JP2000232878A - フラクトシル転移酵素、並びに該酵素を用いた１−ケストース及びニストースの分別製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 酵素法によるフラクトオリゴ糖の工業的製造
に適し、クロマト分離法による１−ケストース（以下１
−Ｋ）及びニストース（以下Ｎ）の効率的分離に適した
フラクトシル転移酵素、並びにこれを使用した１−Ｋ及
びＮの分別製造法の提供。 【解決手段】 エウロチウム属糸状菌菌体、その培養
液、及びそれらからのフラクトシル転移酵素を用いショ
糖を基質にして反応溶液中にフラクトオリゴ糖を生成さ
せる。この糖の組成比は式１ で表され、１−Ｋ、Ｎの生成量に比べフラクトシルニス
トースの生成量が微量。得られたフラクトオリゴ糖の混
合物をクロマト分離、第１段目のクロマト分離によりシ
ョ糖区分、還元糖区分、フラクトオリゴ糖区分に画分す
る。次いでフラクトオリゴ糖区分を第２段目のクロマト
分離により１−Ｋ区分とＮ区分に画分しそれぞれを結晶
化させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ビフィズス菌生育
促進効果のあるオリゴ糖としての１−ケストース及びニ
ストースを製造するのに有用な酵素である新規なフラク
トシル転移酵素、及び該酵素を用いた１−ケストース結
晶及びニストース結晶の分別製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】１−ケストースは、ショ糖のフラクトシ
ル基の１位の炭素原子にフラクトースが１個転位した分
子構造を有する三糖類であり、ニストースは該１−ケス
トースにさらにフラクトースが１個転位した四糖類であ
る。また、該ニストースにさらにフラクトースが１個転
位したものは、フラクトシルニストースである。これら
のフラクトオリゴ糖は、人間が摂取した時、胃で消化さ
れにくく腸に達し、ビフィズス菌の生育促進効果を示す
フラクトオリゴ糖として、食品素材などに有用であるこ
とと共に、低う蝕性であることの特徴が知られている
（例えば、特公昭５９−５３８３４号公報参照）。

【０００３】これらのフラクトオリゴ糖は、各種フラク
トオリゴ糖の混合物となっていることが一般的であり、
単独成分毎に結晶化が困難であったため、主として、各
種フラクトオリゴ糖の混合物を噴霧乾燥或いは凍結乾燥
したアモルファスな粉体や、含結晶糖蜜固化物を粉砕し
たものが製品化されていたが（例えば、特開昭６０−１
４９５９６号公報参照）、これらの製品はいずれも吸湿
性が強く、長期保存には不向きであり、例えば、包装形
態として防吸湿性の包装材を使用する等の特別な手段が
必要であるばかりでなく、開封後のフラクトオリゴ糖の
取扱いにも注意を要していた。

【０００４】１−ケストースやニストースの吸湿性の問
題を解決するものとしてこれらの各フラクトオリゴ糖を
結晶化させる技術が提案されており、特公平６−７００
７５号公報には１−ケストースの結晶化技術が、特開平
６−１６５７００号公報にはニストースの結晶化技術が
開示されている。しかしながら、１−ケストースの結晶
化技術について言えば、純度７０％以上（工業化目的の
ためには純度８０％以上）の１−ケストースを含む水溶
液を用意する必要があり、また、該ニストースの結晶化
技術は、純度４０％以上（工業化目的のためには純度７
０％以上）のニストース水溶液を用意する必要があり、
このような高純度のオリゴ糖溶液を得るには、該公報に
示されるように、特定のフラクトオリゴ糖のみを高純度
に生産することができる生産物特異性の高い生産菌を用
いるか、或いは何等かの効率的分離法により、純度を高
める予備処理をする必要があった。

【０００５】例えば、前記生産物特異性の高い生産菌を
用いる方法には、前記特公平６−７００７５号公報及び
特公平４−４１６００号公報に記載の方法が挙げられ、
該公報によれば、スコプラリオプシス・ブレビカウリス
を使用し、培養法によって発酵生産物として純度の高い
１−ケストースを得ているが、該微生物の培養物自体は
酵素活性が低いため、培養液に基質を反応させる、いわ
ゆる酵素反応法による手法は生産性が悪く、しかも、該
微生物由来の酵素は４５℃以上で酵素が失活してしまう
ため、その適用が不利であった。

【０００６】また、前記効率的分離法の例として、フラ
クトオリゴ糖の工業的分離に適し、フラクトオリゴ糖の
純度を高める方法には、カチオンイオン交換樹脂を用い
る各種クロマト分離法が挙げられる。しかしながら、該
クロマト分離法では、分子量比に大きな差異があるフラ
クトオリゴ糖同士の混合物は分離しやすいが、分子量比
が１に近いものほど分離しにくいという欠点があった。
例えば、単糖類と二糖類では分子量比が１：２であり、
二糖類と三糖類では１：１．５であり、三糖類と四糖類
では１：１．３であり、さらに四糖類と五糖類では１：
１．２であり、構成糖の数の多いもの同士ほどその分子
量比は１に接近してくることになり、以上列挙した順に
クロマト分離が難しくなるという問題があった。

【０００７】このような理由により、クロマト分離法を
用いるオリゴ糖の分離技術には、例えば、特公昭６３−
５１００号公報に開示されるように、単糖類、二糖類、
三糖類以上の３区分の分離が行われているが、三糖類と
四糖類、さらには四糖類と五糖類以上の分離技術は進ん
でいないのが現状である。その最大の理由は、従来の微
生物由来のオリゴ糖生産酵素では三糖以上の区分にケス
トース、ニストースの他に、さらに構成糖の数の多い五
糖類であるフラクトシルニストース等が無視できない量
で生産されており、従ってこのフラクトシルニストース
の相対的な量の多さが影響してケストース、ニストース
がきれいに分離できないことに起因していた。

【０００８】具体例を挙げて説明すれば、従来よりアス
ペリギウス・ニガー（ＡＴＣＣ ２０６１１）、オーレ
オバシジュウム・プルランス（ＡＨＵ ９５４９）など
の微生物がフラクトオリゴ糖の生産菌として知られてい
るが、これらの微生物を含め種々の微生物起源のフラク
トオリゴ糖の組成は、通常、フラクトシルニストース／
（１−ケストース＋ニストース）として１０〜１５％程
度（５〜７．５重量％程度）である。五糖類であるフラ
クトシルニストースは、三糖類の１−ケストースや四糖
類のニストースの分画、結晶化の妨げになっていた。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】そこで本発明は、酵素
反応法によるフラクトオリゴ糖の工業的な製造に適し、
且つクロマト分離法による１−ケストース及びニストー
スの効率の良い分離に適し、最終生産物として吸湿性の
ない結晶とすることができるフラクトシル転移酵素であ
って、フラクトシルニストースの生成量が微量であると
いう特徴を有するフラクトシル転移酵素を提供するこ
と、並びに該酵素を使用した１−ケストース及びニスト
ースの分別製造方法を提供すること、並びに１−ケスト
ース結晶及びニストース結晶を製造する方法を提供する
ことを目的とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは自然
界に存在する微生物より、五糖類であるフラクトシルニ
ストースを作らないか、作ってもわずかであるフラクト
オリゴ糖生産酵素を検索した。その結果、「かつおぶ
し」生産菌の一種とされるエウロチウム・リーペンス
（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ ｒｅｐｅｎｓ）の培養菌体、培養
液、或いはそれらから抽出精製した酵素にショ糖を基質
として作用させ、１−ケストース、ニストースを主とし
て生産し、フラクトシルニストースをほとんど生産しな
い作用があることを見いだし、且つクロマト分離の手法
を用いて高純度１−ケストース及び高純度ニストースの
製造法及びそれらの各結晶の製造法を確立した。また、
クロマト分離液より、１−ケストース、ニストースを結
晶品として得たばかりでなく、それらを回収した後の振
り蜜を再び酵素反応に供することにより、生産ロスの少
ない１−ケストース及びニストースの製造方法を確立
し、本発明を完成させた。

【００１１】すなわち、本発明のフラクトシル転移酵素
は、エウロチウム属に属する微生物により生産されたも
のであることを特徴とし、０．１Ｍ以上のシュークロー
スを基質として反応させた場合に反応生成物としてのフ
ラクトオリゴ糖における組成比が、次式（１）、 フラクトシルニストース／（１−ケストース＋ニストース）＜０．０５ … 式（１） で表すことができるフラクトオリゴ糖を生じる能力を有
するフラクトシル転移酵素であることを特徴とする。

【００１２】前記本発明のフラクトシル転移酵素を製造
できるエウロチウム属に属する微生物には、エウロチウ
ム属に属し、前記式（１）で示されるフラクトオリゴ糖
を生産する微生物であれば、どのようなものでもよい
が、例えば、エウロチウム・リーペンス（Ｅｕｒｏｔｉ
ｕｍ ｒｅｐｅｎｓｅ）（別名：Ｅｕｒｏｔｉｕｍ ｓ
ｐ．ＨＳ−１００５）（ＦＥＲＭ Ｐ−１７１９９）を
使用することができる。

【００１３】本発明の１−ケストース及びニストースを
主体とするフラクトオリゴ糖の製造方法は、エウロチウ
ム属に属する微生物菌体、該微生物の培養液、及びそれ
らから抽出精製される酵素からなる群から選ばれた生体
触媒を用い、ショ糖を基質にして作用させて、反応溶液
中にフラクトオリゴ糖を生成させ、前記式（１）、で表
されるフラクトオリゴ糖を製造することを特徴とする。

【００１４】前記本発明のフラクトオリゴ糖の製造方法
においては、酵素反応に作用させる基質としてのショ糖
を０．１Ｍ以上とすることによって前記式（１）で示さ
れる組成比の１−ケストース及びニストースを主体とす
る混合物を得ることができる。

【００１５】これらのフラクトオリゴ糖を含む反応液か
ら、１−ケストース及びニストースを分離するには、ク
ロマト分離法により行うことができる。前記クロマト分
離は、第１段目のクロマト分離と第２段目のクロマト分
離から構成することができる。第１段目のクロマト分離
により、還元糖を主成分とする第１フラクション、未反
応ショ糖を主成分とする第２フラクション、及びケスト
ース、ニストースを主成分とする第３フラクションに分
け、さらに第２段目のクロマト分離により、前記第３フ
ラクションから１−ケストース及びニストースを分離す
ることを特徴とする。

【００１６】前記工程で得られる１−ケストース及び／
又はニストースを公知の手法で結晶化させることによ
り、吸湿性の少ない１−ケストース結晶及び／又はニス
トース結晶を製造することができる。

【００１７】本発明のフラクトオリゴ糖の製造方法は、
上記工程を繰り返し適用することができ、そのために
は、前記未反応ショ糖を主成分とする第２フラクション
をリサイクルタンクに集め、且つ前記１−ケストース区
分を結晶化させて１−ケストース結晶と振り密を得、該
振り密をリサイクルタンクに集め、且つ前記ニストース
区分を結晶化させてニストース結晶と振り密を得、該振
り密をリサイクルタンクに集め、リサイクルタンクに集
められている混合物に対して、基質としてのショ糖が
０．１Ｍ以上となるように、さらにショ糖を添加してシ
ョ糖濃度を調整し、前記工程で得られたショ糖濃度の調
整された混合物を基質であるショ糖原料として、前記生
体触媒に再度適用して、前記工程を繰り返すことを特徴
とする。

【００１８】

【発明の実施の形態】使用する微生物 本発明のフラクトシル転移酵素を生産する微生物は、北
海道上川郡清水市ホクレン農業協同組合連合会清水製糖
工場敷地内より単離されたものである。該微生物の菌学
的性質を以下に記す。

【００１９】（１）コロニーはツアペック寒天培地上で
増殖し、２０日目には直径２〜３ｃｍに達した。２０％
ショ糖を含むツアペック寒天培地上では２５℃で１４日
目に６〜７ｃｍに達する。コロニーの色調は分生子頭と
栄養菌糸のために黄緑色から緑色がかった灰色である
が、時々は黄色がかった橙色から赤茶色となる。

【００２０】（２）２０％ショ糖を含むツアペック寒天
培地上では球形〜亜球形の被子器（７５〜１００μｍ）
が豊富に形成され、橙色から黄色の層を形成し、その周
りを黄色から橙色の菌子のネットワークが取り囲む。

【００２１】（３）子のうは球形〜亜球形（１０〜１２
μｍ）で鎖が集まったように見える。子のう胞子はレン
ズ状（直径４．８〜５．６μｍ、短径４．０〜４．５μ
ｍ）であり、外側はなめらかであるが、ややでこぼこし
ており赤道付近に溝の痕跡が観測できる。

【００２２】（４）分生子頭は直径１００〜２００μｍ
である。

【００２３】（５）分生子柄は２００〜８００μｍの長
さで頂点でふくらみ、２０〜４０μｍ径の頂のうを作
る。

【００２４】（６）分生子は７〜１０μｍ×３．５〜
４．５μのサイズで上記分生子頂のうに生じる。

【００２５】（７）分生子はやや球状から楕円形であ
り、細い棘毛で密におおわれ、直径は５〜６．５μｍで
ある。

【００２６】（８）生育至適温度範囲は２５〜３０℃で
あり、４０℃以上では生育しない。

【００２７】上記した菌学的性質を食品菌類ハンドブッ
ク、宇田川俊一他監訳、医歯業出版（１９８４）第３２
頁並びにＣｏｍｏｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｓｏｉｌ Ｆ
ｕｎｇｉ，Ｖｏｌ．１〔Ｋ．Ｈ．Ｐｏｎｓｃｈ他著、Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ（１９８０）Ｐ２９３−２
９５〕の記載と比較した結果、本菌はエウロチウム・リ
ーペンス（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ ｒｅｐｅｎｓｅ）（別
名：Ｅｕｒｏｔｉｕｍｓｐ．ＨＳ−１００５）（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１７１９９）と同定された。

【００２８】Ｅ．ｒｅｐｅｎｓ由来のフラクトシル転移
酵素 （１）作用及び基質特異性 ０．０３Ｍ以下のショ糖存在下では主に加水分解のみを
行い、０．１Ｍ以上のショ糖存在下では主にフラクトオ
リゴ糖の生成が行われる。０．８Ｍショ糖を基質とし、
２４時間反応させた場合に、１−ケストース及びニスト
ースの生成が認められ、その比率は、１−ケストースを
１００として、ニストース１５．７である。なお、ショ
糖に対するｋｍ値は１．５３Ｍである。

【００２９】本発明のフラクトシル転移酵素は、フラク
トシルニストースの生成量が微量であり、０．１Ｍ以上
のシュークロースを基質として反応させた場合に反応生
成物としてのフラクトオリゴ糖の組成比が、次式、 フラクトシルニストース／（１−ケストース＋ニストー
ス）＜０．０５ となる。

【００３０】（２）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 至適ｐＨは６．８である。また、各種ｐＨに４℃で１８
時間保持後、残存活性をｐＨ６．８で測定した場合の安
定範囲は５．５〜７．５である。

【００３１】（３）力価測定法 酵素反応は０．１Ｍショ糖を基質として４５℃で行い、
生成した１−ケストースを液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）で測定する。酵素単位は、上記の条件下で１分
間に１μｍｏｌの１−ケストースを生成する酵素量を１
ユニットとする。以上の測定により、後記（６）に示す
方法で精製した酵素の比活性は１，２６０ユニット／ｍ
ｇで回収率は１５．４％であった。

【００３２】（４）作用温度の範囲 本酵素の至適温度は４５℃であり、また２５℃以上の各
種温度に６０分間保持後、残存活性を４５℃で測定した
ところ、その安定範囲は４５℃までで、それ以上、即
ち、５０℃で２０％失活、６０℃で完全に失活する。し
かし高濃度のショ糖の存在下ではその安定性が増し、例
えば、１．８Ｍショ糖の存在下では至適温度は６０℃で
あり、安定温度範囲も６５℃までとなり、７０℃で４０
％失活、７５℃で完全に失活する。

【００３３】図１に、本発明のフラクトシル転移酵素を
種々の温度に保持した場合の相対酵素活性（％）をグラ
フにして示す。図１の酵素活性の測定条件は、ｐＨ６．
８の緩衝液中に４ユニットの酵素を入れ、様々な温度で
６０分間保持した後、残存活性を４５℃で測定してい
る。なお、ショ糖存在下での活性測定においては温度ス
トレスをかけていた時に生成された１−ケストース量を
差し引いて計算している。図１のグラフにおいて、曲線
Ａはショ糖なしの場合、曲線Ｂは１．８Ｍショ糖存在下
の場合を示す。

【００３４】（５）ｐＨ、温度などによる失活の条件 ｐＨ４．５では約４０％失活し、ｐＨ３．５で完全に失
活する。ｐＨ８．５では約３０％失活し、ｐＨ１０で完
全に失活する。

【００３５】（６）精製法Ｅ．ｒｅｐｅｎｓ （ＦＥＲＭ Ｐ−１７１９９）を３０
重量％ショ糖を含む培地５００ｍｌを用い、３０℃、７
日間振とう培養を行って湿菌体を得、該湿菌体に対して
超音波処理を行って、得られた菌体抽出液を粗酵素液と
して、各種カラムクロマトグラフィー操作（ＤＥＡＥ−
セファロース ＣＬ−６Ｂ、トヨパールＨＷ−５５Ｓ及
びトヨパール ＨＷ−６５Ｓ、そしてフェニル−トヨパ
ール ６５０Ｓ）を行って精製酵素とする。

【００３６】（７）分子量 前記（６）で精製される精製酵素は、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＢ）により均一に精製
されたことが確認されたものについて、その移動率の比
較の結果、本酵素の分子量は７７，０００と算出され
る。等電点電気泳動（ＩＥＦ）による等電点はｐＨ４．
８である。

【００３７】フラクトオリゴ糖の製造方法 次に上記Ｅ．ｒｅｐｅｎｓ由来のフラクトシル転移酵素
を用いたフラクトオリゴ糖含有糖組成物の生産法を説明
する。最初にＥ．ｒｅｐｅｎｓ（ＦＥＲＭ Ｐ−１７１
９９）から粗酵素を得る方法を述べる。

【００３８】（１）粗酵素液の調製 培地には、ショ糖として５〜４０重量％、好ましくは２
０〜３０重量％を含み、窒素原として酵母エキス０．５
〜３重量％、好ましくは１．０〜２．０重量％を含み、
さらにリン酸塩類、マグネシウム塩など、たとえばリン
酸カリウム、硫酸マグネシウムなどの無機塩類を０．１
〜１．０重量％、好ましくは０．２〜０．５重量％加え
たものを用いる。培地のｐＨは４．５〜７．５、好まし
くは５．０〜６．０に調節する。上記微生物の培養は、
あらかじめ２４〜４８時間振とう培養したものを上記培
地に摂取し、２５〜３５℃、好ましくは２８〜３０℃で
２４〜７２時間、好ましくは３０〜４８時間通気撹拌培
養することにより行う。

【００３９】この培養によって得られるフラクトオリゴ
糖生産酵素は、菌体、培養液の両方に存在し、菌体、或
いは培養液、或いは培養物全体を粗酵素として使用でき
る。１分間あたり１μＭの１−ケストースを生産する力
価を１ユニットとした場合、例えば、本培養物１ｍｌあ
たりの力価はｐＨ６．０、５５℃で３０〜４０ユニット
となる性質を有する。

【００４０】（２）粗酵素液の性質 基質としてショ糖を濃度７０％（ｗ／ｖ）溶液に調整
し、該基質溶液１リットルあたり５ｇの湿菌体を粗酵素
として入れ、５５℃、種々のｐＨで１６時間反応させ、
生産された１−ケストース量を測定し、得られた結果を
図２に示す。図２によれば、本フラクトシル転移酵素の
１−ケストースの生産に適切なｐＨは５．０〜６．０で
あることがわかる。

【００４１】また、基質としてショ糖を濃度７０％（ｗ
／ｖ）溶液に調整し、該基質溶液１リットルあたり５ｇ
の湿菌体を粗酵素として入れ、ｐＨ６．０で種々の温度
で２４時間反応させ、生産された１−ケストース量を測
定して得られた結果を図３に示す。図３によれば、本発
明の粗フラクトシル転移酵素の１−ケストースの生産に
適切な温度は５０〜６０℃であることがわかる。

【００４２】（３）フラクトオリゴ糖含有物の製造 上記（１）で調製された粗酵素液を、ｐＨ４．５〜７．
０、好ましくは５．０〜６．０に調整した３０〜８０％
（ｗ／ｖ）、好ましくは６０〜７０％（ｗ／ｖ）のショ
糖溶液の５〜３０倍量、好ましくは１０〜２０倍量に投
入し、反応温度を４０〜６０℃、好ましくは５０〜５５
℃に調節し、ゆっくり撹拌しながら２４〜７２時間、好
ましくは３０〜４８時間反応させる。その結果反応糖組
成物として還元糖２０〜３５％、ショ糖１５〜３５％、
ケストース２０〜３５％、ニストース１０〜２５％、フ
ラクトシルニストース１％以下のフラクトオリゴ糖組成
物が得られる。

【００４３】本発明のフラクトシル転移酵素による反応
生成物である上記フラクトオリゴ糖との比較のために、
従来のフラクトオリゴ糖生産菌、例えば、アスペリギウ
ス・ニガー（ＡＴＣＣ２０６１１）により生産されるオ
リゴ糖組成を示せば、還元糖３５％、ショ糖１０％、１
−ケストース２５％、ニストース２５％、フラクトシル
ニストース５％である。このように、本フラクトシル転
移酵素の場合は、フラクトシルニストースの生産性が極
端に低いという特徴があり、この特徴が以下に述べるよ
うにクロマト分離を容易に行うための利点となる。

【００４４】図４に、上記（１）で調製された粗酵素液
３．３リットルを７０％（ｗ／ｖ）ショ糖溶液１００リ
ットルに、最適条件下（ｐＨ６．５、５５℃）で作用さ
せて酵素反応を行わせたときの反応時間に対する、ショ
糖濃度、１−ケストース濃度、ニストース濃度、フラク
トシルニストース濃度の関係をグラフとして示す。

【００４５】（４）フラクトオリゴ糖のクロマト分離 次に上記（３）で得られた本発明のフラクトオリゴ糖組
成物を、以下に示す方法によりクロマト分離する。本ク
ロマト分離法の特徴は、クロマト分離工程を合計２段行
う点にあり、さらに各々のクロマト分離工程は以下に詳
述するようにそれぞれ別の方法、目的で行う点に特徴が
ある。まず、第１段目のクロマト分離工程は、分離剤と
してカチオンイオン交換樹脂を用い、上記（３）で得ら
れた本発明のフラクトオリゴ糖組成物を、クロマト分離
処理して、還元糖を主成分とする第１フラクション、未
反応ショ糖を主成分とする第２フラクション、及びケス
トース、ニストースを主成分とする第３フラクションに
分けた。次のクロマト分離にかける原液部分である。こ
のような多種類の糖の分離には、例えば、公知の半連続
的なクロマト分離方式である新ＭＣＩ方式、具体的に
は、特開昭６３−１５８１０５号公報に開示された方法
が好適に利用できる。

【００４６】前記新ＭＣＩ方式とは、イオン交換樹脂等
の吸着剤が充填された充填床の前端と後端が流体通路で
連結された流体の循環を可能にしたクロマト分離系に、
吸着剤に対する親和性が異なる複数の成分を含む原料流
体を供給し、充填床の前端から後端の方向に充填床内を
流通させて各成分の濃度分布を有する吸着帯域を形成さ
せた後、２以上の画分に分離する方法において、充填床
前端から原料流体を供給しつつ、充填床から任意の一成
分が富化された画分を抜き出す第一工程、及び充填床前
端から脱着剤流体を供給して充填床後端から他の成分が
富化された画分を抜き出す第二工程、及び充填床への流
体の供給及び充填床からの流体の抜き出しを行わずに充
填床内の流体を充填させ、前記第一工程で抜き出された
成分と、他の成分が混在する帯域を充填床の前端に移動
させる第三工程の各工程を任意の順序で含み、上記各工
程を繰り返すことを特徴とするクロマト分離方法であ
る。

【００４７】該新ＭＣＩ方式による前記還元糖を主成分
とする第１フラクションは、排除するかあるいは濃縮
し、別途甘味料として回収してもよい。前記未反応ショ
糖を主成分とする第２フラクションは、反応液に戻し、
再度、酵素反応に供してもよい。前記第３フラクション
は、ケストース、ニストースを主成分としているので、
次に行う第２段目のクロマト分離工程の原液とする。

【００４８】第１段目のクロマト分離工程のさらに好ま
しい態様を説明すれば、カチオンイオン交換樹脂とし
て、好ましくは、ナトリウム型のカチオンイオン交換樹
脂（平均粒径２２０ミクロン）を採用し、原液濃度が５
０〜７０％（ｗ／ｗ）、運転負荷が０．０５〜０．１
０、好ましくは０．０７〜０．０８（リットル／時間・
樹脂）、水使用比が２〜３（ｖ／ｖ）、好ましくは２．
７〜２．８（ｖ／ｖ）となるように設定してクロマト分
離工程を行う。

【００４９】該第１段目のクロマト分離工程により得ら
れる前記三つのフラクションは、第１フラクションの糖
組成が還元糖純度９５〜９８％、第２フラクションの糖
組成がショ糖４０〜５０％、フラクトオリゴ糖３５〜４
０％、還元糖１０〜２０％、第３フラクションの糖組成
がフラクトオリゴ糖９５〜９７％（内フラクトシルニス
トース３％以下）、ショ糖３〜５％となる。

【００５０】本発明の目的を達するためには、以上のク
ロマト分離工程の他に、単塔カラムによる回分法による
クロマト分離も可能であるが、上記方法に比べ使用樹脂
量、水量は多くなる。

【００５１】次に第２段目のクロマト分離について述べ
る。第２段目のクロマト分離の目的は第１段目のクロマ
ト分離で得られた第３フラクションを原液として、そこ
からケストース、ニストースを高純度で得るところにあ
る。そのために、クロマト分離方式として、公知の擬似
移動床方式クロマト分離、例えば、製糖技術研究会誌，
Vol.41, p.29〜36(1993)に示される方法が好適に適用で
きる。

【００５２】該擬似移動床方式によるクロマト分離と
は、イオン交換樹脂等の充填剤が充填された充填層を実
際に移動させることなく、移動層方式（カラムの一端に
溶離液を供給しながら充填層の中間に２成分を含む原液
を連続供給すると同時に、充填剤を溶離液の流れ方向と
は逆向きに移動させて、原液中の各成分を互いに逆向き
に移動させて連続的に各成分を分離する方式）と同じ効
果を得る方式である。具体的には、充填層を何本かのカ
ラムに分割し、円環状に連結した装置構成とし、供給液
の供給位置、抜出し位置を間欠的に反対方向へ移動させ
ていき、見かけ上、充填層が移動している効果を得て、
２成分を分離する方式である。

【００５３】第２段目のクロマト分離により得られる第
１フラクションは、ケストースを主成分とするフラクシ
ョンであり、第２フラクションはニストースを主成分と
するフラクションである。

【００５４】第２段目のクロマト分離の分離カラムに使
用される分離剤としては第１段目と同じくナトリウム型
カチオンイオン交換樹脂を採用することが、二つのフラ
クションに効率よく分離するために有利である。

【００５５】本発明の１−ケストース及びニストースの
分別製造方法に使用される第１段目のクロマト分離及び
第２段目のクロマト分離において、用いられる分離剤と
して、好ましくは、ナトリウム型のカチオンイオン交換
樹脂（平均粒径２２０ミクロン）が採用できる。

【００５６】擬似移動層方式を採用した第２段目のクロ
マト分離において、１−ケストース及びニストースを分
離するには、第２段目のクロマト分離装置に供給する原
液濃度を５０〜７０％（ｗ／ｗ）、運転負荷を０．０２
〜０．０３（リットル／時間・樹脂）、好ましくは０．
０２５〜０．０２８（リットル／時間・樹脂）、溶離水
使用比を１．５〜２．５（ｖ／ｖ）、好ましくは１．９
〜２．２（ｖ／ｖ）と設定することにより、この第２段
目のクロマト分離から、１−ケストース純度８０〜８５
％（内フラクトシルニストース１％以下）の第１フラク
ションと、ニストース純度７０〜８０％（内フラクトシ
ルニストース４％以下）の第２フラクションが得られ
る。

【００５７】前記工程で得られる各高純度の１−ケスト
ース溶液及びニストース溶液からの各フラクトオリゴ糖
の結晶化方法は、公知の結晶化方法、例えば、特公平６
−７００７５号公報に開示の１−ケストース結晶の製造
方法、及び、特開平６−１６５７００号公報に開示のニ
ストース結晶の製造方法によって製造することができ
る。

【００５８】図５は、上記に詳述した本発明の１−ケス
トース結晶及びニストース結晶の製造方法の工程を示す
フロー図である。１は、本発明のフラクトシル転移酵素
をシュークロースに作用させて酵素反応を行わせるため
の反応槽である。該反応槽１における酵素反応によって
得られたフラクトオリゴ糖混液は、第１段目のクロマト
分離塔２に導入され、ショ糖区分、還元糖区分、フラク
トオリゴ糖区分に分画される。前記ショ糖区分は後述す
るリサイクルタンク４に回される。前記還元糖区分は、
別途、甘味料等に利用することができる。

【００５９】前記フラクトオリゴ糖区分は、第２段目の
クロマト分離塔３へ導入され、ここで１−ケストースと
ニストースに分画される。各々分離された１−ケストー
ス及びニストースに対してそれぞれ結晶化工程が施さ
れ、１−ケストース結晶及びニストース結晶がそれぞれ
製造される。これらの１−ケストース及びニストースの
各結晶化工程において、結晶を採取した後の振り密は、
前記リサイクルタンク４へ集められ、前記回収されたシ
ョ糖区分と混合される。該リサイクルタンク４に集めら
れた混合物は、糖組成物として、還元糖５〜７％、ショ
糖６０〜７０％、１−ケストース１７〜２２％、ニスト
ース６〜８％、フラクトシルニストース０．２〜０．５
％となる。

【００６０】この糖混合物を、再度、反応槽１へ戻し、
５５℃に保ち、シュークロース濃度７０％（ｗ／ｖ）、
ｐＨ５．０〜６．０に調整し、上記に述べたように本発
明のエウロチウム属に属するフラクトシル転移酵素生産
菌の培養物を再度投入し、２６〜３１時間反応させるこ
とによって、反応糖組成として、還元糖２９〜３１％、
ショ糖１８〜２２％、１−ケストース３１〜３４％、ニ
ストース１５〜１７％、フラクトシルニストース１％以
下の糖組成物を得ることができる。

【００６１】このように、本発明の１−ケストース結晶
及びニストース結晶の製造方法は、第１段目のクロマト
分離で生ずるショ糖区分、１−ケストース結晶工程で生
ずる振り密、ニストース結晶工程で生ずる振り密を完全
に再利用でき、無駄のない高効率な製造サイクルを実現
できる。

【００６２】

【実施例】〔実施例１〕酵素液によるオリゴ糖の製造 （１）粗酵素液の製造Ｅｕｒｏｔｉｕｍ ｒｅｐｅｎｓ （別名：Ｅｕｒｏｔｉ
ｕｍ ｓｐ．ＨＳ−１００５）（ＦＥＲＭ Ｐ−１７１
９９）をポテトデキストロース寒天培地のスラントか
ら、直径１０ｃｍのツアペック寒天培地（ショ糖２０％
を含む）上に接種し、１４日間、３０℃にて培養した。
そこに生じたコロニーから滅菌水で胞子を回収し、ショ
糖１００ｇ／リットル、酵母エキス１５ｇ／リットル、
リン酸カルシウム０．３ｇ／リットル、硫酸マグネシウ
ム０．３ｇ／リットルを含む培養液１００ｃｃ（ｐＨ
６．０）中に接種し、２４時間３０℃で１２０ｒｐｍの
振とう培養を行った。

【００６３】得られた培養物を、ショ糖２００ｇ／リッ
トル、酵母エキス１５ｇ／リットル、リン酸カルシウム
０．３ｇ／リットル、硫酸マグネシウム０．３ｇ／リッ
トル、炭酸カルシウム１．５ｇ／リットルからなる液体
培地５リットル（ｐＨ６．０）に接種し、４８時間、３
０℃、通気量１／２ｖｖｍ、撹拌速度４００ｒｐｍで培
養した。得られた培養液のオリゴ糖生産活性（１−ケス
トース生産活性）は、３１．８ユニット／１ｍｌ培養液
であった。この培養液を粗酵素液とした。

【００６４】（２）酵素反応法によるオリゴ糖の製造 ショ糖濃度７０％（ｗ／ｖ）のｐＨ６．０に調整したシ
ョ糖水溶液１００リットルを５５℃に保ち、該ショ糖水
溶液中に上記（１）の工程で得られた粗酵素液３．３リ
ットルを投入した。上記温度でゆっくり撹拌しながら４
３時間保った。その後、濾過することによって、反応生
成物として糖組成物を含んだ溶液を得た。該糖組成物溶
液の糖組成を下記の表１に示す。

【００６５】

【表１】

【００６６】前記表１に示すように、ショ糖を本発明に
よる酵素反応させることによって、５単糖であるフラク
トシルニストースの含有量の極めて少ない、１−ケスト
ース（３単糖）及びニストース（４単糖）を主体とする
フラクトオリゴ糖が得られたことがわかる。

【００６７】〔実施例２〕オリゴ糖の精製 （第１段目のクロマト分離） 前記実施例１で得られた糖組成物溶液１００リットル
を、前記新ＭＣＩ分離方式のクロマト分離による三成分
分離を行って、以下に示す還元糖区分（表２）、ショ糖
区分（表３）、オリゴ糖区分（表４）の３区分を分離し
て得た。該クロマト分離に使用したクロマト分離装置
（三菱ダイアイオンＵＢＫ５３０Ｎａ型）には、総樹脂
容量１１リットルを充填し、運転負荷（０．０７５リッ
トル／ｈ・樹脂リットル、水使用比２．７５（ｖ／
ｖ））で運転した。その時の各区分における各成分の分
配率、及び各区分における各成分の比率を下記の表２〜
表４に示す。

【００６８】

【表２】

【００６９】

【表３】

【００７０】

【表４】

【００７１】前記表４によれば、オリゴ糖区分には、５
単糖であるフラクトシルニストースの含有量の極めて少
ない、１−ケストース（３単糖）及びニストース（４単
糖）を主体とするオリゴ糖組成物が得られたことがわか
る。

【００７２】〔実施例３〕１−ケストース及びニストースの分離 （第２段目のクロ
マト分離） 前記実施例２で得られたオリゴ糖区分を７０％（ｗ／
ｗ）に濃縮し３５リットルを得た。それを擬似移動床方
式を用いる二成分分離で１−ケストース区分とニストー
ス区分に分離した。クロマトカラムは総樹脂容量９リッ
トルのクロマト分離装置（三菱ダイヤイオンＵＢＫ５３
０Ｎａ型）で処理（運転負荷０．０２７リットル／ｈ・
樹脂リットル、水使用比較２．０（ｖ／ｖ））した。そ
の時の各区分における各成分の分配率及び各区分におけ
る各成分の比率は次の表５、表６のようになった。

【００７３】

【表５】

【００７４】

【表６】

【００７５】１−ケストース区分は下記の実施例４で述
べる１−ケストースの結晶製品化に供し、ニストース区
分は下記の実施例５で述べるニストースの結晶製品化に
供した。

【００７６】〔実施例４〕１−ケストースの結晶化 前記実施例３で得られた１−ケストース区分（１−ケス
トース純度８３．７％、５６％（ｗ／ｗ）液として約２
０リットル）をエバポレーターで９０％（ｗ／ｗ）にま
で濃縮し、これを結晶母液とした。８０℃にて１−ケス
トースの種結晶スラリー（２０ｍｌエタノール懸濁液）
を投入し、ゆるやかに大気圧下で撹拌しながら１７時間
かけ、８０℃から６５℃へ徐々に温度を下げることによ
り、均一な粒径（直径０．１〜０．２ｍ）の結晶が析出
した。６５℃条件下で遠心分離（３，０００ｒｐｍ）に
より結晶を分離し、純度９７％の１−ケストース結晶
６．２ｋｇを得た。

【００７７】その振り蜜純度は７３．４％であったの
で、これを９０％（ｗ／ｗ）に再び濃縮し、１−ケスト
ース種結晶スラリー（１０ｍｌ、エタノール懸濁液）を
投入し、ゆるやかに大気圧下で撹拌しながら２０時間か
け８０℃から６５℃へ徐々に温度を下げることにより、
再び均一な粒径の結晶が析出した。６５℃条件下で遠心
分離（３，０００ｒｐｍ）により結晶を分離し、純度９
６％の１−ケストース結晶２．５ｋｇを得た。その振り
蜜糖組成は、１−ケストース６４％、ニストース２５
％、ショ糖９％、Ｆ−ニストース２％であり、固形分と
して５．３ｋｇあった。このものは下記の実施例６に述
べる酵素反応液へ戻し、再利用することとした。

【００７８】〔実施例５〕ニストースの結晶化 前記実施例４で得られたニストース区分（ニストース純
度７６．０％、５６％（ｗ／ｗ）液として約１５リット
ル）をエバポレーターで８０％（ｗ／ｗ）にまで濃縮
し、これを結晶母液とした。６５℃にてニストース種結
晶スラリー（４０ｍｌエタノール懸濁液）を投入し、ゆ
るやかに大気圧下で撹拌しながら２４時間かけ、６５℃
から２０℃へ徐々に温度を下げることにより、均一な長
さ（０．２〜０．４ｍｍ）の結晶が析出した。室温にて
遠心分離（３，０００ｒｐｍ）により結晶を分離し、純
度９６％のニストース結晶５．１ｋｇを得た。

【００７９】その振り蜜のニストース純度は５８．２％
であったので、これを８０％（ｗ／ｗ）に再び濃縮し、
６５℃にてニストース種結晶スラリー（２０ｍｌ、エタ
ノール懸濁液）を投入し、ゆるやかに大気圧下で撹拌し
ながら２４時間かけ６５℃から２０℃へ徐々に温度を下
げることにより、再び均一な粒径（０．１〜０．３ｍ
ｍ）の結晶が析出した。室温にて遠心分離（３，０００
ｒｐｍ）により結晶を分離し、純度９４％のニストース
結晶１．７ｋｇを得た。この振り蜜糖組成は、ニストー
ス４２％、１−ケストース４７％、ショ糖５％、フラク
トシルニストース６％であり、固形分として３．７ｋｇ
あったので、このものは下記の実施例６に述べる酵素反
応液へ戻し、再利用することとした。

【００８０】〔実施例６〕リサイクル区分を混合した酵素反応による糖組成 前記実施例１における反応原液のかわりに、前記実施例
２におけるショ糖区分、前記実施例４における１−ケス
トース結晶化振り蜜、前記実施例５におけるニストース
結晶化振り蜜を混合したところ固形分重量としては３
６．９ｋｇになり、これにショ糖３３．１ｋｇを加え、
１００リットルとし、全糖量７０％（ｗ／ｖ）の反応液
を作成した。この中に前記実施例１で作成したＥ．ｒｅ
ｐｅｎｓ培養液３．３リットルを加え、５５℃にコント
ロールし、ゆっくり撹拌させながら２９時間反応させ
た。この時の反応前の糖組成と反応後糖組成を下記の表
７に示した。

【００８１】

【表７】

【００８２】以上の結果から、上記リサイクル区分を使
用した場合、純粋なショ糖を使用した場合と同様酵素反
応が順調に進み、かつ短時間で前記実施例１に示した糖
組成に落ちつくことが分かった。

【００８３】〔実施例７〕Ｅ．ｒｅｐｅｎｓ由来のフラクトシル転移酵素の精製 （１）粗酵素の調製Ｅｕｒｏｔｉｕｍ ｒｅｐｅｎｓ （ＦＥＲＭ Ｐ−１７
１９９）をフラスコ内に５００ｍｌの培地とともに入
れ、３０℃７日間の振とう培養を行った。培養物から菌
体を分離、洗浄し、湿重量６３ｇの洗浄菌体を得た。そ
の内の４３ｇを２００ｍｌの２０ｍＭリン酸バッファ
（ｐＨ７．０）で懸濁した。超音波破砕、遠心分離して
得られた上澄み液２００ｍｌを粗酵素標品とした。

【００８４】（２）ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ６Ｂカ
ラム処理 １０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＤＥ
ＡＥ−セファロースＣＬ６Ｂカラム（径３０ｍｍ、長さ
２７０ｍｍ）に１７９ユニットの活性を有する上記粗酵
素を適用し、同じ緩衝液で洗浄した。吸着した酵素蛋白
質は食塩濃度を０から１Ｍまで直線的に上げることによ
り、１時間あたり４０ｍｌの流速で溶出した。１フラク
ション１０ｍｌとし活性区分（７２〜７６フラクショ
ン）を集め、限外ろ過により濃縮した。

【００８５】（３）トヨパールＨＷ−５５Ｓカラム処理 前記工程（２）で限外ろ過により濃縮した酵素溶液を、
トリス−塩酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）で透析
し、同一の緩衝液で平衡化したトヨパールＨＷ−５５Ｓ
カラム（径２６ｍｍ、長さ４２０ｍｍ）に適用し、同緩
衝液で各５ｍｌずつ分画した。活性を示した４９〜５９
フラクションを集め、限外ろ化により濃縮した。

【００８６】（４）トヨパールＨＷ−６５Ｓカラム処理 前記工程（３）で限外ろ過により濃縮した酵素溶液を、
トリス−塩酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）で平衡化
したトヨパールＨＷ−６５Ｓカラム（径２６ｍｍ、長さ
４２０ｍｍ）に適用し、同緩衝液で各５ｍｌずつ分画し
た。活性を示した５４〜６２フラクションを集め、限外
ろ過により濃縮した。

【００８７】（５）フェニル−トヨパール６５０Ｓカラ
ム処理 前記工程（４）で限外ろ過により濃縮した酵素溶液を、
２ｍＭメルカプトエタノールと５０％飽和硫安を含む
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したフェ
ニル−トヨパール６５０Ｓカラム（径ｌ６ｍｍ、長さ１
６５ｍｍ）に適用した。吸着した酵素蛋白質は硫安濃度
を５０％から０％飽和に直線的に下げることにより溶出
した。流速を３０ｍｌ／ｈとし、１フラクション２．５
ｍｌとした時、活性は６１から６４フラクションに認め
られた。

【００８８】該フラクションについて限外ろ過により濃
縮した精製酵素を再びフェニル−トヨパール６５０Ｓカ
ラムに適用した。同一条件で溶出し、活性区分を集め、
限外ろ過により濃縮した。その後、本精製酵素をポリア
クリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により検定
し、単一バンドにまで精製されたことを確かめた。

【００８９】以上の手順により得られた結果（総タンパ
ク量、全活性、比活性、精製度、収率）を下記の表８に
示す。

【００９０】

【表８】

【００９１】表８によれば、最終精製品について、比活
性は１２６０ユニット／ｍｇまで上昇し、活性の回収率
は１５．４％、粗酵素より１８３００倍精製された（な
お、２ステップから３ステップ目で活性が上昇している
が、これは２ステップ目の精製操作において何等かの原
因で、可逆的な阻害があったためであろうと推測され
る。）。

【００９２】

【発明の効果】本発明のフラクトシル転移酵素は、シュ
ークロースを基質として作用させた場合、前記式（１）
で示されるように、１−ケストース及びニストースの生
成量に比べてフラクトシルニストースの生成量が微量で
あるという特徴を有するので、クロマト分離法による１
−ケストース及びニストース分離において、フラクトシ
ルニストースの影響を無くすことができ、効率の良い分
離を行うことができる。したがって、酵素反応法による
フラクトオリゴ糖の工業的な製造に適す。

【００９３】本発明の１−ケストース結晶及びニストー
ス結晶の製造方法は、第１段目のクロマト分離で生ずる
ショ糖区分、１−ケストース結晶工程で生ずる振り密、
ニストース結晶工程で生ずる振り密を完全に再利用で
き、無駄のない高効率な製造サイクルを実現できる。

【００９４】１−ケストース、ニストースの有する各々
の特性（例えば１−ケストースはフラクトオリゴ糖の中
でビフィズス菌活性が最も強い、ニストースは結晶水を
とりこむ作用があり食べられる乾燥剤としての有用性が
ある）を生かした商品が提供可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のフラクトシル転移酵素を種々の温度に
保持した場合の相対酵素活性（％）をグラフにして示
す。

【図２】基質としてショ糖を濃度７０％（Ｗ／Ｖ）溶液
に調整し、該基質溶液１リットルあたり５ｇの湿菌体を
本発明のフラクトシル転移酵素の粗酵素として入れ、５
５℃、種々のｐＨで１６時間反応させ、生産された１−
ケストース量を測定して得られた結果をグラフとして示
す。

【図３】基質としてショ糖を濃度７０％（Ｗ／Ｖ）溶液
に調整し、該基質溶液１リットルあたり５ｇの湿菌体を
本発明のフラクトシル転移酵素の粗酵素として入れ、ｐ
Ｈ６．０で種々の温度で２４時間反応させ、生産された
１−ケストース量を測定して得られた結果をグラフとし
て示す。

【図４】本発明のフラクトシル転移酵素の粗酵素液３．
３リットルを７０％（Ｗ／Ｖ）ショ糖溶液１００リット
ルに、最適条件下（ｐＨ６．５、５５℃）で作用させて
酵素反応を行わせたときの反応時間に対する、ショ糖濃
度、１−ケストース濃度、ニストース濃度、フラクトシ
ルニストース濃度の関係をグラフとして示す。

【図５】本発明の１−ケストース結晶及びニストース結
晶の製造方法の工程を示すフロー図である。

【符号の説明】

１ 反応槽 ２ 第１段目のクロマト分離塔 ３ 第２段目のクロマト分離塔 ４ リサイクルタンク

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 古賀 裕 北海道上川郡清水町第１線71番地 ホクレ ン農業協同組合連合会清水製糖工場内 (72)発明者 塩見 ▲徳▼夫 北海道札幌市厚別区上野幌２条４丁目１− 29 (72)発明者 小野寺 秀一 北海道札幌市白石区平和通１丁目北７−23 アサヒ平和ビル303 (72)発明者 佐々木 博 北海道札幌市豊平区西岡１条４丁目２−11 Ｆターム(参考） 4B050 DD03 LL02 LL05 4B064 AF04 CA05 CA21 CE10 CE15 DA10

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 エウロチウム属に属する微生物の生産す
   るフラクトシル転移酵素であって、且つ０．１Ｍ以上の
   シュークロースを基質として反応させた場合に反応生成
   物としてのフラクトオリゴ糖の組成比が、次式、 フラクトシルニストース／（１−ケストース＋ニストー
   ス）＜０．０５ で表すことができるフラクトオリゴ糖を生じる能力を有
   するフラクトシル転移酵素。
2. 【請求項２】 前記エウロチウム属に属する微生物が、
   エウロチウム・リーペンス（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ ｒｅｐ
   ｅｎｓｅ）である請求項１記載のフラクトシル転移酵
   素。
3. 【請求項３】 エウロチウム属に属する微生物菌体、該
   微生物の培養液、及びそれらから抽出精製される酵素か
   らなる群から選ばれた生体触媒を用い、０．１Ｍ以上の
   ショ糖を基質にして作用させて、反応溶液中にフラクト
   オリゴ糖を生成させ、 該フラクトオリゴ糖の組成比が、次式、 フラクトシルニストース／（１−ケストース＋ニストー
   ス）＜０．０５ で表されることを特徴とするフラクトオリゴ糖の製造方
   法。
4. 【請求項４】 前記エウロチウム属に属する微生物が、
   エウロチウム・リーペンス（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ ｒｅｐ
   ｅｎｓｅ）である請求項３記載の１−ケストース及びニ
   ストースの混合物の製造方法。
5. 【請求項５】 請求項３における、次式、 フラクトシルニストース／（１−ケストース＋ニストー
   ス）＜０．０５ で表される組成のフラクトオリゴ糖を含む反応液から、
   １−ケストース及びニストースをクロマト分離により各
   フラクトオリゴ糖に分離することを特徴とする１−ケス
   トース及びニストースの分別製造方法。
6. 【請求項６】 前記クロマト分離は、第１段目のクロマ
   ト分離と第２段目のクロマト分離から構成され、 第１段目のクロマト分離により、還元糖を主成分とする
   第１フラクション、未反応ショ糖を主成分とする第２フ
   ラクション、並びに１−ケストース及びニストースを主
   成分とする第３フラクションに分け、 前記第３フラクションを第２段目のクロマト分離によ
   り、１−ケストース及びニストースの個別のフラクトオ
   リゴ糖に分離することを特徴とする請求項５記載の１−
   ケストース及びニストースの分別製造方法。
7. 【請求項７】 前記第２段目のクロマト分離は、擬似移
   動床方式である請求項６記載の１−ケストース及びニス
   トースの分別製造方法。
8. 【請求項８】 請求項５、６又は７で得られた１−ケス
   トースを結晶化することを特徴とする１−ケストース結
   晶の製造方法。
9. 【請求項９】 請求項５、６又は７で得られたニストー
   スを結晶化することを特徴とするニストース結晶の製造
   方法。
10. 【請求項１０】 （１）エウロチウム属に属する微生物
    菌体、該微生物の培養液、及びそれらから抽出精製され
    るフラクトシル転移酵素から選ばれた生体触媒として用
    い、０．１Ｍ以上のショ糖を基質にして作用させて、反
    応溶液中にフラクトオリゴ糖を生成させ、 （２）得られた反応溶液を第１段目のクロマト分離によ
    り、還元糖を主成分とする第１フラクション、未反応シ
    ョ糖を主成分とする第２フラクション、並びに１−ケス
    トース及びニストースを主成分とする第３フラクション
    に分け、 （３）前記未反応ショ糖を主成分とする第２フラクショ
    ンをリサイクルタンクに集め、 （４）前記１−ケストース及びニストースを主成分とす
    る第３フラクションを、第２段目のクロマト分離によ
    り、１−ケストース区分とニストース区分に分離し、 （５）前記工程で得られた１−ケストース区分を結晶化
    させて１−ケストース結晶と振り密を得、 （６）前記工程で得られたニストース区分を結晶化させ
    てニストース結晶と振り密を得、 （７）前記１−ケストース結晶工程で生ずる振り密と前
    記ニストース結晶工程で生ずる振り密を前記リサイクル
    タンクに集め、 （８）リサイクルタンクに集められている混合物に対し
    て、基質としてのショ糖が０．１Ｍ以上となるように、
    さらにショ糖を添加してショ糖濃度を調整し、 （９）前記工程で得られたショ糖濃度の調整された混合
    物を基質であるショ糖原料として、前記生体触媒に再度
    適用して、前記工程を繰り返すことを特徴とする１−ケ
    ストース結晶及びニストース結晶の分別製造方法。