JP2000500227A

JP2000500227A - 基本転写機構のレチノイドｘレセプターおよび成分

Info

Publication number: JP2000500227A
Application number: JP9510258A
Authority: JP
Inventors: エバンス，ロナルド，エム．; シュルマン，アイラ，ジー．
Original assignee: ザソールクインスチチュートフォアバイオロジカルスタディズ
Priority date: 1995-08-29
Filing date: 1996-07-24
Publication date: 2000-01-11
Also published as: EP0907886A1; AU717841B2; US5906920A; AU6508196A; CA2230637A1; WO1997008550A1

Abstract

(57)【要約】レチノイドＸレセプター（ＲＸＲ）は、ホモ二量体としてまたはレセプターのステロイド／甲状腺ホルモン上科の他の構成員とのヘテロ二量体としてホルモンシグナル形成経路の広汎な配置に関与している。本発明によれば、ＲＸＲのリガンド依存性トランス活性化機能が特定され、ＲＸＲが基本転写機構の成分と相互作用する能力が検討されている。イン・ビボおよびイン・ビトロ実験は、ＲＸＲリガンド結合ドメインはＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）の高度に保存された領域と直接に特定的およびリガンド依存性接触を行う。ＲＸＲによるリガンド依存性転写を減少させてイン・ビボおよびイン・ビトロでのＲＸＲ−ＴＢＰ相互作用を破壊する突然変異の能力は、ＲＸＲが基本転写機構と直接接触して活性化を行うことを示唆している。

Description

【発明の詳細な説明】基本転写機構のレチノイドＸレセプターおよび成分謝辞本発明は、国立衛生研究所によって付与された助成金第ＧＭ２６４４４号による政府の支持の下で行った。政府は、本発明において一定の権利を有する。発明の分野本発明は、核レセプターによって媒介される工程の調節法に関する。特定の側面では、本発明はこのような調節に有用な化合物の同定法並びにこれらの分析に有用な組成物に関する。発明の背景レセプターのステロイド／甲状腺ホルモン上科の構成員は、脊椎動物の発生、分化およびホメオスターシスに関与する複雑な遺伝子ネットワークの発現を制御している。これらのレセプターの限定的特徴は、一部はリガンドによって活性化される転写因子として機能するその能力にある。レチノイドＸレセプター（ＲＸＲ）は、このレセプターの上科の多くの構成員の機能および活性において中心的位置を占めている。例えば、レチノイン酸レセプター（ＲＡＲ）、甲状腺ホルモンレセプター（ＴＲ）、ビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）、ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプター（ＰＰＡＲ）および数種類のオーファンレセプターでヘテロ二量体を形成することによって、ＲＸＲはシグナル形成経路の様々な配置に関与している(Mangelsdorf et al.，Recent Prog．in Hormone Res．48:99-121( 1993))。ＲＸＲホモ二量体が９−シスレチノイン酸に応答する能力により、この核レセプターによって影響を受ける更にもう一つのシグナル成形経路が同定される。核レセプターの機能におけるＲＸＲの重要な役割は、脊椎動物のＲＸＲとDr osophilaの核レセプターultrospiricle との間で構造的および機能的に保存されることによって更に強調される(Oro et al.，Nature 347:298-301(1990); およびYao et al.，Cell 71:63-72(1992))。ＲＸＲ（および他の核レセプター）が転写を活性化する機構は、ほとんど知られていない。多くの検討により、レセプターのステロイド／甲状腺ホルモン上科のほとんどの構成員における２種類の独立したトランス活性化機能（タウドメイン；τ）が定義されている。これらの活性化機能としては、アミノ末端領域に存在する構成的活性化機能（τ１またはＡＦ−１）、およびカルボキシ末端の２００〜２５０アミノ酸に存在するリガンド依存性の活性化機能が挙げられる。核レセプターのカルボキシ末端ドメインは、複雑な、リガンド依存性の活性化を媒介するレセプターホモ−およびヘテロ二量体化およびリガンド結合である(Parker ，M.G.，Curr．Opin．in Cell Biol．5:499-504(1993);およびStunnenberg，H． G.，BioEassays 15:309-315(1993))。リガンドの結合は、レセプターの形態変化を誘発し、転写を活性化すると考えられる(Allan et al.，J．Biol．Chem．267: 19513-19520(1992); Beekman et al.，Mol．Endocrinol．7:1266-1274(1993); T oney et al.，Biochemistry 32:2-6(1993); Leid，M.，J．Biol．Chem．269:141 75-14181 (1994))。活性化したレセプターがどのようにしてそのシグナルを基本転写機構へ伝搬するかは、現在は知られていない。基本転写因子ＴＦＩＩＢと幾つかの核レセプターとの直接的相互作用が報告されている(Ing et al.，J．Biol．Chem．267:1761 7-17623(1992); Baniahmad et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:8832-8836 (1993); Fondell et al.，Gene & Devel．7:1400-1410(1993); Blanco et al.， Proc．Natl．Acad．Sci．USA 92:1535-1539(1995);およびMacDonald et al.，J ．Biol．Chem．270:4748-4752(1995))。核レセプター−ＴＦＩＩＢ相互作用は、リガンドによって影響されるとは思われない。実際に、ＴＲとＴＦＩＩＢとの間の相互作用は転写抑制と関連することがある(Baniahmad et al.，(1993)上記文献；およびFondell et al.，上記文献)。核レセプターによってリガンドにより活性化された転写に関与することが示唆される数種類の新規なタンパク質の同定 (Halachmi et al.，Science 264:1455-1458(1994); Jacq et al.，Cell 79: 107 -118(1994); Berkanstam et al.，Cell 69:401-412(1992); Cavailles et al.， Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:10009-10013(1994);およびLee et al.，Nature 374:91-94(1995))は、コアクティベーターまたは架橋因子も、リガンドによって活性化したレセプターから基本転写装置へのシグナルの伝達に関与することがあることを示唆している。活性化したレセプターがどのようにしてそのシグナルを基本転写機構へ伝搬するかについての理解が限られていることに鑑みると、当該技術で必要なことは、このシグナル発生過程についてより理解を深めることである。このようなシグナル発生に関与する基本転写機構の成分の同定は大きな価値があるであろう。このような成分の同定も、核レセプターに対する新規リガンドの分析法の開発を促進する。発明の簡単な説明本発明により、本発明者らは、ＲＸＲシグナル形成に関与する基本転写機構の成分を同定した。更に、本発明により、ＲＸＲのリガンド依存性トランス活性化機能を特定し、基本転写機構の成分と相互作用するＲＸＲの能力を検討した。イン・ビボおよびイン・ビトロ発現は、ＲＸＲリガンド結合ドメインがＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）の高度に保存された領域と直接特異的およびリガンド依存性接触を行うことを示している。ＲＸＲによるリガンド依存性転写を減少させてイン・ビボおよびイン・ビトロでＲＸＲ−ＴＢＰ相互作用を破壊する突然変異の能力は、ＲＸＲが基本転写機構と直接接触して活性化を行うことを示唆している。近年、リガンドによって活性化される転写に要するＲＸＲのカルボキシ末端での小さな領域が同定されている(Durand et al.，EMBO J．13:5370-5382(1994); Leng et al.，Mol．Cell．Biol．15:255-263(1995); およびZhang et al.，Mol ．Cell．Biol．14:4311-4323(1994))。ステロイドおよび甲状腺ホルモンレセプター上科のほとんどの構成員中に保存されているこの活性化ドメイン(Danielian et al.，EMBO J．11:1025-1033(1992))は、異種ＤＮＡ結合ドメインに融合するときには、構成的アクティベーターとして機能する。本発明により、ＲＸＲのトランス活性化特性を哺乳類およびSaccharomyces cerevisiae細胞で検討した。ＲＸＲτｃドメインが哺乳類およびS．cerevisiae で機能することができることから、ＲＸＲによって媒介される活性化経路が保存されていることが示唆される。イン・ビボおよびイン・ビトロの両実験は、ＲＸＲτｃドメインは、ＲＸＲリガンド結合ドメインとＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）の保存されたカルボキシ末端ドメインとの間の相互作用を媒介することを示している。ＲＸＲ τｃドメインまたはＴＢＰにおける突然変異はこの相互作用を破壊し、ＲＸＲ− ＴＢＰ相互作用はＲＸＲによるトランス活性化において機能的役割を演じていることを示唆している。図面の簡単な説明図１は、ＲＸＲτｃドメインにおける点突然変異のトランス活性化を誘発するＲＸＲの能力に対する影響を示す。図１Ａは、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン、およびヒトＲＸＲα（アミノ酸４４４〜４６２）の最後の１９個のアミノ酸、およびヒトＴＲα（アミノ酸３９１〜４１０）の最後の２０アミノ酸の融合によるトランス活性化の結果を表す。太文字は、ＲＸＲ４４４〜４６２配列に導入される突然変異である。点線は、総ての他のアミノ酸がＲＸＲ４４４〜４６２配列と同一であることを示している。ＧＡＬ４ＲＸＲ４４４〜４６２の活性は、１００％に設定した。図１Ｂは、ＧＡＬ４−ＲＸＲリガンド結合ドメイン融合（ＧＡＬ４ＲＸＲ１９７〜４６２）へ図１Ａに記載の点突然変異を導入することによって調製した構築物によるトランス活性化の結果を表す。ＧＡＬ４ＲＸＲ１９７〜４４３は、τｃ切断を表す。トランスフェクションの後、ＣＶ１細胞を１００ｎＭＬＧ６９（ＲＸＲ特異的リガンド）の存在下（黒塗り棒線）または非存在下（白塗り棒線）で３６時間培養した。リポーターのみに対するフォールド誘導を記録する。図２は、レセプターリガンド結合ドメインと基本転写機構の各種成分との間の相互作用を評価するための酵母のツー・ハイブリッド分析の結果を表す。図２Ａは、ＧＡＬ４活性化ドメインと、ＲＸＲ、ＲＡＲおよびＴＲとの間の融合を用いて得た結果を表す。活性化ドメイン融合をＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインとヒトＴＢＰの保存されたカルボキシ末端ドメインとの融合と共に、菌株Ｙ１９０に同時形質転換した。ここに示される結果は、レセプターリガンド結合ドメインとＴＢＰとの相互作用を示す。ＧＡＬ４活性化ドメインのみの活性をリガンドの非存在下にて測定した。β−ガラクトシダーゼ活性は、１μＭの９−シスレチノイン酸（ＲＸＲおよびＲＡＲ）または１μＭのＴＲＩＡＣ（ＴＲ）の存在下（黒塗り棒線）または非存在下（白塗り棒線）で１６時間成育した後に測定した。レセプターとＴＢＰの間の相互作用は、リガンドの非存在下では検出されない。図２Ｂは、ＲＸＲリガンド結合ドメイン突然変異体とＴＢＰとの相互作用を示している。９−シスレチノイン酸の存在下での活性だけを示す。９−シスレチノイン酸の非存在下では、突然変異体とＴＢＰとの間に相互作用は見られない。点突然変異体はＲＸＲのアミノ酸１９７〜４６２からなっている。ＲＸＲ１９７〜４４３はτｃ切断を表している。図２Ｃは、ヒトＴＢＰの代わりに全長のDrosopila ＴＡＦ１１０を用いて、図２Ａにまとめた実験を繰り返している。図２Ｄは、ＲＸＲリガンド結合ドメイン突然変異体とＴＡＦ１１０との間の相互作用を示している。９−シスレチノイン酸の存在下での活性だけを示している。突然変異体とＴＡＦ１１０との相互作用は、９−シスレチノイン酸の非存在下では見られない。図３はＴＢＰの基本反復における点突然変異により、イン・ビボでのＲＸＲとの相互作用が破壊されることを示している。図３ＡはＧＡＬ４活性化ドメインとＲＸＲ（アミノ酸１９７〜４６２）との融合を、ＧＡＬ４結合ドメインとヒトＴＢＰ（保存されたカルボキシ末端ドメイン、アミノ酸１５１〜３３５）との融合と共に宿主（菌株Ｙ１９０）に同時形質転換した。Ｙ２３３ｇ、Ｒ３２１Ｅ／Ｋ２３２Ｅ／Ｒ２３５Ｅ、Ｖ２３６ＧおよびＶ２３７Ｇは、ＴＢＰに導入されたアミノ酸の変化である。β−ガラクトシダーゼ活性は、実施例の節に記載の１μＭの９−シスレチノイン酸の存在下で１６時間成育した後に測定した。図３Ｂは、ＧＡＬ４活性化ドメインとＲＸＲτｃ突然変異体をＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインと図３Ａに記載のＴＢＰ突然変異体Ｖ２３７Ｇとの融合と共に宿主（菌株Ｙ１９０）に同時形質転換したときの結果を表す。β−ガラクトシダーゼ活性は、実施例の節に記載の１μＭの９−シスレチノイン酸の存在下（黒塗り棒線）または非存在下（白塗り棒線）で１６時間成育した後に測定した。点突然変異体は、ＲＸＲのアミノ酸１９７〜４６２からなっている。ＲＸＲ１９７〜４４３はτｃ切断を表している。ＡおよびＢの縮尺の違いに留意されたい。発明の詳細な説明本発明により、ＲＸＲのリガンド依存性の活性化機能（τｃ）の突然変異を用いて、リガンド依存性トランス活性化におけるこのドメインの役割を検討する。 τｃドメインは、疎水性および負に帯電した面を有する潜在的に両親媒性のαヘリックスをコードする。このドメインはＲＸＲによる転写のリガンド依存性活性化に必要であり、哺乳類細胞およびS．cerevisiae において異種ＤＮＡ結合ドメインに融合するときには転写を活性化するのに十分である。酵母のツー・ハイブリッド分析法およびイン・ビトロでのＧＳＴプル・ダウン実験を用いて、ＲＸＲリガンド結合ドメインＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ、図２および３を参照）の保存されたカルボキシ末端ドメインに存在する基本反復と直接かつ特異的に接触することを示した。ＲＸＲのトランス活性化能を減少してイン・ビボおよびイン・ビトロにおけるＲＸＲ−ＴＢＰ相互作用を破壊するτｃドメインにおける突然変異の能力は、この相互作用が機能的に有意であることを示唆している。ＲＸＲおよびＴＲはいずれも、ＴＦＩＩＤ複合体の第二成分であるＴＡＦ１１０（図２Ｂを参照）と相互作用する。機能性τｃドメインがＲＸＲ−ＴＡＦ１００の相互作用に必要でない（図２Ｃを参照）という知見は、ＴＡＦ１１０の相互作用は転写の活性化に十分でないことを示している。しかしながら、ＲＸＲが、互いに相互作用しないＴＦＩＩＤ複合体の２個の構成員と相互作用することができることは、レセプター機能にとって重要なことがある。したがって、本発明によれば、レチノイドＸレセプター（ＲＸＲ）の作動薬または拮抗薬である化合物を同定する方法が提供される。本発明の方法は、基本転写機構のトランス活性化依存性のリガンド依存性成分と有効に結合した（あるいは、ＲＸＲリガンド結合ドメインと有効に結合した）ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインを含んでなる第一の融合タンパク質、ＲＸＲリガンド結合ドメインと有効に結合した（あるいは、基本転写機構のトランス活性化依存性のリガンド依存性成分と有効に結合した）ＧＡＬ４活性化ドメインを含んでなる第二の融合タンパク質、ＲＸＲに対する前記の作動薬または拮抗薬と見なされているもの、およびリポーター遺伝子に有効に結合したＧＡＬ４応答要素を含んでなるリポーター構築物を接触させ、基本転写機構のトランス活性化とは独立したリガンド依存性成分と有効に結合したＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン（あるいは、ＧＡＬ４活性化ドメイン）を含んでなる第三の融合タンパク質、前記第二の融合タンパク質（あるいは、前記第一の融合タンパク質）、ＲＸＲに対する前記作動薬または拮抗薬と見なされているもの、および前記リポーター構築物を接触させた後、前記トランス活性化依存性のリガンド依存性成分、および基本転写機構の前記トランス活性化とは独立したリガンド依存性成分の存在下でトランス活性化を誘発する化合物を作動薬として同定し、基本転写機構の前記トランス活性化とは独立したリガンド依存性成分の存在下でトランス活性化を誘発するが、しかし基本転写機構の前記トランス活性化依存性のリガンド依存性成分の存在下では誘発しない化合物を拮抗薬として同定し、前記トランス活性化依存性のリガンド依存性成分または基本転写機構の前記トランス活性化とは独立したリガンド依存性成分のいずれの存在下でもトランス活性化を誘発することができない化合物をＲＸＲを含むホルモンによって媒介される経路の作動薬としてもまたは拮抗薬としても同定しないことを含んでなる。場合によっては、前記トランス活性化依存性のリガンド依存性成分または基本転写機構の前記トランス活性化とは独立したリガンド依存性成分のいずれの存在下でもトランス活性化を誘発することができない化合物を、ＲＸＲを結合する能力について更に試験することができる。結合しない化合物はＲＸＲの作動薬でも拮抗薬でもないが、ＲＸＲを結合する（が、基本転写機構の前記成分のいずれかの存在下でそのトランス活性化を誘発することができない化合物は、他の（すなわち、非ホルモンによって媒介される）シグナル形成経路に関与していると思われる。本発明の実施に用いられる各種構築物は、当該技術分野で周知である。したがって、ＧＡＬＤＮＡ結合ドメイン、ＧＡＬ４活性化ドメイン、ＧＡＬ４応答要素、および基本転写機構の各種構成員は、当該技術分野で十分に特定され、詳細に記載されている。例えば、酵母ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインは、少なくともその第一の７４アミノ酸を含んでいる（例えば、Keegan et al.，Sci ence 231:699-704(1986)）。好ましくは、ＧＡＬ４タンパク質の最初に９０以上のアミノ酸が用いられ、酵母ＧＡＬ４の最初の１４７個のアミノ酸残基が現在のところ最も好ましい。本発明の実施に用いられるＤＮＡ結合ドメインを含んでなるＧＡＬ４断片を、レセプタータンパク質ないの多数の部位のいずれかに組込むことができる。例えば、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインをレセプタータンパク質のアミノ末端に導入することができ、またはＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインをレセプターの天然のＤＮＡ結合ドメインの代わりに用いることができ、またはＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインをレセプタータンパク質のカルボキシ末端または当業者によって容易に決定することができる他の位置にに導入することができる。代表的なＧＡＬ４応答要素は、パリンドローム１７−マーの、 5'-CGGAGGACTGTCCTCCG-3' （配列番号：１）例えばWebster et al.，Cell 52:169-178(1988)に記載の１７ＭＸを含むもの、並びにその誘導体である。好適な応答要素の他の例としては、Hollenbergおよび Evans，Cell 55:899-906（1988）またはWebster et al.，Cell 54:199-207(1988 )に記載されているものが挙げられる。基本転写機構の多数の成分、例えばＴＢＰ、ＴＡＦ、ＴＡＦ１１０、ＴＦＩＩＡ、ＴＦＩＩＢ、ＴＦＩＩＤ、ＴＦＩＩＥ、ＴＦＩＩＦ、ＴＦＩＩＨ、ＳＵＧ１、ＴＲＩＰ１、ＴＩＦ１などが報告されている。基本転写機構の代表的なトランス活性化依存性／リガンド依存性成分としては、ＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）、ＳＵＧ１、ＴＲＩＲ１などが挙げられる。基本転写機構の代表的なトランス活性化とは独立したリガンド依存性成分は、ＴＢＰ突然変異体であるＴＡＦ１１０である。本発明の実施に使用が考えられるリポーター構築物は、 (a) 宿主細胞中で走査可能なプロモーター、 (b) ホルモン応答要素、および (c) リポータータンパク質をコードするＤＮＡセグメントを含み、リポータータンパク質コードＤＮＡセグメントは、ＤＮＡセグメントの転写のためのプロモーターに有効に結合しており、ホルモン応答要素は、その活性化のためのプロモーターに有効に結合している。本発明の実施に使用が考えられるホルモン応答要素は、１ヌクレオチドのスペーサーによって分離された２個以上の半部位の少なくとも１回の直接反復からなっている。スペーサーヌクレオチドは、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴのいずれか１つから選択することができる。本発明の実施に使用が考えられる応答要素の各半部位は、配列 -RGBNNM- （前記式中、ＲはＡまたはＧから選択され、ＢはＧ、ＣまたはＴから選択され、それぞれのＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧから独立して選択され、ＭはＡまたはＣから選択される）を含んでなり、但し、前記-RGBNNM-配列の少なくとも４個のヌクレオチドは配列-AGGTCA-の相当する位置におけるヌクレオチドと同一である。本発明の実施に用いられる応答要素は、場合によってはＮ_x（但し、ｘは０〜５の範囲にある）が先行することができる。現在のところ好ましい応答要素は、最小配列 AGGACA A AGGTCA （配列番号：２）の少なくとも１個のコピー（最も普通には１、２または３個のコピー）を含む。前記のように、最小配列は、場合によっては、例えば配列 GGACC AGGACA A AGGTCA CGTTC （配列番号：３）におけるように追加の残基が隣接することができる。代表的なリポーター遺伝子としては、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）などが挙げられる。代表的なプロモーターとしては、シミアンウイルス（ＳＶ）プロモーターまたはその改質形態（例えば、ΔＳＶ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、哺乳類腫瘍ウイルス（ＭＴＶ）プロモーターまたはその改質形態（例えばΔＭＴＶ）などが挙げられる（例えば、Mangelsdorf et al.，Nature 345:224-229(1990); Mangelsdorf et al.，Cell 66:555-561（1991）、およびB erger et al，J．Steroid Biochem．Molec．Biol．41:733-738(1992)）。本明細書で用いられる「有効なリポーター遺伝子に機能的に結合した有効な応答要素」という用語において、「有効」という語は、（「ＧＡＬ４応答要素」および「リポーター遺伝子」という用語によって表される）それぞれのＤＮＡ配列が操作でき、すなわち所期の目的に対して働くことを意味し、「機能的に」という語は、リガンド−レセプター複合体によって適当に活性化して、２個のセグメントが結合した後、「ＧＡＬ４応答要素」が「作動し」あるいは活性化した結果としてリポーター遺伝子が発現されることを意味している。任意の細胞系を、本発明の実施に使用が考えられる機能的バイオアッセイの適当な「宿主」として用いることができる。したがって、本発明の実施に使用が考えられる細胞としては、形質転換細胞、非形質転換細胞、腫瘍細胞、様々な細胞型の一次培養物などが挙げられる。本発明の実施に用いることができる代表的な細胞としては、Schneider 細胞、ＣＶ−１細胞、ＨｕＴｕ８０細胞、Ｆ９細胞、ＮＴＥＲＡ２細胞、ＮＢ４細胞、ＨＬ−６０細胞、２９３細胞、HeLa細胞、酵母細胞などが挙げられる。機能的バイオアッセイ型に用いられる好ましい宿主細胞は、ＣＯＳ細胞およびＣＶ−１細胞である。ＣＯＳ−１（ＣＯＳと表される）細胞はＳＶ４０Ｔ抗原（Ｔａｇ）を発現するサル腎細胞であり、ＣＶ−１細胞はＳＶ４０Ｔａｇを発現しない。ＣＯＳ−１誘導体系にＴａｇが存在すると、導入された発現プラスミドを複製することができ、アッセイ期間中に産生されるレセプターの量が相対的に増加する。ＣＶ−１細胞は現在のところ好ましいが、これは遺伝子導入研究について特に好都合であり、感受性が高く詳細に報告された宿主細胞系を提供するからである。前記細胞（またはその画分）は、生理活性化合物と接触するときには、生理学的条件下に保持される。「生理学的条件」は、約３７℃の温度において、等張性の水性栄養培地を含むことは当業者によって容易に理解される。本発明のアッセイにおいて、ＲＸＲ−ＴＢＰ相互作用はリガンドとは独立している。本発明のアッセイおよびトランス活性化実験は、ＬＧ６９および９−シスレチノイン酸についてのＫ_d値をかなり上回るリガンド濃度で行われる (Allegretto et al.，J．Biol．Chem．268:26625-26633(1993))ので、リガンドの親和性における小さな変化は、有意な影響を与えるとは思われない。ＲＸＲτ ｃドメイン突然変異体がリガンド依存性の様式でＴＡＦ１１０と相互作用し（図２Ｄ参照）イン・ビトロでリガンドと結合することができることは、突然変異体とＴＢＰとの間の相互作用の不在は、リガンド結合の欠損からは生じないことを示している。総合すると、これらの結果は、ＲＸＲτｃドメインがＴＢＰと直接相互作用し、この相互作用はリガンドによって制御されることを示唆している。この結論はＧＡＬ４−τｃドメイン融合とＴＢＰとのイン・ビトロ相互作用によって支持される。最後に、ＴＢＰに第二の部位突然変異を導入することによってＲＸＲτｃドメイン突然変異体およびＴＢＰの間の相互作用を回復することができることは、τｃドメインが直接にＴＢＰと相互作用するという結論を更に支持している。多数の因子がＴＢＰの基本反復と接触することができることは、ＴＢＰのこのドメインと相互作用がトランス活性化の共通機構を表すことができることを示唆している。ＲＡＲおよびＴＲはＴＢＰと相互作用しないという観察（図２Ａを参照）は、異なるＲＸＲ／核レセプターヘテロ二量体が転写機構の様々な成分と接触することによって転写を活性化することができることを示唆している。この結論は、ＲＸＲのリガンド応答性をヘテロ二量体ペアリングによって改質することができるという観察と一致している。ＲＸＲτｃドメインにおける突然変異がヘテロ二量体によるトランス活性化に悪影響を及ぼすことができることは、ＲＸＲτｃドメインがヘテロ二量体として複合体形成するときには、基礎転写機構の異なるコアクティベーターまたは成分に再度方向設定することができる。本発明のもう一つの態様によれば、９−シス−レチノイン酸に結合する能力を保持しているが、９−シス−レチノイン酸によっては活性化されないＲＸＲ突然変異体が提供される。このような突然変異体の例としては、ＲＸＲ突然変異体Ｄ４４４Ａ、ＲＸＲ突然変異体Ｔ４４５Ａ、ＲＸＲ突然変異体Ｐ４４６Ａ、ＲＸＲ突然変異体１４４７Ａ、ＲＸＲ突然変異体Ｄ４４８Ａ、ＲＸＲ突然変異体Ｔ４４９Ａ、ＲＸＲ突然変異体Ｆ４５０Ｐ、ＲＸＲ突然変異体Ｌ４５１Ａ、ＲＸＲ二重突然変異体Ｍ４５４Ａ，Ｌ４５５Ａ、ＲＸＲ二重突然変異体Ｅ４５３Ｋ、Ｅ４５６Ｋ、ＲＸＲ突然変異体Ｍ４５２Ａなどが挙げられる。本発明の更にもう一つの態様によれば、レチノイドＸレセプターの作動薬を同定する方法が提供される。本発明の方法は、前記のＲＸＲ突然変異体を含む（すなわち９−シス−レチノイン酸に結合する能力を有するが、９−シス−レチノイン酸によって活性化される能力を欠いている）細胞を推定ＲＸＲリガンドと接触させ、前記細胞がリポーター遺伝子に有効に結合したＲＸＲ応答要素を含み、次いで、リポーター遺伝子生成物の発現を監視することを含んでなる。この態様の別の側面では、レチノイドＸレセプターの拮抗薬を同定する方法も提供される。この方法は、（前記の）ＲＸＲ突然変異体を含む細胞を一定量のＲＸＲ作動薬および可変量の推定拮抗薬と接触させ、前記細胞がリポーター遺伝子に有効に結合したＲＸＲ応答要素を含み、次いで、リポーター遺伝子生成物の発現を前記試験細胞に投与した推定拮抗薬の量の関数として監視することを含んでなる。本発明の更にもう一つの態様によれば、レチノイドＸレセプターと基礎転写機構の１以上の成分とのリガンド依存性相互作用を検出する方法が提供される。本発明の方法は、基本転写機構の第一の成分と有効に結合した（あるいは、ＲＸＲリガンド結合ドメインと有効に結合した）ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインを含んでなる第一の融合タンパク質、ＲＸＲリガンド結合ドメインと有効に結合した（あるいは、基本転写機構の第一の成分と有効に結合した）ＧＡＬ４活性化ドメインを含んでなる第二の融合タンパク質、ＲＸＲリガンド、およびリポーター遺伝子に有効に結合したＧＡＬ４応答要素を含んでなるリポーター構築物を接触させ、前記リポーターの発現を監視することを含んでなる。本発明のこの態様の別の側面によれば、前記の接触および監視段階を、異なる第一の融合タンパク質（または異なる第二の融合タンパク質）であって、元の第一（第二）の融合タンパク質ではなく基本転写機構の異なる成分を含むことによって元の第一（第二）の融合タンパク質とは異なるものを用いて、繰り返すことができる。この追加段階により、基本転写機構の転写依存性／リガンド依存性および転写独立／リガンド依存性成分を両方とも同定することができ、これは前記アッセイを行うのに有用である。本発明を、下記の非制限的例に関して更に詳細に説明する。例１プラスミドの調製 S．cerevisiae における組込みのため、プラスミドｐＲＳ３０５ＣＹＨを、ＡＤＨプロモーター、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン（アミノ酸１〜１４７）、インフルエンザ赤血球凝集素エピトープおよびポリリンカーを記載順に含むｐＡＳ１−ＣＹＨ２（S．Elledge、Baylor College of Medicineより寄贈）のＢｇｌＩＩ−ＳａｌＩ断片をクローニングしてＢａｍＨＩ−ＳａｌＩで消化されたｐＲＳ３０５とすることによって構築した(Sikorski およびHieter，Genetics 122:19- 27(1989))。 S．cerevisiae でヒトＴＢＰ突然変異体のＧＡＬ４−ＤＮＡ結合ドメイン融合を発現させるため、プラスミドｐＧ６Ｈを、ｐＡＳ１−ＣＹＨ２からＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン−インフルエンザ赤血球凝集素エピトープ−ポリリンカーのＰＣＲ増幅によって構築した。６個のヒスチジンをコードする配列を、５′オリゴヌクレオチドにおけるＧＡＬ４の開始剤メチオニンの直後に含めた。増幅した生成物を連結してＢａｍＨＩで消化したｐＧ−１とした(Schene et al.，「酵母における構成的および誘導性遺伝子発現のベクター(Vectors for constitutive and inducible gene expression in yeast)、Guthrie およびFink（監修）、（A cademic Press，Inc.、サン・ディエゴ）、３８９〜３９８頁（１９９１年））。ＣＶ１細胞でＧＡＬ４−ＤＮＡ結合ドメイン融合を発現するため、プラスミドｐＣＭＸＧ４ｅｐｉを、ｐＡＳ１−ＣＨＹ２からＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン −インフルエンザ赤血球凝集素エピトープ−ポリリンカーのＰＣＲ増幅およびクローニングによってＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩで消化したｐＣＭＸとすることによって構築した(Umesono et al.，Cell，65:1255-1266(1991))。最適の哺乳類の翻訳開始配列を５′オリゴヌクレオチドに含めて、ＧＡＬ４のアミノ末端に導入した。レセプターリガンド結合ドメイン融合を、ヒトＲＸＲα（アミノ酸１９７〜４６２）、ヒトＲＡＲα（アミノ酸１８６〜４６２）、およびヒトＴＲα（アミノ酸１２１〜４１０）のＰＣＲ増幅によってクローニングした。τｃドメイン（ＲＸＲ１９７〜４４３）の切断を有するリガンド結合ドメイン融合を前記と同様に増幅したが、イン・フレーム停止コドンを適当な位置で３′オリゴヌクレオチドに導入した。 τｃドメイン融合に対して、ヒトＲＸＲαのアミノ酸４４４〜４６２およびヒトＴＲαの３９１〜４１０をＰＣＲによって増幅した。点突然変異を、適当な塩基の変更を有するオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲによってＲＸＲτｃドメインに導入した。増幅生成物をＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩで消化したｐＲＳ３０５ＣＹＨに連結した。ＣＶ１細胞で発現させるため、ｐＲＳ３０５ＣＹＨクローンからの適当な制限断片をｐＣＭＸＧ４ｅｐｉにサブクローンした。ツー・ハイブリッドアッセイのため、ＲＸＲ、ＲＡＲおよびＴＲのＧＡＬ４− 活性化ドメイン融合を前記同じ増幅生成物をＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩで消化したｐＡＣＴＩＩにクローニングすることによって構築した(S．Elledge，Baylor Coll ege of Medicine; Durfee et al.，Gene & Development 7:555-569(1993) を参照されたい）。ヒトＴＢＰ（ｐＡＳ＋ｈ１８０ｃ）、全長DrosophilaＴＡＦ１００および全長 DrosophilaＴＡＦ４０（ｐＡＳ＋ｄＴＡＦ４０）のＣ−末端ドメインを発現するＧＡＬ４−ＤＮＡ結合ドメイン融合がG．Gill およびR．Tjianによって提供された(UC Berkeley;Hoey et al.，Cell 72:247-260(1993)を参照)。ヒトＴＢＰ（アミノ酸１５５〜３３５）を２個の断片でのＰＣＲによって増幅した。点突然変異を適当なオリゴヌクレオチドに導入した。ＰＣＲの後に、２個の断片をＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩで消化したｐＧ６Ｈにクローニングした。ヒトＴＦＩＩＢのＧＡＬ４−ＤＮＡ結合ドメイン融合をヒトｃＤＮＡのＰＣＲ増幅によって作成し、ｐＧ６ＨのＢａｍＨＩ部位にクローニングした。ＧＳＴ−ＲＸＲ１９７−４６２を、ヒトＲＸＲαから適当な配列のＰＣＲ増幅によって構築した。増幅生成物を、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩで消化したｐＧＥＸ２ＴＫにクローニングした。総てのＰＣＲから誘導した構築物は、配列決定によって確かめた。プラスミドｐＧＥＸ−ＴＢＰは、Dr．I．Verma(Salk Institute) の厚意により寄贈を受けた（Kerr et al.，Nature 365:412-419(1993)を参照）。ヒトＲＸＲα、ヒトＲＡＲαおよびヒトＴＲβのリガンド結合ドメインを発現する哺乳類の発現構築物は別に報告されている(Forman et al.，Cell 81:541-550( 1995))。ＴＫプロモータールシフェラーゼ融合のＧＡＬ４上流についての３個の結合部位を含むルシフェラーゼリポーターＧＡＬ３−ＴＫ−ＬＵＣは、Dr．P.N．Rnaga rajanから寄贈された。ＧＡＬ３−ＴＫ−ＬＵＣは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位でＴＫ −ＬＵＣのＴＫプロモーターの上流にクローニングした二本鎖ＧＡＬ４応答要素の３個のコピーを含んでいる。ＴＫ−ＬＵＣは下記のようにして調製した。ＭＴＶ−ＬＴＲプロモーター配列をHollenbergおよびEvans，Cell 55:899-906(1988) に記載のＭＴＶ−ＬＵＣプラスミドからＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ消化によって取り出し、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子プロモーターのＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩ断片(プラスミドｐＢＬＣＡＴ２から単離した転写開始部位ｍに対して−１０５〜＋５１、Luckow & Schutz，Nucleic Acids Res．15:5 490(1987))でクローニングして、親構築物ＴＫ−ＬＵＣを生成した。例２酵母菌株および方法菌株Ｙ１９０（ＭＡＴａｇａｌ４ｇａｌ１８０ｈｉｓ３ｔｒｐ１−９０１ａｄｅ２−１０１ｕｒａ３−５２ｌｅｕ２−３，−１１２ｃｙｈ^r ＵＲＡ３：：ＧＡＬ１−−＞ｌａｃＺＬＹＳ２：：ＧＡＬ１−−＞ＨＩＳ３； S．Elledge（Baylor College of Medicine）から寄贈；Ｙ１９０は、Durfee et al.,前記文献に記載のＹ１５３から誘導される）を総ての実験に用いた。β−ガラクトシダーゼアッセイには、３種類の独立した形質転換体の最小量を、適当なアミノ酸を補足した最小培地（０．６６％ＹＮＢ、２％グルコース）中で、３０ ℃にて一晩成育した。細胞を新鮮な培地中に１：２０に希釈し、所望ならば３，３′，５−トリヨードチロ酢酸（ＴＲＩＡＣ）の９−シスレチノイン酸を加えた。β−ガラクトシダーゼ活性を、Rose et al．著、酵母遺伝学の方法(Methods i n yeast genetics)（Cold Spring Harbor Laboratory Press,コールド・スプリング・ハーバー）（１９９０年）に記載の方法で３０℃で１６時間成育した後に測定した。例３トランスフェクションＣＶ１細胞を１０％活性炭−樹脂で分離したウシ胎児血清を補足したＤＭＥＭに２×１０⁴細胞／ウェルの濃度で４８穴プレートで培養した。３７℃で１２〜１６時間成育した後、細胞をＤＯＴＡＰトランスフェクション試薬を用いて製造業者(Boehringer Mannheim)の指示にしたがってトランスフェクションした。それぞれのウェルについて、ＧＡＬ３−ＴＫ−ＬＵＣリポーター１２ｎｇ、適当な発現構築物３６ｎｇ、および内部コントロールとしてｐＣＭＸ−βｇａｌＤＮＡ６０ｎｇをトランスフェクションした。ＤＮＡを、１０％活性炭−樹脂で分離したウシ胎児血清を補足したＤＭＥＭ２００μｌと共に導入した。細胞をＮＤＡと共に３７℃で５時間インキュベーションした。次いで培地を除いて、細胞を新鮮な培地で洗浄し、９−シスレチノイン酸、Ｔ₃（３，３′，５−トリヨード− Ｌ−チロニン）またはビタミンＤ₃を含むまたは含まない培地２００μｌを加えた。ＲＸＲに特異的なリガンドＬＧ６９（４−［１−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル−１−エテニル］安息香酸）およびＲＡＲに特異的なリガンドＡＭ５８０（４−（５，６，７，８− テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタミド）安息香酸も用いた。３７℃で３６時間成育した後に、細胞を回収した。それぞれの試料のルシフェラーゼ活性を、β−ガラクトシダーゼ活性の水準によって規格化した。それぞれのトランスフェクションは２試料で行い、少なくとも３回繰り返した。記録した折り畳み誘導(fold induction)は、それぞれの実験に含まれるＧＡＬ３−ＴＫ−ＬＵＣリポーターのみに対するものである。例４ＲＸＲ−ＴＢＰ相互作用アッセイＧＳＴ−融合タンパク質を、製造業者(LKB-Pharmacia)の指示にしたがって、誘導し、可溶化して、グルタチオンビーズに結合した。グルタチオンビーズに結合した後、懸濁液１５μｌを、適当な³⁵Ｓで標識したイン・ビトロで翻訳したタンパク質１〜２μｌと共にＮＥＴＮ（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭＫＣｌ、０．７ｍＭＥＤＴＡ、０．５％ＮＰ４０、１ｍＭＰＭＳＦ）５００μｌ中で１時間インキュベーションした。インキュベーションの後、ビーズをＮＥＴＮで３回洗浄した。結合したタンパク質を×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液２０μｌで溶出し、ＳＤＳ−１０％ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動により分離した。イン・ビトロで翻訳したＧＡＬ４融合とＧＳＴ−ＴＢＰとの相互作用を、下記の改良点を有する前記手続を用いて行った。初期相互作用はＫＣｌを０．３ＭＮａＣｌに代え、脱脂乾燥乳を加えて最終濃度を０．５％（ｗ／ｖ）としたＮＥＴＮ中で行った。インキュベーションの後、ビーズを、ＮａＣｌ濃度を０．５Ｍまで増加させ、脱脂乾燥乳を加えて最終濃度を０．５％（ｗ／ｖ）としたＮＥＴＮで３回洗浄した。固定の後、ゲルを１Ｍサリチル酸で処理して、乾燥し、オートラジオグラフィ処理を行った。例５ＲＸＲτｃドメインの突然変異誘発ＲＸＲのカルボキシ末端の１９個のアミノ酸およびＴＲの２０個のアミノ酸は、異種ＤＮＡ結合ドメインに融合すると、転写を活性化することが示されている（図１；Durand et al.,前記文献；Leng et al.,前記文献; Zhang et al.，前記文献; Baniahmad et al.，Mol．Cell．Biol．15:76-86(1995); Barettino et al .，EMBO J．13:3039-3049(1994); およびTone et al.，J．Biol．Chem．269: 31 157-31161(1994)）。この領域は、疎水性および負に帯電した面を有する両親媒性αヘリックスを形成することが提案されている（Danielian et al.，前記文献）。図１Ａは、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインおよびとヒトＲＸＲαの最後の１９個のアミノ酸の突然変異体（アミノ酸４４４〜４６２）およびヒトＴＲαの最後の２０個のアミノ酸（アミノ酸３９１〜４１０）の融合によるトランス活性化の結果を示している。これらの構築物をリポーターＧＡＬ３−ＴＫ−ＬＵＣと共にＣＶ１細胞にトランスフェクションし、または前記の組込まれたＧＡＬ１−ｌａｃＺリポーターを含むS．cerevisiae 菌株Ｙ１９０のゲノムに組込んだ。ＣＶ１細胞のトランスフェクションの結果を、β−ガラクトシダーゼ発現プラスミドで同時トランスフェクションすることによって規格化した。S.cerevisiae抽出物のウェスターンブロットでは、ＧＡＬ４融合は同様な水準で発現することを示している。ＲＸＲのカルボキシ末端の１９個のアミノ酸（図１Ａ）の突然変異は、数個の他のトランス活性化ドメインと同様に、疎水性で酸性のアミノ酸が機能にとって極めて重要であることを示している(CressおよびTriezenberg，Science 251:87- 90(1991))。ヘリックスの疎水性面内で、位置４５０でのフェニルアラニンのプロリンへの（Ｆ４５０Ｐ）、位置４５１でのロイシンのアラニンへの（Ｌ４５１Ａ）、二重突然変異体メチオニン４５４のアラニンへの／ロイシン４５５のアラニンへの（Ｍ４５４Ａ／Ｌ４５５Ａ）個々の変化により、哺乳類およびS．cerev isiae細胞において単離したτｃドメインに関して分析するときには、転写を活性化するＧＡＬ４機能の能力が著しく減少する。ヘリックスの帯電した面での二重突然変異体グルタミン酸４５３のリシンへの／グルタミン酸４５６のリシンへの（Ｅ４５３Ｋ／Ｅ４５６Ｋ）変化により、単離したτｃドメインの転写を活性化する能力も少なくなる（図１Ａ）。単一突然変異Ｅ４５３ＫおよびＥ４５６Ｋは、転写を約６０〜７０％減少させる。しかしながら、メチオニン４５２からアラニンへの突然変異（Ｍ４５２Ａ）は、ほとんど影響を及ぼさない。これらの同一の突然変異の完全なリガンド結合ドメイン（図１Ｂ）または完全長レセプターへの組み入れにより、ＲＸＲ特異的リガンドに応答して転写を活性化するこれらの突然変異体ＲＸＲの能力が減少する。重要なことには、１９個のアミノ酸の切断（ＧＡＬ４ＲＸＲ１９７〜４４３）によっても、転写を活性化することができないレセプターを生成する（図１Ｂ）。ＧＡＬ４ＲＸＲ１９７〜４４３で見られたリガンド依存性転写の減少は、リガンド結合の欠損から生じるとは思われない（図２Ｄを参照されたい）。総合すれば、これらの結果により、ＲＸＲの最後の１９個のアミノ酸はトランス活性化に必要且つ十分であることが確認され、ヘリックス残基の疎水性および帯電した面が共にこの機能にとって重要であることを示している。例６ＲＸＲはＴＡＴＡ結合タンパク質と相互作用する哺乳類およびS．cerevisiae 細胞では、ＲＸＲτｃドメインの突然変異が定量的に同様な効果を有するという知見（図１Ａ）は、ＲＸＲが転写機構の構造的および機能的に保存された成分と直接接触していることを示唆している。この観察は、ステロイドおよび甲状腺ホルモンレセプター上科の構成員を含む幾つかの他の転写因子が基本転写機構の成分と相互作用するという知見と一致している(Ing et al.,前記文献; Baniahmad et al.，(1993)前記文献; Fondell et al.，前記文献; Blance et al.,前記文献; およびMacDonald et al.，前記文献)。したがって、本発明者らは、ＲＸＲと、ＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）、ＴＡＦ１１０、ＴＡＦ４０およびＴＦＩＩＢなどの幾つかの基本転写因子との相互作用を、酵母ツー・ハイブリッド系(FieldおよびSong，Nature 340:245-246(1989); Du rfee et al.，Genes & Devel．7:555-569(1993))およびイン・ビトロタンパク質 −タンパク質相互作用アッセイを用いて検討した。図２Ａに示されるように、ツー・ハイブリッドアッセイでは、ＲＸＲと、ＴＢＰの保存されたカルボキシ末端ドメインとの間に特異的でリガンド依存性相互作用が検出される。したがって、ＧＡＬ４活性化ドメイン、およびＲＸＲ、ＲＡＲおよびＴＲ、およびＲＸＲτｃ突然変異体の融合を、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインおよびヒトＴＢＰ（図２Ａおよび２Ｂを参照）または全長DrosophilaＴＡＦ１１０（図２Ｃおよび２Ｄを参照）の保存されたカルボキシ末端ドメインとの融合と共に同時形質転換した。β−ガラクトシダーゼ活性を、１μＭ９−シスレチノイン酸（ＲＸＲおよびＲＡＲ）または１μＭＴＲＩＡＣ（ＴＲ；図２Ａおよび２Ｃを参照）の存在下（黒棒線）または非存在下（白棒線）で１６時間成育した後に測定した。レセプターリガンド結合ドメインと、ＴＢＰおよびＴＡＦ１１０との相互作用を、それぞれ図２Ａおよび２Ｃに示す。ＧＡＬ４活性化ドメイン単独での活性は、リガンドの非存在下だけで測定した。図２Ａおよび２Ｃの間の尺度の違いに留意されたい。ＲＸＲリガンド結合ドメイン突然変異体、およびＴＢＰおよびＴＡＦ１１０の間の相互作用を、それぞれ図２Ｂおよび２Ｄに示す。９−シスレチノイン酸の存在下での活性のみを示す。突然変異体と、ＴＢＰまたはＴＡＦ１１０との間の相互作用は、９−シスレチノイン酸の非存在下では検出されない。点突然変異体は、ＲＸＲのアミノ酸１９７〜４６２からなる。ＲＸＲ１９７〜４４３は、τｃ切断を表している。S．cerevisiae のウェスターンブロットでは、ＧＡＬ４−活性化ドメイン融合は同様な水準で発現されることを示している。ＴＡＦ４０と、ＲＸＲ、ＲＡＲまたはＴＲとの間の相互作用も試験したが、検出されなかった。ＴＲとＴＦＩＩＢとの間に、相互作用が検出された。ＲＸＲが転写を活性化する能力（図１）を減少させるＲＸＲτｃドメインの突然変異は、ＲＸＲとＴＢＰとの間の検出可能な相互作用を減少させる（図２Ｂ）。ＴＲおよびＲＡＲは、ＲＸＲτｃドメインに対して有意な配列相同性を示すτ ｃドメインを有するが、ＴＲまたはＲＡＲとＴＢＰとの間の相互作用は検出されない（図２Ａ）。しかしながら、ＴＲの同じ領域は、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインに融合すると、S.cerevisiaeで転写を活性化する。ＲＡＲとＴＢＰ、またはＴＲとＴＢＰとの間に相互作用を検出することができないことから、ＲＸＲホモ二量体によるトランス活性化は、ＲＡＲおよびＴＲヘテロ二量体によるトランス活性化よりは転写機構の異なる成分を用いることができることが示唆される。図２Ｃは、ＲＸＲがＴＦＩＩＤ複合体の第二成分ＴＡＦ１１０とリガンド依存性相互作用を行うことができることも示している。ＲＸＲとＴＡＦ１１０との間の相互作用は、τｃドメイン突然変異体を分析するときでも検出可能であり、τ ｃドメインの機能状態が相互作用にとって重要ではないことを示している（Ｒ× ２Ｄ）。しかし、転写上の欠損を有するＲＸＲ突然変異体とＴＡＦ１１０との間のリガンド依存性相互作用を検出することができることは、ＲＸＲτｃドメインにおける突然変異はリガンド結合に大きな影響を及ぼさないことを示唆している。ＴＲ（図２Ｃ）もＴＡＦ１１０と相互作用するという観察は、この基本因子が多重核レセプターの普通の標的となることができることを示唆している。ツー・ハイブリッドアッセイの結果は、ＲＸＲがＴＢＰと直接タンパク質−タンパク質相互作用を行うことを示唆しているが、この相互作用が保存されたコアクティベーターによって媒介される可能性は、このアッセイによって除外することはできない。ＲＸＲとＴＢＰとの間の相互作用を更に特定するため、ＴＢＰが、細菌により発現されるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼＲＸＲ融合タンパク質とイン・ビトロで相互作用する能力を検討した。したがって、ＧＳＴプル・ダウン実験を下記のようにして行った。ＴＢＰを前記のようにイン・ビトロで転写して、翻訳し、コマジーで染色したゲルによって測定される固定された等量のＧＳＴ−ＲＸＲ１９７〜４６２またはＧＳＴ−ＲＸＲ−Ｅ４５３Ｋ／Ｅ４５６Ｋ）とインキュベーションした。ビーズを十分に線状した後、結合したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって溶出して分割し、ゲルをオートラジオグラフィ用に加工した。添加を行うときに、１．０μＭの９−シスレチノイン酸を総ての緩衝液に含ませた。暴露時間は２時間であった。これらの条件下では、ＴＢＰとＧＳＴ単独との間には相互作用はほとんどまたは全く見られない。したがって、ＧＳＴプル・ダウン実験では、イン・ビトロで翻訳されたＴＢＰおよびＧＳＴ−ＲＸＲ１９７−４６２の間に強力な相互作用が示される。ＧＳＴ −ＲＸＲ１９７−４６２とＴＡＦ１１０との間のイン・ビトロ相互作用も観察される。ツー・ハイブリッドアッセイにおけるＲＸＲ−ＴＢＰ相互作用（図２Ｂ）を減少させるＲＸＲτｃドメインの突然変異により、ＲＸＲとＴＢＰとのイン・ビトロでの相互作用が約６分の１に減少する。同様な結果は、全長ＧＳＴ−ＲＸＲ融合を用いるときに見られる。ＴＢＰと、τｃドメインの機能状態に感受性が高いτｃドメイン自身（ＧＡＬ４ＲＸＲ４４４−４６２）との間の直接的イン・ビトロ相互作用も、下記のようにして検出することができる。リン像形成分析(phosphorimaging analysis)によって測定したイン・ビトロで翻訳したＧＡＬ４ＲＸＲ４４４−４６２、ＧＡＬ４ＲＸＲ４４４−４６２−Ｅ４５３Ｋ／Ｅ４５６ＫまたはＧＡＬ４（１−１４７）の等量を、固定したＧＳＴ−ＴＢＰまたは固定したＧＳＴとインキュベーションした。ビーズを十分に洗浄した後、結合したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって溶出して、分割し、ゲルをオートラジオグラフィ用に加工した。暴露時間は７時間であった。ＲＸＲτｃドメインにおける突然変異に対するイン・ビトロでの相互作用の感受性は、τｃドメインがＲＸＲとＴＢＰとの間の直接相互作用を媒介することを示唆している。ツー・ハイブリッドアッセイとは異なり、ＲＸＲ−ＴＢＰ相互作用はイン・ビトロではリガンドの非存在下で検出することができる。リガンドを添加すると、相互作用は、リン像形成によって定量すると３〜５倍に増加する。リガンド依存性相互作用の検出は、イン・ビトロでは、用いられる多量のタンパク質がツー・ハイブリッドアッセイでは検出することができない弱い相互作用をイン・ビトロで安定化する能力から生じることがある。ＲＸＲ−ＴＢＰ相互作用を更に画定するため、突然変異をＴＢＰの基本反復に含まれる十分に保存されたアミノに導入し、ＲＸＲとの相互作用についてツー・ハイブリッドアッセイで分析した。このＴＢＰのドメインは、数種類の転写因子の普通の標的であることが示されている(Lee et al.，Cell 67:365-376(1991); Metz et al.,Mol．Cell．Biol．14:6021-6029(1994a); およびMetz et al.，EMB O J．13:3832-3842(1994b))。したがって、ＧＡＬ４活性化ドメインとＲＸＲ（アミノ酸１９７−４６２）との間の融合を、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインとヒトＴＢＰ（保存されたカルボキシ末端ドメイン、アミノ酸１５１−３３５）との間の融合と共に菌株Ｙ１９０に同時形質転換した。Ｙ２３３Ｇ、Ｒ３２１Ｅ／Ｋ２３２Ｅ／Ｒ２３５Ｅ、Ｖ２３６Ｇ、およびＶ２３７Ｇは、ＴＢＰに導入されるアミノ酸変化を同定する。β−ガラクトシダーゼ活性を、材料および方法に記載の１μＭの９−シスレチノイン酸の存在下にて１６時間成育した後に測定した。S．cerevisiae 抽出物のウェスターンブロットは、ＧＡＬ４−ＴＢＰ融合が同様な水準で発現したことを示している。図３Ａは、ＴＢＰ突然変異体Ｖ２３７Ｇが検出可能なＲＸＲ−ＴＢＰ相互作用を減少することを示している。Ｖ２３６Ｇを含むＴＢＰのこの領域での数種類の他の突然変異体では、効果が見られない。ＴＢＰにおける単純な点突然変異が野生型ＲＸＲリガンド結合ドメインとの相互作用を破壊することができるという知見により、ＴＢＰ−Ｖ２３７ＧがＲＸＲ τｃ突然変異体と相互作用する能力の検討が促進された。したがって、ＧＡＬ４活性化ドメインとＲＸＲτｃ突然変異体との間の融合を、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインと図３Ａに関して前記したＴＢＰ突然変異体と共に、菌株Ｙ１９０に同時形質転換した。β−グルクロニダーゼ活性を、前記と同様に１μＭの９−シスレチノイン酸の存在下（黒棒線）または非存在下（白棒線）において１６時間成育した後に測定した。点突然変異体は、ＲＸＲのアミノ酸１９７〜４６２からなる。ＲＸＲ１９７〜４４３はτｃ切断を表している。ＡとＢの尺度の違いに留意されたい。図３Ｂに示されるように、正のリガンド依存性の相互作用を、ＴＢＰ−Ｖ２３７Ｇと、単純なＲＸＲτｃドメイン突然変異体Ｍ４５４Ａ／Ｌ４５５Ａとの間に検出することができる。ＴＢＰ−Ｖ２３７ＧとＲＸＲ−Ｍ４５４Ａ／Ｌ４５５Ａの間に検出される相互作用は、野生型の相互作用に比較して弱いが、約１０倍のリガンド依存性の相互作用が観察される（図３Ｂ）。ＲＸＲτｃドメイン突然変異体をＴＢＰ突然変異体と強力に結合することによるＲＸＲ−ＴＢＰ相互作用の奪還は、ツー・ハイブリッドアッセイで検出されたＲＸＲ−ＴＢＰ相互作用は、直接的タンパク質−タンパク質相互作用から生じ、第三の因子によって媒介されないことを示している。本発明を幾つかの好ましいその態様に関して詳細に説明したが、改質および変更は、記載されかつ請求されるものの精神および範囲内にあることが理解されるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ

Claims

【特許請求の範囲】１．レチノイドＸレセプター（ＲＸＲ）の作動薬または拮抗薬である化合物の同定法であって、基本転写機構のトランス活性化依存性のリガンド依存性成分と有効に結合したＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインを含んでなる第一の融合タンパク質、ＲＸＲリガンド結合ドメインと有効に結合したＧＡＬ４活性化ドメインを含んでなる第二の融合タンパク質、ＲＸＲに対する前記の作動薬または拮抗薬と見なされているもの、およびリポーター遺伝子に有効に結合したＧＡＬ４応答要素を含んでなるリポーター構築物を接触させ、基本転写機構のトランス活性化とは独立したリガンド依存性成分と有効に結合したＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインを含んでなる第三の融合タンパク質、前記第二の融合タンパク質、ＲＸＲに対する前記作動薬または拮抗薬と見なされているもの、および前記リポーター構築物を接触させた後、前記トランス活性化依存性のリガンド依存性成分および基本転写機構の前記トランス活性化とは独立したリガンド依存性成分の存在下でトランス活性化を誘発する化合物を作動薬として同定し、基本転写機構の前記トランス活性化とは独立したリガンド依存性成分の存在下でトランス活性化を誘発するが、基本転写機構の前記トランス活性化依存性のリガンド依存性成分の存在下では誘発しない化合物を拮抗薬として同定し、前記トランス活性化依存性のリガンド依存性成分または基本転写機構の前記トランス活性化とは独立したリガンド依存性成分のいずれの存在下でもトランス活性化を誘発することができない化合物をＲＸＲの作動薬としてもまたは拮抗薬としても同定しないことを含んでなる、前記方法。２．基本転写機構の前記トランス活性化依存性のリガンド依存性成分がＴＢＰである、請求項１に記載の方法。３．基本転写機構の前記トランス活性化から独立したリガンド依存性成分がＴＡＦ１１０である、請求項２に記載の方法。４．レチノイドＸレセプター（ＲＸＲ）の作動薬または拮抗薬である化合物の同定法であって、ＲＸＲリガンド結合ドメインと有効に結合したＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインを含んでなる第一の融合タンパク質、基本転写機構のトランス活性化依存性のリガンド依存性成分と有効に結合したＧＡＬ４活性化ドメインを含んでなる第二の融合タンパク質、ＲＸＲに対する前記の作動薬または拮抗薬と見なされているもの、およびリポーター遺伝子に有効に結合したＧＡＬ４応答要素を含んでなるリポーター構築物を接触させ、前記第一の融合タンパク質、基本転写機構のトランス活性化とは独立したリガンド依存性成分と有効に結合したＧＡＬ４活性化ドメインを含んでなる第三の融合タンパク質、ＲＸＲに対する前記作動薬または拮抗薬と見なされているもの、および前記リポーター構築物を接触させた後、前記トランス活性化依存性のリガンド依存性成分および基本転写機構の前記トランス活性化とは独立したリガンド依存性成分の存在下でトランス活性化を誘発する化合物を作動薬として同定し、基本転写機構の前記トランス活性化とは独立したリガンド依存性成分の存在下でトランス活性化を誘発するが、基本転写機構の前記トランス活性化依存性のリガンド依存性成分の存在下では誘発しない化合物を拮抗薬として同定し、前記トランス活性化依存性のリガンド依存性成分または基本転写機構の前記トランス活性化とは独立したリガンド依存性成分のいずれの存在下でもトランス活性化を誘発することができない化合物をＲＸＲの作動薬としてもまたは拮抗薬としても同定しないことを含んでなる、前記方法。５．基本転写機構の前記トランス活性化依存性のリガンド依存性成分がＴＢＰである、請求項４に記載の方法。６．基本転写機構の前記トランス活性化から独立したリガンド依存性成分がＴＡＦ１１０である、請求項５に記載の方法。７．９−シス−レチノイン酸に結合する能力を保持するが、９−シス−レチノイン酸によっては活性化されないＲＸＲ突然変異体。８．前記突然変異体がＲＸＲ突然変異体Ｄ４４４Ａ、ＲＸＲ突然変異体Ｔ４４５Ａ、ＲＸＲ突然変異体Ｐ４４６Ａ、ＲＸＲ突然変異体Ｉ４４７Ａ、ＲＸＲ突然変異体Ｄ４４８Ａ、ＲＸＲ突然変異体Ｔ４４９Ａ、ＲＸＲ突然変異体Ｆ４５０Ｐ、ＲＸＲ突然変異体Ｌ４５１Ａ、ＲＸＲ二重突然変異体Ｍ４５４Ａ，Ｌ４５５Ａ、ＲＸＲ二重突然変異体Ｅ４５３Ｋ，Ｅ４５６Ｋ、またはＲＸＲ突然変異体Ｍ４５２Ａから選択される、請求項７に記載の突然変異体レセプター。９．レチノイドＸレセプターの作動薬の同定法であって、請求項７に記載のＲＸＲ突然変異体を含む細胞を推定ＲＸＲリガンドと接触させ、前記細胞がリポーター遺伝子に有効に連結したＲＸＲ応答要素を含み、次いでリポーター遺伝子生成物の発現を監視することを含んでなる方法。１０．レチノイドＸレセプターの拮抗薬の同定法であって、ＲＸＲ突然変異体を含む細胞を一定量のＲＸＲ作動薬および可変量のその推定拮抗薬と接触させ、ここで前記突然変異体は９−シス−レチノイン酸に結合する能力を保持するが、９−シス−レチノイン酸によって活性化はされず、前記細胞がリポーター遺伝子に有効に連結したＲＸＲ応答要素を含み、次いでリポーター遺伝子生成物の発現を、前記試験細胞に投与した推定拮抗薬の量の関数として監視することを含んでなる方法。１１．ＲＸＲリガンド結合ドメインと有効に結合したＧＡＬ４活性化ドメインを含んでなる融合タンパク質。１２．レチノイドＸレセプターおよび基本転写機構の１以上の成分とのリガンド依存性相互作用を検出する方法であって、基本転写機構の第一の成分と有効に結合したＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインを含んでなる第一の融合タンパク質、ＲＸＲリガンド結合ドメインと有効に結合したＧＡＬ４活性化ドメインを含んでなる第二の融合タンパク質、ＲＸＲリガンド、およびリポーター遺伝子に有効に連結したＧＡＬ４応答要素を含んでなるリポーター構築物と接触した後、前記リポーターの発現を監視することを含んでなる、方法。１３．元の第一の融合タンパク質とは異なる基本転写機構の成分を含むことによって元の第一の融合タンパク質と異なる、別の第一の融合タンパク質を用いて、前記接触および監視段階を繰り返すことをも含む、請求項１２に記載の方法。１４．基本転写機構の前記成分がＴＢＰ、ＴＡＦ、ＴＡＦ１１０、ＴＦＩＩＡ、ＴＦＩＩＢ、ＴＦＩＩＤ、ＴＦＩＩＥ、ＴＦＩＩＦ、ＴＦＩＩＨ、ＳＵＧ１、ＴＲＩＰ１またはＴＩＦ１から選択される、請求項１３に記載の方法。１５．レチノイドＸレセプターと基本転写機構の１以上の成分との間のリガンド依存性相互作用を検出する方法であって、ＲＸＲリガンド結合ドメインと有効に結合したＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインを含んでなる第一の融合タンパク質、基本転写機構の第一の成分と有効に結合したＧＡＬ４活性化ドメインを含んでなる第二の融合タンパク質、ＲＸＲリガンド、およびリポーター遺伝子に有効に連結したＧＡＬ４応答要素を含んでなるリポーター構築物を接触させた後、前記リポーターの発現を監視することを含んでなる方法。１６．元の第二の融合タンパク質とは異なる基本転写機構の成分を含むことによって元の第二の融合タンパク質と異なる、別の第二の融合タンパク質を用いて、前記接触および監視段階を繰り返すことをも含む、請求項１５に記載の方法。１７．基本転写機構の前記成分がＴＢＰ、ＴＡＦ、ＴＡＦ１１０、ＴＦＩＩＡ、ＴＦＩＩＢ、ＴＦＩＩＤ、ＴＦＩＩＥ、ＴＦＩＩＦ、ＴＦＩＩＨ、ＳＵＧ１、ＴＲＩＰ１またはＴＩＦ１から選択される、請求項１６に記載の方法。