽出
β−カロチン４．３％を含むブラケスレア・トリスポラのバイオマス６０ｇを
、ヘキサン(メルク(Merck，p.a.))９００mlに混合した。懸濁液を５０℃に温め
、この温度で３時間撹拌しながら保持した。続いて、懸濁液をろ過し、β−カロ
チン濃度１．５g/リットルの抽出物を生成した。
実施例５
ヘキサン抽出物からの高純度β−カロチン結晶の分離
実施例４で得られた抽出物を、β−カロチン濃度１０g/リットルまで、溶媒を
５０℃真空下で蒸発させることによって濃縮した。濃縮物を５℃まで冷却し、５
℃で２時間撹拌しながら保持した。結晶をろ過し、２ケーク量のヘキサンで洗浄
し、純度８７．９％の粗製結晶０．９４gを生成した。
続いて乾燥した粗製結晶を、３０分間３５mlエタノール中で５０℃で攪拌した
。室温まで冷却した後、結晶をろ過し、２ケーク量のエタノールで洗浄し、真空
下、室温で乾燥した。純度９８．０％の結晶０．８５ｇを得た。
実施例６
粗製β−カロチン結晶の水洗
純度８５．３％の粗製結晶を、乾燥ブラケスレア・トリスポラのバイオマスを
酢酸エチルで５０℃、３０／１の溶媒対バイオマス比で抽出した後に得て、続く
抽出物の濃縮で濃度１５g/リットルとした。
これら粗製結晶を脱イオン水（２０g/リットル）に懸濁し、３０分間４０℃で
撹拌した。結晶をろ過した後、結晶を２ケーク量のエタノールで室温で洗浄し、
真空下、室温で乾燥した。
脱イオン水を用いてｐＨ４で洗浄すると、純度９６．２％の結晶が生成し、脱
イオン水を用いてｐＨ７又はｐＨ１０で洗浄すると、純度９２％の結晶が生成す
る。
実施例７
高純度β−カロチン結晶の大規模分離
４．２％のβ−カロチンを含むブラケスレア・トリスポラの乾燥バイオマス２
１０kgを、酢酸エチル４２００リットルと混合した。懸濁液を５０℃に加熱し、
その温度で３時間撹拌して保持した。続いて懸濁液をろ過し、β−カロチン濃度
１．４g/リットルの抽出物を生成した。
酢酸エチル抽出物を、引き続き５０℃の脱イオン水と体積比１０／１（抽出物
／水）で混合した。１５分間５０℃で攪拌した後、層を分離した。その後、酢酸
エチル層をβ−カロチン濃度６g/リットルまで蒸発によって濃縮した。
濃縮物を５℃に冷却し、β−カロチンの結晶を得た。２時間５℃で攪拌した後
、結晶をろ過し、２ケーク量の酢酸エチルで洗浄し、６．４kgの湿結晶（乾燥物
６０．２％）を生成した。湿結晶を７５リットルのエタノール中、５０℃で３０
分間撹拌した。懸濁液を２０℃に冷却し、結晶をろ過し、次いで２ケーク量のエ
タノールで洗浄した。結晶を真空下、室温で乾燥し、３．６kgの純度９７．２％
の結晶を生成した。実施例８
高純度β−カロチン結晶の大規模分離
４．２％のβ−カロチンを含むブラケスレア・トリスポラの乾燥バイオマス４
００kgを、酢酸エチル１２ｍ3と混合した。懸濁液を５０℃に加熱し、その温度
で８時間撹拌して保持した。続いて懸濁液をろ過し、β−カロチン濃度１．７g/
リットルの抽出物を生成した。
続いて酢酸エチル抽出物を、５０℃の脱イオン水と体積比５／１で混合した。
１５分間５０℃で攪拌した後、層を分離した。その後、酢酸エチル層をβ−カロ
チン濃度４g/リットルまで蒸発によって濃縮した。
濃縮物を５℃に冷却し、β−カロチンの結晶を得た。２時間５℃で攪拌した後
、結晶をろ過し、２ケーク量の酢酸エチルで洗浄し、２４kgの湿結晶（乾燥物５
５％）を生成した。次いで湿結晶を４５０リットルのエタノール中、５０℃で３
０分間撹拌した。その後、懸濁液を５℃に冷却し、結晶をろ過し、続いて２ケー
ク量の酢酸エチルで、最後に１ケーク量のエタノールで洗浄した。２３kgの湿結
晶が得られた。
次に、結晶を４５０リットルのエタノール（９５％）中で５０℃３０分間攪拌
した。懸濁液を２０℃に冷却した後、結晶をろ過し、２ケーク量のエタノールで
洗浄し、湿結晶２３kgを得た。結晶は、最終的に真空下室温で乾燥され、純度１
００．４％の結晶１３．８kgを生成した（FCC IIIの分光光度法）。Description: FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to the field of recovery of carotenoids from natural sources. Background of the Invention Currently, high purity (96% or more) β-carotene crystals are produced by chemical synthesis. When obtained from natural sources, β-carotene is mostly in the form of an oily extract (palm oil, algal oil). Although β-carotene crystals can be obtained from natural sources such as plants (eg, carrots) and microorganisms (eg, algae (Dunaliella) and fungi (Blakeslea)), relatively pure crystals can be obtained. Currently available methods for obtaining from such natural sources have significant disadvantages. Current methods for purifying β-carotene crystals from natural sources generally include an extraction step and an additional purification step. Extraction, various extraction solvents, i.e. ethyl acetate, the organic solvents such as butyl acetate or hexane, vegetable oils, or propane, ethylene, carried out in supercritical fluids such as CO 2. Further purification of the extract is necessary to obtain a relatively pure β-carotene preparation. Several purification steps have been described, such as chromatography, adsorption / desorption steps and crystallization or precipitation. The β-carotene crystals that crystallize directly from the extract can be obtained, for example, by evaporating the solvent after solvent extraction of a suitable natural material, but in general, for example, the desired e.g. It does not have high purity. In such cases, recrystallization is necessary (Dutch Patent 6411184, U.S. Pat. No. 4,439,629). The main disadvantage of recrystallization is that large amounts of solvent are required to solubilize β-carotene. In addition, in order to recrystallize β-carotene in a sufficiently high yield, a large amount of antisolvent (precipitating solvent) is also required. Therefore, these methods require large amounts of solvent and can often result in significant loss of β-carotene. SUMMARY OF THE INVENTION The present invention discloses a method for preparing at least 90% pure β-carotene crystals from natural sources. The method includes the following steps. (1) a step of solvent-extracting β-carotene from the natural material to produce a β-carotene extract; (2) a step of crystallizing β-carotene from the extract to produce crude β-carotene crystals; (3) treating the crude β-carotene crystals with a solvent selected from the group consisting of solvents in which β-carotene exhibits low solubility; (4) optionally, treating the solvent with a β-carotene having a low solubility. (5) a step of evaporating the remaining solvent from the crystals; Optionally, the β-carotene extract obtained after the solvent extraction of the natural source is washed with water before the crystallization of β-carotene. In a preferred embodiment, the method of the present invention provides a crystalline β-carotene preparation with a purity of at least 95% from natural sources. The method of the present invention can be advantageously used to increase the β-carotene content of a somewhat impure crystalline β-carotene preparation. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention discloses a method for recovering high-purity β-carotene crystals from natural raw materials in high yield. According to the present invention, high purity β-carotene crystals are recovered from crude β-carotene using a simple and convenient solvent treatment. The method of the invention involves treating a crude β-carotene crystal preparation with a solvent in which β-carotene exhibits low solubility. The crude β-carotene crystals subjected to the method of the present invention are obtained by conventional extraction and crystallization techniques. Generally, extraction of β-carotene from natural raw materials is performed with organic solvents, vegetable oils or supercritical fluids. Subsequent crystallization or precipitation is performed by such methods as cooling, evaporating the solvent, or adding an anti-solvent, after which the crystals are filtered. The β-carotene content of the crude crystals depends mainly on the natural raw materials used for the isolation, whereas the applied crystallization procedure can additionally work as well. Generally, the β-carotene content varies between 60-90%. Surprisingly, the solvent treatment of the crude crystals according to the invention considerably increases the β-carotene content of the crystals. The crystals obtained after the solvent treatment have a β-carotene content of 90% or more, preferably a 92% or more β-carotene content, more preferably a 94% or more β-carotene content. In the method according to the invention, the crude β-carotene crystals are treated with a solvent in which β-carotene has low solubility. The solvent treatment of the present invention includes a step of stirring the crude β-carotene crystals for a time sufficient to dissolve impurities in the solvent, a step of filtering the crystals, and a step of washing the crystals with a new solvent for several hours. Optionally, this process is repeated one or more times. After the re-cleaning step, the remaining solvent is evaporated. Suitable solvents for use in the treatment according to the invention are those in which β-carotene has a low solubility, ie a solubility of at most 1 g / l at 25 ° C. Preferably, such a solvent is water or an organic solvent. When water is used, the pH of the water is not a critical factor in the treatment of the present invention, but the pH is preferably 7 or less. More preferably, the pH of the water is 4-6. Organic solvents preferably mean lower alcohols or lower acyl esters thereof, or acetone, where lower is understood to consist of straight-chain or branched 1 to 5 carbon atoms. More preferably, the organic solvent is ethanol or ethyl acetate. Solvents in which β-carotene exhibits low solubility are applied in sufficient amounts to remove significant amounts of impurities. Preferably, the ratio of solvent to crystal is 5 ml or more solvent per gram of crystal, more preferably 5 ml to 10 ml per gram of crystal, most preferably 20 ml to 40 ml per gram of crystal. The upper limit of solvent volume / g of crystal is not a technical limit but is determined by economic criteria. The time required to dissolve the impurities in the solution depends on the temperature at which the stirring is performed. Generally, stirring is performed at a temperature below the boiling point of the solvent. Preferably, the stirring is performed at a temperature between 20 and 80C, more preferably between 30 and 60C, most preferably at 50C. The solubility of β-carotene in the solvent used can also influence the temperature of the stirring process. When using a solvent in which β-carotene has a relatively low solubility, for example ethanol, stirring is preferably carried out at an elevated temperature, for example 50 ° C., whereas β-carotene exhibits a relatively high solubility. With the use of a solvent, for example ethyl acetate, the stirring temperature may be selected in a lower range, for example, 20-25 ° C. If a solvent is used in which β-carotene exhibits a relatively high solubility, optionally the stirring temperature is maintained at a higher level, for example 50 ° C., and after stirring the mixture is brought to a lower temperature, for example 5 to 20 ° C. Cooling is preferred to prevent relatively high β-carotene loss. At 50 ° C., a suitable stirring time is, for example, about 30 minutes. The present invention also contemplates the option of subsequently treating the crude β-carotene crystals with two or more different solvents in which β-carotene has low solubility. Further optionally, washing of the extract obtained by solvent extraction of the natural material with water is carried out prior to crystallization of the β-carotene from the extract. In this embodiment, the amount of water used is not critical, but it may be appropriate to choose an amount of water that results in good phase separation. The present invention provides a simple and convenient method for increasing the β-carotene content of β-carotene crystals. The solvent treatment of the present invention is advantageously applied to any crystalline β-carotene preparation which can be obtained from natural sources (plants or microorganisms) and whose purity is not as high as desired. In addition, the method of the present invention can be applied to crude crystalline preparations of natural carotenoids other than β-carotene. Preferably, the method of the present invention comprises the steps of: starting from a microbial source, more preferably from algae or fungi (including yeasts), even more preferably from the other order of the Mucorales, and most preferably from the Blakeslea trispo Applies to β-carotene crystals obtainable from ra). In a preferred embodiment of the present invention, high-purity natural β-carotene crystals can be obtained from a microbial source such as, for example, Brakeslea trispora. A high purity, natural crystalline β-carotene preparation has a purity of 95% or more, preferably 96% or more, more preferably 97% or more, even more preferably 98% or more, most preferably 99% or more. It has the above purity. Due to the natural origin of the high-purity crystalline β-carotene preparation, the preparation may also contain small amounts of other carotenoids, such as γ-carotene. The gamma-carotene content may thereby vary from about 0.5% to about 1.5%. A preferred method comprises the steps of washing the ethyl acetate extract obtained from Braquesrea trispora with water prior to crystallization, crystallizing β-carotene from the washed extract to obtain crude crystals, Treatment with different solvents, firstly with ethyl acetate and secondly with ethanol (both treatments occur at 50 ° C.). Thus, the process of the present invention allows the preparation of crystalline β-carotene preparations from natural sources in a very high purity, ie not obtainable by the prior art, ie 95% or more. The high-purity β-carotene crystals obtained by the method of the present invention are suitable for food, pharmaceutical and cosmetic applications. Natural β-carotene crystals are generally applied as an oily suspension, for example a 30% (w / v) suspension of a vegetable oil such as soybean oil. Example 1 Extraction of β-Carotene from Biomass with Ethyl Acetate 54 g of Brakeslea trispora biomass containing 4.3% β-carotene was mixed with 600 ml of ethyl acetate (Merck, Pa). The suspension was warmed to 50 ° C. and kept at this temperature with stirring for 2 hours. Subsequently, the suspension was filtered to produce an extract having a β-carotene concentration of 1.7 g / liter. The β-carotene concentration of the crystals was analyzed spectrophotometrically (FCC III / Monographs) or by proton NMR. Example 2 Separation of high-purity β-carotene crystals from an ethyl acetate extract The extract obtained in Example 1 was concentrated by evaporating the solvent under vacuum at 50 ° C to a β-carotene concentration of 12 g / l. . The concentrate was cooled to 20 ° C. and kept stirring at 20 ° C. for 2 hours. The crystals were filtered and washed with two cakes of ethyl acetate to yield 0.7 g of 91.9% pure crystals. The dried crude crystals were subsequently stirred at 50 ° C. in 35 ml ethanol for 30 minutes. After cooling to room temperature, the crystals were filtered, washed with 2 cakes of ethanol and dried under vacuum at room temperature. 0.65 g of crystals having a purity of 97.0% was obtained. Example 3 Separation of High Purity β-Carotene Crystals from an Ethyl Acetate Extract An extract containing 1.7 g / l of β-carotene was prepared as described in Example 1. The extract was concentrated by evaporating the solvent under vacuum at 50 ° C. to a β-carotene concentration of 10 g / l. The concentrate was cooled to 5 ° C and kept stirring at 5 ° C for 2 hours. The crystals were filtered and washed with two cakes of ethyl acetate to give a purity of 94. 0.8 g of 1% crude crystals were produced. The dried crude crystals were subsequently stirred at 50 ° C. in 41 ml ethanol for 30 minutes. After cooling to room temperature, the crystals were filtered, washed with 2 cakes of ethanol and dried under vacuum at room temperature. 0.78 g of crystals having a purity of 97.3% was obtained. Example 4 Extraction of β-Carotene from Biomass with Hexane 60 g of Brakeslea trispora biomass containing 4.3% β-carotene was mixed with 900 ml of hexane (Merck, Pa). The suspension was warmed to 50 ° C. and kept at this temperature with stirring for 3 hours. Subsequently, the suspension was filtered to produce an extract having a β-carotene concentration of 1.5 g / liter. Example 5 Separation of High Purity β-Carotene Crystals from Hexane Extract The extract obtained in Example 4 was concentrated by evaporating the solvent under vacuum at 50 ° C. to a β-carotene concentration of 10 g / l. The concentrate was cooled to 5 ° C and kept with stirring at 5 ° C for 2 hours. The crystals were filtered and washed with two cakes of hexane to yield 0.94 g of crude crystals of 87.9% purity. The dried crude crystals were subsequently stirred at 50 ° C. in 35 ml ethanol for 30 minutes. After cooling to room temperature, the crystals were filtered, washed with 2 cakes of ethanol and dried under vacuum at room temperature. 0.85 g of crystals having a purity of 98.0% was obtained. Example 6 Washing of crude β-carotene crystals in water Crude crystals with a purity of 85.3% were obtained after extracting the biomass of dried Braquesrea trispora with ethyl acetate at 50 ° C. at a solvent to biomass ratio of 30/1 followed by extraction. The product was concentrated to a concentration of 15 g / liter. These crude crystals were suspended in deionized water (20 g / liter) and stirred at 40 ° C. for 30 minutes. After filtering the crystals, the crystals were washed with 2 cakes of ethanol at room temperature and dried under vacuum at room temperature. Washing with deionized water at pH 4 produces 96.2% pure crystals, and washing with deionized water at pH 7 or pH 10 produces 92% pure crystals. Example 7 Large Scale Separation of High Purity β-Carotene Crystals 10 kg of dried Brakeslea trispora biomass containing 4.2% β-carotene were mixed with 4200 liters of ethyl acetate. The suspension was heated to 50 ° C. and kept stirring at that temperature for 3 hours. Subsequently, the suspension was filtered to produce an extract having a β-carotene concentration of 1.4 g / liter. The ethyl acetate extract was subsequently mixed with deionized water at 50 ° C. in a volume ratio of 10/1 (extract / water). After stirring at 50 ° C. for 15 minutes, the layers were separated. Thereafter, the ethyl acetate layer was concentrated by evaporation to a β-carotene concentration of 6 g / liter. The concentrate was cooled to 5 ° C. to obtain β-carotene crystals. After stirring for 2 hours at 5 ° C., the crystals were filtered and washed with two cakes of ethyl acetate to yield 6.4 kg of wet crystals (60.2% dry). The wet crystals were stirred in 75 liters of ethanol at 50 ° C. for 30 minutes. The suspension was cooled to 20 ° C., the crystals were filtered and then washed with two cakes of ethanol. The crystals were dried at room temperature under vacuum to yield 3.6 kg of crystals with a purity of 97.2%. Example 8 Large Scale Separation of High Purity β-Carotene Crystals 400 kg of dried biomass of Braquesrea trispora containing 4.2% β-carotene was mixed with 12 m 3 of ethyl acetate. The suspension was heated to 50 ° C. and kept stirring at that temperature for 8 hours. Subsequently, the suspension was filtered to produce an extract having a β-carotene concentration of 1.7 g / liter. Subsequently, the ethyl acetate extract was mixed with deionized water at 50 ° C. in a volume ratio of 5/1. After stirring at 50 ° C. for 15 minutes, the layers were separated. Thereafter, the ethyl acetate layer was concentrated by evaporation to a β-carotene concentration of 4 g / liter. The concentrate was cooled to 5 ° C. to obtain β-carotene crystals. After stirring at 5 ° C. for 2 hours, the crystals were filtered and washed with 2 cakes of ethyl acetate to produce 24 kg of wet crystals (55% dry matter). The wet crystals were then stirred in 450 liters of ethanol at 50 ° C. for 30 minutes. Thereafter, the suspension was cooled to 5 ° C., the crystals were filtered and subsequently washed with 2 cakes of ethyl acetate and finally with 1 cake of ethanol. 23 kg of wet crystals were obtained. Next, the crystals were stirred in 450 liters of ethanol (95%) at 50 ° C. for 30 minutes. After cooling the suspension to 20 ° C., the crystals were filtered and washed with two cakes of ethanol to obtain 23 kg of wet crystals. The crystals were finally dried at room temperature under vacuum to yield 13.8 kg of crystals of 100.4% purity (FCC III spectrophotometry).
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(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｒ 1:89）
(31)優先権主張番号 ９６２０２８５２．８
(32)優先日 平成８年10月15日(1996．10．15)
(33)優先権主張国 ヨーロッパ特許庁（ＥＰ）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
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ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme court ゛ (Reference) C12R 1:89) (31) Priority claim number 96202852.8 (32) Priority date October 15, 1996 (1996.10.15) (33) European Patent Office (EP) claiming priority (81) Designated State EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT , LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, KE, LS, MW, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, B , BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, GH, HU, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL , TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZW