JP2000279172A - 新規なインドール酸化酵素をコードするｄｎａとその利用 - Google Patents
新規なインドール酸化酵素をコードするｄｎａとその利用Info
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Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 微生物を用いてインジゴを従来よりも効率よ
く製造する方法を提供する。 【解決手段】 アシネトバクター属に属するインジゴ生
産菌からインドール酸化酵素をコードするＤＮＡを単離
し、同ＤＮＡを含む組換えベクターで形質転換された微
生物の形質転換体又はその形質転換体の培養物から採取
したインドール酸化酵素の粗精製画分もしくは精製酵素
を、インドールを含有する水性溶液に加えてインジゴを
生成させることにより、インジゴを製造する。
く製造する方法を提供する。 【解決手段】 アシネトバクター属に属するインジゴ生
産菌からインドール酸化酵素をコードするＤＮＡを単離
し、同ＤＮＡを含む組換えベクターで形質転換された微
生物の形質転換体又はその形質転換体の培養物から採取
したインドール酸化酵素の粗精製画分もしくは精製酵素
を、インドールを含有する水性溶液に加えてインジゴを
生成させることにより、インジゴを製造する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、インドール酸化酵
素をコードするＤＮＡ及びその利用に関し、詳しくは、
アシネトバクター・エスピー．(Acinetobacter sp.)Ｍ
Ｙ−１５株由来のインドール酸化酵素をコードするＤＮ
Ａ、及びこのＤＮＡを導入した形質転換体を用いてイン
ドールを酸化することによりインジゴを生成させる方法
に関する。
素をコードするＤＮＡ及びその利用に関し、詳しくは、
アシネトバクター・エスピー．(Acinetobacter sp.)Ｍ
Ｙ−１５株由来のインドール酸化酵素をコードするＤＮ
Ａ、及びこのＤＮＡを導入した形質転換体を用いてイン
ドールを酸化することによりインジゴを生成させる方法
に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来インジゴは、化学合成法により製造
され、工業用染料として広く利用されている。しかしな
がら化学合成法は、反応が多段階になるので収率が悪
く、また化学的分解による副産物が多い等の欠点があっ
た。
され、工業用染料として広く利用されている。しかしな
がら化学合成法は、反応が多段階になるので収率が悪
く、また化学的分解による副産物が多い等の欠点があっ
た。
【０００３】一方、インジゴを製造する種々の方法の中
で有望視されている方法として、微生物又はその酵素も
しくは同酵素をコードする遺伝子を用いる方法が知られ
ている。例えば、シュードモナス属微生物を用いてイン
ドールから製造する方法｛P.M.M. Gray: Proc. Royal S
oc. London, ser. B, vol.102, p2263-2279(1928)、特
開平4-287691号公報｝、ミコバクテリウム属微生物を用
いてインドールから製造する方法｛O. Sebck and H. ae
ger: Nature, vol.196, p79-795(1962)｝、マイクロコ
ッカス属微生物を用いてインドールから製造する方法
｛M. Fujioka andH. Wada: Biochimica et Biophysica
Acta, vol.158, p70-78(1968)｝、シュードモナス属微
生物由来のキシレンオキシゲナーゼ遺伝子またはナフタ
レンオキシゲナーゼ遺伝子を連結したプラスミドを含有
するEscherichia coliを酵素触媒として用い、インドー
ルから製造する方法｛Burt D. Ensley, Barry J. Ratzk
in,Timthy D. Osslund and Mary J. Simon; Science, v
ol.222, p167-169(1983)｝、モルセラ属菌を用いてイン
ドールから製造する方法｛J. Eyal, Md. A. Mabud,and
J.F. Walter; Applied Biochemistry and Biotechnolog
y, vol.30, p303-312(1991)｝、ロドコッカス属微生物
由来の色素生成遺伝子を連結したプラスミドを含有する
Escherichia coliを酵素触媒として用い、インドールか
ら製造する方法｛S. Hart and D.R. Woods; Journal of
General Microbiology, vol.138, p205-509(1992)｝等
が挙げられる。しかし、これらの方法は、いずれも実用
的な製造技術を確立するには至っておらず、効率よくイ
ンジゴを製造する方法の開発が望まれている。
で有望視されている方法として、微生物又はその酵素も
しくは同酵素をコードする遺伝子を用いる方法が知られ
ている。例えば、シュードモナス属微生物を用いてイン
ドールから製造する方法｛P.M.M. Gray: Proc. Royal S
oc. London, ser. B, vol.102, p2263-2279(1928)、特
開平4-287691号公報｝、ミコバクテリウム属微生物を用
いてインドールから製造する方法｛O. Sebck and H. ae
ger: Nature, vol.196, p79-795(1962)｝、マイクロコ
ッカス属微生物を用いてインドールから製造する方法
｛M. Fujioka andH. Wada: Biochimica et Biophysica
Acta, vol.158, p70-78(1968)｝、シュードモナス属微
生物由来のキシレンオキシゲナーゼ遺伝子またはナフタ
レンオキシゲナーゼ遺伝子を連結したプラスミドを含有
するEscherichia coliを酵素触媒として用い、インドー
ルから製造する方法｛Burt D. Ensley, Barry J. Ratzk
in,Timthy D. Osslund and Mary J. Simon; Science, v
ol.222, p167-169(1983)｝、モルセラ属菌を用いてイン
ドールから製造する方法｛J. Eyal, Md. A. Mabud,and
J.F. Walter; Applied Biochemistry and Biotechnolog
y, vol.30, p303-312(1991)｝、ロドコッカス属微生物
由来の色素生成遺伝子を連結したプラスミドを含有する
Escherichia coliを酵素触媒として用い、インドールか
ら製造する方法｛S. Hart and D.R. Woods; Journal of
General Microbiology, vol.138, p205-509(1992)｝等
が挙げられる。しかし、これらの方法は、いずれも実用
的な製造技術を確立するには至っておらず、効率よくイ
ンジゴを製造する方法の開発が望まれている。
【０００４】従来よりも効率よくインジゴを製造する方
法として、アシネトバクター属に属するインジゴ生産菌
をインドールを含む水性溶液に作用させてインジゴを製
造する方法（特開平７−３２７６９０号）、及び同方法
においてインドールを含む水溶液で酸化剤を添加する方
法（特開平８−８９２７１号）が提案されている。これ
らの方法により収率は向上したが、未だ改善の余地があ
る。
法として、アシネトバクター属に属するインジゴ生産菌
をインドールを含む水性溶液に作用させてインジゴを製
造する方法（特開平７−３２７６９０号）、及び同方法
においてインドールを含む水溶液で酸化剤を添加する方
法（特開平８−８９２７１号）が提案されている。これ
らの方法により収率は向上したが、未だ改善の余地があ
る。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記観点か
らなされたものであり、微生物を用いてインジゴを従来
よりも効率よく製造する方法を提供することを課題とす
る。
らなされたものであり、微生物を用いてインジゴを従来
よりも効率よく製造する方法を提供することを課題とす
る。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意検討を行い、インドール酸化酵素
遺伝子を取得し、これを適当なベクターを用いて微生物
に導入し、菌体内に同遺伝子を多コピー保持する形質転
換体を得ることが出来れば、微生物の触媒能力を従来の
方法に比して飛躍的に増大させることが可能となると考
えた。そして、アシネトバクター・エスピー．（Acinet
obacter sp.）MY-15の菌体からインドール酸化酵素をコ
ードするＤＮＡ断片を単離することに成功し、同ＤＮＡ
断片を含む組換えベクターで微生物を形質転換して、イ
ンドール酸化酵素活性が向上した形質転換体を調製し、
これを利用してインジゴ生産性を大幅に向上させること
に成功し、本発明を完成するに至った。
を解決するために鋭意検討を行い、インドール酸化酵素
遺伝子を取得し、これを適当なベクターを用いて微生物
に導入し、菌体内に同遺伝子を多コピー保持する形質転
換体を得ることが出来れば、微生物の触媒能力を従来の
方法に比して飛躍的に増大させることが可能となると考
えた。そして、アシネトバクター・エスピー．（Acinet
obacter sp.）MY-15の菌体からインドール酸化酵素をコ
ードするＤＮＡ断片を単離することに成功し、同ＤＮＡ
断片を含む組換えベクターで微生物を形質転換して、イ
ンドール酸化酵素活性が向上した形質転換体を調製し、
これを利用してインジゴ生産性を大幅に向上させること
に成功し、本発明を完成するに至った。
【０００７】かくして本発明によれば、（１）下記
（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ
断片： （Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有す
るタンパク質、（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミ
ノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、
欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からな
り、かつ、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するイ
ンドール酸化酵素のβサブユニットとともにインドール
を酸化することによりインジゴを生成させる反応を触媒
する活性を有するタンパク質を構成し得るポリペプチ
ド； （２）下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである（１）
記載のＤＮＡ断片： （ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列を含むＤＮ
Ａ、（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列とスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、配列
番号４に記載のアミノ酸配列を有するインドール酸化酵
素のβサブユニットとともに、インドールを酸化するこ
とによりインジゴを生成させる反応を触媒する活性を有
するタンパク質を構成し得るポリペプチドをコードする
ＤＮＡ； （３）下記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すタンパク質をコード
するＤＮＡ断片： （Ｃ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有す
るタンパク質、（Ｄ）配列表の配列番号４に記載のアミ
ノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、
欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からな
り、かつ、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するイ
ンドール酸化酵素のαサブユニットとともにインドール
を酸化することによりインジゴを生成させる反応を触媒
する活性を有するタンパク質を構成し得るポリペプチ
ド； （４）下記（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡである（３）
記載のＤＮＡ断片： （ｃ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列を含むＤＮ
Ａ、（ｄ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列とスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、配列
番号２に記載のアミノ酸配列を有するインドール酸化酵
素のαサブユニットとともに、インドールを酸化するこ
とによりインジゴを生成させる反応を触媒する活性を有
するタンパク質を構成し得るポリペプチドをコードする
ＤＮＡ； （５）前記（１）又は（２）に記載のＤＮＡ、及び請求
項３又は４に記載のＤＮＡ断片を含むＤＮＡ； （６）前記（１）〜（５）のいずれかに記載のＤＮＡが
ベクターに連結された組換えベクター； （７）前記（１）〜（５）のいずれかに記載のＤＮＡが
導入されることより形質転換された形質転換体； （８）前記（７）に記載の形質転換体を培地で培養し、
その培養物からインドール酸化酵素又はそのサブユニッ
トを採取することを特徴とするインドール酸化酵素又は
そのサブユニットの製造法；及び （９）前記（７）に記載の形質転換体、またはこの形質
転換体の培養物から採取したインドール酸化酵素の粗精
製画分もしくは精製酵素を、インドールを含有する水性
溶液に加えてインジゴを生成させることを特徴とするイ
ンジゴの製造法；が提供される。
（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ
断片： （Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有す
るタンパク質、（Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミ
ノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、
欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からな
り、かつ、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するイ
ンドール酸化酵素のβサブユニットとともにインドール
を酸化することによりインジゴを生成させる反応を触媒
する活性を有するタンパク質を構成し得るポリペプチ
ド； （２）下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである（１）
記載のＤＮＡ断片： （ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列を含むＤＮ
Ａ、（ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列とスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、配列
番号４に記載のアミノ酸配列を有するインドール酸化酵
素のβサブユニットとともに、インドールを酸化するこ
とによりインジゴを生成させる反応を触媒する活性を有
するタンパク質を構成し得るポリペプチドをコードする
ＤＮＡ； （３）下記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すタンパク質をコード
するＤＮＡ断片： （Ｃ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有す
るタンパク質、（Ｄ）配列表の配列番号４に記載のアミ
ノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、
欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からな
り、かつ、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するイ
ンドール酸化酵素のαサブユニットとともにインドール
を酸化することによりインジゴを生成させる反応を触媒
する活性を有するタンパク質を構成し得るポリペプチ
ド； （４）下記（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡである（３）
記載のＤＮＡ断片： （ｃ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列を含むＤＮ
Ａ、（ｄ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列とスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、配列
番号２に記載のアミノ酸配列を有するインドール酸化酵
素のαサブユニットとともに、インドールを酸化するこ
とによりインジゴを生成させる反応を触媒する活性を有
するタンパク質を構成し得るポリペプチドをコードする
ＤＮＡ； （５）前記（１）又は（２）に記載のＤＮＡ、及び請求
項３又は４に記載のＤＮＡ断片を含むＤＮＡ； （６）前記（１）〜（５）のいずれかに記載のＤＮＡが
ベクターに連結された組換えベクター； （７）前記（１）〜（５）のいずれかに記載のＤＮＡが
導入されることより形質転換された形質転換体； （８）前記（７）に記載の形質転換体を培地で培養し、
その培養物からインドール酸化酵素又はそのサブユニッ
トを採取することを特徴とするインドール酸化酵素又は
そのサブユニットの製造法；及び （９）前記（７）に記載の形質転換体、またはこの形質
転換体の培養物から採取したインドール酸化酵素の粗精
製画分もしくは精製酵素を、インドールを含有する水性
溶液に加えてインジゴを生成させることを特徴とするイ
ンジゴの製造法；が提供される。
【０００８】本発明の「インドール酸化酵素」とは、イ
ンドールを酸化することによりインジゴを生成させる反
応を触媒する活性を有する酵素を意味する。
ンドールを酸化することによりインジゴを生成させる反
応を触媒する活性を有する酵素を意味する。
【０００９】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係るインドール酸化酵素は、αおよびβサブユ
ニットからなるヘテロ２量体である。本発明の第一のＤ
ＮＡは、インドール酸化酵素のαサブユニットをコード
する。また、本発明の第二のＤＮＡは、インドール酸化
酵素のβサブユニットをコードする。さらに、本発明の
第三のＤＮＡは、これらのインドール酸化酵素のαサブ
ユニットをコードするＤＮＡ及びβサブユニットをコー
ドするＤＮＡをともに含むＤＮＡである。以下、本明細
書では、インドール酸化酵素の各サブユニットをコード
するＤＮＡ断片、及びこれらのＤＮＡ断片をともに含む
ＤＮＡを、便宜上「インドール酸化酵素遺伝子」という
ことがある。
本発明に係るインドール酸化酵素は、αおよびβサブユ
ニットからなるヘテロ２量体である。本発明の第一のＤ
ＮＡは、インドール酸化酵素のαサブユニットをコード
する。また、本発明の第二のＤＮＡは、インドール酸化
酵素のβサブユニットをコードする。さらに、本発明の
第三のＤＮＡは、これらのインドール酸化酵素のαサブ
ユニットをコードするＤＮＡ及びβサブユニットをコー
ドするＤＮＡをともに含むＤＮＡである。以下、本明細
書では、インドール酸化酵素の各サブユニットをコード
するＤＮＡ断片、及びこれらのＤＮＡ断片をともに含む
ＤＮＡを、便宜上「インドール酸化酵素遺伝子」という
ことがある。
【００１０】本発明のインドール酸化酵素の各サブユニ
ットをコードする遺伝子は、アシネトバクター属細菌か
らクローニングすることにより得られたものであるが、
本発明によりその塩基配列が決定されたので、この配列
に基づいて合成することも可能である。また、この配列
に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとす
るバイブリダイゼーションによって、又は前記配列に基
づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとする
ＰＣＲによって、アシネトバクター属細菌染色体ＤＮＡ
ライブラリーから単離することもできる。
ットをコードする遺伝子は、アシネトバクター属細菌か
らクローニングすることにより得られたものであるが、
本発明によりその塩基配列が決定されたので、この配列
に基づいて合成することも可能である。また、この配列
に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとす
るバイブリダイゼーションによって、又は前記配列に基
づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとする
ＰＣＲによって、アシネトバクター属細菌染色体ＤＮＡ
ライブラリーから単離することもできる。
【００１１】アシネトバクター属細菌としては、アシネ
トバクター・エスピー．ＭＹ−１５株、アシネトバクタ
ー・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticu
s)ＡＴＣＣ１９６０６株、アシネトバクター・エスピ
ー．ＶＡ−６６株、及びアシネトバクター・エスピー．
ＶＡ−２５１株等が挙げられる。こらの菌株は、キシレ
ン、安息香酸等を主炭素源とする培地で生育する微生物
の中から、インジゴ生産菌として分離された株である
（特開平８−８９２７１号）。ＭＹ−１５株、ＶＡ−６
６株及びＶＡ−２５１株は、通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所（郵便番号305-8566日本国茨城県つ
くば市東一丁目１番３号）に、それぞれ順にＦＥＲＭＢ
Ｐ−４６１３、ＦＥＲＭＢＰ−４７７０、及びＦＥＲＭ
ＢＰ−４７７１の受託番号で、ブダペスト条約に基づき
国際寄託されている。後記実施例では、インドール酸化
酵素は、アシネトバクター・エスピー．ＭＹ−１５株か
ら単離された。
トバクター・エスピー．ＭＹ−１５株、アシネトバクタ
ー・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticu
s)ＡＴＣＣ１９６０６株、アシネトバクター・エスピ
ー．ＶＡ−６６株、及びアシネトバクター・エスピー．
ＶＡ−２５１株等が挙げられる。こらの菌株は、キシレ
ン、安息香酸等を主炭素源とする培地で生育する微生物
の中から、インジゴ生産菌として分離された株である
（特開平８−８９２７１号）。ＭＹ−１５株、ＶＡ−６
６株及びＶＡ−２５１株は、通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所（郵便番号305-8566日本国茨城県つ
くば市東一丁目１番３号）に、それぞれ順にＦＥＲＭＢ
Ｐ−４６１３、ＦＥＲＭＢＰ−４７７０、及びＦＥＲＭ
ＢＰ−４７７１の受託番号で、ブダペスト条約に基づき
国際寄託されている。後記実施例では、インドール酸化
酵素は、アシネトバクター・エスピー．ＭＹ−１５株か
ら単離された。
【００１２】以下に、上記微生物からインドール酸化酵
素の各サブユニット遺伝子を取得する方法、これらの遺
伝子産物であるインドール酸化酵素の製造法、およびイ
ンドールを酸化してインジゴを生成させる方法の一例を
説明する。
素の各サブユニット遺伝子を取得する方法、これらの遺
伝子産物であるインドール酸化酵素の製造法、およびイ
ンドールを酸化してインジゴを生成させる方法の一例を
説明する。
【００１３】インドール酸化酵素遺伝子は、通常上記の
供給源微生物の染色体上に存在し、染色体由来のＤＮＡ
ライブラリーから以下に述べるショットガンクローニン
グ法により分離・取得することができる。
供給源微生物の染色体上に存在し、染色体由来のＤＮＡ
ライブラリーから以下に述べるショットガンクローニン
グ法により分離・取得することができる。
【００１４】（１）インドール酸化酵素遺伝子を含む染
色体ＤＮＡ断片の単離：アシネトバクター・エスピー．
ＭＹ−１５株の菌体から、インドール酸化酵素遺伝子を
含む染色体ＤＮＡを単離する方法は、遺伝子の単離に関
する公知のいずれの方法もが使用できる。以下にその一
例を説明する。
色体ＤＮＡ断片の単離：アシネトバクター・エスピー．
ＭＹ−１５株の菌体から、インドール酸化酵素遺伝子を
含む染色体ＤＮＡを単離する方法は、遺伝子の単離に関
する公知のいずれの方法もが使用できる。以下にその一
例を説明する。
【００１５】（Ａ）染色体ＤＮＡバンクの作製：上記菌
株より染色体ＤＮＡを抽出する際には、適当な培地で培
養した該菌株の菌体を使用することができるが、培養し
た菌体を集菌後に凍結保存した保存試料を使用すること
も可能である。
株より染色体ＤＮＡを抽出する際には、適当な培地で培
養した該菌株の菌体を使用することができるが、培養し
た菌体を集菌後に凍結保存した保存試料を使用すること
も可能である。
【００１６】得られた染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、
例えばＥｃｏＲＩを用いて分解し、エシェリヒア・コリ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等の宿主−ベク
ター系を用いて染色体ＤＮＡバンクを作製する。具体的
に使用し得るベクターとしては、例えばｐＵＣ１１８
（宝酒造製）、ｐＢＲ３２２（宝酒造製）、コスミドｐ
ＷＥ−１５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミ
ドベクターが挙げられる。
例えばＥｃｏＲＩを用いて分解し、エシェリヒア・コリ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等の宿主−ベク
ター系を用いて染色体ＤＮＡバンクを作製する。具体的
に使用し得るベクターとしては、例えばｐＵＣ１１８
（宝酒造製）、ｐＢＲ３２２（宝酒造製）、コスミドｐ
ＷＥ−１５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミ
ドベクターが挙げられる。
【００１７】上記ＥｃｏＲＩ分解により得られる様々な
ＤＮＡ断片の上記プラスミドベクターへの挿入、例えば
ｐＵＣ１１８（宝酒造製）への挿入は、制限酵素、例え
ばＥｃｏＲＩで開裂したベクターとＥｃｏＲＩ分解ＤＮ
Ａ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結することに
より行うことができる。かくして染色体ＤＮＡバンクが
得られる。
ＤＮＡ断片の上記プラスミドベクターへの挿入、例えば
ｐＵＣ１１８（宝酒造製）への挿入は、制限酵素、例え
ばＥｃｏＲＩで開裂したベクターとＥｃｏＲＩ分解ＤＮ
Ａ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結することに
より行うことができる。かくして染色体ＤＮＡバンクが
得られる。
【００１８】（Ｂ）インドール酸化酵素遺伝子を含むベ
クターの選別：上記（Ａ）項で調製した染色体ＤＮＡバ
ンクからインドール酸化酵素遺伝子を含むベクターを選
別するには、この染色体ＤＮＡバンクを用いて宿主微生
物、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ）の形質導入あるいは形質転換を行い、得
られる形質導入体あるいは形質転換体から、適当な手段
によりインドール酸化酵素遺伝子を保持するクローンを
選別すればよい。
クターの選別：上記（Ａ）項で調製した染色体ＤＮＡバ
ンクからインドール酸化酵素遺伝子を含むベクターを選
別するには、この染色体ＤＮＡバンクを用いて宿主微生
物、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ）の形質導入あるいは形質転換を行い、得
られる形質導入体あるいは形質転換体から、適当な手段
によりインドール酸化酵素遺伝子を保持するクローンを
選別すればよい。
【００１９】具体的には、上記プラスミドベクターをエ
シェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）、例えばＪＭ１０９（宝酒造製）を通常の方法［Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒ
ｅｓｓ （１９８９）等参照］にて形質転換し、インド
ールを含有する寒天培地上に生育させることによりコロ
ニーを形成させる。
シェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）、例えばＪＭ１０９（宝酒造製）を通常の方法［Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒ
ｅｓｓ （１９８９）等参照］にて形質転換し、インド
ールを含有する寒天培地上に生育させることによりコロ
ニーを形成させる。
【００２０】生育したコロニーのうち、青の呈色を示し
ているコロニーより、通常の方法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８
９）等参照］によりプラスミドＤＮＡの抽出を行う。
ているコロニーより、通常の方法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８
９）等参照］によりプラスミドＤＮＡの抽出を行う。
【００２１】こうして、アシネトバクター・エスピー．
ＭＹ−１５株の染色体ＤＮＡ由来のインドール酸化酵素
遺伝子を有するプラスミドベクターを含む形質転換体を
選別し、プラスミドＤＮＡを抽出することが可能であ
る。
ＭＹ−１５株の染色体ＤＮＡ由来のインドール酸化酵素
遺伝子を有するプラスミドベクターを含む形質転換体を
選別し、プラスミドＤＮＡを抽出することが可能であ
る。
【００２２】更に、上記のようにして抽出したプラスミ
ドＤＮＡを、適当な制限酵素、例えばＥｃｏＲＩでベク
ターから切り出すことにより、本発明のＤＮＡを取得す
ることができる。
ドＤＮＡを、適当な制限酵素、例えばＥｃｏＲＩでベク
ターから切り出すことにより、本発明のＤＮＡを取得す
ることができる。
【００２３】このようにして得られるＤＮＡ断片の１つ
として、上記アシネトバクター・エスピー．ＭＹ−１５
株の染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩの完全分解によ
り切断して得られる、大きさが約２．８ｋｂのＤＮＡ断
片を挙げることができる。
として、上記アシネトバクター・エスピー．ＭＹ−１５
株の染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩの完全分解によ
り切断して得られる、大きさが約２．８ｋｂのＤＮＡ断
片を挙げることができる。
【００２４】（２）塩基配列の決定：前記（１）項で得
られたＥｃｏＲＩの２．８ｋｂのＤＮＡ断片の全塩基配
列は、例えばプラスミドｐＵＣ１１８ベクタ−（宝酒造
（株）製）を用いるダイデオキシヌクレオチド酵素法
［dideoxy chain termination法、Sanger et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, Vol.74, p.5463 (1977)］によ
り決定することができる。
られたＥｃｏＲＩの２．８ｋｂのＤＮＡ断片の全塩基配
列は、例えばプラスミドｐＵＣ１１８ベクタ−（宝酒造
（株）製）を用いるダイデオキシヌクレオチド酵素法
［dideoxy chain termination法、Sanger et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, Vol.74, p.5463 (1977)］によ
り決定することができる。
【００２５】後記実施例において、上記のようにしてア
シネトバクター・エスピー．ＭＹ−１５株から単離さ
れ、決定された約２．８ｋｂのＤＮＡ断片には、２つの
オープンリーデイングフレームの存在が確認された。ア
シネトバクター・エスピー．ＭＹ−１５株のインドール
酸化酵素遺伝子は、２つの異なるオープンリーディング
フレームから構成されており、それぞれ配列番号１に示
す４１３個からなるアミノ酸配列をコードする１２３９
塩基対、および１７８個からなるアミノ酸配列をコード
する５３７塩基対から構成されることがわかった。
シネトバクター・エスピー．ＭＹ−１５株から単離さ
れ、決定された約２．８ｋｂのＤＮＡ断片には、２つの
オープンリーデイングフレームの存在が確認された。ア
シネトバクター・エスピー．ＭＹ−１５株のインドール
酸化酵素遺伝子は、２つの異なるオープンリーディング
フレームから構成されており、それぞれ配列番号１に示
す４１３個からなるアミノ酸配列をコードする１２３９
塩基対、および１７８個からなるアミノ酸配列をコード
する５３７塩基対から構成されることがわかった。
【００２６】上記の塩基配列を包含する本発明のインド
ール酸化酵素遺伝子は、天然のアシネトバクターの染色
体ＤＮＡから分離されたもののみならず、通常用いられ
るＤＮＡ合成装置、例えばアプライド・バイオシステム
ズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製３９
４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて合成されたも
のであってもよい。
ール酸化酵素遺伝子は、天然のアシネトバクターの染色
体ＤＮＡから分離されたもののみならず、通常用いられ
るＤＮＡ合成装置、例えばアプライド・バイオシステム
ズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製３９
４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて合成されたも
のであってもよい。
【００２７】尚、本発明のインドール酸化酵素をコード
するＤＮＡは、配列番号１及び配列番号３に示す塩基配
列に限定されるものではなく、配列番号２及び配列番号
４に示すアミノ酸配列をコードし得るものであればよ
い。また、本発明のインドール酸化酵素のαサブユニッ
トをコードするＤＮＡは、配列番号２に示すアミノ酸配
列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠
失、挿入、付加、又は逆位等の変異を含むアミノ酸配列
からなるものであっても、βサブユニットとともにイン
ドール酸化酵素活性を有するタンパク質を構成し得るポ
リペプチドをコードするものであってもよい。
するＤＮＡは、配列番号１及び配列番号３に示す塩基配
列に限定されるものではなく、配列番号２及び配列番号
４に示すアミノ酸配列をコードし得るものであればよ
い。また、本発明のインドール酸化酵素のαサブユニッ
トをコードするＤＮＡは、配列番号２に示すアミノ酸配
列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠
失、挿入、付加、又は逆位等の変異を含むアミノ酸配列
からなるものであっても、βサブユニットとともにイン
ドール酸化酵素活性を有するタンパク質を構成し得るポ
リペプチドをコードするものであってもよい。
【００２８】また、本発明のインドール酸化酵素のβサ
ブユニットをコードするＤＮＡは、配列番号４に示すア
ミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置
換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列か
らなり、かつ、アルファサブユニットとともにインドー
ル酸化酵素活性を有するタンパク質を構成し得るポリペ
プチドをコードするものであってもよい。
ブユニットをコードするＤＮＡは、配列番号４に示すア
ミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置
換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列か
らなり、かつ、アルファサブユニットとともにインドー
ル酸化酵素活性を有するタンパク質を構成し得るポリペ
プチドをコードするものであってもよい。
【００２９】上記のような、配列番号２に記載のアミノ
酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するインドー
ル酸化酵素のαサブユニットをコードするＤＮＡとして
は、配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡとストリ
ンジェントな条件でハイブリダイズし得るＤＮＡとして
取得され得る。また、配列番号４に記載のアミノ酸配列
と実質的に同一のアミノ酸配列を有するインドール酸化
酵素のβサブユニットをコードするＤＮＡとしては、配
列番号３に示す塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェ
ントな条件でハイブリダイズし得るＤＮＡとして取得さ
れ得る。具体的には、配列番号１又は３に示す塩基配列
と７０％以上、好ましくは９０％以上の相同性を有する
ＤＮＡが挙げられる。
酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するインドー
ル酸化酵素のαサブユニットをコードするＤＮＡとして
は、配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡとストリ
ンジェントな条件でハイブリダイズし得るＤＮＡとして
取得され得る。また、配列番号４に記載のアミノ酸配列
と実質的に同一のアミノ酸配列を有するインドール酸化
酵素のβサブユニットをコードするＤＮＡとしては、配
列番号３に示す塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェ
ントな条件でハイブリダイズし得るＤＮＡとして取得さ
れ得る。具体的には、配列番号１又は３に示す塩基配列
と７０％以上、好ましくは９０％以上の相同性を有する
ＤＮＡが挙げられる。
【００３０】酵素活性を実質的に害さないアミノ酸残基
の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等の変異位置及び
様式は、当業者に容易に選択され得る。また、酵素活性
に実質的に影響を与えないアミノ酸残基の置換、欠失、
挿入、付加、又は逆位等の変異を有するインドール酸化
酵素又はそのサブユニットをコードするＤＮＡは、例え
ば、自然突然変異株又は変種から取得され得る。
の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等の変異位置及び
様式は、当業者に容易に選択され得る。また、酵素活性
に実質的に影響を与えないアミノ酸残基の置換、欠失、
挿入、付加、又は逆位等の変異を有するインドール酸化
酵素又はそのサブユニットをコードするＤＮＡは、例え
ば、自然突然変異株又は変種から取得され得る。
【００３１】アミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、
又は逆位等の変異を有するインドール酸化酵素遺伝子の
作製は、突然変異剤を用いる方法や部位特異的変異法等
の通常の変異操作によって得られる。また、そのＤＮＡ
によりコードされるインドール酸化酵素が酵素活性を保
持していることの確認は、インドールに作用させたとき
に青色の呈色を示すことにより行うことができる。ま
た、インジゴの定量は、以下のようにして行うことがで
きる。微生物をＬＢ培地で培養し、培地にインドールを
添加してインジゴを生成させた後、該反応液からインジ
ゴをＤＳＭ（ジメチルスルフォキシド）で抽出し、酢酸
エチルで希釈してＡ610の吸光度を測定し、得られた値
から予め酢酸エチルに溶解した標品のインジゴを用いた
作成した標準曲線を用いて抽出液中のインジゴを定量す
る（Appl. Environ. Microbiol., 63, 4287-4291 (199
7)）。
又は逆位等の変異を有するインドール酸化酵素遺伝子の
作製は、突然変異剤を用いる方法や部位特異的変異法等
の通常の変異操作によって得られる。また、そのＤＮＡ
によりコードされるインドール酸化酵素が酵素活性を保
持していることの確認は、インドールに作用させたとき
に青色の呈色を示すことにより行うことができる。ま
た、インジゴの定量は、以下のようにして行うことがで
きる。微生物をＬＢ培地で培養し、培地にインドールを
添加してインジゴを生成させた後、該反応液からインジ
ゴをＤＳＭ（ジメチルスルフォキシド）で抽出し、酢酸
エチルで希釈してＡ610の吸光度を測定し、得られた値
から予め酢酸エチルに溶解した標品のインジゴを用いた
作成した標準曲線を用いて抽出液中のインジゴを定量す
る（Appl. Environ. Microbiol., 63, 4287-4291 (199
7)）。
【００３２】（３）インドール酸化酵素遺伝子を有する
組換えベクター及びこの組換えベクターを保持する形質
転換体の作製：本発明のインドール酸化酵素遺伝子は、
これを適当なベクターに連結して組換えベクターを調製
し、この組換えベクターで適当な宿主微生物を形質転換
することにより、発現させることができる。αサブユニ
ットをコードするＤＮＡを用いればαサブユニットを、
βサブユニットをコードするＤＮＡを用いればβサブユ
ニットを、これらの両方を含むＤＮＡを用いればαサブ
ユニット及びβサブユニットの両方を、産生させること
ができる。
組換えベクター及びこの組換えベクターを保持する形質
転換体の作製：本発明のインドール酸化酵素遺伝子は、
これを適当なベクターに連結して組換えベクターを調製
し、この組換えベクターで適当な宿主微生物を形質転換
することにより、発現させることができる。αサブユニ
ットをコードするＤＮＡを用いればαサブユニットを、
βサブユニットをコードするＤＮＡを用いればβサブユ
ニットを、これらの両方を含むＤＮＡを用いればαサブ
ユニット及びβサブユニットの両方を、産生させること
ができる。
【００３３】組換えベクターを調製する際には、通常、
インドール酸化酵素遺伝子を宿主微生物に適したプロモ
ーターとともに、このプロモーターの下流に該遺伝子の
コード領域の５’末端側が連結されるようにして、ベク
ターに挿入する。あるいはプロモーターを含む発現ベク
ターを用い、これにインドール酸化酵素遺伝子を挿入し
てもよい。
インドール酸化酵素遺伝子を宿主微生物に適したプロモ
ーターとともに、このプロモーターの下流に該遺伝子の
コード領域の５’末端側が連結されるようにして、ベク
ターに挿入する。あるいはプロモーターを含む発現ベク
ターを用い、これにインドール酸化酵素遺伝子を挿入し
てもよい。
【００３４】このような発現ベクターを用いた発現方法
の他に、プロモーターを連結したインドール酸化酵素遺
伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主微生物の染色体中に直接
導入する相同組換え技術［A. A. Vertes, et al., Bios
ci. Biotechnol. Biochem.,Vol.57, p.2036 (1993)、
等］、あるいはトランスポゾンや挿入配列等を用いて導
入する技術［A. A. Vertes et al., Molecular Microbi
ol., Vol.11, p.739 (1994)、等］によっても発現させる
ことができる。
の他に、プロモーターを連結したインドール酸化酵素遺
伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主微生物の染色体中に直接
導入する相同組換え技術［A. A. Vertes, et al., Bios
ci. Biotechnol. Biochem.,Vol.57, p.2036 (1993)、
等］、あるいはトランスポゾンや挿入配列等を用いて導
入する技術［A. A. Vertes et al., Molecular Microbi
ol., Vol.11, p.739 (1994)、等］によっても発現させる
ことができる。
【００３５】発現ベクターとしては、宿主微生物内で複
製増殖可能であれば特に制限されるものではないが、プ
ラスミドベクター、ファージベクターのいずれかを用い
ることができる。具体的なプラスミドベクターとして
は、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＨＳＧ２９８、ｐＵ
Ｃ１１８、ｐＳＴＶ２８、ｐＴＷＶ２２８、ｐＨＹ３０
０ＰＬＫ（以上のプラスミドベクターは、例えば宝酒造
（株）から購入できる）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＰＬ−
Ｌａｍｂｄａ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ（以上は、例えばファルマシア社か
ら購入できる）、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ、ｐＣ
ＲＹ３ＫＸ（米国特許第５，１８５，２６２号）、ある
いはこれらの誘導体等を挙げることができる。
製増殖可能であれば特に制限されるものではないが、プ
ラスミドベクター、ファージベクターのいずれかを用い
ることができる。具体的なプラスミドベクターとして
は、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＨＳＧ２９８、ｐＵ
Ｃ１１８、ｐＳＴＶ２８、ｐＴＷＶ２２８、ｐＨＹ３０
０ＰＬＫ（以上のプラスミドベクターは、例えば宝酒造
（株）から購入できる）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＰＬ−
Ｌａｍｂｄａ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ（以上は、例えばファルマシア社か
ら購入できる）、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ、ｐＣ
ＲＹ３ＫＸ（米国特許第５，１８５，２６２号）、ある
いはこれらの誘導体等を挙げることができる。
【００３６】また、ファージベクターとしては、（λＦ
ｉｘIIベクタ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社から購入でき
る）等を挙げることができる。本発明のインドール酸化
酵素遺伝子を発現させるためのプロモーターは、宿主微
生物が保有するプロモーターを一般に用いることができ
るが、それに限られるものではなく、インドール酸化酵
素遺伝子の転写を開始させるための原核生物由来の塩基
配列であればいかなるプロモーターであっても良い。具
体的には、ラクトースオペロンのプロモーター、トリプ
トファンオペロンのプロモーター、λファージ由来のＰ
Ｌプロモーター、トリプトファンラクトース雑種（ｔａ
ｃ）プロモーター［H. A. Bose et al., Proc. Natl. A
cad. Sci. U. S. A., Vol.80, p.21 (1983)］等が挙げ
られる。また、アシネトバクター属細菌由来のプロモー
ターが機能可能な微生物を宿主として用いる場合には、
得られたインドール酸化酵素遺伝子固有のプロモーター
を使用してもよい。さらに、プロモーターの塩基配列が
分かっている場合には、通常用いられるＤＮＡ合成装
置、例えばアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉ
ｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製３９４ＤＮＡ／ＲＮ
Ａシンセサイザーを用いて合成されたものであってもよ
い。
ｉｘIIベクタ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社から購入でき
る）等を挙げることができる。本発明のインドール酸化
酵素遺伝子を発現させるためのプロモーターは、宿主微
生物が保有するプロモーターを一般に用いることができ
るが、それに限られるものではなく、インドール酸化酵
素遺伝子の転写を開始させるための原核生物由来の塩基
配列であればいかなるプロモーターであっても良い。具
体的には、ラクトースオペロンのプロモーター、トリプ
トファンオペロンのプロモーター、λファージ由来のＰ
Ｌプロモーター、トリプトファンラクトース雑種（ｔａ
ｃ）プロモーター［H. A. Bose et al., Proc. Natl. A
cad. Sci. U. S. A., Vol.80, p.21 (1983)］等が挙げ
られる。また、アシネトバクター属細菌由来のプロモー
ターが機能可能な微生物を宿主として用いる場合には、
得られたインドール酸化酵素遺伝子固有のプロモーター
を使用してもよい。さらに、プロモーターの塩基配列が
分かっている場合には、通常用いられるＤＮＡ合成装
置、例えばアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉ
ｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製３９４ＤＮＡ／ＲＮ
Ａシンセサイザーを用いて合成されたものであってもよ
い。
【００３７】これらのプローモーターのうち、発現効率
を向上させる目的で、誘導性のあるプロモーターを使用
することもできる。例えば、上記ラクトースオペロンの
プロモーターの場合には、ラクトースやイソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加すること
により遺伝子発現を誘導することができる。
を向上させる目的で、誘導性のあるプロモーターを使用
することもできる。例えば、上記ラクトースオペロンの
プロモーターの場合には、ラクトースやイソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加すること
により遺伝子発現を誘導することができる。
【００３８】インドール酸化酵素遺伝子を導入する宿主
としては、特に限定されるものではないが、エシェリヒ
ア（Ｅｓｃｈｅｉｃｈｉａ）属細菌、バチルス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ）属細菌、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属
細菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細
菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ）属細菌、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏ
ｃｃｕｓ）属細菌、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃ
ｉｌｌｕｓ）属細菌、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ）属細菌、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）
属細菌、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ）属細菌等を好適に用いることができる。
としては、特に限定されるものではないが、エシェリヒ
ア（Ｅｓｃｈｅｉｃｈｉａ）属細菌、バチルス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ）属細菌、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属
細菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細
菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ）属細菌、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏ
ｃｃｕｓ）属細菌、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃ
ｉｌｌｕｓ）属細菌、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ）属細菌、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）
属細菌、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ）属細菌等を好適に用いることができる。
【００３９】具体的には、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルス・サチリス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・ブレ
ビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・
ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａ
ｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、セラチア・マーセッ
センス（Ｓｅｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、シ
ュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕ
ｔｉｄａ）、シュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、コリネバク
テリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・
フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕ
ｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂ
ｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎ
ｔｕｍ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏ
ｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、サーマス
・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・ラクティス（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチル
ス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅ
ｉ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）等を用いることがで
きる。
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルス・サチリス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・ブレ
ビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・
ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａ
ｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、セラチア・マーセッ
センス（Ｓｅｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、シ
ュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕ
ｔｉｄａ）、シュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、コリネバク
テリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・
フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕ
ｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂ
ｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎ
ｔｕｍ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏ
ｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、サーマス
・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・ラクティス（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチル
ス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅ
ｉ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）等を用いることがで
きる。
【００４０】上記宿主微生物への遺伝子の導入法として
は、コンピテントセル法［Journalof Molecular Biolog
y,Vol.53, p.159 (1970)］、パルス波通電法［J. Indus
t.Microbiol., Vol.5, p.159 (1990)］等による形質転
換法、ファージを用いた形質導入法［E. Ohtsubo, Gene
tics, Vol.64, p.189 (1970)］、接合伝達法［J. G. C.
Ottow, Ann. Rev.Microbiol., Vol.29, p.80 (197
5)］、細胞融合法［M.H. Gabor, J. cteriol., Vol.13
7, p.1346 (1979)］等を用いることができる。これらの
方法から、宿主微生物に適した方法を適宜選択すればよ
い。
は、コンピテントセル法［Journalof Molecular Biolog
y,Vol.53, p.159 (1970)］、パルス波通電法［J. Indus
t.Microbiol., Vol.5, p.159 (1990)］等による形質転
換法、ファージを用いた形質導入法［E. Ohtsubo, Gene
tics, Vol.64, p.189 (1970)］、接合伝達法［J. G. C.
Ottow, Ann. Rev.Microbiol., Vol.29, p.80 (197
5)］、細胞融合法［M.H. Gabor, J. cteriol., Vol.13
7, p.1346 (1979)］等を用いることができる。これらの
方法から、宿主微生物に適した方法を適宜選択すればよ
い。
【００４１】（４）本発明の形質転換体を用いたインド
ール酸化酵素の製造、及びインドール酸化酵素を用いた
インドールからのインジゴの製造：上記（３）のように
して得られる形質転換体またはこの形質転換体の培養物
から採取したインドール酸化酵素の粗精製画分もしくは
精製酵素をインドールを含有する水性溶液に加えること
により、インドールを酸化してインジゴを生成せしめる
ことができる。ここで培養物とは、形質転換体の菌体又
は／及び培養後の培地（培養に液体培地を用いた場合に
はその培養上清）をいう。
ール酸化酵素の製造、及びインドール酸化酵素を用いた
インドールからのインジゴの製造：上記（３）のように
して得られる形質転換体またはこの形質転換体の培養物
から採取したインドール酸化酵素の粗精製画分もしくは
精製酵素をインドールを含有する水性溶液に加えること
により、インドールを酸化してインジゴを生成せしめる
ことができる。ここで培養物とは、形質転換体の菌体又
は／及び培養後の培地（培養に液体培地を用いた場合に
はその培養上清）をいう。
【００４２】上記形質転換体の培養は、炭素源、窒素
源、無機塩、各種ビタミン等を含む通常の栄養培地で行
うことができ、炭素源としては、例えばブドウ糖、ショ
糖、果糖、麦芽糖等の糖類、エタノール、メタノール等
のアルコール類、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸、マレ
イン酸、フマル酸等の有機酸類、廃糖蜜等が用いられ
る。窒素源としては、例えばアンモニア、硫酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等が
それぞれ単独もしくは混合して用いられる。また、無機
塩としては、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸二水
素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他
にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープ
リカー、カザミノ酸、ビオチン等の各種ビタミン等の栄
養素を培地に添加することができる。
源、無機塩、各種ビタミン等を含む通常の栄養培地で行
うことができ、炭素源としては、例えばブドウ糖、ショ
糖、果糖、麦芽糖等の糖類、エタノール、メタノール等
のアルコール類、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸、マレ
イン酸、フマル酸等の有機酸類、廃糖蜜等が用いられ
る。窒素源としては、例えばアンモニア、硫酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等が
それぞれ単独もしくは混合して用いられる。また、無機
塩としては、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸二水
素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他
にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープ
リカー、カザミノ酸、ビオチン等の各種ビタミン等の栄
養素を培地に添加することができる。
【００４３】培養は、通常、通気攪拌、振とう等の好気
条件下で行う。培養温度は、宿主微生物の生育し得る温
度であれば特に制限はなく、また、培養途中のｐＨにつ
いても宿主微生物が生育し得るｐＨであれば特に制限は
ない。培養中のｐＨ調整は、酸またはアルカリを添加し
て行うことができる。
条件下で行う。培養温度は、宿主微生物の生育し得る温
度であれば特に制限はなく、また、培養途中のｐＨにつ
いても宿主微生物が生育し得るｐＨであれば特に制限は
ない。培養中のｐＨ調整は、酸またはアルカリを添加し
て行うことができる。
【００４４】かくして得られる培養物から遠心分離等に
より菌体を集めることにより、インドール酸化酵素遺伝
子の発現産物、すなわちインドール酸化酵素を含有する
菌体を取得することができる。
より菌体を集めることにより、インドール酸化酵素遺伝
子の発現産物、すなわちインドール酸化酵素を含有する
菌体を取得することができる。
【００４５】本発明のインジゴの製造法に用いられる形
質転換体としては、該形質転換体を培養した培養液から
分離した菌体はもちろんのこと、培養液、菌体の破砕
物、抽出物、形質転換体より得られる粗酵素標品、精製
した酵素標品を使用してもよい。さらに、上記形質転換
体、その破砕物、抽出物または精製酵素を担体に固定化
したものも使用することができる。
質転換体としては、該形質転換体を培養した培養液から
分離した菌体はもちろんのこと、培養液、菌体の破砕
物、抽出物、形質転換体より得られる粗酵素標品、精製
した酵素標品を使用してもよい。さらに、上記形質転換
体、その破砕物、抽出物または精製酵素を担体に固定化
したものも使用することができる。
【００４６】形質転換体を担体に固定化する場合には、
培養物から回収されたまま、あるいは適当な緩衝液、例
えば０．０２〜０．２Ｍ程度のリン酸緩衝液（ｐＨ６〜
１０）等で洗浄された菌体を使用することができる。ま
た、培養物から回収された菌体を、超音波、圧搾等の手
段で破砕して得られる破砕物、該破砕物を水等で抽出し
て得られるインドール酸化酵素を含有する抽出物、該抽
出物を更に硫安塩析、カラムクロマトグラフィー等の処
理を行って得られるインドール酸化酵素の部分精製成分
等を担体に固定化したものも、本発明のインジゴの製造
に使用することができる。
培養物から回収されたまま、あるいは適当な緩衝液、例
えば０．０２〜０．２Ｍ程度のリン酸緩衝液（ｐＨ６〜
１０）等で洗浄された菌体を使用することができる。ま
た、培養物から回収された菌体を、超音波、圧搾等の手
段で破砕して得られる破砕物、該破砕物を水等で抽出し
て得られるインドール酸化酵素を含有する抽出物、該抽
出物を更に硫安塩析、カラムクロマトグラフィー等の処
理を行って得られるインドール酸化酵素の部分精製成分
等を担体に固定化したものも、本発明のインジゴの製造
に使用することができる。
【００４７】これら菌体、菌体破砕物、抽出物または精
製酵素の固定化は、それ自体既知の通常用いられている
方法に従い、アクリルアミドモノマー、アルギン酸、ま
たはカラギーナン等の適当な担体に菌体等を固定化させ
る方法により行うことができる。
製酵素の固定化は、それ自体既知の通常用いられている
方法に従い、アクリルアミドモノマー、アルギン酸、ま
たはカラギーナン等の適当な担体に菌体等を固定化させ
る方法により行うことができる。
【００４８】反応に用いる水性溶液は、インドールを含
有する水溶液または適当な緩衝液、例えば０．０２〜
０．２Ｍ程度のリン酸緩衝液（ｐＨ６〜１０）とするこ
とができる。この水性溶液には、更に菌体の細胞膜の物
質透過性を高める必要のあるときには、トルエン、キシ
レン、非イオン性界面活性剤等を０．０５〜２％（ｗ／
ｖ）添加することもできる。
有する水溶液または適当な緩衝液、例えば０．０２〜
０．２Ｍ程度のリン酸緩衝液（ｐＨ６〜１０）とするこ
とができる。この水性溶液には、更に菌体の細胞膜の物
質透過性を高める必要のあるときには、トルエン、キシ
レン、非イオン性界面活性剤等を０．０５〜２％（ｗ／
ｖ）添加することもできる。
【００４９】水性溶液中の反応原料となるインドール濃
度は、０．１ｍＭ〜５０ｍＭＭ程度が適当である。上記
の水性溶液における酵素反応温度およびｐＨは特に限定
されないが、通常１０〜６０℃、好ましくは１５〜５０
℃が適当であり、反応液中のｐＨは５〜１０、好ましく
は６〜９付近とすることができる。また、ｐＨの調整
は、酸またはアルカリを添加して行うことができる。発
明で使用する酵素は、培養液をそのまま又はそれから遠
心分離、濾過等で集め、これを水又は緩衝液に懸濁して
得ることができる。このようにして得られた酵素をイン
ドールと水の存在下、反応させるが、反応液中のインド
ールの濃度は酵素の活性を阻害しない範囲で可能な限り
高くするのが有利である。反応は静置、攪拌、振盪のい
ずれの方法で行ってもよい。また、酵素を適当な支持体
に固定化してカラムに充填し、インドール溶液を流す方
法も利用できる。反応は、通常、10〜60℃好ましくは20
〜50℃、pH５〜９、好ましくはｐ６〜８で行う。
度は、０．１ｍＭ〜５０ｍＭＭ程度が適当である。上記
の水性溶液における酵素反応温度およびｐＨは特に限定
されないが、通常１０〜６０℃、好ましくは１５〜５０
℃が適当であり、反応液中のｐＨは５〜１０、好ましく
は６〜９付近とすることができる。また、ｐＨの調整
は、酸またはアルカリを添加して行うことができる。発
明で使用する酵素は、培養液をそのまま又はそれから遠
心分離、濾過等で集め、これを水又は緩衝液に懸濁して
得ることができる。このようにして得られた酵素をイン
ドールと水の存在下、反応させるが、反応液中のインド
ールの濃度は酵素の活性を阻害しない範囲で可能な限り
高くするのが有利である。反応は静置、攪拌、振盪のい
ずれの方法で行ってもよい。また、酵素を適当な支持体
に固定化してカラムに充填し、インドール溶液を流す方
法も利用できる。反応は、通常、10〜60℃好ましくは20
〜50℃、pH５〜９、好ましくはｐ６〜８で行う。
【００５０】尚、上記水性溶液には、反応時に酸化剤を
添加すると、インジゴの生成収率が一層向上する場合が
ある。酸化剤としては、亜硝酸ナトリウム、亜硝酸カリ
ウム等の硝酸塩、塩化第二鉄等の金属塩、ハロゲン、ペ
ルオクソ酸等が挙げられ、好ましくは、亜硝酸ナトリウ
ム、塩化第二鉄が挙げられる。添加濃度は、酸化剤の種
類によって異なるが、インジゴ生成を阻害しない濃度で
加えることが望ましく、通常、０．００１〜０．０５％
（W/V)、好ましくは０．００５〜０．０２％である。
添加すると、インジゴの生成収率が一層向上する場合が
ある。酸化剤としては、亜硝酸ナトリウム、亜硝酸カリ
ウム等の硝酸塩、塩化第二鉄等の金属塩、ハロゲン、ペ
ルオクソ酸等が挙げられ、好ましくは、亜硝酸ナトリウ
ム、塩化第二鉄が挙げられる。添加濃度は、酸化剤の種
類によって異なるが、インジゴ生成を阻害しない濃度で
加えることが望ましく、通常、０．００１〜０．０５％
（W/V)、好ましくは０．００５〜０．０２％である。
【００５１】以上のようにして培養液中あるいは反応液
中に生成してきたインジゴは酢酸エチル等の有機溶剤に
よって抽出することにより単離・精製される。
中に生成してきたインジゴは酢酸エチル等の有機溶剤に
よって抽出することにより単離・精製される。
【００５２】
【実施例】以下に本発明の方法を実施例により具体的に
述べるが、本発明はこれに限定されるものではない。
述べるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００５３】
【実施例１】アシネトバクター・エスピー．ＭＹ−１５
株由来のインドール酸化酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片の
クローン化 （１）インドール酸化酵素遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断
片の調製：アシネトバクター・エスピー．ＭＹ−１５株
をＬＢ培地（トリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、Ｎａ
Ｃｌ５ｇを水１Ｌに溶解）を用いて３０℃で対数増殖期
後期まで振とう培養し、菌体を集めた。
株由来のインドール酸化酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片の
クローン化 （１）インドール酸化酵素遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断
片の調製：アシネトバクター・エスピー．ＭＹ−１５株
をＬＢ培地（トリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、Ｎａ
Ｃｌ５ｇを水１Ｌに溶解）を用いて３０℃で対数増殖期
後期まで振とう培養し、菌体を集めた。
【００５４】得られた菌体を、１０ｍｇ／ｍｌの濃度に
なるよう、リゾチームを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ−２０
ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・
２Ｎａ溶液１５ｍｌに懸濁した。次に、この懸濁液にプ
ロテナーゼＫ（宝酒造（株）社製）を最終濃度が１００
μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で１時間保温し
た。さらにドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を、最終
濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保
温して溶菌させた。この溶菌液に、等量のフェノール／
クロロホルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに
振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ，２０分
間，１０〜１２℃）し、上清画分を分取した。この上清
に酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるよう添加した後、２
倍量のエタノールをゆっくりと加えた。水層とエタノー
ル層の間に存在するＤＮＡをガラス棒でまきとり、７０
％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡ
に１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍｌを加え、４℃で一晩静置し染色
体ＤＮＡ溶液を得た。
なるよう、リゾチームを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ−２０
ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・
２Ｎａ溶液１５ｍｌに懸濁した。次に、この懸濁液にプ
ロテナーゼＫ（宝酒造（株）社製）を最終濃度が１００
μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で１時間保温し
た。さらにドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を、最終
濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保
温して溶菌させた。この溶菌液に、等量のフェノール／
クロロホルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに
振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ，２０分
間，１０〜１２℃）し、上清画分を分取した。この上清
に酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるよう添加した後、２
倍量のエタノールをゆっくりと加えた。水層とエタノー
ル層の間に存在するＤＮＡをガラス棒でまきとり、７０
％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡ
に１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍｌを加え、４℃で一晩静置し染色
体ＤＮＡ溶液を得た。
【００５５】（２）染色体ＤＮＡのベクターへの挿入：
上記（１）項で得たアシネトバクター・エスピー．ＭＹ
−１５株の染色体ＤＮＡ溶液の９０μｌに制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩ ５０ｕｎｉｔｓを加え、３７℃で１時間反応さ
せて完全分解した。この完全分解ＤＮＡと、制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩで切断したプラスミドベクターｐＵＣ１１８
（宝酒造製）とを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ
７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴ
Ｐ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2およびＴ４ＤＮＡリガーゼ
１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度
である）、１６℃で１０時間反応させて完全分解ＤＮＡ
とベクターとを連結させた。
上記（１）項で得たアシネトバクター・エスピー．ＭＹ
−１５株の染色体ＤＮＡ溶液の９０μｌに制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩ ５０ｕｎｉｔｓを加え、３７℃で１時間反応さ
せて完全分解した。この完全分解ＤＮＡと、制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩで切断したプラスミドベクターｐＵＣ１１８
（宝酒造製）とを混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ
７．６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴ
Ｐ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2およびＴ４ＤＮＡリガーゼ
１ｕｎｉｔの各成分を添加し（各成分の濃度は最終濃度
である）、１６℃で１０時間反応させて完全分解ＤＮＡ
とベクターとを連結させた。
【００５６】（３）形質転換体の作製及び目的組換え体
ＤＮＡの選別：得られた連結反応液を用い、塩化カルシ
ウム法［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５３， ｐ．１５９（１９７
０）］により、エシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造
（株）社製）を形質転換し、アンピシリン ５０μｇ／
ｍｌを含む培地［トリプトン１０ｇ，イーストエキスト
ラクト ５ｇ，ＮａＣｌ ５ｇ、インドール １１７ｍ
ｇおよび寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹し、青
い呈色を示すコロニーを選択した。
ＤＮＡの選別：得られた連結反応液を用い、塩化カルシ
ウム法［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５３， ｐ．１５９（１９７
０）］により、エシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造
（株）社製）を形質転換し、アンピシリン ５０μｇ／
ｍｌを含む培地［トリプトン１０ｇ，イーストエキスト
ラクト ５ｇ，ＮａＣｌ ５ｇ、インドール １１７ｍ
ｇおよび寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹し、青
い呈色を示すコロニーを選択した。
【００５７】このプレートに生育した青色のコロニーを
常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを
抽出し、該プラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩにより切断
したところ、プラスミドｐＵＣ１１８の長さ３．４ｋｂ
のＤＮＡ断片に加え、長さ約２．８ｋｂのＤＮＡ断片が
確認された。
常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを
抽出し、該プラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩにより切断
したところ、プラスミドｐＵＣ１１８の長さ３．４ｋｂ
のＤＮＡ断片に加え、長さ約２．８ｋｂのＤＮＡ断片が
確認された。
【００５８】上記で得られたプラスミドをｐＩｎｄ−１
と命名し、該プラスミドで形質転換されたエシェリヒア
・コリＪＭ１０９株（宝酒造（株）製）をＩｎｄ−１と
命名した。
と命名し、該プラスミドで形質転換されたエシェリヒア
・コリＪＭ１０９株（宝酒造（株）製）をＩｎｄ−１と
命名した。
【００５９】
【実施例２】インドール酸化酵素の塩基配列の決定 実施例１で得られたインドール酸化酵素遺伝子を含む長
さが約２．８ｋｂのＤＮＡ（ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ）
断片について、その塩基配列をｐＵＣ１１８（宝酒造
（株）社製）を用いるジデオキシヌクレオチド酵素法
（ｄｉｄｅｏｘｙｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
法）［Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｖｏｌ．
７４，ｐ．５４６３，（１９７７）］により決定した。
さが約２．８ｋｂのＤＮＡ（ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ）
断片について、その塩基配列をｐＵＣ１１８（宝酒造
（株）社製）を用いるジデオキシヌクレオチド酵素法
（ｄｉｄｅｏｘｙｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
法）［Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｖｏｌ．
７４，ｐ．５４６３，（１９７７）］により決定した。
【００６０】その塩基配列中には、２つのオープンリー
デイングフレーム（ＯＲＦ）が存在し、インドール酸化
酵素遺伝子は、後記配列表の配列番号１及び２に示す塩
基配列を有し、４１３個のアミノ酸をコードする１２３
９塩基対及び、１７８個のアミノ酸をコードする５３４
塩基対より構成されることが判明した。４１３個のアミ
ノ酸をコードするＯＲＦはインドール酸化酵素のαサブ
ユニットを、１７８個のアミノ酸をコードするＯＲＦは
βサブユニットを、それぞれコードしているものと推定
された。
デイングフレーム（ＯＲＦ）が存在し、インドール酸化
酵素遺伝子は、後記配列表の配列番号１及び２に示す塩
基配列を有し、４１３個のアミノ酸をコードする１２３
９塩基対及び、１７８個のアミノ酸をコードする５３４
塩基対より構成されることが判明した。４１３個のアミ
ノ酸をコードするＯＲＦはインドール酸化酵素のαサブ
ユニットを、１７８個のアミノ酸をコードするＯＲＦは
βサブユニットを、それぞれコードしているものと推定
された。
【００６１】
【実施例３】インドール酸化酵素の製造および活性の確
認 実施例２で作製したＩｎｄＡ−１株を、アンピシリン
５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地［トリプトン１０ｇ，イ
ーストエキストラクト ５ｇ，ＮａＣｌ ５ｇ）に植菌
し、３０℃で１５時間好気的に振とう培養した。得られ
た培養物を遠心分離（３，０００×ｇ、４℃、２０分
間）して菌体を回収後、５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝
液（ｐＨ６．０）で洗浄した。次いで、洗浄菌体（湿重
量）を上記リン酸緩衝液に懸濁し、菌体懸濁液とした。
認 実施例２で作製したＩｎｄＡ−１株を、アンピシリン
５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地［トリプトン１０ｇ，イ
ーストエキストラクト ５ｇ，ＮａＣｌ ５ｇ）に植菌
し、３０℃で１５時間好気的に振とう培養した。得られ
た培養物を遠心分離（３，０００×ｇ、４℃、２０分
間）して菌体を回収後、５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝
液（ｐＨ６．０）で洗浄した。次いで、洗浄菌体（湿重
量）を上記リン酸緩衝液に懸濁し、菌体懸濁液とした。
【００６２】対照として、外来遺伝子を含まないプラス
ミドｐＵＣ１１８を用いて、実施例１と全く同様にエシ
ェリヒア・コリＪＭ１０９株を形質転換し、該形質転換
体から上記と同様に菌体懸濁液を調製し、以下のインジ
ゴ生成反応に供した。
ミドｐＵＣ１１８を用いて、実施例１と全く同様にエシ
ェリヒア・コリＪＭ１０９株を形質転換し、該形質転換
体から上記と同様に菌体懸濁液を調製し、以下のインジ
ゴ生成反応に供した。
【００６３】インドール酸化酵素活性の確認は、これら
の菌体をＬＢ培地に懸濁し、これに、最終濃度 １１７
ｍｇ／Ｌのインドールを添加し、３７℃で反応させ、青
色の呈色を観察することにより行った。
の菌体をＬＢ培地に懸濁し、これに、最終濃度 １１７
ｍｇ／Ｌのインドールを添加し、３７℃で反応させ、青
色の呈色を観察することにより行った。
【００６４】その結果、ＩｎｄＡ−１から調製された菌
体についてのみ、インジゴの生成が認められ、インドー
ル酸化酵素活性を検出し得た。
体についてのみ、インジゴの生成が認められ、インドー
ル酸化酵素活性を検出し得た。
【００６５】
【実施例４】インドール酸化酵素を含む形質転換体を用
いたインドールの酸化反応によるインジゴの製造 実施例３と同様に、実施例２で作製したＩｎｄＡ−１株
を、アンピシリン ５０μｇ／ｍｌを含む上記ＬＢ培地
に植菌し、３０℃で１５時間好気的に振とう培養した。
得られた培養物を遠心分離（３，０００×ｇ、４℃、２
０分間）して菌体を回収後、５０ｍＭリン酸カリウム緩
衝液（ｐＨ６．０）で洗浄した。
いたインドールの酸化反応によるインジゴの製造 実施例３と同様に、実施例２で作製したＩｎｄＡ−１株
を、アンピシリン ５０μｇ／ｍｌを含む上記ＬＢ培地
に植菌し、３０℃で１５時間好気的に振とう培養した。
得られた培養物を遠心分離（３，０００×ｇ、４℃、２
０分間）して菌体を回収後、５０ｍＭリン酸カリウム緩
衝液（ｐＨ６．０）で洗浄した。
【００６６】インドール酸化反応は、洗浄した菌体を、
同緩衝液５００ｍｌに懸濁し、１００ｍｇインドールを
添加し、３０℃で２４時間反応させた。途中、２時間後
にインドール１００ｍｇを添加した。反応後、１００ｍ
ｌの酢酸エチルを加えて生成した青色色素を抽出し、酢
酸エチル画分を分取後、減圧下に酢酸エチルを蒸発さ
せ、４０ｍｇの青色結晶を得た。この青色結晶を分析し
たところ、クロマトグラフのＲｆ値、可視吸収スペクト
ル、ＵＶ吸収スペクトル等がインジゴ標品（和光純薬特
級）と一致した。
同緩衝液５００ｍｌに懸濁し、１００ｍｇインドールを
添加し、３０℃で２４時間反応させた。途中、２時間後
にインドール１００ｍｇを添加した。反応後、１００ｍ
ｌの酢酸エチルを加えて生成した青色色素を抽出し、酢
酸エチル画分を分取後、減圧下に酢酸エチルを蒸発さ
せ、４０ｍｇの青色結晶を得た。この青色結晶を分析し
たところ、クロマトグラフのＲｆ値、可視吸収スペクト
ル、ＵＶ吸収スペクトル等がインジゴ標品（和光純薬特
級）と一致した。
【００６７】
【発明の効果】本発明により、新規なインドール酸化酵
素及びそれをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを有する組換
えベクター、及び該組換えベクターを含有する形質転換
体が提供される。
素及びそれをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを有する組換
えベクター、及び該組換えベクターを含有する形質転換
体が提供される。
【００６８】本発明のインドール酸化酵素遺伝子を含有
する形質転換体により、安定に活性を保持するインドー
ル酸化酵素を著量生産することができ、本菌体あるいは
本菌から調製したインドール酸化酵素を利用することに
より、インドールからインジゴを効率よく製造すること
ができる。
する形質転換体により、安定に活性を保持するインドー
ル酸化酵素を著量生産することができ、本菌体あるいは
本菌から調製したインドール酸化酵素を利用することに
より、インドールからインジゴを効率よく製造すること
ができる。
【００６９】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 三菱化学株式会社 <120> 新規なインドール酸化酵素をコードするＤＮＡとその利用 <130> J03295 <141> 1999-03-30 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.0
【００７０】 <210> 1 <211> 1242 <212> DNA <213> Acinetobacter sp. MY-15 <220> <221> CDS <222> (1)..(1239) <400> 1 atg atg cgt cgt atc gct ata gta gga gcg ggt caa tct gga ttg cag 48 Met Met Arg Arg Ile Ala Ile Val Gly Ala Gly Gln Ser Gly Leu Gln 1 5 10 15 ctc ggt tta gga tta tta gac aca ggt tat gag gtg acg att gtc acc 96 Leu Gly Leu Gly Leu Leu Asp Thr Gly Tyr Glu Val Thr Ile Val Thr 20 25 30 aat cgt act ggc gat gaa att cgt cag ggc aag gtc atg tcg agt cag 144 Asn Arg Thr Gly Asp Glu Ile Arg Gln Gly Lys Val Met Ser Ser Gln 35 40 45 tgt atg ttt cac act gcc ttg caa aca gag cgt gat gtt gga ctt aat 192 Cys Met Phe His Thr Ala Leu Gln Thr Glu Arg Asp Val Gly Leu Asn 50 55 60 ttt tgg gaa gag caa tgt cca gcg gtt gaa ggg att gga ttt aca ctg 240 Phe Trp Glu Glu Gln Cys Pro Ala Val Glu Gly Ile Gly Phe Thr Leu 65 70 75 80 gtc aac cca gaa aca aaa cag cct gcc ttt gca tgg agt gcg cga ttg 288 Val Asn Pro Glu Thr Lys Gln Pro Ala Phe Ala Trp Ser Ala Arg Leu 85 90 95 gag cgt tat gca caa tcg gta gat cag cgc gtc aag atg ccg tac tgg 336 Glu Arg Tyr Ala Gln Ser Val Asp Gln Arg Val Lys Met Pro Tyr Trp 100 105 110 atg gaa atg ttt gag cgt cgt ggt ggt cag ttg att att caa gat gtt 384 Met Glu Met Phe Glu Arg Arg Gly Gly Gln Leu Ile Ile Gln Asp Val 115 120 125 gga ata gat gaa ctg gaa cag ctc act gct gaa tat gag ctg gtc tta 432 Gly Ile Asp Glu Leu Glu Gln Leu Thr Ala Glu Tyr Glu Leu Val Leu 130 135 140 ctg gcc gca ggt aag ggg gaa gtg gtt aaa cag ttc gag cgt gat gaa 480 Leu Ala Ala Gly Lys Gly Glu Val Val Lys Gln Phe Glu Arg Asp Glu 145 150 155 160 gcg cgt agt tgt ttt gat aag cca caa cgc gcg ctt gct ttg acc tat 528 Ala Arg Ser Cys Phe Asp Lys Pro Gln Arg Ala Leu Ala Leu Thr Tyr 165 170 175 gta aca ggt atg aag caa atg tcg ccg tat tct cgt gtg act ttt aac 576 Val Thr Gly Met Lys Gln Met Ser Pro Tyr Ser Arg Val Thr Phe Asn 180 185 190 gtg att cca gaa gtg ggt gaa tat ttc tgt ttt cct gcg ctt aca gtt 624 Val Ile Pro Glu Val Gly Glu Tyr Phe Cys Phe Pro Ala Leu Thr Val 195 200 205 aca ggt gct tgt gaa att atg gtg ttt gaa ggc att ccc ggt ggg ccg 672 Thr Gly Ala Cys Glu Ile Met Val Phe Glu Gly Ile Pro Gly Gly Pro 210 215 220 atg gat tgc tgg caa gat gca aaa aca cca gaa cag cat ttg caa atg 720 Met Asp Cys Trp Gln Asp Ala Lys Thr Pro Glu Gln His Leu Gln Met 225 230 235 240 agt aaa gat att tta aac aaa tat gtg cct tgg gaa gca gca cgt tgt 768 Ser Lys Asp Ile Leu Asn Lys Tyr Val Pro Trp Glu Ala Ala Arg Cys 245 250 255 gaa aat att gaa tta acc gac gct ggt ggc tat ctg tct gga cgt ttt 816 Glu Asn Ile Glu Leu Thr Asp Ala Gly Gly Tyr Leu Ser Gly Arg Phe 260 265 270 cca ccg gga gtg cgt aaa ccg ata tta acc ctg cca tct ggt cgt aaa 864 Pro Pro Gly Val Arg Lys Pro Ile Leu Thr Leu Pro Ser Gly Arg Lys 275 280 285 gtt ttt ggt atg gcc gat gcg tta gtg gtg aac gac cca atc act ggg 912 Val Phe Gly Met Ala Asp Ala Leu Val Val Asn Asp Pro Ile Thr Gly 290 295 300 caa ggt tca aac aat gcc gcc aag tgt agc aaa att tat ttc gat gcc 960 Gln Gly Ser Asn Asn Ala Ala Lys Cys Ser Lys Ile Tyr Phe Asp Ala 305 310 315 320 att tta gcg cat gac aat caa aca ttt aca gat gaa tgg atg caa cag 1008 Ile Leu Ala His Asp Asn Gln Thr Phe Thr Asp Glu Trp Met Gln Gln 325 330 335 aca ttt gaa cgt tat tgg gca tat gcc gaa aaa gtc gtg gct tgg acc 1056 Thr Phe Glu Arg Tyr Trp Ala Tyr Ala Glu Lys Val Val Ala Trp Thr 340 345 350 aac agt tta ttg ttg cca cca caa ccg cac atg att gag ctt ttg gcg 1104 Asn Ser Leu Leu Leu Pro Pro Gln Pro His Met Ile Glu Leu Leu Ala 355 360 365 gcg gct gag cag aac cat gcc att gct tcg agt att gcc aat aat ttt 1152 Ala Ala Glu Gln Asn His Ala Ile Ala Ser Ser Ile Ala Asn Asn Phe 370 375 380 gat aat cca cgc aat ttt gct cca tgg tgg ttt gat cca gaa cag gcg 1200 Asp Asn Pro Arg Asn Phe Ala Pro Trp Trp Phe Asp Pro Glu Gln Ala 385 390 395 400 caa cgt ttt atc gaa tcg aaa agc tgt caa aaa gtg gct taa 1242 Gln Arg Phe Ile Glu Ser Lys Ser Cys Gln Lys Val Ala 405 410
【００７１】 <210> 2 <211> 413 <212> PRT <213> Acinetobacter sp. <400> 2 Met Met Arg Arg Ile Ala Ile Val Gly Ala Gly Gln Ser Gly Leu Gln 1 5 10 15 Leu Gly Leu Gly Leu Leu Asp Thr Gly Tyr Glu Val Thr Ile Val Thr 20 25 30 Asn Arg Thr Gly Asp Glu Ile Arg Gln Gly Lys Val Met Ser Ser Gln 35 40 45 Cys Met Phe His Thr Ala Leu Gln Thr Glu Arg Asp Val Gly Leu Asn 50 55 60 Phe Trp Glu Glu Gln Cys Pro Ala Val Glu Gly Ile Gly Phe Thr Leu 65 70 75 80 Val Asn Pro Glu Thr Lys Gln Pro Ala Phe Ala Trp Ser Ala Arg Leu 85 90 95 Glu Arg Tyr Ala Gln Ser Val Asp Gln Arg Val Lys Met Pro Tyr Trp 100 105 110 Met Glu Met Phe Glu Arg Arg Gly Gly Gln Leu Ile Ile Gln Asp Val 115 120 125 Gly Ile Asp Glu Leu Glu Gln Leu Thr Ala Glu Tyr Glu Leu Val Leu 130 135 140 Leu Ala Ala Gly Lys Gly Glu Val Val Lys Gln Phe Glu Arg Asp Glu 145 150 155 160 Ala Arg Ser Cys Phe Asp Lys Pro Gln Arg Ala Leu Ala Leu Thr Tyr 165 170 175 Val Thr Gly Met Lys Gln Met Ser Pro Tyr Ser Arg Val Thr Phe Asn 180 185 190 Val Ile Pro Glu Val Gly Glu Tyr Phe Cys Phe Pro Ala Leu Thr Val 195 200 205 Thr Gly Ala Cys Glu Ile Met Val Phe Glu Gly Ile Pro Gly Gly Pro 210 215 220 Met Asp Cys Trp Gln Asp Ala Lys Thr Pro Glu Gln His Leu Gln Met 225 230 235 240 Ser Lys Asp Ile Leu Asn Lys Tyr Val Pro Trp Glu Ala Ala Arg Cys 245 250 255 Glu Asn Ile Glu Leu Thr Asp Ala Gly Gly Tyr Leu Ser Gly Arg Phe 260 265 270 Pro Pro Gly Val Arg Lys Pro Ile Leu Thr Leu Pro Ser Gly Arg Lys 275 280 285 Val Phe Gly Met Ala Asp Ala Leu Val Val Asn Asp Pro Ile Thr Gly 290 295 300 Gln Gly Ser Asn Asn Ala Ala Lys Cys Ser Lys Ile Tyr Phe Asp Ala 305 310 315 320 Ile Leu Ala His Asp Asn Gln Thr Phe Thr Asp Glu Trp Met Gln Gln 325 330 335 Thr Phe Glu Arg Tyr Trp Ala Tyr Ala Glu Lys Val Val Ala Trp Thr 340 345 350 Asn Ser Leu Leu Leu Pro Pro Gln Pro His Met Ile Glu Leu Leu Ala 355 360 365 Ala Ala Glu Gln Asn His Ala Ile Ala Ser Ser Ile Ala Asn Asn Phe 370 375 380 Asp Asn Pro Arg Asn Phe Ala Pro Trp Trp Phe Asp Pro Glu Gln Ala 385 390 395 400 Gln Arg Phe Ile Glu Ser Lys Ser Cys Gln Lys Val Ala 405 410
【００７２】 <210> 3 <211> 537 <212> DNA <213> Acinetobacter sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(534) <400> 3 atg aat atc aac aca tcg cag gaa ctg gat tta aaa ccg att gat acg 48 Met Asn Ile Asn Thr Ser Gln Glu Leu Asp Leu Lys Pro Ile Asp Thr 1 5 10 15 gaa aat cca aga gaa ata cgc aac ctg tta ggg cag ttt gct aca ggg 96 Glu Asn Pro Arg Glu Ile Arg Asn Leu Leu Gly Gln Phe Ala Thr Gly 20 25 30 gtt acg gtg att aca acc cgt gga caa gat gga cga aaa att ggg atg 144 Val Thr Val Ile Thr Thr Arg Gly Gln Asp Gly Arg Lys Ile Gly Met 35 40 45 aca gcc aac tcg ttt tct tca ctg tca ctc gat ccg ccg ctg att tta 192 Thr Ala Asn Ser Phe Ser Ser Leu Ser Leu Asp Pro Pro Leu Ile Leu 50 55 60 tgg agt ttg tca aag act gca cca agc tta ttg gat ttt act gag gcc 240 Trp Ser Leu Ser Lys Thr Ala Pro Ser Leu Leu Asp Phe Thr Glu Ala 65 70 75 80 gaa tat ttt gcg att cat atg ctg gca caa gaa cat cac tca ctt tca 288 Glu Tyr Phe Ala Ile His Met Leu Ala Gln Glu His His Ser Leu Ser 85 90 95 ggg cat ttt gcc cgt ggt tca gag gat aag ttt gcc aac att gca cat 336 Gly His Phe Ala Arg Gly Ser Glu Asp Lys Phe Ala Asn Ile Ala His 100 105 110 cgt gag tgt gag cgc ggt tta ccg tta cta gaa gat gta ttg gca aca 384 Arg Glu Cys Glu Arg Gly Leu Pro Leu Leu Glu Asp Val Leu Ala Thr 115 120 125 ttg gta tgt aaa aac gta aat caa tat gaa ggg ggg gat cat ctg att 432 Leu Val Cys Lys Asn Val Asn Gln Tyr Glu Gly Gly Asp His Leu Ile 130 135 140 ttt att ggt cag att gaa cat tat caa cat cgt att ggt gag cct ttg 480 Phe Ile Gly Gln Ile Glu His Tyr Gln His Arg Ile Gly Glu Pro Leu 145 150 155 160 gtg ttt cat gcg ggc aag tat cgt att gct gca gcg cat cca gaa ctg 528 Val Phe His Ala Gly Lys Tyr Arg Ile Ala Ala Ala His Pro Glu Leu 165 170 175 agt att taa 537 Ser Ile
【００７３】 <210> 4 <211> 178 <212> PRT <213> Acinetobacter sp. <400> 4 Met Asn Ile Asn Thr Ser Gln Glu Leu Asp Leu Lys Pro Ile Asp Thr 1 5 10 15 Glu Asn Pro Arg Glu Ile Arg Asn Leu Leu Gly Gln Phe Ala Thr Gly 20 25 30 Val Thr Val Ile Thr Thr Arg Gly Gln Asp Gly Arg Lys Ile Gly Met 35 40 45 Thr Ala Asn Ser Phe Ser Ser Leu Ser Leu Asp Pro Pro Leu Ile Leu 50 55 60 Trp Ser Leu Ser Lys Thr Ala Pro Ser Leu Leu Asp Phe Thr Glu Ala 65 70 75 80 Glu Tyr Phe Ala Ile His Met Leu Ala Gln Glu His His Ser Leu Ser 85 90 95 Gly His Phe Ala Arg Gly Ser Glu Asp Lys Phe Ala Asn Ile Ala His 100 105 110 Arg Glu Cys Glu Arg Gly Leu Pro Leu Leu Glu Asp Val Leu Ala Thr 115 120 125 Leu Val Cys Lys Asn Val Asn Gln Tyr Glu Gly Gly Asp His Leu Ile 130 135 140 Phe Ile Gly Gln Ile Glu His Tyr Gln His Arg Ile Gly Glu Pro Leu 145 150 155 160 Val Phe His Ala Gly Lys Tyr Arg Ile Ala Ala Ala His Pro Glu Leu 165 170 175 Ser Ile
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｐ 17/16 Ｃ１２Ｐ 17/16 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA08 CA01 CA03 DA06 EA04 GA11 GA19 4B050 CC01 CC03 DD02 EE01 LL05 4B064 AE48 CA21 CB11 CD12 CE08 CE15 CE16 DA20 4B065 AA01Y AA26X AB01 AC14 AC16 BA02 BB01 BC01 BC03 BC26 BD15 BD16 BD30 BD32 BD50 CA52
Claims (9)
- 【請求項１】 下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質
をコードするＤＮＡ断片。 （Ａ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有す
るタンパク質。 （Ｂ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列
番号４に記載のアミノ酸配列を有するインドール酸化酵
素のβサブユニットとともにインドールを酸化すること
によりインジゴを生成させる反応を触媒する活性を有す
るタンパク質を構成し得るポリペプチド。 - 【請求項２】 下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであ
る請求項１記載のＤＮＡ断片。 （ａ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列を含むＤＮ
Ａ。 （ｂ）配列表の配列番号１に記載の塩基配列とストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、配列番号
４に記載のアミノ酸配列を有するインドール酸化酵素の
βサブユニットとともに、インドールを酸化することに
よりインジゴを生成させる反応を触媒する活性を有する
タンパク質を構成し得るポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ。 - 【請求項３】 下記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すタンパク質
をコードするＤＮＡ断片。 （Ｃ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有す
るタンパク質。 （Ｄ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、配列
番号２に記載のアミノ酸配列を有するインドール酸化酵
素のαサブユニットとともにインドールを酸化すること
によりインジゴを生成させる反応を触媒する活性を有す
るタンパク質を構成し得るポリペプチド。 - 【請求項４】 下記（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡであ
る請求項３記載のＤＮＡ断片。 （ｃ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列を含むＤＮ
Ａ。 （ｄ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列とストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、配列番号
２に記載のアミノ酸配列を有するインドール酸化酵素の
αサブユニットとともに、インドールを酸化することに
よりインジゴを生成させる反応を触媒する活性を有する
タンパク質を構成し得るポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ。 - 【請求項５】 請求項１又は２に記載のＤＮＡ、及び請
求項３又は４に記載のＤＮＡ断片を含むＤＮＡ。 - 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか一項に記載のＤ
ＮＡがベクターに連結された組換えベクター。 - 【請求項７】 請求項１〜５のいずれか一項に記載のＤ
ＮＡが導入されることより形質転換された形質転換体。 - 【請求項８】 請求項７記載の形質転換体を培地で培養
し、その培養物からインドール酸化酵素又はそのサブユ
ニットを採取することを特徴とするインドール酸化酵素
又はそのサブユニットの製造法。 - 【請求項９】 請求項７記載の形質転換体、またはこの
形質転換体の培養物から採取したインドール酸化酵素の
粗精製画分もしくは精製酵素を、インドールを含有する
水性溶液に加えてインジゴを生成させることを特徴とす
るインジゴの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11089129A JP2000279172A (ja) | 1999-03-30 | 1999-03-30 | 新規なインドール酸化酵素をコードするｄｎａとその利用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11089129A JP2000279172A (ja) | 1999-03-30 | 1999-03-30 | 新規なインドール酸化酵素をコードするｄｎａとその利用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000279172A true JP2000279172A (ja) | 2000-10-10 |
Family
ID=13962283
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11089129A Pending JP2000279172A (ja) | 1999-03-30 | 1999-03-30 | 新規なインドール酸化酵素をコードするｄｎａとその利用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000279172A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009095284A (ja) * | 2007-10-17 | 2009-05-07 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | インドール酸化酵素 |
| WO2018206823A1 (en) * | 2017-11-16 | 2018-11-15 | Bayer Aktiengesellschaft | Enantionselective enzymatic sulfoxidation of chiral arylsufides |
-
1999
- 1999-03-30 JP JP11089129A patent/JP2000279172A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009095284A (ja) * | 2007-10-17 | 2009-05-07 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | インドール酸化酵素 |
| WO2018206823A1 (en) * | 2017-11-16 | 2018-11-15 | Bayer Aktiengesellschaft | Enantionselective enzymatic sulfoxidation of chiral arylsufides |
| EP3486317A1 (en) * | 2017-11-16 | 2019-05-22 | Bayer Aktiengesellschaft | Enantionselective enzymatic sulfoxidation of chiral arylsufides |
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