JP2000509274A - インビボマーカーを有するトランスジェニック植物のモニタリング - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 異種DNAおよびインビボマーカー遺伝子の植物細胞における発現をコードするDNA構築物について開示する。このようなDNA構築物を含む植物および該植物の製造方法も説明する。さらにトランスジェニック植物から非トランスジェニック植物への導入遺伝子の流出の検出方法およびトランスジェニック植物のモニター法についても開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 インビボマーカーを有するトランスジェニック植物のモニタリング 発明の分野 本発明は、トランスジェニック植物のモニタリング方法、より具体的には導入 遺伝子の非トランスジェニック植物群への逸出のモニタリング方法に関する。 発明の背景 トランスジェニック植物の放出および広範な用途の可能性により、規制の重要 性と集中的な科学的研究が促進されてきた。主要な問題の1つは、導入遺伝子が 自然環境に逸出する可能性、およびその導入遺伝子の逸出の結果である。そのよ うな結果の1つには、同種および同属植物ならびに周囲の植生と比較して、トラ ンスジェニック遺伝子型の侵襲性および競争力が増加する可能性がある。例えば 、世界の多くの地域の農作物に関して、遺伝子が同じ系統の雑草に急速に伝播す るという証拠が増えつつある。北米では、そのような伝播が、クランベリー、ブ ラックベリー、およびポプラのような原産の栽培植物、ならびにコメ、モロコシ 、ヒマワリ、およびカノーラのような同じ系統の野生型植物で観察されている。 除草剤抵抗性のカノーラがカナダとヨーロッパですでに市販されており、カノー ラは同系統の複数の雑草と複雑な交配関係を有するため、カノーラ（主にBrassi ca napus）における導入遺伝子の逸出は、特に問題である。 そのような観察があるため、植物バイオテクノロジーリスク評価研究の主流と しては、導入遺伝子の逸出可能性および該導入遺伝子を含む植物群の結末に着目 してきた。遺伝子の流出という現象は、個々の植物種のリスク評価の第1段階で あるため、研究の大部分はこれに着目してきた。残念ながら、遺伝子の流出を推 定する方法の大部分は、労力と費用がかかるため、実施できる研究の範囲が限ら れる。さらに、既存の研究の大部分が典型的には、中立でない遺伝子（例、除草 剤抵抗性遺伝子）または植物中にすでに存在するマーカー（すなわち、表現型ま たは分子マーカー）の使用を含む。これらのマーカーには、種間で普遍的に同一 ではないという欠点がある。さらに、一旦導入遺伝子がトランスジェニック植物 から周囲の生態系に逸出したら、生態系においてその進行をモニターするための 信頼でき、かつ有効な方法は、現在のところ、存在しない。 生態学的に重要である可能性のある導入遺伝子を含む、遺伝子操作された植物 をモニターするための、実際的で費用効果の高いシステムを開発することが非常 に望ましい。そのようなシステムは、基礎および応用研究における使用、ならび に販売による放出のモニタリングに有用であると考えられる。 発明の概要 本発明のアプローチは、導入遺伝子の逸出およびトランスジェニック植物群か ら野生型植物群への遺伝子の流出をモニターする新規技術を含む。この導入遺伝 子の流出のモニタリングは、1つまたは複数の生態学的に重要な導入遺伝子と、 検出可能なインビボマーカーをコードする第2の導入遺伝子とを連結することに よって、植物細胞中で実施できる。 上記を考慮すると、本発明の第1の局面は、異種DNAおよびインビボマーカー遺 伝子の植物細胞における発現をコードするDNA構築物である。 本発明の第2の局面は、上述のDNA構築物を有する植物の形質転換ベクターであ る。 本発明の第3の局面は、異種DNAおよびインビボマーカー遺伝子をコードし、植 物細胞においてそれらを発現させる異種DNA構築物を含む植物細胞である。 本発明の第4の局面は、上述の形質転換植物細胞を含む組換え植物である。 本発明の第5の局面は、異種DNAとインビボマーカーとを含むトランスジェニッ ク植物細胞を製造する方法である。本方法には、再生能力のある植物細胞を提供 する段階、続いて、異種DNAおよびインビボマーカー遺伝子をコードしこれを植 物細胞において発現させるDNA構築物によって植物細胞を形質転換させる段階が 含まれる。 本発明の第6の局面は、植物中で導入遺伝子の逸出をモニターする方法である 。本方法には、導入遺伝子が検出可能なインビボマーカー遺伝子に連結されてい るトランスジェニック植物を、所定の領域に植え付ける段階、その後、該所定の 領域でトランスジェニック植物を成長させる段階、最後に所定の領域外で成長す る植物において検出可能なインビボマーカーが存在するか否かを検出する段階が 含まれる。 本発明の第7の局面は、トランスジェニック植物から野生型植物への導入遺伝 子 の流出を検出する方法である。本方法には、検出可能なインビボマーカー遺伝子 が機能的に結合されている導入遺伝子を有するトランスジェニック植物を、野生 型の植物と共に同じ領域に植え付ける段階、続いて、トランスジェニック植物と 非トランスジェニック植物とを交配させる段階、最後にトランスジェニック植物 と非トランスジェニック植物との後代においてインビボマーカーが存在するか否 かを検出する段階が含まれる。 本発明の前述およびその他の目的および局面は、以下の詳細な説明、本明細書 の図面、および以下の明細にて説明する。 図面の簡単な説明 図1はトランスジェニック植物と非トランスジェニック植物との混成を生育さ せるための円形デザインの該略図である。 図2はトランスジェニック植物のインビボモニタリングに有用なpGPF/Btバイナ リー発現ベクターの該略図である。この図において、Btはバチルス・チューリン ギエンシス（Bacillus thurgiensis）合成遺伝子cryIAcを意味し、HPHはハイグ ロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を意味し、sGFPは合成緑色蛍光蛋白 質を意味し、35Sはプロモーター配列を示す。制限部位は以下のように表す：B=B amHI；C=ClaI；H=HinDIII；K=KpnI；N=NcoI；P=PstI；S=SalI；X=XhoI。 発明の詳細な説明 上記に要約したように、本発明は、遺伝子操作された植物から、周囲の非トラ ンスジェニック植物への導入遺伝子の逸出を、インビボ遺伝子マーカーを用いて モニターする方法を提供する。 本明細書で用いられる「植物」という用語は、維管束植物を意味し、単子葉植 物および双子葉植物の両方、ならびに裸子植物および被子植物の両方を含む。 本明細書において使用される「機能的に結合された」という用語は、1つのDNA 分子上で片方の機能が他方の機能によって影響されるように結合されたDNA配列 を表す。したがって、転写開始領域が、構造遺伝子の発現に影響を与える能力を 有する（すなわち、構造遺伝子が転写開始領域の転写制御を受ける）場合、該転 写開始領域は該構成遺伝子と機能的に結合している。該転写開始領域は、該構造 遺伝子の「上流」にあると言われ、該構造遺伝子は、該転写開始領域の「下流」 に あると言われる。 本発明のDNA構築物または「発現カセット」は、異種DNAおよびインビボマーカ ー遺伝子の植物細胞における発現をコードする。そのような構築物は、好ましく は転写の5'から3'方向に、転写開始領域、該転写開始領域に機能的に結合された 異種DNA、およびRNAポリメラーゼの終止シグナルとポリアデニル化のためのポリ アデニル化シグナルとを含む終結配列を有する（例、nosターミネーター）。こ れらの領域はすべて、形質転換される細胞中で機能する能力を持たなくてはなら ない。終結領域は、転写開始領域と同じ遺伝子に由来してもよく、異なる遺伝子 に由来してもよい。インビボマーカー遺伝子は、異種DNAの上流または下流（す なわち5'側または3'側）のいずれに位置してもよく、それ自身の調節領域を有す るか、または異種DNAの発現のための調節領域と同じものに機能的に結合されて いてもよい。インビボマーカー遺伝子は、発現される異種DNAと同一のDNA分子上 に位置する。 適当なインビボマーカー遺伝子には、緑色蛍光蛋白質(GFP)、アポエクオリン のような蛍光蛋白質をコードする遺伝子、ならびにその類似体および誘導体が含 まれる。緑色蛍光蛋白質は、クラゲ、エクオレア・ビクトリア（Aequorea victo ria）に由来するものであり、様々な微生物、植物、昆虫、および哺乳類細胞で 発現されている。A．Crameriら、Nature Biotech．14，315-319(1996)。 好ましくはRNAポリメラーゼ結合部位（プロモーター）を含む転写開始領域は 、形質転換される宿主生物の天然のものでも、その領域が宿主内で機能的である ような別の供給源に由来しても構わない。別の供給源には、ノパリン、オクタピ ン、マンノピンの生合成の転写開始領域またはその他のオパイン転写開始領域の ようなアグロバクテリウムT-DNA遺伝子、植物の転写開始領域、ウイルス（宿主 特異的ウイルスを含む）の転写開始領域、または部分的もしくは全体的に合成さ れた転写開始領域が含まれる。転写開始領域および終結領域は周知である。dGre ve，J．Mol．Appl．Genet．1，499-511(1983);Salomonら、EMBO J．3，141-146( 1984);Garfinkelら、Cell 27,143-153(1983);およびBarkerら、Plant Mol.Biol ．2，235-350(1983)参照。 RNAポリメラーゼ結合部位に加え、転写開始領域は、転写を調節する領域を含 み 、調節には、例えば化学的もしくは物理的抑制もしくは誘導（例、代謝産物また は光に基づく調節）、または細胞の分化（植物の葉、根、種などに関する）に基 づく調節が含まれる。したがって、転写開始領域または該領域の調節部分は、そ のような調節を受ける適当な遺伝子から得られる。例えば、1,5-リブロース2リ ン酸カルボキシラーゼ遺伝子は、光に誘導されるため、転写開始に使用できる。 ストレス、温度、創傷、病原体の影響等によって誘導される他の遺伝子も知られ ている。 異種DNAは、構造遺伝子、アンチセンス作用因子、リボザイムなどをコードし ていてもよい。構造遺伝子は、蛋白質、ポリペプチド、またはその一部をコード する遺伝子の一部で、リボゾーム結合部位および/または転写開始コドンを含ん でいてもよいが、転写開始領域を含まない。この用語は、形質転換される細胞内 で天然にも生じる構造遺伝子の導入されたコピーをも意味する。構造遺伝子は、 その遺伝子が導入される細胞中に通常は見られない蛋白質や、機能的に結合され ている転写開始領域と組み合わせて蛋白質をコードする場合もあり、この場合、 異種構造遺伝子と呼ばれる。植物種において発現するために本発明の転写開始領 域に機能的に結合できる遺伝子は、染色体遺伝子、cDNA、合成遺伝子、またはそ の組み合わせに由来するものでありうる。任意の構造遺伝子が使用できる。植物 細胞を形質転換する場合、その構造遺伝子は、グリホスフェート抵抗性のような 所望の形質を導入するための酵素；昆虫抵抗性を付与するバチルス・チューリン ギエンシス（Bacillus thuringiensis）蛋白質（またはその断片）などの蛋白質 ；またはウイルス抵抗性を付与する植物ウイルス蛋白質もしくはその断片を、コ ードしていてもよい。 発現カセットは、少なくとも1つの複製系を有するDNA構築物として提供するこ ともできる。便宜上、ColE1、pSC101、pACYC184などの、大腸菌で機能する複製 系を有することが一般的である。このようにすれば、各操作後の各段階で、得ら れた構築物をクローニングし、配列決定し、操作の正確性を判断することができ る。大腸菌の複製系に加えて、またはその代わりに、例えばpRK290のようなP-1 非適合性プラスミドの複製系のような広宿主範囲の複製系を使用することができ る。複製系に加え、1つまたは複数の宿主で有用な少なくとも1つのマーカー、ま たは 各宿主ごとに異なるマーカーをしばしば存在させる。すなわち、原核生物宿主中 における選択のために1つのマーカーを使用し、真核生物宿主、特に植物宿主中 での選択のために別のマーカーを使用することができる。マーカーは、抗生物質 、毒素、重金属などの生命破壊剤から保護したり；例えば栄養要求性宿主に原栄 養性を付与することによって相補性を提供したり；または新規化合物を製造して 可視的な表現型を提供することができる。使用できる遺伝子の例には、ネオマイ シンホスホトランスフェラーゼ(NPTII)、ハイグロマイシンホスホトランスフェ ラーゼ(HPT)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、ニトリ ラーゼ、およびゲンタマイシン抵抗性遺伝子が含まれる。植物宿主の選択に適切 なマーカーは、インディゴの生産を提供するβグルクロニダーゼ、可視光の生産 を提供するルシフェラーゼ、カナマイシン抵抗性またはG418抵抗性を付与するNP TII、ハイグロマイシン抵抗性を付与するHPT、およびグリホセート（glyphosate ）抵抗性を付与する変異aroA遺伝子が含まれるが、これらに限定されるわけでは ない。 本発明を実施するために使用できるベクターには、アグロバクテリウムベクタ ーが含まれる。数多くのアグロバクテリウムベクターが知られている。例えば、 Andersonの米国特許第4,536,475号、Schliperoortらの来国特許第4,693,977号、 Sederoffらの米国特許第4,886,937号；T．Hallら、欧州特許出願第0122791号；R ．Fraleyら、Proc Natl．Acad．Sci．USA 84，4803(1983)；L．Herrera-Estrell aら、EMBO J 2，987，(1983)；G.Helmerら、Bio/Technology 2，520I(1984)；N ．Muraiら、Science 222，476(1983)を参照のこと。一般に、そのようなベクタ ーには、少なくとも1つの腫瘍誘導性（または「Ti」）プラスミドを有するアグ ロバクテリウム、典型的にはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobact erium tumefaciens）が含まれる。アグロバクテリウムがアグロバクテリウム・ リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）である場合は、このプラスミドは根誘 導性（または「Ri」）プラスミドとしても知られている。Ti（またはRi）プラス ミドは、宿主植物がアグロバクテリウムに感染した時に宿主植物の細胞に伝達さ れる「T-DNA」と呼ばれるDNAを含む。アグロバクテリウムベクター中では、T-DN Aは遺伝子操作技術により、「発現カセット」、または形質転換植物細胞中で発 現させるための対象となる一つもしくは複数の遺伝子およびそれに結合した調節 配列を 含むように修飾される。アグロバクテリウムは、「バイナリー」ベクター系の場 合のように複数のプラスミドを含む場合がある。そのようなアグロバクテリウム ベクターは、外来遺伝子を様々な植物種に導入するのに有用であり、特に双子葉 植物の形質転換に有用である。 本発明のDNA構築物で植物組織を形質転換するために使用できるベクターには 、非アグロバクテリウムベクター、特に射撃ベクター、ならびにDNAを介する形 質転換に適当なベクターも含まれる。 細胞の射撃による形質転換に適当な、本発明のDNA構築物を有する微粒子も、 本発明に係る細胞の形質転換に有用である。その微粒子は、形質転換細胞を作製 するために細胞中に入れられる。形質転換細胞が植物細胞である場合は、当技術 分野で公知の技術にしたがって、形質転換細胞から植物を再生させることができ る。本発明の実施には、任意の適当な射撃細胞形質転換法および装置が使用でき る。装置および手順の例は、Stompら、米国特許第5,112,466号；およびSanford およびWolf、米国特許第4,945,050号に開示されている（本明細書で引用される すべての参照の米国特許の開示は、全体が参照として本明細書に組み入れられる ）。射撃形質転換手順を使用する場合は、形質転換される細胞中で複製すること のできるプラスミド中に発現カセットを組み込むことができる。そのようなシス テムで使用するために適当な微粒子の例として、1〜5μｍの金の球が含まれる。 DNA構築物は、沈殿のような、任意の適当な方法で微粒子に沈着させることがで きる。 当技術分野で周知の方法にしたがって、植物細胞のプロトプラストをDNAを介 して形質転換させ、その後、形質転換されたプロトプラストから植物を再生させ ることにより、本発明のDNA構築物を用いて植物種を形質転換できる。 適当な複製系を制限酵素で切断し、その使用できる部位に特定の構築物または 断片を挿入することにより、種々の構築物、発現カセット、マーカーなどを含む 種々の断片を連続的に導入することができる。連結およびクローニング後、さら なる操作のためにDNA構築物を単離することができる。これらの技術はすべて、 文献に多くの例があるので、Sambrookら、「Molecular Cloning:A Laboratory M anual（分子クローニング：実験室マニュアル）」（第2版、1989）(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)の具体例を参照されたい。 器官発生または胚発生によって後にクローン増殖する能力のある任意の植物組 織を本発明のベクターによって形質転換できる。本明細書で使用される「器官発 生」という用語は、分裂中心から苗条および根が順次発生する過程を意味する； 本明細書で使用される「胚発生」という用語は、体細胞または配偶子から苗条が 協調して（順次ではなく）共に発生する過程を意味する。選択される特定の組織 は、形質転換される特定の種で使用でき、最も適当なクローン増殖系によって異 なる。組織標的の例には、葉片、花粉、胚、子葉、胚軸、大形配偶子、カルス組 織、既存の分裂組織（例、頂端分裂組織、腋芽、および根の分裂組織）、および 誘導した分裂組織（例、子葉の分裂組織および胚軸の分裂組織）が含まれる。 本発明の植物は、種々の形態をとりうる。植物は、形質転換細胞と非形質転換 細胞とのキメラであってもよく、クローン形質転換体（例、すべての細胞が発現 カセットを含むよう形質転換されたもの）であってもよく、形質転換組織と非形 質転換組織とを接ぎ木したもの（例、柑橘類において形質転換していない若枝に 形質転換された根茎を接ぎ木したもの）が含まれうる。形質転換植物は、クロー ン増殖または古典的な育種技術のような種々の方法で増殖できる。例えば、第1 世代(またはT1)の形質転換植物は、同型接合の第2世代（またはT2）形質転換植 物が得られるように自家受粉させ、T2植物を古典的な育種技術によってさらに増 殖させてもよい。育種を補助するために、発現カセットに優性の選択マーカー（ nptIIのような）を結合させてもよい。 本発明の実施に使用できる植物には、タバコ(Nicotiana tabacum)、カノーラ( Brassica spp.)、ジャガイモ(Solanum tuberosum)、大豆(glycine max)、ピーナ ツ(Arachis hypogaea)、綿花(Gossypium hirsutum)、サツマイモ(Ipomoea batat us)、カッサバ(Manihot esculenta)、コーヒー(Cofea spp.)、ココナツ(Cocos N ucifera)、パイナップル(Ananas comosus)、柑橘類の木(Citrus spp.)、ココア( Theobroma cacao)、チャノキ(Camellia sinensis)、バナナ(Musa spp.)、アボカ ド(Persea americana)、イチジク(Ficus casica)、グアバ(Psidium guajava)、 マンゴー(Mangifera indica)、オリーブ(Olea europaea)、パパイヤ(Carica pap aya)、カシュー(Anacardium occidentale)、マカデミア(Macadamia integrifoli a)、アーモンド(Prunus amygdalus)、テンサイ(Beta vulgaris)、トウモロコシ( Ze a mays)、小麦、えん麦、ライ麦、大麦、コメ、野菜、観賞植物、および針葉樹 が含まれる（がこれらに限定されるわけではない）。野菜には、トマト(Lycoper sicon esculentum)、レタス(例、Lactuea sativa)、インゲン(Phaseolus vulgar is)、ライマメ(Phaseolus limensis)、エンドウ(Pisum spp.)ならびにキュウリ( C．sativus)、カンタロープ(C．cantalupensis)およびマスクメロン(C．melo)の ようなキュウリ属に属するものが含まれる。観賞植物には、アゼリア(Rhododend ron spp・)、アジサイ(Macrophylla hydrangea)、ハイビスカス(Hibiscus rosasa nensis）、バラ(Rosa spp.)、チューリップ(Tulipa spp.)、ラッパスイセン(Nar cissus spp.)、ペチュニア(Petunia hybrida)、カーネーション(dianthus caryo phyllus)、ポインセチア(Euphorbia pulcherima)、およびキクが含まれる。本発 明を実施するために使用できる裸子植物には、テーダマツ(Pinus taeda)、ベイ マツ(Pseudotsuga menziesii)のようなマツ；アメリカツガ(Tsuga canadensis) ；ベイトウヒ(Picea glauca)；セコイア(Sequoia sempervirens)などの針葉樹が 含まれる。 さらに本発明は、除草剤、疾病、または害虫に対する抵抗性を付与する遺伝子 のような生態学的に重要な1つまたは複数の導入遺伝子を、緑色蛍光蛋白質(GFP) 遺伝子のようなリアルタイムのインビボマーカーをコードする第2の導入遺伝子 に連結する方法を提供する。本方法は、トランスジェニック花粉ドナー群から非 トランスジェニック受粉植物群への遺伝子の流出（例、トランスジェニック植物 と非トランスジェニック植物の混成した植物群内でのトランスジェニック遺伝子 の逸出）を推定する方法を提供する。導入遺伝子の結末は紫外線または青光線下 でトランスジェニック/非トランスジェニックハイブリッドを目視観察すること によって追跡できる。本発明の1つの態様においては、図1に示すように植物の混 合物を円形デザインに植え付ける。植物の混合物には、1つの種の植物が含まれ るが、好ましくは複数の種の植物が含まれる。この円形デザインでは、トランス ジェニック植物を区画の中央または「中心部（bullseye）」で育成する。非トラ ンスジェニック植物は中心部を取り巻く同心の輪の内部で育成する。植え付け後 、植物を交配させる。交配後、いくつかの植物の種を、輪のサンプリング地点か らのサンプルとする。これらの種を発芽させ、紫外線を用いて蛍光の存在または 非存在 を調べてスコア化する。このスコア結果を用いて、交雑の頻度および率を決定す る。枝分かれ分散分析（例、ANOVA（SAS Institute、ノースカロライナ州ケアリ ー）を用いて、種、距離、および距離の中の位置の間での有意な差を検出する。 本発明の特に好ましい態様においては、上述の遺伝子の流出の推定方法を用い て、選択された遺伝子操作を受けた作物種と、トランスジェニック作物種と生殖 上適合する雑草種との間の遺伝子の伝達をモニターする。作物種およびそれに対 応する雑草種の部分的リストを以下の表1に記載する。 表1：作物種およびそれに生殖上適合する雑草種の部分的リスト 以下の実施例は、本発明を説明するために記載したものであり、本発明を制限 するものと解釈すべきではない。 実施例1 紫外線下で緑色の蛍光を発するトランスジェニックタバコを作製した。CaMV35 Sプロモーターの制御下のクラゲ、エクオリア・ビクトリア（Aequoria victoria ）由来のGFP遺伝子の変異型およびカナマイシン選択マーカーを有するプラスミ ドmGFP4（英国Jim Haseloffからの寄贈物）をタバコ(Nicotiana tabacum cv．Xa nthi)に組み込んだ。方法は、効率のよいアグロバクテリウム・ツメファシエン ス（Agrobacterium tumefaciens）による葉片の形質転換の後、カナマイシンに よる選択、およびインビトロ器官形成(Schardlら、Gene 61，1-11，1987)の誘導 である。すべての形質転換には、アグロバクテリウムGV3850株を使用した。 25のトランスジェニック系統のうち、紫外線下で植物全体が蛍光を発するもの が2つ回収された。これらの2つの植物を、暗室で、ほぼ同じサイズの他のトラン スジェニックタバコ植物群の中に無作為に植え付けた。異なる時点で、携帯用UV ライト（365nm、UVPモデル100AP、カリフォルニア州アップランド）を用いて3人 がそれそれ赤色蛍光を発する非トランスジェニック植物から、緑色の蛍光を発す るトランスジェニック植物を正しく識別することができた。 実施例2 この実験では、GFPマーカーが、この場合は害虫抵抗性である別の形質に連結 されたトランスジェニック植物を作製した。図2に構造を示すように、改良され たGFP遺伝子、sGFP（ハーバード大学Jen Sheen氏からの寄贈物）をバチルス・チ ューリンギエンシス合成導入遺伝子(Bt cryIAc)に連結した。Bt cryIAcはオオタ バコガ(Helicoverpa zea)の幼虫のような鱗翅目の昆虫を殺す殺虫性エンドトキ シン蛋白質をコードする。タバコは実施例1に説明した方法を用いて形質転換し 、カノーラはA．Mehra-Paltaら、Rapeseed in a Changing World:GCIRC Congres s 1108-1115(Saskatoon，Canada 1991)に説明される手順を用いて形質転換した 。トランスジェニック系統は、蛍光および高レベルのBt cryIAc発現の両方で選 択した。 この2つの遺伝子が連結し、機能的に共に作用することが示される。各作物の 、両方の遺伝子を含む（例えばStewartら、1996のような慣習的な分子法を用い て確認した）20のトランスジェニック植物と、20の非トランスジェニック植物と を圃場に植え付けた。植物の半分（トランスジェニックおよび非トランスジェニ ックの両方）を、オオタバコガ（Helicoverpa zea）の卵50個を各植物上に置く ことにより昆虫に暴露した。残りの植物は、昆虫に暴露しなかった。卵の孵化を モニターした。1週間後、昆虫の数を調べ、植物の落葉を目視観察によって評価 した。同 時に、昆虫に暴露したものとしなかったもの両方のすべての植物を、夜間に携帯 用UVライトで観察した。植物を、GFP陽性および陰性についてスコア化して、そ の評価を落葉度と比較した。この2つの変数の間には有意な正の相関があり、こ れは圃場において両方の遺伝子が連結し、機能していることを示す。 前述の実施例は、本発明を説明するために示したものであり、本発明を制限す るものと解釈すべきではない。本発明は以下の請求の範囲によって定義されるも のであり、請求の範囲の同義語は本発明に含まれる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1．異種DNAおよびインビボマーカー遺伝子の植物細胞における発現をコードす るDNA構築物。 2．異種DNAが昆虫抵抗性バチルス・チューリンギエンシス蛋白質をコードする 、請求項1記載のDNA構築物。 3．インビボマーカー遺伝子が蛍光蛋白質をコードしている、請求項1記載のDN A構築物。 4．異種DNAおよびインビボマーカー遺伝子の植物細胞における発現をコードす るDNA構築物を有する植物形質転換ベクター。 5．アグロバクテリウムベクターである、請求項4記載の植物形質転換ベクター 。 6．微粒子である、請求項4記載の植物形質転換ベクター。 7．異種DNAとインビボマーカー遺伝子とをコードしており植物細胞においてそ れらを発現するような異種DNA構築物を含む植物細胞。 8．双子葉植物細胞である、請求項7記載の植物細胞。 9．単子葉植物細胞である、請求項7記載の植物細胞。 10．異種DNAとインビボマーカー遺伝子とをコードしており植物細胞において それらを発現するような異種DNA構築物を含む形質転換植物細胞を有する組換え 植物。 11．単子葉植物である、請求項10記載の組換え植物。 12．双子葉植物である、請求項10記載の組換え植物。 13．植物が、タバコ、ジャガイモ、大豆、ピーナツ、綿花、および野菜作物か らなる群より選択される双子葉植物である、請求項9記載の組換え植物。 14．植物がカノーラ（canola）である、請求項10記載の組換え植物。 15．再生能力のある植物細胞を提供する段階、および 異種DNAとインビボマーカー遺伝子とをコードしており該植物細胞において発 現するようなDNA構築物によって該植物細胞を形質転換させる段階 を含む、トランスジェニック植物細胞の製造方法。 16．形質転換段階が、DNA構築物を該植物細胞に伝達するアグロバクテリウム ベ クターに該植物細胞を感染させることによって実行される、請求項15記載の方法 。 17.形質転換段階が、発現カセットを有する微粒子を植物細胞に撃ち込むこと によって実施される、請求項15記載の方法。 18．植物細胞が再生能力を有する植物組織中に存在する、請求項15記載の方法 。 19．形質転換植物細胞から苗条を再生させる段階をさらに含む、請求項15記載 の方法。 20．形質転換植物細胞から根を再生させる段階をさらに含む、請求項16記載の 方法。 21．形質転換植物細胞から植物体を再生させる段階をさらに含む、請求項16記 載の方法。 22．植物細胞が単子葉植物細胞である、請求項16記載の方法。 23．植物細胞が双子葉植物細胞である、請求項16記載の方法。 24．（a）導入遺伝子が検出可能なインビボマーカー遺伝子に連結されている トランスジェニック植物を所定の領域に植え付ける段階、 （b）該所定領域で該トランスジェニック植物を成長させる段階、および （c）該所定領域の外側または該所定領域の内側で成長する植物において、検 出可能なインビボマーカー遺伝子の有無を異なる時期に検出する段階 を含む、植物中の導入遺伝子の逸出をモニターする方法。 25．所定領域が農業圃場である、請求項25記載の方法。 26．インビボマーカー遺伝子が蛍光蛋白質をコードしている、請求項25記載の 方法。 27．インビボマーカー遺伝子が緑色蛍光蛋白質をコードしている、請求項26記 載の方法。 28．導入遺伝子が昆虫抵抗性をコードしている、請求項25記載の方法。 29．（a）その導入遺伝子が検出可能なインビボマーカー遺伝子に機能的に結 合しているトランスジェニック植物を、野生型植物と共に共通の区域に植え付け る段階、 （b）該トランスジェニック植物と非トランスジェニック植物とを交配させる 段階、および （c）該トランスジェニック植物と非トランスジェニック植物との子孫におい てインビボマーカーの有無を検出する段階 を含む、トランスジェニック植物から野生型植物への導入遺伝子の流出を検出す る方法。 30．インビボマーカー遺伝子が蛍光蛋白質をコードしている、請求項30記載の 方法。 31．インビボマーカー遺伝子が緑色蛍光蛋白質をコードしている、請求項30記 載の方法。 32．導入遺伝子が昆虫抵抗性コードしている、請求項30記載の方法。 33．トランスジェニック植物および野生型植物に複数の種が含まれる、請求項 30記載の方法。 34．トランスジェニック植物がタバコまたはカノーラである、請求項30記載の 方法。 35．植え付ける段階が、野生型植物をトランスジェニック植物と共に共通の区 域に植え付ける段階を含む、請求項30記載の方法。