JP2000266748A - 抗マウスＩｇＥ抗体を用いたマウスＩｇＥの測定キット及び測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 マウスを用いたアレルゲン感作による血中ま
たは細胞培養上清のIgE濃度の測定は、動物実験におけ
る各種アレルギー疾患の病勢や薬剤による治療効果、及
び予知、診断に有用な情報を提供する。 【解決手段】 マウスIgEの少なくとも一部を認識する
抗体を用い、抗原抗体反応をマウスIgE非含有血清の存
在下で行うことを特徴とする、対象試料中のマウスIgE
を簡便かつ高感度に測定するためのキット、及び該測定
キットを使用する測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、マウスイムノグロ
ブリンE（IgE）を認識する抗体を含む、対象試料中のマ
ウスIgEを測定するための測定キット、及び、マウスイ
ムノグロブリンE（IgE）を認識する抗体を用いて対象試
料中のマウスIgEを測定するための測定方法に関する。
本発明の測定方法によってマウスIgEを測定して得られ
る結果は、マウスを用いた動物モデル実験における各種
アレルギー疾患の病勢や薬剤による治療効果、および予
知、診断に有用な情報を提供する。

【０００２】

【従来の技術】生体内に異物が侵入したとき、それを排
除しようとする免疫反応が起こる。この免疫反応が生体
に対して様々な病気をもたらす場合をアレルギーと呼
び、現在このアレルギー反応の作用機序によりＩ型から
Ｖ型の5種類に分類されている。近年では、乳幼児を中
心としてアトピー性皮膚炎に代表される種々のアレルギ
ー疾患患者が激増し、社会問題となっているが、これら
のアレルギー疾患の多くはアレルゲンに反応するIgEが
過剰に産生されることにより発症する即時型（Ｉ型）ア
レルギーと呼ばれている。

【０００３】一般的に、アレルギーを発症していない状
態では血中IgE濃度はおよそ数ng/mL程度と極めて微量に
保たれているが、いったんアレルギーを発症すると血中
IgE濃度はこれの数十倍から数千倍に増加する。大量に
産生されたIgEは肥満細胞上のリセプターに結合し、さ
らに体内に侵入したアレルゲンによって細胞膜上で架橋
されることにより肥満細胞からヒスタミンなどの炎症因
子が血中に放出されてアレルギー疾患を発症すると考え
られている。

【０００４】このＩ型アレルギーの治療を最終目標とし
てIgE産生調節メカニズムを解明する研究が盛んに行わ
れており、肥満細胞から放出されるヒスタミンやロイコ
トリエンなどのケミカルメディエーターによる炎症反応
を抑える薬剤や、IgEとリセプターとの結合を阻害する
薬剤などの開発が進められている。

【０００５】このため、血中のIgE量を定量することは
Ｉ型アレルギー疾患、特にアトピー性疾患においては重
要な診断基準となる。また、寄生虫感染、重症肝障害、
湿疹、IgEミエローマでも上昇することが知られてお
り、血中IgE量を定量することはこれらの疾患を判別す
ることにも役立つ。

【０００６】ヒト血中IgEの測定方法は、ヒトIgEに対す
る抗体を組み合わせたELISA系やRIA系により測定するこ
とが可能であり、サンドイッチ法や競合法により行われ
ている。また、肥満細胞や好塩基球上に存在するIgEリ
セプター(FcεRI及びFcεRII)との結合を応用したアレ
ルギーの発症に関与するIgEの測定方法も開発されてい
る(特開平7−072150（特願平5-218920）、特開平8−101
194（特願平6-237590）)。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】動物モデルとしては、
一般にマウスが用いられており、マウスIgEを測定する
試薬類は既に市販されているが、測定感度が高々１０ng
/ml程度であり、更に２５倍以上に希釈した検体試料が
１００μlも必要であった。そこで、本発明者等は、操
作が簡便で、測定精度および測定感度、再現性が優れ、
将来的に広く一般的に使用されることを目的としたマウ
スIgEの測定系（キット）を開発すべく、鋭意研究を進
めてきた。

【０００８】その結果、マウスIgEを認識する抗体を用
い、抗原抗体反応をマウスIgE非含有血清の存在下で行
うことによって、従来公知の測定方法に比べて約５００
倍程度高い測定感度が得られることを見出し、それに基
づいて対象試料中のマウスIgEを測定するための、簡便
で、測定精度、測定感度および再現性に優れている測定
キット及び測定方法に関する本発明を完成させた。

【課題を解決するための手段】

【０００９】即ち、本発明は、マウスIgEの少なくとも
一部を認識する抗体を含み、抗原抗体反応をマウスIgE
非含有血清の存在下で行うことを特徴とする、対象試料
中のマウスIgEを測定するための測定キットに係る。更
に、本発明は、マウスIgEの少なくとも一部を認識する
抗体を用い、抗原抗体反応をマウスIgE非含有血清の存
在下で行うことを特徴とする、対象試料中のマウスIgE
を測定するための測定方法に係わる。該方法は、上記本
発明の測定キットを使用して行うことが好ましい。本発
明の測定方法における抗原抗体反応は、マウスIgE非含
有血清の存在下で実施することが特徴である。ここで、
「マウスIgE非含有血清」とは、マウスIgEを実質的に含
まない（本発明測定方法の検出感度以下のマウスIgEし
か含まない）ような血清を意味する。抗原抗体反応溶液
中の該マウスIgE非含有血清の最終濃度は、当業者が適
宜決めることができ、高い測定感度を得るためには、好
ましくは、５容量％〜９０容量％、より好ましくは１０
容量％〜５０容量％である。かかるマウスIgE非含有血
清は、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、ヤギ、ヒ
ツジ、ウマ、ブタ、ニワトリ等の温血動物の血清を、抗
マウスIgE抗体を固相化した樹脂に通してマウスIgEを吸
収する等の当業者に公知の方法で調製することが出来
る。マウスIgE非含有血清は、例えば、抗原抗体反応に
際して、その系に直接加えても良いし、抗体又はマウス
IgEを含む対象試料（検体）又は標識抗体を希釈する為
の希釈溶液に予め含有させておくこともできる。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明に於いて、マウスIgEとは
マウス血中に存在する全てのIgEを指す。即ち、血中に
は遊離のIgEとして肥満細胞や好塩基球上のIgEリセプタ
ー(FcεRIおよびFcεRII)に結合するものと、それらリ
セプターには結合しないものが存在するが、その何れで
あってもよく、あるいは、これらの混合物であってもよ
い。また、マウスB細胞やマウスミエローマ細胞などの
マウスIgEを産生しうる細胞を人為的に培養した培養上
清中に遊離されるIgEでもよい。更に、B細胞のmRNA等を
用いて遺伝子工学的に作製したリコンビナントのマウス
IgEでもよい。

【００１１】本発明の測定方法は、マウスIgEの少なく
とも一部を認識する抗体を含むことを特徴とするが、以
下にこの抗体について説明する。本発明で用いる抗体
は、前述のマウスIgEを抗原として認識し得る抗体であ
れば如何なるものでも良い。従って、本発明で用いる抗
体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗
体であっても良い。尚、固相化抗体としてポリクローナ
ル抗体を使用する場合には、抗体の非特異的反応を抑え
る為に、精製したマウスIgEを固相化したカラム等を使
用して特異的に精製したものが好ましい。又、遺伝子工
学的に作成されるキメラ抗体等であっても良い。更に、
以上の抗体にペプシン、パパイン等のタンパク質分解酵
素を作用させて得られる、F(ab’)_２、Fab’、Fab等の
抗体のFc部分を除去したフラグメントも本発明で使用す
る抗体に含まれる。これらのフラグメントは、抗体のFc
部分がない為にマイクロタイタープレート等の固相への
非特異的結合が低く、本発明において酵素等の化学物質
で標識して使用する標識抗体として好ましい。高測定感
度を得る為には、特に、F(ab’)_２を標識抗体として使
用することが好ましい。例えば、固相サンドイッチ法な
どのような二段階の抗原抗体反応を行う測定方法におい
ては、担体へのコーティングに用いられる固相化抗体
（一次抗体）としてはポリクローナル抗体又はモノクロ
ーナル抗体、標識二次抗体としてはポリクローナル抗体
由来のFc部分を除去したフラグメント、というように二
種類以上の抗体を使用することが出来る。

【００１２】本発明で用いる抗体は、B細胞のmRNA等を
用いて遺伝子工学的に作製したり、動物に免疫する等の
当業者に公知の如何なる方法で作製することができる
が、抗体の作製方法として、以下の方法が一般的であ
る。まず、マウスIgE、もしくはその一部を免疫原とし
て用い、動物に免疫する。ここで用いる免疫原は、前述
のマウスIgEを認識する所望の抗体が得られるようなも
のであればよく、マウスIgE全体であっても一部であっ
てもよく、また、天然であっても人工的に作製されたも
のであってもよい。

【００１３】免疫原として用いるマウスIgEを天然から
得る場合は、IgEを含むマウス血清画分あるいは血漿画
分から塩析、透析やアフィニティークロマトグラフィ
ー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラ
フィー等各種クロマトグラフィーを用いて精製すること
が可能である。また、IgEを産生するマウスミエローマ
細胞等、適当な細胞を培養し、その培養上清から精製す
ることも可能である。

【００１４】マウスIgEを人工的に作製するには、所望
のマウスIgEのアミノ酸配列をコードするDNAを作製し、
該DNAで適当な宿主細胞を形質転換し、形質転換された
宿主細胞の培養上清から回収すればよい。

【００１５】上記のようにして得たマウスIgEを免疫原
とする動物の免疫に際して有用な免疫動物は、ウサギ、
モルモット、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ニワトリ等
の温血動物である。また、これらの動物を免疫する方法
は、当該技術分野で通常行われている方法でよい。尚、
二種類の抗マウスIgE抗体を使用するような場合には、
それぞれ別の免疫原に由来するものを使用することも出
来る。

【００１６】次に、免疫した動物から抗体を得るのであ
るが、この方法も、当該技術分野で従来公知の方法によ
ればよい。その一例を挙げると、下記のとおりである。

【００１７】目的の抗体がポリクローナル抗体である場
合は、免疫した動物から得られる抗血清を既存のプロテ
インGカラムに供し、カラム吸着画分をグリシン塩酸緩
衝液等の酸性緩衝液で溶出してIgG画分を回収したの
ち、透析等によって目的の溶媒に置換する。次に、この
画分に抗マウスIgE活性があるか否かを判定する。判定
の具体的方法としては、公知の酵素免疫測定法に従い、
プレートに吸着した抗原に抗体を反応させ、これに酵素
標識した二次抗体を反応させ、酵素の作用による基質の
発色反応で酵素活性を測定する方法、あるいはラジオア
イソトープで標識された抗原を用いる公知のラジオイム
ノアッセイ法等が例示されるが、公知の各種の方法を用
いることが可能である。

【００１８】また、モノクローナル抗体を調製する場合
は、免疫した動物の脾細胞とミエローマ細胞株などの細
胞融合用のペアレントセルを融合させ、得られる融合細
胞（ハイブリドーマ）の中から好適なものを選択してク
ローン化し、次いで、その融合細胞を生体外または生体
内で培養し、この培養混合物より特異性の高いモノクロ
ーナル抗体を採取する。

【００１９】上記のようにして得た抗体は、必要に応じ
て精製を行う。精製方法は、塩析、透析、イオン交換ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー
等の公知の方法を任意に組み合わせればよい。

【００２０】本発明の測定方法では、上記のようにして
得た抗体を用いるが、該抗体は、例えば、固相化抗体及
び／又は標識抗体として、対象試料中の被検物質である
マウスIgEとの抗原抗体反応によって、対象試料中の被
検物質マウスIgEをトラップする為に使用されることが
望ましい。標識抗体及びマウスIgE標準品は、溶液又は
凍結乾燥等の各種形態で提供することができる。固相化
抗体は、ビーズ、マイクロタイタープレート、試験管、
ニトロセルロース膜、ナイロン膜等の固相化担体表面
に、当業者には公知の方法によって、マウスIgEの少な
くとも一部を認識する抗体を結合させることによって調
製される。本発明の測定キットは、マウスIgEの少なく
とも一部を認識する各種抗体に加えて、以下に記載する
測定方法・測定原理に応じて、様々な試薬、材料、器具
等を含有するものである。例えば、各種固相化担体（測
定に際して、測定者自らが固相化抗体を調製するような
場合）、マウスIgE標準品、検出用試薬、マウスIgE非含
有血清、反応媒体又は試料用の希釈溶液等、当業者には
公知のものを挙げることが出来る。

【００２１】本発明の測定キット及び測定方法は、以上
に説明したように、試料中のマウスIgEを測定すること
を目的としている。この場合、対象試料は血液、血漿、
血清およびIgE産生細胞の培養上清等が好ましいが、マ
ウスIgEを含む溶液であれば、これらに限定されるもの
ではない。本発明の測定キット及び測定方法における被
検物質の検出原理は特定のものに限定されない。測定方
法として、凝集法、サンドイッチ法、競合法、及び、固
相直接法等を挙げることができる。

【００２２】凝集法では、抗体を粒子、例えばラテック
ス粒子や赤血球の表面に結合させ、マウスIgEが存在す
ると粒子の凝集が生じるようにし、この粒子の凝集の程
度を指標としてマウスIgEを測定する。なお、この凝集
法では、ラテックスや赤血球以外にも、ゼラチンやマイ
クロビーズ、カーボン粒子等、一般に用いられている粒
子を使用することができる。

【００２３】また、サンドイッチ法、固相直接法、競合
法では、標識された抗体や抗原を使用し、エンザイムノ
アッセイ(EIA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、ケミルミ
ネッセンスイムノアッセイ(化学発光免疫測定法)、フル
オロイムノアッセイ(蛍光免疫測定法)、時間分解蛍光免
疫測定法(TR-FIA)等の原理で測定を行うことが出来る。

【００２４】以下に、本発明の好適例として、EIAの原
理に基づく固相サンドイッチ法を説明する。EIAによる
固相サンドイッチ法ではまず、ペルオキシダーゼ、アル
カリフォスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ等の酵素
で標識した、マウスIgEを認識する抗体を準備する。ま
た、使用する固相にはマウスIgEを認識する抗体を吸着
させておく。次に固相の抗体非吸着面を、その反応系に
は影響しないタンパク質、例えばBSA(ウシ血清アルブミ
ン)などでブロッキング処理を行う。サンプル（試料）
もしくはスタンダードを固相に添加し、第一ステップの
抗原抗体反応を行わしめる。反応後、固相を洗浄し、上
述の酵素標識抗体を添加して固相化抗体と反応したマウ
スIgEと、第二ステップの抗原抗体反応を行わしめる。
なお、サンプル(試料)もしくはスタンダードと酵素標識
抗体を同時に添加することも可能である。過剰の酵素標
識抗体を洗浄操作で除去した後、使用する酵素に応じた
発色基質、例えば1,2-フェニルジアミンとH₂O₂、P-ニト
ロフェニルリン酸、2-ニトロフェニル-β-D-ガラクトシ
ド、3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン等を加えて酵
素と反応させる。基質の発色は、酵素量、ひいてはサン
プル中のマウスIgE物質量に依存するので、発色最終産
物の量を測定することにより、マウスIgEを定量するこ
とが出来る。

【００２５】固相直接法では、サンプル（試料）を直接
固相に吸着させ、固相のマウスIgE非吸着面を、その反
応系には影響しないタンパク質、例えばBSA(ウシ血清ア
ルブミン)などでブロッキング処理し、次いでマウスIgE
を認識する酵素標識抗体を添加、反応させる。以降は、
固相サンドイッチ法と同様の操作を行い、サンプル中の
マウスIgEの有無を判定するか、定量を行う。

【００２６】固相競合法では、使用する抗体が認識する
一定量のマウスIgEを直接固相に吸着させ、次いでブロ
ッキング処理をした後、ここにマウスIgEを認識する酵
素標識抗体とサンプル(試料)とを添加する。一定時間反
応させた後、洗浄して固相に非結合の物質を除去し、発
色基質を加えて酵素と反応させる。反応後、サンプル添
加による、酵素標識抗体の固相マウスIgEへの結合阻害
度を測定することにより、サンプル中のマウスIgEを定
量する。尚、はじめに抗体を固相に吸着させ、酵素標識
したマウスIgEをサンプル(試料)と同時に添加し、サン
プル添加による、標識物の固相化抗体への結合阻害度を
測定することにより、サンプル(試料)中のマウスIgEを
定量しても良い。

【００２７】上記以外の方法として、抗原抗体反応を固
相ではなく液相で行い、後に、抗体を用いた凝集沈降法
もしくは物理化学的な手法によって、標識抗体と結合し
たマウスIgEを不溶化して定量する方法もある。また、
マウスIgEを認識する抗体を標識するのではなく、その
抗体を認識する二次抗体を得、それを標識し、抗原抗体
反応を行わせて、マウスIgEを測定することも可能であ
る。

【００２８】サンドイッチ法、固相直接法、競合法のい
ずれにおいても、標識酵素−発色基質の組み合わせを、
標識酵素−生物発光基質または化学発光基質、標識酵素
−蛍光基質等の組み合わせに変えることが可能である。
この場合の、酵素−発光基質の代表的な組み合わせは、
アルカリフォスファターゼーAMPPD、ホースラディッシ
ュペルオキシダーゼールミノール、ルシフェラーゼール
シフェリン等があり、酵素−蛍光基質の代表的な組み合
わせは、アルカリフォスファターゼーウンベリフェリル
フォスフェート、ホースラディッシュペルオキシダーゼ
ーｐ-ハイドロキシフェニルプロピオン酸等がある。

【００２９】さらに、上記３種の測定方法において、酵
素に代わって、放射性物質や化学発光物質あるいは蛍光
物質で直接あるいは間接的に標識された抗体や抗原を用
い、放射能や発光、蛍光の強度を測定することにより、
サンプル(試料)中のマウスIgEを測定することも可能で
ある。放射性物質としては、¹²⁵Iや¹³¹I等が一般に使用
されており、化学発光物質の代表的なものには、アクリ
ジニウムエステル等がある。また、蛍光強度を測定する
場合には、より高感度な方法として、抗体あるいは抗原
にキレート剤を直接あるいは間接的に結合させ、励起光
照射後にそのキレート剤から発せられる蛍光の強度を時
間分解的に測定することにより、試料中のマウスIgEを
測定する方法(時間分解蛍光免疫測定法)も有用である。
尚、代表的な希土類金属の例として、ユーロピウムがあ
げられる。

【００３０】本発明の各測定方法におけるその他の反応
条件等は、その目的・対象試料の種類・測定原理等に応
じて、当業者が適宜決定することが出来る。

【００３１】以下の実施例で示されるように、本発明の
測定キットを使用する検出系・測定方法は、マウス血清
中のIgEを測定することにおいて非常に安定な系であ
る。更に、測定に必要な対象試料は、わずか数μlとい
う微量なもので充分であり、且つ、０．５ng/ml以上の
マウスIgEが検出可能であるような高感度なものであ
る。以上、説明した本発明の測定キット及び測定方法
は、マウスを用いた動物モデル実験における各種アレル
ギー疾患の病勢や薬剤による治療効果、および予知、診
断に有用な情報を提供する。

【００３２】

【実施例】以下に、実施例をもって本発明をよりいっそ
う具体的に説明するが、これらは実施例の一例として示
すものであり、本発明はこれらにより何等限定されるも
のではない。なお、記載に用いる略号は、当該技術分野
における慣用略号によるものである。

【００３３】マウスIgE非含有血清の作製 マウスIgE非含有ラット血清を以下のように作製した。 （１）抗マウスIgE抗体固相化樹脂の作製 ヤギ抗マウスIgE抗血清から精製した抗マウスIgE抗体を
N-ヒドロキシスクシンイミド活性化樹脂（AmershamPhar
maciaBiotech社、HiTrap NHS-activated）に5mg/mlにな
るように取扱説明書通り結合させた。 （２）マウスIgEの吸収操作 ラット血清を抗マウスIgE抗体固相化樹脂に1mm/min.の
線流速で通し、素通りしてきた画分を集め、固相サンド
イッチ法により、ラット血清中のマウスIgEを測定し
た。血清中のマウスIgE濃度が測定限界以下になるま
で、上記の操作を繰り返した。

【００３４】西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギF(a
b’)₂抗マウスIgEポリクローナル抗体の調製 （１）ヤギF(ab’)₂抗マウスIgEの調製 ヤギ抗マウスIgE抗血清から得られたIgG画分を0.1M 酢
酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)に一晩透析する。同緩衝液
で２mg/mlとなるように調製し、同緩衝液で溶解したブ
タペプシンを終濃度4%となるように添加した。37℃に保
たれたインキュベーターで24時間インキュベーションし
酵素消化を行った。酵素消化後、0.2M NaHCo₃で平衡化
したSuperose 12カラム(Pharmacia製)で分離を行い、F
(ab’)₂画分を回収した。回収されたF(ab’)₂画分は2mg
/mlに濃度調整し、使用するまで-80℃で保存した。 （２）過ヨウ素酸活性化西洋ワサビペルオキシダーゼと
ヤギF(ab’)₂抗マウスIgEとのカップリング 公知の方法に従い調製した過ヨウ素酸活性化西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ(4mg/ml,0.2M NaHCO₃に溶解)と、上記
（１）で調製したヤギF(ab’)₂抗マウスIgE(2mg/ml)を
等量づつ混合し、常温、遮光下で6時間インキュベーシ
ョンした。その後、カップリングを行った総タンパク量
と等量の水素化ホウ素ナトリウムを加え、4℃で一晩放
置した。20mM Tris-HCl,150mM NaCl(pH7.4)に一晩透析
し、透析後、ELISAで使用しうる濃度に希釈し、以下の
測定系で使用した。

【００３５】ELISAの原理に基づく、固相サンドイッチ
法による測定 ELISAの原理に基づく、固相サンドイッチ法によるマウ
スIgEの測定系を以下のように作製した。

【００３６】

【実施例１】Ａ モノクローナル抗体ー酵素標識ポリク
ローナル抗体の系 （１）抗マウスIgE抗体の担体へのコーティング 抗マウスIgEラットモノクローナル抗体(Crystal Chem I
nc. 製)を炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）に2μg/mlとなるよ
うに溶解した。これをマイクロタイタープレート(Nunc
社、マイクロモジュールプレート、Maxsorp-F8)に100μ
lずつ分注し、4℃で一晩放置した。 （２）マイクロタイタープレートのブロッキング 各ウェルを300μlの洗浄液(150mM NaCl,0.05% Tween20
を含む20 mMトリス塩酸緩衝液 (pH7.4))で３回洗浄後、
ブロッキング溶液(0.1% BSA(オリエンタル酵母社製),15
0mM NaCl,0.05% Tween20を含む20 mMトリス塩酸緩衝液
(pH7.4))300μlを加え25℃で2時間放置した。 （３）マウスIgEの測定 各ウェル中のブロッキング溶液を除去後、各ウェルに希
釈溶液(30%マウス IgE非含有ラット血清,0.1 % BSA,150
mM NaCl,0.05% Tween20を含む20mMトリス塩酸緩衝液 (p
H7.4))を95μl分注した。ここに、検体血清を5μl加
え、25℃で４時間放置した。標準マウスIgEとしては、
マウスミエローマ細胞由来精製 (100ng/ml)を用い、こ
れを希釈溶液で２倍段階希釈し、同様に各ウェルに5μl
加え、25℃で４時間放置した。また、この系での測定範
囲以外の検体については予め検体希釈溶液で希釈してか
ら測定した。各ウェルを洗浄液300μlで5回洗浄後、西
洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスIgEポリク
ローナル抗体を希釈液で希釈し、100μlずつ加え、25℃
で2時間放置した。次に、各ウェルを洗浄液300μlで5回
洗浄後、TMB溶液(3,3’,5,5’テトラメチルベンジジン)
を100μlずつ加え、25℃遮光下で30分間反応させた。そ
の後、1規定硫酸を100μlずつ加え反応を停止させた。
各ウェルの吸光度をマイクロプレートリーダーを用いて
主波長450nm、副波長630nmで測定した。図１に標準マウ
スIgE (100ng/ml)の2倍段階希釈したものの希釈直線性
を示す。良好な希釈直線性を示している。

【００３７】

【実施例２】Ｂ ポリクローナル抗体ー酵素標識ポリク
ローナル抗体の系 （１）抗マウスIgE抗体の担体へのコーティング 抗マウスIgEラットポリクローナル抗体を炭酸緩衝液
（ｐＨ９．６）に10μg/mlとなるように溶解した。これ
をマイクロタイタープレート(Nunc社、マイクロモジュ
ールプレート、Maxsorp-F8)に100μlずつ分注し、4℃で
一晩放置した。 （２）マイクロタイタープレートのブロッキング 各ウェルを300μlの洗浄液(150mM NaCl,0.05% Tween20
を含む20 mMトリス塩酸緩衝液 (pH7.4))で３回洗浄後、
ブロッキング溶液(0.1% BSA(オリエンタル酵母社製),15
0mM NaCl,0.05% Tween20を含む20 mMトリス塩酸緩衝液
(pH7.4))300μlを加え25℃で2時間放置した。 （３）マウスIgEの測定 各ウェル中のブロッキング溶液を除去後、各ウェルに希
釈溶液(マウス30% IgE非含有ラット血清,0.1 % BSA,150
mM NaCl,0.05% Tween20を含む20mMトリス塩酸緩衝液 (p
H7.4))を95μl分注した。ここに、検体血清を5μl加
え、25℃で４時間放置した。標準マウスIgEとしては、
マウスミエローマ細胞由来精製IgE(100ng/ml)を用い、
これを希釈溶液で２倍段階希釈し、同様に各ウェルに5
μl加え、25℃で４時間放置した。また、この系での測
定範囲以外の検体については予め検体希釈溶液で希釈し
てから測定した。各ウェルを洗浄液300μlで5回洗浄
後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスIgE
ポリクローナル抗体を希釈液で希釈し、100μlずつ加
え、25℃で2時間放置した。次に、各ウェルを洗浄液300
μlで5回洗浄後、TMB溶液(3,3’,5,5’テトラメチルベ
ンジジン)を100μlずつ加え、25℃遮光下で30分間反応
させた。その後、1規定硫酸を100μlずつ加え反応を停
止させた。各ウェルの吸光度をマイクロプレートリーダ
ーを用いて主波長450nm、副波長630nmで測定した。図２
に標準マウスIgE(100ng/ml)の2倍段階希釈したものの希
釈直線性を示す。良好な希釈直線性を示している。

【００３８】

【実施例３】Ｃ ポリクローナル抗体ー酵素標識F(a
b’)₂ポリクローナル抗体の系 （１）抗マウスIgE抗体の担体へのコーティング 抗マウスIgEラットポリクローナル抗体を炭酸緩衝液
（ｐＨ９．６）に2μg/mlとなるように溶解した。これ
をマイクロタイタープレート(Nunc社、マイクロモジュ
ールプレート、Maxsorp-F8)に100μlずつ分注し、4℃で
一晩放置した。 （２）マイクロタイタープレートのブロッキング 各ウェルを300μlの洗浄液(150mM NaCl,0.05% Tween20
を含む20 mMトリス塩酸緩衝液 (pH7.4))で5回洗浄後、
ブロッキング溶液(0.1% BSA(オリエンタル酵母社製),15
0mM NaCl,0.05% Tween20を含む20 mMトリス塩酸緩衝液
(pH7.4))300μlを加え25℃で2時間放置した。 （３）マウスIgEの測定 各ウェル中のブロッキング溶液を除去後、各ウェルに希
釈溶液(30% マウスIgE非含有ラット血清,0.1 % BSA,150
mM NaCl,0.05% Tween20を含む20mMトリス塩酸緩衝液 (p
H7.4))を95μl分注した。ここに、検体血清を5μl加
え、4℃で16時間放置した。標準マウスIgEとしては、マ
ウスミエローマ細胞由来精製IgE(200ng/ml)を用い、こ
れを希釈溶液で２倍段階希釈し、同様に各ウェルに5μl
加え、4℃で16時間放置した。また、この系での測定範
囲以外の検体については予め検体希釈溶液で希釈してか
ら測定した。各ウェルを洗浄液300μlで5回洗浄後、西
洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギF(ab’)₂抗マウスIg
Eポリクローナル抗体を希釈液で希釈し、100μlずつ加
え、25℃で2時間放置した。次に、各ウェルを洗浄液300
μlで5回洗浄後、TMB溶液(3,3’,5,5’テトラメチルベ
ンジジン)を100μlずつ加え、25℃遮光下で30分間反応
させた。その後、1規定硫酸を100μlずつ加え反応を停
止させた。各ウェルの吸光度をマイクロプレートリーダ
ーを用いて主波長450nm、副波長630nmで測定した。図３
に標準マウスIgE(200ng/ml)の2倍段階希釈したものの希
釈直線性を示す。良好な希釈直線性を示している。実際
に検体中のIgE量を測定する場合は、これをマウスIgE標
準曲線とし検体中のIgE量を換算した。

【００３９】

【実施例４】Ｄ モノクローナル抗体ー酵素標識F(a
b’)₂ポリクローナル抗体の系 （１）抗マウスIgE抗体の担体へのコーティング 抗マウスIgEラットモノクローナル抗体(Crystal Chem I
nc. 製)を炭酸緩衝液（pH 9.6）に１μg/mlとなるよう
に溶解した。これをマイクロタイタープレート(Nunc
社、マイクロモジュールプレート、Maxsorp-F8)に100μ
lずつ分注し、4℃で一晩放置した。 （２）マイクロタイタープレートのブロッキング 各ウェルを300μlの洗浄液(150mM NaCl,0.05% Tween20
を含む20 mMトリス塩酸緩衝液 (pH7.4))で5回洗浄後、
ブロッキング溶液(0.1% BSA(オリエンタル酵母社製),15
0mM NaCl,0.05% Tween20を含む20 mMトリス塩酸緩衝液
(pH7.4) )300μlを加え25℃で2時間放置した。 （３）マウスIgEの測定 各ウェル中のブロッキング溶液を除去後、各ウェルに希
釈溶液(30% マウスIgE非含有ラット血清,0.1 % BSA,150
mM NaCl,0.05% Tween20を含む20mMトリス塩酸緩衝液 (p
H7.4))を95μl分注した。ここに、検体血清を5μl加
え、4℃で16時間放置した。標準マウスIgEとしては、マ
ウスミエローマ細胞由来精製IgE(32ng/ml)を用い、これ
を希釈溶液で２倍段階希釈し、同様に各ウェルに5μl加
え、4℃で16時間放置した。また、この系での測定範囲
以外の検体については予め検体希釈溶液で希釈してから
測定した。各ウェルを洗浄液300μlで5回洗浄後、西洋
ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギF(ab’)₂抗マウスIgE
ポリクローナル抗体を希釈液で希釈し、100μlずつ加
え、25℃で2時間放置した。次に、各ウェルを洗浄液300
μlで5回洗浄後、TMB溶液(3,3’,5,5’テトラメチルベ
ンジジン)を100μlずつ加え、25℃遮光下で30分間反応
させた。その後、1規定硫酸を100μlずつ加え反応を停
止させた。各ウェルの吸光度をマイクロプレートリーダ
ーを用いて主波長450nm、副波長630nmで測定した。図４
に標準マウスIgE(32ng/ml)の2倍段階希釈したものの希
釈直線性を示す。良好な希釈直線性を示している。実際
に検体中のIgE量を測定する場合は、これをマウスIgE標
準曲線とし検体中のIgE量を換算した。以上の本発明の
測定キットを使用することにより、5μlのマウス血清を
用いて０．５ng/ml以上のマウスIgEが検出することがで
きた。

【００４０】

【実施例５】マウスIgE測定キットの基礎性能試験 （１）血清検体の希釈試験 実施例４の試験法に従って実際にマウス血清検体の希釈
試験を行った。血清はIgE量の不明な血清2検体を検体希
釈液でそれぞれ2倍段階希釈し、同時に測定した標準マ
ウスIgEから得られた標準曲線に基づいて、検体のIgE濃
度を算出した。図５の結果に示すとおり、ほぼ原点を通
る良好な直線性が得られている。 （２）添加回収試験 上記の試験法に従ってマウスIgEの添加回収試験を行っ
た。血清検体3検体に標準マウスIgEを添加し、測定値か
ら添加したIgE量の回収率を求めた。表１に示すとお
り、添加回収率は84.8%から126.8%（平均値107.2％）と
良好な結果が得られている。

【００４１】

【表１】

【００４２】（３）同時再現性試験 上記の試験法に従って同時再現性試験を行った。表２に
結果を示すとおり、CV値は10%以下で良好な同時再現性
を示している。

【００４３】

【表２】

【００４４】（４）日差再現性試験 上記の試験法に従って日差再現性試験を行った。表３に
結果を示すとおり、CV値は10%以下で良好な日差再現性
を示している。

【００４５】

【表３】

【００４６】（３）および（４）の結果から、この検出
系がマウス血清中のIgEを測定することにおいて非常に
安定な系であることを示している。また、本測定系を用
いると、わずか5μlのマウス血清を用いることにより0.
5ng/ml以上のマウスIgEが検出可能であった。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、モノクローナル抗体ー酵素標識ポリク
ローナル抗体の系において、マウスミエローマ由来標準
IgE(100 ng/ml)を2倍段階希釈により希釈し、本発明の
実施例の方法(ELISAの原理に基づく、固相サンドイッチ
法)により測定波長450nm、副波長630nmでの吸光度を測
定した結果を示すグラフである。

【図２】図２は、ポリクローナル抗体ー酵素標識ポリク
ローナル抗体の系において、マウスミエローマ由来標準
IgE(100 ng/ml)を2倍段階希釈により希釈し、本発明の
実施例の方法(ELISAの原理に基づく、固相サンドイッチ
法)により測定波長450nm、副波長630nmでの吸光度を測
定した結果を示すグラフである。

【図３】図３は、ポリクローナル抗体ー酵素標識ポリク
ローナルF(ab’)₂抗体の系において、マウスミエローマ
由来標準IgE(200 ng/ml)を2倍段階希釈により希釈し、
本発明の実施例の方法(ELISAの原理に基づく、固相サン
ドイッチ法)により測定波長450nm、副波長630nmでの吸
光度を測定した結果を示すグラフである。

【図４】図４は、モノクローナル抗体ー酵素標識F(a
b’)₂ポリクローナル抗体の系において、マウスミエロ
ーマ由来標準IgE(32 ng/ml)を2倍段階希釈により希釈
し、本発明の実施例の方法(ELISAの原理に基づく、固相
サンドイッチ法)により測定波長450nm、副波長630nmで
の吸光度を測定した結果を示すグラフである。

【図５】図５は、マウス血清検体を測定系に0.0625μ
l、0.125μl、0.25μl用いて、本発明の実施例４の方法
(ELISAの原理に基づく、固相サンドイッチ法)により測
定波長450nm、副波長630nmでの吸光度を測定し濃度を図
４より算出したグラフである。

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 マウスIgEの少なくとも一部を認識する
   抗体を含み、抗原抗体反応をマウスIgE非含有血清の存
   在下で行うことを特徴とする、対象試料中のマウスIgE
   を測定するための測定キット。
2. 【請求項２】 前記抗体として、ポリクローナル抗体及
   びモノクローナル抗体の二種類の組み合わせを使用する
   請求項１に記載の測定キット。
3. 【請求項３】 前記ポリクローナル抗体がF(ab’)_２又
   はFab’の形態である、請求項１又は２に記載の測定キ
   ット。
4. 【請求項４】 前記血清がウサギ、モルモット、ラッ
   ト、マウス、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、又はニワトリ
   由来の血清である、請求項１ないし３のいずれか一項に
   記載の測定キット。
5. 【請求項５】 測定方法としてエンザイムノアッセイを
   用いる、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の測定
   キット。
6. 【請求項６】 測定方法としてラジオイムノアッセイを
   用いる、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の測定
   キット。
7. 【請求項７】 測定方法としてフルオロイムノアッセイ
   を用いる、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の測
   定キット。
8. 【請求項８】 測定方法としてケミルミネッセンスイム
   ノアッセイを用いる、請求項１ないし４のいずれか一項
   に記載の測定キット。
9. 【請求項９】 測定方法として時間分解蛍光免疫測定法
   を用いる、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の測
   定キット。
10. 【請求項１０】測定方法として粒子の凝集を指標とする
    イムノアッセイを用いる、請求項１ないし４のいずれか
    一項に記載の測定キット。
11. 【請求項１１】前記粒子がラテックス粒子である請求項
    １０に記載の測定キット。
12. 【請求項１２】マウスIgEの少なくとも一部を認識する
    抗体を用い、抗原抗体反応をマウスIgE非含有血清の存
    在下で行うことを特徴とする、対象試料中のマウスIgE
    を測定するための測定方法。
13. 【請求項１３】前記対象試料が、血漿、血清または細胞
    培養上清から選ばれる請求項１２に記載の測定方法。
14. 【請求項１４】抗原抗体反応溶液中の該マウスIgE非含
    有血清の最終濃度が、５容量％〜９０容量％である、請
    求項１２に記載の測定方法。
15. 【請求項１５】対象試料中に含まれる０．５ng/ml以上
    のマウスIgEが検出可能である、請求項１２に記載の測
    定方法。