JP2000504921A - 抗原非特異的グリコシル化抑制因子誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 配列番号１のアミノ酸配列を持つ抗原非特異的ヒトグリコシル化抑制因子と比較して、生物活性が高められた、配列番号１の抗原非特異的ヒトグリコシル化抑制因子の誘導体；配列番号１の抗原非特異的ヒトグリコシル化抑制因子の誘導体をコードするポリヌクレオチドであって、該誘導体は、配列番号１のヌクレオチド配列の変異を含み、かつ配列番号１のアミノ酸配列を持つ抗原非特異的ヒトグリコシル化抑制因子と比較して、生物活性が高められた前記のポリヌクレオチド；前記のポリヌクレオチドを含む組換えベクター；前記のポリヌクレオチドで形質転換された原核生物細胞又は真核生物細胞；抗原非特異的ヒトグリコシル化抑制因子誘導体の製造方法；前記の抗原非特異的ヒトグリコシル化抑制因子誘導体と医薬的に許容できる担体とを含む医薬組成物；および抗原に対するヒトの免疫応答を抑制する方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 抗原非特異的グリコシル化抑制因子誘導体 技術分野 本発明は、抗原に対するヒトの免疫応答を抑制するために利用することのでき る抗原非特異的グリコシル化抑制因子（以下、「GIF」という）の誘導体タンパ ク質、該GIF誘導体タンパク質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換え発現 ベクター、該ＤＮＡで形質転換された細胞、該GIF誘導体タンパク質の製造方法 、並びに、該GIF誘導体タンパク質を含む医薬組成物に関する。 背景技術 花粉症に見られるようなアレルギー疾患は、アレルゲン（抗原）に対するIgE 抗体によって引き起こされる事はよく知られている。故に、アレルゲンに対する IgE抗体産生の制御および抑制は、アレルギー疾患の根本的治療になると考えら れている。近年、アレルギー患者に、ごく微量のアレルゲンを繰り返し注射する 減感作療法が医療現場で行われている。この減感作療法では、一部の患者の臨床 的な症状に改善は見られるものの、アナフラキシーショックを引き起こす危険性 もある。従って、減感作療法は、限られた患者に十分な監視の元で行われている に過ぎない。 この問題を克服する試みとして、天然の抗原に対する抗体とは結合しない修飾 抗原を注射する試みがなされた。しかしながら、この試みでは、患者のIgE抗体 価を下げる事はできなかった。一方で、修飾抗原を投与すると、ヘルパーT細胞 のみでなく抗原特異的サプレッサーT細胞も誘導される事、さらにその抗原特異 的サプレッサーT細胞を移植すると、抗原感作により誘導される持続的なIgE産生 も抑制される事が見いだされた（TakatsuおよびIshizaka，J．Immunol.，117，1 211，1976）。この事から、ヘルパーT細胞を誘導する事なく、抗原特異的サプレ ッサーT細胞のみが誘導できれば、持続性のIgE産生を抑制する事が可能である事 が示唆された。 １９８０年に入って、IgE産生調節機構の研究過程において、IgEに結合する 性質を有し、1gE産生を選択的に制御する二種類のT細胞因子が発見された。一方 のIgE結合因子はIgE産生を増強し、もう一方の因子はIgE産生を抑制する。これ ら二つの因子は、そのタンパク部分は共通であるが、糖鎖の部分が異なっている 。IgE産生を増強する因子は、高マンノース型のN型糖鎖を有し、レンチルレクチ ンに結合する。一方、IgE産生を抑制する因子は、レンチルレクチンへの親和性 を持たない（Yodoiら、J．Immunol.，128，289，1982）。また、この糖鎖構造の 違いによって、二つのIgE結合因子の生物活性が異なる事が示された。生理的条 件下では、このIgE結合因子のグリコシル化の過程は、この過程を促進または阻 害する二つのT細胞因子によって制御される。IgE結合因子のグリコシル化を促進 1して、IgE産生を増強する因子を産生させる因子はグリコシル化促進因子（GEF ）と呼ばれ、一方IgE結合因子のグリコシル化を抑制し、IgE産生を抑制する因子 を産生させる因子はグリコシル化抑制因子（GIF）と命名された。実験動物では 、IgE産生が増強されている時は常にGEFが作られており、またIgE産生が抑制さ れている時は常にGIFが作られている事から、GEFとGIFのバランスがIgE結合因子 の性状を決定し、IgE産生を調節していると考えられた。 その後の研究から、GIFを産生するT細胞は、抗原特異的サプレッサーT細胞で ある事が判明した（Jardieuら、J．Immunol.，133，3266，1984）。オボアルブ ミン（OVA）特異的サプレッサーT細胞ハイブリドーマを用いた研究では、まず、 この細胞は構成的にGIFを産生している事、そしてこのGIFは抗原に対する特異性 は示さない（抗原非特異的GIF）事が見いだされたが、さらに、この細胞をオボ アルブミン処理した抗原提示細胞で剌激するとオボアルブミンに親和性を有する GIF（抗原特異的GIF）産生が誘導される事が見いだされた。抗原特異的GIFは、 抗原結合性のポリペプチド鎖と非特異的GIFから構成されることが明らかとなっ た（JardieuおよびIshizaka、Immune Regulation by Characterized Polypeptid es，Goldstein他編、Alan R．Liss,Inc.，N.Y.，595ページ、1987）。抗原特異 的GIFは、抗原特異的サプレッサーT細胞因子と共通の抗原決定基を有し（Steele ，J.K.ら、J．Immunol．142，2213-2220，1989）、抗原（担体）特異的に抗体応 答を抑制する事が明らかとなった（Jardieu，P.ら、J．Immunol ．138，1494-1501，1987）。また、オボアルブミンで免疫したマウスに非特異的 GIFを投与し、そのマウスの脾細胞をさらにオボアルブミンで剌激すると、オボ アルブミン特異的GIFの産生が誘導される事も見出された（Akasaki，M．ら、J． Immunol．136，3172-3179，1986）。 最近、本発明者らは、マウスサプレッサーT細胞よりGIFを単離し、マウス抗原 非特異的GIF遺伝子をクローニングする事に成功した。さらに、そのGIF遺伝子を プローブにして、ヒト遺伝子も取得した（Mikayama，T.ら、Proc.Natl.Acad.Sci .USA，90,10056-10060，1993）。ところが、この遺伝子を遺伝子組換え技術によ り大腸菌宿主或いは動物細胞宿主において直接発現させたところ、産生された組 換えGIFは、サプレッサーT細胞由来GIFに比べて、極めて低い生物活性しか示さ なかった。動物宿主細胞において、その遺伝子を融合タンパク質（これは小胞体 に輸送される）の形で発現させた場合だけ、産生された組換えGIFはサプレッサ ーT細胞由来GIFにほぼ匹敵する生物活性を有することがわかった。その後、GIF ペプチドが十分高い生物活性を示すには何らかの翻訳後修飾が必要である事が示 された（Liu，Y-C.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91,11227-11231，1994）。し かしながら、限られた量の精製タンパク質よりGIFの構造を決定することは多く の困難を伴い、生物活性に必要な構造は未だ不明である。 アレルギーの治療には、抗原特異的サプレッサーT細胞を誘導できる非特異的G IF、あるいは抗原特異的GIFそのものを投与する事が極めて有効である事が期待 され、そのためには組換えDNA技術を用いて大量に十分高い生物活性を有するGIF を生産する必要がある。しかし、前述したように、GIFが十分高い生物活性を示 すための分子的機構がどのようなものか不明であるので、十分高い生物活性を有 する組換えGIF誘導体を作製することは、未だに成功していない。 よって、本発明は、高い生物活性を有するGIF誘導体を提供することを目的と する。 また、本発明は、製造法や宿主によらず高い生物活性を有するGIF誘導体を大 量生産できる方法およびそれに必要な材料を提供することを目的とする。 さらに、本発明は、アレルギー等の疾患の治療を目的とした、抗原に対する免 疫反応を抑制するために使用することができる医薬組成物を提供することを目的 とする。 発明の開示 組換えDNA技術によりGIFを製造する場合、哺乳動物宿主細胞を用い分泌の為の シグナルペプチドを持った他の蛋白との融合蛋白の形で分泌発現させる方法以外 の生産方法では、サプレッサーＴ細胞ハイブリドーマ産生GIFに比べ生物活性の 低いものが作られる。発明者らは、その理由が、組換えタンパク質においてしば しば見られるような不適当な分子内ジスルフィド結合に起因するのではなく、GI F分子が分子間でジスルフィド結合によらない会合をして三量体を形成すること を発見した。さらに、本発明者らは、変異の導入や化学修飾により、高い生物活 性を有するGIF誘導体が得られることを見出した。本発明は、上記の知見に基づ いて完成されたものである。本発明の主題は以下のとおりである。 （1）配列番号１のアミノ酸配列を持つ抗原非特異的ヒトグリコシル化抑制因子 と比較して生物活性が高められた、配列番号１の抗原非特異的ヒトグリコシル化 抑制因子の誘導体。 （2）配列番号１の抗原非特異的ヒトグリコシル化抑制因子の誘導体をコードす るポリヌクレオチドであって、該誘導体は、配列番号１のヌクレオチド配列の変 異を含み、かつ、配列番号１のアミノ酸配列を持つ抗原非特異的ヒトグリコシル 化抑制因子と比較して生物活性が高められた、前記のポリヌクレオチド。 （3）(2)のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。 （4）(2)のポリヌクレオチドで形質転換された原核生物細胞または真核生物細胞 。 （5）(4)の原核生物細胞又は真核生物細胞を培養し、産生された抗原非特異的ヒ トグリコシル化抑制因子誘導体を分離および精製することを特徴とする、抗原非 特異的ヒトグリコシル化抑制因子誘導体の製造方法。 （6）抗原非特異的ヒトグリコシル化抑制因子またはその誘導体に、その三量体 形成に関与する領域での分子間会合の強さを弱めるような化学修飾をおこなうこ とを特徴とする、抗原非特異的ヒトグリコシル化抑制因子誘導体の製造方法。 （7）(1)の抗原非特異的ヒトグリコシル化抑制因子誘導体と医薬的に許容できる 担体とを含む医薬組成物。 （8）免疫抑制に有効な量の(1)の抗原非特異的ヒトグリコシル化抑制因子誘導体 をヒトに投与することを含む、抗原に対するヒトの免疫応答を抑制する方法。 図面の簡単な説明 図１は、ペプシン消化組換えGIFの各ペプチド断片のSuper ODSカラムでの分画 パターンとそのアミノ酸配列を示す。 図２は、組換えGIF(天然型)とC57A/N106S-GIFの光散乱により測定された分子 量分布を示す。, 図３は、カルボキシメチル化組換えGIFのＣＭ−５ＰＷカラムでの分画パター ンを示す。 図４は、ピリジルエチル化組換えGIFのＣＭ−５ＰＷカラムでの分画パターン を示す。 図５は、アレルギー反応（Active Cutaneous Anaphylaxis）に対するＧＩＦ誘 導体(C57A/N106S-GIF)の効果を示す。 図６は、インスリン依存性糖尿病の進展に対するＧＩＦ誘導体(C57A/Nl06S)の 効果を示す。 発明を実施するための最良の形態 本発明によれば、宿主及び生産方法によらず、高い免疫抑制活性を有するGIF 誘導体タンパク質（以下、「本発明のタンパク質」という）が提供される。 ここで、GIFの免疫抑制活性（以下、「GIF活性」という）とは、in vivoにお いて、抗原により惹起されるイムノグロブリンＥ及びイムノグロブリンＧ１に属 する特異抗体の産生を抑制する活性である。この活性は、in vitroでは、マウス Ｔ細胞ハイブリドーマ１２Ｈ５細胞をグリコシル化ＩｇＥ結合因子産生から非グ リコシル化ＩｇＥ結合因子産生に変換する能力として計測することができる（Iw ataおよびIshizaka，J．Immunol.，141，3270 1988）。 本発明のタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列の一部を置換、欠失及び／ 又は挿入する変異が導入された、および／または、配列番号１のアミノ酸配列内 のひとつまたはそれ以上のアミノ酸残基が化学修飾された、免疫抑制活性を有す る抗原非特異的ヒトグリコシル化抑制因子誘導体である。変異および／または化 学修飾の結果、GIF分子の生物活性が高められ、配列番号１のアミノ酸配列を含 む抗原非特異的ヒトグリコシル化抑制因子の三量体形成に関与する領域での分子 間会合の強さが弱められる。分子間会合の強さは、光散乱、分析用超遠心、結晶 構造解析等により測定することができ、高いGIF活性を示す為には、その測定値 が６１４未満であるとよい。 分子間会合の強さを弱める変異としては、変異しようとする部位の分子間相互 作用（特に水素結合形成及び疎水性相互作用による）を変化させるような、１以 上のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入が挙げられる。このような目的の為の変異 の例としては、会合に関与する領域の極性の変化をもたらす置換、欠失、挿入、 付加変異（例えば、中性アミノ酸残基を荷電アミノ酸残基に或いは荷電アミノ酸 残基を中性アミノ酸残基に置換する、荷電アミノ酸残基の挿入或いは欠失を行う 等）、或いは会合に関与する領域のアミノ酸残基の側鎖の大きさの異なるアミノ 酸残基への置換などが挙げられる。また、会合に関わる領域内ではないが、その 領域の構造に影響し会合の強さを弱めるような領域外のアミノ酸残基の変異も挙 げる事ができる。 好ましい変異の部位としては、三量体構造をとる為の分子間会合に関わってい ると推定される領域、その領域の近傍あるいはその領域の構造に関与する他の領 域のアミノ酸残基が挙げられる。分子間会合に関わっていると推定される領域と しては、分子間水素結合網形成に関わっている３７−４５位、４７−５０位、９ ４−９８位及び１０６−１１０位、並びに、配列番号１のアミノ酸配列を持つ分 子の疎水性相互作用を主体としてクラスターを形成するのに関わっている３９、 ４８、５０、５７及び５９位が挙げられる。具体的な変異の例としては、５７位 システイン残基がアラニン残基またはセリン残基に置換されたもの、或いは５７ 位システイン残基及び１０６位アスパラギン残基がそれぞれアラニン残基及びセ リン残基へ置換されたもの等がある。 分子間会合を弱める修飾とは、従来知られているタンパク質のアミノ酸残基の 選択的な化学的修飾のうち、修飾されるアミノ酸残基の荷電を高めるまたは低く する、或いは、疎水性を高めるまたは低くするような修飾を指し、例えばリン酸 化、アルキル化、アシル化等やシステイン残基のスルフヒドリル基の修飾などが 挙げられる。具体的な修飾の例としては、システイン残基を選択的に化学修飾す るカルボキシメチル化、ピリジルエチル化およびエチルマーキュリーチオサリチ レート(EMTS)または5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)(DTNB)、Ｎ末端を修飾 するアセチル化、ホルミル化等が挙げられる。 天然型のアミノ酸配列を含むGIFタンパク質のみならず、天然型GIFのアミノ酸 配列（配列番号１）を置換、欠失および／または挿入する変異が導入されたGIF タンパク質にも、選択的な化学修飾を行うことができる。変異型GIFタンパク質 の化学修飾の例としては、５７位のシステイン残基がアラニン残基に置換された 変異型GIFおよび５７位のシステイン残基と１０６位のアスパラギン残基がそれ ぞれアラニン残基とセリン残基に置換された変異型GIFのカルボキシメチル化が 挙げられるが、それらに限定されることはない。 また、本発明によれば、高い免疫抑制活性を有するGIF誘導体タンパク質をコ ードするポリヌクレオチド（以下、「本発明のポリヌクレオチド」という）が提 供される。本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１のアミノ酸配列の一部を置 換、欠失及び／又は挿入する変異が導入された、グリコシル化抑制因子の免疫抑 制活性を持つ抗原非特異的ヒトグリコシル化抑制因子誘導体のアミノ酸配列をコ ードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであるが、この変異は、配列 番号１のアミノ酸配列を含む抗原非特異的ヒトグリコシル化抑制因子の分子間会 合、特に、三量体形成に関与する領域での分子間会合の強さを弱めるようなもの である。これらのポリヌクレオチドは、既に知られているGIFｃＤＮＡ（前述Mik ayama，T.ら）を用いた部位特異的突然変異法により、或いは変異させたい部位 を含む部分ポリヌクレオチドを化学合成しGIFｃＤＮＡの対応領域と置き換える ことにより、または全部を化学合成することによって、作製することができる。 また、本発明のポリヌクレオチドは、遺伝コードの結果として縮重関係にある いずれのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドをも含む。この場合、GIF誘 導体タンパク質を発現させるべき宿主に適した優先コドンをGIFコード領域の一 部又は全部に一つき採用することにより、タンパク質の発現量を向上させること ができる。特に、優先コドンをGIFコード領域の一部分について採用する場合に は 、Ｎ末端をコードする領域についてそれを採用することが有効である。 本発明のポリヌクレオチドの例としては、配列表の配列番号２、３または２０ のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド等が挙げられる。 本発明のポリヌクレオチドは、制限酵素による切断部位の供与、および／また は、発現を容易にするような発現ベクター構築のための開始部、終止部へのＤＮ Ａの付加的供与を含むことができる。 また、本発明によれば、本発明のポリヌクレオチドを組み込んだベクター、該 ベクターで形質転換された宿主細胞の他、該宿主細胞を培養し、産生された本発 明のタンパク質を分離および精製することを特徴とする、本発明のタンパク質の 製造方法が提供される。 この場合の宿主細胞としては、原核生物（例えば細菌、好ましくは大腸菌(E.c oli )）、真核生物（例えば酵母、昆虫、あるいは哺乳動物）細胞を用いることが できる。哺乳動物細胞の例としては、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣 （Chinesｅ Hamster Ovary）細胞、Ｘ63.6.5.3．細胞、Ｃ-127細胞、ＢＨＫ（Ba by Hamster Kidney）細胞、ヒト由来細胞（例えば、HeLa細胞）等があげられる 。酵母の例としては、Saccharomyces cerevisiaeやPichia pastoris等があげら れる。昆虫細胞の例としては、蚕(Bombyx mori)培養細胞（例えば、Sf21細胞） 等があげられる。 これらの宿主細胞を形質転換させるために用いられるベクターには、大腸菌用 としてpKC30（Shimatake H．and M．Rosenberg、Nature、292、128-132、1981） 、pTrc99A（Amann E.ら、Gene6、69、301-315、1988）等があげられる。哺乳動 物細胞用としてはpSV2-neo（Southern and Berg；J．Mol．Appl．Genet.、１、3 27-341、1982）、pCAGGS（Niwaら；Gene、108、193-200、1991）、あるいはpcDL -SR α296（Takebeら；Mol．Cell．Biol．、8、466-472、1988）等がある。酵母 用としてはpG-l（Schena M．and Yamamoto K.R.；Science、241、965-967、1988 ）等がある。蚕細胞用としては、組換えウイルス作製用トランスファーベクター pAc373（Luckowら、Bio/Technology、6、47-55、1988）等がある。 これらのベクターは必要に応じて複製起点、選択マーカー、プロモーターを含 む。さらに真核細胞用のベクターには、必要に応じてＲＮＡスプライス部位、ポ リアデニル化シグナル等が付加される。 複製起点として、哺乳動物細胞用ベクターには、SV40、アデノウイルス、ウシ パピローマウイルス由来のもの等を用いることができる。大腸菌用ベクターとし ては、ColE1、R因子、F因子由来のものを用いることができる。酵母用としては2 μmDNA、ARS1由来のものを用いることができる。 遺伝子発現用プロモーターとして、啼乳動物細胞用ベクターには、ウイルス由 来のもの、例えば、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、SV 40由来のもの等あるいは、染色体由来のもの（例えば、EF1-α）等を用いること ができる。大腸菌用ベクターには、バクテリオファージλ由来のものや、trp、l pp、lac、tacプロモーターを用いることができる。Saccharomyces cerevisiae用 ベクターには、ADH、PHO5、GPD、PGK、MAFαプロモーター、Pichia pastoris 用ベクターには、A0X1プロモーター等を用いることができる。蚕細胞用 ベクターには、核多角体病ウイルス由来のプロモーター等を用いることができる 。 選択マーカーとして、哺乳動物細胞用ベクターには、ネオマイシン(neo)耐性 遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）遺伝子 、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝 子等を用いることができる。大腸菌用ベクターとしては、カナマイシン耐性遺伝 子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等を用いることがで きる。酵母用としてはLeu2、Trp1、Ura3遺伝子等を用いることができる。 以上の様な宿主−ベクター系を用いて本発明のタンパク質を得るためには、以 下のようにすればよい。上記ベクターの適当な部位に本発明のＤＮＡを組み込ん だ組換えＤＮＡ体により、宿主細胞を形質転換させた後、得られた形質転換体を 培養し、さらに培養細胞内あるいは培養液から本発明のタンパク質を分離および 精製すればよい。これらに用いられる手段や方法は公知のものを組み合わせれば よい。 そのような精製方法としては、一般にタンパク質の精製に用いる工程（イオン 交換クロマトグラフィー、疎水相互クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラ フィー、逆相クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、分取電気泳動法 、及び等電点電気泳動法など）の一つ以上を組み合わせた方法がある。また、精 製法として、GIFを認識する抗体を用いたアフィニティー精製が挙げられる（国 際公開WO94/26923）。 また、本発明によれば、天然型アミノ酸配列を含むGIFまたはその誘導体に、 その分子間会合、特に、その三量体形成に関与する領域での分子間会合の強さを 弱めるような化学修飾をおこなうことを特徴とする、化学修飾型である本発明の タンパク質についての製造方法が提供される。より詳細には、天然型アミノ酸配 列を含むGIFまたはその誘導体に、修飾されるアミノ酸残基の荷電を高めるまた は低くする、或いは、疎水性を高めるまたは低くするような修飾基を結合させ、 生産物を単離および精製することにより、化学修飾型である本発明のタンパク質 を製造することができる。 具体的な化学修飾としては、リン酸化、アルキル化、アシル化、EMTS修飾、DT NB修飾等が挙げられ、より具体的な修飾の例としては、システイン残基を選択的 に化学修飾するカルボキシメチル化及びピリジルエチル化、Ｎ末端を修飾するア セチル化，ホルミル化等が挙げられる。 リン酸化は、プロテインキナーゼを用いて、ＡＴＰのγ-リン酸基を、セリン 、スレオニンまたはチロシンのヒドロキシル基へ転移させる酵素的反応で行う事 ができる。 ＳＨ基のアルキル化は、ハロゲン化アルキルを含む化合物（モノヨード酢酸及 びそのアミド、モノブロモ酢酸及びそのアミド、α-ヨードプロピオン酸、β− ブロモエチルアミン、モノクロロ酢酸、クロロアセトフェノンなど）を用いるこ とができる。例えば、ファルネシルブロミドを用いて、ファルネシル基の様なリ ピドを導入する事もできる。また、アミノ基の修飾には、脂肪族アルデヒド、カ ルボニルを含むケトンなどを用いることができる。 アシル化は、、カルボン酸無水物またはカルボン酸塩化物を用いるか、カルボ ン酸とカルボジイミドなどの脱水縮合剤を用いて、ヒドロキシル基、スルフヒド リル基またはアミノ基の水素をアシル基で置換する反応により行うことができる 。アミノ基のアセチル化では、例えば、Ｎ-アセチルイミダゾールやＮ-アセチル ス クシンイミド等が用いられる。また、末端にカルボキシル基を有するポリエチレ ングリコールとＮ-ヒドロキシスクシンイミドをカルボジイミドを用いて脱水縮 合させると、アミノ基と反応する活性化ＰＥＧが得られ、タンパク質のＮ末をＰ ＥＧ化する事ができる。また、Ｎ末にグリシンを付加し、ミリストイル化したり 、チロシン、スレオニン、システインなどではパルミトイル化、レチノイル化、 およびリポイル化もできる。 エチルマーキュリーチオサリチレート（以下、「EMTS」という）のようなチオ ール試薬またはDTNBまたはメチルメタンチオスルフェートを用いて、タンパク質 のシステイン残基を修飾してもよい。 高分子化合物で修飾する具体的な例としては、可溶性デキストリンを結合する 方法（Wileman,T.E.ら、J.Pharm.Phamacol．33，85，1982）や、ポリ-DL-アラニ ンを用いる方法（Uren,J.R.ら、Cancer Res.，42，4068-4071，1982）などが挙 げられる。 化学修飾の程度は、未反応のタンパク質側の反応基の量を定量することで確認 できる。例えば、システイン残基のフリーのＳＨ基をモノヨード酢酸或いは４− ビニルピリジンで修飾し、それぞれＳ-カルボキシメチル化或いはＳ-ピリジルエ チル化を行った場合、未反応のＳＨ基は、エールマン法（Glazer,A.N.,The Prot eins，3rd.，II，Academic Press，NY，1976）により定量することができる。 また、ヨウ素化試薬（三ヨウ化イオン(I^-3)、塩化ヨウ素など）を用いれば、 チロシン残基が、ジエチルピロカーボネートを用いればヒスチジン残基が、フェ ニルグリオキサールを用いればアルギニン残基がそれぞれ修飾されるので、未反 応のアミノ酸残基の量は、アミノ酸組成分析或いは紫外吸収スペクトルの変化に より確認できる。或いは、修飾により分子量が大きく変わる場合には、ドデシル 硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用 いて、修飾されたタンパク質の移動度の変化を追うことにより確認される。また 、どのアミノ酸残基が修飾されたかは、ペプチドマッピングを行うことにより確 認できる。 なお、修飾されたタンパク質の単離および精製についても、前述の遺伝子組換 えによる変異型である本発明のタンパク質の製造方法において挙げたような、公 知の手段や方法を組み合わせて行なうことができる。 さらに、本発明は、本発明のタンパク質を有効成分とする医薬組成物（以下、 「本発明の医薬組成物」という）を提供する。本発明の医薬組成物は、免疫抑制 の為、より詳細には、治療すべきヒトにおいて望ましくない免疫応答を緩和ない しは予防するのに用いられる。ここで、望ましくない免疫応答（即ち、抗原に対 し起こった免疫応答が有害になるような応答）には、リウマチ，多発性硬化症及 び糖尿病等の自己免疫疾患、種々の抗原に対するアレルギー疾患、受容者対移植 片（ＨＶＧ）及び移植片対受容者拒絶反応等が含まれる。本発明の態様において 、本発明の医薬組成物を糖尿病の治療および／または予防のために用いることが できる。本発明は、治療上有効量の本発明のタンパク質および医薬的に許容でき る担体を含む医薬組成物を包含する。この医薬組成物は、希釈剤、防腐剤、可溶 化剤、乳化剤および他のアジュバントを含んでもよい。本明細書中で用いる「治 療上有効量」という用語は、指定の条件および投与法に対して治療効果を提供す る量を示す。このような医薬組成物は、液体であるか、あるいは凍結乾燥または さもなくば乾燥された剤形であって、種々のpH、およびイオン強度から成る緩衝 剤（例えばトリス-塩酸、酢酸塩、燐酸塩）より選択した希釈剤；表面に吸着し ないようにするためのアルブミンまたはゼラチンのような添加剤；界面活性剤（ 例えばTween 20、Tween 80、Pluronic F68、胆汁酸塩）；可溶化剤（例えばグリ セロール、ポリエチレングリコール）；酸化防止剤（例えばアスコルビン酸、メ タ重亜硫酸ナトリウム）；防腐剤（例えばチメロサール、ベンジルアルコール、 パラベン）；賦形剤または等張化剤（例えばラクトース、マンニトール）を配合 した製剤の形態をとりうる。また、有効成分である本発明のタンパク質は、金属 イオンと錯体化されたり、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲルなどのよう な重合化合物の粒状製剤中に取り込まれたり、その表面上に吸着されてもよく、 あるいは、リポソーム、ミクロエマルジョン、ミセル、単層または多層小胞、赤 血球ゴースト、またはスフェロプラスト中へ取り込まれてもよい。このような医 薬組成物は、本発明のタンパク質の物理的状態、溶解性、安定性、in vivo放出 速度およびin vivoクリアランスに影響を及ぼすと思われるので、組成物の選択 は、有効成分である本発明のタンパク質の物理的および化学的特性による。本発 明の医薬組成物は、経肺、経鼻、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内ま たは経皮的に投与可能であり、投与経路に応じて必要であれば、粒状形態にした り、保護被膜、プロテアーゼ阻害剤、または吸収促進剤を配合することもできる 。 本発明のタンパク質は、通常０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜２ｍｇ／ｋｇ体重を 、患者の年齢、病状、性別および疾病の重篤度並びに投与経路等に応じて、一日 １乃至数回を毎日または数日毎に投与することができる。 以下、実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明するが、これらの実施例は 説明のためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。 〔実施例１〕システイン残基置換GIF誘導体の大腸菌における発現 A. 発現系の構築 本実施例は、大腸菌におけるシステイン残基置換GIF誘導体の発現に関するも のである。GIFポリペプチドに存在する３個のシステイン残基（５７，６０，８ １位に存在）について、配列番号１のGIF遺伝子の当該部位のヌクレオチドに変 異を入れて、それぞれアラニン残基に置換するようにした。 大腸菌用発現ベクターpST811（特開昭63-269983号）にヒトGIFｃＤＮＡを挿入 した発現プラスミドpTMK-hGIF（前述、WO94/26923）をテンプレートＤＮＡとし て、次のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応法（Ｐ ＣＲ）（Mullis，et al.，Method in Enzymol.，155；335-350，1987）を行った 。 各ＰＣＲサイクルにおける変性温度は９５℃、１分間、アニーリング温度は５ ６℃、２分間、伸長は７２℃、２分間の条件で行った。以下、ＰＣＲはすべてこ の条件で行った。増幅したＤＮＡ断片は、アガロースゲルにより回収し、AflII 、PstIにより消化した。 また、pTMK-hGIFをPstI、BamHIにて切断し、GIFcDNAの３’-側のDNA断片を回 収した。これらの断片を、AflII、BamHIで切断したベクターpST811にDNAリガー ゼを用いて挿入した。この発現プラスミドは、５７位のシステイン残基をコード する塩基配列がアラニン残基をコードする配列に変換されたヒトGIF cDNA（配列 番号２）を含むものであり、pC57A-hGIFと命名した。 同様に、６０位のシステイン残基をコードする塩基配列がアラニン残基をコー ドする配列に変換されたヒトGIF cDNAを含む発現プラスミドpC60A-hGIFは、次の とおり構築した。まず、pTMK-hGIFをテンプレートとして、上記プライマー＃１ および次のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてPCRを行った。 増幅されたDNA断片は、回収後AflII、NheIを用いて消化した。 また、次のプライマーを用いて、３’-側のDNA断片を作製した。 増幅されたDNA断片は、回収後NheI、BamHIを用いて消化した。これらの断片を 、AflII、BamHIで切断したベクターpST811に挿入した。 さらに、８１位のシステイン残基をコードする塩基配列がアラニン残基をコー ドする配列に変換されたヒトGIF cDNAを含む発現プラスミドpC81A-hGIFは、次の とおり構築した。pTMK-hGIFをテンプレートとして、上記プライマー＃１および 次のプライマーを用いてPCRを行った。 増幅されたDNA断片は、回収後AflII、NheIを用いて消化した。 また、プライマー＃２及び次のプライマーを用いて、3’-側のＤＮＡ断片を作 製した。 増幅されたＤＮＡ断片は、回収後NheI、BamHIを用いて消化した。これらの断 片を、AflII、BamHIで切断したベクターpST811に挿入した。 各発現プラスミドは、コンピテントＲＲ１大腸菌宿主細胞に導入した。 各発現系の構築に用いたプライマーの配列及びＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ 断片の配列は、、通常のＤＮＡシークエンシングにより確認した。B ． GIF誘導体を産生する大腸菌の培養 発現プラスミドpC57A-hGIF、pC60A-hGIFあるいはpC81A-hGIFを含むRR1大腸菌 を50mg/lのアンピシリン含有20mlルリア培地で一晩37℃で培養した。さらに、0. 8%グルコース、0.4%カザミノ酸、10mg/lチアミン、50mg/lアンピシリンから構成 される１リットルのM9培地に移し、３７℃で３時間培養した。さらに、40mgのイ ンドールアクリル酸を添加し、３７℃で５時間培養した。 〔実施例２〕組換えGIF誘導体産物の精製 本実施例は、大腸菌で発現させた組換えGIF誘導体タンパク質をインビボに投 与する事ができるまで精製する方法に関するものである。 実施例１で培養した湿潤重量約５gの大腸菌体を回収し、30mlの水に懸濁後フ レンチプレス（8000psi、４回繰り返し）で菌体を破砕した。15000ｘgで１０分 間遠心分離し、その上清を回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、GIF誘導体タン パク質の発現を確認した。 pC57A-hGIFの発現プラスミドにコードされたGIF誘導体タンパク質を、C57A-GI Fと命名した。同様に、発現プラスミドpC60A-hGIFおよびpC81A-hGIFにコードさ れたGIF誘導体タンパク質を、それぞれ、C60A-GIF、C81A-GIFと命名した。 最終濃度が20mMとなるように上記のGIF誘導体タンパク質に酢酸ナトリウム緩 衝液（pH5.5）を添加し、同じ緩衝液で平衡化したCM-Sepharose Fast Flowカラ ム（5ｘ18cm）（Pharmacia社製）にかけた。この操作は４℃で行った。このカラ ムを、2ml/分の流速で、20mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5）、および0.3M塩化 ナトリウム含有20mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5）で洗浄し、0.5M塩化ナトリ ウム含有20mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5）によりGIF誘導体タンパク質を溶出 した。 この溶出画分を、１００倍量の20mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5）に対して 透析し、同じ緩衝液で平衡化したT0SOH CM-5PWカラム（0.75ｘ7.5cm）（東ソー 社製）にかけた。このカラムを、1ml/分の流速で、20mM酢酸ナトリウム緩衝液（ pH5.5）で洗浄後、0から0.5Mの塩化ナトリウムの濃度勾配を用いて、GIF誘導体 タンパク質を溶出させた。この操作は室温で行った。 GIF誘導体タンパク質を含む画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および抗GIF抗体（前 述、WO94/26923）を用いたウエスタンブロットにより確認した。この操作により 、C57A-GIF、C60A-GIF、C81A-GIFのいずれもが、９９%以上の精製度で回収でき た。これらのサンプルは、透析によりPBS溶液に置き換え保存した。 さらに、大腸菌由来エンドトキシンを完全に除去するため、精製サンプルに１ ０分の１量のPyroSep C（ダイセル化学社製）を添加し、必要に応じて１〜１２ 時間撹拌後、上清を回収した。エンドトキシン量は、リムラスES-IIシングルテ スト（和光純薬社製）で測定した。また、GIF誘導体タンパク質の濃度は、280nm の吸光度を測定し、アミノ酸組成分析より得たそれぞれの誘導体の分子吸光係数 を用いて計算した。 〔実施例３〕組換えGIF誘導体の生物活性 本実施例は、実施例２で作製した組換えGIF誘導体のin vivo活性に関するもの である。上記組換えGIF誘導体のin vivoのIgE抗体産性抑制効果を評価した。活 性の比較対照として、すでにin vivoにおいてIgEおよびIgG1抗体産生抑制活性が 見出されている天然型アミノ酸配列を有する遺伝子組換え大腸菌産生ヒトGIFタ ンパク質を、発現プラスミドがpTMK-hGIF（wo94/26923,前述）であること以外は 実施例１Ｂおよび実施例２と同じ方法で生産し、用いた。 BDF₁マウスを、1mgのアラムに吸着させた0.1μgDNP−オボアルブミンを腹腔内 に注射して免疫し、各種組換えGIFを10μgずつ、免疫前日、当日、および１、２ 、３、４、６、８、１０日目にそれぞれ腹腔内に投与した。コントロールとして は、PBSを投与した。 抗原免疫後２週目、および３週目に採血し、各マウス血清中の抗DNP-IgE、抗D NP-IgG1量を酵素抗体法にて測定した。その結果、以下に示すように、C57A-GIF ではコントロールのGIFに比べて明らかに高い活性が見られた（表１）。 マウスT細胞ハイブリドーマ12H5細胞をグリコシル化IgE結合因子産生から非グ リコシル化IgE結合因子産生に変換するこのサイトカインの能力により、同じ調 製物のGIF生物活性を評価した(Iwataら，J．Immunol．140:2534，1988)。上記の ハイブリドーマ細胞の懸濁液を少量とって、試験すべき試料の存在下で、10μg/ mlのマウスIgEとともに24時間培養した。培養上清をCF50A膜で濾過し、濾液中の IgE結合因子をレンチルレクチンセファロース上で分画した(Yodoiら，J．Immuno l．125:1436，1980)。通過画分中の因子とカラムに残った因子をロゼット抑制法 で評価した。十分な量のGIFが試験試料中に存在する場合には、12H5細胞が生産 した大部分のIgE結合因子はレンチルレクチンに対する親和性を欠き、通過画分 中に回収された(Iwata & Ishizaka，J．Immunol．141:3270，1988)。GIF生物活 性が検出された天然型GIFまたはその誘導体の最小濃度を表１に示す。 表１ 組換えGIFおよび組換えGIF誘導体の活性 試料 Ｎ 抗DNP-IgE（ng/ml） in vitro GIF生物活性の 最小濃度（ng/ml） PBS(コントロール) ６ ４０９±７５ −−− GIF ４ ３４５±１２５ ＞１０００ C57A-GIF ４ １９７±７４ １２５ C60A-GIF ４ ３０４±１１０ ２５０ C81A-GIF ４ ３７５±１５５ ＞１０００ 〔実施例４〕組換えGIFおよび組換えGIF誘導体における分子内S-S結合の関与の否定 本実施例は、組換えGIFおよび組換えGIF誘導体はいずれも分子内S-S結合を有 さないという事を示すものである。 １）実施例３で生物活性を測定した組換えGIFおよび組換えGIF誘導体2.4μgを0. 2M酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.0）に溶解し、１２５分の１量のペプシン（Sigma 社製）を添加し、室温で７時間静置し、タンパク質を消化した。そのサンプルを 、９５％溶液A（0.05%トリフルオロ酢酸）および５%溶液B（0.02%トリフルオロ 酢酸、70%イソプロパノール、30%アセトニトリル）で平衡化したSuper ODSカラ ム（0.2ｘ5cm）（東ソー社製）にかけ、0.2ml/分の流速で、５分洗浄後、４０分 間かけて溶液Bの比率を25%まで直線的に上げ、さらに５分かけて１００%まで上 げて断片化したペプチドを分画回収した。すべての回収されたペプチドについて 、気相式アミノ酸シークエンサーPPSQ 10（島津製作所社製）を用いてそのアミ ノ酸配列を決定した。その結果、１個のシステイン残基を含む３種類のペプチド が別々に分画される事が判明した。この事は、いずれのシステイン残基も互いに S-S架橋していないという事を示している。組換えＧＩＦおよび組換えＧＩＦ誘 導体のペプシン処理による各ペプチドの分画パターンとその配列を図１に示す。 更にこの事を確認するために、ペプシン消化したサンプルに最終10mMとなるよ うにジチオスレイトール(DTT)を添加し、室温で３０分置いた後Super ODSカラム にかけ、上記と同様の操作を行った。これら、各ペプチドの溶出パターンは、い ずれの組換えGIFおよび組換えGIF誘導体でも一致した。 ２）ジスルフィド結合が蛋白質の安定性を保持するために重要であることが一般 的に知られている。もし、分子内部にジスルフィド結合が存在するならば、シス テインのアラニンへの置換は、蛋白質分子を著しく不安定化するはずである。GI Fに存在する３つのシステイン残基をそれぞれ独立にアラニンに置換した変異体 、C57AおよびC81Aの熱力学的安定性をpH5.5、50mM酢酸緩衝液中で測定したとこ ろ、変性の転移温度は、それぞれ68.7℃および71.6℃であり、天然型の70.9℃と ほぼ一致した。これは３つのシステインがいずれもジスルフィド結合を形成して いないことを示す。 ３）Ｘ線結晶構造解析の結果、天然型のアミノ酸配列を含む大腸菌産生組換えヒ トGIFタンパク質における３つのシステインのイオン原子間の距離、すなわちＳ （Cys57）とＳ(Cys60)、Ｓ(Cys57)とＳ(Cys81)およびＳ(Cys60)とＳ(Cys81) 間の距離はそれぞれ約10オングストローム、13オングストロームおよび8オング ストロームであった。ジスルフィド結合形成のためのには、これらの原子間距離 が約2.0オングストロームに近づく必要があるが、各々の残基は明確な三次構造 の上に位置しているため近づくことは困難である。これは、GIFが分子内にジス ルフィド結合を形成できないことを示す。 〔実施例５〕組換えGIFは三量体として存在する A. 組換えGIFの分子量測定 実施例３で比較対照として用いた天然型アミノ酸配列を有する組換えGIFを1.2 mg/mlの濃度でPBSに溶解し、0.1M塩化ナトリウム含有50mMリン酸緩衝液（pH6.8 ）で平衡化したShodex KW803カラム（昭和電工社製）にかけた。1.0ml/分の流速 で溶出させたGIFタンパク質の絶対分子量を、WYATT DAWN DSP-F光散乱計（wyatt 社製）により測定した。測定された分子量分布を図２に示す。dn/dc値は0.180cm³ /g、A2=0で計算を行った結果、分子量は３６４９０という値となった。 次に、組換えGIFを0.68mg/mlの濃度でPBSに溶解し、分析用超遠心機0ptima XL （Beckman社製）により、１７０００rpm、２０℃、１５時間遠心分離し、平均分 子量を測定した。その結果、GIFタンパク質の平均分子量は、３２０１３という 値となった。また、会合定数は614.18と計算された。 以上の結果は、組換えGIFタンパク質は、三量体として存在している事を示し ている。B. 組換えGIFの結晶構造解析 組換えGIFの結晶化は、蒸気拡散法に基づいて行った。具体的には、20mg/mlの 濃度のGIFタンパク質を、2.0M硫酸アンモニウム、2%(w/v)ＰＥＧ４００を含む10 0mMＨＥＰＥＳ緩衝液（pH7.5）に溶解し、４℃に放置した。約１〜２週間後に0. 5mm程度の結晶が得られた。 この結晶について、浸積法を用いて重原子誘導体結晶を作成した。１つは、0. 2mM ＨｇＣｌ₂、2.6M硫酸アンモニウム、2%(w/v)ＰＥＧ４００を含む100mMＨＥ ＰＥＳ緩衝液（pH7.5）に５日間浸積したものと、もう一つは0.2mM ＨｇＣｌ₂の かわりに1.0mMエチルマーキュリーチオスレイトール（ＥＭＴＳ）を含む上記溶 液に３日間浸積したものを作成した。反応は、４℃で行った。データ収集は、Ｉ Ｐ回折計を用いて行った。Ｘ線源には出力４ｋｗのポータブル発生機を用いた。 組換えGIF結晶は、2.3A°の分解能で３０時間、ＨｇＣｌ₂処理重原子誘導体結晶 は2.5A°の分解能で２５時間、ＥＭＴＳ処理重原子誘導体結晶は2.7A°の分解能 で４０時間、それぞれ測定した。 構造解析について、位相計算は多重同型置換法を用いて行い、位相改良計算は 溶媒領域平均化法、分子平均化法を用いて行った。得られたデータに基づき、分 子構造の解釈（主鎖のトレースと側鎖の帰属）並びに分子モデルの構築を行った ところ、組換えGIFは、三量体構造を取っており、配列番号１のアミノ酸配列に おける、３７−４５位と４７−５０位領域、および、９４−９８位と１０６−１ １０位の領域が分子間水素結合網を形成することで、また、３９、４８、５０お よび５７位が疎水性相互作用を主体とするクラスターを形成することで、会合に 関わっている事が明かとなった。 〔実施例６〕システイン以外のアミノ酸残基置換GIF誘導体の大腸菌での生産、生物活性およ び構造 A ． １０６番目のアミノ酸が置換されたGIF誘導体の大腸菌での生産 BBL社より市販されている完全合成DNA（コード＃BBG54）を購入した。このDNA は、配列番号１のアミノ酸配列とは１０６番目のアスパラギン残基がセリン残基 に置き変わっている点のみ異なるアミノ酸配列をコードするＤＮＡである（配列 番号１１）。このDNAにさらに、実施例１の方法と同様にして、５７番目、ある いは８１番目のシステイン残基をアラニンに置換する配列に変えて、pST811発現 ベクターを用いて大腸菌で発現させた。発現した組換えGIFタンパク質は、実施 例２と同じ方法を用いて精製した。この場合、GIFタンパク質は0.3Mの塩化ナト リウムで溶出された。このようにして得られた２カ所のアミノ酸に変異を持つGI F誘導体を、それぞれC57A/N106S-GIF、C81A/N106S-GIFと命名した。B. C57A/N106S-GIF、C81A/N106S-GIFの生物活性 実施例３と同様のインビボアッセイを用いて、上記の組換えGIF誘導体の抗体 産生抑制活性を評価した。ここでは、20μgを投与した。その結果、C57A/N106S- GIFはC81A/N106S-GIFよりも高い活性を示した（表２）。 表２ 組換えGIF誘導体の活性 試料 Ｎ 抗DNP-IgE（ng/ml） PBS(コントロール) １０ 84.3±21.0 C57A/N106S-GIF ４ 27.2± 8.2 C81A/N106S-GIF ４ 86.3±17.5 一方、GIF誘導体の投与を６回（抗原投与前日、１、３、６、８、１０日）に 減らして行った別の実験では、C57A/N106S-GIFはC57A-GIFよりもさらに高い活性 を示した（表３）。 表３ 組換えGIF誘導体の活性 試料 Ｎ 抗DNP-IgE（ng/ml） PBS(コントロール) ６ 345.1±128.6 C57A-GIF ４ 127.1±42.5 C57A/N106A-GIF ４ 61.3±20.4C ． C57A/N106Sの立体構造 実施例５と同様に、C57A/N106S-GIFの分子量分布を光散乱計により測定した。 その結果、C57A/N106Sは天然型GIFと同様に三量体構造をとってはいるが、その 分子量分布は低分子側にシフトしており（図２）、三量体構造がより不安定であ るという事が示された。 〔実施例７〕システインがセリンに置換されている哺乳類細胞由来組換え変異型GIFの生物活 性 A. 哺乳類細胞における変異型GIFの構築および発現 PCRを用いて、配列番号１の５７、６０または８１位のシステイン残基のコー ド配列(TGC)を、それぞれ、セリン残基(AGC)に変えた。２セットのPCRプライマ ーを採用して、一残基の変異を行った。第１セットのプライマーについては、セ ンスプライマーは、リボソーム結合部位(ATC)と追加のEcoRI部位を上流に持つヒ トGIFの5'コード配列に対応し（プライマーＡ）、アンチセンスプライマーは、 変異の部位にかかる配列をコードする（プライマー１、２、３）。 第２セットのプライマーについては、センスプライマーは変異の部位にかかる 配列をコードするが、これは第１のプライマーセットのアンチセンスプライマー と重複しており（プライマー４、５、６）、アンチセンスプライマーは、停止コ ドン(TAA)と追加のEcoRI部位を下流に持つヒトGIFの3'コード配列をコードする （プライマーＢ）。 ヒトGIF cDNAを鋳型として用いることにより、２つのcDNAフラグメントの各々 をPCRで増幅し、次いで、Bio-Radキットを用いて精製した。２つのcDNAフラグメ ントにおいて重複する配列のために、この２つのフラグメントをその後アニール して、第２回目のPCRの鋳型として、プライマーAおよびBとともに用いて、変異 させた、全長のヒトGIFを作製した。57位のシステイン残基がセリン残基に置換 されているC57S-GIFの作製のために、プライマーA、１、４およびBを用い た。60位のシステイン残基がセリン残基に置換されているC60S-GIFの作製のため に、プライマー A、2、5およびBを用いた。81位のシステイン残基がセリン残基 に置換されているC81S-GIFの作製のために、プライマーA、3、6およびBを用いた 。変異させたcDNAフラグメントをその後クローニングベクターTA（Invitrogen） に連結し、配列をDNA配列決定により確認した。１残基の変異を持つヒトGIFをコ ードするEcoRIフラグメントをその後啼乳類発現ベクターpEFneo（Liuら，Proc． Natl．Acad．Sci．USA，91:11227，1994）のEcoRI部位に挿入した。得られたプ ラスミドをその後BMT10細胞にトランスフェクトし、安定なトランスフェクタン トをG418耐性により選択した。 選択したトランスフェクタントの培養上清を回収し、濃縮し、抗GIFポリクロ ーナル抗体結合affigelまたは抗GIFモノクローナル抗体388F-1結合affigel(WO94 /26923、上記)のいずれかで吸着させた。免疫吸着剤に保持されたタンパク質を 酸性pHで溶離し、溶出液画分のGIFの濃度をSDS-PAGEおよび銀染色で測定した。B. 変異型GIFの生物活性 T細胞ハイブリドーマ12H5細胞(Iwataら，J．Immunol.，140:2534，1988)を用 いて、GIF活性を検出した。ハイブリドーマ細胞の懸濁液を等量の試験試料と混 合し、10ftg/mlのマウスIgEとともに24時間培養した。培養上清をCF50A膜で濾過 し、IgE結合因子(IgE-BF)を含有する濾液をレンチルレクチンセファロース上で 分画した(Yodoiら，J．Immunol．125:1436，1980)。未結合のタンパク質（流出 液画分）と0.2M αメチルマンノシドで溶離したタンパク質（溶出液画分）をIgE -BFの存在についてロゼット抑制法で評価した。十分な量のGIFをマウスIgEとと もに12H5細胞の培養液に添加した場合は、その細胞が生産した大部分のIgE-BFは レンチルレクチンに対する親和性を欠き、流出液画分中に回収された(Iwata & I shizaka，J．Immunol.，141:3270，1988）。このようにして、流出液画分／溶出 液画分のロゼット抑制のパーセントの割合が3.0以上の場合は、GIFが(+)とした 。GIF活性に必要とされる最小濃度を表４に示す。表４ BMT10 細胞において発現したGIF誘導体の活性 試料 ＧＩＦ活性に必要とされる最小濃度 天然型 ＞1000ng/ml （ポリクローナル抗-GIF精製） C57S （ポリクローナル抗-GIF精製） 62.5ng/ml （388F1精製） 33.0ng/ml C60S （ポリクローナル抗-GIF精製） 500ng/ml C81S （ポリクローナル抗-GIF精製） ＞500ng/ml 〔実施例８〕大腸菌由来組換えGIFの修飾体の作製と生物活性 本実施例は、システイン残基を修飾した組換えGIF誘導体の作製に関するもの である。A ． カルボキンメチル化組換えGIFの作製 実施例３で比較対照として用いた天然型アミノ酸配列を有する組換えGIF2.5mg を1.25mlのPBSに溶解し、1N水酸化ナトリウム溶液に240mg/mlの濃度で溶解させ たモノヨード酢酸溶液を20μl添加し、室温で一晩静置した。反応終了後、NAP-2 5（Pharmacia）を用いて20mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.5）に溶液を交換し、 同じ緩衝液で平衡化したTOSOH CM-5PWカラム（0.75ｘ7.5cm）（東ソー）にかけ た。1.0ml/分の流速で、塩化ナトリウム濃度を0.5Mまで直線的に上げて、タンパ ク質を溶出した。GIFタンパク質のピークは４つ得られた（図３）。なお、反応 前の組換えGIFは、同カラムでは単一ピークであり、反応後画分の４番目のピー クと同一の分画にくる。それぞれの画分のGIFのフリーの-SH基をエールマン法（ 前述Glazerら）により定量した。その結果、一番目のピークのGIFから、順に、2 .1個、2.4個、2.7個、3.0個という値が得られた。この事は、一番目のピークのG IFは、それぞれ一カ所のシステインの-SH基がアルキル化されたGIFが三量体を形 成しているものであり、二番目のピークのGIFは、一カ所のシステインの-SH基が アルキル化されたGIFが二分子と、いずれのシステインもアルキルされていないG IF一分子が会合したものであり、三番目のピークのGIFは、一箇所のシステイン の-SH基がアルキル化されたGIFが一分子と、いずれのシステインもアルキルされ ていないGIF二分子が会合したものであり、四番目のピークのGIFは、いずれのシ ステインもアルキル化されていないGIF三分子が会合したものであるといったこ とを事を示している。一番目のピークのGIFから、順に、それぞれCM3-GIF、CM2- GIF、CM1-GIF、CM0-GIFと呼ぶこととする。 このモノヨード酢酸によるGIFの修飾がどのシステイン残基に起きたかについ て、実施例４のペプチドマッピングの方法を用いて調べた所、６０番目のシステ イン残基にのみ修飾がおきている事が判明した。B ． カルボキンメチル化組換えGIFの生物活性 上記CM3-GIF、CM2-GIF、CM1-GIF、CM0-GIFについて実施例３の方法を用いてイ ンビボ抗体産生抑制活性を評価した。その結果、システイン残基の修飾によって も、活性の高低が種々に変化する事が見い出された（表５）。表５ 組換えGIFの修飾体の生物活性 試料 Ｎ 抗DNP-IgG1（μg/ml） PBS(コントロール) １０ 35.3±3.21 CM0-GIF ４ 19.8±5.54 CM1-GIF ４ 14.9±4.86 CM2-GIF ４ 9.5±0.97 CM3-GIF ４ 30.1±4.92C ． ピリジルエチル化組換えGIFの作製 実施例３で比較対照として用いた天然型アミノ酸配列を有する組換えGIF2.5mg を1.25mlのPBSに溶解し、4-ビニルピリジンを0.2μl添加した後、室温で一晩静 置した。反応終了後、20mM酢酸ナトリウム緩衝液に交換し、TOSOH CM-5PWカラム を用いて分画した。カルボキシメチル化の場合と同様に４つのピークが得られ（ 図４）、それぞれのGIFタンパク質のフリーの-SH基のエールマン法による測定値 は、一番目のピークから順に2.1、2.4、2.7、3.0であった。これらのGIF分子を 、それぞれPE3-GIF、PE2-GIF、PE1-GIF、PE0-GIFと呼ぶこととする。また、ピリ ジルエチル基は、カルボキシメチル基と同様に６０番目のシステイン残基にのみ 入っていた。D ． ピリジルエチル化組換えGIFの生物活性 上記PE3-GIF、PE2-GIF、PE1-GIF、PE0-GIFについて実施例３の方法を用いてイ ンビボ抗体産生抑制活性を評価した。その結果は、必ずしもカルボキシメチル化 したGIFとは一致しなかったが、これは、修飾基の化学的性質の違いによるもの と考えられる。しかし、修飾をする事により、活性の上昇は確認された（表６） 。表６ 組換えGIFの修飾体の生物活性 試料 Ｎ 抗DNP-IgG1（μg/mｌ） PBS(コントロール) １０ 35.3±3.21 PE0-GIF ４ 25.5±7.90 PE1-GIF ４ 24.5±5.67 PE2-GIF ４ 21.3±3.71 PE3-GIF ４ 13.2±2.09 〔実施例９〕組換えGIF誘導体の抗アレルギー作用 本実施例は組換えGIF誘導体が強力にアレルギー反応を抑制する事を示すもの である。C57A/N106Sを用いて、抗原感作により惹起されるアレルギー反応に対す る抑制効果を調べた。BDF₁マウスをアラムlmgに吸着させた0.ｌttgDNP-オボアル ブミンで免疫し、C57A/Nl06Sを20μgの用量で免疫前日、当日、１、２、３、４ 、６、８、１０、１２日目に腹腔内に投与した。コントロールとしてはPBSを投 与した。 １４日目に耳に0.1μgのDNP-BSAを投与し、さらに0.5%エバンズブルー溶液を0 .25ml静注した。３０分後にマウスを死亡させ耳を取り、0.7mlの1N水酸化カリウ ム溶液に入れて３７℃で一晩インキュベートした。そこに0.6Nリン酸：アセトン （5：13）9.3mlを加え、撹拌後、上清中の色素量を620nmの吸光度で測定した。 アレルギー反応抑制作用を持つコントロール薬剤として、抗アレルギー剤である ケトチフェンを１３日目に1mg/kg投与した。この実験を２回（実験１、実験２） 行った。 その結果、C57A/N106Sを投与したマウスでは、ほとんど色素漏出が見られず、 市販の抗アレルギー剤よりも高い抑制作用を示した（図５）。 〔実施例１０〕大腸菌由来組換えGIFの修飾体の作製と生物活性 A ． カルボキシメチル化組換えGIF誘導体の作製 組換えGIF誘導体(C57AまたはC57A/N106S)(0.2mg)を10mlのPBSに溶解し、1N水 酸化ナトリウム溶液に240mg/mlの濃度で溶解させたモノヨード酢酸溶液を5μl添 加し、室温で一晩静置した。反応終了後、YM3膜（Amicon）を用いて溶媒を1mlま で濃縮した。得られた溶液を50mlの20mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)に添加し 、再度1mlまで濃縮した。このステップをもう一度繰り返し、得られた溶液を20m M酢酸ナトリウム（pH5.5）で平衡化したT0SOH CM-5PWカラム（0.7ｘ7.0cm）にか けた。1.0ml/分の流速で、塩化ナトリウム濃度を0.5Mまで直線的に上げて、タン パク質を溶出した。それぞれ１つのシステイン残基がアルキル化されている３つ のGIF変異型分子(C57AまたはC57A/N106S)の三量体に対応する一番目のピークを 回収し、それぞれC57A-CM3またはC57A/N106S-CMと呼ぶこととする。 実施例４に記載したように行ったペプチドマッピングの結果、60位および／ま たは81位のシステイン残基がカルボキシメチル基で修飾されたことが判明した。B ． カルボキシメチル化組換えGIF誘導体の生物活性 C57A-CM3およびC57A/N106S-CMについて実施例３の方法を用いてインビボ抗体 産生抑制活性を評価した。但し、９回の注射の代わりに−１、０、１日目に３回 の投与を行った。その結果、カルボキシメチル化されたGIFはC57AまたはC57A/N1 06Sよりも高い活性を示した（表７）。表７に示した、生物活性を検出する同じ 調製物のインビトロアッセイ（実施例３）も、C57AおよびC57A/N106Sのカルボキ シメチル化は活性を著しく高めることを示していた。表７ 組換えGIFの修飾体の生物活性 試料 N 抗DNP-IgE インビトロGIF活性のため の最小濃度 （ng/ml） （ng/ml） PBS(コントロール) 6 2684.1±675.9 -- C57A 4 1750.2±491.5 100 C57A-CM3 4 200.2±52.5 10 C57A/N106S 4 397.2±214.0 100 C57A/N106S-CM 4 126.5±48.9 10 〔実施例１１〕組換えGIF誘導体によるNODマウスの自然発症糖尿病の予防 本実施例は、組換えGIFがインスリン依存性糖尿病を予防する能力が高いこと を示す。 NOD（nonobese diabetic）雌マウス（Serreze，D.V．ら，J．of Autoimmunity ，2，759-776(1989)，Bowman，M.A．ら，Immunology Today，15，No.3，115-120 (1994)）に５〜38週令の期間にわたり10μgのC57A/N106Sを３回／週で腹腔内注 射した。試験片と熱量アッセイを用いて、マウスの糖尿を１週間に１回モニター した。絶食糖血値が持続して200mg/dlとなった時に糖尿病と診断した。C57A/N10 6Sで処理したマウスにおいては、自然発症糖尿病からのほぼ完全な保護が観察さ れた（図６）。 〔実施例１２〕組換えGIFのEMTSまたはDTNB修飾体の作製と生物活性 A ． EMTS修飾GIFの作製 実施例３で比較対照として用いた組換え天然型GIF 100μg/mlをPBSに溶解し、 種々の濃度のエチルマーキュリーチオサリチレート(EMTS)とともに24時間4℃で インキュベートした。PBSで十分に透析した後、誘導体の濃度をELISAで測定し、 調製物の生物活性を測定した。EMTS修飾GIFを分離するために、試料を10m Mリン酸緩衝液（pH6.5）で平衡化したCM-5PWカラム上で分画した。0.5ml/分の流 速で、塩化ナトリウム濃度を0.5Mまで直線的に上げてタンパク質を溶出し、２つ の主要なピークを得た。同じカラムからの未処理GIFの溶離プロフィールと比較 したところ、36〜38分に回収された後のタンパク質ピークは未修飾GIFに対応し 、31〜34分に回収された先のピークはもとのGIF調製物には存在しないことが示 された。B ． 組換えGIFのEMTS修飾体の生物活性 実施例３に記載されているように、マウスT細胞ハイブリドーマ12H5細胞をグ リコシル化IgE結合因子産生から非グリコシル化IgE結合因子産生に変換する能力 により、上記のEMTS処理したGIFおよび分画されたGIFのGIF生物活性を評価した 。GIF生物活性が検出されるGIF誘導体の最小濃度を表８に示す。 表８ GIF のEMTS修飾体の活性 EMTS濃度(mM) CM-5PW画分 生物活性のための最小濃度 （ng/ml） 未処理 未分画 ＞1000 0.05 未分画 10 0.25 未分画 5 0.25 先のピーク 2 0.25 後のピーク 500 上記の結果は、先のピークがGIFの生物活性誘導体であることを示している。 生物活性GIFの産生がスルフヒドリル基の修飾によるものであることを確認する ために、EMTSで処理して作製した生物活性GIF誘導体の一部を一晩5mMのジチオト レイトールとともに4℃でインキュベートした。十分に透析した後、還元物のGIF 生物活性を測定したところ、GIF生物活性の検出のためには1μg/mlの還元型GIF が必要であることが示された。このことは、GIFの生物活性に対するEMTS処理の 効果がEMTSとシステイン残基との反応によるものであることを示している 。C ． GIFのDTNB修飾体の作製 生物活性の高い誘導体の産生がSH基のメルカプチド形成に特異なものである可 能性を避けるために、組換え天然型GIFを他のチオール試薬である5,5'-ジチオビ ス(2-ニトロ安息香酸)(DTNB)で処理した。130μg/ml GIFのPBS溶液を24時間種々 の濃度のDTNBとともに4℃でインキュベートし、PBSで十分に透析した。 Aに記載したように、得られたDTNB処理GIFをさらにCM-5PWカラム上で分画した。 クロマトグラムによれば、一つの主要なピークが26〜29分の間に回収されたこと が示された。このことは、未修飾のGIFが実験条件下で46〜48分に溶出されたが 、検出できなかったことを示している。D ． 組換えGIFのDTNB修飾体の生物活性 Bに記載した方法で、DTNB修飾GIF誘導体のGIF生物活性を測定し、表９に示す 。 表９ GIF のDTNB修飾体の活性 DTNB濃度(mM) CM-5PW画分 生物活性のための最小濃度 （ng/ml） 未処理 未分画 ＞1000 0.10 未分画 10 0.25 未分画 8 0.25 主要ピーク 5 この結果は、水銀の取り込みは生物活性の高いGIFの産生に必須ではないこと を示している。 上記の生物活性GIF誘導体の一部を一晩5mMのジチオトレイトールとともに4℃ でインキュベートし、十分に透析した。GIF生物活性を測定したところ、1μg/ml の還元型GIFですらGIF活性を示さないことが示された。この結果は、不活 性rGIFのSH基をDTNBで修飾すると、高いGIF生物活性をもたらすことを示してい る。 以下、製剤例を示す。 ＜製剤例１＞ 実施例２で得られたC57A-GIFを含む溶液を無菌濾過した後、１０ｍｌバイアル 瓶に充填し注射剤とした。 ＜製剤例２＞ 実施例２で得られたC57A-GIFを含む溶液を無菌濾過した後、濃縮し、これを無 菌操作で１０ｍｌバイアル瓶に５ｍｌ充填し、−２０℃で凍結乾燥後、ゴム栓に 施栓した凍結乾燥物を用いて注射剤とした。 ＜製剤例３＞ 実施例６で得られたC57A/N106S-GIFを含む溶液を無菌濾過した後、１０ｍｌバ イアル瓶に充填し注射剤とした。 ＜製剤例４＞ 実施例６で得られたC57A/N106S-GIFを含む溶液を無菌濾過した後、濃縮し、こ れを無菌操作で１０ｍｌバイアル瓶に５ｍｌ充填し、−２０℃で凍結乾燥後、ゴ ム栓に施栓した凍結乾燥物を用いて注射剤とした。 ＜製剤例５＞ 実施例８で得られたCM2-GIFを含む溶液を無菌濾過した後、１０ｍｌバイアル 瓶に充填し注射剤とした。 ＜製剤例６＞ 実施例８で得られたCM2-GIFを含む溶液を無菌濾過した後、濃縮し、これを無 菌操作で１０ｍｌバイアル瓶に５ｍｌ充填し、−２０℃で凍結乾燥後、ゴム栓に 施栓した凍結乾燥物を用いて注射剤とした。 ＜製剤例７＞ 実施例８で得られたPE3-GIFを含む溶液を無菌濾過した後、１０ｍｌバイアル 瓶に充填し注射剤とした。 ＜製剤例８＞ 実施例８で得られたPE3-GIFを含む溶液を無菌濾過した後、濃縮し、これを無 菌操作で１０ｍｌバイアル瓶に５ｍｌ充填し、−２０℃で凍結乾燥後、ゴム栓に 施栓した凍結乾燥物を用いて注射剤とした。 ＜製剤例９＞ 実施例７で得られたC57S-GIFを含む溶液を無菌濾過した後、濃縮し、これを無 菌操作で１０ｍｌバイアル瓶に５ｍｌ充填し、注射剤とした。 ＜製剤例１０＞ 実施例７で得られたC57S-GIFを含む溶液を無菌濾過した後、濃縮し、これを無 菌操作で１０ｍｌバイアル瓶に５ｍｌ充填し、−２０℃で凍結乾燥後、ゴム栓に 施栓した凍結乾燥物を用いて注射剤とした。 ＜製剤例１１＞ 実施例１０で得られたC57A-CM3を含む溶液を無菌濾過した後、濃縮し、これを 無菌操作で１０ｍｌバイアル瓶に５ｍｌ充填し、注射剤とした。 ＜製剤例１２＞ 実施例１０で得られたC57A-CM3を含む溶液を無菌濾過した後、濃縮し、これを 無菌操作で１０ｍｌバイアル瓶に５ｍｌ充填し、−２０℃で凍結乾燥後、ゴム栓 に施栓した凍結乾燥物を用いて注射剤とした。 ＜製剤例１３＞ 実施例１０で得られたC57A/N106S-CMを含む溶液を無菌濾過した後、濃縮し、 これを無菌操作で１０ｍｌバイアル瓶に５ｍｌ充填し、注射剤とした。 ＜製剤例１４＞ 実施例１０で得られたC57A/N106S-CMを含む溶液を無菌濾過した後、濃縮し、 これを無菌操作で１０ｍｌバイアル瓶に５ｍｌ充填し、−２０℃で凍結乾燥後、 ゴム栓に施栓した凍結乾燥物を用いて注射剤とした。 ＜製剤例１５＞ 実施例１２Ａで得られたEMTS修飾GIF（CM-5PW分画における先のピーク）を含 む溶液を無菌濾過した後、濃縮し、これを無菌操作で１０ｍｌバイアル瓶に５ｍ ｌ充填し、注射剤とした。 ＜製剤例１６＞ 実施例１２Ａで得られたEMTS修飾GIF（CM-5PW分画における先のピーク）を含 む溶液を無菌濾過した後、濃縮し、これを無菌操作で１０ｍｌバイアル瓶に５ｍ ｌ充填し、−２０℃で凍結乾燥後、ゴム栓に施栓した凍結乾燥物を用いて注射剤 とした。 ＜製剤例１７＞ 実施例１２Ｃで得られたDTNB修飾GIF（CM-5PW分画における主要ピーク）を含 む溶液を無菌濾過した後、１０ｍｌバイアル瓶に充填し、注射剤とした。 ＜製剤例１８＞ 実施例１２Ｃで得られたDTNB修飾GIF（CM-5PW分画における主要ピーク）を含 む溶液を無菌濾過した後、濃縮し、これを無菌操作で１０ｍｌバイアル瓶に５ｍ ｌ充填し、−２０℃で凍結乾燥後、ゴム栓に施栓した凍結乾燥物を用いて注射剤 とした。 以上、本発明の好ましい態様について記載したが、本発明の精神を逸脱するこ となく種々の変更および改良が可能であることが当業者には明らかであることが 理解されよう。 従って、本発明の範囲は、以下の請求の範囲によってのみ決定されるべきであ る 産業上の利用可能性 本発明により、高い免疫抑制活性を有するGIF誘導体タンパク質を安定且つ大 量に生産することが可能になる。これらのGIF誘導体タンパク質は、アレルギー 疾患等の治療および／または予防に利用することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/52 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｋ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 ０８／６１０，７２８ (32)優先日 平成８年３月４日(1996．3．4) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 渡▲会▼ 浩志 群馬県前橋市上小出町２丁目37−16 (72)発明者 黒木 良太 神奈川県横浜市金沢区能見台５丁目13−20 −２ (72)発明者 加藤 洋一 神奈川県横浜市金沢区能見台６丁目35−５ −101 (72)発明者 石坂 公成 山形県山形市蔵王半郷1659−15 (72)発明者 仲野 龍己 北海道札幌市中央区南23条西８丁目１−30 −504

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．配列番号１のアミノ酸配列を持つ抗原非特異的ヒトグリコシル化抑制因子と 比較して、生物活性が高められた、配列番号１の抗原非特異的ヒトグリコシル化 抑制因子の誘導体。 ２．配列番号１のアミノ酸配列の変異および／または化学修飾を含む請求項１記 載の抗原非特異的ヒトグリコシル化抑制因子誘導体。 ３．変異および／または化学修飾により、配列番号１のアミノ酸配列を持つ抗原 非特異的ヒトグリコシル化抑制因子の三量体形成に関与する領域での分子間会合 の強さが弱められた請求項２記載の抗原非特異的ヒトグリコシル化抑制因子誘導 体。 ４．三量体形成に関与する領域が、配列番号１のアミノ酸配列の３７−４５位、 ４７−５０位、５７位、５９位、６０位、９４−９８位及び１０６−１１０位か らなる群より選ばれる少なくとも一つの領域である請求項３記載の抗原非特異的 ヒトグリコシル化抑制因子誘導体。 ５．三量体の会合定数が６１４未満となるように分子間会合の強さが弱められた 請求項３記載の抗原非特異的ヒトグリコシル化抑制因子誘導体。 ６．配列番号１のアミノ酸配列の少なくとも５７位システイン残基に変異が導入 された請求項２記載の抗原非特異的ヒトグリコシル化抑制因子誘導体。 ７．配列番号１のアミノ酸配列において、３７−４５位、４７−５０位、５９位 、６０位、９４−９８位及び１０６−１１０位からなる群より選ばれる少なくと も一つの領域内において１箇所以上にアミノ酸残基の変異がさらに導入された請 求項６記載の抗原非特異的ヒトグリコシル化抑制因子誘導体。 ８．５７位システイン残基がアラニン残基またはセリン残基に置換された請求項 ６記載の抗原非特異的ヒトグリコシル化抑制因子誘導体。 ９．５７位システイン残基及び１０６位アスパラギン残基がそれぞれアラニン残 基及びセリン残基へ置換された請求項７記載の抗原非特異的ヒトグリコシル化抑 制因子誘導体。 10．配列番号１のアミノ酸配列内の一つまたはそれ以上のアミノ酸残基の化学修 飾が、リン酸化、アルキル化、アシル化、EMTS修飾およびDTNB修飾からなる群よ り選択される請求項２記載の抗原非特異的ヒトグリコシル化抑制因子誘導体。 11．システイン残基がカルボキシメチル化された請求項10記載の抗原非特異的ヒ トグリコシル化抑制因子誘導体。 12．システイン残基がピリジルエチル化された請求項10記載の抗原非特異的ヒト グリコシル化抑制因子誘導体。 13．システイン残基がEMTS修飾された請求項10記載の抗原非特異的ヒトグリコシ ル化抑制因子誘導体。 14．システイン残基がDTNB修飾された請求項10記載の抗原非特異的ヒトグリコシ ル化抑制因子誘導体。 15．配列番号１のアミノ酸配列の少なくとも５７位システイン残基に変異が導入 され、かつ、配列番号１のアミノ酸配列内の一つまたはそれ以上のアミノ酸残基 の化学修飾が、リン酸化、アルキル化、アシル化、EMTS修飾およびDTNB修飾から なる群より選択される請求項２記載の抗原非特異的ヒトグリコシル化抑制因子誘 導体。 16．５７位システイン残基がアラニン残基またはセリン残基に置換された請求項 15記載の抗原非特異的ヒトグリコシル化抑制因子誘導体。 17．システイン残基がカルボキシメチル化された請求項15記載の抗原非特異的ヒ トグリコシル化抑制因子誘導体。 18．変異が配列番号１のアミノ酸配列の１０６位アスパラギン残基にさらに導入 された請求項15記載の抗原非特異的ヒトグリコシル化抑制因子誘導体。 19．１０６位アスパラギン残基がセリン残基へ置換された請求項18記載の抗原非 特異的ヒトグリコシル化抑制因子誘導体。 20．配列番号１の抗原非特異的ヒトグリコシル化抑制因子の誘導体をコードする ポリヌクレオチドであって、該誘導体は、配列番号１のヌクレオチド配列の変異 を含み、かつ配列番号１のアミノ酸配列を持つ抗原非特異的ヒトグリコシル化抑 制因子と比較して、生物活性が高められた、前記のポリヌクレオチド。 21．変異が、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの挿入およびヌクレオチドの置 換からなる群より選択される請求項20記載のポリヌクレオチド。 22．変異により、配列番号１のアミノ酸配列を持つ抗原非特異的ヒトグリコシル 化抑制因子の三量体形成に関与する領域での分子間会合の強さが弱められた請求 項20記載のポリヌクレオチド。 23．三量体形成に関与する領域が、配列番号１のアミノ酸配列の３７−４５位、 ４７−５０位、５７位、５９位、６０位、９４−９８位及び１０６−１１０位か らなる群より選択される少なくとも一つの領域である請求項22記載のポリヌクレ オチド。 24．ヌクレオチド配列が、配列番号１のアミノ酸配列の少なくとも５７位システ イン残基に変異が導入された抗原非特異的ヒトグリコシル化抑制因子誘導体タン パク質のアミノ酸配列をコードする請求項23記載のポリヌクレオチド。 25．配列番号１のアミノ酸配列の３７−４５位、４７−５０位、５９位、６０位 、９４−９８位及び１０６−１１０位からなる群より選択された少なくとも一つ の領域内において、１箇所以上にアミノ酸残基の変異がさらに導入された請求項 24記載のポリヌクレオチド。 26．ヌクレオチド配列が、５７位システイン残基がアラニン残基またはセリン残 基に置換された抗原非特異的ヒトグリコシル化抑制因子誘導体タンパク質のアミ ノ酸配列をコードする請求項24記載のポリヌクレオチド。 27．ヌクレオチド配列が、５７位システイン残基及び１０６位アスパラギン残基 がそれぞれアラニン残基及びセリン残基へ置換された抗原非特異的ヒトグリコシ ル化抑制因子誘導体タンパク質のアミノ酸配列をコードする請求項26記載のポリ ヌクレオチド。 28．請求項20記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。 29．請求項20記載のポリヌクレオチドで形質転換された原核生物細胞又は真核生 物細胞。 30．原核生物が細菌である請求項29記載の細胞。 31．原核生物が大腸菌である請求項29記載の細胞。 32．真核生物が哺乳動物である請求項29記載の細胞。 33．請求項29記載の原核生物細胞又は真核生物細胞を培養し、産生された抗原非 特異的ヒトグリコシル化抑制因子誘導体を分離および精製することを特徴とする 、抗原非特異的ヒトグリコシル化抑制因子誘導体の製造方法。 34．抗原非特異的ヒトグリコシル化抑制因子またはその誘導体に、その三量体形 成に関与する領域での分子間会合の強さを弱めるような化学修飾をおこなうこと を特徴とする、抗原非特異的ヒトグリコシル化抑制因子誘導体の製造方法。 35．化学修飾が、リン酸化、アルキル化およびアシル化からなる群より選択され る請求項34記載の方法。 36．請求項１記載の抗原非特異的ヒトグリコシル化抑制因子誘導体と医薬的に許 容できる担体とを含む医薬組成物。 37．免疫抑制のために使用する請求項36記載の医薬組成物。 38．アレルギーの治療および／または予防のために使用する請求項36記載の医薬 組成物。 39．糖尿病の治療および／または予防のために使用する請求項36記載の医薬組成 物。 40．免疫抑制に有効な量の請求項１記載の抗原非特異的ヒトグリコシル化抑制因 子誘導体をヒトに投与することを含む、抗原に対するヒトの免疫応答を抑制する 方法。 41．抗原非特異的ヒトグリコシル化抑制因子誘導体が、配列番号１のアミノ酸配 列の少なくとも５７位のシステイン残基に変異を含む請求項40記載の方法。 42．投与が非経口投与である請求項40記載の方法。 43．非経口投与が、皮下、筋肉内、腹腔内、腔内、経皮、または静脈内注射であ る請求項42記載の方法。 44．糖尿病の治療および／または予防のために使用する請求項40記載の方法。