JP2000505291A

JP2000505291A - トランスアミナーゼ及びアミノトランスフェラーゼ

Info

Publication number: JP2000505291A
Application number: JP9528527A
Authority: JP
Inventors: ウォーレン，パトリック，ブイ．; スワンソン，ロナルド，ブイ．
Original assignee: ディベルサコーポレーション
Priority date: 1996-02-09
Filing date: 1997-01-21
Publication date: 2000-05-09
Anticipated expiration: 2017-01-21
Also published as: JP2003000289A; AU718147B2; EP1015563A4; US5962283A; US6268188B1; WO1997029187A1; JP2003000288A; IL125704A0; JP3414405B2; EP1015563A1; CA2246243A1; AU1836797A

Abstract

(57)【要約】種々のammonjfex、aquifex、およびpyrobaculum生物由来の熱安定トランスアミナーゼおよびアミノトランスフェラーゼ酵素を開示する。これらの酵素は、天然または組換え宿主細胞から製造され、医薬、農業および他の産業において利用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】トランスアミナーゼ及びアミノトランスフェラーゼ本出願は、1996年２月９日出願の係属中の米国特許出願第08/599,171号の一部継続出願である1996年５月８日出願の係属中の米国特許出願第08/646,590号の一部継続出願である。本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、そのようなポリヌクレオチド及びポリペプチドの使用、並びにそのようなポリヌクレオチド及びポリペプチドの製造及び単離に関する。特に、本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、トランスアミナーゼ及び／またはアミノトランスフェラーゼとして推定的に同定された。アミノトランスフェラーゼは、α-アミノ酸からα-ケト酸へのアミノ基の転移を触媒する酵素である。これらはトランスアミナーゼとも呼ばれる。タンパク質中に共通して見られる20種のL-アミノ酸のα-アミノ基はアミノ酸の酸化的分解の間に除去される。殆どのL-アミノ酸の異化における最初の段階であるα-アミノ基の除去は、アミノトランスフェラーゼ(またはトランスアミナーゼ)により促進される。これらのアミノ基転移反応においては、α-アミノ基はα -ケトグルタル酸のα-炭素原子に転移され、対応するアミノ酸のα-ケト酸類似体を残す。そのような反応においては正味の脱アミノ化(すなわちアミノ基の喪失)はなく、これはα-アミノ酸が脱アミノ化される間に前記α-ケトグルタル酸がアミノ化されるからである。アミノ基転移反応の効果は、多数の種類のアミノ酸からアミノ基を一つの形態、すなわちL-グルタミン酸として集めることである。グルタミン酸は生合成経路あるいは窒素排出産物を形成し排泄する最終的な一連の反応へとアミノ基を送り込む。細胞はいくつかの異なるアミノトランスフェラーゼを含み、多くはアミノ基受容体としてα-ケトグルタル酸に特異的である。アミノトランスフェラーゼは、もう一方の基質、すなわちアミノ基を供与するL-アミノ酸についての特異性において異なり、そのアミノ基供与体に従って命名される。アミノトランスフェラーゼにより触媒される反応は自由に可逆的であり、約1.0(ΔＧ^0'≒0 kJ/mol)の平衡定数を有する。アミノトランスフェラーゼは二分子ピンポン反応を触媒する酵素の古典的な例である。そのような反応においては、第一の基質は第二の基質が結合できる前に活性部位から離れなければならない。すなわち、入ってくるアミノ酸は活性部位に結合し、そのアミノ基をピリドキサールリン酸に与え、α-ケト酸の形態で離れる。その後入ってくるα-ケト酸が結合し、ピリドキサミンリン酸からアミノ基を受け取り、アミノ酸の形態で離れる。血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼ及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼレベルの測定は医療における重要な診断方法であり、心臓障害の指標として、また障害からの回復をモニターするために使用されている。本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、それらの酵素活性の結果、トランスアミナーゼ及び／またはアミノトランスフェラーゼとして同定された。本発明の一つの態様によれば、新規な酵素、並びにそれらの活性な断片、類似体及び誘導体が提供される。本発明の別の態様によれば、本発明の酵素並びにそのような酵素の活性な類似体及び断片をコードする、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡを含む単離された核酸分子が提供される。本発明の別の態様によれば、ATCC受託番号の寄託物に含まれるＤＮＡにより発現される成熟ポリペプチドをコードする単離された核酸分子が提供される。本発明のさらに別の態様によれば、組換え技術によりそのようなポリペプチドを生産する方法であって、本発明の核酸配列を含む組換え原核生物及び／または真核生物宿主細胞を、前記酵素の発現とその後の前記酵素の回収を促進する条件下で培養することを含む方法が提供される。本発明のさらに別の態様によれば、α-アミノ酸からα-ケト酸へアミノ基を転移させるために、そのような酵素あるいはそのような酵素をコードするポリヌクレオチドを使用する方法が提供される。殆どのトランスアミナーゼはL-アミノ酸を基質として使用するが、以下に記載するように本発明のトランスアミナーゼは D-アミノ酸を基質として使用するように変換することができ、これにより例えば合成ピレスロイドの製造、及びβ-ラクタム抗生物質の構成成分として等、その用途が拡大されるものである。本発明のトランスアミナーゼは高温下、及び有機溶媒中で安定であり、従って医薬、農薬及びその他の化学産業で使用される光学的に純粋なキラル化合物の生産のためにL-及び／またはD-アミノ酸とともに使用するのに優れている。本発明のさらに別の態様によれば、本発明の核酸配列にハイブリダイズするのに十分な長さの核酸分子を含む核酸プローブも提供される。本発明のさらに別の態様によれば、例えば、ヌクレオチド配列の特定の領域すなわち保存配列領域を使用することにより異なった生物からの類似酵素をコードする可能性のある類似した配列を同定するためのプローブを生成することのような科学研究に関連したin vitroの目的のために前述の酵素、あるいは前述の酵素をコードするポリヌクレオチドを使用する方法が提供される。本発明のこれらの態様及びその他の態様は本明細書の教示から当業者に明らかであろう。添付の図面は本発明の態様を例示するものであり、請求の範囲により画定される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。図１は、本発明のAquifexアスパラギン酸トランスアミナーゼＡの完全長ＤＮＡ(配列番号17)及び対応する推定アミノ酸配列(配列番号25)を示す。配列決定は本発明の全ての配列について378自動ＤＮＡシークエンサー(Applied Biosystems ,Inc.)を使用して行った。図２は、Aquifexアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼＢの完全長ＤＮＡ( 配列番号18)及び対応する推定アミノ酸配列(配列番号26)を示す。図３は、Aquifexアデノシル-8-アミノ-7-オキソノナノエートアミノトランスフェラーゼの完全長ＤＮＡ(配列番号19)及び対応する推定アミノ酸配列(配列番号27)を示す。図４は、Aquifexアヤチルオルニチンアミノトランスフェラーゼの完全長ＤＮＡ(配列番号20)及び対応する推定アミノ酸配列(配列番号28)を示す。図５は、Ammonifex degensiiアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの完全長ＤＮＡ(配列番号21)及び対応する推定アミノ酸配列(配列番号29)を示す。図６は、Aquifexグルコサミン:フルクトース-6-リン酸アミノトランスフェラーゼの完全長ＤＮＡ(配列番号22)及び対応する推定アミノ酸配列(配列番号30)を示す。図７は、Aquifexヒスチジノールリン酸アミノトランスフェラーゼの完全長ＤＮＡ(配列番号23)及び対応する推定アミノ酸配列(配列番号31)を示す。図８は、Pyrobacullum aerophilum分枝鎖アミノトランスフェラーゼの完全長ＤＮＡ(配列番号24)及び対応する推定アミノ酸配列(配列番号32)を示す。図９は、Ammonifex degensiiヒスチジノールリン酸アミノトランスフェラーゼの完全長ＤＮＡ(配列番号35)及び対応する推定アミノ酸配列(配列番号36)を示す。図10は、Aquifexアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの完全長ＤＮＡ(配列番号39)及び対応する推定アミノ酸配列(配列番号40)を示す。図11は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼを使用してタンパク質のアミノトランスフェラーゼ活性を調べるために使用したアッセイの説明図である。用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖生産に関与するＤＮＡのセグメントを意味するものであり、コード領域に先行あるいは後続する領域(リーダー及びトレイラー)並びに個々のコードセグメント(エキソン)の間の介在配列(イントロン)を含む。ＲＮＡポリメラーゼが二つのコード配列を単一のｍＲＮＡに転写し、これが両方のコード配列に由来するアミノ酸を有する単一のポリペプチドに翻訳される場合は、コード配列がもう一つのコード配列に「作動可能に結合」されている。コード配列は、発現された配列が最終的にプロセシングされて所望のタンパク質を生成する限り、互いに隣接している必要はない。「組換え」酵素とは、組換えＤＮＡ技術により生産された酵素、すなわち所望の酵素をコードする外来ＤＮＡ構築物により形質転換された細胞から生産された酵素をいう。「合成」酵素は、化学合成により製造されたものである。特定の酵素のＤＮＡ「コード配列」あるいは特定の酵素を「コードするヌクレオチド配列」は、適当な調節配列の制御下に置かれたときに転写され、酵素に翻訳されるＤＮＡ配列である。本発明の一つの態様によれば、図1〜8の推定アミノ酸配列(配列番号17〜32)を有する成熟酵素をコードする、単離された核酸(ポリヌクレオチド)が提供される。本発明の別の態様によれば、本発明の酵素をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。寄託物は本発明の酵素をコードするＤＮＡを含むゲノムクローンの混合物である。それぞれのＤＮＡを含む各ゲノムクローンをpQEベクター(Quiagen，Inc.，Chatsworth，CA)に挿入した。寄託物はAmerican Type Cultu re Collection,12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852,USAに1995年1 2月13日に寄託し、ATCC受託番号を得た。寄託は特許手続きのための微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条件下で行われた。これらの株は特許発行に際し、無効にされることなく、制限あるいは条件なしに公衆に分譲される。これらの寄託は単に当業者の便宜のために行われたものであり、35U.S.C§112により寄託が必要であると認めたものではない。寄託物に含まれるポリヌクレオチドの配列、並びにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書の配列の記載と矛盾する場合に優先するものである。寄託物を製造し、使用し、販売するためにはライセンスを必要とするが、ここでそのようなライセンスを認可するものではない。本発明のポリヌクレオチドは、以下の生物に由来するゲノムＤＮＡライブラリーから初めて回収された。 Aquifex VF5はイタリアのVulcanoで単離された真生細菌である。これは、グラム陰性、桿状の化学合成無機力源無機栄養海洋生物で、基質としてＯ₂、気体相にH₂/CO₂＋0.5％Ｏ₂を含む高塩濃度培地中で約85〜90℃(Ｔ_max=95℃)においてpH 6.8で最適に増殖する。 Ammonifex degensii KC4は、インドネシアのJavaで単離された新規な真生細菌生物である。このグラム陰性の化学合成無機力源無機栄養生物は三つの呼吸系を有する。この細菌は硝酸塩、硫酸塩、及び硫黄を利用できる。この生物は基質として0.2％硝酸塩、気体相にH₂/CO₂を含む低塩濃度培地中で70℃においてpH7.0で最適に増殖する。 Pyrobaculum aerophilium IM2は、イタリアのIschia Marontiで単離された好熱性硫黄古細菌(Crenarchaeota)である。基質として硝酸塩、酵母エキス、ペプトン及びＯ₂、気体相にN₂/CO₂、Ｏ₂を含む低塩濃度培地中で100℃においてpH7 .0で最適に増殖する桿状生物である。従って、前記ポリヌクレオチド及びそれによりコードされる酵素はそれらが単離された生物により同定され、以下の記載において、「VF5/ATA」(図１及び配列番号17及び25)、「VF5/AAB」(図２及び配列番号18及び26)、「VF5/A87A」(図３及び配列番号19及び27)、「VF5/AOA」(図４及び配列番号20及び28)、「KC4/AA」(図５及び配列番号21及び29)、「VF5/GF6PA」(図６及び配列番号22及び30)、「VF5/HPA」(図７及び配列番号23及び31)、「IM2/BCA」(図８及び配列番号24及び32)、「KC4/HPA」( 図９及び配列番号35及び36)、及び「VF5/AA」(図10及び配列番号39及び40)と記載する場合がある。本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、表１に示すように、公知の遺伝子及びそれによりコードされるタンパク質にヌクレオチド及びタンパク質レベルで同一性を示す。表１に特定した全てのクローンは、トランスアミナーゼあるいはアミノトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。本発明の酵素をコードする核酸分子を単離する一つの手段は、当分野で認知された方法を使用して、天然または人工的に設計されたプローブにより遺伝子ライブラリーを検索することである(例えば、Current Protocols in Molecular Biol ogy,Ausubel F.M.ら(EDS.)Green Publishing Company Assoc．and John Wiley I nterscience，New York，1989，1992参照)。配列番号17〜24、35及び39のポリヌクレオチド及びそれらの断片(連続した少なくとも12個のヌクレオチドを含む)が特に有用なプローブであることは当業者に理解されるであろう。この目的に特に有用なその他のプローブは、配列番号1〜9、33〜34及び37〜38の配列のハイブリダイズ可能な断片である(すなわち、連続した少なくとも12個のヌクレオチドを含む)。本明細書に開示した特定の核酸配列にハイブリダイズする核酸配列については、ハイブリダイゼーションは低いストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシー、あるいは高いストリンジェンシーの条件下で行い得る。オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの例として、固定した変性核酸を含むポリマーメンブランを最初に、0.9M NaCl、50mM NaH₂PO₄、pH7.0、5.0mM Na₂EDTA、0.5％SDS、1 0×Denhard's及び0.5mg/mLポリリボアデニル酸を含む溶液中で45℃で30分間プレハイブリダイズさせる。その後、約２×10⁷cpm(比活性4-9×10⁸cpm/ug)の³²P末端標識オリゴヌクレオチドプローブを溶液に加える。12〜16時間インキュベートした後、メンブランを0.5％SDSを含む1×SET(150mM NaCl、20mMトリス塩酸塩、p H7.8、１mM Na₂EDTA)中で室温で30分間洗浄し、その後新しい１×SET中でオリゴヌクレオチドプローブのためにTm-10℃(Tmは-10℃)で30分間洗浄する。ハイブリダイゼーションシグナルの検出のために面ブランをオートラジオグラフィーフィルムに露光する。ストリンジェントな条件とは、少なくとも90％の同一性、好ましくは少なくとも95％の同一性、最も好ましくは少なくとも97％の同一性が配列間に存在するときにのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。本明細書においてその全体が参考のために援用されるJ．Sambrookら、Molecular Cloning，A Laboratory Manual,2d Ed,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)を参照のこと。本明細書で使用するように、第一のＤＮＡ(ＲＮＡ)配列ともう一つのＤＮＡ( ＲＮＡ)配列とを例えばBLASTNにより互いに適切に整列させたときに、第一の配列の塩基と他方の配列の塩基との間にそれぞれ少なくとも70％、及び好ましくは少なくとも80％もしくは90％の同一性がある場合に、第一のＤＮＡ(ＲＮＡ)配列は他方のＤＮＡ(ＲＮＡ)配列に少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％同一であるものとする。本発明は、参照ポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチドであるが、その変化がサイレント変化、例えば該ポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を変えないような変化であるポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、参照ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドにおけるアミノ酸の置換、付加、欠失、融合及び切断を起こすようなヌクレオチド変化に関する。本発明の好ましい態様においては、これらのポリペプチドは、参照ポリペプチドによりコードされたポリペプチドと同じ生物学的活性を保持する。本発明のポリヌクレオチドは、表１に挙げた生物からのゲノム遺伝子ライブラリーから回収されたものである。遺伝子ライブラリーはλZAP IIクローニングベクター(Stratagene Cloning Systems)中に生成させた。これらのライブラリーについて集団切り出しを行い、pBluescriptファージミド中にライブラリーを生成した。本明細書に以下に記載するプロトコール／方法に従ってライブラリーを生成し、切り出しを行った。本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡあるいはＤＮＡの形態であり得、ＤＮＡはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡを包含する。このＤＮＡは二本鎖あるいは一本鎖であってよく、一本鎖である場合コード鎖、あるいは非コード鎖（アンチセンス)であってもよい。成熟酵素をコードするコード配列は、図1〜8に記載したコード配列(配列番号17〜24)に同一であってもよく、あるいは遺伝子コードの重複もしくは縮重の結果として図１〜10のＤＮＡ(配列番号17〜24、35及び39)と同じ成熟酵素をコードする異なるコード配列であってもよい。図１〜10の成熟酵素をコードするポリヌクレオチド(配列番号25〜32、36及び40)は、限定するものではないが、成熟酵素のコード配列のみ；成熟酵素のコード配列及び、リーダー配列またはプロタンパク質配列のような追加のコード配列；成熟酵素のコード配列(及び任意に追加のコード配列)及び、イントロンや成熟酵素のコード配列の非コード配列５’及び／または３’のような非コード配列を包含し得る。従って、用語「酵素(タンパク質)をコードするポリヌクレオチド」は、酵素のコード配列のみを含むポリヌクレオチド、並びに追加のコード配列及び／または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含するものである。本発明はさらに、図１〜10の推定アミノ酸配列(配列番号25〜32、36及び40)を有する酵素の断片、類似体、及び誘導体をコードする上記したポリヌクレオチドの変異体に関する。前記ポリヌクレオチドの変異体は、前記ポリヌクレオチドの天然の対立遺伝子変異体、あるいは前記ポリヌクレオチドの非天然の変異体であってよい。従って本発明は、図１〜10に示したものと同じ成熟酵素をコードするポリヌクレオチド(配列番号17〜24、35及び39)、並びに図１〜10の酵素の断片、誘導体あるいは類似体をコードする、そのようなポリヌクレオチド(配列番号17〜24、35 及び39)の変異体を包含する。そのようなヌクレオチド変異体は、欠失変異体、置換変異体、及び付加あるいは挿入変異体を包含する。上記に示したように、前記ポリヌクレオチドは、図１〜10に示したコード配列 (配列番号17〜24、35及び39)の天然の対立遺伝子変異体であるコード配列を有し得る。当分野で知られるように、対立遺伝子変異体はポリヌクレオチド配列の代替的な形態であり、コードされた酵素の機能を実質的に変えることのない１個以上のヌクレオチドの置換、欠失、あるいは付加を有し得るものである。また、特異的な方法やその他の進化的(evolution)方法を使用して、機能において大きな変化を生じ得るＤＮＡ配列のごくわずかな変化を生成することができる。本発明の完全長遺伝子の断片は、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーのハイブリダイゼーションプローブとして使用して完全長ＤＮＡを単離し、また前記遺伝子に対して高い配列類似性を有するかあるいは類似した生物学的活性を有するその他のＤＮＡを単離することができる。このタイプのプローブは好ましくは少なくとも10、好ましくは少なくとも15、さらにより好ましくは少なくとも30塩基を含み、例えば少なくとも50の塩基を含んでもよい。このプローブは、完全長転写体に対応するＤＮＡクローン、並びに調節領域及びプロモーター領域、エキソン及びイントロンを含む完全な遺伝子を含むゲノムクローンを同定するのにも使用し得る。スクリーニングは例えば、公知のＤＮＡ配列を使用してオリゴヌクレオチドプローブを合成し、遺伝子のコード領域を単離することを含む。本発明の前記遺伝子もしくは遺伝子配列の部分に相補的であるか又は同一の配列を有する標識されたオリゴヌクレオチドを使用してゲノムＤＮＡのライブラリーをスクリーニングしてライブラリーのどのメンバーにプローブがハイブリダイズするかを判定する。また、そのようなプローブは分析的に検出可能な試薬により標識でき、そして好ましくはそのように標識して、プローブの同定を容易にすることもできる。有用な試薬としては、限定するものではないが、放射能、蛍光染料あるいは検出可能な産物の形成を触媒することができる酵素等が挙げられる。前記プローブはこのように他のソースからのＤＮＡの相補的コピーを単離するため、あるいは関連する配列についてそのようなソースをスクリーニングするのに有用である。本発明はさらに、少なくとも70％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％の同一性が配列間にある場合に、上記した配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、ストリンジェントな条件下で上記したポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書で使用するように、用語「ストリンジェントな条件」は、配列間に少なくとも95％の同一性、好ましくは少なくとも97％の同一性が存在するときにのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。好ましい態様における上記したポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図１〜10のＤＮＡ (配列番号17〜24、35及び39)によりコードされた成熟酵素と実質的に同じ生物学的機能あるいは活性を有する酵素をコードするものである。あるいは、前記ポリヌクレオチドは少なくとも15塩基、好ましくは少なくとも 30塩基、より好ましくは少なくとも50塩基を有し得、本発明のポリヌクレオチドのいずれの部分にもハイブリダイズし得、上記したようにそれに対して同一性を有し、そして活性を保持していてもよく、していなくてもよい。例えばそのようなポリヌクレオチドは、配列番号17〜24、35及び39のポリヌクレオチドのためのプローブとして、例えばポリヌクレオチドを回収するために使用でき、あるいは診断プローブ、あるいはPCRプライマーとして使用できる。従って本発明は、配列番号25〜32、36及び40の酵素をコードするポリヌクレオチドに少なくとも70％の同一性、好ましくは少なくとも90％の同一性、より好ましくは95％の同一性を有するポリヌクレオチド、並びにその断片に関し、これらの断片は少なくとも15塩基、好ましくは少なくとも30塩基、最も好ましくは少なくとも50塩基を有し、本発明のポリヌクレオチドの任意の部分に対してストリンジェントな条件下で少なくとも90％同一、好ましくは少なくとも95％同一、最も好ましくは少なくとも97％同一である。本発明はさらに、図１〜10(配列番号17〜24、35及び39)の推定アミノ酸配列を有する酵素、並びにそのような酵素の断片、類似体、及び誘導体に関する。図１〜10の酵素(配列番号25〜32、36及び40)をいう場合の用語「断片」、「誘導体」及び「類似体」は、そのような酵素と実質的に同じ生物学的機能または活性を保持する酵素を意味する。従って類似体は、プロタンパク質部分を切断することにより活性化されて活性な成熟酵素を生成することができるプロタンパク質を包含する。本発明の酵素は、組換え酵素、天然酵素、あるいは合成酵素であってよく、好ましくは組換え酵素である。図１〜10の酵素(配列番号25〜32、36及び40)の断片、誘導体、または類似体は、(i)１以上のアミノ酸残基が保存もしくは非保存アミノ酸残基(好ましくは保存アミノ酸残基)により置換され、そのような置換アミノ酸残基は遺伝子コードによりコードされていてもいなくてもよいもの、あるいは(ii)１以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、あるいは(iii)成熟酵素が別の化合物、例えば酵素の半減期を延長するための化合物(例えばポリエチレングリコール)に融合したもの、あるいは(vi)追加的なアミノ酸、例えばリーダー配列もしくは分泌配列、または成熟酵素もしくはプロタンパク質配列の精製に使用される配列が成熟酵素に融合されたものであってよい。そのような断片、誘導体、及び類似体は、本明細書の記載から当業者の理解の範囲にあるものとみなされる。本発明の酵素及びポリヌクレオチドは好ましくは単離された形態で提供され、好ましくは均質なものに精製されたものである。用語「単離された」は、物質が最初にあった環境(天然物の場合はその天然の環境)から取り出されていることを意味する。例えば、生きた動物中に存在する天然のポリヌクレオチドまたは酵素は単離されたものではないが、天然系において共存する物質の一部あるいは全部から分離された同じポリヌクレオチドまたは酵素は単離されたものである。そのようなポリヌクレオチドはベクターの部分であってもよく、及び／またはそのようなポリヌクレオチドまたは酵素は組成物の一部であってもよく、そのようなベクターまたは組成物がその天然の環境の一部でなくても単離されたものである。本発明の酵素は、配列番号25〜32、36及び40の酵素(特に成熟酵素)、並びに配列番号25〜32、36及び40の酵素に少なくとも70％の類似性(好ましくは少なくとも70％の同一性)、より好ましくは配列番号25〜32、36及び40の酵素に少なくとも90％の類似性(より好ましくは少なくとも90％の同一性)、さらに好ましくは配列番号25〜32、36及び40の酵素に少なくとも95％の類似性(さらに好ましくは少なくとも95％の同一性)を有する酵素を包含し、さらに少なくとも30アミノ酸、より好ましくは少なくとも50アミノ酸を一般的に含むそのような酵素の部分を包含する。当該技術分野において公知のように、２種類の酵素の間の”類似性”は、一方の酵素のアミノ酸配列及びその保存アミノ酸の置換を第２の酵素の配列と比較することにより決定する。変異体、すなわち”断片”、”類似”もしくは”誘導”ポリペプチド、と参照ポリペプチドとは、いかなる組み合わせで存在していてもよい１以上の置換、付加、欠失、融合及びトランケーションによってアミノ酸配列が異なり得るものである。好ましい変異体の中には、保存アミノ酸の置換により参照とは異なるものがある。このような置換は、ポリペプチド中の所定のアミノ酸を類似の特徴を有する別のアミノ酸で置換するものである。保存的置換として典型的に見られるものは、脂肪族アミノ酸Ala、Val、Leu及びIleの中でのあるものの別のものへの置き換え；ヒドロキシル残基Ser及びThrの交換、酸性残基Asp及びGluの交換、アミド残基 Asn及びGlnの間での置換、塩基性残基Lys及びArgの交換並びに芳香族残基Phe、T yrの間での置き換えである。最も好ましい変異体は、参照ポリペプチドと異なるが、それと同じ生物学的機能及び活性を保持するものである。本発明の酵素の断片又は部分はペプチド合成による対応全長酵素の製造に用いることができ、したがって、これらの断片は全長酵素を製造するための中間体として用いることができる。本発明のポリヌクレオチドの断片又は部分は本発明の全長ポリヌクレオチドの合成に用いることができる。また、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子工学的に処理された宿主細胞及び組換え技術による本発明の酵素の製造にも関する。宿主細胞は本発明のベクターを用いて遺伝子工学的に処理（遺伝子導入、又は形質転換、又はトランスフェクシヨン）され、ここで、ベクターは例えば発現ベクターのようなクローニングベクターであり得る。このベクターは、例えば、プラスミド、ファージ等の形態であり得る。工学的に処理された宿主細胞は、プロモーターの活性化、形質転換体の選択又は本発明の遺伝子の増幅に適するように改変された通常の栄養培地において培養することができる。温度、pH等の培養条件は発現用に選択された宿主細胞に関して従来用いられるものであり、当業者には明らかであろう。本発明のポリヌクレオチドは組換え技術による酵素の製造に用いることができる。このため、例えば、このポリヌクレオチドは酵素を発現させるための様々な発現ベクターのいずれかに含有させることができる。このような発現ベクターには、染色体、非染色体及び合成DNA配列、例えば、SV40の誘導体；細菌プラスミド；ファージDNA；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドとファージD NA、ウイルスDNA（例えばワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、及び仮性狂犬病ウィルスのＤＮＡ）との組み合わせに由来するベクターが含まれる。しかしながら、宿主細胞において複製可能かつ生存可能である限り、他のいかなるベクターをも用いることができる。適切なDNA配列を様々な手順によりこのベクターに挿入することができる。一般には、DNA配列は当該技術分野において公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位（１ヶ所もしくは複数箇所）に挿入する。このような手順及びその他の手順は当業者の範囲内にあるものと認められる。この発現ベクター中のDNA配列は、mRNAの合成を指令するための適切な発現制御配列（１つもしくは複数）（プロモーター）に作動可能に連結する。このようなプロモーターの代表的な例としては、LTR又はSV40プロモーター、大腸菌lac又はtrp、ファージラムダP_Lプロモーター、及び原核もしくは真核細胞又はそれらのウイルスにおいて遺伝子の発現を制御することが知られる他のプロモーターを挙げることができる。また、発現ベクターは、翻訳を開始させるためのリボソーム結合部位及び転写ターミネーターをも含む。また、このベクターは発現を増幅させるのに適する配列を含んでいてもよい。加えて、発現ベクターは、好ましくは、形質転換宿主細胞を選択するための表現型形質を付与する１以上の選択可能なマーカー遺伝子、例えば、真核細胞の培養についてはジヒドロ葉酸還元酵素もしくはネオマイシン耐性、又は大腸菌におけるテトラサイクリンもしくはアンピシリン耐性を含む。上述の適切なDNA配列及び適切なプロモーター又は制御配列を含むベクターは、適切な宿主の形質転換に用いてその宿主にタンパク質を発現させることができる。適切な宿主の代表的な例として、細菌細胞、例えば、大腸菌、ストレプトマイセス、枯草菌；真菌細胞、例えば、酵母；昆虫細胞、例えば、ドロソフィラ（Dr osophila）S2及びスポドプテラ（Spodoptera）Sf9；動物細胞、例えば、CHO、CO Sもしくはボウズ(Bowes)メラノーマ；アデノウイルス；植物細胞等を挙げることができる。特には、本発明は、上に広範に記述される配列の１以上を含む組換え構築体をも包含する。この構築体は、本発明の配列が挿入されているプラスミドもしくはウイルスベクターのようなベクターを順方向又は逆方向に含む。この実施態様の好ましい態様においては、この構築体は、その配列に作動可能に連結する、例えばプロモーターを含む調節配列をさらに含む。多数の適切なベクター及びプラスミドが当業者に公知であり、かつ商業的に利用可能である。例として以下のベクター、即ち、細菌性:pQE7O、pQE60、pQE−9（キアジェン（Qiagen））、pBlue script II KS、ptrc99a、pKK223-3、pDR540、pRIT2T（ファルマシア(Pharmacia) ）；真核性：pXT1、pSG5（ストラタジーン（Stratagene）pSVK3、pBPV、pMSG、p SVL SV40（ファルマシア）が提供される。しかしながら、宿主細胞において複製可能かつ生存可能である限り、他のいかなるプラスミド又はベクターをも用いることができる。プロモーター領域は、CAT（クロラムフェニコール転移酵素）ベクター又は選択可能なマーカーを有する他のベクターを用いて、あらゆる所望の遺伝子から選択することができる。適切なベクターの２つはpKK232−８及びpCM7である。特定の命名された細菌性プロモーターには、lacl、lacZ、T3、T7、gpt、ラムダP_R、P_L 及びtrpが含まれる。真核性プロモーターには、CMV最初期、HSVチミジンキナーゼ、初期及び後期SV40、レトロウイルスに由来するLTR、及びマウスメタロチオネイン−Iが含まれる。適切なベクター及びプロモーターの選択は十分に当該技術分野における通常の技術の水準内にある。さらなる実施態様においては、本発明は上述の構築体を含む宿主細胞に関する。この宿主細胞は哺乳類動物細胞のような高等真核生物細胞であっても酵母細胞のような下等真核生物細胞であってもよく、あるいは宿主細胞は細菌細胞のような原核生物細胞であってもよい。宿主細胞への構築体の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE−デキストラン介在トランスフェクション、又は電気穿孔法によって行うことができる（Davis,L.,Dibner,M.,Battey,I.,分子生物学における基本的方法（Basic Methods in Molecular Biology），（1986)）。宿主細胞中の構築体は通常の方法でその組換え配列によってコードされる遺伝子産物の製造に用いることができる。あるいは、本発明の酵素は通常のペプチド合成機によって合成により製造することができる。成熟タンパク質は、哺乳類動物細胞、酵母、細菌、又は他の細胞中で、適切なプロモーターの制御の下において発現させることができる。本発明のDNA構築体から誘導されるRNAを用いて、細胞非含有翻訳系をこのようなタンパク質の製造に用いることも可能である。原核性及び真核性宿主と共に用いるのに適するクローニング及び発現ベクターは、Sambrookら,分子クローニング；実験マニュアル（Molecular Cloning;A Laboratory Manual）,第２版,Cold Spring Harbor,N. Y.,(1989)に記述されており、その開示は参考として本明細書に組み込まれる。高等真核生物による本発明の酵素をコードするDNAの転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増加する。エンハンサーは、プロモーターに作用してその転写を増大させる、通常約10ないし300bpの、DNAのシス作用性要素である。その具体例には、複製起点の100ないし270bp後期側のSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが含まれる。一般に、組換え発現ベクターは、複製起点及び宿主細胞の形質転換を可能にする選択可能なマーカー、例えば大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子及びＳ．セレビシエ（S.cerevisiae）TRP1遺伝子、並びに下流構造遺伝子の転写を指令するための高発現遺伝子に由来するプロモーターを含む。このようなプロモーターは、3 −ホスホグリセレートキナーゼ（PGK）のような解糖酵素、α−因子、酸ホスホターゼ、又は熱ショックタンパク質をコードするオペロンから誘導することができる。異種構造配列を、適切な位相において、転写開始及び終止配列、並びに好ましくは、翻訳された酵素の分泌を導くことが可能なリーダー配列で組み立てる。場合により、この異種配列はＮ−末端同定ペプチドを含む融合酵素をコードしてもよく、このＮ−末端同定ペプチドは所望の特徴、例えば発現した組換え産物の安定化もしくは単純化された精製、を付与する。細菌用に有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造DNA配列を、適切な翻訳開始及び終止シグナルと共に、機能的プロモーターを含む作動可能な読み取り相に挿入することにより構築する。このベクターは、そのベクターの維持を確実なものとし、かつ、所望であれば、宿主内での増幅をもたらすために、１以上の表現型選択可能マーカー及び複製起点を有する。形質転換に適切な原核生物宿主には、他のものも選択材料として用いることができるが、大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌、並びにシュードモナス属、ストレプトマイセス属、及びスタフィロコッカス属内の様々な種が含まれる。代表的かつ非限定的な例として、細菌用に有用な発現ベクターは、公知のクローニングベクターpBR322（ATCC37017）の遺伝的要素を含む市販のプラスミドに由来する細菌複製起点及び選択可能マーカーを含んでもよい。このような商業的なベクターには、例えば、pKK223−3（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ（P harmacia Fine Chemicals）、ウプサラ（Uppsala）、スウェーデン）及びpGEM1 （プロメガ・バイオテック（Promega Biotec）、マジソン、WIUSA）が含まれる。これらのpBR322”主鎖”部を適切なプロモーター及び発現させようとする構造配列に結合させる。適切な宿主株を形質転換し、その宿主株を適切な細胞密度まで成長させた後、選択されたプロモーターを適切な手段（例えば、温度シフト及び化学的誘発）により誘発させ、細胞をさらなる期間培養する。細胞を、典型的には遠心によって回収し、物理的もしくは化学的手段によって破壊し、それにより生じた粗製抽出物をさらなる精製のために保持する。タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、凍結−解凍サイクル処理、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤の使用を含むあらゆる都合の良い方法で破壊することができ、そのような方法は当業者には公知である。様々な哺乳類動物細胞培養系も組換えタンパク質の発現に用いることができる。哺乳類動物発現系の例には、Gluzman,Cell,23:175(1981)に記述されるサル腎臓線維芽細胞のCOS−７系、並びに適合するベクターを発現させることが可能な他の細胞系、例えば、C127、3T3、CHO、HeLa及びBHK細胞系が含まれる。哺乳類動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーター及びエンハンサーを含み、かつあらゆる必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与及び受容部位、転写終止配列、並びに5'隣接非転写配列をも含む。必要とされる非転写遺伝的要素を提供するのにSV40由来のDNA配列及びポリアデニル化部位を用いることができる。酵素は、組換え細胞の培養物から、硫酸アンモニウムもしくはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンもしくはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含む方法によって回収及び精製することができる。必要に応じて、成熟タンパク質の高次構造を完成させるに当たり、タンパク質の再折り畳み工程を用いることができる。最後に、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を最終精製工程に用いることができる。本発明の酵素は、天然から精製された生成物であっても、化学合成法の生成物であっても、組換え技術によって原核生物もしくは真核生物宿主から（例えば、培養中の細菌、酵母、高等植物、昆虫及び哺乳類動物細胞により）産生されるものであってもよい。組換え体産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明の酵素はグリコシル化されたものでも、非グリコシル化のものであってもよい。また、本発明の酵素は開始メチオニンアミノ酸残基を含んでいてもいなくてもよい。トランスアミナーゼはアミノ酸及びアミノ糖の代謝における一群の鍵酵素であり、微生物から哺乳類動物までの全ての生物において見出される。このアミノ基転移反応において、アミノ基はアミノ酸からα−ケト酸に転移される。アンモニアを放出することなくアミノ基の転移に介在するのに、ピリドキサールリン酸が補因子として必要である。アミノ酸には、現在、動物飼料の添加物、ヒトの栄養補助剤、輸液の成分、並びに医薬及び農業用製品を製造するための合成中間体としての用途がある。例えば、Ｌ−グルタミン酸はヒトの食物の香味増強剤として知られる最良のものである。Ｌ−リジン及びＬ−メチオニンは動物飼料及びヒトの補助剤に対する大容量添加物である。Ｌ−トリプトファン及びＬ−トレオニンは同じような潜在的な用途を有する。Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−アスパラギン酸は、低カロリー甘味料アスパルテーム及び特定のアミノ酸をも含む組成を有する他の見込みのある低カロリー甘味料の製造における鍵化合物として、非常に重要な市場潜在力を有する。輸液では、ヒトの食餌において必須のものを含む広範囲のアミノ酸が必要とされる。トランスアミナーゼは高度に立体選択的であり、基質としてＬ−アミノ酸を最も用いる。1995年12月７日に出願され、”組み合わせ酵素の開発”と題する、通常に譲渡された係属する米国仮出願第60／008,316号（その開示の全体は参考として本明細書に組み込まれる）に開示されるアプローチを用いて、本発明のトランスアミナーゼを、Ｄ−アミノ酸を基質として用いるように変換することができる。そのような変換は、多数の広範なトランスアミナーゼ応用を可能にする。例えば、Ｄ−バリンを合成ピレスロイドの製造において用いることができる。Ｄ− フェニルグリシン及びその誘導体はβ−ラクタム抗生物質の成分として有用であり得る。さらに、この熱安定性トランスアミナーゼは高温及び有機溶媒中で優れた安定性を有する。したがって、これらは、医薬、農業、及び他の化学的な製造において用いられる光学的に純粋なキラル化合物の製造にＬ−及び／又はＤ−アミノ酸のいずれかを用いるのにより適している。アミノ酸及びそれらの誘導体の工業的規模での製造においてトランスアミナーゼを用いるのには多くの理由がある。 1) トランスアミナーゼは対応するα−ケト酸からのＤ−もしくはＬ−アミノ酸の立体選択的な合成を触媒することができる。従って、Ｌ−もしくはＤ−異性体は全く生成されず、また分割は必要ない。 2) トランスアミナーゼは均一に高い触媒速度を有し、酵素１mg当たり毎分 400μモル以下の基質を変換することができる。 3) 必要とされる多くのα−ケト酸類は化学合成により低コストで都合よく製造することができる。 4) トランスアミナーゼを用いる固定化酵素法のための資本投資は大規模発酵法のためのものよりも非常に低く、そのバイオリアクターの生産性はしばしば 1桁高いオーダーである。 5) この技術は、様々な特異性を持つトランスアミナーゼが存在するため、一般に広範囲のＤ−もしくはＬ−アミノ酸に適用することができる。このような広い範囲は、同じ装置及び、しばしば、同じ生体触媒を用いて、多くの異なるＬ− もしくはＤ−アミノ酸を製造することを可能にする。本発明の配列に相当する酵素に対して生じる抗体は、その酵素を動物に直接注射することにより、又はその酵素を動物、好ましくは非ヒトに投与することにより得ることができる。次に、そのようにして得られた抗体を酵素自体と結合させる。このようにして、酵素の断片のみをコードする配列でさえも天然型酵素全体を結合する抗体の産生に用いることができる。次いで、このような抗体を、その酵素を発現する細胞からの酵素の単離に用いることができる。モノクローナル抗体を調製するには、連続細胞系培養によって産生される抗体をもたらすあらゆる技術を用いることができる。具体例には、ハイブリドーマ技術（Kohler及びMilstein,Nature,256:495−497，1975）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozborら，Immunology Today 4:72,1983）、及びヒトモノクローナル抗体を産生させるためのEBV−ハイブリドーマ技術（モノクローナル抗体及び癌治療（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy）における Coleら，Alan R.Liss,Inc.,pp.77−96,1985）が含まれる。一本鎖抗体の製造について記述される技術（米国特許第4,946,778号）を本発明の免疫学的酵素産生物に対する一本鎖抗体の製造に適用することができる。また、遺伝子導入マウスを本発明の免疫学的酵素産生物に対するヒト化抗体の発現に用いることもできる。本発明の酵素に対して産生させた抗体は他の生物及び試料からの類似の酵素のスクリーニングにおいて用いることができる。このようなスクリーニング技術は当該技術分野において公知であり、例えば、そのようなスクリーニング検定の１つがSambrook及びManiatis，分子クローニング；実験マニュアル（第２版），第２巻，8.49項，Cold Spring Harbor，1989に記述されており、これは参考としてその全体がここに組み込まれる。以下の実施例を参照して本発明をさらに説明するが、本発明はこのような実施例に限定されるものではないことは理解される。全ての部又は量は、他に指定されない限り、重量基準である。以下の実施例の理解を容易にするため、特定の頻繁に現れる方法及び／又は用語を説明する。 ”プラスミド”は大文字及び／又は数字に先行し、及び／又はそれが続く小文字の”p”で表される。本明細書における出発プラスミドは、商業的に入手可能であるか、無制限に公的に入手可能であるか、あるいは入手可能なプラスミドから公表された手順に従って構築することができる。加えて、説明されるものと等価のプラスミドが当該技術分野において公知であり、当業者には明らかであろう。 DNAの”消化”は、DNAの特定の配列でのみ作用する制限酵素を用いるDNAの触媒的開裂を指す。本明細書で用いられる様々な制限酵素は商業的に入手可能であり、それらの反応条件、補因子及び他の要件は当業者に公知のものを用いた。分析の目的では、典型的には１μｇのプラスミド又はDNA断片を、約20μlのバッファー溶液中の約２単位の酵素と共に用いる。プラスミドを構築するためのDNA断片を単離する目的では、典型的には５ないし50μｇのDNAをより大容積中の20ないし250単位の酵素で消化する。特定の制限酵素に適切なバッファー及び基質の量はその製造者によって指定される。37℃で約１時間のインキュベーション時間を通常用いるが、供給者の指示に従って変動し得る。消化の後、その反応物をポリアクリルアミドゲル上で直接電気泳動して所望の断片を単離する。開裂した断片のサイズ分離は、Goeddelら，Nucleic Acids Res.,8:4057(1980) に記述される８パーセントポリアクリルアミドゲルを用いて行う。 ”オリゴヌクレオチド”は一本鎖ポリデオキシヌクレオチド又は２本の相補的ポリデオキシヌクレオチド鎖を指し、これは化学的に合成されたものでもよい。このような合成オリゴヌクレオチドには5'リン酸がなく、したがって、キナーゼの存在下においてATPを用いてリン酸を付加することなしに別のオリゴヌクレオチドに連結することはない。合成オリゴヌクレオチドは脱リン酸化されていない断片に連結する。 ”連結”は、２つの二本鎖核酸断片の間にリン酸ジエステルを形成するプロセスを指す（Maniatis,Ｔ.ら，同著，ｐ.146）。特に断らない限り、連結は、ほぼ等モル量の連結しようとするDNA断片0.5μｇ当たり10単位のT4 DNAリガーゼ（“ リガーゼ”）と共に公知のバッファー及び条件を用いて達成することができる。特に断らない限り、形質転換はSambrook及びManiatis,分子クローニング；実験マニュアル，Cold Spring Harbor，1989に記述される通りに行った。実施例１トランスアミナーゼ及びアミノトランスフェラーゼの細菌性発及び精製本発明の酵素をコードするDNA、配列番号(SEQ ID NO:)25ないし32、36及び40 を、このDNAを含むpBluescriptベクターから、本明細書に注記されるプライマーを用いるPCR技術によって最初に増幅した。次に、増幅した配列をこれらのプライマーの配列の下にリストされたそれぞれのPQEベクターに挿入し、本明細書で説明されるプロトコルに従って酵素を発現させた。また、ゲノムDNAもPCR増幅の鋳型として用いられており、すなわち、陽性クローンが同定され、かつプライマーの配列がcDNAを用いて決定されると、それをゲノムDNAに戻し、所望の配列（１つもしくは複数）を直接増幅することが可能であった。それぞれの遺伝子の5 ’及び3’プライマー配列及びベクターは以下の通りである：Auifex アスパラギン酸トランスフェラーゼＡベクター：pQET1Auifex アスパラギン酸トランスフェラーゼＢベクター：pQET1Auifex アデノシル−8−アミノ−7−オキソノナノエートアミノトランスフェラーゼベクター：pQET12 Aquifex アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼベクター：pQET12Ammonifex degensii アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼベクター：pQET12 Aquifex グルコサミン：フルクトース−６−リン酸アミノトランスフェラーゼベクター：pQET1Aquifex ヒスタジン−リン酸アミノトランスフェラーゼベクター：pQET1Pyrobacullum aerophilum 分枝鎖アミノトランスフェラーゼベクター：pQET1Ammonifex degensii hp アミノトランスフェラーゼベクター：pQET1 Aquifex アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼベクター：pQET1 指示される制限酵素部位はそれぞれの遺伝子について指示される細菌性発現ベクター上の制限酵素部位に相当する（キアジェン社、チャッツワース、ＣＡ）。 PQEベクターは抗生物質耐性（Amp^r）、細菌性複製起点（ori）、IPTG−調節可能プロモーターオペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位（RBS）、6−Hisタグ及び制限酵素部位をコードする。 pQEベクターを指示される制限酵素で消化した。増幅した配列をそれぞれのpQE ベクターに連結し、RBSをコードする配列を有する枠中に挿入した。次に、この連結混合物を電気穿孔法による大腸菌Ｍ15／pREP4株（キアジェン社）の形質転換に用いた。Ｍ15／pREP4はプラスミドpREP4の複数のコピーを有し、このプラスミドはlacIリプレッサーを発現し、かつカナマイシン耐性（Kan^r）をも付与する。形質転換体をLBプレート上で成長するそれらの能力により同定し、アンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択した。プラスミドDNAを単離し、制限分析により確認した。所望の構築体を含むクローンを、Amp（100μg／ml）及びKan（ 25μg／ml）の両者を補充したLB培地における液体培養で一晩（Ｏ／Ｎ）増殖させた。このＯ／Ｎ培養物を用いて、大量培養物に１：100ないし１：250の比で接種した。これらの細胞を0.4ないし0.6の光学密度60０（０.Ｄ.⁶⁰⁰）まで増殖させた。その後、IPTG（”イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド”）を 1mMの最終濃度まで添加した。IPTGはlacIリプレッサーを不活性化することによりＰ／Ｏの一掃を誘発し、これは遺伝子の発現の増加につながる。細胞をさらに３ないし４時間増殖させた。その後、遠心により細胞を回収した。上に詳述されるプライマー配列は、以下に説明されるハイブリダイゼーション技術による寄託物からの標的遺伝子の単離に用いることもできる。実施例２寄託されたゲノムクローンからの選択クローンの単離目的の遺伝子に対応する２つのオリゴヌクレオチドプライマーを、寄託物からのその遺伝子の増幅に用いる。ポリメラーゼ連鎖反応を、0.1μｇの目的の遺伝子のDNAを含む25μlの反応混合物中において行う。この反応混合物は1.5〜5mM M gCl₂、0.01％（w／v）ゼラチン,dATP、dCTP、dGTP、dTTPの各々20μM、各々のプライマー25ピコモル及び1.25単位のTaqポリメラーゼである。30サイクルのPCR（ 94℃で１分間の変性；55℃で１分間のアニーリング；72℃で１分間の伸長）をパーキン−エルマー・シータス（Perkin-Elmer Cetus）9600サーマルサイクラーを用いて行う。増幅した産生物をアガロースゲル電気泳動により分析し、期待される分子量を有するDNAバンドを切り出して精製する。このPCR産生物を、そのDNA 産生物のサブクローン化及び配列決定により、目的の遺伝子であることを立証する。本発明の多くの変更及び変形が上述の教示に照らして可能であり、したがって、添付の請求の範囲の範囲内で、本発明は特に説明されたものとは別の方法で実施することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＩＬ，ＪＰ，ＵＳ

Claims

【特許請求の範囲】１．（a）配列番号25〜32、35、および40に示されるアミノ酸配列を含む酵素をコードするポリヌクレオチドと少なくとも70%の同一性を有するポリヌクレオチド；（b）該(a)のポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチド；および（c）該(a)または該(b)のポリヌクレオチドの連続する少なくとも15個の塩基を含むポリヌクレオチドからなる群より選択されたメンバーを含む単離されたポリヌクレオチド。２．前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。３．前記ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。４．配列番号25のアミノ酸１〜414を含む酵素をコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。５．配列番号26のアミノ酸１〜373を含む酵素をコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。６．配列番号27のアミノ酸１〜453を含む酵素をコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。７．配列番号28のアミノ酸１〜343を含む酵素をコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。８．配列番号29のアミノ酸１〜398を含む酵素をコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。９．配列番号30のアミノ酸１〜592を含む酵素をコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。 10．配列番号31のアミノ酸１〜354を含む酵素をコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。 11．配列番号32のアミノ酸１〜303を含む酵素をコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。 12．配列番号36のアミノ酸１〜363を含む酵素をコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。 13．配列番号40のアミノ酸１〜394を含む酵素をコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。 14．(a)ＡＴＣＣ受託番号の寄託物に含まれるＤＮＡによって発現された酵素をコードするポリヌクレオチドと少なくとも70%の同一性を有するポリヌクレオチド；（b）該(a)のポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチド；および（c）該(a)または該(b)のポリヌクレオチドの連続する少なくとも15個の塩基を含むポリヌクレオチドからなる群より選択されたメンバーを含む単離されたポリヌクレオチド。 15．請求項２に記載のＤＮＡを含むベクター。 16．請求項13に記載のベクターを含む宿主細胞。 17．請求項14に記載の宿主細胞から前記ＤＮＡにコードされたポリペプチドを発現することを含む、該ポリペプチドの製造方法。 18．該細胞が請求項14に記載のベクターに含まれるＤＮＡによってコードされたポリペプチドを発現するように該細胞を該ベクターで形質転換またはトランスフェクトすることを含む、細胞の製造方法。 19．配列番号25〜32、36、および40に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%同一であるアミノ酸配列を含む酵素からなる群より選択されたメンバーからなる酵素。 20．アミノ酸を、α-ケト酸の存在下で、配列番号25〜32、36、および40に示されるアミノ酸配列を有する酵素からなる群より選択された酵素と接触させることを含む、アミノ基をアミノ酸からα-ケト酸に転移する方法。