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JP2000128791A - 随伴細胞に及ぼす白血病抑制因子の増殖作用 - Google Patents

随伴細胞に及ぼす白血病抑制因子の増殖作用

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Publication number
JP2000128791A
JP2000128791A JP11328151A JP32815199A JP2000128791A JP 2000128791 A JP2000128791 A JP 2000128791A JP 11328151 A JP11328151 A JP 11328151A JP 32815199 A JP32815199 A JP 32815199A JP 2000128791 A JP2000128791 A JP 2000128791A
Authority
JP
Japan
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lif
cells
myoblast
myoblasts
concentration
Prior art date
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Pending
Application number
JP11328151A
Other languages
English (en)
Inventor
Lawrence Austin
ローレンス・オウスチン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Monash University
Original Assignee
Monash University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Monash University filed Critical Monash University
Publication of JP2000128791A publication Critical patent/JP2000128791A/ja
Pending legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
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    • A61K35/34—Muscles; Smooth muscle cells; Heart; Cardiac stem cells; Myoblasts; Myocytes; Cardiomyocytes
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • C12N2501/235—Leukemia inhibitory factor [LIF]

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 筋芽細胞導入治療薬剤の提供。 【解決手段】 当該薬剤は、随伴細胞にとって増殖し、
および／または筋芽細胞に分化するのに充分な時間およ
び条件下で増殖および／または分化に有効な量のＬＩＦ
と哺乳類の随伴細胞とを接触させることによって得られ
る筋芽細胞を含むものである。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は哺乳類(動物)の随伴
細胞(衛星細胞または外套細胞の増殖および／または分
化を促進するための、単独またはインターロイキン−６
(ＩＬ−６)および／または腫瘍(トランスフォーミング)
増殖因子α(ＴＧＦα)および／または線維芽細胞増殖因
子(ＦＧＦ)のような他のサイトカインとの組み合せでの
白血病抑制因子(ＬＩＦ)の用途に関するものである。本
発明はまたＬＩＦが単独または他のサイトカインとの組
み合せで哺乳類の随伴細胞を増殖させ、および／または
筋芽細胞に分化するために用いられる筋芽細胞導入治療
を含む方法を意図するものである。本発明はまた、それ
ぞれイン ビドロまたはイン ビボで哺乳類の随伴細胞
の増殖および／または分化を促進するために、単独また
は他のサイトカインとの組み合せでのＬＩＦを含む細胞
活性化組成物および医薬組成物を指向するものである。
【０００２】骨格筋は神経支配され、腱を介して刺激さ
れ骨に結合している並列の多核細胞から成っている。こ
れらの高度に分化した細胞は複製され得ないが、筋肉は
損傷または病後再生について高い能力を持ち、これは筋
線維と密接な関係にある幹細胞、いわゆる随伴細胞の活
性化により達成される。筋細胞核の２０％までが随伴細
胞に見出されることが概算されている。
【０００３】活性化により、随伴細胞は伸長した単核の
筋芽細胞に分化する。これらは、充分な数の場合、融合
して多核化した筋管、すなわち筋線維の前駆体を形成す
る。筋細胞の一次培養は全て随伴細胞より発生する。筋
を細かく切り、トリプシンにより処理し、線維および細
胞外マトリクスを粉砕する。この方法の結果放出される
随伴細胞は採集し、細胞培養状態下に置く。
【０００４】約３日の誘導期後、細胞は増殖し、筋芽細
胞への分化を受ける。これらはまた増殖し、培養が全面
に達した場合、細胞は融合して多核細胞を形成し始め
る。細胞は何回も継代してもよいが、これは融合前に筋
芽細胞の段階でなされなければならない。
【０００５】ヘパリン結合性増殖因子、線維芽細胞増殖
因子(ＦＧＦ)が随伴細胞の増殖を促進することが見出さ
れているが、随伴細胞の増殖および筋芽細胞への続く分
化の制御の特性は、周知ではない(デ・マリオおよびス
トマン、ディファレシエーション、第３９巻、４２−４
９頁(１９８８年)。
【０００６】本発明は、一部分、培養中の筋細胞増殖の
初期の段階に及ぼすいろいろなサイトカインの作用の研
究から生じたものである。本発明によって、ＬＩＦおよ
び程度は低いがＩＬ−６およびＴＧＦαのような他のサ
イトカインが随伴細胞の増殖および続く筋芽細胞の分化
を促進することが見出されている。
【０００７】したがって、本発明の一つの特徴は、上記
の随伴細胞が増殖および／または筋芽細胞に分化するの
に充分な時間および条件下で刺激に有効な量のＬＩＦと
上記の細胞とを接触させることを含む哺乳動物の随伴細
胞の増殖および／または筋芽細胞への分化を促進する方
法に関するものである。
【０００８】本発明の他の特徴は、上記の随伴細胞が増
殖および／または筋芽細胞へ分化するのに充分な時間お
よび条件下一種またはそれ以上の他のサイトカインとの
同時または逐次の組み合せで刺激に有効な量のＬＩＦと
上記の細胞とを接触させることを含む哺乳類の随伴細胞
の増殖および／または筋芽細胞への分化を促進する方法
に関するものである。
【０００９】さらに本発明の他の特徴は、上記の随伴細
胞が増殖および／または筋芽細胞へ分化するのに充分な
時間および条件下、増殖および／または分化に有効な量
のＬＩＦと哺乳類の随伴細胞とを接触させることおよび
次に筋肉に多数の部位で上記の筋芽細胞を投与すること
を含んでいる筋芽細胞導入治療法を意図するものであ
る。この実施態様の別法として、ＬＩＦは一種またはそ
れ以上の他のサイトカインとの同時または逐次の組み合
せで用いられる。
【００１０】なお、本発明の他の特徴は、一種またはそ
れ以上の他のサイトカインおよび一種またはそれ以上の
生理学的に許容可能な担体および／または希釈剤との組
み合せでＬＩＦを含んでいる、細胞を活性化する組成物
に関するものである。
【００１１】さらに、なお本発明の他の特徴は、哺乳類
の随伴細胞の増殖および／または筋芽細胞への分化を刺
激するための細胞を活性化する組成物の製造における単
独または一種またはそれ以上の他のサイトカインとの組
み合せでのＬＩＦの使用に関するものである。
【００１２】さらに、なお本発明の他の特徴には、ＬＩ
Ｆおよび一種またはそれ以上の他のサイトカインおよび
一種または医薬的に許容可能な担体および／または希釈
剤を含んでいる、随伴細胞の増殖および／または分化を
促進するための医薬組成物を提供することがある。
【００１３】一つの好ましい実施態様には、ＬＩＦを所
望の組み合せでのサイトカインはＩＬ−６および／また
はＴＧＦαおよび／またはＦＧＦを包含する。随伴細胞
およびサイトカインは同種または異種の哺乳類から生じ
得る。同じ哺乳類が用いられる場合、随伴細胞およびサ
イトカインは同じ哺乳類の同じかまたは異なる種から生
じ得る。本明細書で意図した哺乳類はヒト、マウスおよ
び家畜動物を包含するがこれに限定するものではない。
【００１４】本発明は、天然に存在している(自然の)、
組み換えおよび／または合成のサイトカインに、および
／またはそれらの誘導体および／類縁体に、および／ま
たはそれらの全ての組み合せに拡大するものである。た
とえば、組み換えのネズミおよびヒトのＬＩＦは国際特
許出願第ＰＣＴ／ＡＵ８８８／０００９３号に開示され
ている。本明細書で用いる用語「ＬＩＦ」はＬＩＦおよび
その誘導体および類縁体の全ての上記の形を包含し、Ｌ
ＩＦ分子のポリペプチド部への単一または多重アミノ酸
置換、欠失および／または添加および分子の炭水化物部
(存在する場合)への単一または多重置換、欠失および／
または添加を包含する。ＬＩＦの誘導体および類縁体は
目的の活性度を有する自然の、組み換えの、および／ま
たは合成のＬＩＦの部分を包含する。
【００１５】本明細書に用いた「同時または逐次の組み
合せ」とは、同時すなわち単一の組成物で、またはかわ
るがわるそれらの各活性な分子または群の投与で、ＬＩ
Ｆおよび一つまたはそれ以上の他のサイトカインを添加
することを意味する。限定されない例として、ＬＩＦは
最初に用い、続いて二番目のサイトカイン続いて三番目
のサイトカイン等々が用いられ得る。別法として、ＬＩ
Ｆは最初に続いて用い、他のサイトカインの組み合せが
用いられ得る。他の実施態様として、他のサイトカイン
は最初に用い(同時または逐次)、続いてＬＩＦが用いら
れ得る。
【００１６】本発明は、特に一次性、遺伝学的に検定し
た筋病に関して医学的に重要である。かなり多数のそれ
らの疾患が存在し、そのうちもっとも重症で、もっとも
普通のものはデュシェンヌ筋ジストロフィ(ＤＭＤ)であ
る。影響を受けた遺伝子は既知であり、その蛋白質生成
物はその由来を調べられている。蛋白質生成物であるジ
ストロフィンはおそらく細胞骨格、膜連鎖の成分であ
る。それは大きく、４２５０００ダルトンであり、遺伝
子はヒト遺伝子の最大のものである。その複雑さの故
に、遺伝学的操作が近い将来に可能になりそうもない。
しかし、他の方法はmdxマウスを含めた筋ジストロフィ
のマウスのモデルに有効であることを示されている。
【００１７】この方法は正常なマウスから誘導した培養
物中における筋芽細胞を増殖させ、多くの部位で突然変
異マウスの筋にそれらを注入することを含む。結果は拒
絶反応が最小なだけでなく、また筋が以前になかったジ
ストロフィンを含むことを示している。
【００１８】非常に重度の筋萎縮を示しているマウス株
において(ジストロフィンが不足していないが、未知の
欠陥をもつ突然変異)筋力はほとんど正常に戻った。す
なわち、培養物中に増殖したヒト筋芽細胞を多くの部位
でＤＭＤの筋に注入される筋芽細胞導入療法と称する方
法が意図される。この方法は全ての一次性筋病に適用で
き、ＤＭＤのみに限定されない。
【００１９】方法は多くの部位で・多数の筋への多数の
筋芽細胞の注入を含む。それは時間がかゝり、筋芽細胞
培養のコストが高い。現在、筋芽細胞を培養する方法は
さまざまな濃度の高価な試薬であるウシ胎児血清(ＦＣ
Ｓ)を用いた長時間の培養に培地を利用する。すなわ
ち、筋芽細胞の分化および増殖を促進し得る全ての因子
は筋芽細胞生産のコストの減少に重要である筈である。
それ故に、本発明によって、ＬＩＦは単独またはＩＬ−
６および／またはＴＧＦαおよび／またはＦＧＦのよう
な他のサイトカインとの組み合せでこの要求を果し得
る。
【００２０】したがって、本発明の一つの特徴は、随伴
細胞を刺激するのに充分な時間および条件下で単独また
はＩＬ−６および／またはＴＧＦαおよび／またはＦＧ
Ｆのような他のサイトカインとの組み合せで刺激に有効
な量のＬＩＦと上記の随伴細胞を接触させることを含ん
でいる哺乳類の随伴細胞の増殖および／または筋芽細胞
への分化を促進する方法を指向するものである。
【００２１】本発明は、またＩＬ−６および／またはＴ
ＧＦαおよび／またはＦＧＦのような他のサイトカイン
および一種またはそれ以上の生理学的に許容可能な担体
および/または希釈剤と共にかまたは共にでなく、ＬＩ
Ｆを含んでいる、細胞を活性化する組成物を指向するも
のである。好ましくは、組成物は一種またはそれ以上の
他のサイトカインとの組み合せでＬＩＦを含む。
【００２２】本発明は、また組成物が一種またはそれ以
上の他のサイトカインおよび一種またはそれ以上の医薬
的に許容可能な担体および／または希釈剤と共にかまた
は共にでなく、ＬＩＦを含む、哺乳類の随伴細胞の増殖
および／または筋芽細胞への分化を促進するための医薬
組成物を指向するものである。一つの実施態様として、
本明細書で意図したＬＩＦ以外のサイトカインは、ＩＬ
−６および／またはＴＧＦαおよび／またはＦＧＦを包
含する。医薬組成物の製造方法は、オソルらにより編集
され、ここに引用することにより組み込まれたレミング
トン'ズ・ファルマシューティカル・サイエンス第１６
版、１９８０年、マック・パブリシング・カンパニーに
記載されたように当業界では既知である。投与の経路お
よび活性な成分の有効量は状況により決定され得るが好
ましいのは筋肉内注射であり、他の経路も用い得る。本
発明の実施態様の説明の目的の場合、用いられるＬＩＦ
の有効量は約０.１−約１０００単位／ml、好ましくは
約１−約１００単位／ml、最も好ましくは約１−約５０
単位／mlである。ＬＩＦの単位はＰＣＴ／ＡＵ８８／０
００９３に定義される。一般に、他のサイトカインは約
１−１００ng／mlで用いられ得る。さらに詳しくは、Ｉ
Ｌ−６は好ましくは約６０−約１００ng／ml、ＴＧＦα
は好ましくは約１−約２０ng／ml、およびＦＧＦは好ま
しくは約２０−約５０ng／mlの濃度で用いられ得る。こ
れらの濃度は状況により変化し得、これらの有効量に本
発明を必ずしも制限することは意図しないものである。
【００２３】本発明はさらに次の図面および実施例によ
って記載されるが、これらは発明を限定するものではな
い。
【００２４】
【実施例】実施例１ 材料および方法 マウス筋細胞:用いた筋はマウスＣＤ７／ＢＬ／１０系
のあと足からのものであった。同じ系からの突然変異体
もまた用いた。これは筋蛋白質ジストロフィンが欠けて
いるmdx突然変異体である。これは同じ遺伝子がヒトの
状態に影響を与えるから、筋ジストロフィで研究するた
めに秀れたモデルである。これらの細胞の一次培養を５
−１０容量％ＦＣＳを用いたことを除いて、グラシング
ハら、マスクル・アンド・ナーブ、第１１巻、１２３１
−１２３９頁、１９８８年に記載されたように増殖させ
た。集密状態の約８０％のとき、細胞を簡単にリン酸緩
衝食塩水で洗浄し、解離緩衝液中で０.０２５重量／容
量％トリプシンで処理して、それらを解離した。ウシ胎
児血清(ＦＣＳ)を５容量％濃度に添加して、トリプシン
を抑制し、細胞を１０分間１０００rpmで遠心分離し、
リン酸緩衝食塩水で二度洗浄した。それらを次に集密状
態の１０％でＨamＦ１２、２０容量％ＦＣＳに入れて、
継代細胞とした。
【００２５】ヒト筋細胞:これらの条件下で、多くの細
胞は生存し、分化するが、２０容量％ＦＣＳを用いる最
適条件の場合よりも低い速度である。通常、３−４日の
誘導期があり、その間に細胞数が減少に向かい、続いて
５−７日で筋芽細胞の出現がある。細胞を最終的に３−
５０００細胞／ウェルの濃度で９６ウェルクラスタープ
レートに入れる。増殖因子を培養の開始後３日に添加
し、効果を期間を通して随伴細胞または筋芽細胞のよう
な細胞を数えてはかった。ヒト骨格筋の試料(０.５−
１.５g)を外科手術を通して同意している患者から協力
している外科医により取出した。ヒト倫理委員会会認可
をモナシ大学、モナシ医学センター、クレイトンおよび
ローヤル チルドレン病院、パークビレーから保有す
る。それらの試料を研究所に逆送し、培養を基本的にマ
ウス細胞について記載したように開始した。
【００２６】イン ビボ筋芽細胞移入:継代マウスまた
はヒト筋芽細胞を３０単位／mlＬＩＦの不存在下または
存在下で集密状態の８０−９０％に増殖させ、上記の通
り採取した。それらを３×１０ 8細胞／mlでリン酸緩衝
食塩水に懸濁した。生後２５−３２日の突然変異株mdx
マウスをピプノルム(０.３ml／kg)およびジアザパン(５
mg／kg)の混合物の腹腔内注入により麻酔をかけた。一
つの伸筋ジギトルム・ロンガスを露出させ、筋芽細胞を
注入した。それらの細胞を２７ゲージに先端を電解研摩
した針と合ったＳＧＥ皮下注射器から１μlロットで導
出した。皮下注射器をミクロマニピュレーターに装填し
て、注入の位置および深さを制御した。４または５回の
注入を１.５−２mmの間隔で各マウスにした。対照の注
入をリン酸緩衝食塩水のみを用いて実施した。損傷を縫
い合せ、マウスが回復するのを可能にした。４−６週
後、動物を首を切ることにより殺し、ＥＤＬを再露出
し、氷冷リン酸緩衝食塩水で冷却し、摘出して組織−Ｔ
ek ＯＣＴに埋め込み、液体Ｎ2の温度でイソペンタン
により急冷した。塊を−２５℃でトリミングし、横方向
切片を３−４μmに−２０℃で低温恒温装置中で切っ
た。通風乾燥した後、切片をリン酸緩衝食塩水で１／２
００に希釈した６０kdまたは３０kdの抗ジストロフィン
抗体(ホフマンら、セル、第５１巻、９１９−９２８
頁、１９８７年)により処理した。前免疫血清を同様に
希釈した。１００％湿度で３０分間、室温でのイキュベ
ーション後、切片を３回洗浄し、次に１／４希釈でフル
オレスセインイソチオシアネート・ロバー抗ヒツジ抗体
法(サイレニアス・メルボルン)に付した。それを再び洗
浄し、カバーグラスに載せた。
【００２７】実施例２ マウス筋芽細胞 マウス筋芽細胞の一次培養を継代し、いろいろな濃度で
ＬＩＦを含んでいる培地に増殖させた。この方法を５、
７.５および１０容量％ＦＣＳを含んでいる培地で３回
実施した。こうして、継代細胞が一次培養と同じ方法で
ＬＩＦに反応するかどうか試験することおよびまたいろ
いろな増殖条件下でのＬＩＦへの反応を調べることが可
能であった。図１は継代マウス細胞がＦＣＳのいくつか
細胞濃度でＬＩＦに反応することを示す。ＬＩＦの最適
濃度は、一次培養に対するのと同様に３０単位／ml(１
４pg／ml)である。低い濃度でよりも１０容量％ＦＣＳ
濃度でのＬＩＦが大きな効果があり、これは対照よりも
１３倍の増大である。
【００２８】ヒト筋芽細胞:これらの細胞を供与体ヒト
筋から増殖させ、継代細胞を最初のマウス細胞培養に実
施したように７.５容量％ＦＣＳを含んでいるＨamＦ１
２培地に９６ウェル集積プレートでウェル当り２−３０
００細胞で接種した。培地はいろいろな濃度のＬＩＦを
含有した。細胞数を１２日まで時間で数え、結果を図２
に示す。マウス細胞によるのと同様に、ＬＩＦによる筋
芽細胞の増殖の著しい促進があった。また、ＬＩＦに見
い出された最適濃度は３０単位／mlであった。これはヒ
ト筋芽細胞がマウス筋芽細胞と同じ方法でＬＩＦと反応
することを示す。以前に、ＴＧＦαがマウス筋芽細胞を
も促進することを見い出している。ヒト細胞を１０ng／
mlまでの範囲の濃度でこのサイトカインの存在で増殖さ
せた。図３はマウス細胞で見い出したのと同様に、１ng
／mlの最適濃度でのＴＧＦαへの早い反応があったこと
を示す。ＬＩＦの場合と同様に、高濃度は最適でよりも
少い効果しかなかった。マウス細胞と異なって、反応は
早く起った。これは種の相違または細胞の継代またいく
つかの他の未知の因子に依り得る。
【００２９】ＬＩＦ活性化のＦＣＳ濃度の効果:継代ヒ
ト筋芽細胞を０−２０容量％ＦＣＳの範囲の濃度のＦＣ
Ｓを含有しているＨamＦ１２培地に増殖させた。ＦＣＳ
濃度のそれぞれで、ＬＩＦを０.３０または１００単位
／mlで添加した。図４は０および１容量％ＦＣＳでＬＩ
Ｆの不存在下または存在下で細胞の増殖はないことを示
す。ＦＣＳ濃度が２容量％である場合、ここでもＬＩＦ
の不存在下で増殖はないが、いくらかの増殖はＬＩＦの
存在で起る。ＦＣＳの濃度を増すことで、ＬＩＦは増大
した増殖をもたらし、先に示したように、３０単位／ml
のＬＩＦは全ＦＣＳ濃度で１００単位／mlよりもさらに
効果的である。ＬＩＦによる増殖の最適の促進が１５容
量％ＦＣＳで起ることを見い出した。
【００３０】イン ビボ筋芽細胞移入:マウスにＥＤＬ
筋当り１−１.５×１０6細胞の割合で、実施例１に記載
のようにＬＩＦの存在下でマウスかまたはヒト筋芽細胞
培養を注入した。これらを殺し、筋を４〜６週後免疫細
胞化学的に調製した。第５Ａ図はＣ５７−ＢＬ−１０ジ
ストロフィン陽性対照マウス株のＥＤＬ筋にジストロフ
ィンの存在を示す。他の研究者が記載したように(パー
トリッジら．ネーチャー、第３３７巻、１７６−１７９
頁、１９８９年)ジストロフィンは筋線維鞘膜の表面の
下にある。mdxジストロフィン陰性筋を第５Ｂ図に示
す。免疫反応は明らかでない。第５Ｃ図はヒト筋芽細胞
を６週早く注入したmdxマウスからのＥＤＬ筋切片を示
す。融合が起っていることは線維の筋鞘にあったジスト
ロフィン陽性パッチから見ることができる。陽性融合を
マウス筋芽細胞をＥＤＬ筋に注入した場合に見い出し
た。
【００３１】筋芽細胞に対するＬＩＦレセプター:マウ
ス筋芽細胞をカバーグラス上に増殖させ、フィブロネク
チンで調製して、確実に充分な付着をさせた。培養の８
日後、それらに非標識のＬＩＦの不存在下および１００
０培過剰の存在下で125Ｉ−標識したＬＩＦを作用させ
た。第６Ａ図はＬＩＦレセプターが筋芽細胞に対して存
在することを示すが、第６Ｂ図は低い非特異性結合を示
す。
【００３２】当業者は、本明細書に記載した本発明が、
特に記載したもの以外にも、変形および修正が可能なこ
とを理解できる筈である。本発明が全ての上記の変形や
修正を包含することは当然理解されるべきである。本発
明はまた個々にまたは全体に本明細書に言及し、または
示した全ての段階、特性、組成物および化合物および上
記の段階または特性の任意の２つまたはそれ以上のおよ
び全ての組み合せを包含する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１はＦＣＳのいくつかの濃度でＬＩＦに対
する継代細胞の反応を示しているグラフである。継代マ
ウス筋芽細胞(Ｐ２)を５、７.５または１０容量％ＦＣ
Ｓを含んでいるＨamＦ１２培地中、ウェル当り２５００
細胞で９６ウェル プレートに入れた。ＬＩＦを表示し
た濃度で添加し培地の交換なしに細胞を増殖させた。細
胞数を表示した時間で計算し、ウェル表面mm2当りの細
胞数として示す。
【図２】 図２はヒト筋芽細胞に及ぼすＬＩＦの効果を
示しているグラフである。ヒト筋芽細胞をヒト骨格筋の
試料から誘導継代し全面の約８０％に増殖した。これら
の継代細胞を図１に記載したようにＬＩＦの存在下で増
殖させた。
【図３】 図３は表示した濃度でのＴＧＦα置換ＬＩＦ
の効果を示しているグラフである。
【図４】 図４はＬＩＦ活性に対するＦＣＳ濃度の効果
を示しているグラフである。ＬＩＦおよびＦＣＳ筋芽細
胞を図２に記載したように増殖させた。０−２０容量％
の範囲にあるＦＣＳをＬＩＦの添加の前にＨamＦ１２倍
地に添加した。(ａ)０容量％−５容量％ＦＣＳ、(ｂ)
７.５容量％−２０容量％ＦＣＳ。
【図５】 図５は培養でＬＩＦ支持筋芽細胞の融合を示
している写真である。ヒト筋芽細胞をＬＩＦの不存在ま
たは３０単位／mlの存在下で増殖させた。これらを採集
し、リン酸緩衝食塩水に懸濁し、mdxマウスの一つの伸
筋 ジギトラム・ロンガスに注入した。５週後にマウス
を殺し、筋を低温切開により封埋した。切片を抗ジスト
ロフィン抗体で処理し、ジストロフィンの存在をフルオ
レスセインを標識した抗ヒツジ抗体を用いて見えるよう
にした。(Ａ)Ｃ５７−ＢＬ−１０正常、ジストロフィン
陽性マウスの筋。(Ｂ)注入されない、ジストロフィン陰
性mdxマウスの筋。(Ｃ)ＬＩＦの存在下で増殖した筋芽
細胞を注入したmdxマウスの筋。筋鞘の下にジストロフ
ィン陽性部の斑点があることに注意。
【図６】 図６は筋芽細胞上のＬＩＦレセプターを示し
ている写真である。 125Ｉ−ＬＩＦに付したマウス筋芽
細胞のオートラジオグラフィー。(a)125Ｉ−ＬＩＦ単
独。(b)１０００倍過剰の非標識のＬＩＦの存在下での
125Ｉ−ＬＩＦ。

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 随伴細胞にとって増殖し、および／また
    は筋芽細胞に分化するのに充分な時間および条件下で増
    殖および／または分化に有効な量のＬＩＦと哺乳類の随
    伴細胞とを接触させることによって得られる筋芽細胞を
    含む、筋芽細胞導入治療薬剤。
  2. 【請求項２】さらにＬＩＦとの同時または逐次投与のた
    めの一種またはそれ以上の他のサイトカインの添加を含
    んでいる、請求項１記載の薬剤。
  3. 【請求項３】 ＬＩＦ、サイトカインおよび／または随
    伴細胞が同じ哺乳類からのものである、請求項１または
    ２記載の薬剤。
  4. 【請求項４】 ＬＩＦ、サイトカインおよび／または随
    伴細胞が同一種の哺乳類からのものである、請求項３記
    載の薬剤。
  5. 【請求項５】 ＬＩＦ、サイトカインおよび／または随
    伴細胞が異なる哺乳類からのものである、請求項１また
    は２記載の薬剤。
  6. 【請求項６】 哺乳類がヒト、マウスまたは家畜動物で
    ある、請求項１−５の何れか１項記載の薬剤。
  7. 【請求項７】 ＬＩＦおよび／またはサイトカインが組
    み換えまたは化学合成で製造されたものである、請求項
    １または２記載の薬剤。
  8. 【請求項８】 サイトカインがＩＬ−６、ＴＧＦαおよ
    び／またはＦＧＦの一種またはそれ以上である、請求項
    １−７の何れか１項記載の薬剤。
  9. 【請求項９】 ＬＩＦが約０.１−１０００単位／mlの
    濃度で供給され、サイトカインが約１−１００ng／mlの
    濃度で供給される、請求項１−８の何れか１項記載の薬
    剤。
  10. 【請求項１０】 ＬＩＦが約１−１００単位／mlの濃度
    で供給される、請求項９記載の薬剤。
  11. 【請求項１１】 ＬＩＦが約１０−５０単位／mlの濃度
    で供給される請求項１０記載の薬剤。
  12. 【請求項１２】 得られる筋芽細胞が筋内注入により投
    与される、請求項１−９の何れか１項記載の薬剤。
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