JP2000505068A - 補体活性化を阻害する新規ペプチド類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 補体の活性化阻害能を有するペプチド類を提供する。これらのペプチド類を使用する補体活性化および補体介在組織損傷の阻害方法も提供する。また、これらのペプチド類を使用する補体活性化阻害能を有する組成物の製造方法と、該方法によって製造されたペプチド類似体および擬ペプチドも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 補体活性化を阻害する新規ペプチド類 序 本発明は、ナショナル・インスティテュート・オブ・ヘルスの後援による研究 の間に完成されたものである。合衆国政府は本発明にある種の権利を有しうる。 発明の背景 補体は、炎症反応に関与する一群の関連血漿蛋白質である。古典的および副経 路による補体の活性化は血小板、好酸球および好中球からキニン類を発生させる 。この活性化は食作用および感染症縮小に重要である。 補体は病原性生物に対する重要な防御ラインであるが、その活性化はまた宿主 の損傷を引き起こす。補体介在組織損傷が、試験アレルギー神経症（Vriesendro p et al.，J.Neuroimmunol.，1995,58:157）、ＩＩ型コラーゲン誘発関節炎（Wa tson,W.C.およびA.S.Townes,J.Exp.Med.,1985,162:1878）、重症筋無力症（Naka no,S.およびA.G.Engel,Neurology，1993,43:1167;Baroh,R.J.およびR.L.Brey,Cl in.Neurol.Neurosurg.，1993 95:285）、溶血性貧血(Schreiber,A.D.およびM.M. Frank,J.C1in.Invest.,1972 51:575)、糸球腎炎(McLean,R.H.,Pediatr.Nephrol. ,1993 7:226)および免疫複合体誘発脈管炎（Cochrane,C.G.,SpringerSemin.Immu nopathol.，1984 7:263）のような自己免疫疾患を包含する種々の疾患において 報告されている。また、成人呼吸窮迫症候（Robbins et al.，Am．Rev.Respir.D is.,1987 135:651）、卒中（Vasthare et al.,FASEB J.,1993 7:A424）、心臓発 作（Kilgore et al.，Cardiovasc.Res.1994 28:437）、異種移植（Wang etal.， Histochem．J．1992 28:437）、多発性硬化症（Williams et al.，Clin.Neurosc i.，19942:229）、火傷損傷（Gallinaro et al.，Surg.Gynecol.Obstet.，1992 174 :435）、体外透析および血液酸素付加(Pekna et al.，Clin.Exp.Immunol.，1 993 91:404)でも同定されている。 第三補体成分Ｃ３は、補体活性化の古典的および副経路の両方において重要な 役割を果たすことが知られている。古典的（Ｃ４ｂ，２ａ）および副（Ｃ３ｂ， Ｂｂ）経路Ｃ３コンベルターゼによるＣ３の蛋白分解的活性化は、Ｃ３の、アナ フィラトキシンペプチドＣ３ａおよびオプソニンフラグメントＣ３ｂへの開裂を 導く。補体攻撃を受けている標的細胞への準安定性Ｃ３ｂの共有結合は、Ｃ５ａ の発生およびＣ５ｂ−９膜攻撃複合体の形成をもたらす。しかし、補体活性化か らもたらされる組織損傷は、膜攻撃複合体Ｃ５ｂ−Ｃ９により直接伝達（介在） され、また、アナフィラトキシンペプチドＣ３ａおよびＣ５ａの発生により間接 的に伝達される。これらのペプチドは、それらの好中球およびマスト細胞に対す る作用を介して損傷を誘発する。Ｃ５ａで刺激されると、好中球は、組織損傷を 起こすセリンエラスターゼを産生する。Ｃ５ａも、好中球からの毒性酸素誘導遊 離ラジカルの発生を引き起こす。Ｃ３ａおよびＣ５ａ共に、ＩＬ−３初回免疫刺 激された好塩球からのインターロイキン類の速やかな、増強された産生を刺激す る。 活性化プロセスの制御は、補体活性化のレギュレーターと称される構造的、機 能的に関連した蛋白質の１ファミリー（以下、ＲＣＡと称する）により、イン・ ビボで伝達される。ＲＣＡは、血漿蛋白質、すなわち、因子ＨおよびＣ４結合蛋 白質、ならびに膜蛋白質、すなわち、補体受容体１（ＣＲ１）、崩壊促進因子（ ＤＡＦ）および膜補因子蛋白質（ＭＣＲ）の両方を包含する。これらの蛋白質は 、古典的および副経路のＣ３およびＣ５コンベルターゼを不活化することにより 、Ｃ３ａおよびＣ５ａの発生を阻害する。これらの蛋白質による補体活性化の阻 害は、Ｃ３およびＣ５コンベルターゼのサブユニットの解離により、および／ま たは因子１によるサブユニットの蛋白分解的不活化により達成される。 非常に多くの病状を経る補体介在組織損傷の重要性から、特異的補体インヒビ ターの必要性がますます高まっている。そのようなインヒビターを同定するため に種々のアプローチが用いられている。これらには、ペプチドまたは化合物を用 いてセリンプロテアーゼを標的とすることが包含される。ＰＣＴ／ＵＳ９５／０ ２９４５は、Ｃ３阻害活性を有する第１機能ドメインとＣ５ｂ−９阻害活性を有 する第２機能ドメインを持つキメラ補体インヒビター蛋白質を開示している。よ り最近、Ｃ３のチ オエステルを標的とすることが試みられている。例えば、Ｃ３の最も強力なイン ヒビターの１つと考えられているサリチルヒドロキサメートは、Ｃ３のチオエス テルと反応することにより補体を阻害する（Sim et al.，Biochem.J.，1981 193 :115）。この化合物による古典的および副経路介在溶血活性の阻害に要する５０ ％阻害濃度は、各々、２８０μＭおよび３３μＭであった。しかし、サリチルヒ ドロキサメートは、毒性副作用として、全身性紅斑狼瘡様症候を生じることが報告 されている(Simet al.，Lancet 1984 ii:422)。Kalliらは、ＣＲ１の可溶形（ｓ ＣＲ１）が、いくつかの補体依存性疾患モデルにおいて補体を阻害することを示 している(Springer Semin.Immunopathol.,1994 15:417)。 本発明においては、補体活性化を阻害するペプチドが同定され、合成される。 発明の概要 本発明の目的は、補体活性化を阻害するペプチドおよびペプチド類似体を提供 することである。本発明の具体的なペプチドは、配列番号１のペプチドのＮ−末 端環状領域の少なくとも一部からなる。好ましい具体例において、本発明のペプ チドは、配列番号２の少なくとも１３個のアミノ酸配列からなる。 本発明のもう１つの目的は、配列番号１または配列番号２を有する、Ｃ３と相 互作用し、補体の活性化を阻害することのできるペプチドの配座を同定し、つい で、Ｃ３と相互作用して補体の活性化を阻害するに十分に類似した配座を有する 組成物を製造することからなる補体活性化阻害能を有するペプチド類似体、擬ペ プチドのような組成物の製造方法を提供することである。 また、本発明のもう１つの目的は、Ｃ３と相互作用し、補体の活性化を阻害す ることのできるような、配列番号１または配列番号２を有するペプチド分と十分 に類似した配座からなる補体の活性化阻害能を有する組成物を提供することであ る。そのような組成物の例には、保存的アミノ酸置換、すなわち、配列番号１ま たは２と比較したときに構造を実質的に変化させない置換を有し、かつ補体阻害 活性を有する配列番号１または配列番号２のペプチド類似体が包含される。他の 例には、補体阻害作用を示すに十分に、配列番号１または２と類似した配座を有 する擬ペプチド が包含される。 さらに、本発明のもう１つの目的は、本発明のペプチドの有効量をヒトに投与 することからなる患者における補体活性化の阻害方法を提供することである。 本発明のさらなる目的は、本発明のペプチドの有効量を患者に投与することか らなる患者における補体介在組織損傷の治療方法を提供することである。 本発明のさらに他の目的は、人工器官またはインプラントに使用される生体適 合物質の表面を、本発明のペプチドでコートすることからなる人工器官またはイ ンプラントの使用中に起きる補体活性化の阻害方法を提供することである。 本発明のさらに他の目的は、本発明のペプチドで、生理液体（例、血液、尿） が流れるチューブをコートすることからなる該液体の体外シャントの間の補体活 性化阻害方法を提供することである。 図面の簡単な説明 図１は、Ｃ３および、Ｃ３の蛋白分解的活性化形であるＣ３ｂ、エラスターゼ を用いてＣ３から生じさせた１３５,３００ＭｒフラグメントであるＣ３ｃおよ びエラスターゼを用いてＣ３から生じさせた３５,０００Ｍｒフラグメントであ るＣ３ｄを包含するＣ３フラグメントに対する、ファージー展示ランダムペプチ ドライブラリーから単離されたＣ３結合クローンの特異結合を示す棒グラフであ る。マイクロタイタープレートのウエルを、２μｇのＣ３、Ｃ３ｂ、Ｃ３ｃまた はＣ３ｄでコートし、プロック緩衝液で飽和し、０.０５％Tween２０を含むＰＢ Ｓ（ｐＨ７.４）で洗浄し、陽性（クローン９）または陰性（クローン１）クロ ーンと共に２２℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ（ｐＨ７.４）中、凝集 Ｃ３ ２５０μｇ／ｍｌを添加して結合を阻害した。結合したＭ１３ファージ粒 子を、パーオキシダーゼ結合抗Ｍ１３抗体およびＡＢＴＳパーオキシダーゼ基質 により検出した。斜線を付した棒は、プレートに対するパーオキシダーゼ結合抗 Ｍ１３抗体の非特異的結合を示す。交差した斜線を付した棒は、Ｃ３またはＣ３ フラグメントに対するクローン９の結合を示す。横線を付した棒は、２５０μｇ ／ｍｌの凝集Ｃ３の存在下におけるＣ３またはＣ３フラグメントに対するクロー ン９の結合を示す。縦線を 付した棒は、Ｃ３またはＣ３フラグメントに対するクローン１の結合を示す。 図２は、ペプチドＩのＣ３およびＣ３フラグメントに対する結合を示す折れ線 グラフである。マイクロタイタープレートをペプチドＩでコートし、ブロック緩 衝液で飽和し、０.０５％Tween２０を含有するＰＢＳ(ｐＨ７.４)で洗浄し、Ｃ ３（●）、Ｃ３ｂ（■）、Ｃ３ｃ（▲）またはＣ３ｄ（▼）の２倍稀釈液と共に ２２℃で１時間インキュベートした。ついで、プレートを洗浄し、ポリクローナ ル・ウサギ抗Ｃ３抗体（２μｇ／ｍｌ）およびパーオキシダーゼ結合抗ウサギ抗 体の１：１０００稀釈と共にインキュベートした。ＡＢＴＳパーオキシダーゼ基 質で発色させた。 図３は、本発明のペプチドによる好酸球の古典的および副経路介在細胞溶解の 阻害を示す折れ線グラフである。環状ペプチド（ペプチドＩ（●）およびペプチ ドＩＶ（▲））ならびに還元およびアルキル化ペプチド（ペプチドＩＩ（■）お よびペプチドＶ（▼））の補体活性化の副経路（図３Ａ）および古典的経路（図 ３Ｂ）に対する効果を試験した。 図４は、正常ヒト血清（以下、ＮＨＳと称する）における副経路活性化の間の ペプチドＩＶによるＣ３開裂阻害を示す。Ｃ３の開裂は、５ｍＭ ＭｇＥＧＴＡ 、ザイモサンおよび濃度の増加するペプチドＩＶと共に¹²⁵Ｉ−Ｃ３（０.５μＣ ｉ）含有ＮＨＳを３７℃にて３０分間インキュベートすることにより測定した。 試料を還元条件下、７.５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動させ、ついで、ゲルをオ ートラジオグラフィーに付した。放射活性バンドを切り出し、計数した。Ｃ３の １００％開裂がペプチドＩＶ不存在下のＣ３開裂と等しいとして、データを正規 化した。対照は、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含有していた。還元およびアルキル化ペ プチドＶ（２００μＭ）を対照ペプチドとして含めた。 図５は、精製成分で再構成された副経路の活性化の間のペプチドＩＶによるＣ ３開裂の阻害を示す。副経路を、Ｃ３および因子ＢおよびＤを添加して再構成し 、種々の濃度のペプチドＩＶを添加した。還元条件した、７.５％ＳＤＳ−ＰＡ ＧＥ上で泳動させて試料を分析した。ゲルをクーマシーブルーで染色し、各バン ドの強度をデンシトメーター分析で測定した。ペプチドＩＶの不存在下に見られ るＣ３の開裂を、Ｃ３の１００％開裂としてデータを正規化した。対照は、ＥＤ ＴＡを含有して いた。還元およびアルキル化ペプチドＶ（２００μＭ）を対照として含めた。 図６は、因子Ｂ開裂に対するペプチドＩＶの作用を示す。因子Ｂ開裂を、Ｍｇ ＥＧＴＡの存在下、Ｃ３ｂを、因子Ｂ、因子Ｄおよび種々の濃度のペプチドＩＶ （６μＭ〜４００μＭ）と共に３７℃で１時間インキュベートして測定した。試 料を、ＤＴＴの存在下７.５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析した。ゲルを染色し、 デンシトメーター分析でスキャンした。還元およびアルキル化ペプチドＶ（２０ ０μＭ）を対照ペプチドとして含めた。対照は、１０ｍＭ ＥＤＴＡの添加によ りセットした。 図７は、マイクロタイタープレートにコートしたＣ３に結合するプロペルジン に対するペプチドＩＶの効果を示す棒グラフである。Ｃ３（２０μｇ／ｍｌ）を マイクロタイタープレートのウエルにコートし、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含有する ＮＨＳおよびペプチドＩＶの濃度グラジエントと共に２２℃で１時間インキュベ ートした。プロペルジンの結合をポリクローナル・ヤギ抗プロペルジン抗体(１０ μｇ／ｍｌ)およびパーオキシダーゼ結合抗ヤギ抗体の１：１０００稀釈により 検出した。還元およびアルキル化ペプチドＶを対照ペプチドとして含めた。 発明の詳細な説明 補体活性化を阻害するペプチド類が同定されている。本発明のペプチドは、配 列番号１のＮ−末端環状領域の少なくとも一部からなる。好ましい具体例におい ては、本発明のペプチドは、配列番号２の少なくとも１３個のアミノ酸配列から なる。配列番号１および配列番号２の類似体および擬似体も本発明範囲内のもの である。 本発明のペプチドを同定するため、２７アミノ酸の長さのランダムペプチドを 発現する２×１０⁸のユニーククローンを含むファージー展示ランダムペプチド ライブラリーをスクリ−ニングした。このライブラリーのペプチドはバクテリオ ファージＭ１３のマチュア蛋白ＩＩＩのアミノ酸末端と融合している。Ｃ３ｂは 他の補体蛋白質に対して比較的低い親和性を有しているので、これらの相互作用 の研究には、伝統的に半生理イオン強度緩衝液が使用されている。しかし、高い 親和性を有するファージを選択する可能性を高めるために、バイオパンニング用 の生理イオン強度の緩衝液を使用した。Ｃ３結合ペプチドを発現するファージ粒 子を、Ｃ３ｂをコー トしたマイクロタイタープレートで培養してアフィニティ精製した。３回のバイ オパンニングの後、個々のファージを単離し、結合をテストした。１６クローン のうち１４クローンがＣ３ｂと結合した。全陽性クローンからＤＮＡを単離し、 各々の塩基配列を決定した。全１４陽性クローンは同じ配列を有しており、この クローンが特異的で、２回および３回のバイオパンニングの間に増幅されたこと を示していた。 個々の陽性（クローン９、配列番号４）および陰性（クローン１）クローンで 得られた結合結果は、クローン９が固定化Ｃ３、Ｃ３ｂおよびＣ３ｃと結合した が、Ｃ３ｄとは結合しなかったことを示した（図１参照）。陽性クローンの結合 強度は、Ｃ３＞Ｃ３ｂ＞Ｃ３ｃの順であった。クローン９の結合の特異性は、Ｅ ＬＩＳＡで示された。凝集Ｃ３（２５０μｇ／ｍｌ）は、Ｃ３、Ｃ３ｂおよびＣ ３ｃに対する結合を著しく阻害した。 ファージー展示ペプチドに相当する２７アミノ酸ペプチド（配列番号１）を合 成した。このペプチドは、その環状形のものを、ここでペプチドＩと称する。ペ プチドＩのアミノ酸配列を表１に示す。ペプチドＩは、Ｃ３および幾つかのＣ３ フラグメントと結合し、補体活性化の古典的および副経路の両方を阻害すること が判明した。この合成ペプチド（ペプチドＩ）をマイクロタイタープレートにコ ートし、そのＣ３およびＣ３フラグメントに対する結合をＥＬＩＳＡで分析した 。固定化ペプチドＩＣ３およびＣ３ｂと結合したが、Ｃ３ｄとの結合は検出され なかった（図２）。ペプチドＩは、Ｃ３ｃとも結合せず（図２）、その天然配座 にＣ３ｃが存在する場合、該ペプチドの結合部位が埋められることを示している 。 このペプチドは、ヒトＣ３の濃度の約２倍の濃度でＣ３の蛋白分解的活性化を 阻害することにより、正常ヒト血清における補体活性化を阻害する。副経路の阻 害を、ＭｇEＧＴＡの存在下にウサギ好酸球を用いて測定し（図３Ａ）、抗体コ ート・ヒツジ好酸球の細胞溶解阻害を、古典的経路阻害の指標として使用した（ 図３Ｂ）。ペプチドＩは、各々、６５μＭおよび１９μＭのIＣ₅₀で、古典的お よび副経路の両方を阻害した。 阻害のメカニズムの分析は、このペプチドが、ＭｇＥＧＴＡの存在下で正常ヒ ト 血清中のＣ３開裂を阻害したことを示した。副経路を精製補体成分で再構成っし た場合に同様な結果が得られた。しかし、このペプチドは、因子Ｂの開裂を阻害 せず、Ｃ３ｂと因子Ｂの相互作用またはＣ３ｂ，Ｂｂの生成に影響しなかったこ とが示された。また、このペプチドはプロペルジンとＣ３との結合にも影響を与 えず、正常ヒト血清におけるＣ３開裂の観察された阻害は、一部、プロペルジン 安定化Ｃ３コンベルターゼに対するその影響によるものでないことを示した。こ れらの結果は、Ｃ３ｂの発生に続く活性化プロセスを阻害する補体活性化の他の レギュレーター(因子Ｈ、ＭＣＰ、ＤＡＦおよびＣＲ１）と異なり、本発明のペ プチドが天然Ｃ３と直接相互作用し、その活性化を阻害することを示している。 ペプチドＩの種々の類似体を試験し、補体の阻害に関与する該ペプチドの領域 または残基を決定した。これらの試験の結果を表１に示す。全てのペプチドの純 度および同一性をレーザー脱着マススペクトル分析(Moore，W.T.，Biol.Mass Sp ectrom.1993 22:149-162)で厳密にモニターした。全ての環状ペプチドにおいて 、チオールとｐ−ヒドロキシメルクリ安息香酸との反応を含むマスシフト分析(A ngeletti et al.，Techniques in Protein Chemistry VII.，MarshakDR．Ed.，S an Diego,Academic Press，1996 p.261)を使用するマススペクトル分析によりジ スルフィド結合の形成を確認した。 表１ Ｃ３結合ぺプチドおよびその類似体のアミノ酸配列および機能的活性 （N.D.:実施せず） Ｃ３との相互作用に必要なペプチドＩの最小領域を同定するため、２つのオー バーラップするペプチドを合成し、古典的および副経路介在溶血分析においてそ れらの活性を測定した。表１参照。テストした２つのオーバーラップするペプチ ドは、環状１３−アミノ酸Ｎ−末端ペプチド（ペプチドＩＶ）および鎖状１７マ ーＣ末端ペプチド（ペプチドＩＩＩ）であった。阻害活性は、親ペプチド（ペプ チドＩＶ）の環状Ｎ−末端領域により保持されていた。対照的に、ペプチドＩＩ Ｉは阻害活性を示さず、この領域が結合には重要でないことが示された。また、 各々、ペプチドＩおよびＩＶを、還元し、アルキル化して鎖状ペプチドＩＩおよ びＩＶを調製した。この還元およびアルキル化は、ペプチドＩおよびＩＶの阻害 活性を破壊し、ペプチドＩおよびＩＶの安定構造を維持するためにシステイン・ ジスルフィド架橋が重要であることが示された。副経路を阻害するのに必要なペ プチドＩまたはＩＶの濃度は、古典的経路を阻害するのに必要な濃度よりも低か ったが、これは、多分、副経路の方がＣ３の標的細胞上での活性化および沈着に 、より感受性であるためである。 ペプチドＩＶは、該制約された(constrained)領域の外に２つのフランキング ・アミノ酸残基を含んでいる。ペプチドの大きさをさらに減じるため、これら２ つの残基を削除してペプチドＶＩを得た。この削除は、ペプチドの活性を２.８ 倍減じることになり、ペプチドの阻害活性の増強にこれらの残基の重要性が示さ れた。 ペプチドの最小機能領域を位置付けするため、さらなる一連の類似体を合成し た。環の大きさを変化させることにより、短く制約されたペプチドを生じさせた 。この目的のため、１１員環内部の１〜６残基を削除した（表１、ペプチドＶＩ Ｉ〜ＸＩＶ）。この一連のペプチド全てにおいて、活性が失われ、１１員環の全 長が該生物活性に重要であることが示された。 さらなる一連の類似体において、ペプチドの生物活性を維持するための各残基 の貢献を決定するため、各残基をＡｌａで置換した。この一連の９個のペプチド （表１のペプチドＸＶ〜ＸＸＩＩＩ）において、２つのシステインを除いて１１ 員環の各残基を、系統的にアラニンで置換した。Ｖａｌ³、Ｈｉｓ⁹またはＡｒｇ¹⁰ の置換は、機能的活性の最小変化をもたらし、これらの残基がＣ３ｂとの相互 作用に顕著には貢献していないであろうことが示された。Ｖａｌ²、 Ｇｌｎ⁴、Ａｓｐ⁵またはＴｒｐ⁶の置換は、ペプチドＶＩと比較して、ペプチド の活性を６〜３６倍減じた。これらの残基はペプチドのＮ−末端側半分に集中し ている。Ｇｌｙ⁷のＡｌａによる置換は、ペプチドの活性を１００倍以上も劇的 に減少させ、該Ａｌａの側鎖がペプチドのＣ３への結合を立体的に妨害するか、 グリシンの周囲の自由回転が結合に重要であることが示唆された。かくして、Ｖ ａｌ²、Ｇｌｎ⁴、Ａｓｐ⁵およびＴｒｐ⁶の側鎖が、ペプチドの結合および生物活 性に著しく貢献していると考えられる。 ペプチドＩＶはまた、Ｃ３コンベルターゼＣ３ｂ，Ｂｂが介在するＣ３の開裂 を濃度依存的に阻害することが測定された（図４）。このペプチドは、１０μＭ のＩＣ₅₀でＣ３開裂を阻害し、これは溶血活性の５０％阻害に必要な濃度とよく 相関した（表１）。血清中での補体活性化の間に、Ｃ３コンベルターゼがＣ３を Ｃ３ｂに開裂し、これは直ちに因子ＨおよびＩによりｉＣ３ｂに不活性化される 。この分析は、活性化の間に生じたｉＣ３ｂの量を測定する。すなわち、測定し た阻害が、Ｃ３コンベルターゼによるＣ３開裂の阻害によるもので、Ｃ３ｂのｉ Ｃ３ｂへの因子ＨおよびＩ介在開裂によるものでないことを証明するために、５ μｇの精製Ｃ３ｂを、ペプチドＩＶ存在下に１μｇの因子Ｈおよび０.０４μｇ の因子Ｉと共にインキュベートした。Ｃ３開裂についてのＩＣ₅₀よりも３０倍の 濃度である３００μＭでさえも、ｉＣ３ｂ生成阻害は認められなかった。 ペプチドＩＶの、可能な人工標識物質を含まない精製Ｃ３に対する作用を調べ るため、副経路を精製Ｃ３、因子Ｂおよび因子Ｄで再構成した（図５）。ペプチ ドＩＶは、２８μＭのＩＣ₅₀でＣ３のＣ３ｂへの蛋白分解的活性化を阻害した。 ペプチドＩＶの還元、アルキル化形であるペプチドＶは、Ｃ３開裂の何ら影響し なかった。 液相分析におけるＣ３と因子Ｂとの相互作用も調べた。ここでは、ペプチドＩ Ｖの存在下または不存在下に、Ｃ３ｂ，Ｂｂを生じさせるため、精製Ｃ３ｂ、因 子Ｂおよび因子ＤをＭｇＥＧＴＡと共にインキュベートした。因子Ｄの濃度を調 整して、因子Bの限定的開裂を生じさせた。ペプチドＩＶは、因子Ｂ開裂の阻害 を示さず(図６)、このペプチドがＣ３ｂと因子Ｂとの相互作用またはＣ３ｂ，Ｂ ｂ形成に何の影響も及ぼさないことが示された。 プロペリジンのＣ３との結合に対するペプチドＩＶの影響も、競合ＥＬＩＳＡ を用いて調べた（図７参照）。ペプチドＩＶは、プロペリジンのＣ３に対する結 合に何の顕著な影響を持たず、ＮＨＳにおいて認められたＣ３開裂阻害は、プロ ペリジン安定化Ｃ３コンベルターゼ、Ｃ３ｂ，Ｂｂ，Ｐの崩壊によるものでない ことが示された。 Ｃ３の蛋白分解的活性化形、Ｃ３ｂは２０以上の血清および膜蛋白質と結合し 、その大部分が、構造的、機能的に関連した超科(superfamily)に属している。 しかしながら、天然Ｃ３においては、これらの蛋白質に対する結合部位が埋めら れており、Ｃ３のＣ３ｂへの開裂の際に起こる配座変化の後にのみ利用できるよ うになる。図１、２および５は、ペプチドＩおよびＩＶが天然Ｃ３と結合し、そ の活性化をそばいすることを明らかにしている。すなわち、これらの阻害ペプチ ドによる補体の阻害は、Ｃ５ａの発生のみならず、Ｃ３ａの発生も阻害する。 同定されたファージー展示Ｃ３結合ペプチドに類似する本発明の合成ペプチド は、ＮＨＳ中のＣ３の濃度よりも２倍だけ高い濃度で補体活性化の副経路を抑制 できた（図３および表１）。古典的経路の阻害に必要な濃度は、副経路の阻害に 必要な濃度の５倍であり、本発明のペプチドの阻害活性が多分、Ｃ３またはＣ３イ ンベルターゼの活性化に向けられているこが示された。したがって、本発明のペ プチドは、補体介在損傷が関与する疾患の治療に有用であると考えられる。補体 介在疾患の例には、限定するものではないが、試験アレルギー神経症、ＩＩ型コ ラーゲン誘発関節炎、重症筋無力症、溶血性貧血、糸球腎炎および免疫複合体誘 発脈管炎のような自己免疫疾患を包含する種々の疾患、成人呼吸窮迫症候、卒中 、心臓発作、異種移植、多発性硬化症、火傷損傷、体外透析および血液酸素付加 が包含される。かくして、本発明においては、補体介在損傷が関与する疾患の患 者に本発明のペプチドの有効量を投与して、補体の活性化を阻害することができ る。「有効量」なる用語は、補体の活性化を阻害することのできるペプチドの濃度 を意味する。このような濃度は、本明細書で提示しているようなイン・ビトロの データに基づいて日常業務的に決定できる。適当な投与様式、用量範囲および製 剤ビヒクルも、治療すべき疾患および患者のプロフィールに従って当業者が日常 業務的に決定できる。 本発明の組成物も、補体活性化の阻害が所望の他の状況における用途が見出さ れる。例えば、異種（xenographic）または同種異系（allographic）移植におい て起こる補体活性化は、そのような移植を受けた患者に本発明のペプチドを投与 することにより、または器官を本発明のペプチドでコートすることにより阻害で きる。さらに、本発明のペプチドは、人工器官およびインプラントに使用される 生体適合物質をコートし、そのような人工材料の使用の間に起こる補体活性化を 阻害するために使用できる。他の例として、生理液体の体外シャントの間の補体 活性化は、該液体が流れるチューブを本発明のペプチドでコートすることにより 阻害できる。この方法は、血液透析、腎臓透析および心肺バイパス循環を包含す る種々の体外シャント技術に適用できる。 ペプチドＩおよびＩＶの阻害活性は、ヒトＣ３に非常に特異的である。ペプチ ドＩおよびＩＶは、マウスまたはラット補体によるウサギの好酸球の補体介在細 胞溶解に対する阻害活性は持たなかった。さらに、溶血活性をヒトＣ３で再構成 する、これらのペプチドのＣ３ノックアウトマウスにおける研究は、ヒト血清に 見られる濃度と同様な濃度で阻害を示した。したがって、これらのペプチドの種 々の疾患モデルにおけるイン・ビボ有効性の最初のテストは、ヒトＣ３を発現し ているトランスジェニックマウスのようなモデルまたは、別法として、ヒトＣ３ を注入しているＣ３ノックアウトマウスにおいて行う必要がある。モルモット、 ブタおよびサルの補体におけるペプチドＩＶの阻害活性も測定した。該ペプチド は、サルの補体を阻害したが、モルモットまたはブタの補体を阻害しなかった。 ベンガルザル、カニクイザルおよびヒヒにおける補体阻害はヒトにおける阻害に 匹敵した。 蛋白質またはペプチドのクリアランス速度はその生物効果の重要な決定因子で ある。したがって、本発明のペプチドのイン・ビボ半減期をＳＪＬマウスで測定 した。溶血分析でペプチドＩＶと同等の活性を示した、Ｃ−末端にチロシン残基 を含む本発明のペプチド（ＩＣＶＶＱＤＷＧＨＨＲＣＴＡＧＨＹＹ（配列番号２ ３））を使用した。このペプチドは、１１時間のｔ_1/2を有する異質なクリアラ ンス速度を示した。 本発明のペプチドのＣ３に対する特異性および有効性により、それらはまた、 イ ン・ビトロ分析系におけるＣ３活性化を阻害する試薬としても使用できる。また 、これらのペプチドのＣ３に対する特異性により、これらは、補体カスケードの 異なる成分の重要性をさらに解明する上において非常に有用となる。 本発明のペプチド、特に配列番号１および配列番号２はまた、Ｃ３と相互作用 し、補体活性化を阻害するのに必要なペプチドの特異配座特徴を同定するにも有 用である。構造−機能分析の一例を実施例１２に記載する。この研究では、本発 明のペプチドのretro−inverso擬ペプチドを使用し、ペプチドの補体阻害活性に おける主鎖対 側鎖アミノ酸配座が比較的重要であることを示した。 本発明のペプチドの構造を決定する他の標準的なアプローチも使用できる。こ れらには、種々のコンピュータ化法と組み合わせた多くの核磁気共鳴技術が包含 される。 そのような標準的アプローチを使用して、十分に類似した配座を有する組成物 を製造し、それらの補体活性化阻害能をテストできる。「十分に類似」なる用語は 、Ｃ３と相互作用し、補体活性化を阻害できる配座を意味する。さらに、Ｃ３ノ ックアウトマウスまたはヒトＣ３発現マウスを、抗Ｃ３モノクローナル抗体で特 異的機能をブロックするか、Ｃ３の変異形を注入することにより、ヒトＣ３の構 造／機能関係の研究に使用できる。 短いペプチドの個々の所望の配座が確認されれば、ペプチドまたは擬ペプチド をその配座に適合するように設計することは当該分野でよく知られていることで ある。例えば、G．R．Marshall(1993)，Tetrahedron，49:3547-3558;Hrubyおよ びNikiforovich(1991)，Molecular Conformation and Bilogical Interactions ，P.Balaram&S.Ramasehan，eds.，Indian Acad.of Sci.，Bangalore，PP.429-45 5参照。ペプチド類似体の設計は、上記したようにアミノ酸残基の種々の側鎖の 貢献を考慮すること（すなわち、官能基の影響または立体的配慮について）によ り、さらに精密にできる。 擬ペプチドが、Ｃ３との結合および補体活性化阻害に必要な特異的主鎖配座お よび側鎖機能を提供する目的に、ペプチドと同等に供することのできることは当 業者に明らかなところである。したがって、天然のアミノ酸、アミノ酸誘導体、 類似体 または結合能を有する非アミノ酸分子のいずれかを用いて適当な主鎖配座を形成 させることによってＣ３結合、補体阻害化合物を製造することは本発明の範囲内 のものと考える。非ペプチド類似体またはペプチドおよび非ペプチド成分からな る類似体を、本明細書においては、ときどき、「擬ペプチド」と称し、例示したペ プチドと、補体の活性化を阻害するに十分に類似するように、同じ主鎖配座特徴 および／または他の機能性を有する本発明のペプチドの置換または誘導体化を意 味する。 高親和性ペプチド類似体の開発のために擬ペプチドを使用することは、当該分 野でよく知られている(例えば、Zhae et al.，(1995)，Nature Structural Biol ogy 2:1131-1137;Beely，N.(1994)，Trends in Biotechnoloty 12:213-216;Hrub y，V．J．(1993)，Biopolymers 33:1973-1082参照）。回転束縛がペプチド内の アミノ酸残基のものと類似しているとして、非アミノ酸部分を含む類似体を分析 でき、それらの配座モチーフを、とりわけ、ラマチャンドランプロット(上記Hru byおよびNikiforovich参照)により確かめることができる。 以下に、非限定的実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。 実施例 実施例１ 薬品および緩衝液 Nova Biochem（San Diego，CA）から得たFmocアミノ酸を除いて、ペプチド合 成に使用した全ての薬品および試薬は、Applied Biosystems（Foster City，CA ）から購入した。ベロナール緩衝食塩水（ＶＢＳ、ｐＨ７.４）は、５ｍＭのバ ルビタールおよび１４５ｍＭのＮａＣｌを含んでいた。ゼラチン・ベロナール緩 衝食塩水（ＧＶＢ）は、０．１％ゼラチン含有ＶＢＳ、ＧＶＢ⁺⁺は、０.５ｍＭ のＭｇＣｌおよび０.１５ｍＭのＣａＣｌ₂含有ＧＶＢ、ＧＶＢＥは１０ｍＭのＥ ＤＴＡを含有するＧＶＢであった。ＭｇＥＧＴＡは、０．１ＭのＭｇＣｌ₂およ び０.１ＭのＥＧＴＡを含んでいた。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７.４）は １０ｍＭのリン酸塩および１４５ｍＭのＮａＣｌを含んでいた。ブロック緩衝液 は、０.５％ミルクおよび１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含んでいた。 実施例２ 精製補体成分 ヒト補体蛋白質Ｃ３、因子Ｂ、因子Ｈおよび因子Ｉをよく知られた方法に従っ て正常ヒト血清から精製した。これらの実験で使用するＣ３は、Pangburn,M.K., J．Immunol．Methods1987 102:7に記載される方法に従ってMonoSカラム（Pharma cia,Piscataway,NJ）上で蛋白質試料を分析することによって測定されるように ７２％の天然Ｃ３および２８％のＣ３（Ｈ₂Ｏ）の混合物であった。Ｃ３ｂは、 Ｃ３の限定トリプシン開裂によって生じさせ、Becherer,J.D.およびJ.D.Lambris( Journalof Biological Chemistry 1988 263:14586)が記載する方法に従ってMono Qカラム（Pharmacia）上で精製した。Ｃ３ｃおよびＣ３ｄは、Ｃ３のエステラ ーゼ処理により生じさせ、同様にBechererおよびLambrisに記載されるようにMon o Qカラム上で精製した。凝集Ｃ３は、Erdeo et al．（Eur.J.Immunol.，1995 1 5 :184）により記載される方法に従って、グルタルアルデヒドを使用して調製し た。ヨウ素化のため、天然Ｃ３をMono Sカラム上でＣ３（Ｈ₂Ｏ）から分離し、^{1 25} ＩおよびIodogen（Pierce Chemical Co.，Rockford，IL）で放射標識した。標 識Ｃ３の比活性は１.０から２.５μＣｉ／μｇと変化した。 実施例３ ファージライブラリーの構築 ライブラリーは、各々、ｐＩＩＩのＮ−末端におけるペプチド配列ＳＲＸ₁₂（Ｓ 、Ｐ、ＴまたはＡ）Ａ（Ｖ、Ａ、Ｄ、ＥまたはＧ）Ｘ¹² ＳＲを発現する２×１ ０⁸形 質転換体からなっていた。固定および半固定のアミノ酸（オリゴヌクレオチド設 計のため）にアンダーラインを付してある。ライブラリーは、Kay et al．によ って発行された方法（Gene 1993 128:59）に従って構築された。ランダムアミノ 酸はＮＮＫによってコードされた。ここに、Ｎは等モル比のＡ、Ｃ、ＧまたはＴ を意味し、ＫはＧまたはＴを意味する。ＮＮＫコーディング・スキームは３２コ ドンを利用して２０アミノ酸をコードする。核アミノ酸の頻度は、コドン当たり 、１回（Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｗ、Ｙ）、2回（Ａ、Ｇ、 Ｐ、Ｖ、Ｔ）または３回（Ｌ、Ｒ、Ｓ）である。 実施例４ ファージライブラリーのバイオパンニング 実施例３に記載のファージライブラリーをスクリ−ニングしてＣ３−結合ファ ージを単離した。マイクロタイターウエルプレート（Nunc Inc.，Naperville，I L）を、ＰＢＳ中２０μｇのＣ３ｂで４℃にて一夜コートし、１％ＢＳＡ含有Ｐ ＢＳで２２℃にて３０分間ブロックした。洗浄後、６×１０¹¹プラーク形成単位 のライブラリーを各ウエルに加え、４℃にて一夜インキュベートした。ウエルを 、０．１％Tween２０および０.１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで５回洗浄した。結 合ファージ粒子を１００ｍＭ グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２.３）で溶出し、直ち に１００ｍＭ Tris−ＨＣｌ（ｐＨ８.５）で中和した。回収したファージ粒子 をＤＨ５αＦ’イー・コリ（E．coli）中で増幅した。このバイオパンニング操 作を２回繰り返した。３回目の増幅後に得られた増幅ファージ混合物を培養し、 陽性ファージを、ＥＬＩＳＡにおけるＣ３ｂとの結合を確認することにより同定 した。ここでは結合ファージは、パーオキシダーゼ標識抗Ｍ１３抗体（Pharmaci a）によって検出した。よく知られた方法に従い、陽性ファージストックからＤ ＮＡを調製し、ジデオキシ配列決定に付した。 実施例５ ペプチドの合成および精製 ペプチドは、Fmocアミド樹脂を使用し、Applied Biosystemペプチドシンセサ イザー（モデル４３１Ａ）で合成した。側鎖の保護基は、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ａ ｓｐ（ｏｔＢｕ）、Ａｒｇ（Ｐｍｃ）、Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、 Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）、Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）で あった。５％フェノール、５％チオアニソール、５％水、２.５％エタンジオー ルおよび８２.５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む溶媒混合物と共に２２℃ で３時間インキュベートして樹脂からペプチドを開裂した。反応混合物をガラス 濾過器で濾過し、冷エーテルで沈澱させ、０．１％ＴＦＡを含有する５０％アセ トニトリルに溶解し、凍結乾燥した。開裂後に得られた粗ペプチドを０.１％Ｔ ＦＡ含有１０％アセトニトリルに溶解し、逆相Ｃ−１８カラム（Waters,Milford ,MA）を用いて精製した。ペプチドの０.１Ｍ重炭酸アンモニウム中、０.１５ｍ Ｍ溶液（ｐＨ８.０）を撹拌し、 ２２℃にて４８時間酸素を通気して精製ぺプチド（配列番号１、２、５〜２１） のジスルフィド酸化を行った。精製ペプチドＩを１０ｍＭジチオトレイトール（ ＤＴＴ）で還元し、４０ｍＭヨードアセトアミドでアルキル化した。全てのペプ チドの同一性および純度をレーザー脱着マススペクトル分析で確認した。 実施例６ Ｃ３およびＣ３フラグメントに対するペプチドの結合 Ｃ３および種々のＣ３のフラグメントに対する合成ペプチドの結合を、ＥＬＩ ＳＡにより評価した。マイクロタイタープレート（Nunc）を４００μｇ／ｍｌの ペプチドＩ １００μｌまたはＢＳＡにカップリングしたペプチドＩ（１：１、 ｗ／ｗ）１０μｇ／ｍｌで３７℃にて１時間コートし、ついでブロック緩衝液で ２２℃にて３０分間飽和させた。プレートを０.０５％Tween２０含有ＰＢＳで３ 回洗浄し、種々の量のＣ３またはＣ３フラグメントを添加した。２２℃にて１時 間インキュベーション後、ウエルを洗浄し、２μｇ／ｍｌのポリクローナルウサ ギ抗Ｃ３抗体１００μｌと共に２２℃で１時間インキュベートした。非結合抗Ｃ ３抗体を洗浄により除去して、パーオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧの１： １０００稀釈を加え、２２℃で１時間インキュベートした。ＡＢＳＴパーオキシ ダーゼ基質を添加して発色させ、４０５ｎｍで光学的密度を測定した。ペプチド 不存在下のプレートに対するＣ３およびC３フラグメントの非特異的結合を差し 引き、正味結合を算出した。 実施例７ 溶血分析 古典的および副経路活性のペプチドによる阻害をっ測定した。ペプチドの古典 的経路に対する影響を測定するため、種々の濃度のペプチドを正常ヒト血清（Ｎ ＨＳ、ＧＶＢ⁺中、１：１０稀釈）１１μｌおよび抗体（ＥＡ、１×１０⁹／ｍｌ ）でコートしたヒツジ好酸球５μｌと混合し、ＧＶＢ⁺⁺を添加し、全量を２５０ μｌとした。反応混合物を３７℃にて１時間インキュベートし、遠心分離した。 上澄液の光学的密度を４１４ｎｍで測定し、細胞溶解％を求めた。ペプチドの副 経路に対する影響を、ＮＨＳ中のウサギ好酸球（Ｅｒ）の溶解を測定することに より求めた。種々の濃度のペプチドを５μｌのＮＨＳ、５μｌのＭｇＥＧＴＡお よび１０μｌのＥｒ（１ ×１０⁹／ｍｌ）と混合し、ＧＶＢ中で最終濃度１００μｌとした。反応混合物 を３７℃で２０分間インキュベートし、２００μｌのＧＶＢＥを添加して停止し た。遠心分離後、４１４ｎｍで溶解を測定した。１００％溶解をペプチド不存在 下において起こった溶解と等しいと考えて、溶解％を正規化した。 実施例８ Ｃ３のＣ３コンベルターゼ介在開裂の測定 ＮＨＳ中におけるペプチドＩＶ（配列番号２）によるＣ３開裂の阻害を測定し た。０.５μＣｉの¹²⁵Ｉ−Ｃ３および１４.３ｍＭのＭｇＥＧＴＡを含む３５％ ＮＨＳ７μｌを、ペプチドＩＶ（配列番号２）の濃度グラジエントおよび４μｌ の５０％ザイモサンと混合した。ＧＶＢを添加して反応混合物の全量を２０μｌ に調整した。試料を３７℃で３０分間インキュベートし、１０μｌの３０ｍＭ ＥＤＴＡと混合し、遠心分離した。得られた上澄液を１０ｍＭ ＤＴＴを含有す るＳＤＳ試料緩衝液と混合し、７.５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析し、オー トラジオグラフィーに付した。放射活性バンドを切り出し、計数して開裂したＣ ３％を計算する。１００％¹²⁵Ｉ−Ｃ３開裂がペプチド不存在下における¹²⁵Ｉ− Ｃ３開裂と等しいと考えて、¹²⁵Ｉ−Ｃ３開裂％を正規化した。対照は１０ｍＭ ＥＤＴＡの存在下でインキュベートした。 精製補体成分によるＣ３開裂に対するペプチドＩＶ（配列番号２）の影響も測 定した。２μｇのＣ３を種々の濃度のペプチドと共に３７℃で１５分間インキュ ベートした。ついで、５ｍＭ ＭｇＥＧＴＡの存在下、２μｇの因子Ｂおよび０ .０４μｇの因子Ｄを加え、全量を２０μｌとして副経路を活性化した。３７℃ で２時間後、試料を７.５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動させ、染色し、スキ ャンニングしてデンシトメーター分析し、Ｃ３開裂％を算出した。１００％Ｃ３ 開裂がペプチドの不存在下におけるＣ３開裂の量に等しいと考えて、得られたデ ータを正規化した。 実施例９ 因子Ｂ開裂の測定 因子Ｄによる因子Ｂの限定開裂を定量して因子Ｂに対するペプチドＩＶ（配列 番号２）の影響を測定した。Ｃ３ｂ（２μｇ）を、種々の濃度のペプチドと共に ３７℃ にて１５分間プレインキュベートした。ついで、反応混合物を、５ｍＭ ＭｇＥ ＧＴＡを含有する全量２０μｇのＶＢＳ中、２μｇの因子Ｂおよび０.０６ｇの 因子Ｄと共に３７℃で３０分間インキュベートした。因子Ｂ開裂％を還元条件下 、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での試料の電気泳動および染色ゲルのデンシ トメーター分析で測定した。対照には、５ｍＭ ＭｇＥＧＴＡの代わりに１０ｍ Ｍ ＥＤＴＡを含有させた。 実施例１０ プロペルジンとのＣ３結合測定用のＥＬＩＳＡ Ｃ３へのプロペルジンの結合をＥＬＩＳＡで測定した。マイクロタイターウエ ルを、３７℃における１時間のインキュベーションにより５０μｌのＣ３（２０ μｇ／ｍｌ）でコートした。コーティング後、ウエルを２２℃で３０分間２００ μｌのブロック緩衝液で飽和し、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ中、１： ５０稀釈のＮＨＳ（ｐＨ７.４）５０μｌと共に２２℃で１時間インキュベート した。ペプチドＩＶ（配列番号２）の効果を測定するため、種々の濃度の該ペプ チドを反応混合物に添加した。Ｃ３に結合したプロペルジンの量を、５０μｌの ポリクローナル・ヤギ抗プロペルジン抗体（１０μｇ／ｍｌ）を添加し、ついで ＰＢＳ中パーオキシダーゼ結合抗ヤギ抗体１：１０００稀釈（BioRad,Hercules, CA）の添加により、定量した。各抗体を３７℃で１時間インキュベートし、０. ０５％Tween２０を含有するＰＢＳ（ｐＨ７.４）で洗浄した。ＡＢＴＳパーオキ シダーゼ基質の添加により発色させ、４０５ｎｍにて光学的密度を測定した。 実施例１１ Ｃ３結合ペプチドのイン・ビボ・クリアランス Ｃ末端にチロシン残基を含む本発明のＣ３結合ペプチド（Ｃ３ＢＰ）（ＩＣＶ ＶＱＤＷＧＨＨＲＣＴＡＧＨＹＹ（配列番号２３））を、Iodogen(Pierce)を用 いて¹²⁵Ｉで標識し、逆相Ｃ−８カートリッジ(Waters)で精製した。該標識ぺプ チドは、０.７μＣｉ／μｇの比活性を有していた。正常ＳＪＬマウスに尾静脈 を介して１.４μｇの¹²⁵Ｉ−Ｃ３を注射した。血液試料を種々の時間間隔で抜き 取り、放射活性を測定した。標識Ｃ３ＢＰ注射直後に採取した第１の試料をゼロ 時間点と称 する。 実施例１２ Ｃ３結合ペプチドのRetro-inverso擬ペプチド 天然のＬペプチドは、イン・ビボで蛋白分解酵素により開裂されやすい。その ため、固相ペプチド合成法を使用して本発明のペプチドのプロテアーゼ耐性retr o−inverso擬ペプチド誘導体（Ｃ３ＢＰと称する）を製造した。この類似体の合 成において、配列の方向を逆にし、全てＤ−アミノ酸残基を使用することにより 、各アミノ酸のキラリティーを変化させ、これによりプロテアーゼ耐性を付与す る。局所学的に、該Ｄ−アミノ酸側鎖配座は全て天然の全Ｌ−アミノ酸に対応し 、側鎖の配向が問題の特異的リガンド相互作用系における最も重要な特徴であれ ば、活性を保存することができる(Chorev,M.およびGoodman,M.,Trends in Biote ch.,1993 12:438-445)。最近の研究は、ヒストンＨ３配列のＣ−末端のretro−i nverso擬ペプチド誘導体の抗原性（Guichard et al.，Proc．Nat'l Acad．Sci． USA 1994 91:9765-9769）およびホメオボックス・ドメインの１６マーretro−in verso型の輸送機能(Brugidou et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,1995 214:6 85-693)の保存を証明している。しかしながら、代わりに、リガンド相互作用系 において主鎖原子が顕著な役割を果たす場合、最近の研究に見られるように(How l,J.およびWheatley，M．Biochem．J.，1996 317:577-582)、主鎖原子の指向性 における必然的な変化に伴い、retro−inverso擬ペプチド類似体が不活性化され うる。Ｃ３ＢＰペプチドのretro−inverso類似体は、補体介在溶血分析において 不活性であることが判明し、Ｃ３ＢＰの主鎖原子は該ペプチドの好ましい構造を 維持するにおいて重要な役割を果たしていることが示された。 本発明は、上記に具体的に例示した具定例に限定されるものではなく、以下の 請求の範囲内において変形または修飾することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 サフ，アービンド・ケイ アメリカ合衆国19010ペンシルベニア州 ブリン・マウアー、サウス・ブリン・マウ アー・アベニュー275番、アパートメン ト・ビー６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．配列番号１のペプチドのＮ−末端環状領域の少なくとも一部からなる補体 活性化阻害能を有する合成ペプチド。 ２．配列番号２からなる請求項１記載の合成ペプチド。 ３．配列番号１３、配列番号１５、配列番号２０、配列番号２１または配列番 号２２からなる請求項１記載の合成ペプチド。 ４．配列番号１のペプチドのＮ−末端環状部分のアミノ酸配列の少なくとも一 部からなるペプチドを添加することからなるイン・ビトロ補体分析における補体 活性化阻害方法。 ５．人工器官またはインプラントに使用される生体適合物質の表面を、配列番 号１のペプチドのＮ−末端環状部分のアミノ酸配列の少なくとも一部からなるペ プチドでコートすることからなる人工器官またはインプラントの使用中に起きる 補体活性化の阻害方法。 ６．配列番号１のペプチドのＮ−末端環状領域の少なくとも一部からなるペプ チドを患者に投与することからなる患者における補体活性化の阻害方法。 ７．配列番号１のペプチドのＮ−末端環状部分のアミノ酸配列の少なくとも一 部からなるペプチドの有効量を患者に投与することからなる患者における補体介 在組織損傷の治療方法。 ８．配列番号１のペプチドのＮ−末端環状部分のアミノ酸配列の少なくとも一 部からなるペプチドで、生理液体が流れるチューブをコートすることからなる該 液体の体外シャントの間の補体活性化阻害方法。 ９．（ａ）配列番号１のペプチドのＮ−末端環状部分のアミノ酸配列の少なく とも一部からなる、Ｃ３と相互作用し、補体の活性化を阻害することのできるペ プチドの配座を同定し、ついで （ｂ）補体の活性化を阻害するに十分な類似の配座を有する組成物を製造する ことからなる補体活性化の阻害能を有する組成物の製造方法。 １０．Ｃ３と相互作用し、補体の活性化を阻害することのできるような、配列 番 号１を有するペプチドのＮ−末端環状部分と十分に類似した配座からなる補体の 活性化阻害能を有する組成物。 １１．合成ペプチドである請求項１０の組成物。 １２．配列番号１３、配列番号１５、配列番号２０、配列番号２１および配列 番号２２からなる群から選ばれる請求項１１記載の組成物。 １３．少なくとも一部が非ペプチド擬ペプチドである請求項１０の組成物。