JP2000511406A

JP2000511406A - レプチンアッセイ

Info

Publication number: JP2000511406A
Application number: JP09538203A
Authority: JP
Inventors: ローゼンブラム，チヤールズ・アイ; フアン・デル・プルウフ，レオナルドウス; クレシ，サジヤド・エイ; カリ，ドリス・エフ; ヘス，ジヨン・ダブリユ; トタ，マイケル・アール; チエン，フアン
Original assignee: メルクエンドカンパニーインコーポレーテッド
Priority date: 1996-04-22
Filing date: 1997-04-18
Publication date: 2000-09-05
Also published as: EP0914611A4; EP0914611A1; CA2252443A1; WO1997040380A1

Abstract

(57)【要約】レプチンのトランス活性化アッセイを記載する。レプチン応答要素はプロモーターに近接し、プロモーター領域は機能可能なようにレポーター遺伝子と結合している。レプチンがレセプターと結合すると、レポーター遺伝子が転写される。

Description

【発明の詳細な説明】レプチンアッセイ本発明は、レプチンレセプターと結合する化合物の存在の測定用アッセイに関する。本発明は、サンプル中に存在するレプチンレセプター結合物質の量の定量用アッセイにも関する。発明の背景レプチンはＯｂ遺伝子産物である（Zhangら，1995 Nature 372:425-432）。それがないと、マウスは、ヒトの病的肥満と類似した強度の肥満となる。マウスは、ヒト II型糖尿病と類似した糖尿病に罹り（Zhangら，1995 Nature 372:425-4 32）、生殖力がなくなる（Chehabら，1996 Nature Genetics 12:318-320）。レプチンを十分量与えると、これらの症状は消える。現在、組換えレプチンの調製物をアッセイできる唯一の方法は、ｏｂ／ｏｂマウスに多量のレプチンを注射することによる（Campfield 1995 Science269:546- 549；Rentsch 1995 Biochem Biophys Res Comm 214:131-136）。レプチン活性は餌摂取の抑制に基づき評価されるが、レプチン活性は個体間で大きく変動する。レプチン活性の統一された基準は存在しない。それ故、少量のレプチンを用いるレプチン生物活性の迅速で正確なアッセイが望ましい。発明の詳細な説明本発明は、レプチンレセプター結合化合物がサンプル中に存在するかどうかの測定方法であって、ａ）プロモーターと少なくとも１個のレプチン応答要素（re sponse element）を含み、レポーター遺伝子と機能可能なように結合しているプロモーター領域を含む核酸；及びｂ）レプチンレセプターをコードする核酸；を含む細胞と、サンプルを接触させ、レポーター遺伝子の転写が起るかを測定することを特徴とする該方法に関する。図面の簡単な説明図１は、ＧＴ１−７細胞を用いるレプチンの機能的アッセイを示すグラフである。細胞を、ｏｂ−ｒについて偽トランスフェクトするか、痩身ラットＯｂ−ｒｃＤＮＡでトランスフェクトするか、又はヒトＯｂ−ｒｃＤＮＡでトランスフェクトした。細胞は、レプチンで処理されたＯｂ−ｒ発現細胞でのルシフェラーゼ活性の誘導を示した。図２は、ルシフェラーゼ活性の増加を測定したとき、レプチンの量に対し、細胞が直線性の用量反応性を示すグラフである。ＧＴ１−７細胞を、ヒトＯｂ−ｒで一過性にトランスフェクトし、種々の量のヒトレプチンで処理した。図３は、痩身ラットＯｂ−ｒのＤＮＡ配列である。図４は、ｐＣＭＶ４ベクターに挿入したヒトＯｂ−ｒのＤＮＡ配列である。ヒトｏｂ−ｒのGen Bank受託番号は、Ｕ４３１６８である。ヌクレオチド１４１〜３７７０を、ｐＣＭＶ４−Ｏｂ−４で用いる。図５は脂肪質ラットＯｂ−ｒのＤＮＡ配列である。本明細書と請求の範囲で、以下の定義を適用する。 “レプチンレセプター結合化合物”とは、レプチンレセプターに結合する化合物を意味する。 “レプチン擬似物質”とは、レプチンレセプターに結合し、細胞内反応のカスケードを開始させ、結局レプチン応答要素の制御下に、ＤＮＡ転写が起ることになるレプチン以外の化合物を意味する。 “レプチン応答要素”とは、レプチンレセプター結合事象に応答性で、このような事象が起ると、プロモーターの制御下でＤＮＡの転写を可能とするプロモーター領域内に位置するＤＮＡ配列を意味する。 “プロモーター領域”とは、タンパク質又はペプチドコード配列の上流に位置するＤＮＡを意味し、それは、少なくとも１個の応答要素を含有する。 “プロモーター”は、完全長プロモーター、最小プロモーター、及び完全長より短いが最小プロモーターより多数の核酸を含むプロモーターを包含する。 “Ｏｂ−ｒ”とは、Ｏｂ−レセプターを意味する。本発明の一面は、特定の化合物がレプチンレセプターと結合できるかを測定できる細胞“トランス”活性化アッセイである。一般的に、リガンドのその膜結合レセプターへの結合は、シグナルの細胞内カスケードを開始させる。最後に特定の転写制御要素が活性化され、ＤＮＡの転写が起る。本発明により、天然レプチンのその天然レプチンレセプターとの結合は、レプチン応答要素を活性化するカスケードを開始させ、ＤＮＡ転写に至ることが知見された。本発明で同定された一つのこのようなレプチン応答要素は、ＩＲＦ−１由来γ−インターフェロン活性化配列である。ＩＲＦ−１由来活性化配列は当業界で報告されたが（Pineら， 1994 EMBO J．13:158-167）、レプチン−レプチン受容体結合事象への応答性は今まで不明であった。レプチン応答要素のこの発見により、本発明の基礎となる種々のアッセイの設計が可能となった。選択されたプロモーターと１個以上のレプチン応答要素を含有するプロモーター領域を構築する。プロモーター領域は、ハイブリッドプロモーター領域を含みうる、即ち天然では一緒に存在しないプロモーターと応答要素を含みうるか、又はプロモーター領域は、天然のプロモーター領域でありうる。好適実施態様では、プロモーターは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーターのような十分に特性が明らかにされたプロモーターであるが、選択される宿主細胞で機能することが知られている任意のプロモーターを使用できる。レプチン応答要素の活性に影響しうる転写制御配列が存在しないように、プロモーターが最小プロモーターであることも好ましい。好ましくは、レプチン応答要素はプロモーター領域に近接させる。介在配列がレプチン応答要素の機能を妨害しなければ、介在配列は、レプチン応答要素とプロモーター間に存在しうる。本発明によれば、適切なレプチン応答要素は、ＩＲＦ−１由来γ−インターフェロン活性化配列５’−ＣＴＧＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＧＡＣＧ−３’である。好適実施態様では、プロモーター領域は、複数のＩＲＦ由来γ−インターフェロン活性化配列を含有し、より好ましくは最低３個のこのような配列を含有する。複数のレプチン応答要素が存在する場合、好ましくはそれらを縦列に結合させる。しかし、介在配列がレプチン応答要素の機能を妨害しなければ、介在配列も存在しうる。レプチン−レプチンレセプター結合の結果として起る転写を検出するために、レポーター遺伝子を、少なくとも１個のレプチン応答要素と機能可能なように結合させるのが好ましい。レポーター遺伝子は、容易に検出されるペプチドをコードするか、又は転写もしくは翻訳の簡単な検出を可能なものとする任意の遺伝子でありうる。一般的には、レポーター遺伝子は、宿主細胞で天然に存在するか、又は宿主細胞で少量だけ産生されるタンパク質をコードする。周知のレポーター遺伝子の例には、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ（細菌又は蛍由来）、及びβ− ガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼなどの酵素に基づく他の検出系などがある。特に好適な実施態様では、ルシフェラーゼがレポーター遺伝子である。別の実施態様では、翻訳産物よりも、レポーター遺伝子ＤＮＡから転写されるｍＲＮＡを測定してもよい。ａ）プロモーターと少なくとも１個のレプチン応答要素を含むプロモーター領域；及びｂ）そのプロモーター領域と機能可能なように結合したレポーター遺伝子；を含むレポーター遺伝子構築体は、本発明の更なる別の一面をなす。好ましくは、レポーター遺伝子構築体を適切なベクターに入れ、それを用いて、宿主細胞をトランスフェクトする。ベクターは、選択された宿主細胞で機能できる、プラスミド、コスミド及びウイルスベクターを含む任意の公知のベクターでありうる。宿主細胞は、培養するのが容易な任意の細胞又は細胞株でありうる。一般的に、好適な宿主細胞は、真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞であり、特に好適な実施態様では、マウス視床下部細胞（ＧＴ１−７のような）、哺乳動物神経芽腫細胞株、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５８）もしくはＬ（ＡＴＣＣＣＣＬ１）のようなマウス線維芽細胞株、チャイニーズハムスター卵巣ＣＨＯ −Ｋ１細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ６１）、又はヒト胎児腎由来２９３細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１５７３）である。宿主細胞はその表面に豊富なレプチンレセプターを有するか、又はその表面に豊富なレプチンレセプターを発現するように形質転換されることができるが、後者の状況が好ましい。任意のレプチンレセプターを使用できるが、ヒト及び齧歯類のものが好ましい。ヒトレプチンレセプターをコードする核酸は報告されており（Tartagliaら，1995 Cell 83:1263-1271；引用により本明細書に含まれるものとする）、図４に示す。マウス遺伝子も使用でき、特にGen Bankに寄託された配列に基づくと位置２６〜２７７５も使用できる。野生型ラット、脂肪質ラット（ｆａ／ｆａ遺伝子型）（図３に示す）、及びｏｂレセプター遺伝子のヘテロ接合体ラット（図５に示す）からのレプチンレセプターをコードする核酸は、同時係属中の米国特許出願第号及び第６１／０１３，９６９号（Attorney Doc ket No.19462PV，1996年２月22日出願；19462PV1,1996年３月22日出願；両方とも引用により本明細書に含まれるものとする）に記載されている。種々のレプチンレセプターで細胞をトランスフェクトすることにより、由来が異なるレセプターの生物応答を研究、比較できる。また、特定の所望の突然変異を含むレプチンレセプターも、公知の分子生物学的技術により構築でき、突然変異体の構造と機能は、本発明のアッセイを用いて研究できる。本発明の別の一面は、本発明のアッセイで宿主細胞が使用できるように、宿主細胞をトランスフェクトするのに適した一セットのベクターである。ベクターのセットは、レプチンレセプター構築体を含有する第１のベクターを包含する。レプチンレセプター構築体は、所望のレプチンレセプター又は該レセプターの突然変異型をコードする核酸を含有する。レプチンレセプター構築体は、その天然のプロモーター又は任意の他の所望の異種プロモーターの制御下にありうる。それは、場合によっては、エンハンサー及び膜上でレセプターを発現するのに助けとなる配列のような他の発現制御要素も含みうる。ベクターのセットは、上記レセプター遺伝子構築体を含有する第２のベクターも包含する。本発明の一好適アッセイでは、レプチンレセプターリガンドの可能性のある化合物をアッセイできる。この実施態様では、レプチンレセプター（天然又は組換え）を発現する細胞を、上記レポーター遺伝子構築体でトランスフェクトし、細胞が天然では豊富なレプチンレセプターを発現しない場合、レプチンレセプター構築体でトランスフェクトする。レプチンレセプターリガンドの可能性のあるものを、トランスフェクトされた細胞と接触させ、レポーター遺伝子転写産物又は翻訳産物の存在を検出する。これを、同じくトランスフェクトされた細胞をレプチンと接触させる対照アッセイで測定した転写量又は翻訳量と比較できる。本発明のアッセイの更なる利点は、それが用量反応性であるということ、即ちレプチンリガンド−レプチンレセプター結合は起るほど、レポーター遺伝子の転写及び／又は翻訳が増加し、それ故レプチンレセプター結合活性の定量的測定が可能となるということである。逆スクリーニングも、本アッセイの一部として使用できる。逆スクリーニングでは、同一細胞型の第２の細胞を、上記レポーター遺伝子構築体でトランスフェクトするが、レプチンレセプター遺伝子構築体ではトランスフェクトしない。レプチンレセプターリガンドの可能性のあるものを、トランスフェクトされた細胞と接触させ、レポーター遺伝子転写又は翻訳の存在を検出する。レプチンレセプターの存在下でのみレポーター遺伝子構築体を活性化するこれらのレプチンレセプターリガンドの可能性のあるものは、特異的レプチンアゴニストであると決定される。この実施態様のアッセイを用いて、レプチンアゴニストとアンタゴニストを同定できる。レプチンアゴニストとは、レプチン擬似物質のように、レプチンレセプターと結合し、レプチンの細胞応答と少なくともほぼ等しく、それより大きいこともありうる細胞応答を引起す。このような化合物は、レプチンが不十分なために、肥満、糖尿病又は無生殖力が起る状況下で有用であろう。アッセイのこの実施態様を用いて、レプチンアンタゴニストも同定できる。レプチンアンタゴニストとは、レプチンレセプターと結合できるが、天然のレプチンの応答よりも小さい応答しか引起さない化合物である。このような化合物は、食欲不振や悪液質の治療に有用であろう。本発明のもう一つの面で、種々のレプチン応答要素の可能性のあるものを、レポーター遺伝子の転写を制御するプロモーター近傍に挿入することによって、新規レプチン応答要素を同定できる。この構築体でトランスフェクトされ、天然又は組換えレプチンレセプターを発現する細胞をレプチンと接触させる。結果として起るレポーター遺伝子の転写を、レプチン応答要素がＩＲＦ−１由来γ−インターフェロン活性化配列である場合に起る転写と比較する。このアッセイを用いて同定される新規レプチン応答要素は、本発明の更にもう一つの面をなす。本発明の別の実施態様では、レプチン調製物の力価を測定、定量できる。この実施態様では、レプチン含有調製物を、レポーター遺伝子構築体を含有し、レプチンレセプター（組換え又は天然）を発現している細胞と接触させる。レポーター遺伝子の転写量及び／又は翻訳量を測定し、既知の力価の調製物を用いて得られたものと比較する。本発明の更に別の面では、種々のレプチンレセプターの生物活性を研究、比較できる。この実施態様では、第１の細胞を、レポーター遺伝子構築体と第１のレプチンレセプターでトランスフェクトする。第１のレプチンレセプターは、その活性が測定できる任意のレプチンレセプター、変異体、又は突然変異体でありうる。第１の細胞を、レプチンと接触させ、レポーター遺伝子転写又は翻訳を測定する。この量を、その活性が既知であるか、又は参照として使用できる第２のレプチンレセプターを用いて、同一条件下得られた量と比較する。以下の非限定実施例を、本発明をより良く説明するために提供する。実施例１ベクター構築レプチンでトランス活性化される発現ベクターＡＨ３２を以下のように構築した。ＩＲＦ−１遺伝子からのＳｔａｔ結合要素（ＳＢＥ）（Simsら，1993 Mol C ell Biol．13:690-702;Pineら，1994 EMBO J．13:158-167；両方とも引用により本明細書に含まれるものとする）を含む２種の相補的オリゴヌクレオチドを合成し、標準的分子生物学技術を用いて、キナーゼを作用させ、アニーリングさせた（Sambrookら，1989 Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY）。用いたオリゴヌクレオチドの配列は、５’−ＣＴＧＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＴＧＡＣＧ−３’ 及び５’−ＣＧＴＣＡＴＴＴＣＧＧＧＧＡＡＡＴＣＡＴ−３’である。二本鎖オリゴヌクレオチドを、ｐＴＫＬｕｃのＳｍａＩ部位にクローニングした。プラスミドｐＴＫＬｕｃは、ｐＺＬｕｃに見出されたホタルルシフェラーゼ遺伝子（Sc hdlowら，1992 Mol.Biol Cell 3:941-951）の上流に単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子の−３５〜＋１０のプロモーター配列（McKnightら，1982 Science 217:316-324）を含む。連結されたＤＮＡを用い、ＤＨ５αコンピテント細胞（Gibco/BRL，Gaithersburg，M D）を使用してE.coliを形質転換した。形質転換されたコロニーから得られたＤＮＡを、制限消化分析で分析し、形質転換体の各々で見出されたＳＢＥオリゴヌクレオチドの方向性とコピー数を、配列決定キット（US Biochemical，Clevelan d，OH）を用いて挿入体の配列決定により確認した。クローンＡＨ３２は同一方向で挿入されたＳＢＥを３コピー含むことが知見され、クローンＡＨ３２を用いてヒト線維芽細胞株（WI-38 VA13亜系2RA；ＡＴＣＣＮｏ．ＣＣＬ７５．１）による更なる研究を行った。ＡＨ３２でトランスフェクトされた細胞は、ＩＦＮ −α又はＩＦＮ−γによる処理の６時間後、ルシフェラーゼ活性が６〜１０倍増加することが示された。プライマーＲＯＢＲ３５（５’−ＴＴＧＧＡＧＧＡＣＴＡＴＧＧＧＴＧＴＣ− ３’）及びＲＯＢＲ３７（５’−ＣＴＡＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＡＣＣＴＧＧ−３ ’）を用い、鋳型としてラット視床下部ｃＤＮＡを用いるＰＣＲによって、ラットＯＢ−Ｒの完全長コード配列（サイズ約３．７ｋｂ）を得た。Barnes （Barnes，1994，Proc.Natl.Acad.Sci．91:2216-2220,引用により本明細書に含まれるものとする）の改変法により、ロングＰＣＲは完全長フラグメントを産生した。ロングＰＣＲ反応のために、Taq Extender（Stratagene，La Jolla，CA）とExpand Long Template PCR System(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN) を組合せて使用した。最終容量２０μＬの標準ＰＣＲ反応混合液は、鋳型（ラットｃＤＮＡ）４０ｎｇ、プライマー２００ｎｇ、５００ｍＭｄＮＴＰ、Expand キットからの１×緩衝液３、及びExpand kit enzyme mix ０．２ｍＬからなっていた。反応物質を薄壁反応チューブに集めた。増幅プロトコルは、Perkin Elmer 480 Thermal Cyclerを用い、９２℃、３０秒が１サイクル、続いて９２℃、３０秒、５４℃１分、及び６８℃、５分が３５サイクルであった。完全長産物のＤＮＡ配列を、AmpliTaq DNAポリメラーゼ，ＦＳによるABI PRIS M Dye terminator cycle sequencing(Perkin Elmer，Foster City)を用いて決定し、幾つかのＰＣＲ誘起エラーを検出した。これらのＰＣＲ誘起突然変異を除外するために、正しいＤＮＡ配列を含むクローンからの制限フラグメントを組立てた。３種の異なる制限フラグメントを用いて、ｆａ／ｆａ視床下部ｃＤＮＡ由来の、ヌクレオチド８８０にＣを有する完全長クローンを構築した。ＨｉｎｄIIIポリリンカー部位〜ヌクレオチド５０２のＮＤｅＩ部位のフラグメント、５０２のＮｄｅＩ部位〜１５２２のＳａｃＩ部位のフラグメント、及び１５２２のＳａｃＩ〜ＸｂａＩポリリンカー部位のフラグメントを、ｐｃＤＮＡ３（Invitrogen，San Diego，CA）のＨｉｎｄIII部位とＸｂａＩ部位に連結させることによって、発現構築体を得た。ヌクレオチド８８０にＡを有する野生型（痩身）クローンは、５０２〜１５２２のＮｄｅＩ〜ＳａｃＩフラグメントを痩身ラットの視床下部ｃＤＮＡ由来のフラグメントで置き換えて構築した。ＳＶ４０初期プロモーターの制御下のβ−ガラクトシダーゼ発現ベクターｐＣＨ１１０（Hallら，1983，J Hol Appl Gen 2:101-109）を、Pharmacia Biotech ，Inc.（Piscataway，NJ）から得た。完全コード領域を含むヌクレオチド１４１〜３７７０のヒトＯｂレセプターｃＤＮＡフラグメントは、ＰＣＲを用いて得、それを、D.W.Russellから贈られたｐＣＭＶ４（Andersson,S．1989 J Biol．Chem．264:8222-8229）にサブクローニングした。実施例２細胞培養 P.L.Mellonから贈られたマウス視床下部細胞株、ＧＴ１−７細胞（Lipositsら，1991 Endocrinology 129:1575-1583）を、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Gibco/BRL，Gaithersburg，MD）、１０％子ウシ血清、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び５０Ｕ／ｍＬペニシリン（増殖培地）中で、９５％空気、５％ＣＯ₂雰囲気下、３７℃で維持した。細胞を約４×１０⁴／ｃｍ²で接種し、集密になる前に継代した。実施例３ＧＴ１−７細胞のトランスフェクショントランスフェクションの１８時間前に、３５ｍｍ組織培養皿当り３．５×１０⁵ 細胞で細胞を播いた。プラスミドＡＨ３２、適切なＯｂ−ｒプラスミド、及びｐＣＨ１１０を、リポソーム媒介トランスフェクションを用いて細胞に導入した。詳細には、各プラスミド３００ｎｇをOptimen^TM(Gibco/BRL，Gaithersburg，M D)２００μＬに添加した。Lipofectamine^TM（Gibco/BRL，Gaithersburg，MD）１０μｇを、Optimem^TMの第２の２００μＬ容量に加えた。２つの溶液を混合し、室温で３０分間インキュベートし、Optimen^TMで６００μＬに調整した。細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水で２度洗浄した。ＤＮＡ−リポソーム複合体を細胞に施用した。細胞を６時間インキュベートし、そのときに増殖培地２ｍＬを細胞に加えた。１６時間後、トランスフェクション混合液を除去し、２ｍＬの新しい増殖培地を加えた。実施例４ルシフェラーゼアッセイトランスフェクションの約２４時間後、種々の量の組換えヒトレプチンを細胞に加えた。次いで細胞を２４時間インキュベートした。細胞培養培地を除去し、氷冷したカルシウムとマグネシウムを含まないリン酸緩衝化生理食塩水２ｍＬで細胞を迅速に洗浄した。次いで、製造業者のプロトコルに従い、Promega report er lysis reagent（Promega，Madison，WI）１５０μＬを用いて、アッセイのために細胞を調製した。Promegaルシフェラーゼアッセイ試薬１００μｌを用いて反応を開始させた後、サイクルモードでDynatech ML 3000ルミノメーター(Dynat ech，Chantilly，VA)を用いて、ルシフェラーゼ活性について、細胞溶解液２０ μＬをアッセイした。各細胞溶解液５０μＬのβ−ガラクトシダーゼ活性を、β −ガラクトシダーゼアッセイ（Promega，Madison，WI）を用いて測定した。各サンプルで得られた相対的光単位をβ−ガラクトシダーゼ活性で割って、結果を標準化した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＺＣ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＧ０１Ｎ 33/15 33/566 33/566 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (31)優先権主張番号６０／０３１，００２ (32)優先日平成８年11月15日(1996．11．15) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者フアン・デル・プルウフ，レオナルドウスアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者クレシ，サジヤド・エイアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者カリ，ドリス・エフアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者ヘス，ジヨン・ダブリユアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者トタ，マイケル・アールアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者チエン，フアンアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126

Claims

【特許請求の範囲】１．レプチンレセプター結合化合物がサンプル中に存在するかどうかの測定方法であって、ａ）プロモーターと少なくとも１個のレプチン応答要素を含み、レポーター遺伝子と機能可能なように結合しているプロモーター領域を含む核酸；及びｂ）レプチンレセプターをコードする核酸；を含む細胞と、サンプルを接触させ、レポーター遺伝子の転写が起るかどうかを測定することを特徴とする該方法。２．レプチン応答要素がＩＲＦ−１由来γ−インターフェロン活性化配列であることを特徴とする請求項１に記載の方法。３．ＩＲＦ−１由来γ−インターフェロン活性化配列がＣＴＧＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＧＡＣＧであることを特徴とする請求項２に記載の方法。４．プロモーター領域が複数のレプチン応答要素を含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。５．プロモーター領域が最低３個のＩＲＦ−１由来γ−インターフェロン活性化配列を含むことを特徴とする請求項４に記載の方法。６．レプチンレセプターが組換えレプチンレセプターであることを特徴とする請求項３に記載の方法。７．レプチンレセプターがヒト又は齧歯類由来であることを特徴とする請求項６に記載の方法。８．レプチンレセプターを含む核酸が、図３、４及び５に記載の配列からなる配列の群から選択される配列を含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。９．レポーター遺伝子の転写が、存在するレプチンレセプター結合化合物の量に比例して起ることを特徴とする請求項３に記載の方法。１０．プロモーターと少なくとも１個のレプチン応答要素を含み、レポーター遺伝子と機能可能なように結合しているプロモーター領域を含む核酸。１１．レプチン応答要素が、ＣＴＧＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＴＧＡＣＧであることを特徴とする請求項１０に記載の核酸。１２．プロモーターが最小プロモーターであることを特徴とする請求項１１に記載の核酸。１３．レポーター遺伝子がルシフェラーゼであることを特徴とする請求項１２に記載の核酸。１４．プロモーターと少なくとも１個のレプチン応答要素を含み、レポーター遺伝子と機能可能なように結合しているプロモーター領域を含む核酸を含むベクター。１５．ａ）プロモーターと少なくとも１個のレプチン応答要素を含み、レポーター遺伝子と機能可能なように結合しているプロモーター領域を含む第１のベクター；及びｂ）レプチンレセプターをコードする核酸を含む第２のベクター；を含む一セットのベクター。１６．第２のベクターが、図３、４及び５に記載の配列からなる配列の群から選択される配列を含むことを特徴とする請求項１５に記載の一セットのベクター。１７．ａ）プロモーターと少なくとも１個のレプチン応答要素を含み、レポーター遺伝子と機能可能なように結合しているプロモーター領域を含む核酸を含むベクター；及びｂ）レプチンレセプターをコードする核酸；でトランスフェクトされた細胞。１８．サンプル中に存在するレプチンレセプター結合化合物の量の定量方法であって、ａ）プロモーターと少なくとも１個のレプチン応答要素を含み、レポーター遺伝子と機能可能なように結合しているプロモーター領域を含む核酸；及びｂ）レプチンレセプターをコードする核酸；でトランスフェクトされた細胞を、サンプルと接触させ、惹起されるレポーター遺伝子の転写量を測定することを特徴とする該方法。１９．レプチン応答要素の可能性のあるものがレプチン応答要素であるかどうかの決定方法であって、プロモーターとレプチン応答要素の可能性のあるものを含み、レポーター遺伝子と機能可能なように結合しているプロモーター領域を含む構築体でトランスフェクトされた細胞であって、且つ、レプチンレセプターを発現する該細胞を提供し、該細胞をレプチンと接触させることを特徴とする該方法。２０．レプチンレセプターの可能性のあるもののレプチン結合能力の測定方法であって、レプチンレセプターの可能性のあるものを発現する細胞であって、且つ、プロモーターと少なくとも１個のレプチン応答要素を含み、レポーター遺伝子と機能可能なように結合しているプロモーター領域を含む核酸を含む該細胞を提供し、該細胞をレプチンと接触させることを特徴とする該方法。