JP2000511058A - Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｋａｎｓａｓｉｉを検出するための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ ｒＲＮＡまたはそれをコードするＤＮＡの特定の領域に、またはＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるかまたはそれからなるオリゴヌクレオチドまたは核酸に相補的であるように設計される、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブおよびヘルパーオリゴヌクレオチドを開示しかつ特許請求する。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、標的核酸の選択的検出が可能な条件下で、特定の標的ヌクレオチド配列を有する分子の領域中の標的核酸にハイブリダイズするように設計される。プローブはさらに、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの定型株または非定型株を検出するように設計される。本発明はまた、ハイブリダイゼーションプローブとその特定の標的核酸との間に形成される二本鎖核酸ハイブリッド分子を開示しかつ特許請求する。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｋａｎｓａｉｉを検出するための 組成物および方法 発明の分野 本明細書中に記載および請求する発明は、（例えば咽喉スワブ、組織サンプル 、体液および培養物からの）試験サンプル中の細菌種、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉ ｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉからの核酸を検出するための核酸プローブおよびヘルパ ーオリゴヌクレオチドの設計および使用に関する。発明の背景 Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉは、結核に似た慢性の肺病の 原因となる、ゆっくりと増殖する光色原体細菌である（Ｗａｙｎｅ，Ｌ．Ｇ．お よびＧ．Ｐ．Ｋｕｂｉｃａ、１９９６、”Ｔｈｅ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ” ，１４３５−１４５７、Ｓｎｅａｔｈら編、”Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｂａｃｅｒｉｏｌｏｇｙ”、第２巻、Ｗｉｌｌｉａ ｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌ ｏｓｉｓおよびＭ．ａｖｉｕｍの複合株以外のミコバクテリアの中で、Ｍ．ｋａ ｎｓａｓｉｉは、最も頻繁に単離される種の一つである。 Ｍ．Ｋａｎｓａｓｉｉのような非結核性ミコバクテリアを原因とする播種性感 染は、ＡＩＤＳに感染した個体の数の増加と同様に、公衆衛生への関心を増加さ せる。Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉは、ＨＩＶに感染した患者の（Ｍ．ａｖｉｕｍ複合 後の）播種性疾病の原因となる最も一般的な第二の非結核性ミコバクテリウムで ある。 ミコバクテリアを同定するための古典的方法には、様々な生化学的技術、抗酸 性染色、細胞形態学およびＨＰＬＣ分析が含まれる。Ｍ．Ｋａｎｓａｓｉｉ細胞 は、長さが中程度から長い桿菌である。コロニーは、平らから盛り上がったおよ び滑らかから粗いコロニーの型の範囲である。Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉのコロニー は、暗中で増殖した場合に、典型的には着色していないが、光に晒すど黄色に変 わる（光色原性）。生化学試験では、硝酸還元、ｔｗｅｅｎおよび尿素加水分解 、カタラーゼ活性およびナイアシン生成が陽性であるこどが含まれる。このよう な同定法を用いたミコバクテリア単離物の分化には、数ヶ月かかる。 Ｍ．ｋａｎｎｓａｓｅｉｉのある種の亜種は、非定型である。例として、Ｒｏ ｓｓら、Ｊ．Ｃｌｉｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３０，２９３０−２９３３、１ ９９２、を参照のこと。これらの非定型亜種は、それらの２３Ｓ ｒＲＮＡ配列 に変異を持ち、それ故、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの定型株から誘導された２３Ｓｒ ＲＮＡに関連するプローブでは、必ずしも検出可能ではない。しかしながら、こ れらの不定型株は、感染の原因作因としてかかわり、それ故、Ｍ．ｋａｎｓａｓ ｉｉとしての不定型株を同定できるこどが重要である。それ故、本明細書中に用 いられている用語Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉは、生物体の定型株および非定型株の両 方をさす。 それ故、本発明の目的は、試験サンプル、特にヒトの臨床検体内のＭ．ｋａｎ ｓａｓｉｉを迅速且つ特異的に検出するための核酸ハイブリダイゼーションプロ ーブを提供することにある。さらに、本発明の目的は、以前には検出できなかっ たＭ．ｋａｎｓａｓｉｉの亜種の検出を可能にするプローブを提供することにあ る。 本明細書中に用いられるように、用語「試験サンプル」とは、予期される標的 核酸を含むと予想される任意のサンプルを意味するつもりであり、限定するわけ ではないが、生物サンプル、体液または滲出液（尿、血液、乳、脳骨髄液、痰、 唾液、大便、肺気息音、咽喉あるいは生殖器スワブなど）、一つあるいはそれよ り多くの前述のものを含む臨床検体、環境サンプル、食物サンプルおよび研究室 サンプルを含む。 核酸ハイブリダイゼーションは、完全にまたは部分的に相補的なヌクレオチド 配列を持つ２つの核酸鎖が前もって決められた反応条件下で一緒になって、特定 の水素結合を持つ安定な二本鎖のハイブリッドを形成することによる方法である 。核酸鎖は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）のいずれか であって良く；従って、ハイブリダイゼーションは、ＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッ ド、 ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、またはＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを含むことが できる。 このように、本明細書中に用いられているように、用語「ハイブリダイゼーシ ョン」は、逆平行方向で一緒になり二本鎖領域を持つ安定な構造を形成する、２ つの完全または部分的に相補的な核酸一本鎖の能力をさす。この二本鎖構造の２ つの構成鎖は、時にはハイブリッドとも呼ばれ、水素結合で一緒に保たれている 。これらの水素結合は、アデニンおよびチミンあるいはウラシル（ＡおよびＴあ るいはＵ）またはシトシンおよびグアニン（ＣおよびＧ）塩基を含むヌクレオチ ド間で最も一般的に形成されるが、塩基対は、これらの「認知された」対のメン バーでない塩基の間でも形成することができる。非認知塩基対も、この技術分野 では良く知られている。例えば、”Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ”（Ａｄａｍｓら編、１９９２）を参照の こと。 核酸ハイブリダイゼーションは、特定のヌクレオチド配列を持つ標的核酸を検 出または定量するための一般的方法である。そのような方法は、多数のその他の 目的の内、微生物の同定および分類、感染性疾病および遺伝子異常の診断、食物 および薬剤の試験、ならびに犯罪容疑者の確認に有用である。典型的には、核酸 ハイブリダイゼーションアッセイには、標的配列に相補的である核酸配列を持つ 標識されたオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブが用い られる。そのような標識は、この技術分野では良く知られており、放射活性アイ ソトープ、酵素、または蛍光、発光、または化学発光基を含む；出願者らは、標 識として化学発光アクリジニウムエステルの使用を好む。Ａｒｎｏｒｄら、合衆 国特許第５，１８５，４３９号（本明細書と共通の所有権を享受し、本明細書中 に参照として採用される）を参照のこと。プローブは、相補領域中の水素結合に よる二本鎖のアニーリングを可能にするのに適当なハイブリダイゼーション条件 下で標的配列を持つ核酸を含むと予想されるサンプルと混合される。次いで、プ ローブは、サンプル内に存在する標的核酸とハイブリダイズする。得られたハイ ブリッド二本鎖は、ヒドロキシアパタイト吸着のような、この技術分野で周知の 様々な技術によって検出することができる。また、これらの技術には、Ａｒｎｏ ｌｄら、合衆国特許第５，２８３，１７４号（本明細書と共通の所有権を享受し 、ここに参照として採用する）に開示したように、ハイブリダイズしなかったプ ローブ上に存在する標識を選択的に分解し、次いで残留するハイブリダイズした プローブと関連する標識の量を測定することを含む技術が含まれる。この後者の 技術は、ハイブリダイゼーション防御アッセイ（ＨＰＡ）とも呼ばれ、現在のと ころ、出願者らによって選択されている。 試験サンプルは、時には、用いた特定の標識の感受性の限度によっては、核酸 ハイブリダイゼーションによる直接的な検出または数量化を可能にするための充 分な核酸分子数を含まないであろう。そのような場合には、核酸ハイブリダイゼ ーションを用いて試験サンプル内のその存在または量を同定する前に、検出可能 な標的ヌクレオチド配列の量を増加させる。この方法は、核酸増幅とも呼ばれ、 標的核酸の量を増加させる方法は、標的核酸または標的ヌクレオチド配列を増幅 させることをさす。 増幅方法は、核酸ポリマー化反応の鋳型として標的ヌクレオチド配列を含む少 なくとも一つの核酸鎖を用いて標的ヌクレオチド配列を含む相補的二本鎖を作成 することを含む。増幅は、標的ヌクレオチド配列を含む二本鎖核酸分子のセンス およびアンチセンス鎖の両方で行うことができる。この方法を繰り返し、以後の サイクルの鋳型として核酸生成物を用いることによって、標的ヌクレオチド配列 を持つ核酸分子の数は迅速に増加する。 数多くの増幅法が記載されており、これらの中には、ポリメラーゼ鎖反応（Ｐ ＣＲ）（例えば、Ｍｕｌｌｉｓら、合衆国特許第４，６８３，１９５号を参照の こと）および方法の一つあるいはそれより多くの段階の中にインビトロでの転写 （ＲＮＡ合成）を用いる方法（例えば、Ｍｕｒａｋａｗａら、ＤＮＡ，７，２８ ７−２９５；Ｂｕｒｇら、ＰＣＴ出願ＷＯ８９／１０５０；Ｇｉｎｇｅｒａｓら 、ＰＣＴ出願ＷＯ８８／１０３１５；ＫａｃｉａｎおよびＦｕｌｔｚ、欧州特許 出願第８９３１３１５４号；ＭｃＤｏｎｏｕｇｈら、ＰＣＴ出願ＷＯ９４／０３ ４７２；Ｋａｃｉａｎら、ＰＣＴ出願９３／２２４６１：およびＤａｔｔａｇｕ ｐｔａら、合衆国特許出願番号０８／２１５，１８１、１９９４年３月１６日、 合衆国に出願：を参照のこと）の様々な実施態様がある。これらの参考文献の開 示 は、ここに参照として採用し、これらの参照の最後の２つは、本明細書と共通の 所確を享受する。 ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、予想される標的核酸の存在を検 出、指示および／または定量化するために用いられ；そのようなプローブは、通 常、放射活性またはは発光原子または化学発光部の様な検出可能な化学基で標識 される。出願者らは、標識化試薬としてアクリジニウムエステル誘導体を用いる ことを好む。しかしながら、また、標識したプローブを用いなくても、予想され る標的核酸の存在を検出することもできる。例えば、プローブおよび標的核酸の 間に形成されたハイブリッドは、ヒドロキシアパタイトまたはゲルろ過を用いて 単離することができ、また、未変性のゲル電気泳動を用いることによって可視化 することもできる。時には、予想される標的核酸は、通常、生物起源から誘導さ れたヌクレオチド配列を持つ異なる核酸分子の任意の集団を含むかもしれない。 単に例として、さらに、制限としてではなく、標的ヌクレオチド配列は、（属の 外側の生物体の核酸によってではなく）、生物体の一つの属内の核酸、所望の任 意の検出によって分けることができる。また、標的ヌクレオチド配列は、生物体 の種またはその種の株に対してユニークであっても良い。 すべてのプローブが、検出可能であることを必ずしも意図しているわけではな い。いくつかのハイブリダイゼーションプローブは、「ヘルパーオリゴヌクレオ チド」または「ヘルパープローブ」と呼ばれ、その標識ヌクレオチド配列と結合 するセパレートアッセイプローブの能力を促進するように設計される。理論によ る結合を望むわけではないが、ヘルパープローブは、標的核酸内の分子内水素結 合の量を局所的に減少させることによってアッセイプローブとの結合を促進し、 こうして、標的ヌクレオチド配列を標識プローブとの特異的ハイブリダイゼーシ ョンにより利用しやすくすると、出願者らは考えている。標的プローブの結合部 位の位置および標的核酸の二次構造によって、ヘルパープローブは、標識プロー ブ結合部位に近いヌクレオチド配列領域と関係するか、または、結合部位から遠 いが、それにもかかわらずプローブ結合に影響を与えるヌクレオチド領域と関係 する。ヘルパープローブは、本出願と共通の所有権を享受する、Ｈｏｇａｎら、 合衆国特許第５，０３０，５５７号に記載されており、ここに参照として採用す る。 特定の核酸配列の存在を検出する核酸ハイブリダイゼーションの用途の記載は 、Ｋｏｈｎｅ、合衆国特許第４，８５１，３３０号、およびＨｏｇａｎら、国際 特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８７／０３００９に与えられており、これらの参考文献は 両方とも、本出願と共通の所有権を享受し、ここに参照として採用される。Ｈｏ ｇａｎは、核酸ハイブリダイゼーション技術を用いて、サンプル（例えば、痰、 尿、血液および組織切片、食物、よだれおよび水）中の非ウイルス性生物体また は非ウイルス生物体のグループの存在を検出する方法について記載している。 また、Ｈｏｇａｎ（上記）は、特定の生物体または生物体のグループに属する 標的化リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）ヌクレオチド配列のみを特異的に検出する 数多くのハイブリダイゼーションプローブについて記載している。発明の要約 特徴ある本発明は、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ ｒＲＮＡあるいはそれをコードす るＤＮＡの特定領域、またはＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ ｒＲＮＡあるいはｒＤＮＡ ヌクレオチド配列、を含む、から主になる、またはからなる、オリゴヌクレオチ ドまたは核酸、に相補的であるように設計される、オリゴヌクレオチドハイブリ ダイゼーションアッセイプローブおよびヘルパーオリゴヌクレオチドを開示し請 求する。 本発明のハイブリダイゼーションプローブは、標的核酸の選択的検出を可能に する条件下で、特異的な標的ヌクレオチド配列を持つ分子の領域内て標的核酸に ハイブリダイズするように設計される。 このように、本発明のハイブリダイゼーションプローブおよびヘルパーオリゴ ヌクレオチドの基礎的および新規の特徴は、適当な限定されたハイブリダイゼー ション反応条件下で、標的でない核酸または核酸領域以上に、標的Ｍ．ｋａｎｓ ａｓｉｉ核酸の前もって決定された領域と優先的にハイブリダイズする、それら の能力である。この特異性は、標的核酸の領域のヌクレオチド配列および水素結 合したハイブリダイゼーション複合体内に含まれるハイブリダイゼーションプロ ーブの間の相補性の程度、ならびにハイブリダイゼーションの反応条件、の作用 による。 また、本発明は、ハイブリダイゼーションプローブおよびそれらの特異的標的 核酸の間に形成される二本鎖核酸ハイブリッド分子を開示し請求する。アッセイ プローブおよび標的核酸分子の間に形成されるハイブリッドの構造はハイブリダ イゼーション反応後にハイブリダイズしなかったアッセイプローブから物理的に または化学的に識別することができるので、前記ハイブリッドは、Ｍ．ｋａｎｓ ａｓｉｉの検出および／または定量に有用である。例えば、アッセイプローブお よび標的核酸分子の間に形成されるハイブリッドは、ヒドロキシアパタイト、ゲ ルろ過、ゲル電気泳動、およびその他の関連する方法論の使用を通して、ハイブ リダイズしなかったアッセイプローブから分離することができる。標識したアッ セイプローブを用いる場合、アッセイプローブ上に存在する標識をハイブリッド 部分として検出することができ、その結果、ハイブリッド上の標識は、原サンプ ル内に標的核酸が存在することを示す。標識されていないアッセイプローブを用 いる場合、ハイブリッドの存在は、分光光度計、染料の結合、およびその他の周 知の方法を通して検出することができる。 代わりに、標識したアッセイプローブを用いると、ハイブリダイズしなかった 標識したプローブからハイブリッドを物理的に分離する必要なしに、ハイブリッ ドの存在を検出することができる。Ａｒｎｏｌｄら、合衆国特許第５，２８３， １７４号（以前に参照として採用した）に開示したように、ハイブリダイズしな かったプローブ上に存在する標識の分解は選択的である。この後者の技術は、ハ イブリダイゼーション保護アッセイ（ＨＰＡ）と呼ばれ、現在のところ、出願者 に好まれている。 このように、本発明の目的は、試験サンフワレ中で、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉを その他の微生物から識別する能力を持つオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーシ ョンアッセイプローブを提供することにある。これらのプローブは、Ｍ．ｋｓｎ ｓａｓｉｉ核酸に高度の特異性を持ち、そして、Ｍ．ｇａｓｔｒｉ、Ｍ．ａｖｉ ｕｍおよびＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅの様な密接に関連する生物体から の核酸に同一プローブがハイブリダイゼーションしないハイブリダイゼーション 条件下で、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ核酸とハイブリダイズするであろう。従って、 ハ イブリダイゼーションアッセイプローブの使用は、これらの生物体を含む試験サ ンプル内でのＭ．ｋａｎｓａｓｉｉの特異的検出または定量を可能にする。これ らのプローブは、ハイブリダイゼーションアッセイ内で単独で用いるか、または 、その他のアッセイプローブおよび／またはヘルパーオリゴヌクレオチドと一緒 に用いることができる。ハイブリダイゼーションアッセイプローブを用いると、 増幅していない標的核酸を直接検出するか、または、核酸増幅を通して得られた Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉヌクレオチド配列を持つ核酸を検出することができる。 本発明のプローブは、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ株に特異的であるかまたは非特異 的であるかのいずれかであることができる。上記のように、２３Ｓ ｒＲＮＡ内 に異なる核酸配列を持つＭ．ｋａｎｎｓａｓｉｉの不定型変異体が存在する。２ つのそのような不定型の亜種は、本明細書中で”ＢＯＶ”および”ＣＯＵ”亜種 と同定されたが、以下の方法に従って同定される。プローブは、Ｍ．ｋａｎｓａ ｓｉｉの定型および不定型亜種の両方を包括するように、または一つの亜種を排 除するように、設計することができる。このように、本発明の目的は、Ｍ．kaｎ ｓａｓｉｉでない生物体からＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ生物体（定型および不定型） のすべてを識別する能力を持つオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッ セイプローブおよび／またはプローブ混合物を提供することにある。さらに、本 発明の目的は、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ生物体の一つの亜種を検出し同定する能力 を持つオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブを提供する ことにある。このプローブ内には、定型のＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ生物体、Ｍ．ｋ ａｎｓａｓｉｉ ＢＯＶ 亜種、およびＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ ＣＯＵ 亜種に 特異的なプローブが含まれる。 本発明のもう一つの目的は、すべてのＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ生物体を検出する 方法、およびＭ．ｋａｎｓａｓｉｉでない生物体からＭ．ｋａｎｓａｓｉｉを識 別するための方法を提供することにある。さらに、本発明の目的は、定型、ＢＯ ＶおよびＣＯＵの様なＭ．ｋａｎｓａｓｉｉの亜種を互いに識別する方法を提供 することにある。 本発明のもう一つの目的は、咽喉スワブまたはその他のサンプルから誘導され た試験サンプル内のＭ．ｋａｎｓａｓｉｉの迅速、特異的、且つ再現可能な同定 を、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの核酸と関係するハイブリダイゼーションアッセイプ ローブおよびヘルパーオリゴヌクレオチドを用いることによって可能にすること にある。 本発明のもう一つの目的は、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ−特異的ハイブリダイゼー ションアッセイプローブが標的核酸にハイブリダイゼーションする速度を増加さ せ、さらに、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの核酸にハイブリダイズする能力を持つヘル パーオリゴヌクレオチドを用いることによって、形成されたハイブリッドの安定 性を増加させ、それによってＭ．ｋａｎｓａｓｉｉの標的への標識プローブの結 合を促進する、組成物を提供することにある。発明の詳細な説明 本発明は、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの不定型株から得られた核酸を含む、Ｍ．ｋ ａｎｓａｓｉｉの核酸の特異的検出に用いられるハイブリダイゼーションアッセ イプローブおよびヘルパーオリゴヌクレオチドと関連する。ここ開示されたおよ び請求されたすべてのオリゴヌクレオチドは、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの核酸のそ れと相補的な少なくとも一つのヌクレオチド配列領域を含むという事実を共有す る。定義 以下の用語は、別に特に示さない限り、明細書に示した意昧を持つ。 「標的核酸」とは、標的ヌクレオチド配列を持つ、一本鎖または二本鎖の核酸 を意味する。 「オリゴヌクレオチド」とは、長さが２より大きいヌクレオチド、好ましくは 、長さが１０および１００の間のヌクレオチド、最も好ましくは１２および５０ の間のヌクレオチド、の一本鎖ヌクレオチドポリマーを意味する。そのようなオ リゴヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によって、ホスホロチオエート結合 によって、またはその他の稀な、あるいは天然発生でない結合によって、連結す ることができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡｓ）（ ｃｉｔｅ）を含むことができる。さらに、オリゴヌクレオチドは、２’メトキシ − または２’ハロゲン化−リボピラノシル部分のような一般的でないヌクレオチド またはヌクレオチドでない部分を持つことができる。ここに定義されたオリゴヌ クレオチドは、核酸、好ましくはＤＮＡであるが、ＲＮＡであっても良く、また は、共有結合したリボ−およびデオキシリボ−ヌクレオチドの組み合わせを持っ ていても良い。稀なあるいは天然発生でない結合および／または一般的でないヌ クレオチドまたは非ヌクレオチド部分で置換しても、標的配列とハイブリダイズ するオリゴヌクレオチドの能力を干渉してはならない。限定された配列のオリゴ ヌクレオチドプローブは、化学的または生化学的合成のように、当業者らに既知 の技術によって、および、組換え核酸分子、例えば細菌またはレトロウイルスベ クター、からのインビトロまたはインビボで発現させることによって、作成する ことができる。この開示から予期されるように、オリゴヌクレオチドは、染色体 ＤＮＡまたはそのインビボでの転写生成物からなるものではない。 「標的核酸配列」、「標的ヌクレオチド配列」または「標的配列」とは、一本 鎖の標的核酸分子のヌクレオチド配列、およびそれと完全に相補的なデオキシリ ボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列、の全体または一部分を含む特定の 所望のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列を意昧する。 「実質的に類似する」ヌクレオチド配列は、特定の同定された核酸配列と比較 して、（ＲＮＡまたはＤＮＡと等価のヌクレオチドを除いて）同一、または２０ ％より多くないミスマッチ、あるいは内部欠失および／または付加を持つ、ヌク レオチド配列である。対照核酸内で同定された配列と実質的に類似したヌクレオ チド配列を持つオリゴヌクレオチドは、その対照核酸の選択的ハイブリダイゼー ション能力を分かち持つ。さらに、実質的に類似したヌクレオチド配列を持つオ リゴヌクレオチドは、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で同定さ れた配列と完全に相補的なヌクレオチド配列を持つ核酸と、安定で、検出可能な ハイブリッドを形成することができるが、非標的核酸配列とは安定で検出可能な ハイブリッドを形成しないであろう。これらの実質的に類似した配列は、同定さ れた配列の３’末端および／または５’末端にさらなるヌクレオチドを持つこと ができる。 「ストリンジェント」ハイブリダイゼーションアッセイ条件とは、特異的ハイ ブリダイゼーションアッセイプローブが標的核酸（好ましくはＭ．ｋａｎｓａｓ ｉｉのｒＲＮＡまたはｒＤＮＡ）とハイブリダイズすることができ、その他の微 生物（例えば、Ｍ．ｇａｓｔｒｉ、Ｍ．ａｖｉｕｍおよびＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌ ｌｕｌａｒｅ）またはヒトのいずれかから誘導された試験サンプル内に存在する その他の核酸とは、有意にハイブリダイズしない。これらの条件は、ＧＣ含量お よびプローブの長さ、ハイブリダイゼーション温度、ハイブリダイゼーション試 薬または溶液の組成、および求められるハイブリダイゼーション特異性の程度を 含む因子に依存して変えることができることが認識されているであろう。具体的 なストリンジェントハイブリダイゼーション条件の例は、以下の開示に提供され る。 「プローブ」とは、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でそれと 安定にハイブリダイズさせる目的で、検出しようとする核酸配列と部分的または 完全に相補的である配列を持つ一本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。属または 種−特異的プローブの場合、プローブは、ストリンジェントハイブリダイゼーシ ョン条件下で、標的核酸と安定にハイブリダイズする能力を持つが、系統発生論 的に属または種の外側の生物体からの核酸のような、非標的核酸とはハイブリダ イズする能力を持たない。プローブは、必要なわけではないが、そのような配列 がストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でプローブの望ましい特異性 を実質的に変えることがない限りにおいて、標的配列と相補的でない領域を持つ ことができる。そのような非相補的領域が存在するならば、それらは、５’プロ モーター配列および／またはＲＮＡ転写のための結合部位、制限エンドヌクレア ーゼ認識部位、プローブの固定化を可能にする非選択的配列、または、特定の第 二の標的核酸とハイブリダイゼーションするための結合部位を含むことができる か、または、触媒活性部位、またはプローブ上、標的核酸上あるいはその両方上 のヘアピン構造のような所望の二次または三次構造を授与するであろう配列を含 むことができる。プローブは、プローブが標的配列とハイブリダイズしたことを 検出または確認するために用いることのできる、酵素またはその他のリガンドと 共に、ラジオアイソトープ、蛍光または化学発光部の様なレポーター基部で標識 することができる。プローブの一つの用途は、ハイブリダイゼーションアッセイ プローブとしてであり；また、プローブをは、インビボまたはインビトロでの治 療用オリゴヌクレオチドまたはアンチセンス薬剤として用いて、病気になった、 感染した、または病原性の細胞内の遺伝子転写、ｍＲＮＡスプライシングまたは 翻訳をブロックするまたは阻害することもできる。 本開示に用いられる、特異的配列のグループ「から選択された配列から主にな る核酸配列を持つプローブ（またはオリゴヌクレオチド）」と言う句は、基礎的 および新規の特徴を持つようなプローブが、ストリンジェントハイブリダイゼー ション条件下で列挙された核酸配列のグループの一つと正確に相補性であるヌク レオチド配列を持つヌクレオチド配列領域内で核酸と安定で検出可能なハイブリ ッドを形成するであろうことを意味する。この定義下での正確な補体は、関連す るＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含む。 「核酸ハイブリッド」または「ハイブリッド」とは、好ましくは長さが１０お よび１００の間のヌクレオチド、より好ましくは、長さが約１２および５０の間 のヌクレオチドの、二本鎖の水素結合領域を含む核酸構造を意味し、そのそれぞ れの鎖が他の鎖と相補性であり、そしてその中の領域がストリンジェントハイブ リダイゼーション条件下で充分に安定であり、限定するわけではないが、化学発 光または蛍光検出、オートラジオグラフ、またはゲル電気泳動を含む手段によっ て検出される。そのようなハイブリッドは、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡ、 またはＤＮＡ：ＤＮＡの二本鎖分子を含むことができる。 「相補的」とは、２つの一本鎖核酸の類似領域、または同一の一本鎖核酸の異 なる領域のヌクレオチド配列が、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件 下で一本鎖を安定な二本鎖水素結合領域に共にハイブリダイズすることを可能に する、ヌクレオチド塩基組成物を持つことを意味している。一つの一本鎖領域の ヌクレオチドの隣接配列が、ＡはＵまたはＴと対になり、そしてＣはＧと対にな ると言ったような、その他の一本鎖領域の類似ヌクレオチド配列と一連の「規範 的な」水素結合塩基対を形成することができる場合、ヌクレオチド配列は、「完 全に」相補的である。 「保守的に修飾された変異体」とは、第一の核酸の第一のヌクレオチド配列領 域に相補的であるヌクレオチド配列を持つ核酸またはオリゴヌクレオチドであっ て、第一のヌクレオチド配列領域が第二の「対照」核酸内に含まれる第二のヌク レオチド配列領域と完全に相補的である、上記の核酸またはオリゴヌクレオチド を意味する。保守的に修飾された変異体は、８より多くない付加ヌクレオチドを 持ち、そして、対照核酸より８より多くない数で少ないヌクレオチドを持つ。そ のような保守的に修飾された変異体は、対照ヌクレオチド配列より長いプローブ を与える５’−および３’−に非相補的ヌクレオチドを持つことができることを 、理解するであろう。保守的に修飾された変異体は、ストリンジェントハイブリ ダイゼーション条件下で、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉヌクレオチド配列を持つ標的核 酸領域と安定で検出可能なハイブリッドを形成するが、非標的ヌクレオチドとは 、安定で検出可能なハイブリッドを形成しないであろう。 「核酸増幅」または「標的増幅」とは、少なくとも一つの標的核酸配列を持つ 核酸分子の数を増やすことを意味している。 「ヘルパーオリゴヌクレオチド」とは、標識されたハイブリダイゼーションア ッセイプローブの座とは異なる座で標的核酸とハイブリダイズするように設計さ れた常態では標識されていない核酸プローブであって、それによって標識された プローブのハイブリダイゼーション速度を増加させるか、あるいは標的：標識化 プローブハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）を高めるかのいずれか、またはその両 方の、上記核酸プローブを意味する。ハイブリダイゼーションの条件およびプローブ／プライマーの設計 ハイブリダイゼーション反応条件（その最も重要なものはハイブリダイゼーシ ョン温度およびハイブリダイゼーション溶液内の塩濃度である）は、本発明のハ イブリダイゼーションプローブが、試験サンプル内に存在すると予想される他の 非標的ヌクレオチド以上に、標的Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉヌクレオチド配列を持つ 核酸と好んでハイブリダイズすることを可能にするように選択することができる 。塩濃度を減少および／または温度を上昇（ストリンジェンシーの増加と呼ばれ る）させると、二本鎖ハイブリッド分子内で対になったヌクレオチド塩基間の水 素結合が崩壊するので、核酸ハイブリダイゼーションの程度は減少する；このプ ロセスを「融解」と呼ぶ。 一般的に言えば、最も安定なハイブリッドは、最も大きい数の連続的に完全に 調和した（即ち水素結合した）ヌクレオチド塩基対を持つそれらである。従って 、そのようなハイブリッドは、通常、ハイブリダイゼーション条件のストリンジ ェンシを増加させると最後に融解すると期待される。しかしながら、一つまたは それより多くのミスマッチ、「非規範的」または不完全塩基対を含む二本鎖核酸 領域は、（結果として核酸のヌクレオチド配列内のその位置で弱い塩基対を生じ るか、または塩基対を生じないが）試験サンプル内に存在する他の非標的核酸と 交差反応することなくハイブリダイゼーションアッセイで核酸ハイブリッドを検 出することを可能にする比較的高いストリンジェンシー条件下で、なお充分に安 定であることができる。 それ故、一方では、標的生物体の核酸および非標的であるが密接に関連した生 物体の核酸の間の配列の変異の程度、ならびに、他方では、特定のハイブリダイ ゼーションプローブのヌクレオチド配列および標的核酸のヌクレオチド配列との 間の相補性の程度の両方によって、プローブおよび標的の間の一つまたはそれよ り多くのミスマッチは、非標的核酸以上に標的にハイブリダイズするオリゴヌク レオチドの能力を必ずしも負かすものではない。 本発明のハイブリダイゼーションアッセイプローブは、プローブ：標的ハイブ リッドの融解温度（Ｔ_m、与えられた反応混合物内で可能性のある二本鎖分子の 半分が一本鎖、変性常態である温度と定義される）、ならびに、プローブおよび 試験サンプル内に存在すると予想される系統分類学的に最も密接に関連する生物 体のｒＲＮＡまたはｒＤＮＡの間に形成されたミスマッチハイブリッドのＴ_m、 の間の差異を最大にするように、選ばれ、選択され、および／または設計された が、検出されるようにしたわけではない。標識されてない増幅オリゴヌクレオチ ドおよびヘルパーオリゴヌクレオチドは、本発明に有用な標識されたハイブリダ イゼーションアッセイプローブのように極端に高度の特異性を持つ必要はないが 、それらは、一般的には、その他の核酸以上に一つまたはそれより多くの生物体 の標的核酸と優先的にハイブリダイズするように類似の様式で設計される。核酸配列 Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ、ならびに、Ｍ．ｇａｓｔｒｉ、Ｍ．ａｖｉｕｍおよび Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｕｌａｒｅのように密接に関連する生物体、のｒＲＮＡの 核酸配列は、公表された起源から得られるか、または、この技術分野で周知の核 酸配列決定技術を用いて出願者らが独立的に決定することもできる。例えば、Ｌ ａｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８２，６９５５、１９８ ５を参照のこと。 これらの様々な生物体のｒＲＮＡ配列をアラインすることによって、出願者ら は、種間相対変動性(relative interspecies variability)を持つ特異的識別領 域を発見した。標的生物体（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）および非標的生物体（例え ば、Ｍ．ｇａｓｔｒｉ、Ｍ．ａｖｉｕｍおよびＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｅ）の間で最も多くのヌクレオチド配列変動性を示すそれらの領域を、種特異的 ハイブリダイゼーションアッセイプローブを設計するための潜在的標的領域とし て選んた。 図１は、定型のＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ、ならびに、”ＣＯＵ”および”ＢＯＶ ”と名付けられた２つの不定型変異体株の２３Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチドの６ ２２および６８０（大腸菌２３Ｓ ｒＲＮＡ；「６５０領域」と番号付けた）の 間の共通配列を示している。配列番号１は、定型株からのものであるが、配列番 号２は、ＢＯＶ株から、そして配列番号３はＣＯＵ株からのものである。 稀に同定される推定のユニークな潜在的標的ヌクレオチド配列は、機能的な種 特異的ハイブリダイゼーションアッセイプローブをその配列を含むＭ．ｋａｎｓ ａｓｉｉのｒＲＮＡまたはｒＤＮＡとハイブリダイズするように作ることを保証 しない。様々なその他の要素が、種特異的プローブの標的部位としての核酸座の 適合性を決定するであろう。例として、可能性のある標的ヌクレオチド配列の（ およびこのような二本鎖プローブ：標的ハイブリッドの）ＧＣ含量の増加は、一 般的にハイブリッドの安定性およびＴ_mを増加させる。一つまたはそれより多く の「非標的」生物体と同一であるその配列領域内で隣接するヌクレオチドの数も また、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉのｒＲＮＡと完全に相補的なプローブおよび非標的 生物体または生物体類のｒＲＮＡヌクレオチド配列を持つ核酸の間の部分的ミス マッチを持つハイブリッドの安定性およびＴ_mに影響を与える。従って、２つ のハイブリッドの融解温度の差が、充分な大きさ、常態で少なくとも２−５℃、 でない場合、プローブは、ユニークな領域を標的としても、種特異的とはならな いかも知れない。 ハイブリダイゼーションの好ましい温度および（塩濃度のような）ハイブリダ イゼーション溶液組成は、二本鎖ハイブリッドの安定性に主な影響を与える２つ の条件である；これらの条件は、属−または種−に特異的なプローブの構築にお いて考慮されなばならない。ハイブリッド核酸の熱安定性は、反応混合物のイオ ン強度と共に増加する。他方、ホルムアミド、尿素、ジメチルスルホキシドおよ びアルコールのように、水素結合を崩壊させる化学薬品は、ハイブリッドの熱安 定性を大きく減少させることができる。 その標的へのプローブの特異性を最大にするために、本発明の主題のプローブ は、高いストリンジェンシー条件下でそれらの標的とハイブリダイズするように 設計された。そのような条件下では、高度の相補性を持つ一本鎖の核酸のみが、 互いにハイブリダイズするであろう：そのような高度の相補性を持たない一本鎖 の核酸は、ハイブリッドを形成しないように企てられるであろう。従って、アッ セイ条件（例えば、温度およびイオン強度）のストリンジェンシーから、ハイブ リッドを形成するために２つの核酸鎖間に存在しなければならない相補性の量を 決定することができる。本発明に関連して、ストリンジェンシーは、プローブお よび標的核酸間に形成されたハイブリッドならびにプローブおよび存在する任意 の一本鎖非標的核酸間に形成される可能性のあるハイブリッドとの間の安定性の 差異を最大にするように選択される。 適当なプローブ特異性は、非標的生物体の配列と完全に相補的であるヌクレオ チド配列を持つプローブの長さを最少にすることによって、非標的配列と相同の ＧおよびＣを多く含む領域を避けることによって、および可能な限り多くの非標 的配列との不安定なミスマッチを含むプローブを構築することによって、設計す ることができる。 標的核酸配列の長さ、およびプローブ配列の全体の長さもまた、特異性に重要 である可能性がある。ある場合には、種特異的プローブ標的として用いることの できる、位置および長さの異なる、特定の「可変」領域内にいくつかのヌクレオ チド配列が存在することもある。ある場合には、種特異的プローブを特定のｒＲ ＮＡ可変領域に対して設計することができない。その理由は、配列領域がプロー ブに接近しにくいか、またはその他の理由によるかのいずれかである。ハイブリ ダイズする完全に相補的でない核酸も可能ではあるが、最も長く伸長した完全に 相同な塩基配列が、一般的に、ハイブリッド安定性を決定するであろう。異なる 長さおよび塩基組成のオリゴヌクレオチドプローブを用いることもできる。 ハイブリダイゼーションを阻害する強い分子内構造を形成する標的領域は、あ まり好ましくない標的領域である。同様に、結果として広範な自己相補性を生ず るプローブ設計もまた、避けられるべきである。上に説明したように、ハイブリ ダイゼーションは、水素結合した二本鎖ハイブリッドを形成する相補的核酸の２ つの一本鎖の連合である。このように、２つの鎖の一つまたは両方が、分子内ま たは分子間結合に全体的にまたは部分的に含まれるならば、それが、新しい分子 間プローブ：標的ハイブリッドの形成に預かる可能性はほとんどない。例えば、 リボソームＲＮＡ分子は、水素結合によって非常に安定な分子内ヘリックスおよ び二次構造を形成することが知られている。実質的な標的配列部分がプローブと のハイブリダイゼーションまで一本鎖状態で残るようなハイブリダイゼーション アッセイを設計することによって、プローブと標的の間のハイブリダイゼーショ ン速度および範囲を大きく増加させることができる。これを達成できる一つの方 法は、標的ヌクレオチド配列として、細胞内水素結合に比較的含まれない配列を 選ぶことによる方法である。代わりにまたはさらに、ハイブリダイゼーションア ッセイプローブを、ハイブリダイゼーションアッセイプローブとのハイブリダイ ゼーションをより可能にしやすい標的部位を作ることのできるヘルパーオリゴヌ クレオチドを持つプローブ混合物内で用いることもできる。そのようなヘルパー プローブは一般に記載されている。 それらの標的核酸と完全にマッチしたオリゴヌクレオチドの融解温度を概算す る数多くの式が手に入る。 そのような式の一つ； Ｔ_m＝81.5＋16.6(log₁₀［Na⁺］+0.41(フラクションG+C)−（600／N） （式中、Ｎ＝ヌクレオチド数中のオリゴヌクレオチドの長さ）；は、長さが約１ ４および７０の間のヌクレオチドのオリゴヌクレオチドのＴｍに関して、良好な 概算を提供する。そのような計算から、続いて行う実験に基づくＴ_mの証明また は「微細チューニング」は、スクリーニング技術を用いて行うことができる。ハ イブリダイゼーションおよびオリゴヌクレオチドプローブのさらなる情報に関し ては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９（ここに１１章を参照として 採用する）を参照のこと。この参考文献は、また、ハイブリッドのＴ_mとのミス マッチの影響の評価を提洪する。オリゴヌクレオチドの調製 オリゴヌクレオチドは、共に共有結合したヌクレオチドサブユニットから作ら れる。ヌクレオチドサブユニットの糖基は、リボース、デオキシリボースまたは Ｏ−メチルリボースあるいは２’ハロゲン化リボースのようなそれから修飾され た誘導体であることができる。ヌクレオチドサブユニットは、ホスホジエステル 結合の様な結合、修飾された結合、またはオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼ ーションを妨げない非ヌクレオチド部分によって、多分結合するであろう。修飾 された結合には、標準ホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合またはメ チルホスホネート結合のような別の結合と置き換えるそれらの結合が含まれる。 上記のように、ハイブリダイゼーションアッセイプローブとして用いた場合、オ リゴヌクレオチドは、好ましくは、その標的配列へのプローブのハイブリダイゼ ーションの同定を助ける、アクリジニウムエステルまたはラジオアイソトープの ようなレポーター基を含む。 本発明のオリゴヌクレオチドはすべて、ハイブリダイゼーションアッセイプロ ーブであろうとヘルパーオリゴヌクレオチドであろうと、それらの性能を強化す る、または増幅生成物の特徴を促進するために、化学基で修飾することができる 。例えば、あるポリメラーゼのヌクレオリティック(nucleolytic)活性に耐性な オリゴヌクレオチドを減少させるホスホロチオエートまたはメチルホスホネート 基をもつそれらの様な骨格−修飾オリゴヌクレオチドは、増幅またはその他の反 応 へのそのような酵素の使用を可能にする。修飾のもう一つの例としては、ヌクレ オチド間またはハイブリダイゼーションまたはプライマーの伸長を妨げないオリ ゴヌクレオチド鎖の末端に取り入れられた、非ヌクレオチドリンカーを用いる（ 例えば、Ａｒｎｏｌｄら、欧州特許出願８８３０８７６６−０、ここに参照とし て採用する）ことが含まれる。 上に開示したように、オリゴヌクレオチドの５’末端は、いくつかの核酸ポリ メラーゼ内に存在する５’−エキソヌクレアーゼ活性に耐性であるように修飾す ることができる。そのような修飾は、Ａｒｎｏｌｄら、上記、「ヌクレオチドプ ローブのための非ヌクレオチド結合試薬」("Non-Nucleotid Linking Reagents f or Nucleotide Probes")（前もってここに参照として採用された）に記載された それらのような技術を用いて、プライマーの末端５’ヌクレオチドに非ヌクレオ チド基を付加することによって、遂行することができる。Ｍ．ｋａｎｓａｓｉiのｒＲＮＡおよびｒＤＮＡに対するオリゴヌクレオチドハ イブリダイゼーションアッセイプローブ ここに開示され請求されたオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセ イプローブは、形態分類学上密接に関連する細菌種、好ましくは、Ｍ．ｇａｓｔ ｒｉ、Ｍ．ａｖｉｕｍおよびＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、の核酸以上に 、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉのｒＲＮＡまたはｒＤＮＡヌクレオチド配列を含む標的 核酸と優先的にハイブリダイズすることができる。これらのハイブリダイゼーシ ョンアッセイプローブは、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ変異体のｒＲＮＡを含むＭ．ｋ ａｎｓａｓｉｉと前記の形態分類学的に密接に関連した種とのリボソームＲＮＡ の関連領域のヌクレオチド配列の比較に基づいて、設計され、選択され、および ／または、選択された。 本発明のハイブリダイゼーションアッセイプローブは、以下の標的ｒＲＮＡヌ クレオチド配列： および、チミンをウラシルの代わりに用いたそのＤＮＡ版： または、これらの配列と完全に相補的であるヌクレオチド配列；と相補的である 。 ハイブリダイゼーションプローブは、１０、１１、１２、１３、１４または１ ５から１００までのヌクレオチドの長さで変化させることができ、好ましくは、 １０および５０の間のヌクレオチドの長さである。プローブは、上記のように、 ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で同定された標的領域とハイブ リダイズする能力を持たねばならない。そのように、それらは、一つの標的領域 の少なくとも１０ヌクレオチドの隣接する領域と少なくとも７５％の相補注を持 たねばならない。好ましくは、相補性は少なくとも８０％であり、８５％、９０ ％、９５％またはそれより多くのプローブが最も好ましいが、7７５％から完全 に相同の範囲内のぐらいの相補性を持つプローブがここでは有用である。隣接領 域は、１０より多いヌクレオチド、例えば、１１、１２、１３、１４、または１ ５ヌクレオチドまたはそれより多く、であることができる。さらに、隣接領域へ のハイブリダイゼーションは、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ核酸と検出可能なハイブリ ッドを作り出さねばならず、そして、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｇａｓｔｒｉ、また は、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅの核酸のような非標的核酸と検出可能な ハイブリッドを形成する能力を持っていてはならない。 これらのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブの好ま しい実施態様では、ヌクレオチド配列： および、ウラシルをチミンの代わりに用いた、そのＲＮＡ版： または、それと完全に相補的なヌクレオチド配列、を持つ。 これらの好ましいオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプロー ブのコア配列は、ヌクレオチド配列： を持つ。 オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブは、単独で、または組み 合わせのいずれかで、用いることができる。配列番号７と関連するプローブおよ びそれらの関連するプローブは、定型のＭ．ｋａｎｓａｓｉｉの検出に用いるこ とができ；配列番号８と関連するプローブおよびそれらの関連するプローブは、 不定型のＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ ＢＯＶ株の検出に用いることができ；配列番号 ９および配列番号４０と関連するプローブおよびそれらの関連プローブは、不定 型のＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ ＣＯＵ株の検出に用いることができる。これらのプ ローブの組み合わせは、関連する組み合わせのＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ株の検出に 用いることができる。 本発明のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブは、プ ローブが標的配列ハイブリダイズしたことを検出または確認するために用いるこ とのできる酵素またはその他のリガンドと共に、ラジオアイソトープ、蛍光また は化学発光部のような検出可能な標識で標識することが好ましい。出願者らは、 化学発光アクリジニウムエステルを標識として用いることを選択する。Ａｒｎｏ １ｄら、合衆国特許第５，１８５，４３９号（本出願と共通の所有権を享受し、 ここに参照として採用する）を参照のこと。相補性領域内の水素結合によって２ つの鎖のアニーリングを可能にするに適当なハイブリダイゼーション条件下で、 アッセイプローブを、標的配列を持つ核酸を含むと予想されるサンプルと混合す る。 また、プローブまたはプローブ類を、一つまたはそれより多くの非標識ヘルパ ーオリゴヌクレオチドと結合させると、標的Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉヌクレオチド 配列を持つ核酸との結合を促進することができる。次いで、プローブは、サンプ ル中に存在する標的核酸とハイブリダイズし；得られたハイブリッド二本鎖を、 ヒドロキシアパタイト吸着および放射活性のモニタリングのような、この技術分 野で周知の様々な技術によって、分離し検出することができる。また、これらの 技術には、Ａｒｎｏｌｄら、合衆国特許第５，２８３，１７４号（本出願と共通 の所有権を享受し、ここに参照として採用する）に開示したような、ハイブリダ イズしなかったプローブ上に存在する標識を選択的に分解し、次いで残留したハ イブリダイズプローブと関連する標識の量を測定することを含むそれらが含まれ る。出願者らは、現在のところ、後者の技術を選択している。 Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの検出において用いられるヘルパーオリゴヌクレオチド 特定のヘルパーオリゴヌクレオチドを用いて、ハイブリダイゼーションアッセ イプローブの標的核酸へのハイブリダイゼーションを促進した。ヘルパーオリゴ ヌクレオチドは、本出願人に共通に所有される、ＨｏｇａｎおよびＭｉｌｌｉｍ ａｎ、米国特許５，０３０，５５７（本明細書の一部としてここに引用する）に 記載されている。Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの特異的検出を促進する特定のヘルパー オリゴヌクレオチドは、以下のＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ ＲＮＡヌクレオチド配列 に相補的なヌクレオチド配列を有する： およびウラシルがチミンで置換されているそのＤＮＡ版： またはこれらに完全に相補的なヌクレオチド配列。 これらのヘルパーオリゴヌクレオチドの好ましい態様は、以下のヌクレオチド 配列を有するオリゴヌクレオチドである：またはこれらに完全に相補的なヌクレオチド配列。 ヘルパーオリゴヌクレオチドは、一般に、ストリンジェントなハイブリダイゼ ーション条件下で用いることができるが、その選択性に関しては種特異的である 必要はない。すなわち、ヘルパーオリゴヌクレオチドのための標的ヌクレオチド 配列は、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ種に独特である必要はない。好ましくは、Ｍ．ｋ ａｎｓａｓｉｉの検出のために、ハイブリダイゼーションアッセイプローブをヘ ルパーオリゴヌクレオチドと組み合わせて用いる。 以下の本発明の種々の態様の例は、例示のためのみのものであり、本発明の範 囲を制限することを意図するものではない。実施例１ Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの種々の株の２３Ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ配列 は、ＰＣＲ増幅およびサイクルシークエンシングを用いて得た。 種々のＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡ配列を、Ｍ．ｇａｓｔｒｉ、 Ｍ．ａｖｉｕｍおよびＭ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅを含む、いくつかの密 接に関連する系統学的近縁種のものと比較した。Ｅ．ｃｏｌｉのヌクレオチド６ ５０付近の領域に対応する領域が、プローブ設計に用いることができる種特異的 変異を有することが見いだされた。プローブ配列番号：７、プローブ配列番号： ８およびプローブ配列番号：９が、非定型変種を含むＭ．ｋａｎｓａｓｉｉのｒ ＲＮＡ配列と他の密接に関連する生物との間を最もよく区別しうるものとして選 択された。実施例２ この実験においては、密接に関連する生物であるＭ．ｇａｓｔｒｉおよびＭ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対するハイブリダイゼーションにより、配列番号： ８のヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションプローブの特異性を試験した。 配列番号：１３の配列を有するヘルパーオリゴヌクレオチドを用いて、ハイブリ ダイゼーションアッセイプローブの標的核酸へのハイブリダイゼーションを促進 した。Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ，Ｍ、ｇａｓｔｒｉおよびＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏ ｓｉｓのＡＴＣＣタイプ株を用いた。生物を適当な固体培地に植菌し、対数期ま で増殖させた。各培養物からの１μｌ白金耳の増殖物を、ガラスビーズ、および ５％ソルビトール、２．８５ｍＭアジ化ナトリウム、３．７ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、 ０．０３５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５０ｍＭコハク酸、１０ｍＭ ＥＤ ＴＡ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、１％ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）、および６０ ０ｍＭ ＬｉＣｌからなる２００μｌの溶解溶液を含む細菌溶解管に加えた。管 を室温で１５分間超音波処理して生物を溶解させ、次に、９５℃±５℃で１０分 間不活性化させた。 プローブはアクリジニウムエステルで標識した。各プローブについて、約２． ５ｘ１０⁶ＲＬＵ（相対光単位；ルミノメーターにより検出された光子の数の測 定値）を用いた。ハイブリダイゼーションは、０．０５Ｍコハク酸リチウム（ｐ Ｈ５）、０．６Ｍ ＬｉＣｌ，１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ） 、１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１０ｍＭエチレングリコール ビス（ベータアミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＥＧＴ Ａ）を含む溶液を用いて、６０℃で１５分間実施した。０．１５Ｍ四ホウ酸ナト リウム（ｐＨ８．５）、１％ＴＲＩＴＯＮ^RＸ−１００を含む３００μｌの溶液 を各管に加え、各反応液を６０℃で８分間インキュベートし、室温に冷却した。 ハイブリダイゼーションの検出は、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ ＬＥＡＤＥＲ^RＩルミ ノメーター（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅ ｇｏ，ＣＡ）で分析した。ルミノメーターは、２種類の試薬を自動的に注入する ；第１の試薬は１ｍＭ硝酸および０．１％過酸化水素を含み、第２の試薬は１Ｎ 水酸化ナトリウムを含む。アッセイの結果はＲＬＵで表した。３０，０００ＲＬ Ｕより大きいＲＬＵ値は、陽性反応であると考えられた。これらの実験について 、各反応は二重に実施した。結果を以下に示す。 表１：配列番号：２のヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーションアッセ イプローブを用いるＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ核酸の検出 実施例３ この実験においては、配列番号：８および配列番号：９のヌクレオチド配列の ハイブリダイゼーションプローブの特異性を、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの定型株に 対するこれらのプローブのハイブリダイゼーションにより試験した。株１−９は ＢＯＶ株と分類され、株１０−１１はＣＯＵ株と分類された。細胞増殖および溶 解、ハイブリダイゼーションおよび検出は、実施例２に記載のとおり行った。各 ハイブリダイゼーション反応において、ヘルパープローブを用いることによりハ イブリダイゼーションを促進した。配列番号：８のヌクレオチド配列のプローブ については、配列番号：１４および配列番号：１５のヌクレオチド配列のヘルパ ープローブを用い、配列番号：９のヌクレオチド配列のプローブについては、配 列番号：１４および配列番号：１３のヌクレオチド配列のヘルパープローブを用 いた。結果は、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの２種類の変異株に対するプローブの特異 性を示した。 表２：配列番号：８または配列番号：９のヌクレオチド配列を有するハイブリダ イゼーションアッセイプローブを用いる非定型Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ核酸の検出 実施例４ この実験においては、多数の異なる密接に関連する生物とのハイブリダイゼー ションにより、配列番号：７のヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーショ ンプローブの特異性を示す。細胞増殖および溶解は、１つのコロニーまたは１０⁸ 個以上の生物から放出されたＲＮＡを用いて、実施例２に記載のとおり行った 。ハイブリダイゼーションは、配列番号：１３および配列番号：１４のヌクレオ チド配列を有するヘルパープローブを用いて、実施例２に記載のとおり行った。 検出は、実施例２に記載のとおり行った。 表３：配列番号：１３および配列番号：１４のヌクレオチド配列を有するハイブ リダイゼーションアッセイプローブを用いるＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ核酸の検出 実施例５ この実験においては、生物の広範な系統発生学的横断（ｃｒｏｓｓ ｓｅｃｔ ｉｏｎ）に対するハイブリダイゼーションにより、配列番号：７のヌクレオチド 配列を有するハイブリダイゼーションプローブの特異性をさらに示す。細胞の増 殖および溶解は、実施例４に記載のとおり行った。ハイブリダイゼーションおよ び検出は、同じヘルパープローブを用いて、実施例４に記載のとおり行った。 表４：配列番号：７のヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーションアッセ イプローブを用いるＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ核酸の検出 実施例６ この実験においては、細菌の標準株について、３つの設計されたプローブ（配 列番号：７、配列番号：８および配列番号：９）および両方のヘルパープローブ （配列番号：１３および配列番号：１４）をすべて含むプローブミックスの特異 性を試験した。全部で５５種のミコバクテリウムのＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）参照株を評価した。これ らの株は、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉに最も密接に関連する生物を代表するものであ った。標準的な特異性試験は、活発に増殖しているＡＴＣＣ株の培養物から得た 増殖物を用いて実施した。ただし、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｅｍｏｐ ｈｉｌｕｍについては、細胞は入手できなかった。そのかわりに、Ｍｙｃｏｂａ ｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｍ ｒＲＮＡを、増殖している細胞培養 物から得ることができるものと等しい濃度で用いた。細胞増殖および溶解は、実 施例２に記載のとおり行った。ハイブリダイゼーションおよび検出もまた実施例 ２に記載のとおり行った。密接に関連するすべてのミコバクテリウムは、３０， ０００ＲＬＵカットオフより十分に低い陰性の結果を生じた。 表５：配列番号：７、配列番号：８および配列番号：９のヌクレオチド配列を有 するプローブの、他のミコバクテリウムに対するＭ．ｋａｎｓａｓｉｉへの特異 性 実施例７ この実験においては、実施例６において用いたプローブとヘルパーとのミック スの特異性を、細菌の標準株に対して試験した。合計６８種のＡＴＣＣ（Ａｍｅ ｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）参照株を評価 した。これらの株は、生物の系統発生学的横断を代表するものであった。標準的 な特異性試験は、活発に増殖しているＡＴＣＣ株の培養物から得た増殖物を用い て実施した。細胞増殖および溶解は、実施例２に記載のとおり行った。ハイブリ ダイゼーションおよび検出もまた、実施例２に記載のとおり行った。すべての系 統発生学的横断生物は、３０，０００ＲＬＵカットオフより十分に低い陰性の結 果を生じた。 表６：配列番号：７、配列番号：８および配列番号：９のヌクレオチド配列を有 するプローブの、生物の系統発生学的横断に対するＭ．ｋａｎｓａｓｉｉへの特 異性 実施例８ ハイブリダイゼーションプローブ（実施例６に示される）のミックスを、７種 のミコバクテリウムを表す５８種の臨床単離物に対するＭ．ｋａｎｓａｓｉｉへ の特異性について試験した。細胞の培養および増殖、およびハイブリダイゼーシ ョンは、実施例２に記載のとおり行った。密接に関連する臨床単離物について交 差反応は観察されなかった。 表７：臨床単離物におけるＭ．ｋａｎｓａｓｉｉに対するプローブおよびヘルパ ーミックスの特異性 実施例９ この実験においては、定型および非定型Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ ｒＲＮＡを用 いて、プローブ・ヘルパーミックス（実施例６に示される）の感度を試験した。 ｒＲＮＡは、０、０．１、０．２５、０．５および１ｎｇ／μｌの濃度で用いた 。試験は各濃度およびｒＲＮＡの各タイプについて二重に実施した。Ｍ．ｋａｎ ｓａｓｉｉの定型株、ＢＯＶ非定型株またはＣＯＵ非定型株のいずれかからの１ ００μｌのｒＲＮＡを、実施例２に記載のとおり、凍結乾燥したプローブおよび ハイブリダイゼーション試薬を含有する管に加えた。反応液をボルテックスし、 ６０℃で１５分間ハイブリダイズさせた。検出は、実施例２に記載のとおり行っ た。結果は、プローブが高感度であり、低レベルの量のＭ．ｋａｎｓａｓｉｉの 定型および非定型ｒＲＮＡを検出しうることを示した。 表８：定型および非定型ｒＲＮＡについてのプローブおよびヘルパーミックスの 感度試験 実施例１０ この実験では、非標的細胞のｒＲＮＡおよびｒＤＮＡを有する非標的細胞の存 在下における、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ ｒＲＮＡの検出についての、実施例６の プローブ／ヘルパーミックスの感度を試験した。．Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｇａｓ ｔｒｉ、およびＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの細胞を、実施例２に記載のとお り増殖させ溶解した。試料は、溶解した非標的細胞と、指示どおりの０ｎｇから １００ｎｇのＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ ｒＲＮＡとの適当なミックスを用いて調製 し、ハイブリダイゼーションおよび検出は、実施例２に記載されるように実施し た。結果は、多数（約１．５ｘ１０⁷個）の非標的細胞の存在下で、優れたシグ ナル回復を示した。 表９：非標的細胞の存在下におけるプローブ／ヘルパーミックスの感度 上述の種々の例において示される態様は、本発明に記載されるオリゴヌクレオ チドが、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ核酸を検出することができ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉ ｉをその既知の最も近い系統発生学的近縁類から区別するアッセイにおいて用い ることができることを示す。本明細書に記載されるいずれの例も、本発明を前述 の開示の態様に限定することを意図するものではなく、追加の態様も以下の特許 請求の範囲の範囲内である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ノット，キャロライン・エフ アメリカ合衆国カリフォルニア州92057, オーシャンサイド，パレット・コート 712

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉを検出するための核酸ハイブリダイゼーションアッ セイプローブであって、 および実質的に類似するこれらの変異体からなる群より選択される核酸配列を有 するオリゴヌクレオチドを含むプローブ。 ２． 前記オリゴヌクレオチドが標識されている、請求項１記載のプローブ。 ３． 前記標識がアクリジニウムエステルである、請求項２記載のプローブ。 ４． Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉがＢＯＶ株である、請求項１記載のプローブ。 ５． Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉを検出するための核酸ハイブリダイゼーションアッ セイプローブであって、 および実質的に類似するこれらの変異体からなる群より選択される核酸配列を有 するオリゴヌクレオチドを含むプローブ。 ６． 前記オリゴヌクレオチドが標識されている、請求項５記載のプローブ。 ７． 前記標識がアクリジニウムエステルである、請求項６記載のプローブ。 ８． Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉがＣＯＵ株である、請求項５記載のプローブ。 ９． 請求項１記載のプローブと、高いストリンジェンシーのハイブリダイゼー ション条件下でそれにハイブリダイズするヌクレオチドポリマーとの間に形成さ れる核酸ハイブリッド。 １０． 請求項５記載のプローブと、高いストリンジェンシーのハイブリダイゼ ーション条件下でそれにハイブリダイズするヌクレオチドポリマーとの間に形成 される核酸ハイブリッド。 １１． Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉを検出するための核酸ハイブリダイゼーションア ッセイプローブミックスであって、次の（ａ）および（ｂ）： （ａ） 次の（ｉ）および（ｉｉ）からなる群より選択される少なくとも１つの オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイプローブ： および実質的に類似するこれらの変異体 からなる群より選択される核酸配列を有するオリゴヌクレオチド、およ び および実質的に類似するこれらの変異体 からなる群より選択される核酸配列を有するオリゴヌクレオチド；およ び および実質的に類似するこれらの変異体 からなる群より選択される核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを含む少なくと も１つのヘルパープローブ を含むプローブミックス。 １２． 前記オリゴヌクレオチドが標識されている、請求項１１記載のプローブ 。 １３． 前記標識がアクリジニウムエステルである、請求項１２記載のプローブ 。 １４． 前記ヘルパープローブが、 および実質的に類似するこれらの変異体 からなる群より選択される核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項 １１記載のプローブミックス。 および実質的に類似するこれらの変異体 からなる群より選択される核酸配列を有するオリゴヌクレオチドをさらに含む、 請求項１１記載のプローブミックス。 １６． 前記ヘルパープローブが、 および実質的に類似するこれらの変異体 からなる群より選択される核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項 １５記載のプローブミックス。 １７． Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉを検出するための核酸ハイブリダイゼーションア ッセイプローブミックスであって、 前記プローブミックスは、群（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の少なくとも２つから それぞれ選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーショ ンアッセイプローブを含み、 （ａ）群（ａ）は、および実質的に類似するこれらの変異体 からなる群より選択される核酸配列を有するオリゴヌクレオチドの群を含み、 （ｂ）群（ｂ）は、 および実質的に類似するこれらの変異体 からなる群より選択される核酸配列を有するオリゴヌクレオチドの群を含み；そ して （ｃ）群（ｃ）は、 および実質的に類似するこれらの変異体 からなる群より選択される核酸配列を有するオリゴヌクレオチドの群を含むこと を特徴とするプローブミックス。 １８． 前記オリゴヌクレオチドが標識されている、請求項１７記載のプローブ 。 １９． 前記標識がアクリジニウムエステルである、請求項１８記載のプローブ 。 ２０． 少なくとも１つのヘルパープローブをさらに含み、ここで前記ヘルパー プローブは、 および実質的に類似するこれらの変異体、 からなる群より選択される核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項 １７記載のプローブミックス。 ２１． 前記ヘルパープローブが、 および実質的に類似するこれらの変異体 からなる群より選択される核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項 ２０記載のプローブミックス。 ２２． Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉを検出するための核酸ハイブリダイゼーションア ッセイプローブミックスであって、前記プローブミックスは、次の（ａ）、（ｂ ）および（ｃ）： および実質的に類似するこれらの変異体 からなる群より選択される核酸配列を有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチ ド、および および実質的に類似するこれらの変異体 からなる群より選択される核酸配列を有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチ ド；および および実質的に類似するこれらの変異体 からなる群より選択される核酸配列を有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチ ド を含み、 ここで、前記プローブミックスは、高いストリンジェンシーのハイブリダイゼー ション条件下で、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔ ｅｒｉｕｍ ｃｈｅｌｏｎａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｏｒｔｕｉｔ ｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｓｔｒｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕ ｍ ｇｏｒｄｏｎａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｍ 、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍｙｃｏｂａ ｃｔｅｒｉｕｍ ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｌｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｍｉａｅ、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ に由来する核酸と検出可能な標的−プローブデュープレックスを形成しない、 ことを特徴とするプローブミックス。 ２３． 前記オリゴヌクレオチドが標識されている、請求項２２記載のプローブ 。 ２４． 前記標識がアクリジニウムエステルである、請求項２３記載のプローブ 。 ２５． 少なくとも１つのヘルパープローブをさらに含み、ここで前記ヘルパー プローブは、および実質的に類似するこれらの変異体 からなる群より選択される核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項 ２２記載のプローブミックス。 ２６． 前記ヘルパープローブが、 および実質的に類似するこれらの変異体 からなる群より選択される核酸配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項 ２５記載のプローブミックス。 ２７． １０から約１００ヌクレオチド塩基の長さの、高いストリンジェンシー のハイブリダイゼーション条件下でＭ．ｋａｎｓａｓｉｉ核酸標的領域にハイブ リダイズして検出可能な標的−プローブデュープレックスを形成しうるオリゴヌ クレオチドを含む、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉを検出するための核酸ハイブリダイゼ ーションアッセイプローブであって、 前記Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ核酸標的領域は、 からなる群より選択され、 ここで、前記プローブは、前記高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーショ ン条件下で、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ ｉｕｍ ｃｈｅｌｏｎａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ 、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｓｔｒｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｏｒｄｏｎａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｍ、Ｍ ｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔ ｅｒｉｕｍ ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｌｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉ ｍ ｉａｅ、またはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに由来 する核酸と検出可能な標的−プローブデュープレックスを形成しない、 ことを特徴とするプローブ。 ２８． 前記オリゴヌクレオチドが標識されている、請求項２７記載のプローブ 。 ２９． 前記標識がアクリジニウムエステルである、請求項２８記載のプローブ 。 ３０． 前記オリゴヌクレオチドが、１０から約５０塩基を含む、請求項２７記 載のプローブ。 ３１． 前記プローブが、前記Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ核酸標的領域の１つの中の １０個の連続するヌクレオチドの領域に少なくとも８０％相補的な核酸配列を含 む、請求項２７記載のプローブ。 ３２． 前記プローブが、前記標的領域のいずれか１つに少なくとも７５％相補 的であり、かつ、ＧＣＧＣＧＣＧ（配列番号：２８）、ＡＣＧＣＧＵＧ（配列番 号：２９）、ＡＣＧＵＧＣＧ（配列番号：３０）、ＣＧＣＧＣＧＣ（配列番号： ３１）、ＣＡＣＧＣＧＵ（配列番号：３２）およびＣＧＣＡＣＧＵ（配列番号： ３３）からなる群より選択されるヌクレオチドコア配列に完全に相補的な核酸配 列を含む、請求項２７記載のプローブ。 ３３． 請求項２７記載のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で 、請求項２７記載のプローブと、前記Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ核酸標的領域を含む 標的核酸との間に形成される、検出可能な核酸ハイブリッド。 ３４． Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉを検出する方法であって、 （１）少なくとも１つの請求項２７記載のプローブを用意し；そして （２）Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉの存在の指標として前記標的−プローブデュープレ ックスを検出する； の各工程を含む方法。 ３５． 少なくとも１つの請求項２７記載のプローブを含む、Ｍ．ｋａｎｓａｓ ｉｉを検出するためのキット。