JP2000500474A

JP2000500474A - 新規な駆虫剤およびワクチンを開発する目的のための感染後の線虫からの抗原の同定

Info

Publication number: JP2000500474A
Application number: JP9519341A
Authority: JP
Inventors: ハルダー，アヒム; ロンデルスハウゼン，ミヒヤエル; アイゼンバイス，ビルヘルム・フリードリヒ
Original assignee: バイエル・アクチエンゲゼルシヤフト; マクス―プランク―ゲゼルシヤフト・ツア・フエルデルング・デア・ビセンシヤフテン・イー・ブイ・ベルリン
Priority date: 1995-11-22
Filing date: 1996-11-11
Publication date: 2000-01-18
Also published as: WO1997019107A1; DE19543554A1; EP0868433A1; AU7569396A

Abstract

(57)【要約】本発明は、線虫から単離されて本質的に純粋形態にあり、そしてＬ３〜Ｌ４の脱皮段階にある線虫仔虫に対して用いられる防御抗−血清との免疫学的反応を示す抗原に関し、その抗原はＬ４段階にある線虫仔虫の

Description

【発明の詳細な説明】新規な駆虫剤およびワクチンを開発する目的のための感染後の線虫からの抗原の同定本明細書は、線虫からの、防御抗血清と免疫学的に反応する本質的に純粋な形態をとる抗原の単離および性質決定、ならびにこれらの抗原を取得するための手段に関する。本発明は更に、新規な駆虫剤およびワクチンを開発するためのこれらの抗原の使用にも関する。ヒトおよび動物のリンパ管およびリンパ組織を攻撃することがある寄生性線虫は慢性疾患を引き起こす。ヒト病原性線虫種は熱帯地域に生じ、そのような地域ではＷＨＯ（世界保健機関）の試算によると１億人を上回る感染者がいる。農業用の動物およびペットにおける線虫疾患は全世界にわたって生じており、そして多大な経済的損害や失費をもたらす。市販品として入手可能な駆虫剤は、その線虫がその試薬に対してまだ耐性を発現していないとすればそれらの寄生性線虫に感染したヒトや動物を治すことができる。予防的投与を行う場合の耐性の発現は既に観察されている。従って耐性を克服することのない新規の駆虫剤の開発の必要性は、大きくない。線虫の表面構造に対する抗体の投与による受動防御免疫も簡単には達成することができない。従ってフィラリア感染に対する受動免疫化のためのモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体の使用に失敗したことが記載されている数々の刊行物が存在する（Ａｂｒａｈａｍｅｔａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．７４：２７５−２８２、Ｖｉｃｋｅｒｙｅｔａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．６９：４７８−４８５、およびＴａｎｎｅｒａｎｄＷｅｉｓｓ（１９７９）ＴｒｏｐｅｎｍｅｄｉｚｉｎｕｎｄＰａｒａｓｉｔｏｌｏｇｉｅ［ＴｒｏｐｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅａｎｄＰａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ］、３０：３７１−３７５）。モノクローナル抗体での受動免疫化はその寄生虫による苦しみを増加させることにつながることさえあり得る（Ｊａｎｅｃｈａｒｕｔｅｔａｌ．（１９９１）ＰａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈ、７７：６６８６７４）。Ｅｉｓｅｎｂｅｉｓｓら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２（１９９４）、７３５−７４２）はスナネズミ（Ｍｏｎｇｏｌｉａｎｇｅｒｂｉｌ）（Ｍ．ウングイクラトゥス（Ｍ．ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔｕｓ））での少数の寄生性フィラリアＡ．ビテアエ（Ａ．ｖｉｔｅａｅ）の仔虫の反復投与により総蠕虫負荷量（ｔｈｅｔｏｔａｌｗｏｒｍｌｏａｄｉｎｇ）の有意な減少がもたらされることを記載している。この部分的防御免疫は、Ｌ３／Ｌ４脱皮段階（ｅｘｓｈｅａｔｈｉｎｇｓｔａｇｅ）での感染後の仔虫により分泌される抗原に関連するように思われる。Ｌ３段階にある不活化された仔虫もしくはＬ４段階にある生きた仔虫の場合にはこの種の作用は全く見られなかった。免疫化させた宿主動物からは、脱皮中であるＬ３およびＬ４の間の段階に分泌される抗原性物質に対する防御抗血清を単離することができる。しかしながらこの分泌は非常に短い期間にのみ、かつ非常に少量で生じるため、純粋形態での抗原の単離は可能とはならない。しかしながら驚くべきことに、Ｌ３段階からＬ４段階への推移の間に分泌される脱皮抗原がＬ４段階でインビトロで培養される線虫の仔虫により有意に高い量で産生されることが見いだされた。この様式で産生される抗原の量はかなり多いため、通常の技術による単離が容易に可能となる。それに加え、驚くべきことに、この様式で単離された抗原は免疫学的性質としては種非特異的であるが、様々な抗血清および様々な線虫種間での種重複性交差反応が見いだされることが判明した。従って本発明は、線虫からの、Ｌ３からＬ４への脱皮段階における線虫仔虫に対する防御抗血清と免疫学的に反応する本質的に純粋形態の単離された抗原に関し、その抗原はＬ４段階の線虫仔虫のインビトロ培養およびその培養物上清からの回収により取得することができる。本出願の意味においては表現「防御抗血清」は、その免疫系が適切な予備免疫化の結果として新規感染物を完全に除去することができる動物からその血清を取得することができることを意味する。驚くべきことに、防御抗血清と免疫学的に反応する抗原を大多数の線虫種から、特にフィラリア種から、例えばカエノルハブディティスエレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓｅｌｅｇａｎｓ）のような例えば自由生活性線虫種、または例えばアカンソケイロネマビテアエ（Ａｃａｎｔｈｏｃｈｅｉｌｏｎｅｍａｖｉｔｅａｅ）、モナネママルティニ（Ｍｏｎａｎｅｍａｎａｒｔｉｎｉ）、ディロフィラリアイミティス（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａｉｍｍｉｔｉｓ）、ウーケレリアバンクロフティ（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａｂａｎｃｈｒｏｆｔｉ）、ブルギアマライ（Ｂｒｕｇｉａｍａｌａｙｉ）、ロアロア（Ｌｏａｌｏａ）、オンコケルカボルブルス（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａｖｏｌｖｕｌｕｓ）、オンコケルカオケンギ（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａｏｃｈｅｎｇｉ）、ドロアクンクルスメディネンシス（Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｕｓｍｅｄｉｎｅｎｓｉｓ）、リトモソイデスシグモドンティス（Ｌｉｔｏｍｏｓｏｉｄｅｓｓｉｇｍｏｄｏｎｔｉｓ）、ハエモンクスコントルトゥス（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓｃｏｎｔｏｒｔｕｓ）、トリキネラスピラリス（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａｓｐｉｒａｌｉｓ）、もしくはトリクリスムリス（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓｍｕｒｉｓ）のような寄生性線虫から単離することができる。防御抗血清は、Ｌ３／Ｌ４脱皮段階以前に生きた線虫仔虫による一次感染に露出され、かつ同一種もしくは異なる種の線虫仔虫での二次負荷感染（ａｓｅｃｏｎｄｌｏａｄｉｎｇｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）の際に少なくとも部分的にそれらの発達を阻害する宿主動物から取得することができる。防御抗血清は、スナネズミ（Ｍｏｎｇｏｌｉａｎｇｅｒｂｉｌ）であるＭ．ウングイクラトゥス（Ｍ．ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔｕｓ）、アフリカシマネズミ（Ａｆｒｉｃａｎｓｔｒｉｐｅｄｍｏｕｓｅ）であるレムニスコミスストリアトゥス（Ｌｅｍｎｉｓｃｏｍｙｓｓｔｒｉａｔｕｓ）、もしくは線虫の他の天然宿主から取得することができることが好ましい。一次感染については、少数の線虫仔虫の反復用量を用いることが好ましく、そのことにより仔虫投与と仔虫計数の間の間隔を線虫種に従って変化させることが可能となる。Ｍ．ウングイクラトゥス（Ｍ．ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔｕｓ）の免疫化の場合には、例えば線虫種Ａ．ビテアエ（Ａ．ｖｉｔｅａｅ）の生きた感染性Ｌ３仔虫を各場合とも３日の間隔で３回、かつ５〜１０匹の仔虫数で投与して良好な免疫化を達成することができる。それに加え防御抗血清は更には、生きたＬ４Ａ．ビテアエ（Ａ．ｖｉｔｅａｅ）仔虫、生きた状態でインビトロで培養したＬ３／Ｌ４もしくはＬ４Ａ．ビテアエ（Ａ．ｖｉｔｅａｅ）仔虫、生きた状態でインビトロで培養された「脱皮した」Ｌ３Ｈ．コントルトゥス（Ｈ．ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ）仔虫、および生きた状態でインビトロで培養したＬ３（８０％嗜眠性）Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）仔虫での予備免疫化によっても取得することができる。この様式で取得される防御抗血清を用いることで、免疫化に用いられるこれらの線虫種の抗原ばかりでなく、他の線虫種の抗原も検出および単離することができる。従って例えば、フィラリアＡ．ビテアエ（Ａ．ｖｉｔｅａｅ）の天然の宿主であるスナネズミ（Ｍｏｎｇｏｌｉａｎｇｅｒｂｉｌ）メリオネスウングイクラントゥス（Ｍｅｒｉｏｎｅｓｕｎｇｕｉｃｕｌａｎｔｕｓ）から得られる防御抗血清は、線虫種Ｍ．マルティニ（Ｍ．ｍａｒｔｉｎｉ）、Ｌ．シグモドンティス（Ｌ．ｓｉｇｍｏｄｏｎｔｉｓ）、Ｄ．イミティス（Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ）、Ｈ．コントルトゥス（Ｈ．ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ）、および更には自由生活性線虫種であるＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）からの抗原に対して免疫学的交差反応性を示す。本発明に関する抗原は、操作的にグリコシル化することができるポリペプチドであることが好ましい。分子量に従って分離することができ、かつ単離された形態で取得することができる異なる抗原が分泌される。取得される抗原の量はアミノ酸配列の部分決定にはわけなく足りるものである。この情報に基づくと、組換えＤＮＡ技術により、その特別な抗原をコードするＤＮＡ分子を単離することも可能となる。コード用のＤＮＡ配列の単離の後には本発明に従う抗原を、例えば細菌、イースト、もしくは昆虫細胞の培養株のような適切な宿主細胞内での組換え法によるか、もしくはトランスジェニックＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）を用いることで産生することもできる。好ましい抗原は、Ａ．ビテアエ（Ａ．ｖｉｔｅａｅ）から取得することができ、そしてゲル濾過クロマトグラフィーに従って約４、１４、１８、２５、２９〜３０、４０、４４、５２、５６、６０、６６、もしくは６８ｋＤの分子量を有する抗原、またはそれらと免疫学的に交差反応する抗原である。それに加え、Ａ．ビテアエ（Ａ．ｖｉｔｅａｅ）から取得することができ、そしてＳＤＳ −ＰＡＧＥに従って約１７、４０、５２、５６、６０、６３、６７、９０、９４、１１６、１８０、２１２、４００、もしくは８００ｋＤの分子量を有する抗原、またはそれらと免疫学的に交差反応する抗原である。例えばＤ．イミティス（Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ）、Ｍ．マルティニ（Ｍ．ｍａｒｔｉｎｉ）、Ｌ．シグモドンティス（Ｌ．ｓｉｇｍｏｄｏｎｔｉｓ）、Ｈ．コントルトゥス（Ｈ．ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ）、およびＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）においてさえも免疫学的に交差反応する抗原を検出することも可能であった。Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）から取得することができ、そしてゲル濾過クロマトグラフィーに従って約１４、１６、２６、２８、３０、４６、４９、５８、および６６ｋＤの分子量を有する抗原、またはＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）から取得することができ、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥに従って約４６、６０、９７、１０９、２１２、もしくは４００ｋＤの分子量を有する抗原、あるいはそれらと免疫学的に交差反応する抗原も同様に好ましい。Ａ．ビタエア（Ａ．ｖｉｔａｅａ）においてさえも免疫学的に交差反応する抗原を検出することも可能であった。特に好ましい抗原は約６０ｋＤの分子量、および（ａ）Ｎ−末端アミノ酸配列（この配列中、Ｘａａはいずれかの所望されるアミノ酸を表す）、または（ｂ）（ａ）からの配列に少なくとも８０％および特に少なくとも９０％相同なＮ−末端アミノ酸配列を持つものである。これらの抗原はセリン／スレオニン蛋白質キナーゼ活性を持つことができる。先に記載した分子量に関連し、本発明に従う抗原に関しては、それらの数値は単におおよその値に過ぎず、そしてそのため、それらは各場合において示される値の±１０％、そして好ましくは±５％の数的範囲を意味するものとして理解されるべきであることを明示するべきである。本発明は更には、Ｌ３〜Ｌ４の脱皮の段階の線虫仔虫に対する防御抗血清と免疫学的に反応する、線虫からの抗原の取得のための方法にも関し、Ｌ４段階の線虫の仔虫はインビトロで培養され、その培養上清を分離し、そしてその抗原をその培養上清から単離する。単離は、ゲル濾過クロマトグラフィー段階を含むことが好ましい。感染後１３日目の段階にあるＡ．ビテアエ（Ａ．ｖｉｔｅａｅ）仔虫の使用が更に好ましい。他の生物体の場合には、本発明に従う抗原の産生が行われる適切な仔虫段階は、インビトロで培養された仔虫の上清からの免疫学的活性の決定による単純な様式で確認することができる。本発明は更に追加的に、活性成分として一つもしくは複数の既述の抗原、そして適切な場合には薬剤学的に慣例となっている添加物、賦形剤、および佐剤を含む薬剤学的組成物にも関する。抗原もしくはそれらを含む薬剤学的組成物を、線虫感染症の診断、予防、および治療に用いることができる。従って本発明は更には、一つもしくは複数の既述の抗原が薬剤学的に許容される形態で投与される、ある線虫感染症に対する免疫化のための方法にも関する。この投与は好ましくは、１〜４日間連続で０．５と２５０ｍｇ／ｋｇの間、特に好ましくは１０と１００ｍｇ／ｋｇの間の用量で、非経口用もしくは経口用製剤として実施される。単回投与は特に好ましい。更に、Ｌ４段階の寄生性線虫、の弱毒化させた仔虫、好ましくはインビトロで少なくとも２日間は培養させた線虫仔虫の投与により繁殖不能免疫（ｓｔｅｒｉｌｅｉｍｍｕｎｉｔｙ）がもたらされることが驚くべきことに見いだされた。インビトロ培養の後にはこの弱毒化させた仔虫は最早体内では成長することはできないが、線虫での反復感染に対する効果的防御をもたらすことはできる。この様式で、フィラリア仔虫に対する繁殖不能免疫が初めて達成される。従って本発明は、活性成分としてＬ４段階の寄生性線虫の弱毒化された仔虫、ならびに適切な場合には薬剤学的に慣例とされている添加物、佐剤、および賦形剤を含む薬剤学的組成物にも関する。弱毒課された仔虫およびそれらを含む薬剤学的組成物は適切な場合には一つもしくは複数の既述の抗原と組み合わせて、寄生性感染症の予防および治療のために用いることができる。本出願は以下の実施例により更に詳細に説明される。実施例１メリオネスウングイクラトゥス（Ｍｅｒｉｏｎｅｓｕｎｇｕｉｃｕｌａｔｕｓ）からの防御抗血清の取得スナネズミ（Ｍｏｎｇｏｌｉａｎｇｅｒｂｉｌ）（Ｍ．ウングイクラトゥス（Ｍ．ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔｕｓ））を、各場合とも３日間の間隔で、各場合ともＡ．ビテアエ（Ａ．ｖｉｔｅａｅ）の１０〜２０匹の生きた感染性仔虫の皮下投与による初期感染に供した。血清の取得はこの初回感染後２５日目に実施した。感染を受けた動物では、Ａ．ビテアエ（Ａ．ｖｉｔｅａｅ）仔虫での後続の二次感染に対する防御を付与する防御抗体が形成された。この過程はＥｉｓｅｎｂｅｉｓｓら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２（１９９４）、７３５−７４２）に詳細に記載されている。同様に、生きたＬ４仔虫、ならびにインビトロで培養されたＬ３／Ｌ４およびＬ４仔虫の使用により防御抗血清を取得することも可能であった。各場合において３日の間隔で１０００匹の生きて脱皮したＨ．コントルトゥス（Ｈ．ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ）Ｌ３＋６＋７仔虫（脱皮したＬ３をインビトロで６日間培養し、その培地を棄却し、そしてこれらの仔虫を新鮮な培地で更に７日間インキュベートする）での３回の皮下感染、およびその初回感染の後２５日目の血清の採取によりＭ．ウングイクラトゥス（Ｍ．ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔｕｓ）からの防御抗血清を取得することも可能であった。更には、各場合とも１４日間の間隔で各１０００匹の生きたＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）Ｌ３８０％嗜眠性＋３時間（Ｌ４への脱皮前には８０％までが嗜眠相にあるＬ３仔虫集団をインビトロで３時間培養する）での３回の皮下感染、および初回感染後４６日目の血清の採取によりＭ．ウングイクラトゥス（Ｍ．ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔｕｓ）から防御抗血清を取得することも可能であった。この様式で取得された抗血清はＬ３〜Ｌ４の脱皮段階中に分泌される線虫抗原を認識する。実施例２線虫仔虫のインビトロ培養Ｍ．ウングイクラトゥス（Ｍ．ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔｕｓ）からのＡ．ビテアエ（Ａ．ｖｉｔｅａｅ）仔虫の単離は、Ｅｉｓｅｎｂｅｉｓｓ、Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．７７（１９９１）５８０−５８６、に記載される要領で実施した。この目的のためには、感染を受け、かつその後に屠殺されたスナネズミ（Ｍｏｎｇｏｌｉａｎｇｅｒｂｉｌｓ）の身体をＲＰＭＩ１６４０培地に添加し、そして粉砕した。仔虫を組織分画から単離し、そしてＲＰＭＩ中に保存した。異なる成熟段階にある仔虫を単離し、Ｌ３段階（感染後０〜６日目）にある仔虫、Ｌ３〜Ｌ４（感染後６〜７日目）の脱皮段階にある仔虫、およびＬ４段階（感染後８日目以降）にある仔虫と特定した。仔虫のインビトロ培養は、３７℃および５％ＣＯ₂下での、５００〜１０００匹（仔虫）／ｍｌ（培養培地ＲＰＭＩ１６４０）の濃度で実施した。実施例３培養培地の上清からの抗原の回収驚くべきことに、培養時間を０〜２、２〜４、４〜６、および６〜８日と明確に区切ることで、１３日令の仔虫（Ｌ４段階）の培養培地の上清中に高収率で抗原を検出することができた。一方でＬ４段階にある１１もしくは１７日令の仔虫は抗原の分泌は全く示さなかった。１４日令のＬ４仔虫と６〜７日令のｍＬ３仔虫は単離するには少なすぎる量でのわずかながらの抗原分泌を示した。抗原の検出は以下の要領でＥＬＩＳＡにより実施した；９６穴のマイクロタイタープレートを一晩、４℃で、１００μｌの１０００匹（仔虫）／ｍｌの粗精製培養培地と共にインキュベートした。この粗精製培地の３つの異なる希釈物、すなわち溶出用緩衝液（０．１ＭＫリン酸緩衝液ｐＨ７．０）中の１：１０、１：１００、および１：１０００を用いた。全ての穴を、溶出用緩衝液中の１５０μｌの３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１０％粉乳、および０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で遮断した。用いた一次抗体は、１％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む溶出用緩衝液中に１：４００で希釈され、その取得法が実施例１に記載されるＭ．ウングイクラトゥス（Ｍ．ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔｕｓ）からの抗−ｍＬ３防御抗血清であった。用いた二次抗体は、１：１５００に稀釈されたウサギ抗−Ｍ．ウングイクラトゥス（Ｍ．ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔｕｓ）免疫グロブリンＩｇＧであり、そして用いた三次抗体は１：２０００に希釈された、パーオキシダーゼとヤギからの抗−ウサギＩｇＧとの複合体であった。各抗体添加の間には、洗浄を各場合とも、１００μｌの溶出用緩衝液＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回実施した。最終的には０．０５％のＨ₂Ｏ₂を含むｏ−フェニレンジアミン（２００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ５．０、中の０．４ｍｇ／ｍｌ）を色素原として添加し、そしてその発色反応を１０μｌの１１ＭＨ₂ＳＯ₄ を用いて停止させた。これらの検査条件下では、１：１００の粗精製培養培地の希釈物でさえも免疫反応性抗原を検出することができた。実施例４分泌された抗原の取得法ＦＰＬＣゲル濾過法によりインビトロで培養され、回収された仔虫の培養上清から総計１２分画を分離することができた。これらの内の７分画が特に興味深く、なぜならそれらは顕著なものとして生ずる、および／または１００％まで免疫防御されている動物の血清からの抗体により抗原として認識されるかのいずれかであるためである。分離は０．５ｍｌ分画きざみで、スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）７５ＨＲ１０／３０ゲル濾過カラムで実施された。溶出は、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０で行った。免疫学的に適切な分画は、防御された動物からの血清を用いるＥＬＩＳＡにより決定された。６８ｋＤ、６６ｋＤ、６０ｋＤ、５６ｋＤ、５２ｋＤ、４４ｋＤ、４０ｋＤ、２９〜３０ｋＤ、２５ｋＤ、１８ｋＤ、１４ｋＤ、および＜４ｋＤで免疫学的に反応性を示す構成成分を認識することができた。最強のものは＜４ｋＤおよび６０ｋＤの分子量を持つ構成成分についてのピークであった。ＦＰＬＣカラムのための対照として単離された培養培地は蛋白質構成成分を含まなかった。実施例５アミノ酸分析のための蛋白質試料の調製実施例４で取得されるＦＰＬＣ分画内の蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥによりバンドに濃縮し、そしてその後に電気泳動的に担体膜に転移させた。Ｌ４仔虫１３日令の粗精製（分画化していない）培養上清の試料を用いる予備実験により、８００、４００、２１２、１８０、１１６、９４、９０、６７、６３、６０、５６、５２、４０、および１７ｋＤの範囲の分子量分散を有する１４本の蛋白質バンドが得られた。得られる蛋白質バンドを０．１μｍの孔隙サイズのニトロセルロース膜に電気泳動的に転移させた。後続の、Ｍ．ウングイクラトゥス（Ｍ．ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔｕｓ）防御抗血清、ウサギ抗−Ｍ．ウングイクラトゥス（Ｍ．ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔｕｓ）免疫グロブリンＩｇＧ、およびパーオキシダーゼでラベル化させた抗−ウサギＩｇＧ、ならびに適切な色素原を用いる「ウエスタン分析（ＷｅｓｔｅｒｎＡｎａｌｙｓｉｓ）」により免疫学的に適切な蛋白質バンドが得られた。その後に蛋白質含有性ＦＰＬＣ分画を蛋白質配列分析のために選択した。個々の分画は、４００μｌの溶出用緩衝液中に約７ｐモルの蛋白質を含んでいた。選択された分画を、大量の適用容積を小さな膜領域を通して濾過させることができる吸引装置を用い、濃縮させた形態でＰＶＤＦ膜に転移させた。この膜を水中で洗浄し、そして蛋白質配列決定時までアルゴン雰囲気下に保存した。抗原の配列決定により以下のＮ−末端アミノ酸準配列が取得された；（配列中、Ｘａａはいずれかの所望されるアミノ酸を表す）。同定された配列領域はメチオニンでは始まらないものの、天然蛋白質はそのＮ −末端から開始するように配列決定された。結局のところ、この蛋白質は恐らくもともとはリーダー配列を有していると思われた。実施例６免疫化実験１３日令のＬ４仔虫の培養培地の上清（免疫化用用量としての４８匹の仔虫の８００μｌの上清）により、後続の負荷感染（ｌｏａｄｉｎｇｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）に対するＭ．ウングイクラトゥス（Ｍ．ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔｕｓ）の有効な防御が示された。接種あたりのインビトロで培養された３６〜４８匹の仔虫の免疫化用量により、８０〜１００％の後続の負荷感染に対する防御が得られた。興味深いことに、少なくとも２日間インビトロで培養したＬ４仔虫の内のいずれもが宿主内では生存しなかった。我々は本明細書では、フィラリア症に対して最初に観察された「繁殖不能免疫（ｓｔｅｒｉｌｅｉｍｍｕｎｉｔｙ）」を取り扱う。実施例７他の線虫での免疫反応性構成成分の同定７．１スナネズミ（Ｍｏｎｇｏｌｉａｎｇｅｒｂｉｌｓ）（Ｍ．ウングイクラトゥス（Ｍ．ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔｕｓ））を、各場合とも線虫種モナネママルティニ（Ｍｏｎａｎｅｍａｍｏｒｔｉｎｉ）およびリトモソイデスシグモドンティス（Ｌｉｔｏｍｏｓｏｉｄｅｓｓｈｉｇｍｏｄｏｎｔｉｓ）の１５〜２０匹のｍＬ３仔虫で免疫化した。この免疫化によりＡ．ビテアエ（Ａ．ｖｉｔｅａｅ）での後続の負荷感染に対する有意な防御が得られた。同様に、Ａ．ビテアエ（Ａ．ｖｉｔｅａｅ）のｍＬ３仔虫でのアフリカシマネズミ（Ａｆｒｉｃａｎｓｔｒｉｐｅｄｍｉｃｅ）（レムニスコミスストリアトゥス（Ｌｅｍｎｉｓｃｏｍｙｓｓｔｒｉａｔｕｓ））の免疫化により、Ｍ．マルティニ（Ｍ．ｍａｒｔｉｎｉ）での後続の負荷感染に対する有意な防御が得られた。負荷感染の際に予備免疫化させた動物に投与された仔虫は完全に不活化されたか、もしくはその発達が強く阻害された。異種の種に対する宿主動物の反応は同種の種に対するものよりも更に大きかった。７．２同様に、線虫種ハエモンクスコントルトゥス（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓｃｏｎｔｏｒｔｕｓ）およびディロフィラリアイミティス（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａｉｍｍｉｔｉｓ）でのＭ．ウングイクラトゥス（Ｍ．ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔｕｓ）の初期感染の場合にＡ．ビテアエ（Ａ．ｖｉｔｅａｅ）での後続の負荷感染に対する防御を達成することが可能であった。７．３例えばカエノルハビディティスエレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｉｄｉｔｉｓｅｌｅｇａｎｓ）のような自由生活性の線虫でさえもＡ．ビテアエ（Ａ．ｖｉｔｅａｅ）に対する交差免疫化をスナネズミ（Ｍｏｎｇｏｌｉａｎｇｅｒｂｉｌｓ）Ｍ．ウングイクラトゥス（Ｍ．ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔｕｓ）において達成することができる。この目的のためには、予めインビトロで１．５〜３時間インキュベートしてあるＬ３／Ｌ４段階（Ｌ３／８０％嗜眠性仔虫）にあるＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）仔虫をＡ．ビテアエ（Ａ．ｖｉｔｅａｅ）による後続の感染に対するＭ．ウングイクラトゥス（Ｍ．ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔｕｓ）の免疫化のために利用した。免疫防御における改善が、例えば０、３０、および７３日目での投与のような、免疫化用投与間の時期を延長することにより達成された。実施例８他の線虫種からの抗原の免疫学的検出８．１線虫種Ｍ．マルティニ（Ｍ．ｍａｒｔｉｎｉ）、Ｌ．シグモイドンティス（Ｌ．ｓｉｇｍｏｄｏｉｔｉｓ）、およびＨ．コントルトゥス（Ｈ．ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ）のｍＬ３仔虫で免疫化させてあり、かつ負荷感染の後にＡ．ビテアエ（Ａ．ｖｉｔｅａｅ）の低い回収率を有したＭ．ウングイクラトゥス（Ｍ．ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔｕｓ）からの血清は、ＥＬＩＳＡにおいてはＡ．ビテアエ（Ａ．ｖｉｔｅａｅ）からの抗原に対する高い特異的交差反応性を示した（実施例３）。抗−Ｌ．シグモイドンティス（Ｌ．ｓｉｇｍｏｄｏｉｔｉｓ）血清および抗−Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）血清の両方は、陽性対照として用いられる同種抗血清と同定度に反応した。抗− Ｍ．マルティニ（Ｍ．ｍａｒｔｉｎｉ）および抗−Ｈ．コントルトゥス（Ｈ．ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ）血清も１３日令Ｌ４−Ａ．ビテアエ（Ａ．ｖｉｔｅａｅ）仔虫からの培養内地内の抗原を認識した。８．２線虫種Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）（Ｌ３８０％嗜眠性＋１．５もしくは３時間のインビトロでの培養）のＬ３仔虫の脱皮により分泌された抗原は、Ａ．ビテアエ（Ａ．ｖｉｔｅａｅ）、Ｍ．マルティニ（Ｍ．ｍａｒｔｉｎｉ）、およびＬ．シグモイドンティス（Ｌ．ｓｉｇｍｏｄｏｉｔｉｓ）で予め免疫化させてあるＭ．ウングイクラトゥス（Ｍ．ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔｕｓ）から得られる防御抗原により認識された。そのＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）抗原のウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロット分析により、約４６ｋＤ、６０ｋＤ、９７ｋＤ、１０９ｋＤ、２１２ｋＤ、および４００ｋＤ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のバンドが得られた。この６０ｋＤの抗原は成虫のＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）蠕虫により、そして脱皮しているＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）Ｌ３仔虫により発現される。他の抗原も成虫のＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）蠕虫により、そしてｍＬ３仔虫により発現され、かつ１３日令Ｌ４Ａ．ビテアエ（Ａ．ｖｉｔｅａｅ）仔虫により発現される対応抗原との免疫学的交反応を示す。培養上清のゲル濾過クロマトグラフィー分析により、約１４、１６、２６、２８、３０、４６、４９、５８、および６６ｋＤの分子量をもつ抗原を同定することも可能であった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 1/26 Ｃ０７Ｋ 1/26 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＨＵ，ＩＬ，ＪＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＫ，ＴＲ，ＵＡ，ＵＳ (72)発明者ロンデルスハウゼン，ミヒヤエルドイツ連邦共和国デー―40699エルクラート・ガリライシユトラーセ11 (72)発明者アイゼンバイス，ビルヘルム・フリードリヒドイツ連邦共和国デー―91093ヘスドルフ・ローエシユトラーセ15

Claims

【特許請求の範囲】１．Ｌ３〜Ｌ４の脱皮の段階にある線虫仔虫に対する防御抗血清と免疫学的に反応し、本質的に純粋形態をとる、線虫類からの単離された抗原であって、Ｌ４段階にある線虫仔虫のインビトロ培養およびその培養上清からの回収により取得することができる抗原。２．自由生活性線虫に由来することを特徴とする、請求の範囲１に記載の抗原。３．カエノルハビディティスエレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｉｄｉｔｉｓｅｌｅｇａｎｓ）に由来することを特徴とする、請求の範囲２に記載の抗原。４．寄生性線虫に由来することを特徴とする、請求の範囲１に記載の抗原。５．アカンソケイロネマビテアエ（Ａｃａｎｔｈｏｃｈｅｉｌｏｎｅｍａｖｉｔｅａｅ）、モナネママルティニ（Ｍｏｎａｎｅｍａｍａｒｔｉｎｉ）、ディロフィラリアイミティス（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａｉｍｍｉｔｉｓ）、ウーケレリアバンクロフティ（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａｂａｎｃｒｏｆｔｉ）、ブルギアマライ（Ｂｒｕｇｉａｍａｌａｙｉ）、ロアロア（Ｌｏａｌｏａ）、オンコケルカボルブルス（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａｖｏｌｖｕｌｕｓ）、オンコケルカオケンギ（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａｏｃｈｅｎｇｉ）、ドラクンクルスメディネンシス（Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｕｓｍｅｄｉｎｅｎｓｉｓ）、リトモソイデスシグモドンティス（Ｌｉｔｏｍｏｓｏｉｄｅｓｓｉｇｍｏｄｏｎｔｉｓ）、ハエモンクスコントルトゥス（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓｃｏｎｔｏｒｔｕｓ）、トリキネラスピラリス（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａｓｐｉｒａｌｉｓ）、もしくはトリクリスムリス（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓｍｕｒｉｓ）に由来することを特徴とする、請求の範囲４に記載の抗原。６．ゲル濾過クロマトグラフィーにより約４、１４、１８、２５、２９〜３０、４０、４４、５２、５６、６０、６６、もしくは６８ｋＤの分子量を有し、かつＡ．ビテアエ（Ａ．ｖｉｔｅａｅ）から取得できることを特徴とする、請求の範囲１〜５のいずれか一つに記載の抗原、またはそれらと免疫学的に交差反応する抗原。７．ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより約８００、４００、２１２、１８０、１１６、９４、９０、６７、６３、６０、５６、５２、４０、もしくは１７の分子量を有し、かつＡ．ビテアエ（Ａ．ｖｉｔｅａｅ）から取得できることを特徴とする、請求の範囲１〜５のいずれか一つに記載の抗原、またはそれらと免疫学的に交差反応する抗原。８．Ｄ．イミティス（Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ）、Ｍ．マルティニ（Ｍ．ｍａｒｔｉｎｉ）、Ｌ．シグモドンティス（Ｌ．ｓｉｇｍｏｄｏｎｔｉｓ）、Ｈ．コントルトゥス（Ｈ．ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ）、もしくはＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）に由来することを特徴とする、請求の範囲６もしくは７に記載の抗原。９．ゲル濾過クロマトグラフィーにより約１４、１６、２６、２８、３０、４６、４９、５８、および６６ｋＤの分子量を有し、かつＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）から取得できることを特徴とする、請求の範囲１〜５のいずれか一つに記載の抗原、またはそれらと免疫学的に交差反応する抗原。１０．ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより約４６、６０、９７、１０９、２１２、もしくは４００ｋＤの分子量を有し、かつＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）から取得できることを特徴とする、請求の範囲１〜５のいずれか一つに記載の抗原、またはそれらと免疫学的に交差反応する抗原。１１．約６０ｋＤの分子量、および（ａ）Ｎ−末端アミノ酸配列（この配列中、Ｘａａはいずれかの所望されるアミノ酸を意味する）、または（ｂ）（ａ）からの配列に少なくとも８０％相同なＮ−末端アミノ酸配列、を有することを特徴とする、請求の範囲６に記載の抗原。１２．セリン／スレオニン蛋白質キナーゼ活性を有することを特徴とする、請求の範囲５〜１１のいずれか一つに記載の抗原。１３．Ｌ４段階にある線虫の仔虫をインビトロで培養し、その培養上清を分離し、そして抗原をその培養上清から単離することを特徴とする、請求の範囲１〜１２のいずれか一つに記載の抗原の取得のための方法。１４．単離がゲル濾過クロマトグラフィー段階を含むことを特徴とする、請求の範囲１３に記載の方法。１５．感染後１３日目の段階にあるＡ．ビテアエ（Ａ．ｖｉｔｅａｅ）の仔虫を用いることを特徴とする請求の範囲１３もしくは１４に記載の方法。１６．活性成分としての請求の範囲１〜１２のいずれか一つに記載の一つもしくは複数の抗原、ならびに適切な場合には薬剤学的に慣習となっている添加物、賦形剤、および佐剤を含むことを特徴とする薬剤学的組成物。１７．線虫感染症の診断、予防、および治療のための、請求の範囲１〜１２のいずれか一つに記載の抗原の使用。１８．請求の範囲１〜１２のいずれか一つに記載の一つもしくは複数の抗原が薬剤学的に許容される形態で投与されることを特徴とする、線虫感染に対する免疫化方法。１９．活性成分としてのＬ４段階にある寄生性線虫の弱毒化させた仔虫、および適切な場合には薬剤学的に慣習となっている添加物、佐剤、および賦形剤を含むことを特徴とする、薬剤学的組成物。２０．弱毒化させた仔虫が少なくとも２日間のインビトロ培養に供されていることを特徴とする、請求の範囲１９に記載の組成物。２１．線虫感染症の予防および治療のためのＬ４段階にある寄生性線虫の弱毒化させた仔虫の使用。２２．弱毒化させた仔虫が少なくとも２日間のインビトロ培養に供されていることを特徴とする、請求の範囲２１に記載の使用。２３．請求の範囲１〜１２のいずれか一つに記載の一つもしくは複数の抗原と組合わされる、請求の範囲２１もしくは２２に記載の使用。２４．寄生性線虫の弱毒化された仔虫が薬剤学的に許容される形態で投与されることを特徴とする、線虫感染に対する免疫化方法。２５．弱毒化させた仔虫が少なくとも２日間のインビトロ培養に供されていることを特徴とする、請求の範囲２４に記載の方法。２６．投与が、請求の範囲１〜１２のいずれか一つに記載される一つもしくは複数の抗原と組合わされて行われることを特徴とする、請求の範囲２４もしくは２５に記載の方法。