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JP2000503764A - Use of RC-9 in the diagnosis and treatment of proliferative artery disease - Google Patents

Use of RC-9 in the diagnosis and treatment of proliferative artery disease

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JP2000503764A
JP2000503764A JP09522889A JP52288996A JP2000503764A JP 2000503764 A JP2000503764 A JP 2000503764A JP 09522889 A JP09522889 A JP 09522889A JP 52288996 A JP52288996 A JP 52288996A JP 2000503764 A JP2000503764 A JP 2000503764A
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オールスタイン，エリオット・ハワード
アーレス，アンソニー・ジョゼフ
オーティーリ，マイケル・ビクター
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Original Assignee
SmithKline Beecham Corp
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、アテローム性動脈硬化症の診断および治療において、ポリヌクレオチド配列、それによりコードされる組換えＲＣ−９タンパク質、およびＲＣ−９抗体を用いる方法を提供する。   (57) [Summary] The present invention provides polynucleotide sequences, recombinant RC-9 proteins encoded thereby, and methods of using the RC-9 antibodies in the diagnosis and treatment of atherosclerosis.

Description

【発明の詳細な説明】 増殖性動脈疾患の診断および治療におけるＲＣ−９の使用発明の分野 本出願は概して冠動脈疾患に関与するタンパク質に関する。発明の背景 進行した多血管性冠動脈疾患の治療として経皮経管冠動脈拡張術（ＰＴＣＡ） を行うことは、過去１０年間で指数的に増加している。しかしながら、この拡張 術の長期的な効果は、この拡張術を施した患者の４０％ほどに観察される、血管 再狭窄が高率で発生することで有意に限定される（Ｐ.Ｌibby ら、Ｃirculation ，86（増補III） :47-52（1992））。この手術に関連して結果的に生じる新内膜 形成は、幾つかの異なる細胞型と活発に関与し、幾つかの相にて生じる動的な過 程である（Ａ.Ｎ.Ｃlowes ら、Ｌab.Invest.49:208-215（1983））。最初の応答 は、本質は、局所的な炎症反応に発展する可能性のある、多くの異なるサイトカ インおよび成長因子を分泌するＴ−リンパ球およびマクロファージが関与する１ 次炎症である。第２期は再狭窄病変の主要細胞成分、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ ）が関与し、この反応ではこれらの因子は内膜に移動し、可溶性の成長および化 学走性因子を分泌し、増殖する(Ｌibbyら、前掲(1992);Ｃlowesら、前掲(1983);Ｒ .Ｒoss、Ｎature362:801-809（1993）；およびＥ.Ｒ.Ｏ'Ｂrien ら、Ｃirc.Ｒes. 73:223-231（1993））。これらの活性化ＶＳＭＣはまた細胞外マトリックスをも 分泌する。第３期は損傷後の最後の数週間であり、慢性的な繊維増殖性病変形成 を特徴とする（Ｒoss、前掲（1993））。バルーン血管形成に対する細胞応答は かなりよく特徴づけされているが、ＰＴＣＡに伴う新内膜形成を妨げる効果的な 抗再狭窄の薬理学的な補助的手段は未だない。 同種異型移植片阻害因子（ＡＩＦ）は同種異型移植片拒絶の診断および治療に 有用であると記載されている。ラットおよびヒトＡＩＦの配列は１９９５年６月 ２９日発行のＷＯ９５／１７５０６に記されている。 当該分野において必要とされるのは、かかる新内膜形成を妨げる方法、ならび に これらを診断およびモニター観察するより好ましい方法である。発明の要旨 本発明は自然に結合している他の細胞性物質から単離された、ＲＣ−９のポリ ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の新規な用途を提供する。また、これらの配列 を含有するベクター、組換え法により製造したＲＣ−９タンパク質および抗ＲＣ −９抗体の新規な用途も提供する。 従って、第１の態様において、本発明は増殖性動脈疾患および血管再狭窄の診 断方法を提供する。これらの方法は、本明細書に記載するＲＣ−９の核酸および アミノ酸配列および抗ＲＣ−９抗体を利用する。 さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載するＲＣ−９核酸配列、タ ンパク質および抗体を用いて、アゴニストおよびアンタゴニストを含む、選択さ れたＲＣ−９配列に特異的に結合する化合物を同定する方法を提供する。なおさ らなる態様において、本発明は前記の方法を用いて製造した化合物または薬物を 提供する。 さらに別の態様において、本発明は増殖性動脈疾患および血管再狭窄の治療方 法を提供する。これらの方法では、本明細書に記載する化合物または薬物、ＲＣ −９の核酸およびアミノ酸配列、および好ましくは抗ＲＣ−９抗体を利用する。 本発明の他の態様および利点は、以下のこれらの好ましい具体例の詳細な記載 においてさらに記載する。図面の簡単な説明 図１は、デイフェレンシャル・ディスプレイ（differential display）により 得られたクローンＲＣ９のＤＮＡ部分配列[配列番号：１]を示す。この配列はジ ーンバンク受入番号Ｕ１０８９４が付与されている。 図２は、ＲＣ−９のゲノムＤＮＡ配列[配列番号：２]を示す。この配列はジー ンバンク受入番号Ｕ３３４７１が付与されている。 図３は、ラットＲＣ−９のｃＤＮＡ[配列番号：３]および推定アミノ酸配列[ 配列番号：４]を図示する。 図４は、ヒトＲＣ−９のｃＤＮＡ[配列番号：５]およびアミノ酸配列[配列番 号：６]を図示する。発明の詳細な記載 本発明は増殖性動脈疾患および血管再狭窄の検出および治療における、ＲＣ− ９と称する遺伝子、およびコードされるタンパク質の新規な用途を提供する。本 明細書で提供するヌクレオチドおよびアミノ酸配列ならびに抗体はかかる血管性 疾患および損傷の診断およびモニター観察に有用である。これらの配列および抗 体はさらに、アテローム性動脈硬化症および血管再狭窄に特徴づけられる他の症 状の治療に有用な化合物の製造にも有用である。 広範な動物種に由来するＤＮＡとのＲＣ−９ＤＮＡクロスハイブリッド形成の 観察により、ＲＣ−９にコードされるタンパク質に関して、実質的な進化上の保 存および重要な生物学的機能の可能性が示唆される。バルーン血管形成で損傷し たラット頚動脈におけるＲＣ−９ ｍＲＮＡの一時的発現は、そのタンパク質産 生物が血管再狭窄の初期ないし中間の段階に役割を果たすことを示している。Ｉ．ＲＣ−９ポリヌクレオチド配列 本発明の方法は本明細書に記載するＲＣ−９ポリヌクレオチド配列を利用でき る。図１−４は本発明の新規な転写物のＤＮＡ配列を示す。図１は以下の実施例 １に記載するように得られたクローンＲＣ−９のヌクレオチド配列[配列番号： １]示す。この部分配列は４２４塩基の長さであり、プローブとして用い、図２ のより長い配列を得た。図２は、２個のイントロンを有する、ＲＣ−９のゲノム ＤＮＡ配列[配列番号：２]を示す。イントロン１は塩基対１２１−７７２にわた り、イントロン２は塩基対１０００−１２７６にわたる。ポリＣトラクトは塩基 対８６４−８７３および１２５４−１２７６に位置する。分岐点コンセンサス配 列は図２の塩基対８５１−８５７および１２１２−１２１８に位置する。図３は ラットＲＣ−９のｃＤＮＡ配列[配列番号：３]を示す。転写開始コドンは図３の 塩基対１４３−１４５に位置し、停止コドンは塩基対５８１−５８３に位置する 。図４はヒトＲＣ−９の６３６塩基対のＤＮＡ配列[配列番号：５]を示す。これ らの配列は４４４塩基対のオープン・リーディング・フレーム（塩基対７２−５ １６）を有し、これは１４７個のアミノ酸タンパク質[配列番号：６]をコードす る。 これらの配列のフラグメントは種々の用途に有用であることが判明している。 望 ましくは、これらの機能的フラグメントは長さが少なくとも約１５個のヌクレオ チドであり、所望のアミノ酸配列、例えばエピトープ、望ましくは、ＲＣ−９様 生物学的活性等により特徴づけられる治療上有用なペプチドをコードする。これ らのＲＣ−９ヌクレオチド配列はポリメラーゼ連鎖反応またはクローニング技術 を慣用的に用いることにより単離できる。別法として、これらの配列は慣用され る遺伝子操作または化学合成技術を用いることにより構築できる。 本発明の方法において用いる場合、ゲノムＲＣ−９ ＤＮＡ配列(図１ 配列番号 ：１および図２配列番号：２)またはコード化ＲＣ−９タンパク質をコードする ｃＤＮＡ配列（図３ 配列番号：３および図４ 配列番号：５）またはその機能的 フラグメントを修飾してもよい。本明細書に記載する配列データを用いて、本発 明に有用なＲＣ−９タンパク質をコードする他のポリヌクレオチド配列を得るこ とは、当業者の範囲内である。核酸レベルでのかかる修飾は、例えばサイレント なまたはアミノ酸配列を変化させる、例えば発現または分泌を改善するためのヌ クレオチド配列に対する修飾を包含する。 さらに別法では、本明細書において有用なポリヌクレオチド配列は、望ましい ならば、容易に評価可能なタグを付加して修飾し、定量化を促進することができ る。例えばインビトロ突然変異誘発およびプライマー修復を包含する既知の技術 により、ヌクレオチドを置換、挿入または欠失することができる。また遺伝暗号 の自然縮退により引き起こされる対立遺伝子変異も包含する。 本明細書に記載するＲＣ−９タンパク質をコードする核酸配列の単離に加え、 アンチセンス配列のごとき例示されているＤＮＡ配列に相補的な配列を含め、他 の核酸配列もまた本発明の範囲内である。高度なまたは中程度のストリンジェン トな条件下で[Ｔ.Ｍaniatis ら、Ｍolecular Ｃloning(Ａ Ｌaboratory Ｍanual )，Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory，387-389（1982）を参照のこと]、図１ −４［配列番号：１、２、３、５］に示すＤＮＡ配列にハイブリダイズするこれ らの配列もまた有用なＤＮＡ配列に包含される。高度にストリンジェントな条件 の例としては、６５℃、４ｘＳＳＣでハイブリダイズし、続いて６５℃で０．１ ｘＳＳＣで１時間洗浄することが挙げられる。別法として、高度にストリンジェ ントな条件の例は５０％ホルム アミド中４２℃で４ｘＳＳＣである。また、中程度に高度なストリンジェントな 条件、例えば５５℃、４ｘＳＳＣでハイブリダイズし、続いて３７℃、０．１ｘ ＳＳＣで１時間洗浄するのもまた有用であることが判明している。また、中程度 に高度なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、５０％ ホルムアミド中３０℃で４ｘＳＳＣが挙げられる。 以下により詳細に記載するように、これらのタンパク質をコードするＲＣ−９ 核酸配列は種々の診断および治療用途に有用である。有利なことに、核酸配列は 、増殖性動脈疾患および血管再狭窄、とりわけ望ましくないＲＣ−９レベルまた は発現に付随する症状の検出および診断に使用するための診断用プローブおよび アンチセンスプローブとして有用である。オリゴヌクレオチドプローブはサザン・ ブロッティングおよびポリメラーゼ連鎖反応のごとき標準的な診断技術において 有用である。 また、ＲＣ−９核酸配列は本発明の方法に有用なＲＣ−９タンパク質を製造す るのに用いることができる。一度構築または単離したこれらのＤＮＡ配列または 適当なフラグメントを用いて本発明のタンパク質をインビトロまたはインビボで 得ることは好ましい。ＩＩ．ＲＣ−９アミノ酸配列 本発明の方法は、本明細書に示すＲＣ−９タンパク質およびその適当な機能的 フラグメントを包含する、ＲＣ−９アミノ酸配列を利用してもよい。ＲＣ−９ラ ットタンパク質[配列番号：４]は図３に示すｃＤＮＡ配列[配列番号：３]により コードされ、ＲＣ−９ヒトタンパク質[配列番号：６]は図４に示すｃＤＮＡ配列[ 配列番号：５]によりコードされる。ラットタンパク質[配列番号：４]は長さが １４７個のアミノ酸であり、分子量が１６８２４．９ダルトンである。ヒトタン パク質もまた長さが１４７個のアミノ酸である[配列番号：６]。ＲＣ−９の生物 学的に活性なフラグメントもまた本発明の方法に有用である。これらの機能的フ ラグメントは長さが少なくとも５個のアミノ酸であるのが望ましく、エピトープ または他の望ましいアミノ酸配列を有していてもよい。 ＲＣ−９タンパク質のアナログまたは修飾体もまた本発明では有用である。典 型的には、かかるアナログはわずか１、２、３または４個のコドンの変化だけが 異な り、ＲＣ−９様の生物学的活性により特徴づけられる。例えば、ＲＣ−９の図示 されたアミノ酸配列（図３および４、配列番号：４および６）から少数のアミノ 酸が変化したポリペプチド；とりわけ保存的アミノ酸置換されたポリペプチドが 挙げられる。保存的置換は側鎖および化学的特性において関連する一連のアミノ 酸内で起こる置換である。加えて、本発明で有用なＲＣ−９タンパク質を修飾し 、例えばその産生を改良するか、タンパク質の安定性もしくは他の特徴、例えば 結合活性もしくは生物学的利用率を増強するか、その用途を競合化合物をスクリ ーニングするのに向上させるか、またはタンパク質に関する他の幾つかの望まし い特性を付与してもよい。 本明細書に記載するＲＣ−９タンパク質およびＲＣ−９タンパク質フラグメン トは以下により詳細に記載する治療用組成物において有用である。本発明の方法 はまた、これらのタンパク質の診断への適用、および抗ＲＣ−９抗体のごとき他 の治療用および診断用試薬を製造するための使用をも包含する。一般に他のタン パク質と同様に、これらのＲＣ−９タンパク質はまたスクリーニングアッセイに おいてまたは研究用手段として供することができる。より望ましくは、ＲＣ−９ タンパク質はまた例えば再狭窄において、ＲＣ−９の作用を妨げるのに有用な化 学的な治療薬のスクリーニングおよび開発にも有用である。ＩＩＩ．ＲＣ−９の組換え発現 本明細書に記載するＤＮＡ配列を用いて組換えＲＣ−９タンパク質を産生する ことができる。得られたタンパク質を本発明の方法において用いてもよく、ある いは本発明の方法がタンパク質のインビボ発現に関与していてもよい。ＲＣ−９ タンパク質を製造するために、ＲＣ−９ ＤＮＡ配列を適当な発現系に挿入して もよい。望ましくは、ＲＣ−９をコードするｃＤＮＡがＲＣ−９タンパク質の発 現を可能とする異種発現調節配列に作動可能に連結している組換え分子またはベ クターを構築する。標準的な分子生物学技術による、哺乳動物（ヒトを包含する ）発現、昆虫例えばバキュロウイルス発現、酵母、真菌、および細菌発現のため の多くの型の適当な発現ベクターおよび宿主細胞系が当業界で公知である。 これらのベクターを適当な宿主細胞に形質転換することにより、選択されたＲ Ｃ −９タンパク質の発現を得ることができる。多くの型が当業界で公知である他の 適当な発現ベクターもまたこの目的で使用できる。 この方法によってトランスフェクトするのに適当な宿主細胞またはセルライン は、スポドプテラ・フルギペデラ[Ｓpodoptera frugipedera（Ｓｆ９）]細胞の ごとき昆虫細胞を包含する。かかる宿主細胞の構築および形質転換方法は周知で ある。[例えばＭillerら、Ｇenetic Ｅngineering，8:277-298（Ｐlenum Ｐress 1986）およびそこに引用される参考文献を参照のこと]。 同様に、ヒト２９３細胞、ラット大動脈セルライン[Ｅ.Ｈ.Ｏhlstein ら、Ｅu r.Ｊ.Ｐharmacol.-Ｍol.Ｐharmacol.Ｓection.225:347-350(1992)]、チャイニー ズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、サルＣＯＳ−１セルラインまたはスイス（ Ｓwiss）、Ｂａｌｂ−ｃまたはＮＩＨマウスに由来するネズミ３Ｔ３細胞のごと き哺乳動物細胞を用いてもよい。適当な哺乳動物宿主細胞および形質転換、培養 、増幅、スクリーニング、製造および精製の方法は当業界で周知である。[例え ばＧething およびＳambrook、Ｎature,293:620-625(1981)または別法として、Ｋa ufinan ら、Ｍol.Ｃell Biol.5(7):1750-1759（1985）もしくはＨowley ら、米国 特許第4419446 号を参照のこと]。別の適当な哺乳動物セルラインはＣＶ−１セ ルラインである。 細菌細胞も同様に宿主細胞として有用である。例えばイー・コリ（Ｅ.coli） の種々の株（例えばＨＢ１０１、ＭＣ１０６１、および以下の実施例で使用する 株）はバイオテクノロジーの分野で宿主細胞として周知である。ビー・サブチリ ス(Ｂ.subtilis)、シュードモナス（Ｐseudomonas）、他の杆菌等の種々の株も またこの方法において使用できる。 当業者に周知の酵母細胞の多くの株もまた本発明の方法に有用なポリペプチド の発現のための宿主細胞として利用できる。他の真菌細胞もまた発現系として用 いることができる。 かくして、本発明は、組み換えＲＣ−９タンパク質の製造方法であって、例え ばトランスフェクションまたはエレクトロポレーションのごとき慣用される手段 により、転写制御配列の調節下でＲＣ−９タンパク質をコードする組換えポリヌ クレオチドを含有する少なくとも１個の発現ベクターで宿主細胞を形質転換する ことから なる方法を提供する。次いで形質転換した宿主細胞をＲＣ−９タンパク質の発現 を可能にする適当な条件下で培養する。例えば、宿主細胞例えばラット大動脈平 滑筋細胞を、該細胞がＲＣ−９タンパク質の過剰発現能を有するのに十分なベク ターでトランスフェクトし、その細胞をＲＣ−９発現を阻害する化合物をスクリ ーニングするのに有用なものとすることができる。別の具体例では、当業者に周 知の適当な手段により、培養培地から（または細胞内に発現した場合、細胞から ）発現したタンパク質を回収し、単離し、精製する。 例えば、タンパク質は細胞溶解した後に可溶性形態で単離してもよく、または 塩化グアニジンで抽出できる。望む場合、本発明のＲＣ−９タンパク質は融合タ ンパク質として製造できる。例えば、選択した宿主細胞においてタンパク質の発 現を増強するか、または精製を改善するために、かかるＲＣ−９融合タンパク質 を製造するのが望ましい。本明細書に記載するＲＣ−９タンパク質に適当な融合 パートナーは当業者に周知であり、とりわけｂ−ガラクトシダーゼおよびポリヒ スチジンを包含する。ＩＶ．抗ＲＣ−９抗体の製造 ＲＣ−９タンパク質、ならびにその修飾体もしくはアナログ、またはそれらを 発現する細胞は、ＲＣ−９に対する抗体を生成するための抗原として有用である 。本発明の方法に有用な抗体はモノクローナル、ポリクローナル、キメラ、一本 鎖およびヒト化抗体、およびＦａｂフラグメントを包含する。これらの抗体は、 ＫohlerおよびＭilsteinのハイブリドーマ技術、Ｈuseら、Ｓcience,246:1275-1 281(1988)に記載されるごとき組み換え技術、または当該分野で公知の任意の他 の変法を含め、常法により製造できる。一本鎖抗体の製造について記載した技術 （米国特許第４９４６７７８号）を適用し、本明細書に記載するＲＣ−９タンパ ク質に対する一本鎖抗体を製造することができる。また、トランスジェニックマ ウス、または哺乳動物のごとき他の生物を用いて、ＲＣ−９タンパク質またはＲ Ｃ−９誘導タンパク質に対するヒト化抗体を発現することができる。本発明の抗 体その物を用いて抗イデオタイプ抗体を生成することができる。かかる抗体を産 生する技術は当業界で周知である。 本発明の抗体はタンパク質の形態で利用できる。また別に、本発明の抗体はイ ンビボで抗体またはその機能的フラグメント（例えば一本鎖またはＦａｂフラグ メント）を発現するポリヌクレオチドの形態で利用できる。Ｖ．診断用試薬 本明細書に記載するＲＣ−９タンパク質、抗体、およびポリヌクレオチド配列（ アンチセンスポリヌクレオチド配列を包含する）をＲＣ−９の産生または過剰産 生に伴う特定の血管性疾患、例えばアテローム性動脈硬化症を診断するための診 断用試薬として用いることができる。例えば、ＲＣ−９タンパク質、抗体、また はポリヌクレオチドはかかる症状に特徴的な血管損傷を診断するのに使用できる 。これらの試薬を、診断または治療法に慣用される放射活性標識、比色酵素標識 系等のごとき診断用標識を用いて標識することもできる。慣用される診断アッセ イ例えばサザン・ブロッティング、ノーザンおよびウェスタン・ブロティング、 ポリメラーゼ連鎖反応等で、選択した哺乳動物組織におけるＲＣ−９レベルを試 薬により測定できる。例えば、ポリヌクレオチド配列を診断用物質として用いて 正常なＲＣ−９ ｍＲＮＡを検出もしくは定量してもよく、または患者のサンプ ル中の標的遺伝子ＲＮＡの突然変異を検出できる。かかる方法では図１−４[配 列番号：１、２、３、５]の核酸配列に相補的なＰＣＲプライマーを利用できる 。また別にハイブリダイゼーション、ＲＮase 保護、化学的開裂、直接的ＤＮＡ 配列決定または制限酵素の使用、例えば制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）および ゲノムＤＮＡのサザン・ブロッテイングのごとき方法により、特異的ＤＮＡ配列 （すなわちＲＣ−９）を検出できる。他の適当なアッセイではＲＣ−９タンパク 質、タンパク質フラグメント、または抗ＲＣ−９抗体を試薬として利用する。こ れらのアッセイはラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタン・ブロ ット分析およびＥＬＩＳＡアッセイを包含する。適当なアッセイ様式および標識 系の選択は当業者の範囲内であり、診断薬の分野における多大な技術に依るさら なる説明がなくても、容易に選択できる。 従って、本発明はアテローム性動脈硬化症のごとき血管再狭窄により特徴づけ られる障害の診断におけるこれらのＲＣ−９タンパク質、抗体またはポリヌクレ オチド試薬の使用方法を提供する。この方法は選択したサンプル例えば血液、血 漿、血 清または他の適当な細胞を選択した試薬、タンパク質、抗体またはＤＮＡ配列と 接触させ、サンプルに対する結合性またはハイブリダイゼーションまたは試薬に 基づいて選択したアッセイ様式でサンプル中に存在するＲＣ−９量を測定し、検 出することからなる。ＶＩ．治療用薬物 本発明はさらに血管再狭窄の治療方法を提供する。さらにとりわけ、この方法 は哺乳動物組織におけるＲＣ−９活性を遮断するための抗ＲＣ−９抗体を投与す ることからなる。ＲＣ−９がその対応する受容体に結合することを遮断するため に使用できる抗イデオタイプ抗体もまた本発明の治療用薬物として有用である。 望ましいわけではないが、治療用薬物はＲＣ−９核酸配列、該核酸配列を含有す るベクターまたはＲＣ−９タンパク質であってもよい。また別に、以下に記載す る方法を用いて得られた薬物は治療用薬物にできる。 一例としては、治療用薬物は医薬用組成物中適当な経路で投与できる。通常、 組成物は活性物質（例えば抗ＲＣ−９抗体、または本明細書に記載するベクター もしくはポリヌクレオチド）を体重ｋｇあたり約１０ｍｇから約１０ｍｇ含有す る。当業者であれば、最適量を適応症、重篤度、投与経路等を考慮して調整でき ることは理解されよう。 適当な医薬用担体は当業者に周知であり、とりわけセイライン、緩衝セイライ ン、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらを組み合わ せたものから容易に選択できる。本発明の医薬用組成物は他の活性成分、または 他の望ましい成分、例えばｐＨ調整物質、保存剤等を含有してもよい。 適当な経路は当業者であれば容易に決定でき、例えば静脈内、筋肉内、皮下、 腹腔内、皮内、経口、経膣、経肛門、鼻腔内、および局所経路を包含する。現在 、好ましい投与方法は静脈内投与である。しかしながら、当業者は別の適当な投 与経路を容易に選択できる。必要または望ましいならば投与を繰り返すことがで きる。ＶＩＩ．薬物スクリーニングおよび開発 本発明はまたアテローム性動脈硬化症および他の血管性障害を治療するための 治療用薬としての有用性を有する化合物またはタンパク質のスクリーニングおよ び開 発において、本明細書に記載するＲＣ−９タンパク質、抗体およびポリヌクレオ チド配列を使用する方法をも提供する。 一例としては、かかる化合物は、ＲＣ−９に結合し、その生物学的活性を亢進 する（アゴニストとして作用）か、または遮断する（アンタゴニストとして作用 ）能力を有する。かかる化合物は前記する血管障害の治療または予防のための薬 物成分として有用であると考えられる。現在、ＲＣ−９の選択された領域と競合 的に結合する能力を有する薬物をスクリーニングおよび開発するための、慣用的 なアッセイおよび技術がある。これらアッセイおよび技術はＲＣ−９タンパク質 またはその一部を発現するためのファージ・ディスプレイ系を使用し、結合可能 な化合物の結合を研究するためのタンパク質を製造するためにトランスフェクト したイー・コリ(Ｅ.coli)または他の微生物の培養物を用いることからなる。例 えばＧ.Ｃesarini、ＦＥＢＳ Ｌetters ，307(1):66-70 （ 1992 年 ６ 月） ； Ｈ.Ｇram ら 、Ｊ.Ｉmmunol.Ｍeth.161:169-176（1993）;Ｃ.Ｓummerら、 Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ,89:3756-3760（1992年５月）を参照されたく、 これは出典明示により本明細書の一部とする。 本発明のこの態様で有用なタンパク質、抗体またはポリヌクレオチド配列を用 いて、他の慣用される薬物スクリーニング技術を実施できる。一例として、ＲＣ −９ＤＮＡ配列に特異的に結合する化合物の同定方法は、簡単には、選択したＲ Ｃ−９ＤＮＡフラグメントを試験化合物と接触させて、試験化合物をＤＮＡグラ グメントに結合させ;ＤＮＡフラグメントに結合する試験化合物があればその量 を測定する工程からなる。かかる方法は試験化合物および固体支持体に固定化し たＲＣ−９ＤＮＡフラグメントをインキュベートすることを包含する。 ＲＣ−９配列に特異的に結合する化合物を同定する別の方法は、固体支持体に 固定化したＲＣ−９ ＤＮＡフラグメントを、試験化合物およびＲＣ−９の受容 体であり、該受容体をＲＣ−９ ＤＮＡフラグメントに結合させるタンパク質配 列の両方と接触させ；ＤＮＡフラグメントに結合する受容体の量を測定する工程 からなっていてもよい。その試験化合物による正常なタンパク質の結合阻害は、 ＲＣ−９に対する試験化合物の結合性を示す。 潜在的アゴニストのＲＣ−９様効果、または潜在的アンタゴニストの効果は、 例えば候補分子の細胞または適当な細胞調製物との相互作用の後のリポーター系 の活性を測定し、ＲＣ−９またはＲＣ−９と同一の効果を惹起させることがわか っている分子の効果と比較することにより決定できる。この点において有用なリ ポーター系は製品に変換した比色標識基質、ＲＣ−９活性の変化に反応するリポ ーター遺伝子、および当業界で周知の結合アッセイを包含するがこれらに限定す るものではない。他の適当な方法は当業者に周知である。 このように、かかる方法を用いることにより、本発明はＲＣ−９またはそれの 一部と相互作用し、望む場合その生物学的活性を増強または低減できる化合物を 提供する。かかる化合物は本発明の範囲内である。 ＲＣ−９のクローニングおよび発現を開示する以下の実施例は単なる例示であ り、何ら本発明を限定することを意図するものではない。実施例１−ＲＣ−９の単離 Ａ．ラット左総動脈バルーン血管形成 以前に記載されるように[Ｅ.Ｈ.Ｏhlsteinら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳ Ａ，90:6189-6193（1993）]、オスＳprague-Ｄawleyラット[３５０ｇ;Ｃharles Ｒiver ＢreedingＬaboratory Ｉnc.，Ｗilmington,ＭＡ]をペントバルビタール ・ナトリウム麻酔[６５ｍｇ／ｋｇ、i.p.−Ｓteris Ｌaboratories,Ｐhoenix,Ａ Ｚ]して、無菌条件下で左総頚動脈バルーン血管形成術を行った。簡単には、左 外部の頚動脈を同定し、付着する組織を取り除き、２−ＦＦogarty動脈塞栓切除 用カテーテル[１２−０６０−２Ｆモデル；Ｂaxter Ｈealthcare，Ｓanta Ａna ，ＣＡ]を挿入した。カテーテルを総頚動脈下方向に大動脈弓まで一定の距離誘 導し、一定容量の流体で膨張させ、挿入部位まで引き戻す。この操作を合計３回 行った。完了後、すぐにカテーテルを除去し、傷を閉じ（９−ｍｍＡutoclips; Ｃlay Ａdams，Ｆranklin Ｌakes，ＮＪ）、Ｐovadyne外科用スクラブ（７．５ ％ポビドン・ヨード−Ｃhaston Ｄayville，ＣＴ）を綿棒で塗る。動物を組織回 収に必要になるまで標準的な実験用飼料および水を自由に摂取できるようにして 、１２時間の明／暗サイクル下でプレキシガラスのケージに収容した。 頚動脈を単離するために、ラットをバルビツレート（１００ｍｇ／ｋｇ、i.p. ） で麻酔し，大静脈を介して瀉血した。その場で左総頚動脈の付着組織を速やかに 除去し、単離し、グアニジン・チオシアネート（Ｐromega Ｃompany,Ｍadison， ＷＩ）中に直接置いた。これらの容器を次いで即座に液体窒素中急速冷凍し、Ｒ ＮＡ単離に必要となるまで−８０℃で保存した。その後のノーザン分析について 、末処理動物からの組織（対照）、および転写物のディファレンシャル発現を、 より詳細には一時的様式で実験するために、６時間、３日、および１４日前に血 管形成を施した動物からの組織を試験した。ノーザン分析をシャム・ベッセル（ sham vessel）でも実施した。Ｂ．ＲＮＡ単離およびノーザン分析 各時点での実験のために、４または５個の左頚動脈をプールさせるか、または 培養物からＶＳＭＣをを単離し、全ＲＮＡを記載されるように入手した[Ｐ.Ｃhom czynskiおよびＮ.Ｓacchi、Ａnn.Ｂiochem.162:156-159（1987）]。等量のＲＮ Ａを装填し、１．３％アガロース／ホルムアルデヒド・ゲルで分離し、ニトロセ ルロースに移し、指示したプローブでハイブリダイゼーションした(０．２５Ｍ ＮａＣｌ、１％ ドデシル硫酸ナトリウム、５０％ホルムアミド、２Ｘデンハー ト溶液、２５ｍｇ変性サケ精子ＤＮＡ、５％硫酸デキストラン、４２℃で一晩) 。ブロットを高度にストリンジェントな条件下で洗浄し（０．１％クエン酸ナト リウム、０．１％ ドデシル硫酸ナトリウム、６５℃）、フィルムに−８０℃で ６−４８時間曝露した。全プローブをランダム・プライミング法により[ａ32Ｐ] −標識した（Ｂoehringer Ｍannheim，Ｉndianapolis In.）（全アイソトープは Ａmersham Inc.，Ａrhngton Ｈeights ＩＬ.より入手）。同一のフィルターを取 り除き、続いて種々のＤＮＡプローブでハイブリダイゼーションした。グリセロ アルデヒド−３−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）プローブをＰ ＣＲ増幅物から生じた（Ｃlontech,Ｐalo Ａlto,ＣＡ.）。ハイブリダイゼーシ ョン・シグナルの相対的強度は、フィルムの直線的変動内で曝露したオートラジ オグラムのデンシオメトリック・スキャニング（ＲＦＬＰ-Ｓcan Ｓoftware，Ｓ canalytics,Ｉnc.)により得た。ヒトおよび多組織ノーザンブロットをＣlontech ,Ｉnc．(Ｐalo Ａlto,ＣＡ.)より購入した。Ｃ．ｍＲＮＡのディフェレンシャル・ディスプレイ 対照左総頚動脈および先にバルーン血管形成を３および１４日前に行った左総 頚動脈の全ＲＮＡを単離し、ディフェレンシャル・ディスプレイ技術を用いて遺 伝子発現の変化を試験した。製造者プロトコルに準じて、ＤＮＡ消化、（１ＵＤ Ｎase；Ｇibo-ＢＲＬ，Ｇaithersberg,ＭＤ)，フェノール／クロロホルム抽出、 およびエタノール沈殿の一連の方法を用いて全ＲＮＡからＤＮＡを除去した。精 製した全ＲＮＡ（０２ｍｇ）を修飾したオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写し た（逆転写酵素はＧenＨunter Ｃorporation,Ｂrooklin,ＭＡより入手）[Ｐ.Ｌi angら、Ｓcience,257:967-971（1992）]。ｃＤＮＡを増幅し、適当な３’オリゴ ｄＴプライマー、ｄＮＴＰ、[35Ｓ]ｄＡＴＰ、および任意の１０量体５’プライ マー（ＧenＨunter）との１０％逆転写反応物を包含することにより標識した。 以下のパラメーターでＰＣＲサイクルを４０回実施した：９４℃で３０秒；４０ ℃で１２０秒；７２℃で４５秒で最後のサイクルの後、７２℃で７分浸す。反応 物から得た標識ｃＤＮＡを６％アクリルアミド・配列決定用ゲルで分離し、乾燥 し、オートラジオグラフ用フイルムに１２−４８時間曝露した。 ３日目の容器中の遺伝子発現は損傷形成の病因の初期の分子学的様相を示して おり（すなわち、これらは新内膜損傷の物理学的形成の前に起こる）、一方１４ 日目の容器は後期の様相を示している(すなわち、最終損傷容量の約８０％は新 内膜内で形成される)[Ｓ.Ａ.Ｄouglasら、Ｅur.Ｊ.Ｐharmacol.255:81-89（1994 ）]。 この実験では、これらのサンプルからのＲＮＡは４個のオリゴｄＴアンカープ ライマー全てを用いて逆転写し、得られたｃＤＮＡを２個の異なる５’十量体を 用いて増幅した。最初配列決定用ゲルの上部の３個のバンドに注意を払う、とい うのはこれらのサンプルは長く、従ってＤＮＡ配列の同定を容易にするからであ る。配列決定用ゲルの上部の３個に注目して、バンドの１０％以下は分別的に発 現していると思われた（８２個中８個）。この最初の実験では、分別発現を表示 する２個のバンドを選別した。 Ｄ．ｃＤＮＡの回収再増幅およびクローニング 選別したｃＤＮＡを配列決定用ゲルから削り取り、溶出し、前記したのと同一 のプライマーを用いて再増幅した[Ｌiang ら、前記で引用]。再増幅したＰＣＲ 産生物 を２．０％アガロース・ゲル上で、臭化エチジウムで染色して可視化し、ガラス 抽出（Ｂio 101，Ｌa Ｊona,ＣＡ）により回収した。再増幅したＰＣＲ産生物を 前記したプローブのように標識し、Ｉnvitorogen ＴＡクローニング系（Ｓan Ｄ iego,ＣＡ)を用いてｐＣＲＩＩベクターにクローニングし、応用バイオシステム モデル３７３Ａ自動配列決定装置で配列決定した。 ＤＮＡセグメントをアクリルアミド配列決定用ゲルから削り取って回収し、溶 出し、同一のプライマーおよび反応条件を用いてＰＣＲ増幅した。再増幅により 単一の産生物を得、その大きさはアクリルアミド配列決定用ゲルに表示される見 かけの大きさと合致する（データは示していない）。これらの再増幅物を次いで ゲルからガラス精製し、ノーザン分析用のプローブとして使用した。 試験したラット組織のうち２個だけがＲＣ９転写物を発現した。精巣ＲＮＡは 約１．３５ｋｂの強いシグナルを示し、頚動脈で観察された１．１ｋｂよりわず かに大きかった。２番目に、約１．１ｋｂのより弱いシグナルが脾臓で観察され た。どのｃＤＮＡを選別すべきかという情報に加えて、このデータはこの転写物 の発現が組織特異的であり、精巣から脾臓までの大きさの差異は、このｍＲＮＡ 転写物のプロセッシングまたは異なる組織の類似するメッセージの存在を示唆す ることを示している。 未処理ラット頚動脈およびバルーン血管形成後３時点で単離した頚動脈からの 全ＲＮＡを、ノーザン分析においてこれらのＤＮＡフラグメントでプロービング し、分別発現を確認した。これらのＤＮＡの各々は別個の遺伝子転写を示すこと が見出された。ノーザン分析によりその発現パターンが立証された。ＲＣ−発現 は未処理の容器中では検出されず、手術後６時間では低レベルで検出され、３日 で最高レベルに達し、１４日の容器では低減し、ディフェレンシャル・ディスプ レイ・ゲルで観察されたパターンを確認した。偽の対照容器ではＲＣ９ ｍＲＮ Ａの発現は検出されなかった。 これらのｃＤＮＡの各々をｐＣＲＩＩベクターにサブクローニングし、両方向 でジデオキシ配列決定を行った。ＲＣ９クローンは４２４塩基（図１、配列番号 ：１）であり、ジーンバンクに以前に寄託された特徴的な遺伝子に著明な配列相 同性を示 すものはなかった。実施例２−ＲＣ−９の単離 ＲＣ９は、バルーン血管形成後のラット頚動脈のディフェレンシャル・ディス プレイ分析から単離した４２４ｂｐのゲノムＤＮＡフラグメントの一部であり、 前記の実施例１に記載するとおり、約１．１ｋｂのｍＲＮＡを同定した。この転 写物を十分に同定し、特徴づけるために、遺伝子全長を得ることが必須である。 再狭窄ラット頚動脈から調製したｃＤＮＡライブラリーは利用できないので、 このメッセージを発現するラット組織を同定し、次いでこの組織由来のｍＲＮＡ から調製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする必要があった。Ａ．ｃＤＮＡライブラリー・スクリーング ラット精巣ｃＤＮＡライブラリー（Ｓtratagene，Ｉnc．）を高度にストリン ジェントな条件下（０．１Ｘ ＳＳＰＥ、６５℃）、４２４ｂｐ ＲＣ９[配列番 号：１]でスクリーニングした。このプローブを用いて約７２０００個のプラーク をスクリーニングし、３ラウンドのスクリーニングの後、このうち３個が陽性で あった。各々がベクター・ポリリンカーの一部としてＥｃｏＲＩ部位でフランキ ングされた約１．６８ｋｂのインサートを含有するこれらの３個のクローンを得 、制限分析により同一であることが示された。１個のクローンを選別し、ＲＣ９ 特異的プライマーを用いるジデオキシヌクレオチド配列決定により、ＲＣ−９に 対する相同性が９８％であることが示され、またバルーン血管形成に供したラッ ト頚動脈をも用いてプロービングし、ｍＲＮＡ発現によるこのクローンの同一性 を確認した。 末処置ラット頚動脈由来およびバルーン血管形成後３時点（１、３および７日 ）で単離した頚動脈由来の全ＲＮＡを大きさで分別し、ＲＣ−９のインサートを 示す放射性標識ＰＣＲ産生物でハイブリダイゼーションした。より具体的には、 全ＲＮＡ（１０ｍｇ）を１．２％アガロース／ホルムアルデヒドゲルで分離し、 ニトロセルロースに移し、ハイブリダイゼーションし、前記するように洗浄した 。グリセロアルデヒド−３−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ(Ｇ３ＰＤＨ)プロ ーブをローディング対照として使用した。グリセロアルデヒド−３−ホスフェー ト・デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）に標準化したこのブロットのスキャニング ・デンシオメト リック分析により、このメッセージの発現においてバルーン血管形成後１日で基 底レベルの９倍、３日後で４倍、および術後７日で２倍に増加するのが確認され た。この発現パターンは、未処置容器中で検出される基底レベルは例外として、 ＲＣ９ディフェレンシャル・ディスプレイで観察されたものと合致し、バルーン 血管形成に反応してラット頚動脈においてこの遺伝子発現に類似したものが誘導 されることが示されら。偽の対照容器からのＲＣ−９−１ ｍＲＮＡのノーザン 分析では基底発現における変化が認められなかった（データは示していない）。Ｂ.配列分析 前記するように、クローンを両方の鎖で全長にわたって配列決定した（Ｓeque nase,Ｕnited Ｓtates Ｂiochemical Ｃorporation）。Ｍac Ｖectorソフトウェ ア・パッケージ（Internatinal Ｂiotechnologies，Ｉnc.）を用いてＤＮＡおよ びタンパク質配列を分析した。配列類似性の調査をＧenＢank Ｎudeic Ａcid Ｄ atabaseおよびＧenetics Ｃomputer Ｇroupプログラムを用いて実施した。 このクローンに由来する１．６８ｋｂのインサートの３’領域のディフェレン シャル・ディスプレイにより得られた４２４ｂｐのフラグメントとの相同性は９ ８％と同定し、さらにこのクローンとＲＣ９の配列との同一性を確認した。核酸 クローンＲＣ−９−１を図２、配列番号：２に示す。図２[配列番号：２]の配列 を続いて分析し、塩基対８６４−８７３、および１２５４−１２７６でポリＣト ラクトが存在し、塩基対８５１−８５７、および１２１２−１２１８で分枝点コ ンセンサス配列が存在することが示された。このことは配列がイントロン配列を 包含することを示している。さらなる分析により２個のイントロンが同定された 。イントロン１は図２の塩基対１２１−７７２にわたり、イントロン２は塩基対 １０００−１２７６にわたる。図２[配列番号：２]の配列を用いて以下の実施例 ３に記載するように、ＲＣ−９ ｃＤＮＡクローンが得られる。Ｃ．ゲノムＤＮＡ種分析 図２、配列番号：２のＲＣ−９配列の進化上の保存を決定するために、ヒト、 サル、ラット、マウス、イヌ、ウシ、ウサギ、ニワトリ、および酵母［サッカロ ミセス・セルビシア（Ｓaccaromyces cervisiae）］を包含する広範な動物種に 由来する、 ＥｃｏＲＩ消化したゲノムＤＮＡを用いてサザン・ブロット分析を実施した。９ 種の異なる動物種に由来する消化したゲノムＤＮＡ ４ｍｇを含有するゲノムＤ ＮＡサザン・ブロットをＣlontech，Ｉnc.（Ｐalo Ａlto,ＣＡ）より購入し、製 造者の指示書に準じて、高度にストリンジェントな条件下(５Ｘ クエン酸ナトリ ウム、１０％デンハート溶液、１００ｍｇ／ｍｌのシアリングしたサケ精子ＤＮ Ａ、１％ ドデシル硫酸ナトリウム、６５℃で、一晩）でＲＣ−９−１ ｃＤＮ Ａクローン全長でハイブリダイゼーションした。ブロットを低(２．０Ｘ硝酸ナ トリウム、０．１％ ドデシル硫酸ナトリウム、５５℃）、または高度にストリ ンジェント（０．２Ｘクエン酸ナトリウム、１％ドデシル硫酸ナトリウム、６５ ℃)な条件下で洗浄し、オートラジオグラフィーに供した。 図２[配列番号：２]のＲＣ−９−１ ＤＮＡを、低ストリンジェント洗浄条件 下(２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、５０℃）で種々の種に由来する多くの制限 断片にハイブリダイゼーションし、最も顕著なものはラットおよびウシの両方の ２４ｋｂフラグメント、並びにマウスの４．４ｋｂフラグメントであった。イヌ 、マウス、ラットおよびウシにおいて他のバンドも検出された。ウサギ、ニワト リ、または酵母ではバンドは可視化されなかった。あまり顕著でないバンドも多 くこのストリンジェント条件下で観察され、ヒト、ラット、およびウシの可視化 された約２．３および１．０ｋｂの長さのバンドを包含する。マウスにおける２ ．５ｋｂでの強いシグナルも顕著である。高度にストリンジェントな洗浄条件下 （０．２Ｘ ＳＳＣ、１％ ＳＤＳ、６５℃）でこれらのバンドは殆ど可視下され ず、ラットで２４ｋｂおよびマウスで４．４ｋｂの残りの顕著なバンドは強度の 変化はない。マウスにおける２．５ｋｂのバンドはもはや認められず、これはこ のバンドが図２[配列番号：２]のＲＣ−９−１配列と交差ハイブリダイゼーショ ンする別の遺伝子を示すことを示唆している。従って、ＲＣ−９−１転写物は良 く保存されると考えられる。実施例３−ＲＣ−９のｃＤＮＡクローニング 試験したラットｍＲＮＡを前記するように単離し、逆転写してオリゴｄＴプラ イマーを用いてｃＤＮＡを生じた。ＲＣ−９プライマーをＲＣ−９ゲノムＤＮＡ （図２、配列番号：２）の最端から選択した。とりわけ、センスプライマー（２ ５量体 オリゴヌクレオチド）は図２[配列番号：２]のヌクレオチド３１−ヌクレオチド ５５に対応し、５’−ＡＣＴ ＴＣＡ ＧＡＣ ＴＣＴ ＣＴＣ ＴＴＣ ＣＣ Ｔ ＡＣＧ Ｇ−３’の配列を有し；アンチセンス・プライマーは図２[配列番 号：２]のヌクレオチド１６５１−１６７８に対応し、５’ＧＣＡ ＴＣＡ Ｇ ＧＧ ＡＧＣＡＴＴ ＡＴＴ ＴＡＴ ＴＴＡ ＧＴＴ Ｔ−３’の配列を有す る。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてＲＣ−９ ｃＤＮＡを得た。以下 のパラメーターを用いてＰＣＲサイクルを４０回実施した：９４℃で１分；５３ ℃で１分」；７２℃で３分、最後のサイクルの後４℃で浸す。ＲＣ−９ ｃＤＮ Ａを１％ アガロースゲルで分離し、標準的な技術を用いて精製した。ＲＣ−９ ｃＤＮＡをベクターｐＣＲＩＩ[Ｉn Ｖitrogen]にライゲーションし、クローン を単離し、ＥｃｏＲＩで制限酵素消化し、これらが正確な大きさのインサートを 含有することを確認した。陽性クローンを配列決定し、図２のゲノム配列と比較 した。ｃＤＮＡ配列の一部をそれによりコードされるアミノ酸配列と共に図３[ 配列番号：３]に示す。図３の配列は６９６塩基対の長さである[配列番号：３] 。図３のヌクレオチド７２−６９６に対応するｃＤＮＡで相同性研究を実施し、 これにより、ｃＤＮＡ配列[配列番号：３]は図２[配列番号：２]のＲＣ−９ゲノ ム配列に９８％相同であることが示された。 配列番号：３および４は、以前にＷＯ９５／１７５０６に記載されるラットＡ ＩＦ配列と実質的に同一であることが見出されている。実施例４−ＲＣ−９の機能 制限エンドヌクレアーゼＢｓｔＸ１を用いて、実施例３のＲＣ−９クローンを ｐＣＲＩＩプラスミドから切断した。ＲＣ−９ ＤＮＡを精製し、予めＢｓｔＸ １で切断し、イー・コリ(Ｅ.coli)中で成長させた発現ベクターｐＲｃ／ＣＭＶ(Ｉ nvitorogen Inc.)にライゲーションした。伸長するために正しい配向でＲＣ−９ を含有する単一の細菌性コロニーを選別した。ｐＲｃ／ＣＭＶ中ＲＣ−９を有す る精製ＤＮＡを得た。 ラット大動脈平滑筋（ＲＡＶＳＭ）細胞をｐＲｃ／ＣＭＶプラスミド単独でか 、またはＲＣ−９を含有するプラスミドｐＲｃ／ＣＭＶでトランスフェクション した。トランスフェクションすべきＤＮＡ（ｐＲｃ／ＣＭＶまたはｐＲｃ／ＣＭ Ｖ ＲＣ −９）と混合したＬipofect ＡＭＩＮＥ試薬（Ｌife Ｔechnologies Ｉnc.)を用 いてトランスフェクションした。Ｌipofect ＡＭＩＮＥ試薬によりＤＮＡが細胞 膜を通過できるようになり、実際ＤＮＡを宿主の染色体に組み込むことができる 。トランスフェクションの２日後、化合物Ｇ４１８（Ｇeneticin）を細胞に加え た。Ｇ４１８はｐＲｃ／ＣＭＶプラスミドを含有しない細胞を殺し、ｐＲｃ／Ｃ ＭＶまたはｐＲｃ／ＣＭＶ ＲＣ−９を含有する細胞のみを残す。トランスフェ クションしたＲＡＶＳＭをＧ４１８存在下、ＲＣ−９に関する機能研究のために 成長させた。 ｐＲｃ／ＣＭＶまたはｐＲｃ／ＣＭＶＲＣ−９のどちらかを含有するＲＡＶＳ Ｍを同一濃度でＴ−１５０フラスコに播種し、５または７日間ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ＋Ｇ４１８中成長させた。次いで細胞をトリプシン処理し、増殖における 差異を見出すためにヘモサイトメーターを用いて計数した。５日目にｐＲｃ／Ｃ ＭＶの細胞数は４．５５ｘ１０4±８．５ｘ１０3セル／ｃｍ2（Ｔ−１５０フラ スコ＠１５０ｃｍ2中）であり、ｐＲｃ／ＣＭＶ ＲＣ−９の細胞数は１．２２ｘ １０5±５ｘ１０2セル／ｃｍ2であり；変化は１６８％であった。７日目の細胞 数は類似の結果であった：ｐＲｃ／ＣＭＶの細胞数は５．９３ｘ１０4±５．５ ｘ１０3セル／ｃｍ2（Ｔ−１５０フラスコ＠１５０ｃｍ2中）であり、ｐＲｃ／ ＣＭＶ ＲＣ−９の細胞数は１．８４ｘ１０5±３．７ｘ１０4セル／ｃｍ2であり ；変化は２１０％であった。 細胞数データにより、ＲＣ−９を含有するＲＡＶＳＭは対照細胞よりも速い速 度で増殖することが明確に示された。実施例５−ヒトＲＣ−９の組織発現 本明細書に記載するヒトＲＣ−９配列、配列番号：５および６は以前にＷＯ９ ５／１７５０６に記載されたヒトＡＩＦ配列と実質的に同一である。ヒトＲＣ− ９[配列番号：５]で形質転換したイー・コリ（Ｅ.coli）は元来pＢluescriptに発 現するが、成長し、陽性クローンが同定された。 ゲル精製ｃＤＮＡプローブ（ＰＣＲにより生じる）を用いて、前記するように 、ノーザン「ドット・ブロット」分析により、ヒトＲＣ−９ ｍＲＮＡ発現を評 価した。発現、シクロフィリンを用いた標準化はＣＮＳ、ＧＩ／尿生殖管および 驚くこ とに、心臓、大動脈および精巣の種々の領域からの「正常な」ヒト組織において 相対的に低値であった（ｈＲＣ−９により定義：シクロフィリンの比率＜１．３ ）。（この最後の観察は、ラットＲＣ−９[配列番号：３]がラット精巣ｃＤＮＡ ライブラリーに由来するクローンであったので特に興味深い）。しかしながら、 発現は炎症細胞機能に関連する器官において数倍に上昇した(骨髄＞胸腺＞脾臓 ＞末梢血白血球、例えばｈＲＣ−９：シクロフィリンの比率＞６．０）。胎児組 織では同様の発現パターンが示された（例えば、胸腺、脾臓で発現は最大）。ヒ ト「疾病」組織ブロットでは、ミトゲン（ＴＧＦｂまたはアンジオテンシンＩＩ ）刺激血管平滑筋細胞に存在するｍＲＮＡが増強され、これにより成長因子刺激 に関連するヒトＲＣ−９[配列番号：６]のアップレギュレーションが示された。 組織分析により、高血圧、うっ血性心不全および心筋梗塞に関連する（例えば心 臓および腎臓における）ヒトＲＣ−９ハイブリダイゼーションの上昇は細胞性増 殖／分化および繊維増殖障害の病因の対照におけるヒトＲＣ−９[配列番号：５ および６]の役割に合致することが示された。平均的な発現に相対的に合致して 、以前に血管形成を行った血管の新内膜に由来する血管平滑筋において、ヒトＲ Ｃ−９ ｍＲＮＡ発現もまた増加した。 本明細書に引用した全ての参考文献は出典明示により本明細書の一部とする。 本発明の特定の具体例を特に記載したが、多くの修飾および変更を行うことがで きることは当業者には明らかであろう。従って、本発明は示した特定の具体例に より限定することを意味するものではなく、むしろ範囲は以下の請求の範囲によ ってのみ規定されるものである。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION           Use of RC-9 in the diagnosis and treatment of proliferative artery diseaseField of the invention   The present application relates generally to proteins involved in coronary artery disease.Background of the Invention   Percutaneous transluminal coronary dilatation (PTCA) as treatment for advanced multivascular coronary artery disease Has increased exponentially over the past decade. However, this extension The long-term effects of surgery are observed in as many as 40% of patients who have undergone this dilatation, Restenosis occurs at a high rate and is significantly limited (P. Libby et al., Circulation). , 86 (Supplement III): 47-52 (1992)). The resulting neointima associated with this operation Formation is actively involved in several different cell types and occurs in several phases. (A. N. Clowes et al., Lab. Invest. 49: 208-215 (1983)). First response The essence is that many different cytokines can evolve into a local inflammatory response. 1 involving T-lymphocytes and macrophages secreting ins and growth factors Next is inflammation. In the second stage, the major cellular component of restenotic lesions, vascular smooth muscle cells (VSMC ) Involved in these reactions these factors migrated to the intima, where soluble growth and Secretes and proliferates chemotactic factors (Libby et al., Supra (1992); Clowes et al., Supra (1983); R Ross, Nature 362: 801-809 (1993); and ERO O'Brien et al., Circ. Res. 73: 223-231 (1993)). These activated VSMCs also have an extracellular matrix. Secrete. The third phase is the last few weeks after the injury, and chronic fibroproliferative lesion formation (Ross, supra (1993)). The cellular response to balloon angiogenesis Quite well characterized, but effective in preventing neointima formation associated with PTCA There are no pharmacological auxiliary measures for anti-restenosis.   Allograft inhibitor (AIF) is used to diagnose and treat allograft rejection It is stated to be useful. Rat and human AIF sequences are June 1995 It is described in WO 95/17506 issued on the 29th.   What is needed in the art are methods to prevent such neointimal formation, and To It is a more preferable method to diagnose and monitor these.Summary of the Invention   The present invention relates to polymorphs of RC-9 isolated from other cellular material with which it is naturally associated. It provides new uses for nucleotide and amino acid sequences. Also, these arrays , RC-9 protein produced by recombinant method and anti-RC It also provides novel uses for the -9 antibody.   Accordingly, in a first aspect, the present invention is directed to the diagnosis of proliferative artery disease and vascular restenosis. Provide a method of disconnection. These methods comprise the nucleic acids of RC-9 described herein and Utilizes amino acid sequences and anti-RC-9 antibodies.   In a further aspect, the present invention relates to the RC-9 nucleic acid sequences described herein. Using proteins and antibodies, selectable, including agonists and antagonists Methods for identifying compounds that specifically bind to a selected RC-9 sequence are provided. Nasasa In another embodiment, the present invention relates to a compound or drug produced using the above method. provide.   In yet another aspect, the invention relates to a method of treating proliferative artery disease and vascular restenosis. Provide the law. In these methods, the compounds or drugs described herein, RC -9 nucleic acid and amino acid sequences, and preferably an anti-RC-9 antibody is utilized.   Other aspects and advantages of the invention are described in the following detailed description of these preferred embodiments. Will be described further.BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES   Figure 1 shows a differential display This shows the DNA partial sequence of the obtained clone RC9 [SEQ ID NO: 1]. This array is Bank accession number U10894.   FIG. 2 shows the genomic DNA sequence of RC-9 [SEQ ID NO: 2]. This array is Bank accession number U33471.   FIG. 3 shows the cDNA of rat RC-9 [SEQ ID NO: 3] and the deduced amino acid sequence [ SEQ ID NO: 4] is illustrated.   FIG. 4 shows the cDNA of human RC-9 [SEQ ID NO: 5] and the amino acid sequence [SEQ ID NO: 5]. No .: 6] is illustrated.Detailed description of the invention   The present invention relates to the detection and treatment of proliferative artery disease and vascular restenosis by RC- No. 9 and novel uses of the encoded protein are provided. Book The nucleotide and amino acid sequences provided herein and the antibodies may Useful for diagnosis and monitoring of diseases and injuries. These sequences and anti- The body also has atherosclerosis and other diseases characterized by vascular restenosis It is also useful for the preparation of compounds useful for treating conditions.   Of RC-9 DNA cross-hybridization with DNA from a wide range of animal species Observations indicate that the protein encoded by RC-9 has substantial evolutionary protection. And the potential for important biological functions. Damaged by balloon angioplasty Transient expression of RC-9 mRNA in isolated rat carotid arteries It shows that organisms play a role in the early or intermediate stages of vascular restenosis.I. RC-9 polynucleotide sequence   The methods of the present invention can utilize the RC-9 polynucleotide sequences described herein. You. FIG. 1-4 shows the DNA sequence of the novel transcript of the present invention. FIG. 1 shows the following embodiment. 1. The nucleotide sequence of clone RC-9 obtained as described in SEQ ID NO. 1] shown. This partial sequence was 424 bases in length and was used as a probe. Longer sequence was obtained. FIG. 2 shows the genome of RC-9 with two introns. Shows the DNA sequence [SEQ ID NO: 2]. Intron 1 spans base pairs 121-772 Intron 2 spans base pairs 1000-1276. Poly C tract is base Located in pairs 864-873 and 1254-1276. Branch point consensus arrangement The rows are located at base pairs 851-857 and 1212-1218 in FIG. Figure 3 The cDNA sequence of rat RC-9 [SEQ ID NO: 3] is shown. The transcription initiation codon is shown in FIG. Located at base pairs 143-145, the stop codon is located at base pairs 581-583 . FIG. 4 shows the 636 base pair DNA sequence of human RC-9 [SEQ ID NO: 5]. this These sequences have a 444 base pair open reading frame (base pairs 72-5). 16), which encodes a 147 amino acid protein [SEQ ID NO: 6] You.   Fragments of these sequences have been found to be useful in a variety of applications. Hope Preferably, these functional fragments are at least about 15 nucleotides in length. And a desired amino acid sequence, such as an epitope, desirably RC-9-like. Encodes a therapeutically useful peptide characterized by biological activity or the like. this These RC-9 nucleotide sequences can be obtained using the polymerase chain reaction or cloning techniques. Can be isolated by conventional use. Alternatively, these sequences are commonly used It can be constructed by using genetic engineering or chemical synthesis techniques.   When used in the method of the present invention, the genomic RC-9 DNA sequence (FIG. 1 SEQ ID NO: : 1 and FIG. 2 SEQ ID NO: 2) or encodes the encoded RC-9 protein cDNA sequence (FIG. 3 SEQ ID NO: 3 and FIG. 4 SEQ ID NO: 5) or its functional The fragment may be modified. Using the sequence data described in this specification, Obtaining other polynucleotide sequences encoding RC-9 proteins that are clearly useful Is within the purview of those skilled in the art. Such modifications at the nucleic acid level can be, for example, silent Or to change the amino acid sequence, e.g., to improve expression or secretion. Includes modifications to the nucleotide sequence.   In yet another alternative, the polynucleotide sequences useful herein are desirable Can be modified by adding easily evaluable tags to facilitate quantification. You. Known techniques including, for example, in vitro mutagenesis and primer repair Can replace, insert or delete nucleotides. Also the genetic code And allelic variations caused by the natural degeneration of   In addition to isolating the nucleic acid sequence encoding the RC-9 protein described herein, Others include those complementary to the exemplified DNA sequence, such as antisense sequences. Are also within the scope of the present invention. Advanced or moderate stringency Under mild conditions [T. Maniatis et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual) ), Cold Spring Harbor Laboratory, 387-389 (1982)], FIG. -4 [SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5] which hybridizes to the DNA sequence shown These sequences are also included in useful DNA sequences. Highly stringent conditions For example, hybridization at 65 ° C. and 4 × SSC followed by 0.1 ° C. at 65 ° C. washing with xSSC for 1 hour. Alternatively, highly stringent 50% Holm 4 × SSC at 42 ° C. in amide. Also, moderately stringent Hybridize under conditions, eg, 55 ° C., 4 × SSC, then 37 ° C., 0.1 × Washing with SSC for 1 hour has also proven useful. Also medium Examples of highly stringent hybridization conditions include 50% 4xSSC at 30 ° C. in formamide.   As described in more detail below, RC-9 encoding these proteins The nucleic acid sequences are useful for various diagnostic and therapeutic applications. Advantageously, the nucleic acid sequence Proliferative artery disease and vascular restenosis, especially unwanted RC-9 levels or Are diagnostic probes for use in detecting and diagnosing symptoms associated with expression; Useful as an antisense probe. Oligonucleotide probes are Southern In standard diagnostic techniques such as blotting and polymerase chain reaction Useful.   Also, the RC-9 nucleic acid sequence produces an RC-9 protein useful in the methods of the invention. Can be used to These DNA sequences, once constructed or isolated, or In vitro or in vivo, the protein of the present invention can be prepared using appropriate fragments. It is preferable to obtain.II. RC-9 amino acid sequence   The method of the present invention relates to the RC-9 protein shown herein and its suitable functional An RC-9 amino acid sequence, including fragments, may be utilized. RC-9 La Protein [SEQ ID NO: 4] is obtained from the cDNA sequence [SEQ ID NO: 3] shown in FIG. The encoded RC-9 human protein [SEQ ID NO: 6] has the cDNA sequence shown in FIG. SEQ ID NO: 5]. Rat protein [SEQ ID NO: 4] has a length It has 147 amino acids and a molecular weight of 168244.9 daltons. Human tongue The protein is also 147 amino acids in length [SEQ ID NO: 6]. Organism of RC-9 Chemically active fragments are also useful in the method of the invention. These functional files Preferably, the fragment is at least 5 amino acids in length, Or it may have other desirable amino acid sequences.   Analogs or modified versions of the RC-9 protein are also useful in the present invention. Scripture Typically, such analogs have only one, two, three or four codon changes. Strange And is characterized by an RC-9-like biological activity. For example, the illustration of RC-9 Amino acids from the amino acid sequence (FIGS. 3 and 4, SEQ ID NOs: 4 and 6) Polypeptides with altered acids; especially polypeptides with conservative amino acid substitutions No. Conservative substitutions involve a series of amino acids related in side chain and chemical properties Substitution that occurs in acids. In addition, modifying the RC-9 protein useful in the present invention E.g., to improve its production or to stabilize the protein or other characteristics, e.g. Enhance binding activity or bioavailability or screen its use with competitive compounds To improve the protein or some other desired Characteristics may be imparted.   RC-9 protein and RC-9 protein fragment described herein The compounds are useful in therapeutic compositions described in more detail below. The method of the present invention Has also been applied to the diagnostic applications of these proteins, and to others such as anti-RC-9 antibodies. And the use of the same for producing therapeutic and diagnostic reagents. Generally other tongues Like protein, these RC-9 proteins can also be used in screening assays. Or as a research tool. More preferably, RC-9 Proteins may also be useful to prevent the action of RC-9, for example, in restenosis. It is also useful for screening and development of biological therapeutics.III. Recombinant expression of RC-9   Producing recombinant RC-9 protein using the DNA sequences described herein be able to. The obtained protein may be used in the method of the present invention. Alternatively, the method of the invention may involve in vivo expression of the protein. RC-9 To produce a protein, the RC-9 DNA sequence is inserted into a suitable expression system. Is also good. Desirably, the cDNA encoding RC-9 is an expression of RC-9 protein. A recombinant molecule or vector operably linked to a heterologous expression control sequence to enable expression. Build a reactor. Mammals (including humans) by standard molecular biology techniques ) Expression, for insects such as baculovirus expression, yeast, fungi, and bacterial expression Many types of suitable expression vectors and host cell systems are known in the art.   By transforming these vectors into appropriate host cells, the selected R C -9 protein expression can be obtained. Many other types are known in the art. Suitable expression vectors can also be used for this purpose.   Suitable host cells or cell lines to be transfected by this method Shows that Spodoptera frugipedera (Sf9) cells Insect cells. Methods for the construction and transformation of such host cells are well known. is there. [See, for example, Miller et al., Genetic Engineering, 8: 277-298 (Plenum Press.  1986) and references cited therein].   Similarly, human 293 cells, a rat aortic cell line [EH Ohlstein et al., Eu. r.J.Pharmacol.-Mol.Pharmacol.Section.225: 347-350 (1992)], Chiney Hamster ovary cells (CHO), monkey COS-1 cell line or Switzerland ( Swiss), murine 3T3 cells derived from Balb-c or NIH mice Mammalian cells may be used. Appropriate mammalian host cells and transformation, culture Methods for amplification, screening, production and purification are well known in the art. [example Getthing and Sambrook, Nature, 293: 620-625 (1981) or, alternatively, Ka ufinan et al., Mol. Cell Biol. 5 (7): 1750-1759 (1985) or Howley et al., USA See Patent No. 4,419,446]. Another suitable mammalian cell line is CV-1 cell line. It is Leline.   Bacterial cells are also useful as host cells. For example, E. coli Of various strains (eg, HB101, MC1061, and as used in the Examples below) Strain) is well known as a host cell in the field of biotechnology. Be subtili Various strains such as B. subtilis, Pseudomonas, and other rods are also available. It can also be used in this method.   Many strains of yeast cells well known to those skilled in the art are also polypeptides useful in the methods of the invention. Can be used as a host cell for expression of Other fungal cells can also be used as expression systems Can be.   Thus, the present invention is a method for producing a recombinant RC-9 protein, comprising, for example, Commonly used means such as transfection or electroporation The recombinant polynucleotide encoding the RC-9 protein under the control of a transcription control sequence. Transforming a host cell with at least one expression vector containing a nucleotide From that Provide a way to become. The transformed host cells are then expressed for RC-9 protein expression. Culture under appropriate conditions that allow for For example, host cells such as rat aortic flat Smooth muscle cells are transformed into a vector sufficient for the cells to be capable of overexpressing the RC-9 protein. Cells and screen the cells with a compound that inhibits RC-9 expression. Can be useful for training. In another embodiment, those skilled in the art From the culture medium (or, if expressed intracellularly, from the cells) by any suitable means known in the art. 3.) Collect, isolate and purify the expressed protein.   For example, the protein may be isolated in soluble form after cell lysis, or Can be extracted with guanidine chloride. If desired, the RC-9 protein of the present invention may comprise a fusion tag. Can be manufactured as protein. For example, the expression of a protein in a selected host cell Such an RC-9 fusion protein to enhance expression or improve purification It is desirable to produce Suitable fusions to the RC-9 protein described herein Partners are well known to those skilled in the art and include, inter alia, b-galactosidase and Stidine.IV. Production of anti-RC-9 antibody   RC-9 proteins, and modified or analogs thereof, or Expressing cells are useful as antigens for generating antibodies against RC-9 . Antibodies useful in the method of the present invention may be monoclonal, polyclonal, chimeric, Chain and humanized antibodies, and Fab fragments. These antibodies are Kohler and Milstein Hybridoma Technology, Huse et al., Science, 246: 1275-1. 281 (1988), or any other known in the art. It can be manufactured by a conventional method, including a modification of the above. Technology described for the production of single-chain antibodies (U.S. Pat. No. 4,946,778) applying the RC-9 tamper described herein. Single-chain antibodies to proteins can be produced. Also, transgenic Mouse, or other organisms such as mammals, using the RC-9 protein or R Humanized antibodies to the C-9 derived protein can be expressed. The present invention The body itself can be used to generate anti-idiotypic antibodies. Producing such antibodies The resulting technology is well known in the art.   The antibodies of the present invention can be used in the form of a protein. Alternatively, the antibodies of the present invention In vivo, antibodies or functional fragments thereof (eg, single chain or Fab flags) ) Can be used in the form of a polynucleotide expressing the same.V. Diagnostic reagent   The RC-9 proteins, antibodies, and polynucleotide sequences described herein ( Production or overproduction of RC-9 (including antisense polynucleotide sequences) Diagnostics for diagnosing certain vascular diseases associated with life, such as atherosclerosis It can be used as a blocking reagent. For example, RC-9 protein, antibodies, Can be used to diagnose vascular damage characteristic of such conditions . These reagents can be used for radioactive labels, colorimetric enzyme labels Labeling can also be performed using a diagnostic label such as a system. Conventional diagnosis A.For example, Southern blotting, Northern and Western blotting, Assay RC-9 levels in selected mammalian tissues, such as by the polymerase chain reaction. It can be measured by drugs. For example, using a polynucleotide sequence as a diagnostic substance Normal RC-9 mRNA may be detected or quantified, or the patient's sump may be detected. Mutation of the target gene RNA in the target gene can be detected. In such a method, FIG. PCR numbers complementary to the nucleic acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 5] can be used . Separately hybridization, RNase protection, chemical cleavage, direct DNA Sequencing or use of restriction enzymes, such as restriction fragment length polymorphism (RFLP) and Specific DNA sequences can be obtained by methods such as Southern blotting of genomic DNA. (That is, RC-9) can be detected. In another suitable assay, the RC-9 protein is used. Quality, protein fragments, or anti-RC-9 antibodies are utilized as reagents. This These assays include radioimmunoassays, competitive binding assays, and Western blots. And ELISA assays. Appropriate assay format and labeling The choice of system is within the skill of the art and is subject to a great deal of skill in the diagnostics art. It can be easily selected without any explanation.   Thus, the invention is characterized by vascular restenosis, such as atherosclerosis. These RC-9 proteins, antibodies or polynucleotides in the diagnosis of Methods of using otide reagents are provided. This method works on selected samples such as blood, blood Serum, blood Reagents, proteins, antibodies or DNA sequences selected from the clear or other suitable cells Contact and bind to sample or hybridize or reagent The amount of RC-9 present in the sample is determined by an assay format selected based on the Consists of putting out.VI. Therapeutic drug   The present invention further provides a method for treating vascular restenosis. More particularly, this method Administers anti-RC-9 antibody to block RC-9 activity in mammalian tissues Consisting of To block the binding of RC-9 to its corresponding receptor Anti-idiotypic antibodies that can be used in the present invention are also useful as therapeutic drugs of the present invention. Although not desirable, the therapeutic drug may contain the RC-9 nucleic acid sequence, Vector or RC-9 protein. Separately, described below The drug obtained using this method can be used as a therapeutic drug.   As an example, the therapeutic drug can be administered by a suitable route in the pharmaceutical composition. Normal, The composition may comprise an active agent (eg, an anti-RC-9 antibody, or a vector as described herein). Or polynucleotide) from about 10 mg to about 10 mg per kg of body weight. You. Those skilled in the art can adjust the optimal amount in consideration of the indication, severity, administration route, etc. It will be understood.   Suitable pharmaceutical carriers are well known to those skilled in the art and include, inter alia, saline, buffered saline. , Dextrose, water, glycerol, ethanol, and combinations thereof Can be easily selected from The pharmaceutical composition of the present invention may contain other active ingredients, or It may contain other desirable components such as pH adjusting substances, preservatives and the like.   Suitable routes can be readily determined by those skilled in the art, for example, intravenous, intramuscular, subcutaneous, Includes intraperitoneal, intradermal, oral, vaginal, anal, intranasal, and topical routes. Current The preferred method of administration is intravenous. However, those skilled in the art will The given route can be easily selected. Dosing may be repeated if necessary or desirable. Wear.VII. Drug screening and development   The present invention is also directed to treating atherosclerosis and other vascular disorders. Screening and screening of compounds or proteins that have utility as therapeutic agents Open In some cases, the RC-9 proteins, antibodies and polynucleotides described herein Also provided are methods of using the peptide sequences.   By way of example, such compounds bind to RC-9 and enhance its biological activity (Acts as an agonist) or blocks (acts as an antagonist) ) Have the ability. Such a compound is a drug for treating or preventing the aforementioned vascular disorders. It is considered to be useful as a material component. Currently competes with selected regions of RC-9 Routine for screening and developing drugs with the ability to bind There are various assays and techniques. These assays and techniques are based on the RC-9 protein. Or use a phage display system to express To produce proteins for studying the binding of complex compounds Using cultured E. coli or other microbial cultures. An example For example, G. Cesarini, FEBS Letters, 307 (1): 66-70 (June 1992)   H. Gram et al., J. Immunol. Meth. 161: 169-176 (1993); C. Summer et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3756-3760 (May 1992). This is incorporated herein by reference.   Use of protein, antibody or polynucleotide sequences useful in this aspect of the invention Other commonly used drug screening techniques. As an example, RC A method for identifying a compound that specifically binds to a -9 DNA sequence is briefly described as follows. The C-9 DNA fragment is contacted with a test compound and the test compound is The test compound, if any, that binds to the DNA fragment Is measured. Such a method involves immobilization on a test compound and a solid support. Incubating the obtained RC-9 DNA fragment.   Another method to identify compounds that specifically bind to the RC-9 sequence is to use a solid support. The immobilized RC-9 DNA fragment was used to test compound and to receive RC-9. A protein sequence that binds the receptor to the RC-9 DNA fragment Contacting both of the columns; measuring the amount of receptor that binds to the DNA fragment It may consist of. The inhibition of normal protein binding by the test compound is 4 shows the binding of the test compound to RC-9.   The RC-9-like effect of a potential agonist, or the effect of a potential antagonist, is Reporter system, eg after interaction of a candidate molecule with cells or suitable cell preparations Activity was measured and found to elicit RC-9 or the same effect as RC-9. Can be determined by comparison with the effect of the molecule in question. Useful resources in this regard The porter system is a colorimetrically labeled substrate converted to a product, a liposome that responds to changes in RC-9 activity. Gene, and binding assays well known in the art. Not something. Other suitable methods are well known to those skilled in the art.   Thus, by using such a method, the present invention provides for RC-9 or its Compounds that can interact with some and, if desired, enhance or reduce its biological activity provide. Such compounds are within the scope of the present invention.   The following example, which discloses the cloning and expression of RC-9, is merely illustrative. It is not intended to limit the invention in any way.Example 1-Isolation of RC-9 A. Rat left common artery balloon angioplasty   As described previously [EH Ohlstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. US A, 90: 6189-6193 (1993)], male Sprague-Dawley rats [350 g; Charles River Breeding Laboratory Inc., Wilmington, MA] -Sodium anesthesia [65 mg / kg, i.p.-Steris Laboratories, Phoenix, A Z], and a left common carotid artery balloon angioplasty was performed under aseptic conditions. Easy left Identify external carotid artery, remove adhering tissue, and perform 2-FFogarty artery embolectomy Catheter [12-060-2F model; Baxter Healthcare, Santa Ana , CA] was inserted. Guide the catheter a fixed distance down the common carotid artery to the aortic arch Guide, inflate with a volume of fluid, and pull back to the insertion site. Repeat this operation 3 times went. Upon completion, the catheter was immediately removed and the wound closed (9-mm Autoclips; Clay Adams, Franklin Lakes, NJ), Povadyne surgical scrub (7.5). % Povidone-iodine-Chaston Dayville, CT) with a cotton swab. Tissue animal Have free access to standard laboratory feed and water until needed for harvest , Housed in plexiglass cages under a 12 hour light / dark cycle.   To isolate the carotid artery, rats were treated with barbiturate (100 mg / kg, i.p. ) Anesthesia was performed and phlebotomy was performed via the vena cava. Immediately remove the attached tissue of the left common carotid artery Removed, isolated, and guanidine thiocyanate (Promega Company, Madison, MA) WI). These containers are then immediately flash frozen in liquid nitrogen and R Stored at -80 ° C until needed for NA isolation. About subsequent Northern analysis , Differential expression of tissues (controls) and transcripts from untreated animals, More specifically, blood was given at 6 hours, 3 days, and 14 days prior to working in a temporary mode. Tissue from animals that underwent tube formation was examined. Northern analysis by Siam Bessel ( sham vessel).B. RNA isolation and Northern analysis   Four or five left carotid arteries were pooled for experiments at each time point, or VSMCs were isolated from cultures and total RNA was obtained as described [P. czynski and N. Sacchi, Ann. Biochem. 162: 156-159 (1987)]. Equivalent RN A, separated on a 1.3% agarose / formaldehyde gel, and And hybridized with the indicated probe (0.25M NaCl, 1% sodium dodecyl sulfate, 50% formamide, 2X Denher Solution, 25 mg denatured salmon sperm DNA, 5% dextran sulfate, overnight at 42 ° C.) . The blot was washed under highly stringent conditions (0.1% sodium citrate). Lium, 0.1% sodium dodecyl sulfate, 65 ° C) Exposure was for 6-48 hours. All probes were randomized by the priming method [a32P] -Labeled (Boehringer Mannheim, Indianapolis In.) (All isotopes are Amersham Inc., obtained from Arhngton Heights IL.). Take the same filter And subsequently hybridized with various DNA probes. Glycero Aldehyde-3-phosphate dehydrogenase (G3PDH) probe Resulted from CR amplification (Clontech, Palo Alto, CA.). Hybridization Relative intensity of the autoradiation signal is within the linear variation of the film. Ogram Densimetric Scanning (RFLP-Scan Software, S canalytics, Inc.). Human and multi-tissue Northern blots from Clontech , Inc. (Palo Alto, CA.).C. Differential display of mRNA   The control left common carotid artery and the left common with prior balloon angioplasty 3 and 14 days prior Isolate carotid total RNA and use differential display technology to isolate it. Changes in gene expression were tested. DNA digestion, (1 UD) according to the manufacturer's protocol Nase; Gibo-BRL, Gaithersberg, MD), phenol / chloroform extraction, DNA was removed from total RNA using a series of methods of ethanol precipitation. Spirit Total RNA (02 mg) was reverse transcribed using a modified oligo dT primer. (Reverse transcriptase was obtained from GenHunter Corporation, Brooklin, Mass.) [P. ang et al., Science, 257: 967-971 (1992)]. amplify the cDNA and add the appropriate 3 'oligo dT primer, dNTP, [35S] dATP and any 10-mer 5 'ply Labeling was included by including a 10% reverse transcription reaction with GenHunter. Forty PCR cycles were performed with the following parameters: 94 ° C. for 30 seconds; 40 Soak at 72 ° C. for 7 minutes after the last cycle at 72 ° C. for 120 seconds; 72 ° C. for 45 seconds. reaction The labeled cDNA obtained from the product is separated on a 6% acrylamide sequencing gel and dried. And exposed to the autoradiographic film for 12-48 hours.   Gene expression in the vessel on day 3 shows early molecular aspects of the pathogenesis of lesion formation (Ie, they occur before the physical formation of neointimal damage), while 14 The day container shows a late appearance (ie, about 80% of the final damage volume is new). (Formed in the intima) [SA Douglas et al., Eur. J. Pharmacol. 255: 81-89 (1994) )].   In this experiment, RNA from these samples was loaded with four oligo dT anchors. Reverse transcript using all of the primers, and the resulting cDNA is converted into two different 5 'decamers. And amplified. First pay attention to the three bands at the top of the sequencing gel, This is because these samples are long and therefore facilitate identification of DNA sequences. You. Paying attention to the top three gels of the sequencing gel, less than 10% of the bands are fractionated. Appeared to be present (8 out of 82). In this first experiment, we show differential expression Two bands to be screened. D. Recovery, reamplification and cloning of cDNA   The selected cDNA was scraped off the sequencing gel, eluted and identical as described above. [Liang et al., Cited above]. Re-amplified PCR Product Was visualized on a 2.0% agarose gel by staining with ethidium bromide. Recovered by extraction (Bio 101, La Jona, CA). Re-amplified PCR product Labeled like the probe described above, the Invitorogen TA cloning system (San D iego, CA) and cloned into pCRII vector, Sequenced on a Model 373A automated sequencer.   The DNA segment was scraped off from the acrylamide sequencing gel, recovered, and dissolved. And amplified by PCR using the same primers and reaction conditions. By re-amplification Obtain a single product, the size of which is indicated on the acrylamide sequencing gel. Consistent with oversize (data not shown). These reamplifiers are then The gel was purified by glass and used as a probe for Northern analysis.   Only two of the rat tissues tested expressed the RC9 transcript. Testis RNA It showed a strong signal of about 1.35 kb, less than 1.1 kb observed in the carotid artery. Crab was big. Second, a weaker signal of about 1.1 kb was observed in the spleen. Was. In addition to information on which cDNAs to select, this data Is tissue-specific, and the difference in size from testis to spleen indicates that this mRNA Suggests transcript processing or the presence of similar messages in different tissues Which indicates that.   From untreated rat carotid artery and carotid artery isolated at 3 time points after balloon angioplasty Probing total RNA with these DNA fragments in Northern analysis Then, the differential expression was confirmed. Each of these DNAs shows distinct gene transcription Was found. Northern analysis confirmed its expression pattern. RC-expression Is not detected in untreated containers, is detected at low levels 6 hours after surgery and is 3 days At the highest level, reduced in 14-day containers, differential display The pattern observed on the ray gel was confirmed. RC9 mRN in fake control container A expression was not detected.   Each of these cDNAs was subcloned into the pCRII vector and Dideoxy sequencing. The RC9 clone has 424 bases (FIG. 1, SEQ ID NO: : 1), and a significant sequence phase in the characteristic gene previously deposited with Gene Bank. Show same sex There was nothing to do.Example 2-Isolation of RC-9   RC9 is used for differential dissection of rat carotid artery after balloon angioplasty. Part of a 424 bp genomic DNA fragment isolated from the prey analysis, As described in Example 1 above, an approximately 1.1 kb mRNA was identified. This roll In order to fully identify and characterize the germ, it is essential to obtain the full length gene.   CDNA library prepared from restenotic rat carotid artery is not available. A rat tissue expressing this message was identified, and then mRNA from this tissue was identified. It was necessary to screen a cDNA library prepared from.A. cDNA library screening   The rat testis cDNA library (Stratagene, Inc.) is highly stringent. Under gentle conditions (0.1X SSPE, 65 ° C), 424 bp RC9 [SEQ ID NO: No.:1]. About 72,000 plaques using this probe And after three rounds of screening, three of these were positive there were. Each is franked at the EcoRI site as part of the vector polylinker. These three clones containing the approximately 1.68 kb inserted insert were obtained. , And restriction analysis showed that they were identical. One clone was selected and RC9 Dideoxynucleotide sequencing using specific primers resulted in RC-9 The homology was 98%, and the ligation was performed for balloon angioplasty. Probed also with the carotid artery, the identity of this clone by mRNA expression It was confirmed.   3 time points after carotid artery and balloon angioplasty from untreated rats (1, 3 and 7 days) ), The total RNA from the carotid artery was fractionated by size, and the RC-9 insert was Hybridized with the indicated radiolabeled PCR product. More specifically, Total RNA (10 mg) was separated on a 1.2% agarose / formaldehyde gel, Transferred to nitrocellulose, hybridized and washed as above . Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (G3PDH) pro Was used as a loading control. Glyceraldehyde-3-phosphate Scanning of this blot, normalized to dehydrogenase (G3PDH) ・ Densiomet Analysis showed that the expression of this message was one day after balloon angioplasty. Increased to 9 times the bottom level, 4 times after 3 days, and 2 times 7 days after operation Was. This expression pattern, with the exception of basal levels detected in untreated containers, Matches what was observed on the RC9 differential display, with a balloon Similarity to this gene expression is induced in rat carotid artery in response to angiogenesis It is shown to be done. Northern of RC-9-1 mRNA from sham control container Analysis showed no change in basal expression (data not shown).B. Sequence analysis   Clones were sequenced on both strands as described above over the entire length (Sequence). nase, United States Biochemical Corporation). Mac Vector software DNA and DNA using a package (Internatinal Biotechnologies, Inc.) And protein sequences were analyzed. Sequence similarity studies were performed by GenBank Nudeic Acid D Performed using the atabase and Genetics Computer Group programs.   Differential 3 'region of the 1.68 kb insert from this clone The homology with the 424 bp fragment obtained by Charal Display is 9 8%, and the identity of this clone with the sequence of RC9 was confirmed. Nucleic acid Clone RC-9-1 is shown in FIG. Sequence of FIG. 2 [SEQ ID NO: 2] Was subsequently analyzed, and the polyC promoter at base pairs 864-873, and 1254-1276. Lacto is present, with branch points at base pairs 851-857 and 1212-1218. The presence of a consensus sequence was indicated. This means that the sequence Indicates inclusion. Further analysis identified two introns . Intron 1 spans base pairs 121-772 in FIG. 1000-1276. Example below using the sequence of FIG. 2 [SEQ ID NO: 2] As described in 3, an RC-9 cDNA clone is obtained.C. Genomic DNA species analysis   To determine the evolutionary conservation of the RC-9 sequence of FIG. Monkeys, rats, mice, dogs, cows, rabbits, chickens, and yeast [Saccharo Saccaromyces cervisiae] Derived from, Southern blot analysis was performed using EcoRI digested genomic DNA. 9 Genome D containing 4 mg of digested genomic DNA from different animal species NA Southern blots were purchased from Clontech, Inc. (Palo Alto, CA) and manufactured by According to the manufacturer's instructions, under highly stringent conditions (5X sodium citrate) Um, 10% denhardt solution, 100 mg / ml sheared salmon sperm DN A, 1% sodium dodecyl sulfate, at 65 ° C., overnight) with RC-9-1 cDN. Hybridization was performed with the full length of the A clone. Blot to low (2.0X sodium nitrate) Thorium, 0.1% sodium dodecyl sulfate, 55 ° C) Agent (0.2X sodium citrate, 1% sodium dodecyl sulfate, 65 C) and subjected to autoradiography.   The RC-9-1 DNA of FIG. 2 [SEQ ID NO: 2] was washed under low stringent washing conditions. Under (2X SSC, 0.1% SDS, 50 ° C.) many restrictions from various species Fragments, most notably both rat and bovine. A 24 kb fragment, as well as a mouse 4.4 kb fragment. Dog Other bands were also detected in mice, rats and cattle. Rabbit, elder No band was visualized in yeast or yeast. Many bands are not very noticeable Observed under stringent string conditions to visualize humans, rats, and cattle About 2.3 and 1.0 kb in length. 2 in mice . A strong signal at 5 kb is also significant. Highly stringent wash conditions (0.2X SSC, 1% SDS, 65 ° C), these bands are almost invisible. The remaining prominent band at 24 kb in rats and 4.4 kb in mice was intense. No change. The 2.5 kb band in mice is no longer visible, Cross-hybridization with the RC-9-1 sequence in FIG. 2 [SEQ ID NO: 2] It suggests that it may be another gene that Therefore, the RC-9-1 transcript is good. Is likely to be preserved.Example 3-cDNA cloning of RC-9   The tested rat mRNA was isolated as described above, reverse transcribed and oligo dT plasmid CDNA was generated using the immer. RC-9 primer was used for RC-9 genomic DNA (FIG. 2, SEQ ID NO: 2). In particular, the sense primer (2 Pentamer Oligonucleotide) is nucleotide 31-nucleotide of FIG. 2 [SEQ ID NO: 2] 55, corresponding to 5'-ACT TCA GAC TCT CTC TTC CC Having the sequence of T ACG G-3 '; the antisense primer is shown in FIG. No.:2], corresponding to nucleotides 1651-1678 of 5'GCA TCAG GG AGCATT ATT TAT TTA GTT T-3 ' You. RC-9 cDNA was obtained using the polymerase chain reaction (PCR). Less than PCR cycles were performed 40 times using the following parameters: 1 minute at 94 ° C; 53 1 minute at 72 ° C "; 3 minutes at 72 ° C, soak at 4 ° C after last cycle. RC-9 cDN A was separated on a 1% agarose gel and purified using standard techniques. RC-9 The cDNA was ligated into the vector pCRII [In Vitrogen] and cloned. Were isolated and digested with EcoRI to obtain the correct insert size. It was confirmed that it was contained. Positive clones were sequenced and compared to the genomic sequence in Figure 2. did. A portion of the cDNA sequence together with the amino acid sequence encoded thereby is shown in FIG. SEQ ID NO: 3]. The sequence in FIG. 3 is 696 base pairs long [SEQ ID NO: 3] . A homology study was performed on the cDNA corresponding to nucleotides 72-696 in FIG. As a result, the cDNA sequence [SEQ ID NO: 3] was obtained from the RC-9 genomic of FIG. 98% homology to the DNA sequence.   SEQ ID NOs: 3 and 4 correspond to rat A previously described in WO 95/17506. It has been found to be substantially identical to the IF sequence.Embodiment 4 Functions of RC-9   The RC-9 clone of Example 3 was cloned using the restriction endonuclease BstX1. It was cut from the pCRII plasmid. RC-9 DNA was purified and BstX 1 and grown in E. coli pRc / CMV (I nvitorogen Inc.). RC-9 with correct orientation to stretch A single bacterial colony containing was selected. Has RC-9 in pRc / CMV Purified DNA was obtained.   Rat Aortic Smooth Muscle (RAVSM) cells were transformed with pRc / CMV plasmid alone Or transfection with plasmid pRc / CMV containing RC-9 did. DNA to be transfected (pRc / CMV or pRc / CM V RC -9) mixed with Lipofect AMINE reagent (Life Technologies Inc.) And transfected. DNA is transformed into cells by Lipofect AMINE reagent It can cross membranes and actually integrate the DNA into the host chromosome . Two days after transfection, compound G418 (Geneticin) was added to the cells. Was. G418 kills cells that do not contain the pRc / CMV plasmid and pRc / CV Only cells containing MV or pRc / CMV RC-9 are left. Transfer RAVSM in the presence of G418 for functional study on RC-9 Grew.   RAVS containing either pRc / CMV or pRc / CMVRC-9 M at the same concentration in a T-150 flask and DMEM + 10% for 5 or 7 days Growed in FBS + G418. The cells are then trypsinized and allowed to grow. Counting was performed using a hemocytometer to find differences. PRc / C on day 5 MV cell number 4.55 × 10Four± 8.5x10ThreeCell / cmTwo(T-150 hula Scotch 150cmTwoMedium) and the cell number of pRc / CMV RC-9 was 1.22 × 10Five± 5x10TwoCell / cmTwoAnd the change was 168%. Day 7 cells Numbers were similar: pRc / CMV cell number 5.93 x 10Four± 5.5 x10ThreeCell / cmTwo(T-150 flask @ 150cmTwoMiddle) and pRc / The cell number of CMV RC-9 is 1.84 × 10Five± 3.7x10FourCell / cmTwoIs The change was 210%.   According to cell number data, RAVSM containing RC-9 is faster than control cells. It was clearly shown that they grew in degree.Example 5-Tissue expression of human RC-9   The human RC-9 sequence described herein, SEQ ID NOs: 5 and 6, was previously described in WO9 It is substantially identical to the human AIF sequence described in 5/17506. Human RC- E. coli transformed with 9 [SEQ ID NO: 5] originally originated in pBluescript. However, they grew and positive clones were identified.   Using gel purified cDNA probes (generated by PCR) as described above Evaluated human RC-9 mRNA expression by Northern “dot blot” analysis. Valued. Expression, normalization with cyclophilin was performed for CNS, GI / urogenital and Surprised And in "normal" human tissue from various areas of the heart, aorta and testis Relatively low values (defined by hRC-9: ratio of cyclophilin <1.3) ). (This last observation indicates that rat RC-9 [SEQ ID NO: 3] Particularly interesting because it was a clone from the library). However, Expression increased several-fold in organs associated with inflammatory cell function (bone marrow> thymus> spleen > Peripheral blood leukocytes, eg hRC-9: cyclophilin ratio> 6.0). Fetal group Weaving showed a similar expression pattern (eg, thymus, spleen, maximal expression). Hi In the “disease” tissue blot, mitogens (TGFb or angiotensin II ) MRNA present in stimulated vascular smooth muscle cells is enhanced, thereby stimulating growth factors. Up-regulation of human RC-9 [SEQ ID NO: 6] related to Histological analysis indicates that it is associated with hypertension, congestive heart failure and myocardial infarction (eg, cardiac Increased human RC-9 hybridization (in the kidney and kidney) is associated with increased cellularity Human RC-9 [SEQ ID NO: 5] in controls for the pathogenesis of reproductive / differentiation and fibroproliferative disorders And 6]. Relatively consistent with the average expression In human vascular smooth muscle derived from the neointima of previously angiogenic blood vessels, human R C-9 mRNA expression was also increased.   All references cited herein are hereby incorporated by reference. Although particular embodiments of the present invention have been specifically described, many modifications and changes may be made. It will be apparent to those skilled in the art. Accordingly, the present invention is directed to the particular embodiment illustrated. It is not meant to be limiting, but rather the scope is defined by the following claims. Is defined only by

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 オーティーリ，マイケル・ビクター アメリカ合衆国19442ペンシルベニア州 ブルー・ベル、クリアビュー・アベニュー 1565番────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page    (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, L U, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF) , CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, S Z, UG), UA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD , RU, TJ, TM), AL, AM, AU, BB, BG , BR, CA, CN, CZ, EE, GE, HU, IL, IS, JP, KG, KP, KR, LK, LR, LT, L V, MD, MG, MK, MN, MX, NO, NZ, PL , RO, SG, SI, SK, TR, TT, UA, US, UZ, VN (72) Inventor Ortiri, Michael Victor             United States 19442 Pennsylvania             Blue Bell, Clearview Avenue             1565th

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．ＲＣ−９の過剰産生により特徴付けられる増殖性動脈疾患の診断方法であ って、 （ａ）患者から由来のサンプルを、検出可能な標識と結合させた （ｉ）ＲＣ−９に対する抗体； （ii）ＲＣ−９ポリヌクレオチド配列；および （iii）ＲＣ−９タンパク質； からなる群から選択される診断用試薬と接触させること： （ｂ）該試薬と該サンプル中のＲＣ−９を結合させることにより、該サンプ ル中のＲＣ−９の存在を検出すること： からなる、増殖性動脈疾患の診断方法。 ２．抗体を、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化 抗体、Ｆａｂフラグメントおよび一本鎖抗体からなる群より選択する、請求項１ 記載の方法。 ３．抗体がモノクローナル抗体である請求項２記載の方法。 ４．ポリヌクレオチド配列が、 （ａ）配列番号：１からなるＤＮＡ配列； （ｂ）配列番号：２からなるＤＮＡ配列； （ｃ）配列番号：３からなるＤＮＡ配列； （ｄ）配列番号：４からなるＤＮＡ配列； （ｅ）前記した（ａ）から（ｄ）のＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ配列； （ｆ）ストリンジェント条件下で（ａ）から（ｄ）へのハイブリダイズ能を 有する配列； （ｇ）ＲＣ−９様生物学的活性を有する（ａ）から（ｄ）のフラグメントお よびアナログ； からなる群より選択される、請求項１記載の方法。 ５．ＲＣ−９タンパク質が、 （ａ）配列番号：４のアミノ酸配列； （ｂ）配列番号：６のアミノ酸配列； （ｃ）（ａ）または（ｂ）のアナログ；および （ｄ）５個のアミノ酸を有してなり、ＲＣ−９様生物学的活性により特徴づ けられる、（ａ）または（ｂ）のフラグメント； からなる群から選択される、請求項１記載の方法。 ６．ＲＣ−９に対する抗体を含んでなる医薬組成物を患者に投与することから なる、ＲＣ−９の過剰産生により特徴づけられる増殖性動脈疾患の処置方法。 ７．抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化 抗体、Ｆａｂフラグメントおよび一本鎖抗体からなる群より選択される、請求項 ６記載の方法。 ８．抗体がモノクローナル抗体である請求項７記載の方法。 ９．選択されたＲＣ−９ＤＮＡ配列に特異的に結合する化合物の同定方法であ って、該ＲＣ−９ＤＮＡ配列を試験化合物と接触させて、該試験化合物を該ＤＮ Ａ配列と結合させ、該ＤＮＡ配列に結合する試験化合物の量を測定する方法。 １０．ＲＣ−９ＤＮＡ配列を固体支持体に固定する請求項９記載の方法。 １１．選択されたＲＣ−９アミノ酸配列に特異的に結合する化合物の同定方法 であって、該ＲＣ−９アミノ酸配列を試験化合物と接触させて、該試験化合物を 該アミノ酸配列と結合させ、該アミノ酸配列に結合する試験化合物の量を測定す る方法。 １２.ＲＣ−９アミノ酸配列を固体支持体に固定する請求項１１記載の方法。 １３．選択されたＲＣ−９抗体に特異的に結合する化合物の同定方法であって 、該ＲＣ−９抗体を試験化合物と接触させて、該試験化合物を該抗体と結合させ 、該抗体に結合する試験化合物の量を測定する方法。 １４．ＲＣ−９抗体を固体支持体に固定する請求項１３に記載の方法。 １５．一群の化合物をＲＣ−９タンパク質、ＲＣ−９ＤＮＡ配列または抗ＲＣ −９抗体でスクリーニングすることにより得られる、ＲＣ−９活性の阻害能を有 する化合物。 １６．ＲＣ−９の過剰産生により特徴付けられる増殖性動脈疾患の治療用医薬 の製造におけるＲＣ−９抗体の使用。[Claims]   1. A method for diagnosing a proliferative artery disease characterized by overproduction of RC-9. What     (A) A sample from the patient was conjugated to a detectable label       (I) an antibody against RC-9;       (Ii) RC-9 polynucleotide sequence; and       (Iii) RC-9 protein; Contacting with a diagnostic reagent selected from the group consisting of:     (B) combining the reagent with RC-9 in the sample to form the sample; Detecting the presence of RC-9 in the A method for diagnosing proliferative artery disease, comprising:   2. Antibodies, polyclonal, monoclonal, chimeric, humanized 2. The method according to claim 1, wherein the antibody is selected from the group consisting of an antibody, a Fab fragment, and a single-chain antibody. The described method.   3. 3. The method according to claim 2, wherein the antibody is a monoclonal antibody.   4. The polynucleotide sequence is     (A) a DNA sequence consisting of SEQ ID NO: 1;     (B) a DNA sequence consisting of SEQ ID NO: 2;     (C) a DNA sequence consisting of SEQ ID NO: 3;     (D) a DNA sequence consisting of SEQ ID NO: 4;     (E) an RNA sequence corresponding to the DNA sequence of (a) to (d) above;     (F) The ability to hybridize from (a) to (d) under stringent conditions Sequence having;     (G) fragments (a) to (d) having RC-9-like biological activity And analogs; The method of claim 1, wherein the method is selected from the group consisting of:   5. RC-9 protein     (A) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4;     (B) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6;     (C) an analog of (a) or (b); and     (D) having 5 amino acids and characterized by an RC-9-like biological activity Fragment of (a) or (b); The method of claim 1, wherein the method is selected from the group consisting of:   6. Administering to a patient a pharmaceutical composition comprising an antibody to RC-9 A method for treating a proliferative artery disease characterized by overproduction of RC-9.   7. Antibodies are polyclonal, monoclonal, chimeric, humanized The antibody is selected from the group consisting of an antibody, a Fab fragment and a single chain antibody. 6. The method according to 6.   8. The method according to claim 7, wherein the antibody is a monoclonal antibody.   9. A method for identifying a compound that specifically binds to a selected RC-9 DNA sequence. Contacting the RC-9 DNA sequence with a test compound to allow the test compound to A method for measuring the amount of a test compound which binds to the A sequence and binds to the DNA sequence.   10. 10. The method according to claim 9, wherein the RC-9 DNA sequence is immobilized on a solid support.   11. Method for identifying a compound that specifically binds to a selected RC-9 amino acid sequence Contacting said RC-9 amino acid sequence with a test compound, Bind to the amino acid sequence and measure the amount of test compound that binds to the amino acid sequence. Way.   12. The method of claim 11, wherein the RC-9 amino acid sequence is immobilized on a solid support.   13. A method for identifying a compound that specifically binds to a selected RC-9 antibody, Contacting the RC-9 antibody with a test compound to bind the test compound to the antibody. A method for measuring the amount of a test compound that binds to the antibody.   14． 14. The method of claim 13, wherein the RC-9 antibody is immobilized on a solid support.   15. A group of compounds is designated as RC-9 protein, RC-9 DNA sequence or anti-RC Has the ability to inhibit RC-9 activity obtained by screening with Compounds.   16. Pharmaceutical for treating proliferative artery disease characterized by overproduction of RC-9 Use of the RC-9 antibody in the production of
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0879882A1 (en) * 1997-05-22 1998-11-25 Smithkline Beecham Corporation ATG-1100 (AIF-1-Gamma), a splice variant of AIF-1/RC-9
EP0879883A1 (en) * 1997-05-22 1998-11-25 Smithkline Beecham Corporation ATG-1120 (AIF-1-DELTA), a splice variant of AIF-1/RC-9
EP1383797A2 (en) * 2001-02-07 2004-01-28 Universiteit Maastricht Markers of unstable atherosclerotic plaques

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010018870A1 (en) 2008-08-15 2010-02-18 藤倉化成株式会社 Polypeptide marker for diagnosis of arteriosclerosis, method for detection of arteriosclerosis by using the maker or the like, and kit for diagnosis of arteriosclerosis
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