JP2000506128A - 抗病原性ペプチドおよびこれらを含む組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 正味の正電荷を有し、αらせん立体配置がないかまたは部分的にのみ有するペプチドは、非溶血性の選択的細胞溶解活性を有することが見い出された。このペプチドは、パーダキシンやメリチンのような天然ペプチドおよびその断片（ここで、Ｌ−アミノ酸残基は、対応するＤ−アミノ酸残基により置換される）、および前記の環状誘導体から誘導されるか、または種々の比の少なくとも１つの正に荷電したアミノ酸と少なくとも１つの疎水性アミノ酸からなる線状ペプチドのジアステレオマーである（ここで、少なくとも１つのアミノ酸残基は、Ｄ−アミノ酸であり、そして好ましくは配列の少なくとも３分の１は、Ｄ−アミノ酸残基からなる）。非溶血性細胞溶解性ペプチドを含んでなる薬剤組成物は、細菌性、真菌性、ウイルス性、マイコプラズマ性および原生動物性感染症を含む、病原体により引き起こされる幾つかの疾患の治療のため、および癌の治療のために使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 抗病原性ペプチドおよびこれらを含む組成物 発明の分野 本発明は、新規な非溶血性細胞溶解性ペプチド、これらを含む組成物、および 疾患または障害の治療および農業におけるこれらの使用に関する。 発明の背景 以下の本文において、先行技術資料が参照されるが、その完全な詳細は、請求 の範囲の前の明細書の最後の「引用文献」の項に見いだすことができる。 利用可能な抗微生物薬に対する微生物の耐性の増大により、代替抗微生物化合 物の開発に多くの研究が集中することになった。 高度に特異的な細胞介在性免疫応答に加えて、またはこれと相補的に、脊椎動 物および他の生物は、別個の群の広域スペクトル細胞溶解性（例えば、抗菌性） ペプチドから構成される防御系を有する。 細胞溶解素としても知られている、このような細胞溶解性ペプチドの脂質−ペ プチド相互作用に関する研究では、その細胞溶解活性に対する両親媒性αらせん 構造の重要性を強調しがちである。この結論は主として、哺乳動物細胞または細 菌単独のいずれか、または両方の型の細胞に対して作用する細胞溶解素による研 究に基づいている。このファミリーの細胞溶解性ペプチドの主要な群は、宿主防 御の短い線状ペプチド（≦４０アミノ酸）であり、これらにはジスルフィド架橋 が全くない（ボーマン（Boman）、１９９５）。これらのペプチドでは、鎖の長 さ、疎水性および電荷の全体的な分布は、相当に多様であるが、脂質二重層と会 合した共通構造、すなわち、両親媒性αらせん構造を共有している（セグレスト （Segrest）ら、１９９０）。 既知の細胞溶解素の例としては、（ｉ）細菌のみに細胞溶解性である抗菌性ペ プチド、例えば、アカスジシンジュサン（cecropia moth）から単離されたケク ロピン（cecropins）（スタイナー（Steiner）ら、１９８１）、カエルの皮膚か ら単離されたマゲイニン（magainins）（ザスロフ（Zasloff）、１９８７） およびダーマセプチン（dermaseptins）（モーア（Mor）ら、１９９１）；（ii ）黄色ブドウ状球菌（Staphylococcus aureus）から単離されたδ−溶血素（ド ープル（Dhople）とナガラジ（Nagaraj）、１９９３）；および（iii）哺乳動物 細胞と細菌の両方を溶解する、ハチ毒のメリチン（ハーバーマン（Habermann） とジェンシュ（Jentsch）、１９６７）および神経毒のパーダキシン（pardaxin ）（シャイ（Shai）ら、１９８８）のような、細胞選択的でない細胞溶解素を含 む。 抗菌性ペプチドは、最初に無脊椎動物において、そして次にヒトを含む脊椎動 物において発見された。相補的または追加的な防御系として、この二次的な化学 的免疫系は、誘導により迅速に合成されるあるレパートリーの小さいペプチドを 生物に供給するが、このペプチドは、時折の偏性病原体による侵入に対して、さ らには片利共生微生物の抑制されない増殖に対して作用する（ボーマン （Boman）、１９９５）。これまで、１００を超える異なる抗菌性ペプチドが単 離され性状解析されている。最も大きなファミリー、そして恐らく最も研究され ているファミリーは、正に荷電し、かつ両親媒性αらせん構造を採っているペプ チドを含む。種々の未変性抗菌性ペプチドで行われた多くの研究は、細胞溶解活 性に関して、両親媒性αらせん構造および正味の正電荷の重要性を強調しがちで ある。正電荷は、正常真核細胞に比較して病原性細胞膜に高濃度で見い出される 負に荷電した膜とのペプチドの相互作用を促進し（アンドルー（Andreu）ら、１ ９８５）、そして両親媒性αらせん構造は、溶解活性に必須である（チェン （Chen）ら、１９８８）。このような相互作用は、エネルギー変換膜の透過性を 増大させることにより、標的生物のエネルギー代謝を破壊すると唱えられている （オカダ（Okada）とナトリ（Natori）、１９８４）。これらの両親媒性構造の ため、これらの抗菌性ペプチドは、「樽−樽板（barrel-stave）」機構によりイ オンチャネル／孔を形成することにより、膜を透過することが示唆されている （リッツォ（Rizzo）ら、１９８７）。このモデルにより、膜貫通型両親媒性α らせんは、外向きの疎水性表面が膜の脂質成分と相互作用し、同時に内側に面し た親水性表面が孔を生成する束を形成する。あるいは、ペプチドは、膜の表面に 平行に結合し、「カーペット」様に膜の表面を覆って界面活性剤のように膜を溶 解する（シャイ（Shai）、１９９５）。 広範な研究にもかかわらず、短い線状非細胞選択性ペプチド（例えば、パーダ キシンおよびメリチン）の作用の正確な様式は、未だ知られておらず、そして同 様な構造的特徴が、啼乳動物細胞および細菌に対するその細胞毒性に必要である かどうかは明白でない。 パーダキシン（３３量体ペプチド）は、紅海モーセソール（Red Sea Moses Sole）のパーダキルス・マーモラツス（Pardachirus marmoratus）（シャイ （Shai）ら、１９８８）および西太平洋の孔雀ソール（Peacock Sole）のパーダ キルス・パヴォニヌス（Pardachirus pavoninus）（トンプソン（Thompson）ら 、１９８６）から精製された興奮性神経毒である。パーダキシンは、その濃度に 応じて種々の生物学的活性を有する（シャイ（Shai）の総説、１９９４）。１０^-7 Ｍ未満の濃度では、パーダキシンは、カルシウム依存的に神経伝達物質の放出 を誘導する。１０^-7Ｍ〜1０^-5Ｍのより高い濃度では、このプロセスはカルシウ ム非依存性であり、１０^-5Ｍ以上で細胞溶解が誘導される。パーダキシンはまた 、インビトロで種々の生理学的調製物の活性に影響を及ぼす。その生物学的役割 は、上皮の浸透度調節系のイオン輸送の妨害、および電位差依存的でわずかにカ チオンに選択的なイオンチャネルを形成することによるシナプス前活性にある。 その構造および種々の生物物理学的研究に基づき、膜へのパーダキシンの挿入に 関する「樽−樽板」機構が提案された（シャイ（Shai）の総説、１９９４）。パ ーダキシンは、らせん−ヒンジ−らせん構造を有する：Ｎ−らせんは残基１〜１ １を含み、そしてＣ−らせんは残基１４〜２６を含む。このらせんは、１３位に 位置するプロリン残基により分離している。この構造モチーフは、細菌に対して 特異的に作用しうる抗菌性ペプチド（例えば、ケクロピン）、および種々の細胞 を溶解しうる細胞毒性ペプチド（例えば、メリチン）の両方において見い出され ている。 メリチン（２６量体両親媒性ペプチド）は、ミツバチのアピス・メリフェラ （Apis mellifera）の毒の主要な成分であり（ハーバーマン（Habermann）とジ ェンシュ（Jentsch）、１９６７）、そして最も研究された膜要求ペプチドの１ つである（デンプセイ（Dempsey）、１９９０）。メリチンは、哺乳動物細胞に とって非常に細胞毒性であるが、同時に非常に強力な抗菌性物質である（スタイ ナー（Steiner）ら、１９８１）。メリチン誘導性溶血の分子機構を理解するた め、および膜タンパク質の構造およびリン脂質膜とのこのようなタンパク質の相 互作用の一般特性を研究するためのモデルとして、膜とのメリチンの相互作用の 性質を決定するための多くの研究が行われてきた。目下の記述された証拠の多く は、メリチンの異なる作用には異なる分子機構が根底にあることを示している。 それにもかかわらず、両親媒性αらせん構造は、その種々の活性の必要条件であ ることが証明されている（ペレス（Perez）ら、１９９４）。 メリチンの構造は、種々の方法を用いて調査されている。Ｘ線結晶学およびメ タノール溶液中のＮＭＲの結果は、この分子が、１２０°の角度で交差する２つ のαらせんセグメント（残基１〜１０および１３〜２６）からなることを示して いる。これらのセグメントは、ヒンジ（１１〜１２）により結合して、親水性側 と疎水性側が反対方向に向かっている屈曲αらせんロッドを形成する。４つのこ のようなモノマーのメリチン分子が、疎水性相互作用により集合して、四量体を 形成している（アンダーソン（Anderson）ら、１９８０；バッゾ（Bazzo）ら、 １９８８；ターウィリガー（Terwilliger）とアイセンバーグ（Eisenberg）、１ ９８２；ターウィリガー（Terwilliger）とアイセンバーグ（Eisenberg）、１９ ８２）。膜表面との最初の相互作用により、四量体がモノマーに解離し、これら は、膜への挿入前にはαらせんコンホメーションを保持していることが見い出さ れた（オルテンバッハ（Altenbach）とハッベル（Hubbell）、１９８８）。 メリチンは、パーダキシンとの幾つかの類似点を共有する。パーダキシンもメ リチンも、間にプロリンヒンジを有する２つのらせんからなっている。さらには 、これらは、そのＮ−らせんに著しい相同性を示しており、そこは大部分疎水性 である（トンプソン（Thompson）ら、１９８６）。しかしパーダキシン（正味電 荷＋１）は、−２の電荷を有するそのＣ末端側に、さらに７個のアミノ酸残基を 含有するが、一方メリチン（正味電荷＋６）は、アミド基で終わり、かつ正に荷 電したテトラペプチド配列Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇを含有する。パーダ キシンとメリチンの間には幾つかの機能的な相違がある。パーダキシンは、双性 イオン性リン脂質と負に荷電したリン脂質の両方に同様に結合する（ラパポート （Rapaport）とシャイ（Shai）、１９９１）が、一方メリチンは、双性イオン性 リン脂質よりも負に荷電したリン脂質に良好に結合する（バテンバーグ （Batenburg）ら、１９８７；バテンバーグ（Batenburg）ら、１９８７）。また 、パーダキシンは、正の協同性でリン脂質に結合する（ラパポート（Rapaport） とシャイ（Shai）、１９９１）が、一方メリチンは、負の協同性で結合する（バ テンバーグ（Batenburg）ら、１９８７；バテンバーグ（Batenburg）ら、１９８ ７）。パーダキシンもメリチンもグラム陽性細菌とグラム陰性細菌に対する強力 な抗菌性ペプチドであるが、パーダキシンは、ヒト赤血球に対してメリチンより も４０〜１００倍溶血性が弱い（オレン（Oren）とシャイ（Shai）、１９９６） 。 Ｌ−置換からＤ−置換にしたパーダキシンの類似体は、ヒト赤血球を溶解しう ることが証明された（ポウニー（Pouny）とシャイ（Shai）、１９９２）。後に なって（以下に報告される結果を参照のこと）、ポウニー（Pouny）とシャイ （Shai）、１９９２に開示されたペプチドの２つ、すなわち、Ｄ−Ｐｒｏ⁷−パ ーダキシンとＤ−Ｌｅｕ¹⁸Ｌｅｕ¹⁹-パーダキシンは、溶血性ではあったが、抗 菌活性が非常に低いことが証明された。Ｌ−置換からＤ−置換にしたマゲイニン の類似体もまた、抗菌活性が欠けていることが発見された（チェン（Chen）ら、 １９８８）。 用語解説 以下において、本文を能率的に読むため、および本発明のよりよい理解を促進 するために、造り出された幾つかの用語を使用する。しかし、これらの用語の完 全な理解のためには、以下の完全な説明を時々参照すべきであることに注意され たい。本明細書におけるこれらの用語とその意味は以下の通りである： 本明細書で使用される「異種ペプチド」とは、Ｄ−およびＬ−アミノ酸残基の 両方を含むペプチドを意味する。 本明細書で使用される「同種ペプチド」とは、自然のＬ−アミノ酸残基のみ、 またはＤ−アミノ酸残基のみのいずれかを含むペプチドを意味する。 本明細書で使用される「同種Ｌ−ペプチド」および「同種Ｄ−ペプチド」とは 、それぞれ専ら、Ｌ−アミノ酸残基またはＤ−アミノ酸残基のいずれかからなる 同種ポリペプチドを意味する。 本明細書で使用される「異種Ｌベースのペプチド」および「異種Ｄベースのペ プチド」とは、それぞれ、主としてＬ−アミノ酸残基を含む異種ペプチド（例え ば、１つまたはそれ以上のＬ−アミノ酸残基が、対のＤ−エナンチオマーにより 置換されている同種Ｌ−ペプチドから誘導されたペプチド）、および１つまたは それ以上のＤ−アミノ酸残基が、対のＬ−エナンチオマーにより置換されている Ｄ−アミノ酸残基を主として含む異種ペプチドを意味する。 本明細書で使用される「らせんペプチド」とは、その長さの大部分にわたって 連続したαらせんストレッチを有するペプチドを意味する。らせんペプチドのら せん部分は、専らＬ−アミノ酸残基またはＤ−アミノ酸残基のいずれかから構成 される。 本明細書で使用される「非らせんペプチド」とは、αらせん構造がないか、ま たはその長さに沿って分散している非連続的αらせん構造を有するペプチドを意 味する。本発明の非らせんペプチドには、αらせんストレッチがあってもよく、 それが末端にある場合には細胞の膜の半幅より短い長さ、例えば、約１０〜１５ 未満のアミノ酸残基を有し、そして非末端αらせんであるならば、細胞の膜の全 幅より短い長さ、例えば、約２０〜２５未満のアミノ酸残基を有する。非らせん ペプチドは、αらせん破壊部分（以下を参照のこと）を有する同種ペプチドであ っても、または異種ペプチドであってもよい。 本明細書で使用される「αらせん破壊部分」とは、αらせん構造中に挿入され るとその連続性を中断する部分を意味する。このような部分は、例えば、アミノ 酸残基のプロリンまたはグリシン、α−メチル置換α−アミノ酸、環状および非 環状の両方の非αアミノ酸（例えば、６−アミノ−ヘキサン酸、３−アミノ−１ −シクロヘキサン酸、４−アミノ−１−シクロヘキサン酸）であっても、または 反対のエナンチオマーのアミノ酸残基のストレッチからなるαらせんストレッチ に挿入されたＬ−またはＤ−エナンチオマーであってもよい。 本明細書で使用される「病原性細胞」とは、癌細胞および細菌、真菌、原生動 物、ウイルスおよびマイコプラズマのような病原性生物、さらには寄生原生動物 （例えば、リーシュマニア（Leishmania）およびマラリア原虫（Plasmodium）） のような病原性生物に感染した哺乳動物細胞を含む、体内では自然に存在しない 細胞を意味する。 本明細書で使用される「選択的細胞溶解活性」とは、病原性細胞の細胞溶解の 誘導におけるある物質の活性を意味し、この選択性は、この物質が、赤血球のよ うな正常非病原性細胞の細胞溶解に必要な濃度よりもはるかに低濃度で病原性細 胞の細胞溶解を誘導することにより表される。 本明細書で使用される「非溶血性」とは、病原性細胞（例えば、微生物細胞、 癌細胞など）のような他の細胞の細胞溶解を引き起こすのに必要な濃度よりも、 はるかに高濃度で赤血球の溶血を引き起こす物質を意味する。 「ジアステレオマー」は、本明細書では「異種ペプチド」の同義語として使用 される。 発明の要約 本発明は、αらせん立体配置をもたないか、または部分的にのみ有するある種 の異種Ｌベースのペプチドが、非溶血性の選択的細胞溶解活性を有するという驚 くべき知見に基づく。この知見は、細胞内のペプチド誘導性細胞溶解が、両親媒 性ペプチドのαらせん立体配置に依存するという優勢な概念から見れば驚くべき ものである。 したがって本発明により、ペプチドが少なくともある種の細胞（例えば、微生 物）に対して細胞溶解活性を及ぼすのに、αらせん構造は必須でないことが了解 されることになった。αらせん構造は、哺乳動物細胞の溶解に必要であるが、抗 菌活性には必要でない。 したがって本発明は、 （ａ）病原性細胞（体内では自然に存在せず、かつ病原性生物および悪性細胞を 含む細胞）に対する細胞溶解活性を有すること；および （ｂ）非溶血性であること、すなわち、赤血球に対する細胞溶解作用がないか、 または病原性細胞に対して該細胞溶解活性を表す濃度よりも実質的に高い濃度で 赤血球に対する細胞溶解作用を有すること、 により表される選択的細胞溶解活性を有するペプチドを提供する。 １つの実施態様において、本発明は以下： （ａ）非選択的細胞溶解性天然ペプチドから誘導され、 （ａａ）Ｌ−アミノ酸残基とＤ−アミノ酸残基の両方を含むペプチド、また は （ａｂ）Ｌ−アミノ酸残基とＤ−アミノ酸残基の１つまたは両方を含み、か つαらせん破壊部分を含むペプチド であること； （ｂ）このペプチドが、＋１より大きな正味の正電荷を有すること；および （ｃ）このペプチドが、両親媒性であること、 という特徴を有する非溶血性細胞溶解性ペプチドを提供する。 非選択的細胞溶解性天然ペプチドは、例えば、パーダキシン、メリチンまたは これらの断片であり、そしてその正味の正電荷は、元のアミノ酸組成、遊離カル ボキシル基の中和、および／または正に荷電したアミノ酸残基または正に荷電し た化学基の付加による。 別の実施態様において、本発明は以下： （ａ）種々の比の、少なくとも１つの疎水性アミノ酸と少なくとも１つの正に荷 電したアミノ酸よりなり、そしてその配列において、少なくとも１つのアミノ酸 残基が、Ｄ−アミノ酸である、非天然合成ペプチドであること； （ｂ）このペプチドが、＋１より大きな正味の正電荷を有すること；および （ｃ）正に荷電したアミノ酸に対する疎水性アミノ酸の比は、このペプチドが病 原性細胞に対して細胞溶解性ではあるが、赤血球の細胞溶解は引き起こさないよ うな比であること、 という特徴を有する非溶血性細胞溶解性ペプチドを提供する。 正に荷電したアミノ酸の例は、リジン、アルギニンおよびヒスチジンであり、 疎水性アミノ酸の例は、ロイシン、イソロイシン、グリシン、アラニン、バリン 、フェニルアラニン、プロリン、チロシンおよびトリプトファンである。正味の 正電荷は、アミノ酸組成によるが、正に荷電した化学基の付加も考慮することが できる。加えて、セリン、トレオニン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン およびシステインのような極性アミノ酸を付加して、分子の疎水性および／また は毒性を低下させることができる。１つの好ましい実施態様において、このペプ チドは、ロイシン、アラニンまたはバリンのような１つの疎水性アミノ酸、およ び リジンまたはアルギニンのような１つの正に荷電したアミノ酸からなる。 この合成ペプチドは、少なくとも６個、特に１０個またはそれ以上のアミノ酸 残基を有する。１つの好ましい実施態様において、この合成ジアステレオマーは 、ロイシン、アラニンまたはバリンおよびリジンからなる１２量体ペプチドであ り、配列の少なくとも３分の１は、Ｄ−アミノ酸よりなる。 さらに別の実施態様において、本発明の非溶血性細胞溶解性ペプチドは、非選 択的細胞溶解性天然ペプチドから誘導されたペプチド、または上述の非天然合成 ペプチド、またはその断片の環状ジアステレオマーである。これらの環状ジアス テレオマーは、従来からのペプチドの環化法により得られる。１つの実施態様に おいて、この環状ジアステレオマーは、Ｎ末端に１〜３個のＬｙｓ残基が付加さ れ、かつ環化のためにＮ末端とＣ末端の両方にシステイン残基が付加された、パ ーダキシンの断片１〜２２から誘導される。 また別の実施態様において、本発明は、例えば、各ペプチドに共有結合したリ ンカーまたは「鋳型」分子の使用により、複合したか、または「束になった」、 本発明の複数の非溶血性細胞溶解性の２つまたはそれ以上の非溶血性細胞溶解性 ペプチドを提供する。この束は、２つまたはそれ以上、好ましくは５つの、同じ ペプチドまたは異なるペプチドの分子よりなる。リンカー／鋳型は、本発明のペ プチドまたは通常使用されるリンカー、例えば、ＯＨ、ＳＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨ₂ 、ＣＨ₂Ｂｒのような活性基を有する、ポリエステル、ポリアミド、ポリペプチ ド、ポリアミノ酸（例えば、ポリリジン）のようなポリマーであってよい。 さらに別の実施態様において、本発明は、各１当量の目的の疎水性アミノ酸、 正に荷電したアミノ酸およびＤ−アミノ酸よりなる混合物を、ペプチド合成のた めの固相法の各カップリング工程で加えることにより得られる、本発明の親水性 ジアステレオマーの非溶血性細胞溶解性混合物を提供する。こうして、リジン、 ロイシンおよびＤ−ロイシンの混合物で３¹²個の異なるペプチドの混合物が得ら れ、そして親水性混合物は、ＨＦ切断、水による抽出および凍結乾燥後ここから 得られた。 さらなる実施態様において、本発明は、異なる比の疎水性アミノ酸、正に荷電 したアミノ酸およびＤ−アミノ酸（例えば、Ｌｙｓ：Ｌｅｕ：Ｄ−Ｌｅｕの１： １：１、２：１：１および３：１：１（モル）コポリマー）からなる非溶血性細 胞溶解性ランダムコポリマーを提供する。 好ましくは、本発明の非溶血性細胞溶解性ペプチドは、αらせん構造がないか 、または細胞膜の幅にまたがるには長さが不足のαらせん構造を有するかのいず れかである。したがって本発明のペプチドは、膜貫通孔の一部を形成することが できる長さの、全Ｄ−または全Ｌ−アミノ酸残基の連続したストレッチを含有し ない。このような長さは、典型的には約２０〜２２個のアミノ酸（ストレッチが 、ペプチドの非末端部分にある場合）、および約半分、すなわち、１０〜１１個 のアミノ酸（ストレッチが、ペプチドの末端にある場合）である（このような場 合に、２つのペプチドはその末端どうしを連結して、細胞膜にまたがることがで きるためである）。 Ｄ−またはＬ−アミノ酸残基のストレッチの中断は、反対のエナンチオマーの アミノ酸によるストレッチ中の１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換により、ま たは連続するストレッチにプロリン、グリシン、α−メチル−α−アミノ酸また は非α−アミノ酸のようなαらせん破壊部分を入れることにより行われる。 本発明のペプチドは、＋１より大きな正味の正電荷を有する。正味の正電荷は 、本発明の元のアミノ酸組成、遊離ＣＯＯＨ基の中和（例えば、アミド化による ）によるか、または正に荷電したアミノ酸または化学基の付加によることもある 。選択的細胞溶解活性は、正味の正電荷を増大させる（例えば、分子の任意の位 置に、正に荷電したアミノ酸および／または正に荷電した基を付加する）ことに より時には増強しうることが見い出された。例えば、ポリアミン基、アルキルア ミノ基またはアミノアルキルアミノ基などは、その末端の一方に、典型的にはそ のカルボキシル末端に付加できる。好ましいこのような基は、アミノエチルアミ ノ基−ＮＨ−ＣＨ₂−ＮＨ₂（以降「ＴＡ」と称する）である。 非選択的細胞溶解性天然ペプチド（例えば、パーダキシンおよびメリチン）か ら誘導される本発明のペプチドは、両親媒性であり、このことは、これらが主に 疎水性アミノ酸残基からなる一方の表面と、主に親水性アミノ酸残基からなる反 対の表面を有することを意味している。本発明の範囲に入るペプチドの両親媒性 は、当該分野で公知の方法により立証することができる。このような方法の一例 は、シッファー（Shiffer）とエドモンドソン（Edmondson）の輪投影法 （wheel projection）（ここで、配列内の各アミノ酸がその隣接するアミノ酸残 基から１００°の角度で転置される（一周当たり３．６アミノ酸）ように、その 配列にしたがい円形にアミノ酸残基を書く）の使用である。多くの親水性のアミ ノ酸がその輪の一方の側に集中し、かつ疎水性アミノ酸がその輪の反対側に集中 すると、このペプチドは両親媒性であると考えられる。 非選択的細胞溶解性天然ペプチドから誘導されていない本発明のペプチド（例 えば、疎水性アミノ酸、正に荷電したアミノ酸およびＤ−アミノ酸からなる合成 ジアステレオマー）は、両親媒性ではない。これらは、＋１より大きな正味の正 電荷を有し、かつ生じるペプチドが病原性細胞には細胞溶解性であるが溶血性で はないような、正に荷電したアミノ酸に対する疎水性アミノ酸の適切な比を有す る。これらのペプチドは、本明細書に記載される抗菌性および溶血性試験を使用 して、本発明により非常に容易にスクリーニングすることができる。１つの実施 態様において、ロイシンとリジンからなるペプチドでは、適切なＬｅｕ：Ｌｙｓ 比は、６アミノ酸残基のジアステレオマーについては６４％：３６％であり、そ して１２アミノ酸残基のジアステレオマーについては６６％：３４％であろう。 理論に束縛されるわけではないが、しかし細胞溶解活性は、膜の表面上での多 くのペプチドの凝集の結果であり、そしてこのようなペプチドと共に細胞膜の障 害を引き起こすと考えられる。したがって、上述のように、本発明では、例えば 、各ペプチドに共有結合したリンカー分子の使用により、複合した（または束に なった）本発明の複数のペプチドを使用することもまた企図される。 本発明の個々のペプチドは、典型的には少なくとも６個、好ましくは１０個ま たはそれ以上のアミノ酸残基からなる。本発明の複合体では、各個別のペプチド は、典型的には５個以上のアミノ酸残基の長さを有する。 好ましい実施態様により、非溶血性細胞溶解性ペプチドは、病原性細胞に対す る選択的細胞溶解活性（この選択性は、ペプチドが、溶血、すなわち、赤血球の 細胞溶解を誘導する濃度よりもはるかに低濃度で病原性細胞の細胞溶解を誘導す ることに表される）を有する、Ｄ−およびＬ−アミノ酸残基の両方を含む異種ペ プチド、すなわち、ジアステレオマーである。 本発明はまた、活性物質として本発明の非溶血性細胞溶解性ペプチド、および 薬剤学的に許容しうる担体を含む薬剤組成物を提供する。本組成物は、グラム陽 性細菌およびグラム陰性細菌、ウイルス、真菌、マイコプラズマ、および寄生原 生動物（例えば、リーシュマニア症を引き起こすリーシュマニア（Leishmania） およびマラリアを引き起こすマラリア原虫（Plasmodium））のような異なる病原 性生物により引き起こされる疾患または障害の治療に使用される。好ましい実施 態様において、抗病原性組成物は、抗微生物性、特に抗菌性組成物である。加え て、本発明の組成物は、悪性細胞に対して有用であり、癌の治療に使用すること ができる。 また、該溶血性非細胞溶解性ペプチドを、必要とする対象に投与することを含 む治療方法が、本発明により提供される。本発明の方法および上記組成物は、ヒ トと獣医学の両方に適用可能である。 さらに、ヒトまたはヒト以外の動物における疾患または障害の治療のための薬 剤組成物、特に抗菌性組成物の調製における、該非溶血性細胞溶解性ペプチドの 使用も、本発明により提供される。 さらに別の実施態様において、本発明の選択的ペプチドは、微生物の駆除用の 殺菌剤として、すなわち、コンタクトレンズの湿潤用の溶液中で使用することが でき、例えば、化粧品または食品業界において保存料として、および農業におい て農薬（例えば、殺真菌剤、殺菌剤）として、または農業産物（例えば、果実お よび豆）の保存のために使用してもよい。 図面の簡単な説明 図１は、アミノエチルアミノパーダキシン（ＴＡｐａｒ）由来ペプチドの円偏 光二色性（ＣＤ）スペクトルを示す。スペクトルは、４０％２，２，２−トリフ ルオロエタノール（ＴＦＥ）／水中の０．８〜２．０Ｘ１０^-5Ｍのペプチド濃 図２は、ヒト赤血球（ｈＲＢＣ）に対するＴＡｐａｒ由来ペプチドの溶血活性 の用量作用曲線を図示している。この挿入図は、低濃度での測定結果を示す。記 号：黒四角、メリチン；黒三角、ＴＡｐａｒ；黒丸、［Ｄ］Ｐ⁷−ＴＡｐａｒ； 白丸、［Ｄ］Ｌ¹⁸Ｌ¹⁹−ＴＡｐａｒ；白四角、［Ｄ］Ｐ⁷Ｌ¹⁸Ｌ¹⁹−ＴＡｐａｒ ；白三角、ダーマセプチン。 図３Ａ〜Ｂは、ＴＡｐａｒ由来ペプチドにより誘導された、小胞の拡散ポテン シャルの最大消失を示す。ペプチドは、蛍光染料のｄｉＳ−Ｃ₂−５およびバリ ノマイシンで前もって平衡化した、卵ホスファチジルコリン／ホスファチジルセ リン（ＰＣ／ＰＳ）（図３Ａ）またはＰＣ（図３Ｂ）よりなる単層小胞（smallu nilamellar vesicles）（ＳＵＶ）を含有する等張性Ｋ⁺不含緩衝液に加えた。蛍 光回収は、ペプチドを小胞と混合して１０〜２０分後に測定した。記号：黒三角 、ＴＡｐａｒ；黒丸、［Ｄ］Ｐ⁷−ＴＡｐａｒ；白丸、［Ｄ］Ｌ¹⁸Ｌ¹⁹−ＴＡｐ ａｒ；白四角、［Ｄ］Ｐ⁷Ｌ¹⁸Ｌ¹⁹−ＴＡｐａｒ； 図４Ａ〜Ｃは、未処理（図４Ａ）、または最小阻止濃度（ＭＩＣ）より低濃度 （４Ｂ）またはＭＩＣ濃度（４Ｃ）の［Ｄ］Ｐ⁷Ｌ¹⁸Ｌ¹⁹−ＴＡｐａｒで処理し て、ネガティブ染色した大腸菌（E．coli）細胞の電子顕微鏡写真を示す； 図５は、メリチンとメリチン由来ジアステレオマーのＣＤスペクトルを示す。 スペクトルは、４０％ＴＦＥ／水中の０．８〜２．０×１０^-5Ｍのペプチド濃度 チン、（・・・・）；［Ｄ］−Ｖ^5,8，Ｉ¹⁷，Ｋ²¹−メリチン−ＣＯＯＨ、 図６は、ｈＲＢＣに対するメリチン由来ジアステレオマーの溶血活性の用量作 用曲線を図示している。記号：黒丸、メリチン；白丸、［Ｄ］−Ｖ^5,8，Ｉ¹⁷， Ｋ²¹−メリチン−ＣＯＯＨ；黒三角、［Ｄ］−Ｖ^5,8，Ｉ¹⁷，Ｋ²¹−メリチン。 図７Ａ〜Ｃは、未処理（図７Ａ）、またはＭＩＣより低濃度（７Ｂ）またはＭ ＩＣ濃度（７Ｃ）の［Ｄ］−Ｖ^5,8，Ｉ¹⁷，Ｋ²¹−メリチンで処理して、ネガテ ィブ染色した大腸菌（E．coli）の電子顕微鏡写真を示す。 図８Ａ〜Ｂは、メリチンとメリチン由来ジアステレオマーにより誘導された、 小胞の拡散ポテンシャルの最大消失を示す。ペプチドは、蛍光染料のｄｉＳ−Ｃ₂ −５およびバリノマイシンで前もって平衡化した、ＰＣ（８Ａ）またはＰＣ／ ＰＳ（８Ｂ）よりなるＳＵＶを含有する等張性Ｋ⁺不含緩衝液に加えた。蛍光 回収は、ペプチドを小胞と混合して１０〜２０分後に測定した。記号：黒丸、メ リチン；黒三角、［Ｄ］−Ｖ^5,8，Ｉ¹⁷，Ｋ²¹−メリチン。 図９Ａ〜Ｂは、励起波長を２８０nmに、発光波長を３４０nmに設定した、ＰＣ ／ＰＳ小胞（黒三角）またはＰＣ小胞（白三角）での滴定による［Ｄ］−Ｖ^5,8, Ｉ¹⁷，Ｋ²¹−メリチン（全濃度０．５μＭ）の蛍光の増大を示す。実験は、５０ mM Ｎａ₂ＳＯ₄、２５mM ＨＥＰＥＳ−ＳＯ₄ ^-2（ｐＨ６．８）中で２５℃で実 施した（図９Ａ）；そして結合等温線は、図９ＡからＣ_f（溶液中の遊離ペプチ ドの平衡濃度）に対するＸ_b ^*（６０％の脂質当たりの結合ペプチドのモル比）を プロットすることにより誘導した（図９Ｂ）。 図１０Ａ〜Ｂは、臭素化リン脂質による環境感受性トリプトファンのクエンチ ングを示す。メリチン（図１０Ａ）および［Ｄ］−Ｖ^5,8，Ｉ¹⁷，Ｋ²¹−メリチ ン（１０Ｂ）は、ＰＣ／ＰＳ（１：１、ｗ／ｗ）ＳＵＶを含有する緩衝液に加え た。２分間インキュベーション後、トリプトファンの発光スペクトルを、２８０ nmで励起を設定した分光蛍光計を用いて記録した。比較のため、Ｂｒ−ＰＣを含 図１１は、ＲＰ−ＨＰＬＣ保持時間に及ぼすＬｅｕ／Ｌｙｓジアステレオマー の疎水性の作用を示す。 図１２は、ｈＲＢＣに対するＬｅｕ／Ｌｙｓジアステレオマーの溶血活性の用 量作用曲線を示す。挿入図は、低濃度での測定結果を示す。記号：白四角、メリ チン；黒四角、［Ｄ］−Ｌ^3,4,8,10−Ｋ₃Ｌ₉；黒丸、［Ｄ］−Ｌ^3,4,8,10−Ｋ₄ Ｌ₈；白三角、［Ｄ］−Ｌ^3,4,8,10−Ｋ₅Ｌ₇;黒三角［Ｄ］−Ｌ^3,4,8,10−Ｋ₇Ｌ₅ 。 図１３Ａ〜Ｂは、Ｌｅｕ／Ｌｙｓジアステレオマーにより誘導された、小胞の 拡散ポテンシャルの最大消失を示す。ペプチドは、蛍光染料のｄｉＳ−Ｃ₂−５ およびバリノマイシンで前もって平衡化した、ＰＣ（図１３Ａ）またはＰＥ／Ｐ Ｇ（１３Ｂ）よりなるＳＵＶを含有する等張性Ｋ⁺不含緩衝液に加えた。蛍光回 収は、ペプチドを小胞と混合して３〜１０分後に測定した。記号：黒四角、［Ｄ ］ −Ｌ^3,4,8,10−Ｋ₃Ｌ₉；黒丸、［Ｄ］−Ｌ^3,4,8,10−Ｋ₄Ｌ₈；黒三角、［Ｄ］− Ｌ^3,4,8,10−Ｋ₅Ｌ₇；十字入り丸、［Ｄ］−Ｌ^3,4,8,10−Ｋ₇Ｌ₅。 図１４Ａ〜Ｈは、未処理、およびＭＩＣの８０％の種々のＬｅｕ／Ｌｙｓジア ステレオマーで処理して、ネガティブ染色した大腸菌（E．coli）の電子顕微鏡 写真を示す。図１４Ａ、対照；図１４Ｂ、［Ｄ］−Ｌ^3,4,8,10−Ｋ₃Ｌ₉で処理し た大腸菌；図１４Ｃ、［Ｄ］−Ｌ^3,4,8,10−Ｋ₄Ｌ₈で処理した大腸菌；図１４Ｄ 、［Ｄ］−Ｌ^3,4,8,10−Ｋ₅Ｌ₇で処理した大腸菌；図１４Ｅ、［Ｄ］−Ｌ^{3,4,8, 10} −Ｋ₇Ｌ₅で処理した大腸菌；図１４Ｆ、対照；図１４Ｇ、［Ｄ］−Ｌ^3,4,8,10 −Ｋ₄Ｌ₈で処理した大腸菌；図１４Ｈ、［Ｄ］−Ｌ^3,4,8,10−Ｋ₅Ｌ₇で処理した 大腸菌。 発明の詳細な説明 驚くべきことに、異種Ｌベースのペプチドは、非病原性細胞（すなわち、赤血 球）にはほとんどまたは全く作用せずに、病原性細胞（例えば、細菌）を選択的 に破壊することにより表される、選択的細胞溶解活性を有することが、本発明に より見い出された。この知見は、細胞（細菌のような病原性細胞であろうと正常 哺乳動物細胞であろうと）中の細胞溶解性ペプチドの細胞溶解活性は、αらせん 立体配置に関連した単一の基礎となる機構から生じるという当該分野において優 勢な説から考えて、非常に驚くべきことである。理論に束縛されるわけではない が、本発明のこれらの知見は、ペプチド誘導性細胞溶解が、標的細胞の膜の厳密 な性質に依存して異なる細胞で機能する、幾つかの細胞溶解機構の結果であるこ とを示していると考えられる；したがってペプチドのαらせん構造を中断するこ とにより（例えば、同種ペプチドの幾つかのアミノ酸残基を反対のエナンチオマ ーで置換することにより）、１つの細胞溶解機構において細胞溶解活性があり、 一方別の細胞溶解性機構において不活性である細胞溶解性ペプチドを得ること、 すなわち、ある種の病原性標的細胞に特異的な細胞溶解性ペプチドを得ることが 可能である。 本明細書では、パーダキシンとメリチン（２つの既知の非細胞選択的細胞溶解 素）のＤ−アミノ酸を組み込んだ類似体（ジアステレオマー）による機能的およ び構造的研究を行って、細胞選択性の基となる分子機構を理解しようとした。デ ータから、生じたジアステレオマーは、αらせん構造を保持せず、このため、哺 乳動物細胞に及ぼす細胞溶解作用を失ったことが判った。しかしこのジアステレ オマーは、高い抗菌活性を保持しており、これは、グラム陽性およびグラム陰性 細菌の両方の完全な細胞溶解により明示された。すなわち、パーダキシンとメリ チンのαらせん構造は、哺乳動物細胞に対する細胞毒性には重要であるが、抗菌 活性には必要条件ではないことが判った。しかし別の研究において、単一のＤ− アミノ酸を非溶血性抗菌性ペプチドのマゲイニンに組み込んだところ、ほぼ全体 としてその抗菌活性は失われた（チェン（Chen）ら、１９８８）。本発明におい てパーダキシンおよびメリチンのジアステレオマーで得られた結果では、疎水性 および正味の正電荷が、非選択的細胞溶解性ペプチドに選択的抗菌活性を与え、 両親媒性αらせん構造は必要ではないことが示唆される。しかしパーダキシンと メリチンのジアステレオマーは、Ｌ−アミノ酸の長いストレッチ（１４〜１７ａ ａ長）を含んでおり、このことにより、残った低いらせん性でも膜結合と不安定 化には充分である可能性が生じる。 線状細胞毒性ペプチドの疎水性と正味の正電荷の調節が、選択的抗菌活性を与 えるのに充分であるかどうかを調査するために、我々は、種々の比のロイシンと リジンからなり、かつその配列の３分の１がＤ−アミノ酸からなる、短いモデル ペプチド（１２ａａ長）のジアステレオマーを検討することにした。ペプチド長 とＤ−アミノ酸の位置は、αらせん構造を形成することができない１〜３個のＬ −アミノ酸の非常に短い連続ストレッチを有する短いペプチドが作成されるよう にした。このジアステレオマーは、（１）細菌およびヒト赤血球に対するその細 胞毒性、（２）その構造、および（３）細菌の細胞壁の形態およびモデルのリン 脂質膜と相互作用して動揺させるその能力に関して評価した。データは、疎水性 と正電荷の調節が、抗菌活性と細胞溶解選択性を与えるのに充分であることを示 している。さらには、生じた抗菌性ペプチドは、非致死濃度でテトラサイクリン のような利用可能な抗菌性薬剤と相乗的に作用し、そして、未変性抗菌性ペプチ ドの活性を劇的に低下させるヒト血清の不活化に対して全く抵抗性である。さら に短いジアステレオマー（６ａａおよび８ａａ長）を調製して試験し、非溶血性 で細胞溶解性であることが判った。 ある種の細胞溶解性非らせんペプチドが、抗病原活性を有するという知見は、 このような非らせんポリペプチドを含む抗病原性薬剤の調製への道を開く。非ら せんペプチドが、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸の両方からなる異種ペプチドであ る場合、抗病原性薬剤は、一方で分解（例えば、プロテアーゼによる）に対して 同種Ｌ−ペプチドよりも抵抗性が大きく、そして他方で全同種Ｄ−ペプチドのよ うに完全に分解抵抗性ではないというさらなる利点を有する。分解に対する抵抗 性は、毒性副作用を伴う可能性のある身体からの緩慢なクリアランスという点か らは不都合であるかもしれない。非αらせん抗病原性ペプチドは、種々の治療法 に使用することができる。 同種Ｄ-ペプチドは、対応する同種Ｌ−ペプチドと本質的に同一の細胞溶解活 性を有することが知られているため（ベッサレ（Bessalle）ら、１９９０）、異 種Ｄベースのペプチドが、異種Ｌベースのペプチドと同じ抗病原性を有すること は明らかである。 本発明の知見、すなわち、ある種の非αらせんペプチドが、赤血球に対する細 胞溶解活性なしに細菌に対する細胞溶解活性を有することは、その細胞膜の組成 において細菌細胞が赤血球とは異なるという事実の結果である。細胞膜の組成の 相違はまた、種々の病原性細胞（癌細胞など）と正常細胞の間にも見い出すこと ができる。すなわち、本発明の知見に基づき、ある種の非αらせんペプチドが、 １つの型の細胞（すなわち、細菌細胞）に対する特異的な細胞溶解活性を有する ことは、非病原性の正常体細胞に対してほとんどまたは全く活性がなく、体内の １つの分類の細胞（例えば、細菌細胞、寄生体の細胞、真菌細胞、原生動物細胞 、または癌細胞）に対する選択的細胞溶解活性を有する種々の薬剤の開発への道 を開く。 病原性細胞に対して選択的細胞溶解活性を有するが、正常非病原性細胞に対し てははるかに低い細胞溶解活性を有するか、または全く細胞溶解活性を持たない 本発明の非溶血性細胞溶解性ペプチドは、全くまたはほとんど毒性副作用なしに 、種々の治療応用に使用することができる。 １つの群の本発明のペプチドは、広範な細胞溶解活性を有するαらせん構造の 同種ペプチドから誘導された、非αらせん異種ペプチドである。したがって本発 明は、１つの実施態様により、ある配列を有するＤ−およびＬ−アミノ酸残基の 両方を含む異種ペプチドを提供するが、ここで、Ｌ−アミノ酸残基のみまたはＤ −アミノ酸残基のみを含み、該異種ペプチドと同じアミノ酸配列を有する同種ペ プチドは、αらせん立体配置を有し、かつ種々の細胞で表される広域スペクトル 細胞溶解活性を有するものである；該異種ペプチドは、該同種ペプチドが細胞溶 解活性である細胞の内の少数のみに細胞溶解活性を有する。例えば、異種ペプチ ドの細胞溶解活性は、病原性細胞のみで表され、一方赤血球のような正常細胞に 対する細胞溶解活性は持たない。 本発明の細胞溶解性ペプチドの例は、αらせん構造を含みかつ細胞溶解活性を 有する天然ペプチドから誘導されるペプチドである。本発明の非らせんペプチド は、Ｄ−アミノ酸が、分子のＮ−およびＣ−らせんに沿って組み込まれ、かつ正 味の正電荷が、正に荷電したアミノ酸残基（例えば、リジン、アルギニン、ヒス チジン）（例えば、Ｎ末端で）、および／または正に荷電した基（例えば、アミ ノエチルアミノのようなアミノアルキルアミノ基）（例えば、分子のＣ末端で） の付加によるか、または遊離カルボキシル基の中和（例えば、これらをアミド基 に変換することによる）により達成される、天然ペプチドの全配列または部分配 列に本質的に対応する配列を有する。このような天然ペプチドの例は、メリチン とパーダキシン、およびその断片である。 例えば、非αらせんペプチドは、３３量体ペプチドであるパーダキシンから、 または２６量体ペプチドであるメリチンから誘導することができ、非αらせんペ プチドは、それぞれ、パーダキシンまたはメリチンの全配列に対応する配列を含 む、３３量体または２６量体ペプチドであってもよく、あるいはパーダキシンま たはメリチンの部分配列（例えば、８〜２３量体メリチン配列）に対応する配列 を有する非らせんペプチドであってもよい。パーダキシンから誘導される異種ペ プチドの場合に、本発明の異種ペプチドは、わずか１０アミノ酸残基および１０ 〜２４の間のアミノ酸残基を含むパーダキシンの部分配列に対応する部分配列を 含んでもよい。 別の群の本発明のペプチドは、天然相同体を持たない配列を有し、少なくとも １つの疎水性アミノ酸および少なくとも１つの正に荷電したアミノ酸よりなり、 そして配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基がＤ−アミノ酸である、非らせん ペプチドである。 抗菌性ペプチドの構造−機能研究を解明するために使用されるモデルペプチド による以前の研究では、３つのパラメーターに焦点を当てた；らせん構造、疎水 性および電荷（アンザイ（Anzai）ら、１９９１；アガワ（Agawa）ら、１９９１ ）。これらのパラメーターの１つの各変化は、同時に他の２つの変化を引き起こ すため、全体の抗菌活性に対する各パラメーター単独の寄与を明らかにすること が困難になった。本発明では、らせん構造の影響を除外したため、ロイシンとリ ジンの比を変えることにより２つのパラメーターだけ、すなわち、疎水性と正味 の正電荷の検討が可能になった。この目的のため、わずか１〜３個の連続Ｌ−ア ミノ酸のストレッチ（短すぎてαらせん構造を形成できない）を含有する短いモ デルペプチド（１２ａａ長）のジアステレオマーを検討のために選択した。 ＣＤ分光学により、低度のα構造を保持している本発明のメリチンとパーダキ シンのジアステレオマーとは異なり、これらのＬｅｕ／Ｌｙｓジアステレオマー はαらせん構造が全く欠けていることが判った（データは示していない）。それ にもかかわらず、Ｌｅｕ／Ｌｙｓジアステレオマーは、未変性の抗菌性ペプチド （例えば、ダーマセプチンＳ）、または抗生物質のテトラサイクリンと同様か、 またはそれより大きい強力な抗菌活性を示す。さらに、最も強力なペプチドの［ Ｄ］−Ｌ^3,4,8,10−Ｋ₄Ｌ₈および［Ｄ］−Ｌ^3,4,8,10−Ｋ₅Ｌ₇（本発明の例３の 、それぞれ、ペプチド２３および２４）は、非常に細胞溶解に感受性のヒト赤血 球に対して溶血活性がなかった。［Ｄ］−Ｌ^3,4,8,10−Ｋ₃Ｌ₉（ペプチド２２） はαらせん構造を欠いているが、未変性細胞溶解性ペプチドのパーダキシンに迫 る相当な溶血活性を有することに注意されたい。これは、疎水性と正電荷の間の 均衡が、両親媒性αらせん構造を埋め合わせることを示すものであろう。しかし 正電荷の増大が、溶血活性を激烈に低下させ、一方抗菌活性は保存されるという ことは、両親媒性αらせん構造が、抗菌活性には必要でないことを証明している 。 負に荷電したリン脂質膜および双性イオン性リン脂質膜の両方とのＬｅｕ／Ｌ ｙｓジアステレオマーの相互作用を検討して、細菌に対するその選択的細胞毒 性の根拠を解明しようとした。負に荷電したＰＥ／ＰＧ小胞を使用して、大腸菌 （E．coli）の脂質組成を模倣し（ショー（Shaw）、１９７４）、双性イオン性 ＰＣ小胞でヒト赤血球の外側リーフレットを模倣した（バークレイジ（Verkleij ）ら、１９７３）。赤血球（図１２）および大腸菌（E．coli）（表５）に及ぼ すＬｅｕ／Ｌｙｓペプチドの生物学的活性は、モデル膜を透過するその能力とよ く相関する。ＰＣ小胞を透過した唯一のペプチドが、顕著な溶血活性を有する唯 一のペプチドであった。これらの結果は、細菌の膜のリン脂質組成が、このファ ミリーの抗菌性ペプチドによる透過においてある役割を果たすことを示唆してい る。負に荷電しているが双性イオン性ではないリン脂質小胞に結合して透過する 、抗菌性で非溶血性ペプチドの能力は、未変性抗菌性ペプチドの特徴であり（ガ ジット（Gazit）ら、１９９４）、そしてこの能力は、細菌表面が、リポ多糖類 （グラム陰性細菌のＬＰＳ）および多糖類（グラム陽性細菌のテイコ酸）を含み 、そしてその内膜が、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）を含んでいる（これ ら全ては、負に荷電している）が、一方、赤血球のような正常真核生物細胞は、 その外側リーフレット上に双性イオン性リン脂質ＰＣを主に発現するという事実 に帰される。 抗菌性ペプチドのマゲイニンは、非溶血性ペプチドであるが、一方メリチン、 パーダキシン、および［Ｄ］−Ｌ^3,4,8,10−Ｋ₄Ｌ₈の配列と類似しているが専ら Ｌ−アミノ酸からなる配列のモデルペプチドは、主としてこれらの高い疎水性に より、溶血性である。マゲイニンのαらせん構造が、３つのＤ−アミノ酸の導入 により中断されると、生じるジアステレオマーは、その正味の正電荷が未変性マ ゲイニンの電荷と同様であっても、抗菌活性はなかった（チェン（Chen）ら、１ ９８８）。したがって、未変性マゲイニンのαらせん構造、疎水性および正味の 正電荷の間に既に存在する最適な均衡が、選択的抗菌活性を可能にしており、そ してこれらの性質の１つのどのような変化によっても、マゲイニンの抗菌活性は 喪失してしまうのであろう。これとは対照的に、疎水性は、メリチン、パーダキ シンおよび本発明のＬｅｕ／Ｌｙｓジアステレオマーにおけるαらせんの消失を 埋め合わせるのに主要な役割を果たすと考えられる。 本発明の結果は、短く単純で容易に操作される抗菌性ペプチドのレパートリー の設計のための新規な方策を示唆している。ジアステレオマーモデルのＬｅｕ／ Ｌｙｓペプチドのそれぞれは、独特のスペクトルの活性を有する（表５）。ジア ステレオマー抗菌性ペプチドのレパートリーの存在により、標的細胞にとって最 も有効なペプチドを選択することができる。さらに、別々にまたは一斉に作用す る、多様な形態のジアステレオマーペプチドの同時投与もまた、選択的生存価を 有し、そしてより広い範囲の感染性微生物に対する良好な遮蔽物を提供する。全 てのＬｅｕ／Ｌｙｓジアステレオマーは、グラム陰性細菌に比較してグラム陽性 細菌に対する抗菌活性の上昇を示した。従来の抗生物質に対する黄色ブドウ状球 菌（Staphylococcus aureus）、腸球菌（enterococci）、および肺炎双球菌 （pneumococci）のようなグラム陽性細菌の耐性の上昇を考えるとき、これらの 結果は重要である（ラッセル（Russel）ら、１９９５）。加えて、未変性抗菌性 ペプチドのダーマセプチンＳとは異なり、［Ｄ］−Ｌ^3,4,8,10−Ｋ₅Ｌ₇（ペプチ ド２４）は、プールされたヒト血清の存在下でその抗菌活性を保持していた。 ジアステレオマーペプチドは、既知の抗菌性ペプチドにまさる幾つかの利点を 有するであろう：（１）このペプチドには、αらせん分解性の細胞溶解素により 誘導される多様な病理学的および薬理学的作用がないであろう。例えば、ブドウ 球菌のδ毒素、抗菌性ペプチドのアラメチシン（alamethicin）、コブラの直接 分解性因子（direct lytic factor）およびパーダキシンは、孔形成およびアラ キドン酸カスケードの活性化により、種々の細胞に幾つかの組織病理学的作用を 及ぼす。しかし、パーダキシンのジアステレオマーは、これらの活性を発揮しな い。加えて、多くの両親媒性αらせんペプチドは、カルモジュリンに結合して幾 つかの細胞応答を導き出し、そしてメリチンを含め全Ｄ−アミノ酸のαらせんは 同様な活性を有する（フィッシャー（Fisher）ら、１９９４）。中断したαらせ ん構造を有するジアステレオマーは、カルモジュリンに結合すると予想されない ；（２）局所のＤ−アミノ酸置換により、完全なＤ−アミノ酸置換により獲得さ れる全体的保護とは反対に、タンパク分解性酵素による抗菌性ペプチドの制御さ れたクリアランスが起こる（ウェード（Wade）ら、１９９０）。分解に対する細 胞溶解性ペプチドの全体的抵抗は、治療用途にとって不都合である。さらに、Ｄ ，Ｌ−アミノ酸を含有する短い断片の抗原性は、その全体がＬまたはＤ−アミノ 酸 の親分子に比較して、劇的に変化する（ベンキラン（Benkirane）ら、１９９３ ）；（３）ジアステレオマーにより誘導される細菌増殖の全体的阻害は、電子顕 微鏡検査（図１４）により示されるように、細菌の細胞壁の全体的溶解を伴う。 したがって、細菌は、このような破壊機構を引き起こす薬剤に対する耐性を容易 にはつくり出せない；（４）［Ｄ］−Ｌ^3,4,8,10−Ｋ₅Ｌ₇（ペプチド２４）は、 電子顕微鏡検査（図１４）により示されるように、そのＭＩＣより低濃度で細菌 の細胞壁を動揺させる能力を有する。細菌の細胞壁に浸透する能力がないため活 性がない臨床的に使用される抗生物質の、ペプチド２４との同時投与は、細菌の この抵抗機構に対する解決策を与えるかもしれない。 パーダキシン、メリチンおよびモデルのペプチドジアステレオマーにより本発 明で得られた結果は、Ｄ−アミノ酸の特異的配列、長さ、または位置のいずれも 、あるポリペプチドを抗菌活性にするのに必要でないことを示していると要約す ることができる。しかしこれらの因子は、哺乳動物細胞に対する細胞毒性には、 より決定的であると考えられる。これらの結果は、線状細胞毒性ポリペプチドの 疎水性と正味の正電荷の調節だけで、感染症の治療用の強力な抗菌性ジアステレ オマーポリペプチドのレパートリーの設計が充分にできることを示している。 本発明はここで、幾つかの非限定的な図面および例を参照して説明される。 実験方法 （ｉ）材料。ブチルオキシカルボニル−（アミノ酸）−（フェニルアセトアミド ）メチル樹脂は、アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）（フォス ターシティー、カリホルニア州）から購入し、ブチルオキシカルボニル （Ｂｏｃ）アミノ酸は、ペニンシュララボラトリーズ（Peninsula Laboratories ）（ベルモント、カリホルニア州）から入手した。ペプチド合成のために使用し た他の試薬は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、シグマ（Sigma））、Ｎ，Ｎ−ジイ ソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、アルドリッチ（Aldrich）、ニンヒドリン で蒸留）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、フルカ（Fluka））、１ −ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ、ピアース（Pierce））およびジメ チルホルムアミド（ペプチド合成等級、バイオラブ（Biolab））を含むものであ った。卵ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびウシ脊髄からのホスファチジルセ リ ン（ＰＳ）（ナトリウム塩−Ｉ等級）は、リピッドプロダクツ（Lipid Products ）（サウスナットフィールド（South Nutfield）、英国）から購入した。卵ホス ファチジルグリセロール（ＰＧ）およびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ ）（Ｖ型、大腸菌（Eschrichi acoli）から）は、シグマ（Sigma）から購入した 。コレステロール（純度特級）は、メルク（Merck）（ダームシュタット （Damstadt）、ドイツ）から供給され、エタノールから２回再結晶した。３，３ ’−ジエチルチオジカルボシアニンヨウ化物［ｄｉＳ−Ｃ₂−５］は、モレキュ ラープローブス（Molecular Probes）（ユージーン、オレゴン州）から入手した 。未変性メリチンはシグマ（Sigma）から購入した。市販のメリチンは、通常痕 跡量のホスホリパーゼＡ₂を含み、これが、リン脂質の急速な加水分解を引き起 こす。したがって、特に注意を払って、ＲＰ−ＨＰＬＣを使用してメリチンから 全てのホスホリパーゼＡ₂を除去した。他の全ての試薬は分析用等級のものとし た。緩衝液は、二回ガラス蒸留水で調製した。 （ii）ペプチド合成および精製。ペプチドは、ブチルオキシカルボニル−（アミ ノ酸）−（フェニルアセトアミド）メチル樹脂（０．０５ｍ当量）で固相法によ り合成した（メリフィールド（Merrifield）ら、１９８２）。樹脂結合ペプチド は、フッ化水素（ＨＦ）により樹脂から切断し、ＨＦ留去後に無水エーテルで抽 出した。これらの粗ペプチド調製物は、ＲＰ−ＨＰＬＣにより示されるように、 １つの主要ピークを含んでいたが、これは、５０〜７０重量％純粋なペプチドで あった。合成したペプチドは、Ｃ₁₈逆相バイオラッド（Bio-Rad）準分取用カラ ム（孔サイズ３００Å）でＲＰ−ＨＰＬＣによりさらに精製した。１．８ml／分 の流速で、両者とも０．０５％のＴＦＡ（ｖ／ｖ）を含有する水中の１０〜６０ ％アセトニトリルの線形勾配を使用して、カラムを４０分で溶出した。分析用Ｈ ＰＬＣにより均質（〜９５％）であることが示された精製ペプチドは、アミノ酸 分析に付し、そして質量分析法に付してこれらの配列を確認した。 （iii）ペプチドのアミノ基転移。上記（ii）のように樹脂結合したペプチドは 、ＤＭＦ中の３０％エチレンジアミンにより３日間でアミノ基転移させて、次に 樹脂を濾過し、保護ペプチド（すなわち、アミノエチルアミノ（ＴＡ）ペプチド ）をエーテルで沈殿させ、ＨＦで保護基を脱離した。合成ＴＡペプチドは、０． １％ＴＦＡ中の２５〜８０％アセトニトリルの線形勾配を使用して、４０分でＣ₁₈ カラムの逆相ＨＰＬＣにより精製し（均質性＞９５％）、次にアミノ酸分析に 付してその組成を確認した。 （iv）ペプチドのアミド化。樹脂結合ペプチド（２０mg）は、メタノール中の飽 和アンモニウム溶液（３０％）とＤＭＳＯ（１：１、ｖ／ｖ）の１：１、ｖ／ｖ よりなる混合物で３日間処理することにより、［Ｄ］−Ｖ^5,8，Ｉ¹⁷，Ｋ²¹−メ リチンのＣ末端に位置するグルタミン残基のカルボン酸基のアミド化を行った。 すなわち、全ての保護基が結合したままであるが、そのＣ末端残基が１つのアミ ド基により修飾されたペプチドが得られた。メタノールとアンモニアは、窒素流 下で留去し、そして保護ペプチドは、ＤＭＳＯで樹脂から抽出し、無水エーテル で沈殿させた。次に生成物をＨＦ切断に付し、上述のようにＲＰ−ＨＰＬＣを使 用してさらに精製に付した。 （ｖ）脂質小胞の調製。ＰＣ／コレステロール（１０：１、ｗ／ｗ）またはＰＣ ／ＰＳ（１：１、ｗ／ｗ）分散液の音波破砕により、単層小胞（ＳＵＶ）を調製 した。簡単に述べると、乾燥脂質とコレステロール（１０：１、ｗ／ｗ）をＣＨ Ｃｌ₃／ＭｅＯＨ混合物（２：１、ｗ／ｗ）に溶解した。次に溶媒を窒素流下で 留去し、脂質（７．２mg/mlの濃度）を１時間真空にして、次に渦流を起こして 適切な緩衝液に再懸濁した。次に生じた脂質分散液を、清澄になるまで浴型音波 破砕機（Ｇ１１２５ＳＰ１音波破砕機、ラボラトリーサプライズカンパニー社（ Laboratory Supplies Company Inc.）、ニューヨーク州）で５〜１５分間音波破 砕した。生じた調製物の脂質濃度は、リン分析により測定した（バートレット（ Bartlett）、１９５９）。小胞は、以下のようにＪＥＯＬ ＪＥＭ １００Ｂ電 子顕微鏡（ジャパンエレクトロンオプティクスラボラトリー社（Japan Electron Optics Laboratory Co.）、東京、日本）を使用して視覚化した。一滴 の小胞を、炭素コーティングした格子に沈積させ、酢酸ウラニルでネガティブ染 色した。この格子の検討により、小胞が２０〜５０nmの平均直径を有する単層で あることが証明された（パパハドジョポウロス（Papahadjopoulos）とミラー （Miller）、１９６７）。 （vi）血清の調製。 ５名の志願者から採血し、室温で４時間凝固させた。次に 血液を１５００ｇで１５分間遠心分離し、血清を取り出してプールした。５６℃ で３０分間加熱することにより血清補体を不活化した。 （vii）ＣＤ分光学。ペプチドのＣＤスペクトルは、（＋）−１０−ショウノウ スルホン酸で装置を較正後、ジャスコ（Jasco）Ｊ−５００Ａ分光偏光計で測定 した。スペクトルは、０．５mmの経路長の蓋付き石英光学セルで２３℃で走査し た。スペクトルは、２５０〜１９０nmの波長で得られた。各ペプチドについて２ ０nm/分の走査速度で８回の走査を行った。ペプチドは、４０％トリフルオロエ タノール（ＴＦＥ）（αらせん構造を強力に促進する溶媒）中の１．５× １０^-5〜２．０Ｘ１０^-5Ｍの濃度で走査した。らせん率（グリーンフィールド （Greenfield）とファスマン（Fasman）、１９６９；ウー（Wu）ら、１９８１） は、以下： ［ここで、［θ］₂₂₂は、２２２nmでの実験的に観察された平均残基楕円率であ り、そして［θ］⁰ ₂₂₂と［θ］¹⁰⁰ ₂₂₂の値（２２２nmでの０％および１００％ら せん含量に対応する）は、それぞれ、２０００および３２０００度・cm²/dmolと 見積もった］のように計算した（ウー（Wu）ら、１９８１）。 （viii）ペプチドの抗菌活性。ジアステレオマーの抗菌活性は、以下のように１ ００μＬの最終容量で滅菌９６ウェルプレート（ヌンク（Nunc）Ｆ９６マイクロ タイタープレート）中で検討した：１０⁶コロニー形成単位（ＣＦＵ）／mlＬＢ （ローリア（Lauria）ブロス）培地の濃度で細菌を含有する懸濁液のアリコート （５０μｌ）を、２倍連続希釈でペプチドを含有する、５０μＬの水またはＰＢ Ｓ中の６６％正常ヒトプール血清に加えた。増殖阻害は、マイクロプレート（Mi croplate）自動リーダーＥ１３０９（バイオテックインストラメンツ（Bio-tek Instruments））で４９２nmの吸光度を測定することにより求め、次に１８〜２ ０時間３７℃でインキュベートした。抗菌活性は、最小阻止濃度（ＭＩＣ）（１ ８〜２０時間のインキュベーション後に１００％増殖の阻害が観察された濃度） として表される。使用した細菌は、大腸菌（Escherichia coli）Ｄ２1、緑膿菌 （Pseudomonas aeruginosa）ＡＴＣＣ２７８５３、アシネトバクターカルコ アセティクス（Acinetobacter calcoaceticus）Ａｃｌｌ、ネズミチフス菌 （Salmonella typhimurium）ＬＴ２、巨大菌（Bacillus megaterium）Ｂｍｌｌ 、ミクロコッカスルテウス（Micrococcus luteus）ＡＴＣＣ９３４１、枯草菌 （Bacillus subtilis）ＡＴＣＣ６０５１であった。 （ix）ヒト赤血球の溶血。ペプチドは、ヒト赤血球（ｈＲＢＣ）に対するその溶 血活性について試験した。ＥＤＴＡを加えた新鮮ｈＲＢＣは、８００ｇで１０分 間の遠心分離によりＰＢＳ（３５mMリン酸緩衝液／０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．３）で３回濯ぎ、ＰＢＳに再懸濁した。次にＰＢＳに溶解したペプチドは、 ５０μＬのＰＢＳ中のストックｈＲＢＣの溶液に加えて、１００μＬの最終容量 とした（最終赤血球濃度、５％、ｖ／ｖ）。生じた懸濁液を３７℃で３０分間撹 拌下でインキュベートした。次に試料を８００ｇで１０分間遠心分離した。ヘモ グロビンの放出は、５４０nmで上清の吸光度を測定することによりモニターした 。ゼロ溶血（ブランク）および１００％溶血の対照は、それぞれ、ＰＢＳおよび トリトン１％に懸濁したｈＲＢＣとした。 （ｘ）電子顕微鏡による細菌に及ぼすペプチドの作用の視覚化。ＬＢ培地中に大 腸菌（E．coli）（１０⁶ＣＦＵ/ml）を含有する試料を、ＭＩＣ、およびＭＩＣ 未満の１つの希釈の種々のペプチドと共に１６時間インキュベートし、次に３０ ００ｇで１０分間遠心分離した。ペレットを再懸濁して、細菌を含有する１滴を 、炭素コーティングした格子に沈積させ、次に２％リンタングステン酸 （ＰＴＡ）（ｐＨ６．８）でネガティブ染色した。格子はＪＥＯＬ ＪＥＭ １ ００Ｂ電子顕微鏡を使用して検査した。 （xi）ペプチドにより誘導される膜透過。膜透過は、以前に報告された（シャイ （Shai）ら、１９９１）ように、拡散ポテンシャル測定法（ロエ（Loew）ら、１ ９８３；シムズ（Sims）ら、１９７４）を利用して評価した。典型的な実験にお いて、ガラス管で、Ｋ⁺含有緩衝液（５０mM Ｋ₂ＳＯ₄、２５mM ＨＥＰＥＳ− ＳＯ₄ ^-2、ｐＨ６．８）中の４μｌのリポソーム懸濁液（３３μMの最終リン脂質 濃度）を、１mlの等張性Ｋ⁺不含緩衝液（５０mM Ｎａ₂ＳＯ₄、２５mM ＨＥＰ ＥＳ−ＳＯ₄ ^-2、ｐＨ６．８）に希釈し、次に蛍光性ポテンシャル感受性染料の ｄｉＳ−Ｃ₂−５を加えた。バリノマイシン（１μｌの１０^-7Ｍ）を懸 濁液に加えて、小胞内の負の拡散ポテンシャルを徐々に引き起こすようにし、こ れが染料の蛍光のクエンチングをもたらした。一旦蛍光が安定化したら（３〜１ ０分間かかった）、ペプチドを加えた。蛍光の上昇により反映される、ひき続い て起こる拡散ポテンシャルの消失は、励起を６２０nmに、発光を６７０nmに設定 したパーキンエルマー（Perkin Elmer）ＬＳ−５０Ｂ分光蛍光計でモニターして 、利得を１００％に調整した。蛍光回収の百分率Ｆ_tは、以下： Ｆ_t ＝ （Ｉ_t−Ｉ_o／Ｉ_f−Ｉ_o）×１００ （ここで、Ｉ_o＝初期蛍光、Ｉ_f＝バリノマイシンの添加前に観察された全蛍光、 そしてＩ_t＝時間ｔでペプチド添加後に観察された蛍光）のように定義された。 （xii）小胞へのペプチドの結合。双性イオン性（ＰＣ）または負に荷電したリ ン脂質（ＰＣ／ＰＳ）からなる小胞との［Ｄ］−Ｖ^5,8，Ｉ¹⁷，Ｋ²¹−メリチン の相互作用は、ＳＵＶ滴定実験でペプチドの内部トリプトファンの発光強度の変 化を測定することにより性状解析した。簡単に述べると、ＳＵＶを、５０mMＮａ₂ ＳＯ₄、２５mM ＨＥＰＥＳ−ＳＯ₄ ^-2（ｐＨ６．８）を含有する緩衝液に溶解 した固定量のペプチド（０．５μM）に２４℃で加えた。２mlの最終反応容量を 含有する１cmの経路長の石英キュベットを全ての実験に使用した。蛍光強度は、 ５nmスリットを使用して励起を２８０nmに設定し、２．５nmスリットを使用して 発光を３４０nmに設定したパーキンエルマー（Perkin-Elmer）ＬＳ−５分光蛍光 計で脂質／ペプチドモル比の関数として測定（４回の別の実験）した。結合等温 線は、下記式： Ｘ_b ＝ Ｋ_PＣ_f （ここで、Ｘ_bは、全脂質（Ｃ_L）当たりの結合ペプチド（Ｃ_b）のモル比として 定義され、Ｋ_Pは、分配係数に対応し、そしてＣ_fは、溶液中の遊離ペプチドの平 衡濃度を表す）を使用して、分配平衡として分析した。実用的な目的のため、ペ プチドは当初ＳＵＶの外側リーフレットのみに分配している（６０％）と仮定し た。したがって、分配等式は、以下： Ｘ_b ^* ＝ Ｋ_P ^*Ｃ_f （ここで、Ｘ_b ^*は、全脂質の６０％当たりの結合ペプチドのモル比として定義さ れ、そしてＫ_P ^*は、推定表面分配係数である）となる。遊離ペプチドＣ_fに 対するＸ_b ^*のプロットから生じた曲線は、通常の結合等温線として参照される。 （xiii）トリプトファンクエンチング実験。周囲環境に感受性のトリプトファン は、膜におけるペプチドの局在を評価するために、以前から臭素化リン脂質 （Ｂｒ−ＰＣ）と組合せて使用されてきた（ボーレン（Bolen）とホロウェイ （Holloway）、１９９０；デクルーン（De Kroon）ら、１９９０）。トリプトフ ァン蛍光のクエンチャーとして使用したＢｒ−ＰＣは、短距離で作用し、膜を激 烈には動揺させないため、ペプチドの膜挿入のプロービングに適している。それ ぞれ１つのトリプトファン残基を含有するメリチンとそのジアステレオマーは、 ２０μｌ（５０μM）のＢｒ−ＰＣ／ＰＳ（１：１、ｗ／ｗ）ＳＵＶを含有する ２mlの緩衝液（５０mM Ｎａ₂ＳＯ₄、２５mM ＨＥＰＥＳ−ＳＯ₄ ^-2、ｐＨ６． ８）に加える（０．５μＭの最終濃度）ことにより、１００：１の脂質／ペプチ ド比を確立した。室温で２分インキュベーション後、トリプトファンの発光スペ クトルは、励起を２８０nm（８nmスリット）に設定したパーキンエルマー （Perkin-Elmer）ＬＳ−５０Ｂ分光蛍光計を使用して記録した。ＰＣ／ＰＳ（１ ：１、ｗ／ｗ）からなり、２５％の６，７ Ｂｒ−ＰＣ、または９，１０ Ｂｒ −ＰＣ、または１１，１２ Ｂｒ−ＰＣのいずれかを含有するＳＵＶを使用した 。各ペプチドに関して３回の別の実験を実施した。対照実験において、Ｂｒ−Ｐ Ｃを含まないＰＣ／ＰＳ（１：１、ｗ／ｗ）ＳＵＶを使用した。例１．パーダキシン由来ジアステレオマーの合成および生物学的活性 １．１ 合成。哺乳動物細胞および細菌に対するその細胞毒性におけるポリカチ オン性細胞溶解素のαらせん構造の役割を試験するために、実験方法のセクショ ン（ii）および（iii）に記載されるように、一連のパーダキシン由来ペプチド を合成し、そしてその構造、ｈＲＢＣに対する溶血活性、抗菌活性および細菌の 形態に及ぼす効果について性状解析した。 パーダキシン（ｐａｒ）は、以下の配列： の３３量体ペプチドである。 正電荷を導入するためのパーダキシン分子の修飾は、パーダキシンの酸性Ｃ末 端を削除するか、またはエチレンジアミン（ＴＡ）とのＣ末端のＧｌｕ残基の両 方のカルボキシル基の反応によりパーダキシンまたはその断片の酸性Ｃ末端を正 の末端に変換することにより、および／またはＬｙｓのような正に荷電したアミ ノ酸残基をＮ末端に付加することにより行った［パーダキシンジアステレオマー では、ＴＡｐａｒまたはパーダキシン断片の７位のＰｒｏ残基をＤ−Ｐｒｏによ り置換（本明細書では［Ｄ］Ｐ⁷で示される）することにより、ＴＡｐａｒまた はパーダキシン断片の１８および１９位の２つのＬｅｕ残基をＤ−Ｌｅｕにより 置換（本明細書では［Ｄ］Ｌ¹⁸Ｌ¹⁹）することにより、または両方の置換（本明 細書では［Ｄ］Ｐ⁷Ｌ¹⁸Ｌ¹⁹）により、Ｎ−らせんおよび／またはＣ−らせんが 改変されている］。Ｄ−アミノ酸は、Ｎ−およびＣ−らせんの中央に導入した。 以下のパーダキシン由来ジアステレオマーは、非溶血性であり、選択的細胞溶 解活性を示すことが判った（太字および下線の残基はＤ−アミノ酸である）。ペ プチドは、以降本明細書では太字の数字により表される。 以下のパーダキシン誘導体を合成したが、これらは本明細書に後述の表１に示 されるように溶血性であることが判った。 １．２ ペプチドの二次構造の決定。ペプチド１、８、１２、１４の二次構造は 、実験方法、セクション（vii）に記載されたように、４０％ＴＦＥ（αらせん 構造を強力に促進する溶媒）、およびＰＢＳ（３５mMリン酸緩衝液／０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）中のＣＤスペクトルから評価した。 パーダキシン由来ジアステレオマーのＣＤスペクトルを図１に示す（図中、 ２２nmでの最小値により示されるように、多くのＤ−アミノ酸が組み込まれるほ どペプチドのαらせん含量の劇的な低下が観察された。８（ＴＡｐａｒ）（５０ ％αらせん）と１（［Ｄ］Ｐ⁷Ｌ¹⁸Ｌ¹⁹−ＴＡｐａｒ）（４％）の間では９０％ を超えるαらせん含量の低下があった。１２（［Ｄ］Ｐ７−ＴＡｐａｒ）と１４ （［Ｄ］Ｌ¹⁸Ｌ¹⁹−ＴＡｐａｒ）のαらせん含量は、それぞれ２５％と１５％で あった。７位のプロリンは、構造にねじれを導入しないが、ＮＭＲ分光学により 明らかにされるようにむしろＮ−らせんの形成に関与していることに注意された い（ザゴースキー（Zagorski）ら、１９９１）。ＰＢＳでは、パーダキシンは、 〜１２％αらせん含量の低い値を与え、一方Ｄ−アミノ酸残基を含む全ての類似 体で、特異的な構造に帰すことのできない非常に低いシグナルを与えた（データ は示していない）。 １．３ 溶血活性および抗菌活性。次にパーダキシン由来ペプチド１〜１７は、 それぞれ、実験方法、セクション（ix）および（xviii）に記載されたように、 非常に感受性の高いヒト赤血球に対する溶血活性、および異なる種の細菌の増殖 を阻害するその能力について試験した。加えて、細胞毒性ハチ毒のメリチン、抗 菌性ペプチドのダーマセプチンＳ、および抗生物質のテトラサイクリンを対照と して使用した。 図２は、ペプチド１、８、１２、１４の溶血活性の用量作用曲線を示す。ＴＡ ｐａｒに導入されたＤ−アミノ酸が、その溶血活性を劇的に低下（対応する類似 体のαらせん含量の低下分と相関する）させていることが判る。αらせん含量が 最も高いペプチド８のＴＡｐａｒは、最も溶血性であり、一方αらせん含量が最 も低いペプチド１の［Ｄ］Ｐ⁷Ｌ¹⁸Ｌ¹⁹−ＴＡｐａｒは、試験した最高濃度（５ ０μＭ）まででは事実上溶血活性が欠けている。ＲＢＣを溶解する能力のないこ とは、ダーマセプチン（図２を参照のこと）、マゲイニンおよびケクロピンのよ うな多くの天然抗菌性ペプチドの特徴である。 表１は、代表的なセットの試験細菌（グラム陰性細菌２種、大腸菌 （Escherichia coli）とアシネトバクターカルコアセティクス（Acinetobacter calcoaceticus）、およびグラム陽性細菌２種、巨大菌（Bacillus megaterium） と枯草菌（Bacillus subtilis）を含む）に対するペプチド１〜１７のＭＩＣ （μＭ）、さらに５０ｐＭペプチドでの溶血％を与える。表２は、幾つかの細菌 種に対する、ペプチド１、8、１２、１４、およびメリチン、ダーマセプチンＳ およびテトラサイクリンのＭＩＣ（μＭ）を与える。データにより、ジアステレ オマー類似体１〜７のαらせん含量と溶血活性の劇的低下にもかかわらず、これ らは全て、親ペプチドのパーダキシンの強力な抗菌活性をほぼ保持しており、こ の活性は、既知の未変性抗菌性ペプチドに匹敵することが明らかになった。 １．４ パーダキシン由来ペプチドにより誘導される膜不安定化。これまで研究 された全てのαらせんの正に荷電した天然の抗菌性ペプチドに共通の性質は、双 性イオン性リン脂質とよりも、負に荷電したリン脂質と大きく相互作用して透過 するこれらの能力である。これらの知見のその生物学的標的膜への関連は、細菌 の表面が、リポ多糖類（グラム陰性細菌のＬＰＳ）、および多糖類（グラム陽性 細菌のテイコ酸）（両方とも酸性である）を含有し、一方正常哺乳動物細胞（例 えば、赤血球）は、その外側リーフレット上に主として双性イオン性リン脂質の ＰＣを発現するという事実にある。ＰＣおよびＰＣ／ＰＳリン脂質小胞（実験方 法、セクションｖにより調製）の両方に及ぼすペプチドの膜透過活性を評価する ための拡散ポテンシャルの消失は、実験方法、セクションxiに記載されたように 測定した。ペプチド１、８、１２、１４に関する図３に示される結果は、パーダ キシン中に導入されたＤ−アミノ酸が、リン脂質膜を透過するペプチドの能力に 有意に影響しなかったことを示している。しかし、溶血活性は全くないが抗菌活 性を保持している唯一のジアステレオマーであるペプチド１は、双性イオン性リ ン脂質よりも、負に荷電したリン脂質を有意に透過しやすい。ペプチド１は、α らせん構造を欠いているが、それ自体未変性抗菌性ペプチドと同様にふるまう。 ペプチド１２および１４で顕著な中間的な活性がなかったことは、これら両方と もが、疎水性相互作用による両方の型の小胞への強力な結合を促進するのに充分 な、疎水性Ｎ−らせんまたは未処理の両親媒性Ｃ−らせんのいずれかを有すると いう事実により説明することができよう。 １．５ 電子顕微鏡を使用する細菌の細胞溶解の視覚化。未処理の細菌および処 理細菌の形態に及ぼすパーダキシン由来ペプチドの作用は、実験方法、セクショ ンxxに記載されたように、ネガティブ染色電子顕微鏡を使用して視覚化した。ペ プチドは、抗菌性測定法（上記例１．３を参照のこと）に使用されたのと同じ条 件下で、これらのＭＩＣ濃度またはそれ以下で細菌に加えた。１８時間インキュ ベーション後に試料を取り出し、直ちに固定して透過型電子顕微鏡により検査し た。図４は、一例として非溶血性類似体の１（［Ｄ］Ｐ⁷Ｌ¹⁸Ｌ¹⁹−ＴＡｐａｒ ）により得られた写真を示す。ＭＩＣではペプチド１は細菌を完全に溶解するこ とが見い出され、小断片のみが観察できた（図４Ｃ）。しかしＭＩＣより低い 濃度では、細菌の細胞壁にパッチが観察された（図４Ｂ）。これらのパッチは、 細胞分解過程に関与する初期工程を示しているかもしれない。例２．メリチン由来ジアステレオマーの合成および生物学的活性 ２．１ 合成。哺乳動物細胞および細菌に対するその細胞毒性におけるαらせん 構造の役割をさらに試験するため、およびこの効果の基になる機構への洞察を得 るため、メリチン（ｍｅｌ）の４つのジアステレオマーを合成した。 メリチンは、以下の配列： の２６量体ペプチドである。 正電荷を導入するためのメリチン分子の修飾は、エチレンジアミンとのＣ末端 のカルボキシル基の反応により、メリチンまたはその断片の酸性Ｃ末端を正の末 端に変換することにより行った［メリチンジアステレオマーでは、メリチンの５ および８位の２つのＶａｌ残基、１７位のＩｌｅ残基および２１位のＬｙｓ残基 を、それぞれＤ−Ｖａｌ、Ｄ−ＩｌｅおよびＤ−Ｌｙｓで置換することにより、 Ｎ−らせんおよびＣ−らせんが改変されている（本明細書では［Ｄ］−Ｖ⁵Ｖ⁸Ｉ¹⁷ Ｋ²¹）］。 以下のメリチン由来ジアステレオマーは、非溶血性であり、選択的細胞溶解活 性を示すことが判った（太字および下線の残基はＤ−アミノ酸である）： ペプチド１８〜２１は次に、その構造、生物学的機能、および細菌および双性 イオン性リン脂質または負に荷電したリン脂質のいずれかからなるモデル膜との 相互作用に関して性状解析した。 ２．２ ＣＤ分光学。ペプチド１８および１９のαらせん構造の含量は、４０％ ＴＦＥ（αらせん構造を強力に促進する溶媒）中のこれらのＣＤスペクトルから 求めた。予想されるように、２０８および２２２nmでの最小値により示されるよ うに、ジアステレオマーのαらせん含量はメリチンの含量よりもはるかに低かっ た（８０％低下）（図５）。メリチンのαらせん含量は、７３％であり、これに 対してジアステレオマーの１８および１９では、それぞれ１５％および７％であ った。 ２．３ メリチンジアステレオマー１８〜２１の抗菌活性および溶血活性。 ｈＲＢＣに対するペプチド１８〜２１の溶血活性、および異なる種の細菌の増殖 を阻害するこれらの能力を検討した。抗菌性測定法では抗生物質のテトラサイク リンを対照とした。ペプチドの溶血活性についての用量作用曲線が得られた（図 ６）。表３は、代表的なセットの試験細菌に対するＭＩＣを与える。メリチンへ のＤ−アミノ酸の導入は、その溶血活性を劇的に低下させ、そしてその低下は、 対応する類似体のαらせん含量の低下分に平行したことが判る。αらせん含量が 最も高いメリチンは、最も溶血性であり、一方試験した最高濃度（５０μＭ）ま でで、αらせん含量が最も低いペプチド１８および１９は、事実上溶血活性がな かった。しかし、メリチンジアステレオマー１８および１９の溶血活性の劇的な 低下にもかかわらず、これらは親ペプチドの強力な抗菌活性をほぼ保持していた 。さらには、ペプチド１９の抗菌活性は、１８の活性よりもわずかに低いのみで あり、このことは、メリチンのＣ末端のアミド基が、抗菌活性に顕著に寄与して いないことを示している。これとは対照的に、遊離カルボン酸Ｃ末端を有するケ クロピンは、アミド化Ｃ末端を有する未変性ケクロピンよりも著しく低い抗菌活 性 を有することが知られている（リー（Ｌｉ）ら、１９８８）。２．４ 細菌の溶解の電子顕微鏡による検討。未処理の細菌および処理細菌の形 態に及ぼすペプチド１８の作用は、透過型電子顕微鏡を使用して視覚化した。図 ７に示されるように、ＭＩＣでペプチド１８は細菌の完全な溶解を引き起こした （図７Ｃ）。しかしＭＩＣより低い濃度では、細菌の細胞壁にパッチが観察され た（図７Ｂ）。これらのパッチは、細胞溶解過程における最初の工程を表すもの であろう。 ２．５ リン脂質膜との相互作用の様式。ペプチド１８および１９の生物学的活 性は同様であるため、モデルリン脂質膜とのペプチド１８の相互作用の様式のみ をメリチンと比較して、観察される膜選択性の根本原理を解明しようとした。こ の目的のために、ＰＣおよびＰＣ／ＰＳ小胞の両方で造り出される拡散ポテンシ ャルを消失させるペプチドの能力を測定し、両方の型の小胞とのペプチドの分配 係数、および膜に結合しているときにはペプチドの局在を求めた。 ２．５．１ ペプチドにより誘導される膜透過性。種々の濃度のメリチンおよび ペプチド１８を、蛍光染料のｄｉＳ−Ｃ₂−５とバリノマイシンで前処理した小 胞と混合した。蛍光回収の動態を経時的にモニターして、ペプチド濃度の関数と して到達した最大レベルを求めた。図８に示されるように、メリチンもペプチド １８もＰＣ／ＰＳ小胞では同様な膜透過活性であり、このことは、メリチンへの Ｄ−アミノ酸の導入が、負に荷電したリン脂質（ＰＳ／ＰＣ）膜に透過する生じ たジアステレオマーの能力に影響しないことを証明した。しかし、メリチンはＰ Ｃ小胞でも非常に活性であったが、ジアステレオマーはＰＣ小胞での膜透過活性 は（試験した最高濃度までで）全くなかった。 ２．５．２ 結合試験。ジアステレオマー１８がＰＣ小胞に透過できないのは、 それがＰＣに結合することができないためか、あるいはＰＣ小胞には結合するが 、一旦結合したら、膜の漏出を誘導する構造に組織化することができないためで ある。これら２つの可能性を区別するために、結合試験を行った。ペプチド１８ の１９位の１つのＴｒｐ残基を内部蛍光プローブとして使用して、ＰＣおよびＰ Ｃ／ＰＳ小胞へのその結合を追跡した。固定濃度（〜０．５μＭ）のペプチドを 目的の小胞（ＰＣまたはＰＣ／ＰＳ）で滴定し、結合が起これば蛍光強度の増大 が観察された。脂質：ペプチドモル比の関数として、生じるＴｒｐの蛍光強度の 増 大をプロットすると、通常の結合曲線が得られた（図９Ａ）。ＰＣ／ＰＳとのペ プチド１８の結合曲線は、ほぼ全てのペプチド分子が、１００：１の脂質：ペプ チドモル比で小胞に結合したことを明らかにしている。しかしＰＣ小胞では、試 験した最大の脂質：ペプチドモル比でさえも、Ｔｒｐの蛍光の正味の増大は観察 されなかったが、このことは、ペプチドがＰＣ小胞に結合しないことを示してい る。結合等温線は、Ｃ_f（溶液中の遊離ペプチドの平衡濃度）に対してＸ^* _b （６０％の全脂質当たりの結合ペプチドのモル比）をプロットすることにより作 製した（図５Ｂ）。表面分配係数は、ゼロのＣ_f値に対する曲線の最初の傾きを 外挿することにより推定した。ペプチド１８の推定表面分配係数Ｋ_P ^*は、１． １±０．２×１０⁴Ｍ^-1であった（４回の測定から得られた）。この値は、ホス ファチジルグリセロール／ホスファチジルコリンへのメリチンの結合について報 告された値（４．５±０．６×１０⁴Ｍ^-1）と類似している（ベシアスクビリ （Beschiaschvili）とシーリグ（Seelig）、１９９０）。 ペプチドの結合等温線の形は、膜内のペプチドの組織化に関する情報を提供し うる（シュバルツ（Schwarz）ら、１９８７）。ペプチド１８の結合等温線は、 下降しているが、これは、負の協同性を示している。この負の協同性の可能な説 明は、低濃度ではＰＳ／ＰＣへのペプチド１８の結合が、電荷作用なしの分配平 衡に比較して、リン脂質の頭部の基の負電荷により増強されることである。加え て、膜への結合により、ペプチドは負の膜表面電荷を部分的に中和する。しかし 、一旦膜表面電荷が中和されると、同類電荷の反発が優勢な因子になるため、さ らなるペプチド１８の結合は困難になる。負に荷電したリン脂質膜へのメリチン の結合の試験において同様な結果が得られた（バテンバーグ（Batenburg）ら、 １９８７；ベシアスクビリ（Beschiaschvili）とシーリグ（Seelig）、１９９０ ）。興味深いことに、ＰＣ小胞にも強力に結合する（クチンカ（Kuchinka）とシ ーリグ（Seelig）、１９８９）メリチンとは異なり、ペプチド１８は、ＰＣ小胞 には結合しなかった。 ２．６ トリプトファンのクエンチング実験。タンパク質またはペプチドの配列 に元々存在するトリプトファン残基は、膜内のペプチドの局在についての内部プ ローブとして作用させることができる。メリチンは、Ｃ−らせんのＮ末端側の １９位にトリプトファン残基を含有する。メリチンとペプチド１８の両方により 、トリプトファン蛍光の最大クエンチングは、６，７−Ｂｒ−ＰＣ／ＰＳ小胞で 観察された（図１０）。次に大きなクエンチングは、９，１０−Ｂｒ−ＰＣ／Ｐ Ｓで観察され、最も少ないクエンチングは、１１，１２−Ｂｒ−ＰＣ／ＰＳで観 察された。これらの結果は、小胞への結合によりペプチドがリン脂質の頭部の基 の近くに配置されることを示している。例３．モデルＬｙｓ／Ｌｅｕジアステレオマーの合成および生物学的活性 ３．１ Ｌｙｓ／Ｌｅｕジアステレオマーの設計。リジンとロイシンの種々の比 よりなる短い線状モデルの１２量体ペプチドの６つのジアステレオマーを合成し て、（１）疎水性と正味の正電荷の間の均衡が、選択的な細菌の溶解に必要な充 分な基準であるかどうかを試験し、そして（２）この作用の基になる機構への洞 察を得ようとした。 第１シリーズのモデルＬｙｓ／Ｌｅｕ １２量体ペプチド２２〜２５において 、これらの配列の３分の１は、Ｄ−アミノ酸残基からなる。Ｄ−アミノ酸の位置 は、αらせん構造の最大の分裂のために作成された全てのペプチドにおいて不変 のままであった。Ｄ−アミノ酸は、ペプチドにそって配置され、１〜３個の連続 Ｌ−アミノ酸の非常に短いストレッチのみが残った。下記ペプチドを合成した： 第２シリーズのモデルＬｙｓ／Ｌｅｕ １２量体ペプチド２６〜２７では、以 下のように、これらの配列の３分の２がＤ−アミノ酸残基からなり、その位置は ペプチド２３および２４のちょうどL−アミノ酸残基の位置である： 第３シリーズのモデルＬｙｓ／Ｌｅｕペプチドでは、６量体および８量体ジア ステレオマーを合成した（それぞれ、ペプチド２８および２９）： 合成した本発明のさらなるＬｙｓ／Ｌｅｕジアステレオマー： ３．２ Ｌｙｓ／Ｌｅｕジアステレオマーの合成。 実験方法、セクション（ii ）に記載されたように、ペプチドを合成した。次にその構造、生物学的機能、お よび細菌および双性イオン性リン脂質または負に荷電したリン脂質のいずれかか らなるモデル膜との相互作用に関してペプチドを性状解析した。 ３．３ 疎水性。ペプチド２２〜２５の疎水性と正味の正電荷は、表４にリスト される。疎水性の平均値は、疎水性スケールのコンセンサス値を使用して計算し た（アイゼンバーグ（Eisenberg）ら、１９８４）。図１１に示されるように、 ペプチドの疎水性と保持時間の間には正の相関が見い出され、このことは、この 構造が、固定相との全体的な疎水性相互作用に顕著に寄与しないことを示唆して いる。 表４ Ｌｅｕ／Ｌｙｓジアステレオマーの疎水性と正味の正電荷 ペプチド名称 正味の電荷 疎水性 ２２． +4 0.12 ２３． +5 -0.01 ２４． +6 -0.15 ２５． +8 -0.42 ３．４ ＣＤ分光学。ジアステレオマー２２〜２５のαらせん構造の含量は、４ ０％ＴＦＥ中のそのＣＤスペクトルから求めた。予想されるように、Ｄ−アミノ 酸の組み込み後には、全てのジアステレオマーでシグナルが観察されなかったが 、このことは、どんな特異的な二次構造も存在しないことを証明している（デー タは示していない）。最近の研究において、ペプチド２３の配列と同一の配列を 有するが、Ｌ−アミノ酸だけからなるペプチドは、メタノール中およびＤＭＰＣ 小胞中で約４０％のαらせん構造を有することが見い出されたことに注意された い（コーナット（Cornut）ら、１９９４）。 ３．５ ペプチド２２〜２９の抗菌活性および溶血活性。ｈＲＢＣに対するペプ チド２２〜２９の溶血活性を試験した。ペプチド２２〜２５の溶血活性について の用量作用曲線を図１２に示すが、ここで、メリチンの溶血活性を対照とした。 ジアステレオマーの疎水性（表４）と溶血活性の間に正の相関が見い出された。 疎水性の最も高いペプチド２２（［Ｄ］−Ｌ^3,4,8,10−Ｋ₃Ｌ₉）は、最も溶血性 のペプチドであった。しかしその溶血活性は、メリチンに比較して非常に低い（ ＞６０倍弱い活性）。他の全てのペプチドは、試験した最高濃度（１００μＭ） まで著しい溶血活性は示さなかった。ペプチド２２〜２９の溶血活性は、表５に 示される。ペプチド２３（［Ｄ］−Ｌ^{3、4、8、10}−Ｋ₄Ｌ₈）は、メリチンによる顕 著な溶血に必要な濃度の＞１００倍の濃度で溶血性でないが、その全部がＬ− アミノ酸である型は、最近の研究でメリチンと同様な溶血活性（〜５倍弱い）を 有することが証明されたことに注意されたい（コーナット（Cornut）ら、１９９ ４）。 ペプチド２２〜２９は、代表的なセットの細菌に対する抗菌活性についても試 験したが、ここで、テトラサイクリン、ダーマセプチンＳ、およびメリチンを対 照として使用した。結果のＭＩＣは、表５に示される。データは、ジアステレオ マー２２〜２９の抗菌活性が、疎水性と正に荷電したアミノ酸の間の均衡により 調節されることを示している。最も疎水性のペプチド２２と最も親水性のペプチ ド２５の両方とも、最も低い範囲の抗菌活性を示した（表５）。しかし、ペプチ ド２３および２４は、試験した細菌の大部分に対して高い抗菌活性を示したが、 前者の方がわずかに強力であった。さらに、各ペプチドは、抗菌活性の独特のス ペクトルを持ち、そしてそれぞれがグラム陰性細菌に比べてグラム陽性細菌に対 して活性が高かった。 ３．６ 血清中のテトラサイクリンとＬｙｓ／Ｌｅｕジアステレオマーの間の相 乗作用。抗生物質のテトラサイクリンとジアステレオマーの間の相乗作用的関係 の可能性を調査するために、一定の等モル濃度（１μＭ）のペプチド２４ （［Ｄ］−Ｌ^3,4,8,10−Ｋ₅Ｌ₇）の存在下で、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）（ＡＴＣＣ２７８５３）に対して２倍連続希釈でテトラサイクリン を試験した。この混合物の抗菌活性は、実験方法、セクション（xii）に記載さ れたように測定した。 テトラサイクリンとジアステレオマー２４の間に相乗作用が観察された。テト ラサイクリンは、緑膿菌（P．aeruginosa）に対してほとんど活性を示さない。 しかしペプチド２４の１μＭ溶液（緑膿菌（P．aeruginosa）に対する溶解活性 に必要な濃度の１０倍低い濃度）と混合すると、テトラサイクリンの活性の８倍 上昇が観察された（表６）。相乗作用の可能な説明は、ペプチドが細菌の細胞壁 を僅かに破壊し、これにより細菌中へのテトラサイクリンの分配が改善されたと いうことである。この説は、そのＭＩＣ未満でペプチド２４が細菌の細胞壁の形 態的な変化を引き起こすことを示す電子顕微鏡検査により支持される（図１４） 。加えて、ペプチド２４および未変性抗菌性ペプチドのダーマセプチンの、緑膿 菌 （P．aeruginosa）と大腸菌（E．coli）に対する抗菌活性に及ぼすプールしたヒ ト血清の作用は相当異なることが見い出された（表６）。ダーマセプチンは血清 の存在下では８〜１０倍活性が弱かったが、ペプチド２４は、その抗菌活性を保 持した。 ａ．結果は、それぞれ二重測定で行った２回の独立実験の平均であり、標準偏差 は２０％である。 ｂ．Ｔｃ−テトラサイクリン ３．７ ペプチド誘導性膜透過。 種々の濃度のペプチドは、蛍光染料のｄｉＳ −Ｃ₂−５およびバリノマイシンで前処理した小胞と混合した。蛍光回収の動態 をモニターして、ペプチド濃度の関数として最大蛍光レベルを求めた（図１３） 。ＰＣ／コレステロール小胞（１０：１）は赤血球外側リーフレットのリン脂質 組成のモデルとし（バークレイジ（Verkleij）ら、１９７３）、そしてＰＥ／Ｐ Ｇ小胞（７：３）は、大腸菌（E．coli）のリン脂質組成を模倣するために使用 した（ショー（Shaw）、１９７４）。モデルリン脂質膜を透過するペプチドのポ テンシャルと、赤血球と大腸菌（E．coli）に対するその溶解活性との間に正の 相関が見い出された。溶血性ペプチド２２だけが、双性イオン性リン脂質小胞を 透過した。さらに、ＰＥ／ＰＧ小胞を透過するペプチドの能力は、大腸菌（E. coli）に対するペプチドの抗菌活性と相関する（表５）。抗菌活性が最も低いペ プチド２５はまた、他の３つのペプチド２２〜２４に比較してＰＥ／ＰＧ小胞を 透過する能力も著しく低くなっていた。 ３．８ 細菌の細胞溶解の電子顕微鏡試験。処理大腸菌（E．coli）の形態に及 ぼすジアステレオマー２２〜２５の作用は、透過型電子顕微鏡を使用して視覚化 した。全てのペプチドが、ＭＩＣで細菌の細胞溶解を引き起こした（データは 示していない）。しかしそのＭＩＣの８０％に相当する濃度でペプチドを使用す ると、使用したペプチドに応じて処理細菌の形態に幾らかの相違が観察された。 最も疎水性のペプチド２２は、細胞壁と細胞膜に最も大きな損傷を引き起こし、 一方最も疎水性の小さいペプチド２５は、局所的な動揺を引き起こしただけだっ た（図１４）。 例４．モデルＬｙｓ／ＡｌａおよびＬｙｓ／Ｖａｌジアステレオマーの合成およ び生物学的活性。 ４．１ ジアステレオマーの設計。線状細胞毒性ペプチドの疎水性と正味の正電 荷の調節が、選択的抗菌活性を付与するのに充分であるかどうかをさらに試験す るために、それぞれ、Ｌｙｓ／ＡｌａまたはＬｙｓ／Ｖａｌ残基からなる、２つ のさらに別のモデルの１２量体ペプチドの３３および３４〜３７（これらの配列 の少なくとも３分の１は、Ｄ−ＡｌａまたはＤ−Ｖａｌ残基である）を合成した ： ４．２ 合成。Ｌｙｓ／ＡｌａおよびＬｙｓ／Ｖａｌジアステレオマーは、実験 方法、セクション（ii）に記載されたように合成した。 ４．３ 抗菌活性および溶血活性。ペプチド３３および３４は、大腸菌（E. coli）と巨大菌（B．megaterium）、およびｈＲＢＣに対して試験した。表７の 結果は、両方のモデルジアステレオマーが抗菌性で非溶血性であることを示して いる：例５．さらなるモデルジアステレオマーの合成 ２つ、３つまたはそれ以上の異なるアミノ酸の６、８、１２、１４、１６、１ ９、２５、２６および３０残基の配列からなる、本発明の下記のモデルジアステ レオマーを合成した： 例６．環状ジアステレオマーの合成および生物学的活性。 ６．１ 設計。Ｎ−およびＣ末端の両方にシステイン残基を有するパーダキシン 断片のジアステレオマーの下記の環状誘導体を合成した： Ｎ−およびＣ末端の両方にシステイン残基を有する異なるアミノ酸残基のジア ステレオマーの下記の環状誘導体を合成した： ６．２ 環状ジアステレオマーの合成。ペプチドのＮおよびＣ末端の両方にシス テイン残基を有する、環状ペプチドは、実験方法、セクション（ii）に記載され たように固相法により合成した。ＨＦ切断およびＲＰ−ＨＰＬＣ精製後、ＰＢＳ （ｐＨ７．３）中に低濃度でペプチドを可溶化して、１２時間後に環化を終了し た。この環状ペプチドは、ＲＰ−ＨＰＬＣでさらに精製して、アミノ酸分析に 付してその組成を確認し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりそのモノマーオー状態を確認 した。６．３ 抗菌活性および溶血活性。ペプチド８６〜８８は、大腸菌（E．c oli）と巨大菌（B．megaterium）、およびｈＲＢＣに対して試験した。表８の結 果は、３つ全ての環状パーダキシン由来ジアステレオマーが抗菌性で非溶血性で あることを示している： 例７．束になったＬｙｓ／Ｌｅｕペプチドジアステレオマーの合成および生物学 的活性。 ７．１ 設計。鋳型としてペプチド２３を、そしてモノマーとしてＣ末端に追加 のシステイン残基を有するペプチド２３または２４（それぞれ、２３Ｃおよび２ ４Ｃ）を使用して、下記の束配列を生成した： ７．２ 合成。 鋳型結合ジアステレオマーを生成するために、１：１モル比の ＤＣＣとブロモ酢酸をＤＭＳＯ中で２５℃で１時間反応させた。鋳型（ペプチド ２３）を反応混合物に加えて、１２時間撹拌し、次にＤＭＳＯを凍結乾燥した。 残ったブロモ酢酸を無水エーテルで抽出した。次に、過剰のＣ末端にシステイン 残基を有するジアステレオマー２３Ｃおよび２４Ｃと鋳型をＰＢＳ（ｐＨ７．３ ）中で２５℃で１時間反応させた。鋳型結合ジアステレオマー９２および９３は 、ＲＰ−ＨＰＬＣでさらに精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで試験してその凝集状態を 確認した。 ７．３ 抗菌活性および溶血活性。鋳型結合ジアステレオマー９２および９３は 、大腸菌（E．coli）と巨大菌（B．megaterium）、およびｈＲＢＣに対して試験 した。表９の結果は、両方の束配列が抗菌性で非溶血性であることを示している ： 例８. 親水性Ｌｙｓ／Ｌｅｕ １２量体ペプチドジアステレオマーの混合物の 合成および生物学的活性。 ペプチドは、上記実験方法、セクション（ii）に記 載されたように、固相法により合成した。各カップリング工程で、各１当量のリ ジン、ロイシンおよびＤ−ロイシンからなる混合物を反応物に加えた。合成によ り、３¹²個の異なるペプチドの混合物が生じた。ＨＦ切断後、親水性ペプチドを ２回蒸留水（ｄｄｗ）で抽出して凍結乾燥した。 Ｌｙｓ／Ｌｅｕ １２量体ペプチドジアステレオマーの親水性混合物は、大腸 菌（E．coli）Ｄ２１（ＭＩＣ：１５μg/ml）と巨大菌（B．megaterium）Ｂｍ１ １ Ｄ２ｌ（ＭＩＣ：３μg/ml）、およびｈＲＢＣ（１００μＭで溶血０％）に 対して試験した。予想されるように、この親水性混合物は、抗菌活性があるが、 非溶血性であった。 例９． Ｌｙｓ／Ｌｅｕ／Ｄ−Ｌｅｕランダムコポリマーの合成および生物学的 活性。異なるサイズのポリマーのジアステレオマーを生成するために、開始剤の 遊離アミノ酸よりも過剰のＮ−カルボキシ無水物残基をＤＭＦ中で２５℃で４時 間重合させた（カッチャルスキー（Katchalski）とセーラ（Sela）、１９５８） 。異なる比のリジン、ロイシンおよびＤ−ロイシンからなるポリマーは、異なる 比のリジン−Ｎ−カルボキシ無水物、ロイシン−Ｎ−カルボキシ無水物およびＤ −ロイシン−Ｎ−カルボキシ無水物を使用して生成した。このような３種のポリ マーおよびその抗菌活性と溶血活性は、表１０に示される。 例１０． ジアステレオマーの抗真菌活性 以下のように、１００μＬの最終容 量にして、滅菌９６ウェルプレート（ヌンク（Nunc）Ｆ９６マイクロタイタープ レート）中でパーダキシン由来ペプチド１および１６（上記例１を参照のこと） の抗真菌活性を試験した：培地（サブロー（Sabouraud's）グルコースブロス培 地）中に１×１０⁶コロニー形成単位（ＣＦＵ）/mlの濃度で真菌を含有する５０ マイクロリットルの懸濁液を、水に連続２倍希釈したペプチドを含有する５０μ Ｌの水に加えた。増殖の阻害は、３０℃で４８時間のインキュベーション時間の 後に、マイクロプレート(Microplate)自動リーダーＥ１３０９（バイオテックイ ンストラメンツ（Bio-tek Instruments））で４９２nmの吸光度を測定すること により求めた。抗真菌活性は、最小阻止濃度（ＭＩＣ）（４８時間のインキュベ ーション後、増殖の１００％阻害が観察された濃度）として表した。使用した真 菌は、カンジダアルビカンス（Candida albicans）（ＩＰ８８６−６５）とクリ プトコッカスネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）（ＩＰ９６０ −６７）とした。表１１に示されるように、ペプチド１および１６の両方とも抗 真菌活性を示した。 例１１． ジアステレオマーの抗癌活性。Ｌｙｓ／Ｌｅｕジアステレオマー２３ および２４（上記例３を参照のこと）の抗癌活性は、マウス腺癌に対して試験し た。ダルベッコー修飾イーグル培地で９６ウェルマイクロタイタープレートに５ 〜１００００個／ウェルで細胞を接種した。細胞の付着後、２０μｌの標準生理 食塩水中の希釈ペプチド溶液をウェルに移して、２０〜１５０μＭの最終濃度範 囲とした。ペプチドと共に１時間のインキュベーション後、癌細胞の生存力は、 トリパンブルー（Trypan blue）（０．１％、ｗ／ｖ）生命染色測定法により測 定した。対照実験では、ペプチド溶媒を単独で細胞に加えた。抗癌活性は、最小 阻止濃度（ＭＩＣ）（１時間のインキュベーション後に増殖の１００％阻害が観 察された濃度）として表した。表１２の結果は、両方のペプチドが、悪性細胞に 対して活性であることを示している。 例１２． リーシュマニアメキシカーナ（Leishmania mexicana）に対するジア ステレオマーの活性。メリチン由来ジアステレオマーペプチド２０（上記例２を 参照のこと）およびＬｅｕ／Ｌｙｓジアステレオマーペプチド２３（上記例３を 参照のこと）はリーシュマニア（Leishmania）に対して試験した。測定されるリ ーシュマニアメキシカーナ（Leishmania mexicana）ＮＲ株のプロマスティゴー ト（promastigotes）は、１０％ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地 で２７℃で培養した。寄生体は、ｌ２００×ｇで４℃で１０分間の遠心分離によ り回収して、ＰＢＳ（５０mMリン酸ナトリウム、１５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ７） で２回洗浄した。洗浄したプロマスティゴートは、血球計で計測し、１×Ｉ０⁶ 寄生体/mlに調整した。この懸濁液のアリコートは、１００μｌの最終容量で、 種々の濃度のジアステレオマーの非存在下または存在下で２６℃で２４時間のイ ンキュベーション後に生存（運動）細胞を計測することにより測定した。抗リー シュマニア（Leishmania）活性は、最小阻止濃度（ＭＩＣ）（２４時間のインキ ュベーション後１００％死滅が観察された濃度）として表した。ペプチド２３で はＭＩＣは１７μＭであり、ペプチド２０ではＭＩＣは３２μＭであることが判 った。 例１３． ジアステレオマー２３の抗ウイルス活性 センダイウイルス（Ｚ株） は、１０〜１１日齢の孵化鶏卵の尿膜包で増殖させ、注入の４８時間後に回収し て精製した。このウイルスは、ｌ６０mM ＮａＣｌ、２０mM トリシン（ｐＨ７ ．４）からなる緩衝液に再懸濁して、−７０℃で保存した。ウイルスの血球凝集 活性は、血球凝集単位（ＨＡＵ）で測定した。１マイクロリットルは、〜６００ ００ＨＡＵを含んでいた。新鮮ヒト血液を血液銀行から入手して、４℃で１ヶ月 まで保存した。使用前に、赤血球をＰＢＳ（ｐＨ７．２）で２回洗浄し、同じ緩 衝液で目的濃度（％、ｖ／ｖ）まで希釈した。ビリオン、赤血球およびペプチド を異なる順の添加および種々の量で混合した。最終インキュベーションは、常に ３７℃で６０分とし、次いで５７００ｇで１０分間遠心分離して無傷の細胞を取 り出した。全ての場合に二重測定試料を使用して、各試料の上清から２つのアリ コートをとって９６ウェルプレートの２つのウェルに入れた。ヘモグロビン放出 の量を、５４０nmのＥＬＩＳＡプレートリーダーでウェルの吸光度を測定するこ とによりモニターした。抗ウイルス活性は、最小阻止濃度（ＭＩＣ）（インキュ ベ ーション後、ヘモグロビンの放出が観察されなかった濃度）として表した。Ｌｙ ｓ／Ｌｅｕジアステレオマーペプチド２３ではＭＩＣは８０μＭであることが判 った。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９８年２月１８日（１９９８．２．１８） 【補正内容】 請求の範囲 １．病原性細胞（病原性生物および悪性細胞からなる、体内では自然に存在し ない細胞）に対する細胞溶解活性を有すること；および、非溶血性であること、 すなわち、赤血球に対する細胞溶解作用がないか、または該細胞溶解活性を表す 濃度よりも実質的に高い濃度で赤血球に対する細胞溶解作用を有すること、によ り表される選択的細胞溶解活性を有するペプチドであって、 以下の特徴： （ａ）（ａａ）Ｌ−アミノ酸残基とＤ−アミノ酸残基の両方を含むペプチド、ま たは （ａｂ）Ｌ−アミノ酸残基とＤ−アミノ酸残基の１つまたは両方を含み、か つαらせん破壊部分を含むぺプチド であること； （ｂ）このペプチドが、＋１より大きな正味の正電荷を有すること；および （ｃ）このペプチドが、両親媒性であること、 を有する、上記ペプチド。 ２．（ｉ）αらせん構造がないか、 （ii）細胞膜の幅にまたがるには不足する長さの非末端αらせん構造を有するか 、または （iii）（ii）で定義されたαらせん構造の長さの半分未満の長さを有する末端 αらせん構造を有するか、 のいずれかである、請求の範囲第１項に記載のペプチド。 ３．病原性細胞に対する選択的細胞溶解活性（この選択性は、ペプチドが、正 常な非病原性細胞の細胞溶解を誘導する濃度よりもはるかに低濃度で病原性細胞 の細胞溶解を誘導することにより表される）を有する、請求の範囲第１項または 第２項のいずれか１項に記載のペプチド。 ４．細菌、ウイルス、真菌、原生動物およびマイコプラズマの病原性細胞に対 する細胞溶解活性を有する、請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載の ペプチド。 ５．細菌に対する細胞溶解活性を有する、請求の範囲第４項に記載のペプチド 。 ６．Ｌ−またはＤ−アミノ酸残基のみを含んでなり、該ペプチドと同じアミノ 酸配列を有する同種ペプチドは、αらせん立体配置を有し、かつ種々の細胞で表 される広域スペクトル細胞溶解活性を有するような配列を有するＤ−およびＬ− アミノ酸残基の両方を含んでなる、請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１項に 記載のペプチド。 ７．パーダキシンまたはその断片から誘導されるジアステレオマーである、請 求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載のペプチド。 ８．＋１より大きな正味の正電荷は、元のアミノ酸組成によるか、または遊離 カルボキシル基の中和または正に荷電したアミノ酸残基および／または正に荷電 した化学基の付加により達成される、請求の範囲第７項に記載のペプチド。 ９．Ｎ末端にＬｙｓ残基を付加したか、および／またはＣ末端にアミノエチル アミノ基を付加した、パーダキシンまたはその断片のジアステレオマーから選択 される、請求の範囲第８項に記載のペプチド。 １０．配列： の、本発明でペプチド１〜７と称されるパーダキシン由来ペプチドから選択され る、請求の範囲第９項に記載のペプチド。 １１．メリチンまたはその断片から誘導されるジアステレオマーである、請求 の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載のペプチド。 １２．配列：の、本発明でペプチド１８〜２１と称される、メリチン由来ペプチドから選択さ れる、請求の範囲第１１項に記載のペプチド。 １３．配列： の、本発明でペプチド２３と称される、Ｌｅｕ／Ｌｙｓジアステレオマーである 、請求の範囲第１項に記載のペプチド。 １４．請求の範囲第１項〜第１３項のいずれか１項に記載の非溶血性細胞溶解 性ペプチド、および薬剤学的に許容しうる担体を含んでなる、薬剤組成物。 １５．病原性生物により引き起こされる感染症の治療に使用するための、請求 の範囲第１４項に記載の薬剤組成物。 １６．病原性生物は、細菌、真菌、原生動物、マイコプラズマおよびウイルス から選択される、請求の範囲第１５項に記載の薬剤組成物。 １７．癌の治療に使用するための、請求の範囲第１４項に記載の薬剤組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 33/00 Ａ６１Ｋ 31/00 ６３３ 35/00 ６３５ Ａ６１Ｋ 38/00 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．病原性細胞（病原性生物および悪性細胞を包含する、体内では自然に存在 しない細胞）に対する細胞溶解活性を有すること；および、非溶血性であること 、すなわち、赤血球に対する細胞溶解作用がないか、または該細胞溶解活性を表 す濃度よりも実質的に高い濃度で赤血球に対する細胞溶解作用を有すること、に より表される選択的細胞溶解活性を有するペプチドであって、 以下の特徴： （ａ）非選択的細胞溶解性天然ペプチドから誘導され、 （ａａ）Ｌ−アミノ酸残基とＤ−アミノ酸残基の両方を含むペプチド、また は （ａｂ）Ｌ−アミノ酸残基とＤ−アミノ酸残基の１つまたは両方を含み、か つαらせん破壊部分を含むペプチド であること； （ｂ）このペプチドが、＋１より大きな正味の正電荷を有すること；および （ｃ）このペプチドが、両親媒性であること、 を有する、上記ペプチド。 ２．（ｉ）αらせん構造がないか、 （ii）細胞膜の幅にまたがるには不足する長さの非末端αらせん構造を有するか 、または （iii）（ii）で定義されたαらせん構造の長さの半分未満の長さを有する末端 αらせん構造を有するか、 のいずれかである、請求の範囲第１項に記載のペプチド。 ３．病原性細胞に対する選択的細胞溶解活性（この選択性は、ペプチドが、正 常な非病原性細胞の細胞溶解を誘導する濃度よりもはるかに低濃度で病原性細胞 の細胞溶解を誘導することにより表される）を有する、請求の範囲第１項または 第２項のいずれか１項に記載のペプチド。 4．細菌、ウイルス、真菌、原生動物およびマイコプラズマの病原性細胞に対 する細胞溶解活性を有する、請求の範囲第１項または第２項に記載のペプチド。 ５．細菌に対する細胞溶解活性を有する、請求の範囲第４項に記載のペプチド 。 ６．Ｌ−またはＤ−アミノ酸残基のみを含んでなり、該ペプチドと同じアミノ 酸配列を有する同種ペプチドは、αらせん立体配置を有し、かつ種々の細胞で表 される広域スペクトル細胞溶解活性を有するような配列を有するＤ−およびＬ− アミノ酸残基の両方を含んでなる、請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１項に 記載のペプチド。 ７．パーダキシンまたはその断片および前記の環状誘導体から誘導されるジア ステレオマーである、請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載のペプチ ド。 ８．＋１より大きな正味の正電荷は、元のアミノ酸組成によるか、または遊離 カルボキシル基の中和または正に荷電したアミノ酸残基および／または正に荷電 した化学基の付加により達成される、請求の範囲第７項に記載のペプチド。 ９．Ｎ末端にＬｙｓ残基を付加したか、および／またはＣ末端にアミノエチル アミノ基を付加した、パーダキシンまたはその断片のジアステレオマーから選択 される、請求の範囲第８項に記載のペプチド。 １０．配列： の、本発明でペプチド１〜７と称されるパーダキシン由来ペプチドから選択され る、請求の範囲第９項に記載のペプチド。 １１．メリチンまたはその断片および前記の環状誘導体から誘導されるジアス テレオマーである、請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載のペプチド 。 １２．配列： の、本発明でペプチド１８〜２１と称される、メリチン由来ペプチドから選択さ れる、請求の範囲第１１項に記載のペプチド。 １３．Ｌ−アミノ酸残基とＤ−アミノ酸残基の両方を含んでなり、Ｌ−アミノ 酸残基だけを含んでなる対応するアミノ酸配列が、自然には見い出されないよう なアミノ酸の配列を有する、請求の範囲第１項に記載の非溶血性細胞溶解性ペプ チド。 １４．正味の正電荷を有し、かつαらせん構造のない、請求の範囲第１３項に 記載のペプチド。 １５．下記の特徴： （ａ）種々の比の、少なくとも１つの疎水性アミノ酸と少なくとも１つの正に荷 電したアミノ酸よりなり、そしてその配列において、少なくとも１つのアミノ酸 残基がＤ−アミノ酸である、非天然合成ペプチドであること； （ｂ）このペプチドが、＋１より大きな正味の正電荷を有すること；および （ｃ）正に荷電したアミノ酸に対する疎水性アミノ酸の比は、このペプチドが病 原性細胞に対して細胞溶解性ではあるが、赤血球の細胞溶解は引き起こさないよ うな比であること、 を有する、請求の範囲第１３項または第１４項に記載の非溶血性細胞溶解性ペプ チド。 １６．正に荷電したアミノ酸は、リジン、アルギニンおよびヒスチジンから選 択され、そして疎水性アミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、グリシン、アラニ ン、バリン、フェニルアラニン、プロリン、チロシンおよびトリプトファンから 選択される、請求の範囲第１５項に記載のペプチド。 １７．＋１より大きな正味の正電荷は、アミノ酸組成、または正に荷電した化 学基の付加によるか、あるいは疎水性は、セリン、トレオニン、メチオニン、ア スパラギン、グルタミンおよびシステインのような極性アミノ酸の付加により低 下する、請求の範囲第１６項に記載のペプチド。 １８．疎水性アミノ酸は、ロイシン、アラニンまたはバリンであり、そして正 に荷電したアミノ酸は、リジンである、少なくとも６アミノ酸残基の、請求の範 囲第１７項に記載のペプチド。 １９．配列の少なくとも３分の１は、Ｄ−アミノ酸からなる、ロイシンとリジ ンからなる６量体、８量体または１２量体ペプチドのジアステレオマーである、 請求の範囲第１８項に記載のペプチド。 ２０．配列： の、本発明で２３〜２９と称されるペプチドから選択される、請求の範囲第１９ 項に記載のＬｅｕ／Ｌｙｓジアステレオマー。 ２１．非選択的細胞溶解性天然ペプチドから誘導されるペプチドまたは非天然 合成ペプチドの環状ジアステレオマーである、請求の範囲第１項に記載の非溶血 性細胞溶解性ペプチド。 ２２．２つまたはそれ以上の複数の、請求の範囲第１項〜第２１項のいずれか １項に記載の非溶血性細胞溶解性ペプチドからなる（該ペプチドは、各ペプチド に共有結合したリンカー分子の使用により束になっている）、非溶血性細胞溶解 性複合体。 ２３．束は、同じペプチドまたは異なるペプチドの、２つまたはそれ以上、好 ましくは５つの分子からなり、そしてリンカーは、先行する請求の範囲のいずれ か１項に記載のペプチドまたは通常使用されるリンカーである、請求の範囲第２ ２項に記載の複合体。 ２４．請求の範囲第１項〜第２１項のいずれか１項に記載の、親水性ジアステ レオマーの非溶血性細胞溶解性混合物。 ２５．異なる比の、疎水性アミノ酸、正に荷電したアミノ酸およびＤ−アミノ 酸からなる、非溶血性細胞溶解性ランダムコポリマー。 ２６．１：１：１、２：１：１または３：１：１（モル）の比で、リジン、ロ イシンおよびＤ−ロイシンからなる、請求の範囲第２５項に記載の非溶血性細胞 溶解性ランダムコポリマー。 ２７．請求の範囲第１項〜第２１項のいずれか１項に記載の非溶血性細胞溶解 性ペプチド、および薬剤学的に許容しうる担体を含んでなる、薬剤組成物。 ２８．請求の範囲第２２項〜第２３項に記載の非溶血性細胞溶解性複合体、請 求の範囲第２４項に記載の親水性ペプチドの混合物または請求の範囲第２５項〜 第２６項に記載のランダムコポリマー、および薬剤学的に許容しうる担体を含ん でなる、薬剤組成物。 ２９．病原性生物により引き起こされる感染症の治療に使用するための、請求 の範囲第２７項または第２８項に記載の薬剤組成物。 ３０．病原性生物は、細菌、真菌、原生動物、マイコプラズマおよびウイルス から選択される、請求の範囲第２９項に記載の薬剤組成物。 ３１．癌の治療に使用するための、請求の範囲第２７項または第２８項に記載 の薬剤組成物。