JP2000504009A

JP2000504009A - ヌクレオシド類似体

Info

Publication number: JP2000504009A
Application number: JP9527435A
Authority: JP
Inventors: ブラウン，ダニエル; ハミルトン，アラン; ロークス，デービッド; シモンズ，エイドリアン; スミス，クリフォード
Original assignee: アマーシャム・ファーマシア・バイオテック・ユーケイ・リミテッド
Priority date: 1996-02-01
Filing date: 1997-02-03
Publication date: 2000-04-04
Also published as: US6239159B1; EP0885235A1; GB9602028D0; KR19990082228A; AU1610397A; AU712310B2; CA2243679A1; WO1997028176A1

Abstract

(57)【要約】Ｍが、（１）または（２）または（３）であり、ここにおいて、Ｘ¹、Ｘ²およびＸ³がそれぞれ、ＣまたはＮであり、Ｒ⁶およびＲ⁷がそれぞれ同じであるかまたは異なり、そしてそれぞれ、Ｈ、ＮＯ₂、ＣＯ、ＣＯＲ⁸、ＯＲ⁸、ＣＮ、Ｏ、ＣＯＮ（Ｒ⁸）₂、ＣＯＯＲ⁸、ＳＯ₂Ｒ⁸、ＳＯ₃Ｒ⁸、ＳＲ⁸、ＮＨＣＨＯ、（ＣＨ₂）_nＮ（Ｒ⁸）₂、ハロゲンまたはリポーターモエティであり、Ｒ⁸およびＲ⁹がそれぞれ、Ｈまたはヒドロカルビルまたはリポーターモエティであり、そしてｎが０〜４である基Ｍが天然塩基と置き換えられるヌクレオシド類似体。該類似体は、ポリメラーゼおよびターミナルトランスフェラーゼ酵素の基質である。

Description

【発明の詳細な説明】ヌクレオシド類似体核酸は、広範囲の研究および診断の技術でインビトロで操作される。その方法は、標識付けまたは塩基配列同一性の確認のための、ポリメラーゼまたはターミナルトランスフェラーゼ酵素による核酸プローブの合成を伴うことがある。標識付けは、しばしば、検出可能にするように化学的に標識されているかまたは特定の化学組成を有するヌクレオチドの包含を伴う。この方法で製造された核酸プローブは、標的に対するそのプローブのハイブリダイゼーションによって相補的配列を有する核酸標的の存在を確認するのに用いることができる。化学的に標識されたかまたは他の方法で修飾されたヌクレオチドをＤＮＡ中に導入するもう一つの方法は、オリゴヌクレオチド合成機中において何等かの所望の配列中で互いに結合しているヌクレオシドホスホルアミダイトまたは他の前駆物質を用いる化学合成を伴い、その最終生成物は、ポリメラーゼの使用によって製造されたＤＮＡと区別がつかない。若干の場合において、天然塩基の塩基対合特異性を持たないオリゴ−またはポリ−ヌクレオチド中へ塩基類似体を包含できることは有用である。ヒポキサンチンは、４種類全部の天然塩基と水素結合を形成することができるが、結合の強さは種々の塩基で異なるので、従来この目的のために考えられてきた。更に最近になって、３−ニトロピロール（ＷＯ94/06810号）および５−ニトロインドール（ LoakesおよびBrown，Nucleic Acids Research，1994，22，4039-43）が考えられた。それらは、天然塩基と構造が異なり、環構造内にそれぞれ１個のヘテロ原子のみを含有し、ニトロピロールは１個の５員環から成り、そしてそれぞれただ一つの環外成分としてニトロ基を有する。両者の塩基類似体は、化学合成によってオリゴヌクレオチド中に包含された。融解温度（Ｔｍ）は、その鋳型に対してハイブリッド形成した修飾オリゴヌクレオチドについて測定された。オリゴヌクレオチドのＴｍは、正しい天然塩基が含まれた場合よりもニトロピロールまたはニトロインドールが存在した場合に低かったが、ニトロピロールおよびニトロインドールは、相補鎖内の向かい合った位置の異なった塩基を強く区別しなかった。包含するためのイミダゾール−カルボキサミドヌクレオシドモノマーの合成も記載された(Pochet ら,Bioorganic and Mediclnal Chemistry Letters,5,1679,(19 95))。本発明は、式（式中、Ｚは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＳＯ、ＮＲ⁹またはＣＨ₂であり、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³およびＲ⁴は、同じであるかまたは異なり、そしてそれぞれ、Ｈ、ＯＨ、Ｆ、ＮＨ₂、Ｎ₃、Ｏ−ヒドロカルビルまたはリポーターモエティ（moie ty）であり、Ｒ⁵は、ＯＨまたは一、二若しくは三リン酸若しくは−チオリン酸、または対応するボラノリン酸であり、或いは、Ｒ²およびＲ⁵の一方は、ホスホルアミダイト、またはポリヌクレオチド鎖中に包含するための他の基であり、そしてＭは、であり、ここにおいて、Ｘ¹、Ｘ²およびＸ³は、同じであるかまたは異なり、そしてそれぞれ、ＣまたはＮであり、Ｘ³がＮである場合、基Ｒ⁷は存在せず、Ｒ⁶およびＲ⁷は、同じであるかまたは異なり、そしてそれぞれ、Ｈ、ＮＯ₂、ＣＯ、ＣＯＲ⁸、ＯＲ⁸、ＣＮ、Ｏ、ＣＯＮ（Ｒ⁸）₂、ＣＯＯＲ⁸、ＳＯ₂Ｒ⁸、ＳＯ₃ Ｒ⁸、ＳＲ⁸、ＮＨＣＨＯ、（ＣＨ₂）_nＮ（Ｒ⁸）₂、ハロゲンまたはリポーターモエティであり、Ｒ⁸およびＲ⁹はそれぞれ、Ｈまたはヒドロカルビルまたはリポーターモエティであり、そしてｎは、０、１、２、３または４である）を有するヌクレオシド類似体であって、但し、Ｒ⁵が三リン酸でない場合、そのヌクレオシド類似体はリポーターモエティを含むことを条件とする上記ヌクレオシド類似体を提供する。ヌクレオシド類似体は、酵素的または化学的手段によって核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）鎖中に包含されることができ、そしてそこで、相補鎖中のヌクレオチド残基と塩基対合できるしまたは適当な核酸鎖中で塩基スタッキングできる化合物である。ヌクレオシド類似体は、１種類の相補的ヌクレオチドだけと対合することによって特異的でありうるし；２種類または３種類の天然塩基、例えば、ピリミジン（Ｔ／Ｃ）またはプリン（Ａ／Ｇ）と塩基対合することによって縮重しうるし；またはそれぞれの天然塩基と無差別に対合することによって普遍的でありうる。Ｍは、必然的ではないが塩基であってよい、以後塩基類似体と称するモエティである。例えば、Ｍは、ピロールまたはインドール環構造を含んでいてよい。本発明の一つの好ましい態様において、基Ｒ⁵は三リン酸である。この場合、本発明のヌクレオシド三リン酸類似体は、酵素的手段によって核酸鎖中に包含されることができる。もう一つの好ましい態様において、本発明のヌクレオシド類似体は、リポーターモエティを含有する。リポーターモエティは、種々のもののいずれか一つであってよい。それは、ヌクレオシド類似体を容易に検出可能にする放射性同位体、例えば、リン酸基若しくはチオリン酸基またはホスホルアミダイト基またはＨ− ホスホン酸基中に包含される３２−Ｐ若しくは３３−Ｐまたは３５−Ｓ、或いは、３−Ｈまたは１２５−Ｉであってよい。それは、質量分析法によって検出可能な安定した同位体であってよい。それは、シグナルモエティ、例えば、酵素、ハプテン、発蛍光団、化学発光基、ラマン標識または電気化学標識であってよい。リポーターモエティは、シグナルモエティおよびそれを分子の残りの部分に結合するリンカー基を含んでいてよく、そのリンカー基は、当該分野において周知のように、最大３０個までの炭素、窒素、酸素および硫黄原子を有する、硬質または軟質で不飽和のまたは飽和した鎖であってよい。そのリポーターモエティは、固体表面およびそれを分子の残りの部分に結合するリンカー基を含んでいてよい。そのリポーターモエティは、末端のまたは他の反応性基、例えば、ＮＨ₂、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ₂またはＳＨを含むリンカー基から成ってよく、シグナルモエティおよび／または固体表面は、核酸鎖中へのヌクレオシド類似体の包含の前または後に結合されうる。リポーターモエティで標識されたプリンおよびピリミジンヌクレオシド類似体は、周知であるし且つ文献で充分に記載されている。標識ヌクレオチド類似体は、配列決定または他の核酸操作中に容易に検出可能な利点を有する。モエティＭ中において、Ｘ¹およびＸ³は、好ましくはＣであり、そしてＸ²は、好ましくは、Ｎである。好ましいモエティＭの例は、下記である。（i）のピロールジカルボキサミドにおいて、どちらのカルボキサミド基も、シグナルモエティに対する結合として作用しうるしまたはリポーターモエティによって置き換えられうる。（ii）および（iii）において、Ｒｐはリポーターモエティを示す。（iv）において、リポーターモエティは、２位、４位または５位でも存在しうる。（v）において、ニトロ基は、４位、５位または６位で存在し、そしてリポーターモエティも存在しうる。Ｍの他の例は、下記である。Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³およびＲ⁴はそれぞれ、Ｈ、ＯＨ、Ｆ、ＮＨ₂、Ｎ₃、Ｏ−アルキルまたはリポーターモエティである。したがって、リボヌクレオシド並びにデオキシリボヌクレオシドおよびジデオキシリボヌクレオシドが、他のヌクレオシド類似体と一緒に考えられる。これら糖置換基は、塩基中に存在する２個または３個の他にもリポーターモエティを含有してよい。Ｒ⁵は、ＯＨまたは一、二若しくは三リン酸若しくは−チオリン酸、または対応するボラノリン酸である。或いは、Ｒ²およびＲ⁵の一方は、ホスホルアミダイトまたはＨ−ホスホン酸若しくはメチルホスホン酸またはホスホロチオエート、または固体表面、例えば、半コハク酸塩調節細孔ガラスに対する適当な結合、または概して化学的手段によってポリヌクレオチド鎖中に包含するための他の基であってよい。オリゴヌクレオチドを合成する場合のホスホルアミダイトおよび関連誘導体の使用は、周知であり且つ文献で記載されている。好ましくは、モエティＭは、リポーターモエティを含有する。リポーターモエティが存在する場合、Ｒ⁵は好ましくは三リン酸であり、或いはＲ²およびＲ⁵の一方は、好ましくは、ホスホルアミダイト残基である。或いは、リポーターモエティが存在しない場合、モエティＭは、例えば、抗体、または酵素若しくは蛍光基を有する他の特異的結合試薬を結合することによってそれ自体検出可能でありうる。本発明が関する新規ヌクレオシド類似体において、少なくとも１個のリポーターモエティは、好ましくは、塩基類似体中にまたは糖モエティ若しくはリン酸基中に存在する。リポーターモエティは、文献の方法によってヌクレオシド類似体の糖モエティ中に導入されうる（例えば、J.Chem.Soc.Chem.Commun.1990,1547-8 ；J.Med.Chem.,1988,31,2040-8)。同位体標識の形のリポーターは、文献の方法によってリン酸基中に導入されうる(Analytical Biochemistry,214,338-340,199 3;ＷＯ 95/15395号)。本発明のヌクレオシド類似体は、２個以上の塩基を置き換えることができるというフルオレセイン−ｄＵＴＰなどの慣用的なハプテン標識ヌクレオチドにまさる可能な利点と共に、ＤＮＡ若しくはＲＮＡを標識するのにまたはオリゴヌクレオチド中に包含するのに有用である。リポーターモエティは、ヌクレオチド類似体の物理的または生化学的性質、特に、一本鎖または二本鎖核酸中に包含されるその能力に対してほとんど悪影響を与えない位置で結合する。本発明の包含されたヌクレオシド類似体を含有する鋳型は、核酸合成におけるコピーに適当でありうる。包含されたヌクレオシド類似体のリポーターモエティがリンカー基から成る場合、シグナルモエティは、リンカー基の末端のまたは他の反応性基によって結合することにより、包含されたヌクレオシド類似体中に導入されうる。本発明のヌクレオシド類似体三リン酸は、ターミナルトランスフェラーゼ等の酵素によって包含されて、非鋳型支配様式で核酸鎖の３’末端を伸長できる。プライマーウォーキングシークエンス法では、プライマー／鋳型複合体をポリメラーゼで伸長させ、そして鎖終結させて、重なり合ったフラグメントセットを生じ、そこでその配列を、電気泳動および検出（放射能または蛍光）後に読み取る。次に、第一プライマーから得られた配列の末端付近の配列情報を用いて第二プライマーを合成する。次に、この第二（「ウォーキング」）プライマーを、同様の鋳型を配列決定するのに用いる。プライマーウォーキングシークエンス法は、余分の配列情報をあまり生じないという点で、別法である「ショットガン」アプローチよりも有効である。プライマーウォーキングでの主な欠点は、各回の配列決定後にウォーキングプライマーを合成する必要があることである。サイクルシークエンス法は、サイクルシークエンス法に用いられるポリメラーゼの最適温度に近いアニーリング温度を有するプライマーを必要とする。１８〜２４残基長さのプライマーが、一般にサイクルシークエンス法に用いられる。必要とされる予め合成されたウォーキングプライマーセットの寸法は、プライマーウォーキングサイクルシークエンス法を非実用的なものにした。縮重したまたは普遍的なヌクレオチド類似体の使用は、この問題に向けられている。標識もされているこのような類似体、例えば、本発明のヌクレオシド類似体の使用は、その問題を克服するのにも役だつであろう。この目的に好ましいリポーターは、慣用的なサイクルシークエンス反応で用いられているような放射性同位体または蛍光基である。ヌクレオシド類似体が塩基特異的鎖終結因子である場合、それらは鎖終結シークエンスプロトコルで用いることができる。本発明のヌクレオシド類似体は、ハプテン、発蛍光団または他のリポーター基で標識された天然核酸プローブを用いる既存の用途、例えば、サザンブロット法、ドットブロット法およびポリアクリルアミドまたはアガロースゲルを基剤とする方法のいずれでも用いることができる。プローブは、塩基類似体に結合しているハプテンに対してかまたは、追加の化学修飾を避ける場合に好都合であると考えられる塩基類似体そのものに対しての何れかを標的とする抗体を用いて検出することができる。この方法で用いられる抗体は、通常、発蛍光団または酵素などの検出可能な基で標識される。蛍光検出は、塩基類似体自体が蛍光性である場合またはヌクレオシド類似体に結合した発蛍光団が存在する場合に用いてもよい。分子多様性およびリポーター基を加えることができる位置の増加した数の組合わせを伴う本発明のヌクレオシド類似体は、一連の改良された酵素基質を生じることができる。実施例１１−（２′−デオキシーβ−Ｄ−リボフラノシル）−５−ニトロインドール−５ ′−三リン酸の合成およびヌクレオシドのリン酸化５−ニトロインドール−２’デオキシヌクレオシド（４００ｍｇ，１．５ミリモル）（Loakes,D.およびBrown,D.M.(1994)Nucleic Acids Res 22,4039-4043 で記載のように製造された）のリン酸トリエチルおよびリン酸トリメチル（１０ｍｌ，１：１）中撹拌溶液に対して、ＰＯＣｌ₃（０．６ｍｌ，６ミリモル）を０〜４℃で滴加した。その混合物を０〜４℃で１５時間撹拌した。次に、その反応混合物を、無水ＤＭＦ（０．５Ｍ溶液２０ｍｌ）中においてピロリン酸トリ−ｎ −ブチルアンモニウム（７．５ミリモル）で処理し、同時に、トリ−ｎ−ブチルアミン（７．５ミリモル，１．８ｍｌ）を加えた。１０分後、反応混合物を１Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム，ＴＥＡＢ（１００ｍｌ，ｐＨ７．５）で急冷し、そして室温で２時間撹拌した。その粗製混合物を、セファデックス（Sephadex ）Ａ−２５カラム上で０〜１ＭＴＥＡＢ（ｐＨ７．５）の直線勾配を用いて精製した。三リン酸ピーク画分を集め(０．７〜０．９Ｍ)、真空中で濃縮し、そして最後に逆相ＨＰＬＣによって精製した。５−ホルムアミドインドール、３−ニトロピロール、ピロール３−カルボキサミドおよびピロール３，４−ジカルボキサミドのヌクレオシドを、同様の方法によってリン酸化した。三リン酸生成物の生成は、３１ＰＮＭＲによって確かめられた。典型的な³¹ＰＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ）データ：−１０．２８（ｄ），−１０．７２（ｄ）および−２２．６７（ｔ）実施例２１−（２′−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−５−ホルムアミドインド− ルの合成１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−エリトロペンタフラノシル）−５−ニトロインドール（１）ジ−Ｏ−ｐ−トルオイルヌクレオシド（Loakes,D.およびBrown，D.M.,Nucl.Ac ids Res.,1994,22,4039-4043）（３．５ｇ，６．８ミリモル）を、メタノール性アンモニア８０ｍｌ中に懸濁させ且つ４５℃で一晩中撹拌した。その溶媒を蒸発させ、そして生成物をクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ₃／５％ＭｅＯＨ）によって分離して、黄色泡状物（１．８１ｇ，９６％）を与えた。¹Ｈ−n.m.r.（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）２．２５−２．３４（１Ｈ，ｍ，Ｈ２’），２．４５ −２．５９（１Ｈ，ｍ，Ｈ２’），３．５２−３．６２（２Ｈ，ｍ，Ｈ５’，Ｈ５”），３．８３−３．８８（１Ｈ，ｍ，Ｈ４’），４．３４−４．４１（１Ｈ，ｍ，Ｈ３’），４．９５（１Ｈ，ｔ，５’−ＯＨ），５．３３（１Ｈ，ｄ，３ ’−ＯＨ），６．８１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，Ｈ１’），６．８１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，Ｈ３），７．８２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，Ｈ７），７．８８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，Ｈ２），８．０３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ₁ ＝９．１Ｈｚ，Ｊ₂＝２．２Ｈｚ，Ｈ６），８．５７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，Ｈ４）。u.v.λｍａｘ（ｎｍ）２６６（ε＝１８３００），３２８．５（ε ＝９２００），λｍｉｎ２２７．５，２９０。ε２６０（μＭ）＝１８．１。１−（３，５−ジ−Ｏ−^t−ブチルジメチルシリル−２’−デオキシ−β−Ｄ− エリトロペンタフラノシル）−５−ニトロインドール（２）ピリジン（２５ｍｌ）中の上のヌクレオシド（０．５ｇ，１．９ミリモル）に対して、塩化ｔ−ブチルジメチルシリル（０．６３ｇ，４．２ミリモル）を加え、そしてその溶液を室温で一晩中撹拌した。その溶液を蒸発させ、抽出し(ＣＨＣｌ₃／水性ＮａＨＣＯ₃)、乾燥させ、そしてクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ₃）によって分離して淡黄色ガムを与えた。収量０．８７ｇ，９３％。¹Ｈ−n.m.r.（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）−０．０１，０．０９（１２Ｈ，２ｘｓ，Ｓｉ− Ｍｅ），０．８５，０．８８（１８Ｈ，２ｘｓ，ｔ−ブチル），２．２７−２．３５，２．４７−２．５９（２Ｈ，ｍ，Ｈ２’，Ｈ２”），３．６４−３．７６（２Ｈ，ｍ，Ｈ５’，Ｈ５”），３．８４−３．８８（１Ｈ，ｍ，Ｈ４’)，４．５１−４．５６（１Ｈ，ｍ，Ｈ３’），６．４３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，Ｈ１′），６．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，Ｈ３），７．７５−７．７８（２Ｈ，ｍ，Ｈ７，Ｈ２），８．０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ₁＝２．３Ｈｚ，Ｊ₂＝９．１Ｈｚ，Ｈ６），８．５３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，Ｈ４）。１−（３，５−ジ−Ｏ−^t−ブチルジメチルシリル−２’−デオキシ−β−Ｄ− エリトロペンタフラノシル）−５−アミノインドール（３）メタノール（４０ｍｌ）中のニトロインドール（０．９ｇ，１．８ミリモル）に対して、メタノール（１０ｍｌ）中のラニー（Raney）ニッケル（３００ｍｇ）を加え、そしてその溶液を水素雰囲気下で２時間撹拌した。その溶液を、セライトを介して濾過し、蒸発させ、そしてクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ₃）によって分離してオフホワイト泡状物／ガムを与えた。収量０．８０ｇ，９２％。¹ Ｈ−n.m.r.（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）０．０３，０．０４（１２Ｈ，２ｘｓ，Ｓｉ−Ｍｅ），０．８８，０．９０（１８Ｈ，２ｘｓ，ｔ−ブチル），２．１３−２．１９，２．４６−２．５３（２Ｈ，ｍ，Ｈ２’，Ｈ２”），３．６５ −３．６８（２Ｈ，ｍ，Ｈ５’，Ｈ５”），３．７７−３．８（１Ｈ，ｍ，Ｈ４ ’），４．４８−４．５１（３Ｈ，ｍ，Ｈ３’，ＮＨ₂），６．１６−６．２１（２Ｈ，ｍ，Ｈ１’，Ｈ３），６．５１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ₁=２．１Ｈｚ，Ｊ₂＝８．７Ｈｚ，Ｈ６），６．６６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，Ｈ４），７．２１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，Ｈ７），７．２９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，Ｈ２）。１−（３，５−ジ−Ｏ−^t−ブチルジメチルシリル−２’−デオキシ−β−Ｄ− エリトロペンタフラノシル）ホルムアミドインドール（４）アミノインドール（０．７９ｇ，１．６６ミリモル）を、ギ酸エチル（２５ｍｌ）と一緒に還流しながら５時間加熱した。溶媒を除去し、そして生成物をクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ₃／１％ＭｅＯＨ）によって分離して橙色ガム／泡状物を与えた。収量０．７２ｇ，８６％。¹Ｈ−n.m.r.（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）０．００１，０．０７（１２Ｈ，２ｘｓ，Ｓｉ−Ｍｅ），０．８４，０．８７（１８Ｈ，２ｘｓ，ｔ−ブチル），２．１９−２．２１，２．４６−２．５４（２Ｈ，ｍ，Ｈ２’，Ｈ２”），３．６３−３．６７（２Ｈ，ｍ，Ｈ５’，Ｈ５”），３．７７−３．７９（１Ｈ，ｍ，Ｈ４’），４．４７−４．９６（１Ｈ，ｍ，Ｈ３’），６．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，Ｈ３），７．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，Ｈ７），７．４６−７．５０（２Ｈ，ｍ，Ｈ６，Ｈ２），７．８６（１Ｈ，ｓ，ＣＨＯ），８．１９−（１Ｈ，ｓ，Ｈ４），９．９７（１Ｈ，ｓ，ＮＨ）。１−（２′−デオキシ−β−Ｄ−エリトロペンタフラノシル）−５−ホルムアミドインドール（５）エタノール（２５ｍｌ）中のシリル化ヌクレオシド（０．７ｇ，１．４ミリモル）、およびフッ化アンモニウム（０．５ｇ，１４ミリモル）を、還流しながら一晩中加熱した。溶媒を除去し、そして生成物をクロマトグラフィー（２回，ＣＨＣｌ₃／１０％ＭｅＯＨ）によって分離してオフホワイト粉末を与えた。収量２００ｍｇ，５２％。¹Ｈ−n.m.r.（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）２．１６− ２．２２および２．４３−２．４５（２Ｈ，ｍ，Ｈ２’，Ｈ２”)，３．４３− ３．５６（２Ｈ，ｍ，Ｈ５’，Ｈ５”），３．７９−３．８０（１Ｈ，ｍ，Ｈ４ ’），４．３２−４．３３（１Ｈ，ｍ，Ｈ３’），４．８４（１Ｈ，ｔ，５’− ＯＨ），５．２４（１Ｈ，ｄ，３’−ＯＨ），６．３１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，Ｈ１’），６．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，Ｈ３），７．２４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，Ｈ７），７．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，Ｈ６），７．５５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，Ｈ２），７．８８（１Ｈ，ｓ，ＣＨＯ），８．２３（１Ｈ，Ｂｒ．ｓ，Ｈ４），９．９６（１Ｈ，ｓ，ＮＨ）。実施例３１−（２′−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−５−アミノインドール５’ 三リン酸の合成ガラス製パー（Parr）水素化加圧容器中の１−（２′−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−５−ニトロインドール５’三リン酸（１０ｍｇ）の水溶液（３ｍｌ）に対して、１０％Ｐｄ／Ｃ（５ｍｇ）を加え且つ３０ｐｓｉＨ₂で２時間水素化した。反応混合物を、セライトのパッドを介して濾過し、その濾液を、デルタＰａｋＣ１８カラム（１．９ｃｍｘ３０ｃｍ，１５ミクロン）上において０〜１００％の緩衝液Ａ（０．１ＭＴＥＡＢ，ｐＨ７．１）および緩衝液Ｂ（０．１ＭＴＥＡＢ中２５％ＣＨ３ＣＮ）の勾配を１２ｍｌ／分で３０分以内で用いて濾過して、アミノインドールヌクレオシド三リン酸（６ｍｇ）を与えた。ＵＶ（Ｈ₂Ｏ）λｍａｘ２６９ｎｍ，³¹ＰＮＭＲ（Ｄ₂Ｏ／ＥＤＴＡ）ｐｐｍ− ６．５１（ｄ）γＰ，−１０．４６（ｄ）αＰ，−２１．９９（ｔ）βＰ実施例４１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−（２−Ｎ−（２，４−ジニトロフェニルアシル）アミノエチル）インドール^*の合成１−（３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−（２−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノメチレン）アミノエチル）インドール（２）^* ３−（２−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノメチレン）アミノエチルインドール（１）（３０４ｍｇ，１．４１ミリモル）のアセトニトリル（乾燥，８ｍｌ）中溶液に対して、水素化ナトリウム（油中６０％分散液，６２ｍｇ，１．５４ミリモル）を加え、そしてその溶液を室温で３０分間撹拌した。塩化α−３，５ −ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−２−デオキシリボフラノシル（６５７ｍｇ，１．６９ミリモル）を加え、そしてその溶液を３時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、そして残留物をクロロホルム中に溶解させた。標題化合物はフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ₃：ＭｅＯＨ，９：１〜ＣＨＣｌ₃：ＭｅＯＨ，１７：３の勾配）後に得られて生成物を与えた。その生成物を、クロマトトロン（ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ，８：１）によって更に精製して、透明な油状物（３８８ｍｇ，４８％）を与えた。¹Ｈ−n.m.r.（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ（ｐｐｍ）１１．００（１Ｈ，ｍ，ＮＣＨＮ），７．９５（４Ｈ，ｍ，Ａｒ），７．６９（１Ｈ，ｍ，Ａｒ），７．５０（１Ｈ，ｍ，Ａｒ），７．３１（４Ｈ，ｍ，Ａｒ），７．１６（２Ｈ，ｍ，Ａｒ），６．８４（Ｈ，２ｘｄ，Ｈ２），６．４６（１Ｈ，ｍ，Ｈ１’），５．７５（１Ｈ，ｍ，Ｈ３’），４．８２−４．４９（３Ｈ，ｍ，Ｈ４’，Ｈ５’，Ｈ５”），３．６８および３．２４（２Ｈ，ｍ），３．１９，３．１５（４Ｈ，２ｘｓおよびｍ，２ｘＮＣＨ₃），３．１２−２．８６（２Ｈ，ｍ），２．７４−２．７１（４Ｈ，２ｘｓおよびｍ，２ｘＮＣＨ₃），２．４８，２．４６，２．４５（６Ｈ，３ｘｓ，ＡｒＣＨ₃）；ＭＳ（ＥＳ＋）計算値５６７（実測値Ｍ＋１＋，５６８，１００％）。１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−（２−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’ −ジメチルアミノメチレン）アミノエチル）インドール（３）^* １−（３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−（２−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノメチレン）アミノエチル）インドール（２）（１７８．９ｍｇ，０．３１５ミリモル）を、メタノール（乾燥，１２ｍｌ）中に溶解させ、そしてナトリウムメトキシド（１７ｍｇ，０．３１５ミリモル）を加えた。その溶液を１４時間撹拌した。薄層クロマトグラフィーは、出発物質の消失およびより遅いランニングスポットの出現を示した(ＣＨＣｌ₃：ＭｅＯＨ，６．５：１)。その溶液をダウエックス（Dowex）５０（Ｈ＋）イオン交換樹脂で中和し且つ濾過し、そしてその濾液を蒸発乾固させた。残留物をエーテル（約２ｘ２ｍｌ）で洗浄して、生成物を白色固体（１２３ｍｇ，粗製１００％）を与えた。¹Ｈ−n.m.r.（３００ＭＨｚ，ＭｅＯＨ−ｄ４）δ（ｐｐｍ）８−７(ｍ，ＡｒおよびＮＣＨＮ)，６．４３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．００，７．８４Ｈｚ，Ｈ１’），４．５１（１Ｈ，ｍ，Ｈ３’），３．９７（１Ｈ，ｍ，Ｈ４’），３．７２（２Ｈ，ｍ，Ｈ５’，Ｈ５”），３．５９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８３Ｈｚ，ＣＨ₂ＣＨ₂），３．０２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８７Ｈｚ，ＣＨ₂ＣＨ₂），２．９１（６Ｈ，ｓ，Ｎ（ＣＨ₃）２，２．６０（１Ｈ，ｍ，Ｈ２’），２．３４（２Ｈ，ｍ，Ｈ２”）。１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−（２−Ｎ−アミノエチル）インドール（４）^* １−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−（２−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ ’−ジメチルアミノメチレン）アミノエチル）インドール（３）（１２３ｍｇ）を、メタノール中飽和ＮＨ₃（１４ｍｌ）およびＮＨ₃（水性）（２ｍｌ）中に溶解させ、そしてその溶液を一晩中（約１４時間）撹拌した。より遅いランニングスポットは、薄層クロマトグラフィー（ＣＨＣｌ₃：ＭｅＯＨ，４：１）によって検出された。溶媒を真空中で除去し、そして水を凍結乾燥機で除去した。粗生成物をメタノールからシリカゲル上に吸着させ、そして追加のＮＨ₃（水性）（約１０滴／２５０ｍｌ）を用いてフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ₃：ＭｅＯＨ，４：１〜ＣＨＣｌ₃：ＭｅＯＨ，２：１）を行った。生成物は固体として得られた（４２．８ｍｇ，４９％）。¹Ｈ（３００ＭＨｚ，ＭｅＯＨ−ｄ４）δ（ｐｐｍ）７．５５（３Ｈ，ｍ，Ａｒ），７．２８−７．１３（２Ｈ，ｍ，Ａｒ），６．４４（１Ｈ，ｍ，Ｈ１’），４．５０（１Ｈ，ｍ，Ｈ３’），３．９７（１Ｈ，ｍ，Ｈ４’），３．７１（２Ｈ，ｍ，Ｈ５’，Ｈ５”），３．２４（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂ＣＨ₂），３．１４（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂ＣＨ₂），２．６３（１Ｈ，ｍ，Ｈ２’），２．３４（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝３．１３，５．９９，１３．５５Ｈｚ，Ｈ２”）。１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−（２−Ｎ−（２，４−ジニトロフェニルアシル）アミノエチル）インドール（５）^* 無水ＤＭＦ（４ｍｌ）中の１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）− ３−（２−アミノエチル）インドール（４３ｍｇ，０．１６ミリモル）に対して、２，４−ジニトロフェニル酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（１００ｍｇ，０．３１ミリモル）および無水トリエチルアミン（５０μｌ，０．３６ミリモル）を加え、そしてその反応を窒素下において室温で１時間撹拌した。薄層クロマトグラフィー分析（クロロホルム／メタノール；９：１）は、出発アミンの存在をなお示した。追加量の２，４−ジニトロフェニル酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（１００ｍｇ，０．３１ミリモル）トリエチルアミン（１００μｌ，０．７２ミリモル）を加え且つ室温で更に１時間撹拌することにより、その反応を完了させた。反応溶媒をトルエンとの完全な共蒸発によって除去して、帯赤色ガムを与えた。その生成物を、繰返しのフラッシュクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール，９：１）によって精製して、若干の２，４−ジニトロフェニル酢酸を混入した赤色ガムとして標題化合物を与えた。収量２４ｍｇ。Ｒｆ０．３５（クロロホルム／メタノール，９：１） ¹Ｈ（３００ＭＨｚ；ＣＤ₃ＯＤ）δ（ｐｐｍ）２．２（１Ｈ，ｍ，糖Ｈ２），２．４（１Ｈ，ｍ，糖Ｈ２），３．９（２Ｈ，ｔ，＝Ｃ−ＣＨ₂），３．４−３．５（２Ｈ，ｍ，ＣＨ₂−ＮＨＣＯ），３．５５−３．７（２Ｈ，ｍ，糖２−Ｈ５），３．９（１Ｈ，ｍ，糖Ｈ４），４．０５（２Ｈ，ｓ，ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ₂ ），４．４５（１Ｈ，ｍ，糖Ｈ３），６．４（１Ｈ，ｍ，糖Ｈ１），７．０−７．５（５Ｈ，ｍ，ＡｒＨ，インドールＨ２），７．７（１Ｈ，ｍ，ＤＮＰ−ＡｒＨ），８．４（２Ｈ，ｍ，ＤＮＰ−ＡｒＨ），８．８（２Ｈ，ｍ，ＤＮＰ−ＡｒＨ）。２，４−ジニトロフェニル酢酸からのシグナルも示す：３．９（ｍ，ＣＨ₂ ），７．５５（ｍ，ＤＮＰ−ＡｒＨ），８．３５（ｍ，ＤＮＰ−ＡｒＨ），８．８（ｍ，ＤＮＰ−ＡｒＨ）。^* クロマトグラフィーにより分離するのが難しい若干のαアノマーも存在した。実施例５１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−ピロール−３−カルボキサミドの合成１−（３’，５’−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−シアノピロール（１）３−シアノピロール（Can.J.Chem.,1981,59,2673）（０．７７ｇ，８．４ミリモル）を、乾燥アセトニトリル（２５ｍｌ）および水素化ナトリウム（６０％，０．３８ｇ，９．５ミリモル）中に溶解させ、そしてその溶液を室温で３０分間撹拌した。次に、これに対して、塩化１−（３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル− ２’−デオキシリボフラノシル）（３．４ｇ，１０ミリモル）を加え、そしてその溶液を室温で２時間撹拌した。溶媒を除去し、そして生成物をクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ₃）によって分離した後、メタノールから再結晶させてオフホワイト固体を与えた。収量２．０６ｇ（２回目収量は更に１．１８ｇを与えた。全収率８７％）。¹Ｈ−n.m.r.（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）２．３７，２．３９（６Ｈ，２ｘｓ，２ｘＰｈＣＨ₃），２．６９−２．８１（２Ｈ，ｍ，Ｈ２’ ，Ｈ２”），４．４８−４．５９（３Ｈ，ｍ，Ｈ５’，Ｈ５”，Ｈ３’），５．６２−５．６３（１Ｈ，ｍ，Ｈ４’），６．２０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，Ｈ１’），６．５１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，Ｈ５），７．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，Ｈ４），７．３１−７．３７，７．８４−７．９４（９Ｈ，ｍ，Ｈ２，Ｐｈ）。ＦＡＢｍａｓｓ，４４５．３（Ｍ＋Ｈ）⁺。１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−シアノピロール（２）上のヌクレオシド（３．２ｇ，７．２ミリモル）を、メタノール中１０％トリエチルアミン（２５ｍｌ）中において還流しながら１２時間加熱した。溶媒を蒸発させ、そして生成物をクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ₃／５％ＭｅＯＨ）によって分離して、透明なガムを与えた。収量１．０２ｇ（７０％）。¹Ｈ−n.m.r. （ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）２．１６−２．３４（２Ｈ，ｍ，Ｈ２’，Ｈ２ ”），３．４０−３．４９（２Ｈ，ｍ，Ｈ５’，Ｈ５”），３．７７−３．８１（１Ｈ，ｍ，Ｈ４’），４．２８（１Ｈ，Ｂｒ．ｓ，Ｈ３’），４．９７（１Ｈ，ｓ，ＯＨ），５．２４（１Ｈ，ｓ，ＯＨ），５．９５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，Ｈ１’），６．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，Ｈ５），７．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，Ｈ４），７．８２（１Ｈ，ｓ，Ｈ２）。１−（２′−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−ピロール−３−カルボキサミド（３）シアノピロール（１ｇ，４．４ミリモル）を、メタノール（５０ｍｌ）およびジオキサン（５ｍｌ）中に溶解させ、そしてそのｐＨをアンモニア溶液でｐＨ９に調整した。次に、過酸化水素（３０％，５ｍｌ）をその溶液に対して加えた後、これを室温で一晩中撹拌した。その溶液を蒸発させ、そしてクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ₃／２０％ＭｅＯＨ）によって分離して、白色泡状物を与えた。収量０．６５ｇ，６０％。¹Ｈ−n.m.r.（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）２．１２ −２．３１（２Ｈ，ｍ，Ｈ２’，Ｈ２”），３．３８−３．４１（２Ｈ，ｍ，Ｈ５’，Ｈ５”），３．７４−３．７８（１Ｈ，ｍ，Ｈ４’），４．２４−４．２７（１Ｈ，ｍ，Ｈ３’），４．８５（１Ｈ，ｔ，５’−ＯＨ），５．２２（１Ｈ，ｄ，３’−ＯＨ），５．８６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，Ｈ１’），６．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，Ｈ４），６．７０（１Ｈ，ＮＨ），６．９４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，Ｈ５），７．２７（１Ｈ，ＮＨ），７．５０（１Ｈ，ｓ，Ｈ２）。u.v.（Ｈ₂Ｏ），λｍａｘ．２２９（ε＝８０００），ε２６０（μＭ）＝３．４。実施例６１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−アミノメチルピロール− ３−カルボキサミドの合成およびアミノカプロエートに対する結合メチル−１−（３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−フタルイミドメチルピロール−３−カルボキシレート（１）ピロール（Baker，J.T.および Sifniades,S.,J.Org.Chem.,1979,44,2798）（１．５ｇ，５．３ミリモル）のアセトニトリル（２５ｍｌ）中溶液に対して、水素化ナトリウム（６０％，０．２３ｇ，５．７ミリモル）を加え、そしてその溶液を室温で３０分間撹拌した。次に、これに対してクロロ糖（２．５ｇ，６．４ミリモル）を加え、そしてその溶液を一晩中撹拌した。溶媒を除去し、そして生成物をメタノールから結晶化させて黄色固体を与えた。収量３．０ｇ，９０％。¹ Ｈ−n.m.r.（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）（ＣＤＣｌ₃）２．４２（６Ｈ，２ｘｓ，２ｘＡｒＣＨ₃），２．５８（２Ｈ，ｍ，Ｈ２’，Ｈ２”），３．７５（３Ｈ，ｓ，ＯＣＨ₃），４．４８（１Ｈ，ｍ，Ｈ４’），４．５５（２Ｈ，ｍ，Ｈ５’，Ｈ５”），５．０５（２Ｈ，ｓ，ＣＨ₂ＮＰｈｔｈ），５．５８（１Ｈ，ｍ，Ｈ３’），５．９０（１Ｈ，ｔ，Ｈ１’），６．８８（１Ｈ，ｓ，Ｈ５），７．２５（４Ｈ，ｍ，４ｘＡｒＣＨ），７．５０（１Ｈ，ｓ，Ｈ２），７．７０−７．９０（４Ｈ，ｍ，４ｘＡｒＣＨ），７．９０（６Ｈ，ｍ，ＡｒＣＨ）。メチル−１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−フタルイミドメチルピロール−３−カルボキシレート（２）上記ヌクレオシド（３ｇ，４．７ミリモル）のメタノール（５０ｍｌ）中懸濁液に対して、ナトリウムメトキシド（０．５５ｇ，１０ミリモル）を加え、そしてその溶液を室温で２時間撹拌した。溶媒を除去し、そして生成物をクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ₃／５％ＭｅＯＨ）によって分離して、オフホワイト固体、収量１．４５ｇ，７７％を与えた。¹Ｈ−n.m.r.（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）２．１０−２．２３(２Ｈ，ｍ，Ｈ２’，Ｈ２”），３．４１（２Ｈ，ｍ，Ｈ５’，Ｈ５”），３．７１（４Ｈ，ｍ，Ｈ４’，ＯＣＨ₃），４．１９（１Ｈ，ｍ，Ｈ３’），４．８１（２Ｈ，ｓ，ＣＨ₂Ｎ），４．８３（１Ｈ，ｔ，５’− ＯＨ），５．１７（１Ｈ，ｄ，３’−ＯＨ），５．８１（１Ｈ，ｔ，Ｈ１’），６．８６（１Ｈ，ｓ，Ｈ５），７．６４（１Ｈ，ｓ，Ｈ２），７．８８（４Ｈ，ｍ，Ａｒ）。ＦＡＢｍａｓｓ，４０１．２（Ｍ＋Ｈ）⁺。１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−フタルイミドメチルピロール−３−カルボキサミド（３）エステル（１．４ｇ，３．５ミリモル）を、０．８８０アンモニア（２５ｍ１）中に溶解させ、そしてその溶液を室温で一晩中撹拌した。溶媒を除去し、そして生成物をクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ₃／２０％ＭｅＯＨ）によって分離して、白色粉末，収量０．９２ｇ，６８％を与えた。¹Ｈ−n.m.r.（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）２．０８−２．３０（２Ｈ，ｍ，Ｈ２’，Ｈ２”），３．４０ −３．４９（２Ｈ，ｍ，Ｈ５’，Ｈ５”），３．６９（２Ｈ，ｓ，ＣＨ₂Ｎ），３．８０−３．８１（１Ｈ，ｍ，Ｈ４’），４．２９（１Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＯＨ），４．３７−４．３９（１Ｈ，ｍ，Ｈ３’），５．２２（１Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＯＨ），５．９０（１Ｈ，ｔ，Ｈ１’），７．２７−７．５９（６Ｈ，ｍ，Ｈ２，Ｈ５，ＡｒＣＨ），９．７０（２Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ₂）。１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−アミノメチルピロール− ３−カルボキサミド（４）フタルイミド化合物（０．９ｇ，２．３ミリモル）を水（１０ｍｌ）中に溶解させて、ヒドラジン水和物（０．７ｍｌ，２２ミリモル）を加え、そしてその溶液を還流しながら一晩中加熱した。溶媒を除去し、そして生成物をイオン交換カラム（ダウエックス５０ＷＸ８−２００，Ｈ⁺型）上において精製し且つ０．５Ｍアンモニアで溶離して、淡褐色固体を与えた。収量０．３５ｇ，５６％。¹Ｈ −n.m.r.（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）２．０４−２．２９（２Ｈ，ｍ，Ｈ２ ’，Ｈ２”），３．７６（２Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＣＨ₂Ｎ），３．９０−３．９４（１Ｈ，ｍ，Ｈ４’），３．３５−３．４５（２Ｈ，ｍ，Ｈ５’，Ｈ５”），４．２５−４．２６（１Ｈ，ｍ，Ｈ３’），４．８−６．６（６Ｈ，ｂｒ，２ｘＯＨ，ＮＨ₂，ＣＯＮＨ₂），５．８０（１Ｈ，ｂｒ．ｓ，Ｈ１’），７．０３（１Ｈ，ｓ，Ｈ５），７．５１（１Ｈ，ｓ，Ｈ２）。ｍ／ｚ（＋ｖｅＥＩ）２５６．１（Ｍ＋Ｈ）⁺。u.v.λｍａｘ２３１．６（ε＝７１００），ε２６０（μＭ）＝３．２。１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−アミノメチルピロール− ３−カルボキサミドのアミノカプロエートに対する結合１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−アミノメチルピロール −３−カルボキサミド（１ミリモル）およびＮ−（トリフルオロアセチル）−６ −アミノヘキサン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（１．２ミリモル）を、炭酸緩衝液ｐＨ９．２（２０ｍｌ）中で混合し且つ室温で一晩中撹拌した。得られた溶液を濃縮乾固させ、そしてその生成物を、５〜１０％メタノール／クロロホルムを用いるシリカゲルクロマトグラフィーによって精製した。¹ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）１．３２−１．６１（６Ｈ，ｍ，３ｘＣＨ₂），１．８５−２．３１（２Ｈ，ｍ，Ｈ２’，Ｈ２”），３．０５（２Ｈ，ｔ，Ｊ，６．８Ｈｚ，ＮＣＯＣＨ₂），３．２９−３．７３（６Ｈ，ｍ，Ｈ５’ ，Ｈ５”，Ｈ４’，Ｈ３’，ＣＨ₂ＮＣＯＣＦ₃），４．２１（２Ｈ，ｂｒｓ，ＣＨ₂ＮＨＣＯ），５．８１（１Ｈ，ｔ，Ｊ=６．６Ｈｚ，Ｈ１’），６．６５（１Ｈ，ｓ，Ｈ２），７．２３（１Ｈ，ｓ，Ｈ５），８．４０，９．６１（２Ｈ，ｂｒｓｘ２，ＮＨ）。実施例７１−（２′−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−ピロール−３，４−ジカルボキサミドの合成ピロール−３，４−ジカルボン酸ジメチルＴＯＳＭＩＣ（１．５ｇ，７．７ミリモル）を、フマル酸ジメチル（１ｇ，６．９ミリモル）および水素化ナトリウム（６０％，０．５ｇ，１２．５ミリモル）の乾燥ＤＭＦ（２５ｍｌ）中０℃溶液に対して加え、そしてその溶液を０℃で１５分間撹拌した。その反応を氷水上に注ぎ、そしてその生成物を濾過し且つ水性エタノールから再結晶させた。０．６１ｇ，４８％。¹ Ｈ−n.m.r.（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）３．６８（６Ｈ，ｓ，２ｘＣＨ₃），７．３９（２Ｈ，ｓ，２ｘＣＨ），１１．８１（１Ｈ，ｓ，ＮＨ）。ジメチル−１−（３’，５’−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−２’−デオキシ−β− Ｄ−リボフラノシル）−ピロール−３，４−ジカルボキシレート（１）ピロール（１ｇ，５．５ミリモル）を、アセトニトリル（２５ｍｌ）中に溶解させ、そしてこれに対して水素化ナトリウム（６０％，０．２５ｇ，６．２ミリモル）を加え、そしてその溶液を室温で３０分間撹拌した。次に、これに対してクロロ糖（２．５ｇ，６．４ミリモル）を加え、そしてその溶液を２時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、そして生成物を通常通り処理し且つクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ₃／１％ＭｅＯＨ）によって分離して黄色泡状物を与えた。収量１．７５ｇ，６０％。¹Ｈ−n.m.r.（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）２．３７，２．３９（６Ｈ，２ｘｓ，２ｘＡｒＣＨ₃），２．７１−２．７５（２Ｈ，ｍ，Ｈ２ ’，Ｈ２”），３．６６（６Ｈ，ｓ，２ｘＯＣＨ₃），４．４５−４．６０（３Ｈ，ｍ，Ｈ３’，Ｈ５’，Ｈ５”），５．６１−５．６３（１Ｈ，ｍ，Ｈ４’），６．２２（１Ｈ，ｔ，Ｊ=6．３Ｈｚ，Ｈ１’），７．３０−７．３７，７．７０−７．９４（８Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ），７．６７（２Ｈ，ｓ，Ｈ２，Ｈ５）。ジメチル−１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−ピロール−３，４−ジカルボキシレート（２）ジ−トルオイルヌクレオシド（１ｇ，１．９ミリモル）をメタノール（２５ｍｌ）中に懸濁させ、ナトリウムメトキシド（２０ｍｇ）を加え、そしてその溶液を還流しながら２時間加熱した。溶媒を除去し、そして生成物をクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ₃／５％ＭｅＯＨ）によって分離して淡黄色ガムを与えた。収量０．４５ｇ，８１％。¹Ｈ−n.m.r.（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ（ｐｐｍ）２．１６− ２．３３（２Ｈ，ｍ，Ｈ２’，Ｈ２”），３．６９（６Ｈ，ｓ，２ｘＯＣＨ₃），３．５１（２Ｈ，ｂｒ．ｓ，Ｈ５’，Ｈ５”），３．７９−３．８３（１Ｈ，ｍ，Ｈ３’），４．２６（１Ｈ，ｍ，Ｈ４’），４．９０（１Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＯＨ），５．２１（ＩＨ，ｂｒ．ｓ，ＯＨ），５．９６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，Ｈ１’），７．６４（２Ｈ，ｓ，Ｈ２，Ｈ５）。１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−ピロール−３，４−ジカルボキサミド（３）ヌクレオシドジエステル（０．３６ｇ，１．２ミリモル）を０．８８０アンモニア溶液（１０ｍｌ）中に溶解させ、そして密封ボトル中において５０℃で一晩中加熱した。その溶液を冷却し且つ蒸発させ、そして生成物をエタノールから結晶化させた。収量０．２６ｇ，８０％。記載の通りのスペクトル(Nucleosides & Nucleotides,1987,6,261)。実施例８ピロール−３，４−ジカルボキサミドヌクレオシドホスホルアミダイトの合成ジメチル−１−［３−Ｏ−（Ｐ−ｂ−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスフィニル）−５−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−デオキシ−ｂ −Ｄ−エリトロ−ペンタフラノシル］−ピロール−３，４−ジカルボキシレートジメチルピロール−３，４−ジカルボン酸ジメチルのヌクレオシド（０．４５ｇ，１．５ミリモル）をピリジン（２５ｍｌ）中に溶解させ、そしてこれに対して塩化ジメトキシトリチル（０．５６ｇ，１．６５ミリモル）を加え、そしてその溶液を室温で一晩中撹拌した。溶媒を除去し、そして生成物を通常通り処理し、蒸発させ、そしてクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ₃／１％ＭｅＯＨ）によって分離して黄色泡状物を与えた。収量０．８９ｇ，９８％。トリチル化されたヌクレオシド（１ｇ，１．７ミリモル）を乾燥ジクロロメタン（１０ｍｌ）中に窒素下で溶解させ、そしてこれに対してジイソプロピルアミン（０．８６ｍｌ，４．９ミリモル）を、続いて２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（０．５６ｍｌ，２．５ミリモル）を加え、そしてその溶液を室温で１時間撹拌した。次に、その溶液に対してメタノール（１００μｌ）を加えた後、その生成物を酢酸エチル（１００ｍｌ）中に溶解させ、そして１０％炭酸ナトリウム（２ｘ２５ｍｌ）で、続いて飽和ブライン（２ｘ２５ｍｌ）で抽出し、乾燥させ、そして蒸発乾固させた。次に、これをクロマトグラフィー（ジクロロメタン：ヘキサン：トリエチルアミン；１０：１０：１）によって分離して、生成物を透明なガムとして与えた。収量０．７１ｇ，５５％。³¹Ｐ−n.m.r.δ（ｐｐｍ）１４７．２２，１４６．６９。実施例９プライマー伸長検定ＤＮＡ中への５−ニトロインドール−２’−デオキシヌクレオシド５’三リン酸および３−ニトロピロール−２’−デオキシヌクレオシド５’三リン酸の包含の酵素依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性の研究のために、³²Ｐまたは³³Ｐで５’末端に標識された９マーのプライマー（5'TGC TGG AGA 3'）または１５マー（5'TGC ATG TGC 的部分に下線を施した）と一緒に用いるプライマー伸長検定が用いられた。プライマー（１ピコモル）および鋳型（２ピコモル）を一緒に、クレノウ（Klenow）緩衝液（５０ｍＭトリスＨＣｌｐＨ７．５，５ｍＭＭｇＣｌ₂および５ｍＭ β−メルカプトエタノール）中において７５℃または９０℃で２分間インキュベートした後、３０℃まで冷却させ、そして１０単位の３’〜５’エキソヌクレアーゼ不含クレノウＤＮＡポリメラーゼを加え、必要に応じて２０μＭヌクレオチドを加えた。反応を３７℃で３０分間インキュベートした後、ホルムアミド含有停止液、ＥＤＴＡおよび色素を加えた。試料を０．４ｍｍの１８％ポリアクリルアミド変性（７Ｍ尿素）ゲル上に載せ、そして約２ｋＶで約４時間流した。ゲルを１０％メタノール／１０％酢酸中で３０分間固定し、そして濾紙上で乾燥させた。次に、それらをオートラジオグラフィーフィルムに暴露させた。３’〜５’エキソヌクレアーゼ不含クレノウ、シークエナーゼ（Sequenase）^T ^M およびサーモシークエナーゼ（ThermoSequenase）^TMＤＮＡポリメラーゼを用いた結果は、１個のｄＮＩＴＰ残基が成長鎖中に包含されたことを示した。これは、追加伸長のための末端塩基の水素結合の重要性を示すと考えられ、そして天然塩基を用いたとしても、プライマーの３’末端の間違った塩基が、更にＤＮＡポリメラーゼで媒介される追加を妨げることを示す他の知見と一致する。ＡＭＶ逆転写酵素での結果は、追加の伸長が妨げられる前に、２個のｄＮＩＴＰ残基が成長鎖中に包含されたことを示した。エキソヌクレアーゼ不含クレノウポリメラーゼを用いるｄＮＰＴＰでの結果は、ｄＮＩＴＰでの結果と同様であったが、プライマーにつき２個のｄＮＰＴＰ単位の付加の形跡により、ｄＮＰＴＰはｄＮＩＴＰより有効な基質であると考えられた。しかしながら、ｄＮＰＴＰは、ＡＭＶ逆転写酵素の基質であるとは考えられなかった。実施例１０エキソマイナスクレノウポリメラーゼを用いるＤＮＡ中への類似体ヌクレオシド三リン酸包含の鋳型依存性それぞれの類似体三リン酸がどんな塩基として包含されているかを確認するために、次の４種類の鋳型を用いてプライマー伸長反応を行った。下線を施された配列に対して相補的なプライマーを、[γ³³Ｐ]ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで５’末端に標識した。標識した後、反応を５分間沸騰させて、ＰＮＫ活性を全て除去した。それぞれの伸長反応について、１ピコモルの³³Ｐ５’末端標識プライマーを、１０μｌｘ２クレノウ緩衝液中で２ピコモルの鋳型とハイブリッド形成させたが、そのハイブリダイゼーションは、通常、滴定誤差を減少させるために大量で（例えば、２６種類の反応に充分に）行われた。プライマーおよび鋳型溶液を７５ ℃で３分間加熱した後、３０℃まで少なくとも３０分間にわたって徐々に冷却させた。その溶液は、５Ｕエキソヌクレアーゼマイナスクレノウ酵素（Amersham）、２ｍＵ無機ピロホスファターゼ（Amersham）と、４０μＭ類似体ヌクレオシド三リン酸および／または４μＭｄＮＴＰαＳの添加によって２倍に希釈された。ｄＮＴＰαＳの選択は、鋳型配列に依った。反応を３７℃で３０分間インキュベートした後、ホルムアミド停止液の添加によって停止させた。反応生成物は、１９％ポリアクリルアミド７Ｍ尿素ゲル上で分離され、そしてバイオマクス（Biomax ）オートラジオグラフィーフィルムまたはリン光スクリーン（Storm リン光映像装置，Molecular Dynamics）への暴露後に、³³Ｐで標識された８〜３２塩基オリゴヌクレオチドラダーとの比較によって寸法分けされた。単一塩基伸長は、鋳型配列および塩基の同一性によって、天然塩基の三リン酸で予想された通りに見られた。２種類の異なった天然塩基の三リン酸の付加は、生成物寸法の予想された増加を生じ、そして完全伸長は、４種類全部の塩基の存在下で得られた。同様に、鎖伸長は、類似体三リン酸全部で見られたが、いったん包含されると、単独でも天然塩基の存在下でも、全てが追加伸長を支持できるわけではなかった。１回の付加後、５−ニトロインドールおよび３−ニトロピロールは、どの鋳型でも更に伸長することができなかったし、そしてホルムアミドインドールは、アデニンとして包含された場合にのみ極めて不十分に伸長した。最も容易に包含された類似体は、ピロールモノカルボキサミドおよびピロールジカルボキサミドであった。両方とも、付加後の追加伸長、ＡおよびＴとして包含後のモノカルボキサミド、ＡおよびＣとして包含後のジカルボキサミドを可能にした。結果を下記の表で要約する。塩基類似体包含された場所伸長する場合の包含場所５−ニトロインドールＡ／Ｃ／Ｇ／Ｔ「ターミネーター」５−アミノインドールＹ＞Ｇ／Ｃ＞ＡＴ／Ｇ／Ｃ** ５−ホルムアミドインドールＡ／Ｃ／Ｇ／ＴＡ* ３−ニトロピロールＡ／Ｃ／Ｇ／Ｔ「ターミネーター」ピロールモノカルボキサミドＡ／Ｔ／Ｇ／ＣＡ／Ｔ*** ピロールジカルボキサミドＡ＞Ｃ／Ｔ／ＧＡ／Ｃ**** (*****極めて良好；*極めて不十分）ＤＮＡ中へのピロールモノ−およびジカルボキサミドヌクレオシド三リン酸のＴａｑポリメラーゼ包含Ｔａｑポリメラーゼがピロールモノカルボキサミド三リン酸（ｄＭＴＰ）およびピロールジカルボキサミド三リン酸（ｄＤＴＰ）を包含しうるかどうかを確認するために、プライマー伸長検定を行った。プライマー（配列：5'ACA GGA AAC AGC TAT GAC CA 3'）を、５’末端に³³Ｐで標識し、そして合成鋳型（5'CTA GTG GTC ATA GCT GTT TCC TGT 3'）に対してアニーリングした。１０ｘＴａｑポリメラーゼ緩衝液（５００ｍＭＫＣｌ，１００ｍＭトリス室温でｐＨ９，１％トリトン−Ｘ１００，１５０ｍＭＭｇＣｌ₂）１０マイクロリットルを含有する１８マイクロリットルの容量中において、１２ピコモルの標識プライマーを６０ピコモルの鋳型に対して、９６℃まで３分間加熱した後、室温まで約２０分間にわたって冷却することによってアニーリングした。２マイクロリットルのＴａｑポリメラーゼ（５単位／マイクロリットル）を加え、そして一連の反応を、このプライマー／鋳型／酵素配合物２マイクロリットルを含有して組み立て、ｄＭＴＰまたはｄＤＴＰおよび０〜４種類の標準ｄＮＴＰの５００ｐＭまたは２ｍＭ原液１マイクロリットル（それぞれの最終濃度：５０μＭ）および水で最大１０マイクロリットルまでにした。各１０マイクロリットル反応をパラフィン油で覆った後、７２℃で１分間インキュベートした。停止液（９５％ホルムアミド，２０ｍＭＥＤＴＡ，０．０５％ブロモフエノールブルー，０．０５％キシレンシアノールＦＦ）６マイクロリットルを加え、その反応を７０℃まで１０分間加熱した後、０．４ｍｍ厚さの１２％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲル上に載せ、そして３５ワットで１５０分間流した。ゲルを１０％メタノール／１２％酢酸中で１５分間固定した後、濾紙上で乾燥させ、そしてオートラジオグラフィーフィルムに暴露させた。結果を次の表で示す。塩基類似体包含された場所伸長する場合の包含場所ピロールジカルボキサミドＡおよびＣＡおよびＣピロールモノカルボキサミドＡ、ＴおよびＣＡおよびＴ実施例１１ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いるオリゴヌクレオチドテーリングターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによって基質として許容される類似体三リン酸の能力を調べるために、オリゴヌクレオチドテーリング（tailing）反応を行った。１５マープライマー（配列：5'TGC ATG TGC TGG AGA 3'）および８〜３２塩基オリゴヌクレオチドマーカーを、[γ³³Ｐ]ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで５’末端に標識した。標識した後、反応を５分間沸騰させて、ＰＮＫ活性を全て除去した。４ピコモルの標識プライマー、２５Ｕターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）および３２μＭｄＮＴＰまたは類似体三リン酸を、２５μｌの１００ｍＭカコジル酸緩衝液ｐＨ７．２、２ｍＭＣｏＣｌ₂および０．２ｍＭ２−メルカプトエタノール中において３７℃で９０分間インキュベートした。その反応を、ホルムアミド停止液の添加によって停止させ、そして反応生成物を、１９％ポリアクリルアミド７Ｍ尿素ゲル上において標識マーカーと一緒に流した。バイオマクスフィルムを用いるオートラジオグラフィーを、乾燥ゲル上で行った。結果は、ピロール−３，４−ジカルボキサミド三リン酸がＴｄＴの優れた基質であることを示し、テーリング生成物はｄＡＴＰ対照より高い分子量で流れた。他の類似体三リン酸は、ピロール−３，４−ジカルボキサミド三リン酸またはｄＡＴＰのような長い反応生成物を生じなかったが、基質としても働き、生成物寸法順序は、ピロール−３−モノカルボキサミド、３−ニトロピロール、５−アミノインドール、そして最後に５−ニトロインドールであった。ニトロインドール生成物の大部分は、多くのニトロピロールの場合と同様に、試料中に残ったが、これは、これらの場合に生じたテイルの凝集を引き起こす疎水性の性状によると考えられる。実施例１２ニトロインドールに対する抗体によるＤＮＡの検出ニトロインドールを含有するＤＮＡが検出されるように、ニトロインドールに対して抗体を生じさせた。ニトロインドールをタンパク質担体に対して結合するために、リンカーおよび官能基を１位（ヌクレオシドの場合、通常は糖で占有されている）に加える必要があった。１−（４−カルボキシブチル）−５−ニトロインドールの合成１−（４−メトキシカルボニルブチル）−５−ニトロインドール（１）５−ニトロインドール（０．３２４ｇ，２．０ミリモル）の無水アセトニトリル（１０ｍｌ）中撹拌溶液に対して、水素化ナトリウム（０．０５７ｇ，２．３８ミリモル）を加えた。得られた赤褐色溶液を４５分間撹拌した後、メチル−５ −ブロモバレレート（０．４２９ｇ，２．２ミリモル）の無水アセトニトリル（１ｍｌ）中溶液を加えた。その溶液を２１時間撹拌し、その間に固体が沈澱した。クロロホルム：エタノール（９９：１）中の薄層クロマトグラフィーによる分析は、２時間後に２種類の成分を示した（出発物質：Ｒｆ＝０．５，１−（４− メトキシカルボニルブチル）５−ニトロインドール：Ｒｆ＝０．８）。更に、２１時間後の分析は、その反応がほとんど完了したことを示した。反応混合物を酢酸エチル（２０ｍｌ）およびモルＨＣｌ（２０ｍｌ）中に注ぎ、そして相が分離した。水性相を酢酸エチル（２０ｍｌ）で抽出し、そして合わせた有機層をモル重炭酸ナトリウム溶液で洗浄した。酢酸エチル溶液を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、そしてロータリーエバポレーターで蒸発させて、黄色油状物（０．５ｇ，１．８１ミリモル，９１％）を与えた。１−（４−カルボキシブチル）−５−ニトロインドール（２）１−（４−メトキシカルボニルブチル）５−ニトロインドール（０．５ｇ）に対して、モル水酸化ナトリウム（１０ｍｌ）を加え、そしてその溶液を油浴中において１２０℃で９０分間撹拌した。次に、それを冷却し、水（１０ｍｌ）を加え、そしてその溶液を酢酸エチル（２ｘ１５ｍｌ）で抽出した。合わせた有機抽出物を水（２ｘ１０ｍｌ）で洗浄し、そして合わせた水性抽出物をモルＨＣｌで酸性にし、そして酢酸エチル（３ｘ１５ｍｌ）で抽出した。その有機抽出物を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、そしてロータリーエバポレーターで蒸発させて、黄色ガムを与えた。そのガムを熱クロロホルム中に溶解させた後、ヘキサン（２ｍｌ）を加え、そしてその溶液を氷上で冷却し、この時に黄色結晶を分離した。これらを濾去し、そしてクロロホルム：ヘキサン（５０：５０）で、続いてヘキサンで洗浄した。その結晶を真空中で乾燥させた（０．４２３ｇ，１．６１ミリモル，８１％），ＭＰ１４１〜２℃。シリカ上においてトルエン：メタノール：酢酸（９０：１６：８）中の薄層クロマトグラフィーは、紫外線下で見た場合に１個の黄色スポットを与えた。質量スペクトルおよびＮＭＲ分析は予想通りであった。１−（４−カルボキシブチル）５−ニトロインドールＫＬＨ結合体の製造１−（４−カルボキシブチル）５−ニトロインドール（１９．５ｍｇ，０．０７５ミリモル）に対して、無水ジメチルホルムアミド（０．５ｍｌ）に続いてＮ −ヒドロキシスクシンイミド（１１．５ｍｇ，０．１ミリモル）および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（２９ｍｇ，０．１５ミリモル）を加えた。これを、窒素下において室温で９０分間撹拌した。出発物質に対するシリカ上においてトルエン：メタノール：酢酸（９０：１６：８）およびクロロホルム：メタノール（９８：２）中の薄層クロマトグラフィーによる分析は、紫外線下で見た場合に「活性エステル」の生成を確証した。スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）（４５ｍｇ，０．６１ｍｌ）を、水（２．２５ｍｌ）およびピリジン（０．２５ｍｌ）が入っているフラスコに加えた。「活性エステル」を上の溶液に対して５分間にわたって撹拌しながら滴加した後、その溶液を窒素下において室温で４時間撹拌し、その間に若干の綿毛状黄色固体が分離した。その混合物を透析袋に移し、そして水に対して２晩の間透析した。若干の淡黄色固体を含有する得られた混合物をフラスコに移し、そして一晩中凍結乾燥させて、６０ｍｇの最終生成物を与えた。この材料を、抗血清生産のためにPolyclonal Antibodies Ltd に委ねた。抗血清生産３頭のヒツジをＫＬＨ結合体で免疫感作した。一次免疫感作は、フロイント完全アジュバント中で配合された結合体を用いて行われた。引続きの再免疫感作は、フロイント不完全アジュバント中で配合された結合体を用いて４週間間隔で行われた。それぞれの再免疫感作から２週間後に血液試料を採取し、そして血清を調製した。抗血清試験抗血清は、西洋ワサビペルオキシダーゼに対して結合した二次抗体を検出用のＥＣＬ基質と一緒に用いて、ナイロン膜上のニトロインドール標識オリゴヌクレオチドのドットブロットに対して調べられた。それぞれの被験動物から得られたプレ免疫血清の反応を、１回目および２回目の採血から得られた血清と比較した。水で希釈された10、５、１、０．５、０．１、０．０５および０．０１ピコモルのニトロインドール標識オリゴヌクレオチド（配列：5'NNN TTC AGC GG 3'，但し、Ｎ＝５−ニトロインドール）を含有する１マイクロリットルアリコートを、ハイボンド（Hybond）Ｎ＋膜上に点在させた。水で希釈された対照オリゴヌクレオチド（配列：5'TGC TGG AGA 3'）の１マイクロリットルアリコートも適用した。この方法で製造されたブロットを８０℃で９０分間焼いてＤＮＡを固定した。焼付けした後、プレ免疫血清の１：１０００希釈の１マイクロリットルアリコートをそれぞれのブロット上に点在させて、正対照を与えた。ブロットを、１０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で１：１０に希釈されたリキッド・ブロック（Liquid Block）（Amersham）中で振とうしながら室温で６０分間インキュベートした。次に、個々のブロットを、ＰＢＳ中０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液中の各血清試料の１：１０００、１：１００００または１：５００００希釈中において振とうしながら６０分間インキュベートした。次に、それらを、０．３％トゥイーン２０含有ＰＢＳ中で振とうしながら各１０分間の洗浄で３回洗浄した。次に、ブロットを、ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡ中で１：２５０００に希釈された、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したアフィニティー精製されたロハバ抗ヒツジＩｇＧ，Ｈ＋Ｌ（Jackson Immuno Research Labs Inc）中において振とうしながら６０分間インキュベートした後、０．３％トゥイーン２０含有ＰＢＳ中で振とうしながら各１０分間の洗浄で３回洗浄した。次に、それらをＥＣＬ検出試薬（Amersham）中で１〜２分間インキュベートした後、バイオマクスフィルム（Amersham）に対して２分間および５分間暴露した。正シグナルは、３頭全部のヒツジの免疫感作後に得られた抗血清から全部の希釈で見られたが、プレ免疫血清は負の反応を与えた。０．１ピコモルのニトロインドール標識オリゴヌクレオチドの最大感受性は、１：１０００抗血清希釈で得られた。未標識オリゴヌクレオチドからのシグナルはなかったが、正対照から強いシグナルが得られた。この実験は、ヌクレオチド類似体でテーリングされたまたは他の方法で標識されたオリゴヌクレオチドプローブまたは他のプローブを検出するまたは捕捉する可能性を示した。実施例１３ピロール類似体ピロール−２，３−ジカルボキサミドのデオキシリボシドは、既知の化合物である。その塩基は、フマル酸ジメチルから出発する種々の経路によって製造されてきた。トシルメチルイソシアネート（Tosmic）との反応は、ピロールジメチルエステルを与える。エステル基１個の還元は、シグナル基の結合のリンカーとして作用しうるアルコール機能を与える。ヌクレオシドは標準法によって製造され、そして濃アンモニア水での処理によってエステルがアミドに変換される。所望の遊離ヌクレオシドが製造されたら、ホスホルアミダイト、Ｈ−ホスホン酸および三リン酸誘導体は、標準法によって合成することができる。実施例１４インドール／インダゾール誘導体Ｉインドール／インダゾール塩基類似体から出発すると、所望のヒドロキシメチル基をマンニッヒ型反応によってＣ−３上に導入できる。次に、この塩基は、確立された手順を用いてヌクレオシド／ヌクレオチド誘導体に変換できる。或いは、同じ種類の一般的な反応により、ジメチルアミノメチル基をＣ−３上に導入できる。これは、第四アンモニウム塩を与えるヨウ化メチルとの反応後に、トリメチルアミンを炭素または窒素または酸素求核基で置き換えて、リポーター基を結合しうるＣ−３位により長い鎖を導入することができるという利点を有する。実施例１５インドール／インダゾール誘導体II Ｒが水素である必要がありうるが、適当に保護されたデオキシリボースモエティでありうるインドール／インダゾールから出発すると、ラジカル臭素化は、Ｎ −ブロモスクシンイミドを用いてＣ−３位で起こりうる。次に、これをヘック（ Heck）または関連反応で用いて、リポーター基を結合しうる示されたアリルアルコール誘導体などの種々のリンカー基をＣ−３に対して導入することができる。オレフィン結合は、還元される必要がありうる。しかなしがら、Ｒ⁵がニトロ基である場合、これも還元されるであろう。ニトロ基は、必要ならば、還元後に導入されうる。所望の遊離ヌクレオシドが製造されたら、ホスホルアミダイト、Ｈ −ホスホン酸および三リン酸誘導体は、標準法によって合成することができる。（ａ）パラホルムアルデヒド／ＫＯＨ。（ｂ）ＨＣＨＯ／ＨＮＭｅ₂。（ｃ）ＭｅＩ。（ｄ）ＮａＯＨ。（ａ）Ｎ−ブロモスクシンイミド。（ｂ）Ｐｄ⁰，ＣＨ₂＝ＣＨＣＨ₂ＯＲ。（ｃ）［Ｈ］。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ハミルトン，アランイギリス国エイチピー６・６エスエイチ, バッキンガムシャー，アマーシャム，リトル・チャルフォント，チャーチ・グローブ 15，アシュダウン (72)発明者ロークス，デービッドイギリス国エスジー６・３エイチエス，ハートフォードシャー，レッチワース，ガーノン・ロード 51 (72)発明者シモンズ，エイドリアンイギリス国エイチピー６・５エルイー，バッキンガムシャー，アマーシャム，ザ・フェニングス 12 (72)発明者スミス，クリフォードイギリス国エイチピー23・５ピージー，ハートフォードシャー，トリング，ハンターズ・クローズ 27

Claims

【特許請求の範囲】１．式（式中、Ｚは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＳＯ、ＮＲ⁹またはＣＨ₂であり、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³およびＲ⁴は、同じであるかまたは異なり、そしてそれぞれ、Ｈ、ＯＨ、Ｆ、ＮＨ₂、Ｎ₃、Ｏ−ヒドロカルビルまたはリポーターモエティであり、Ｒ⁵は、ＯＨまたは一、二若しくは三リン酸若しくは−チオリン酸、または対応するボラノリン酸であり、或いは、Ｒ²およびＲ⁵の一方は、ホスホルアミダイト、またはポリヌクレオチド鎖中に包含するための他の基であり、そしてＭは、であり、ここにおいて、Ｘ¹、Ｘ²およびＸ³は、同じであるかまたは異なり、そしてそれぞれ、ＣまたはＮであり、Ｘ³がＮである場合、基Ｒ⁷は存在せず、Ｒ⁶およびＲ⁷は、同じであるかまたは異なり、そしてそれぞれ、Ｈ、ＮＯ₂、ＣＯ、ＣＯＲ⁸、ＯＲ⁸、ＣＮ、Ｏ、ＣＯＮ（Ｒ⁸）₂、ＣＯＯＲ⁸、ＳＯ₂Ｒ⁸、ＳＯ₃Ｒ⁸、ＳＲ⁸、ＮＨＣＨＯ、（ＣＨ₂）_nＮ（Ｒ⁸）₂、ハロゲンまたはリポーターモエティであり、Ｒ⁸およびＲ⁹はそれぞれ、Ｈまたはヒドロカルビルまたはリポーターモエティであり、そしてｎは、０、１、２、３または４である）を有するヌクレオシド類似体であって、但し、Ｒ⁵が三リン酸でない場合、そのヌクレオシド類似体はリポーターモエティを含むことを条件とする上記ヌクレオシド類似体。２．Ｍがリポーターモエティを含有する請求項１に記載のヌクレオシド類似体。３．Ｒ⁵が三リン酸である請求項１または請求項２に記載のヌクレオシド類似体。４．Ｒ²およびＲ⁵の一方が、ホスホルアミダイトまたはＨ−ホスホン酸である請求項１または請求項２に記載のヌクレオシド類似体。５．Ｘ¹およびＸ³がＣであり、Ｘ²がＮであり、そしてＺが０である請求項１〜４のいずれか１項に記載のヌクレオシド類似体。６．リポーターモエティが、シグナルモエティおよびリンカー基を含む請求項１〜５のいずれか１項に記載のヌクレオシド類似体。７．請求項１〜６のいずれか１項に記載のヌクレオシド類似体の少なくとも１個の残基を含有するポリヌクレオチド鎖。８．シグナルモエティが、包含されたヌクレオシド類似体残基中に導入された請求項７に記載のポリヌクレオチド鎖。９．ポリヌクレオチド鎖と、請求項１〜６のいずれか１項に記載のヌクレオシド三リン酸類似体とを、ポリメラーゼの存在下で反応させることを含む鎖伸長法。１０．ポリヌクレオチド鎖と、請求項１〜６のいずれか１項に記載のヌクレオシド三リン酸類似体とを、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの存在下で反応させることを含む鎖伸長法。１１．式（式中、Ｚは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＳＯ、ＮＲ⁹またはＣＨ₂であり、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³およびＲ⁴は、同じであるかまたは異なり、そしてそれぞれ、Ｈ、ＯＨ、Ｆ、ＮＨ₂、Ｎ₃、Ｏ−ヒドロカルビルまたはリポーターモエティであり、Ｒ⁵は、ＯＨまたは一、二若しくは三リン酸若しくは−チオリン酸、または対応するボラノリン酸であり、或いは、Ｒ²およびＲ⁵の一方は、ホスホルアミダイト、またはポリヌクレオチド鎖中に包含するための他の基であり、そしてＭは、であり、ここにおいて、Ｘ¹、Ｘ²およびＸ³は、同じであるかまたは異なり、そしてそれぞれ、ＣまたはＮであり、Ｘ³がＮである場合、基Ｒ⁷は存在せず、Ｒ⁶およびＲ⁷は、同じであるかまたは異なり、そしてそれぞれ、Ｈ、ＮＯ₂、ＣＯ、ＣＯＲ⁸、ＯＲ⁸、ＣＮ、Ｏ、ＣＯＮ（Ｒ⁸）₂、ＣＯＯＲ⁸、ＳＯ₂Ｒ⁸、ＳＯ₃Ｒ⁸、ＳＲ⁸、ＮＨＣＨＯ、（ＣＨ₂）_nＮ（Ｒ⁸）₂、ハロゲンまたはリポーターモエティであり、Ｒ⁸およびＲ⁹はそれぞれ、Ｈまたはヒドロカルビルまたはリポーターモエティであり、そしてｎは、０、１、２、３または４である）を有するヌクレオシド類似体の残基を含有する核酸を検出する方法であって、Ｍに対して結合する抗体の検出に用いることを含む上記方法。１２．１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−ピロール−３−カルボキサミド。１３．１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−ピロール−３，４ −ジカルボキサミド。１４．［１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−ピロール−３− カルボキサミド］５’−三リン酸。１３．［１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−ピロール−３，４−ジカルボキサミド］５’−三リン酸。