JP2000189169A - Ｌ―グルタミン酸生産菌及びｌ―グルタミン酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 高いＬ−グルタミン酸生産能を有する新規な
Ｌ−グルタミン酸生産菌を取得し、安価かつ効率的なＬ
−グルタミン酸の製造法の開発につなげる。 【解決手段】 エンテロバクター属あるいはセラチア属
に属し、Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素
の活性が高められた株、あるいはＬ−グルタミン酸の生
合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を
生成する反応を触媒する酵素の活性が低下欠損した株で
あって、Ｌ−グルタミン酸生産能を有する微生物を、培
地中で培養し、生成したＬ−グルタミン酸を培養液から
採取することにより、Ｌ−グルタミン酸を製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なＬ−グルタ
ミン酸生産菌及びそれを用いた発酵法によるＬ−グルタ
ミン酸の製造法に関する。Ｌ−グルタミン酸は、食品、
医薬品等として重要なアミノ酸である。

【０００２】

【従来の技術】従来、Ｌ−グルタミン酸は、主としてブ
レビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバ
クテリウム属に属するいわゆるコリネ型Ｌ−グルタミン
酸生産菌またはそれらの変異株を用いた発酵法により製
造されている（アミノ酸発酵、学会出版センター、１９
５〜２１５頁、１９８６年）。その他の菌株を用いた発
酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法としては、バチル
ス属、ストレプトミセス属、ペニシリウム属等の微生物
を用いる方法（米国特許第３，２２０，９２９号）、シ
ュードモナス属、アースロバクター属、セラチア属、キ
ャンディダ属等の微生物を用いる方法（米国特許第３，
５６３，８５７号）、バチルス属、シュードモナス属、
セラチア属、アエロバクター・アエロゲネス（現エンテ
ロバクター・アエロゲネス）等の微生物を用いる方法
（特公昭３２−９３９３号）、エシェリヒア・コリの変
異株を用いる方法（特開平５−２４４９７０号）等が知
られている。

【０００３】上記のような微生物の育種や製造法の改良
により、Ｌ−グルタミン酸の生産性はかなり高まっては
いるが、今後の需要の一層の増大に応えるためには、さ
らに安価かつ効率的なＬ−グルタミン酸の製造法の開発
が求められている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、高い
Ｌ−グルタミン酸生産能を有する新規なＬ−グルタミン
酸生産菌を見出し、安価かつ効率的なＬ−グルタミン酸
の製造法の開発につなげることにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を解決するために、従来の微生物とは異なった微生物で
あって、かつＬ−グルタミン酸生産能を有する微生物を
広く検索、研究した結果、エンテロバクター属あるいは
セラチア属に属する微生物由来の誘導株が高いＬ−グル
タミン酸生産能を有することを見いだし、本発明を完成
するに至った。

【０００６】すなわち、本発明は以下の通りである。

【０００７】（１）エンテロバクター属あるいはセラチ
ア属に属し、下記の性質の少なくとも一方を有し、かつ
Ｌ−グルタミン酸生産能を有する微生物： （ａ）Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素の
活性が高められている、 （ｂ）Ｌ−グルタミン酸の生
合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を
生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損し
ている。

【０００８】（２）Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触
媒する酵素が、クエン酸シンターゼ（以下「ＣＳ」と略
す）、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ
（以下「ＰＥＰＣ」と略す）、およびグルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼ（以下「ＧＤＨ」と略す）から選ばれる前
記（１）の微生物。

【０００９】（３）Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触
媒する酵素が、クエン酸シンターゼ、フォスフォエノー
ルピルベートカルボキシラーゼ、およびグルタミン酸デ
ヒドロゲナーゼのすべてである（２）の微生物、

【００１０】（４）Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から
分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応
を触媒する酵素がα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ
（以下「αＫＧＤＨ」と略す）である前記（１）〜
（３）のいずれかの微生物。

【００１１】（５）微生物がエンテロバクター・アグロ
メランスまたはセラチア・リクエファシエンスに属する
（１）〜（４）のいずれかの微生物。

【００１２】（６）前記（１）〜（５）のいずれかの微
生物を液体培地に培養し、培地中にＬ−グルタミン酸を
生成蓄積せしめ、これを該培地から採取することを特徴
とするＬ−グルタミン酸の製造法。

【００１３】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の微生物は、エンテロバクター属あるいはセラチ
ア属に属す微生物であって、下記の性質の少なくとも一
方を有する微生物である。 （ａ）Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素の
活性が高められている。 （ｂ）Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−
グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵
素の活性が低下または欠損している。

【００１４】このような微生物は、エンテロバクター属
あるいはセラチア属に属す微生物を親株として用い、前
記（ａ）および／または（ｂ）の性質を付与することに
より得られる。親株として使用されるエンテロバクター
属あるいはセラチア属に属す微生物には、以下のような
ものがある。

【００１５】エンテロバクター・アグロメランス（Ente
robacter agglomerans） エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerog
enes） エンテロバクター・アムニゲナス（Enterobacter amnig
enus） エンテロバクター・アスブリア（Enterobacter asburia
e） エンテロバクター・クロエッケ（Enterobacter cloaca
e） エンテロバクター・ディソルベンス（Enterobacter dis
solvens） エンテロバクター・ジェルゴビア（Enterobacter gergo
viae） エンテロバクター・ホルマエッケ（Enterobacter horma
echei） エンテロバクター・インターメディウス（Enterobacter
intermedius） エンテロバクター・ニミプレスラリス（Enterobacter n
imipressuralis） エンテロバクター・サカザキ（Enterobacter sakazaki
i） エンテロバクター・テイロレ（Enterobacter taylora
e） セラチア・リクエファシエンス（Serratia liquefacien
ce） セラチア・エントモフィラ（Serratia entomophila） セラチア・フィカリア（Serratia ficaria） セラチア・フォンティコーラ（Serratia fonticola） セラチア・グリメシ（Serratia grimesii） セラチア・プロテアマキュランス（Serratia proteamac
ulans） セラチア・オドリフェラ（Serratia odorifera） セラチア・プリムシカ（Serratia plymuthica） セラチア・ルビダエ（Serratia rubidaea ）

【００１６】さらに好ましくは、以下に示す菌株が挙げ
られる。 エンテロバクター・アグロメランス ＡＴＣＣ１２２８
７ エンテロバクター・アグロメランス ＡＪ１３３５５ セラチア・リクエファシエンス ＡＴＣＣ１４４６０

【００１７】エンテロバクター・アグロメランス ＡＪ
１３３５５は、平成１０年２月１９日に、通産省工業技
術院生命工学工業技術研究所に、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ
−１６６４４として寄託され、平成１１年１月１１日に
ブタペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１４が付与されている。また、エ
ンテロバクター・アグロメランス ＡＴＣＣ１２２８
７、セラチア・リクエファシエンス ＡＴＣＣ１４４６
０は、ＡＴＣＣより分譲を受けることができる。

【００１８】エンテロバクター・アグロメランス ＡＪ
１３３５５株は静岡県磐田市の土壌から分離された株で
ある。ＡＪ１３３５５の生理的性質を記す。

【００１９】（１）グラム染色性：陰性 （２）酸素に対する挙動：通性嫌気性 （３）カタラーゼ：ネガティブ （４）オキシダーゼ：ポジティブ （５）硝酸還元能：ネガティブ （６）フォゲス−プロスカウエル試験：ポジティブ （７）メチルレッド試験：ネガティブ （８）ウレアーゼ：ネガティブ （９）インドール生成：ポジティブ （１０）運動性：有り （１１）ＴＳＩ培地での硫化水素生成：微弱な活性あり （１２）β−ガラクトシダーゼ：ポジティブ

【００２０】（１３）糖資化性： アラビノース：ポジティブ シュークロース：ポジティブ ラクトース：ポジティブ キシロース：ポジティブ ソルビトール：ポジティブ イノシトール：ポジティブ トレハロース：ポジティブ マルトース：ポジティブ メリビオース：ポジティブ アドニトール：ネガティブ ラフィノース：ポジティブ サリシン：ネガティブ メリビオース：ポジティブ

【００２１】（１４）グリセロース資化性：ポジティブ （１５）有機酸資化性： クエン酸：ポジティブ 酒石酸：ネガティブ グルコン酸：ポジティブ 酢酸：ポジティブ マロン酸：ネガティブ （１６）アルギニンデヒドラターゼ：ネガティブ （１７）オルチンデカルボキシラーゼ：ネガティブ （１８）リジンデカルボキシラーゼ：ネガティブ （１９）フェニルアラニンデアミナーゼ：ネガティブ （２０）色素形成：黄色 （２１）ゼラチン液化能：ポジティブ （２２）生育ｐＨ ｐＨ４生育不良、ｐＨ４．５〜７生
育良好 （２３）生育温度 ２５℃生育良好、３０℃生育良好、
３７℃生育良好、４２℃生育可、４５℃生育不可

【００２２】これらの菌学的性質からＡＪ１３３５５は
エンテロバクター・アグロメランスと判定された。

【００２３】後述の実施例では、Ｌ−グルタミン酸の生
合成反応を触媒する酵素の活性が高めらた株、あるいは
Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタ
ミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活
性が低下または欠損して株を取得するための出発親株と
して、エンテロバクター・アグロメランス ＡＴＣＣ１
２２８７、エンテロバクター・アグロメランス ＡＪ１
３３５５、あるいはセラチア・リクエファシエンス Ａ
ＴＣＣ１４４６０を用いた。しかし、エンテロバクター
属あるいはセラチア属に属する細菌による糖の代謝はい
ずれもエムデン−マイヤーホフ経路を経て行われ、同経
路で生成するピルビン酸は好気的条件下ではトリカルボ
ン酸サイクルにて酸化される。Ｌ−グルタミン酸は、ト
リカルボン酸サイクルの中間体であるα−ケトグルタル
酸より、ＧＤＨあるいはグルタミンシンセターゼ／グル
タミン酸シンターゼによって生合成される。このよう
に、これらの微生物ではＬ−グルタミン酸生合成経路は
共通のものであり、本発明においては、エンテロバクタ
ー属およびセラチア属に属する微生物は単一の概念を形
成する。従って、上記した種または菌株以外のエンテロ
バクター属およびセラチア属に属する微生物も本発明に
含まれる。

【００２４】本発明の微生物は、上記のようなエンテロ
バクター属またはセラチア属に属する微生物であって、
Ｌ−グルタミン酸生産能を有する微生物である。ここで
「Ｌ−グルタミン酸生産能を有する」とは、培養したと
きに培地中にＬ−グルタミン酸を蓄積する能力を有する
ことをいう。本発明においては、Ｌ−グルタミン酸生産
能は、下記の性質の一方または両方を付与することによ
り付与される。

【００２５】（ａ）Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触
媒する酵素の活性が高められている。 （ｂ）Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−
グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵
素の活性が低下または欠損している。

【００２６】エンテロバクター属またはセラチア属微生
物のＬ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素とし
ては、ＧＤＨ、グルタミンシンセターゼ、グルタミン酸
シンターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニッ
ト酸ヒドラターゼ、ＣＳ、ＰＥＰＣ、ピルビン酸デヒド
ロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、エノラーゼ、ホスホ
グリセロムターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリ
セルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオ
ースリン酸イソメラーゼ、フルクトースビスリン酸アル
ドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコースリン酸
イソメラーゼ等が挙げられる。これらの酵素の中では、
ＣＳ、ＰＥＰＣおよびＧＤＨのいずれか１種または２種
もしくは３種が好ましい。さらに、本発明の微生物にお
いては、ＣＳ、ＰＥＰＣおよびＧＤＨの３種の酵素の活
性がともに高められていることが好ましい。細胞中の目
的酵素の活性が増加していること、および活性の増加の
程度は、微生物の菌体抽出液または精製画分の酵素活性
を測定し、野生株または親株と比較することによって確
認できる。

【００２７】本発明で使用されるエンテロバクター属あ
るいはセラチア属に属し、Ｌ−グルタミン酸の生合成反
応を触媒する酵素のいずれか１種、または２種以上の活
性が高められた微生物は、例えば、前記の微生物を出発
親株に用い、これらの酵素をコードする遺伝子に変異を
生じた変異株として、または遺伝子組換え株として取得
することができる。

【００２８】ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性を高める
には、例えば、ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨをコードす
る遺伝子を適当なプラスミド上にクローニングし、得ら
れたプラスミドを用いて宿主となる上記出発親株を形質
転換すればよい。形質転換株の細胞内のＣＳ、ＰＥＰＣ
及びＧＤＨをコードする遺伝子（以下、おのおのをこの
順に「ｇｌｔＡ遺伝子」、「ｐｐｃ遺伝子」、「ｇｄｈ
Ａ遺伝子」と略する）のコピー数が上昇し、その結果Ｃ
Ｓ、ＰＥＰＣ及びＧＤＨ活性が高められる。

【００２９】クローニングされたｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐ
ｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子は、単独または任意の
２種または３種の組合わせで、上記出発親株に導入され
る。２種または３種の遺伝子を導入する場合には、一種
類のプラスミド上に２種又は３種の遺伝子がクローン化
されて宿主に導入されるか、あるいは共存可能な２種類
または３種類のプラスミド上に別々にクローン化されて
宿主に導入される。上記プラスミドとしては、エンテロ
バクター属あるいはセラチア属に属する微生物の細胞中
で自律複製可能なプラスミドであれば特に制限されない
が、例えばpUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、
pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW21
9、pMW218等が挙げられる。他にもファージＤＮＡのベ
クターも利用できる。形質転換は、例えば、D.M.Morris
onの方法（Methods in Enzymology 68, 326(1979)）あ
るいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの
透過性を増す方法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.Bio
l.,53,159(1970)）等により行うことができる。

【００３０】ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性を高める
ことは、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子またはｇｄｈＡ
遺伝子を、宿主となる上記出発親株の染色体ＤＮＡ上に
多コピー存在させることによっても達成できる。エンテ
ロバクター属、あるいはセラチア属に属する微生物の染
色体ＤＮＡ上にｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、または
ｇｄｈＡ遺伝子を多コピーで導入するには、レペッティ
ブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーティッド
・リピート等、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列
が利用できる。あるいは、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝
子、またはｇｄｈＡ遺伝子をトランスポゾンに搭載し
て、これを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入す
ることも可能である。形質転換株の細胞内のｇｌｔＡ遺
伝子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子のコピー数
が上昇し、その結果ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性が
高められる。

【００３１】コピー数を上昇させるｇｌｔＡ遺伝子、ｐ
ｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子の供給源となる生物
としては、ＣＳ、ＰＥＰＣ及びＧＤＨ活性を有する生物
ならいかなる生物でも良い。なかでも原核生物である細
菌、たとえばエンテロバクター属、クレブシェラ属、エ
ルビニア属、パントエア属、セラチア属、エシェリヒア
属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、バ
チルス属に属する細菌が好ましい。具体的な例として
は、エシェリヒア・コリが挙げられる。ｇｌｔＡ遺伝
子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子は、上記のよ
うな微生物の染色体ＤＮＡより得ることができる。

【００３２】ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇ
ｄｈＡ遺伝子は、おのおのＣＳ、ＰＥＰＣもしくはＧＤ
Ｈ活性を欠失した変異株を用いてその栄養要求性を相補
するＤＮＡ断片を上記微生物の染色体ＤＮＡから単離す
ることによって取得できる。またエシェリヒア属のこれ
ら遺伝子、コリネバクテリウム属細菌のこれら遺伝子は
既に塩基配列が明らかにされていることから（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２２巻、５２４３〜５２４９頁、
１９８３年；Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第９５巻、９０９
〜９１６頁、１９８４年；Ｇｅｎｅ、第２７巻、１９３
〜１９９頁、１９８４年；Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、
第１４０巻、１８１７〜１８２８頁、１９９４年；Ｍｏ
ｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、第２１８巻、３３０〜３３
９頁、１９８９年；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ、第６巻、３１７〜３２６頁、１９９２
年）それぞれの塩基配列に基づいてプライマーを合成
し、染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法により取得する
ことが可能である。

【００３３】ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性を高める
には、上記の遺伝子増幅による以外にも、ｇｌｔＡ遺伝
子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子の発現が強化
されることによって達成される。例えば、ｇｌｔＡ遺伝
子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子のプロモータ
ーをそれよりも強力な他のプロモーターに置換すること
によって発現が強化される。たとえば、ｌａｃプロモー
ター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａ
ｃプロモーター、ラムダファージのＰ_Rプロモーター、
Ｐ_Lプロモーター等が強力なプロモーターとして知られ
ている。プロモーターが置換されたｇｌｔＡ遺伝子、ｐ
ｐｃ遺伝子またはｇｄｈＡ遺伝子は、プラスミド上にク
ローニングされて宿主微生物に導入されるか、またはレ
ペッティブＤＮＡ、インバーティッド・リピート、また
はトランスポゾン等を用いて宿主微生物の染色体ＤＮＡ
上に導入される。

【００３４】また、ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性を
高めるには、染色体上のｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子
またはｇｄｈＡ遺伝子のプロモーターを、それらよりも
強力なプロモーターで置換する（ＷＯ８７／０３００６
号、特開昭６１−２６８１８３号参照）か、またはそれ
ぞれの遺伝子のコード配列の上流に、強力なプロモータ
ーを挿入すること（Gene, 29, (1984) 231-241参照）に
よっても達成することができる。具体的には、強力なプ
ロモーターに置換されたｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子
もしくはｇｄｈＡ遺伝子またはそれらの一部を含むＤＮ
Ａと、染色体上の対応する遺伝子との間で相同組換えを
起こさせればよい。

【００３５】ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性が高めら
れたエンテロバクター属またはセラチア属に属する微生
物として具体的には、エンテロバクター・アグロメラン
スＡＴＣＣ１２２８７／ＲＳＦＣＰＧ、エンテロバクタ
ー・アグロメランス ＡＪ１３３５５／ＲＳＦＣＰＧ、
およびセラチア・リクエファシエンス ＡＴＣＣ１４４
６０／ＲＳＦＣＰＧが挙げられる。

【００３６】Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐し
てＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒
する酵素としては、αＫＧＤＨ、イソクエン酸リアー
ゼ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、酢酸キナー
ゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンタ
ーゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロ
ゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピロ
リンデヒドロゲナーゼ等がある。これらの酵素の中で
は、αＫＧＤＨが好ましい。

【００３７】エンテロバクター属またはセラチア属に属
する微生物において、上記のような酵素の活性を低下ま
たは欠損させるには、通常の変異処理法によって、ある
いは遺伝子工学的手法によって、上記酵素の遺伝子に、
細胞中の当該酵素の活性が低下または欠損するような変
異を導入すればよい。

【００３８】変異処理法としては、たとえばＸ線や紫外
線を照射する方法、またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−
Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤で処理する方法等が
ある。遺伝子に変異が導入される部位は、酵素タンパク
質をコードするコード領域であってもよく、プロモータ
ー等の発現制御領域であってもよい。

【００３９】また、遺伝子工学的手法には、例えば遺伝
子組換え法、形質導入法、細胞融合法等を用いる方法が
ある。例えば、クローン化された目的遺伝子の内部に薬
剤耐性遺伝子を挿入し、機能を失った遺伝子（欠陥遺伝
子）を作製する。次いで、この欠陥遺伝子をエンテロバ
クター属またはセラチア属に属する微生物の細胞に導入
し、相同組み換えを利用して染色体上の目的遺伝子を前
記欠陥遺伝子に置換する（遺伝子破壊）。

【００４０】細胞中の目的酵素の活性が低下または欠損
していること、および活性の低下の程度は、候補株の菌
体抽出液または精製画分の酵素活性を測定し、野生株ま
たは親株と比較することによって確認することができ
る。例えば、αＫＧＤＨ活性は、Reedらの方法（L.J.Re
ed and B.B.Mukherjee, Methods in Enzymology 1969,1
3, p.55-61）に従って酵素活性を測定することができ
る。

【００４１】また、目的とする酵素によっては、変異株
の表現型によって目的変異株を選択することができる。
例えば、αＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下した変異株
は、好気的培養条件ではグルコースを含む最少培地、あ
るいは、酢酸やＬ−グルタミン酸を唯一の炭素源として
含む最少培地で生育できないか、または生育速度が著し
く低下する。ところが、同一条件でもグルコースを含む
最少培地にコハク酸またはリジン、メチオニン、及びジ
アミノピメリン酸を添加することによって通常の生育が
可能となる。これらの現象を指標としてαＫＧＤＨ活性
が欠損もしくは低下した変異株の選抜が可能である。

【００４２】相同組換えを利用したブレビバクテリウム
・ラクトファーメンタムのαＫＧＤＨ遺伝子欠損株の作
製法は、ＷＯ９５／３４６７２号に詳述されており、エ
ンテロバクター属およびセラチア属に属する微生物にも
同様の方法を適用することができる。その他、遺伝子の
クローニング、ＤＮＡの切断、連結、形質転換法等の技
術については、Molecular Cloning, 2nd edition, Cold
Spring Harbor press (1989)）等に詳述されている。

【００４３】以上のようにして得られるαＫＧＤＨ活性
が欠損もしくは低下した変異株の具体例としては、エン
テロバクター・アグロメランス ＡＪ１３３５６が挙げ
られる。エンテロバクター・アグロメランス ＡＪ１３
３５６は、平成１０年２月１９日に、通産省工業技術院
生命工学工業技術研究所に、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１
６６４５として寄託され、平成１１年１月１１日にブタ
ペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−６６１５が付与されている。

【００４４】エンテロバクター属またはセラチア属に属
し、前記性質（ａ）および（ｂ）の少なくとも一方を有
し、Ｌ−グルタミン酸生産能を有する微生物を液体培地
に培養することにより、培地中にＬ−グルタミン酸を生
成蓄積させることができる。

【００４５】前記培地としては、炭素源、窒素源、無機
塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機
微量栄養素を含有する通常の栄養培地を用いることがで
きる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能であ
る。培地に使用される炭素源および窒素源は、培養する
菌株の利用可能なものならばよい。

【００４６】炭素源としてはグルコース、グリセロー
ル、フラクトース、シュークロース、マルトース、マン
ノース、ガラクトース、でんぷん加水分解物、糖蜜等の
糖類が使用され、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸等
も単独あるいは他の炭素源と併用して用いられる。

【００４７】窒素源としてはアンモニア、硫酸アンモニ
ウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸ア
ンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩また
は硝酸塩等が使用される。

【００４８】有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタ
ミン、脂肪酸、核酸、さらにこれらのものを含有するペ
プトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆蛋白分解物等が
使用され、生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異
株を使用する場合には要求される栄養素を補添する事が
必要である。

【００４９】無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム
塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。
培養方法は、発酵温度２０ないし４２℃、ｐＨを４ない
し８に制御しつつ通気培養を行う。かくして１０時間な
いし４日間程度培養することにより培養液中に著量のＬ
−グルタミン酸が蓄積される。

【００５０】培養終了後、培養液中に蓄積されたＬ−グ
ルタミン酸を単離する方法としては公知の方法に従って
行えばよい。例えば、培養液から菌体を除去した後に濃
縮晶析する方法、あるいはイオン交換クロマトグラフィ
ー等によって単離することができる。

【００５１】

【実施例】次に、実施例によって本発明をさらに具体的
に説明する。

【００５２】（１）ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、お
よびｇｄｈＡ遺伝子を有するプラスミドの作製 ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子
を有するプラスミドの作成の手順を、図１〜５図に基づ
いて説明する。

【００５３】エシェリヒア・コリ由来のｇｄｈＡ遺伝子
を有するプラスミドｐＢＲＧＤＨ（特開平７−２０３９
８０号）をＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｈＩ消化し、Ｔ４ＤＮ
Ａポリメラーゼ処理で両末端を平滑末端にした後、ｇｄ
ｈＡ遺伝子を有するＤＮＡ断片を精製回収した。一方、
エシェリヒア・コリ由来のｇｌｔＡ遺伝子およびｐｐｃ
遺伝子を有するプラスミドｐＭＷＣＰ（ＷＯ９７／０８
２９４号）をＸｂａＩで消化後、Ｔ４ＤＮＡポリメラー
ゼで両末端を平滑末端にした。これに、上で精製したｇ
ｄｈＡ遺伝子を有するＤＮＡ断片を混合後、Ｔ４リガー
ゼにより連結し、ｐＭＷＣＰに更にｇｄｈＡ遺伝子を搭
載したプラスミドｐＭＷＣＰＧを得た（図１）。また、
ｐＢＲＧＤＨをＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｌＩ消化して得ら
れたｇｄｈＡ遺伝子を有するＤＮＡ断片を精製回収後、
プラスミドｐＳＴＶ２９（宝酒造（株）より購入）のＨ
ｉｎｄＩＩＩ、ＳａｌＩサイトに導入することによっ
て、プラスミドｐＳＴＶＧを得た（図２）。

【００５４】同時に、広宿主域プラスミドＲＳＦ１０１
０の複製起点を有するプラスミドｐＶＩＣ４０（特開平
８−０４７３９７号）をＮｏｔＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼ処理した後、ＰｓｔＩ消化したものと、ｐ
ＢＲ３２２をＥｃｏＴ１４１消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメ
ラーゼ処理した後、ＰｓｔＩ消化したものとを混合後、
Ｔ４リガーゼにより連結し、ＲＳＦ１０１０の複製起点
及びテトラサイクリン耐性遺伝子を有するプラスミドＲ
ＳＦ−Ｔｅｔを得た（図３）。

【００５５】次に、ｐＭＷＣＰＧをＥｃｏＲＩ、Ｐｓｔ
Ｉ消化し、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄ
ｈＡ遺伝子を有するＤＮＡ断片を精製回収し、ＲＳＦ−
Ｔｅｔを同様にＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ消化し、ＲＳＦ１
０１０の複製起点を有するＤＮＡ断片を精製回収したも
のと混合後、Ｔ４リガーゼにより連結し、ＲＳＦ−Ｔｅ
ｔ上にｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ
遺伝子を搭載したプラスミドＲＳＦＣＰＧを得た（図
４）。得られたプラスミドＲＳＦＣＰＧがｇｌｔＡ遺伝
子、ｐｐｃ遺伝子およびｇｄｈＡ遺伝子を、ｐＳＴＶＧ
がｇｄｈＡ遺伝子を発現していることは、エシェリヒア
・コリのｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、あるいはｇｄ
ｈＡ遺伝子欠損株の栄養要求性の相補と各酵素活性の測
定によって確認した。

【００５６】ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ム由来のｇｌｔＡ遺伝子を有するプラスミドは、以下の
ようにして構築した。コリネバクテリウム・グルタミカ
ムのｇｌｔＡ遺伝子の塩基配列（Microbiology, 1994,
140, 1817-1828）をもとに、配列番号６及び７に示す塩
基配列を有するプライマーＤＮＡを用い、ブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９の染
色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、約３ｋｂのｇｌ
ｔＡ遺伝子断片を得た。この断片をＳｍａＩ消化したプ
ラスミドｐＨＳＧ３９９（宝酒造（株）より購入）に挿
入し、プラスミドｐＨＳＧＣＢを得た（図５）。次に、
ｐＨＳＧＣＢをＨｉｎｄＩＩＩで切断し切り出された約
３ｋｂのｇｌｔＡ遺伝子断片をＨｉｎｄＩＩＩ消化した
プラスミドｐＭＷ２１８（ニッポンジーン（株）より購
入）に挿入し、プラスミドｐＭＷＣＢを得た（図５）。
得られたプラスミドｐＭＷＣＢがｇｌｔＡ遺伝子を発現
していることは、エンテロバクター・アグロメランスＡ
Ｊ１３３５５株中での酵素活性の測定によって確認し
た。

【００５７】（２）エンテロバクター・アグロメランス
あるいはセラチア・リクエファシエンスへのＲＳＦＣＰ
Ｇ、ｐＭＷＣＢ及びｐＳＴＶＧの導入とＬ−グルタミン
酸生産性の評価 ＲＳＦＣＰＧ、ｐＭＷＣＢ及びｐＳＴＶＧを用い、エン
テロバクター・アグロメランス ＡＴＣＣ１２２８７
株、エンテロバクター・アグロメランス ＡＪ１３３５
５株、あるいはセラチア・リクエファシエンス ＡＴＣ
Ｃ１４４６０を、エレクトロポレーション（Miller J.
H., "A Short Course in Bacterial Genetics; Handboo
k" Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 199
2）によって形質転換し、テトラサイクリン耐性を示す
形質転換株を取得した。

【００５８】得られた形質転換株あるいは各親株を、グ
ルコース４０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２０ｇ／Ｌ、硫
酸マグネシウム７水塩０．５ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリ
ウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、塩化カル
シウム７水塩０．２５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄７水塩０．０
２ｇ／Ｌ、硫酸マンガン４水塩０．０２ｇ／Ｌ、硫酸亜
鉛２水塩０．７２ｍｇ／Ｌ、硫酸銅５水塩０．６４ｍｇ
／Ｌ、塩化コバルト６水塩０．７２ｍｇ／Ｌ、ホウ酸
０．４ｍｇ／Ｌ、モリブデン酸ナトリウム２水塩１．２
ｍｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、炭酸カルシウム３０ｇ
／Ｌを含有する培地５ｍｌを注入した５０ｍｌ容大型試
験管に接種して、３７℃で培地中の糖が消費されるまで
振とう培養した。ただし、ＡＪ１３３５５／ｐＭＷＣＢ
株及びＡＪ１３３５５／ｐＳＴＶＧ株は、糖消費速度が
遅かったため、親株ＡＪ１３３５５と同様の培養時間１
５時間にて約１０ｇ／Ｌの糖を消費した時点で培養を打
ち切った。形質転換体の培養については、テトラサイク
リン２５ｍｇ／Ｌを添加した。培養終了後、培養液中に
蓄積したＬ−グルタミン酸を測定した結果を表１に示し
た。

【００５９】

【表１】 表１ Ｌ−グルタミン酸蓄積量 ──────────────────────────────── 菌株 Ｌ−グルタミン酸蓄積量 ─────────────────────────────── ＡＴＣＣ１２２８７ ０．０ｇ／Ｌ ＡＴＣＣ１２２８７／ＲＳＦＣＰＧ ６．１ ＡＪ１３３５５ ０．０ ＡＪ１３３５５／ＲＳＦＣＰＧ ３．３ ＡＪ１３３５５／ｐＭＷＣＢ ０．８ ＡＪ１３３５５／ｐＳＴＶＧ ０．８ ＡＴＣＣ１４４６０ ０．０ ＡＴＣＣ１４４６０／ＲＳＦＣＰＧ ２．８ 培地のみ ０．２ ────────────────────────────────

【００６０】エンテロバクター・アグロメランス ＡＴ
ＣＣ１２２８７株、エンテロバクター・アグロメランス
ＡＪ１３３５５株、あるいはセラチア・リクエファシ
エンス ＡＴＣＣ１４４６０株はＬ−グルタミン酸を蓄
積しなかったが、ＲＳＦＣＰＧを導入することによって
ＣＳ、ＰＥＰＣ、およびＧＤＨ活性を増幅した株では、
それぞれ６．１ｇ／Ｌ、３．３ｇ／Ｌ、２．８ｇ／Ｌの
Ｌ−グルタミン酸を蓄積した。また、ＡＪ１３３５５株
のＣＳ活性のみを増幅することによって０．８ｇ／Ｌの
Ｌ−グルタミン酸を、ＧＤＨ活性のみを増幅することに
よっても０．８ｇ／ＬのＬ−グルタミン酸を蓄積した。

【００６１】（３）エンテロバクター・アグロメランス
ＡＪ１３３５５株のαＫＧＤＨ遺伝子（以後「ｓｕｃ
ＡＢ」という）のクローニング エンテロバクター・アグロメランス ＡＪ１３３５５株
のｓｕｃＡＢ遺伝子は、エシェリヒア・コリのαＫＧＤ
Ｈ−Ｅ１サブユニット遺伝子（以後「ｓｕｃＡ」とい
う）欠損株の酢酸非資化性を相補するＤＮＡ断片を、エ
ンテロバクター・アグロメランス ＡＪ１３３５５株染
色体ＤＮＡより選択することによって、クローニングし
た。

【００６２】エンテロバクター・アグロメランス ＡＪ
１３３５５株の染色体ＤＮＡは、エシェリヒア・コリに
おいて通常染色体ＤＮＡを抽出するのに使用されるのと
同様の方法（生物工学実験書、日本生物工学会偏、９７
−９８頁、培風館、１９９２年）で単離した。ベクター
として使用したｐＴＷＶ２２８（アンピシリン耐性）は
宝酒造社製の市販品を用いた。

【００６３】ＡＪ１３３５５株の染色体ＤＮＡをＥｃｏ
Ｔ２２１で消化したもの、およびｐＴＷＶ２２８をＰｓ
ｔＩで消化したものをＴ４リガーゼにより連結し、ｓｕ
ｃＡ欠損のエシェリヒア・コリ ＪＲＧ４６５株（Ｈｅ
ｒｂｅｒｔ Ｊ．ら Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ １９６９，１０５巻、１８２頁）を形質転換した。
こうして得た形質転換株より、酢酸最少培地にて生育す
る株を選択し、これよりプラスミドを抽出してｐＴＷＶ
ＥＫ１０１と命名した。ｐＴＷＶＥＫ１０１を持つエシ
ェリヒア・コリ ＪＲＧ４６５株は酢酸非資化性という
形質の他にコハク酸もしくはＬ−リジンおよびＬ−メチ
オニンの要求性も回復していた。このことよりｐＴＷＶ
ＥＫ１０１にはエンテロバクター・アグロメランスのｓ
ｕｃＡ遺伝子が含まれていると考えられる。

【００６４】ｐＴＷＶＥＫ１０１のエンテロバクター・
アグロメランス由来ＤＮＡ断片の制限酵素地図を図６に
示した。図６の斜線にて示した部分の塩基配列を決定し
た結果を配列番号１に示した。この配列の中には、２つ
の完全長のＯＲＦと、２つのＯＲＦの部分配列と思われ
る塩基配列が見いだされた。これらのＯＲＦまたはその
部分配列がコードし得るアミノ酸配列を、５’側から順
に配列番号２〜５に示す。これらのホモロジー検索をし
た結果、塩基配列を決定した部分は、サクシネートデヒ
ドロゲナーゼアイロン−スルファープロテイン遺伝子
（ｓｄｈＢ）の３’末端側の部分配列、完全長のｓｕｃ
ＡとαＫＧＤＨ−Ｅ２サブユニット遺伝子（ｓｕｃＢ遺
伝子）、サクシニルＣｏＡシンセターゼβサブユニット
遺伝子（ｓｕｃＣ遺伝子）の５’末端側の部分配列を含
んでいることが明らかとなった。これらの塩基配列から
推定されるアミノ酸配列をそれぞれエシェリヒア・コリ
のもの（Eur.J. Biochem., 141, 351-359 (1984)、Eur.
J. Biochem., 141, 361-374(1984)、Biochemistry, 24,
6245-6252 (1985)）と比較した結果を図７〜９に示
す。このように各アミノ酸配列は非常に高い相同性を示
した。また、エンテロバクター・アグロメランス染色体
上でもエシェリヒア・コリと同様に（Eur.J. Biochem.,
141, 351-359 (1984)、Eur.J. Biochem., 141, 361-37
4 (1984)、Biochemistry, 24, 6245-6252 (1985)）、ｓ
ｄｈＢ−ｓｕｃＡ−ｓｕｃＢ−ｓｕｃＣとクラスターを
構成していることが判明した。

【００６５】（４）エンテロバクター・アグロメランス
ＡＪ１３３５５株由来のαＫＧＤＨ欠損株の取得 上記のようにして取得されたエンテロバクター・アグロ
メランスのｓｕｃＡＢ遺伝子を用い、相同組換えにより
エンテロバクター・アグロメランスのαＫＧＤＨ欠損株
の取得を行った。

【００６６】まず、ｐＴＷＶＥＫ１０１をＢｇｌＩＩに
て切断し、ｓｕｃＡ遺伝子のおよそ半分に当たるＣ末端
側領域とｓｕｃＢ遺伝子の全長を取り除いた。続いてそ
こにｐＨＳＧ３９９（宝酒造社製）よりＡｃｃＩによっ
て切り出したクロラムフェニコール耐性遺伝子断片を挿
入した。こうしてできたｓｄｈＢ−ΔｓｕｃＡＢ：：Ｃ
ｍ^r−ｓｕｃＣの領域をＡｆｌＩＩ、ＳａｃＩにて切り
出した。得られたＤＮＡ断片を用いて、エンテロバクタ
ー・アグロメランス ＡＪ１３３５５株を、エレクトロ
ポレーションによって形質転換し、クロラムフェニコー
ル耐性である株を取得して、染色体上のｓｕｃＡＢ遺伝
子がｓｕｃＡＢ：：Ｃｍ^rに置換されたと考えられるｓ
ｕｃＡＢ欠損株エンテロバクター・アグロメランス Ａ
Ｊ１３３５６株を取得した。

【００６７】以上のようにして得られたＡＪ１３３５６
株がαＫＧＤＨ活性を欠損していることを確認するため
に、Reedらの方法（L.J.Reed and B.B.Mukherjee, Meth
odsin Enzymology 1969, 13, p.55-61）に従って酵素活
性を測定した。その結果、表２に示すようにＡＪ１３３
５６株ではαＫＧＤＨ活性を検出できず、目的通りｓｕ
ｃＡＢが欠損していることが確かめられた。

【００６８】

【表２】 表２ αＫＧＤＨ活性 ─────────────────────────── 菌株 αＫＧＤＨ活性 （ΔＡＢＳ／min／ｍｇ タンパク） ─────────────────────────── ＡＪ１３３５５ ０．４８１ ＡＪ１３３５６ ＜０．０００１ ───────────────────────────

【００６９】（５）エンテロバクター・アグロメランス
αＫＧＤＨ欠損株のＬ−グルタミン酸生産性の評価 ＡＪ１３３５５、ＡＪ１３３５６両株を、グルコース４
０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシ
ウム７水塩０．５ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム２ｇ／
Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、塩化カルシウム７水
塩０．２５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄７水塩０．０２ｇ／Ｌ、
硫酸マンガン４水塩０．０２ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛２水塩
０．７２ｍｇ／Ｌ、硫酸銅５水塩０．６４ｍｇ／Ｌ、塩
化コバルト６水塩０．７２ｍｇ／Ｌ、ホウ酸０．４ｍｇ
／Ｌ、モリブデン酸ナトリウム２水塩１．２ｍｇ／Ｌ、
酵母エキス２ｇ／Ｌ、炭酸カルシウム３０ｇ／Ｌ、Ｌ−
リジン一塩酸塩２００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン２００
ｍｇ／Ｌ、ＤＬ−α，ε−ジアミノピメリン酸（ＤＡ
Ｐ）２００ｍｇ／Ｌを含有する培地２０ｍｌを注入した
５００ｍｌ容フラスコに接種して、３７℃で培地中の糖
が消費されるまで振とう培養した。培養終了後、培養液
中に蓄積したＬ−グルタミン酸及びα−ケトグルタール
酸（以後「αＫＧ」と略す）を測定した結果を表３に示
した。

【００７０】

【表３】 表３ Ｌ−グルタミン酸およびαＫＧ蓄積量 ────────────────────────────── 菌株 Ｌ−グルタミン酸蓄積量 αＫＧ蓄積量 ────────────────────────────── ＡＪ１３３５５ ０．０ｇ／Ｌ ０．０ｇ／Ｌ ＡＪ１３３５６ １．５ ３．２ ──────────────────────────────

【００７１】αＫＧＤＨ活性が欠損したＡＪ１３３５６
株は、Ｌ−グルタミン酸を１．５ｇ／Ｌ蓄積した。また
同時に３．２ｇ／ＬのαＫＧを蓄積した。

【００７２】（６）エンテロバクター・アグロメランス
αＫＧＤＨ欠損株へのＲＳＦＣＰの導入とＬ−グルタ
ミン酸生産性の評価 ＡＪ１３３５６株をＲＳＦＣＰＧを用いて形質転換を行
い、得られたＲＳＦＣＰＧ導入株ＡＪ１３３５６／ＲＳ
ＦＣＰＧを、グルコース４０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム
２０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水塩０．５ｇ／Ｌ、リ
ン酸２水素カリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ
／Ｌ、塩化カルシウム７水塩０．２５ｇ／Ｌ、硫酸第一
鉄７水塩０．０２ｇ／Ｌ、硫酸マンガン４水塩０．０２
ｇ／Ｌ、硫酸亜鉛２水塩０．７２ｍｇ／Ｌ、硫酸銅５水
塩０．６４ｍｇ／Ｌ、塩化コバルト６水塩０．７２ｍｇ
／Ｌ、ホウ酸０．４ｍｇ／Ｌ、モリブデン酸ナトリウム
２水塩１．２ｍｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、テトラサ
イクリン２５ｍｇ／Ｌ、炭酸カルシウム３０ｇ／Ｌ、Ｌ
−リジン一塩酸塩２００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン２０
０ｍｇ／Ｌ、ＤＬ−α，ε−ＤＡＰ２００ｍｇ／Ｌを含
有する培地２０ｍｌを注入した５００ｍｌ容フラスコに
接種して、３７℃で培地中の糖が消費されるまで振とう
培養した。培養終了後、培養液中に蓄積したＬ−グルタ
ミン酸及びαＫＧを測定した結果を表４に示した。

【００７３】

【表４】 表４ Ｌ−グルタミン酸およびαＫＧ蓄積量 ──────────────────────────────────── 菌株 Ｌ−グルタミン酸蓄積量 αＫＧ蓄積量 ──────────────────────────────────── ＡＪ１３３５６ １．４ｇ／Ｌ ２．９ｇ／Ｌ ＡＪ１３３５６／ＲＳＦＣＰＧ ５．１ ０．０ ────────────────────────────────────

【００７４】ＲＳＦＣＰＧを導入してＣＳ、ＰＥＰＣ、
およびＧＤＨ活性を増幅した株では、αＫＧ蓄積量が減
少し、Ｌ−グルタミン酸蓄積が更に向上した。

【００７５】

【発明の効果】本発明の微生物は、高いＬ−グルタミン
酸生産能を有することから、コリネ型Ｌ−グルタミン酸
生産菌で従来知られている育種手法等を用いてさらに高
い生産能を付与できると考えられ、また培養条件等の検
討により、安価で、効率の良いＬ−グルタミン酸製造法
の開発につながるものと期待される。

【００７６】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 味の素株式会社（Ajinomoto Co., Inc.) <120> Ｌ−グルタミン酸生産菌及びＬ−グルタミン酸の製造法 <130> P-6389 <150> JP 10-69068 <151> 1998-03-18 <150> JP 10-297129 <151> 1998-10-19 <160> 7 <170> PatentIn Ver. 2.0

【００７７】 <210> 1 <211> 4556 <212> DNA <213> Enterobacter agglomerans <220> <221> CDS <222> (2)..(121) <220> <221> CDS <222> (322)..(3129) <220> <221> CDS <222> (3145)..(4368) <220> <221> CDS <222> (4437)..(4556) <400> 1 t gca ttc agc gtt ttc cgc tgt cac agc atc atg aac tgt gta agt gtt 49 Ala Phe Ser Val Phe Arg Cys His Ser Ile Met Asn Cys Val Ser Val 1 5 10 15 tgt cct aaa ggg cta aac ccg acg cgc gct atc ggc cac att aag tcg 97 Cys Pro Lys Gly Leu Asn Pro Thr Arg Ala Ile Gly His Ile Lys Ser 20 25 30 atg ctg ctg caa cgc agc gcg tagttatacc accgggaacc tcaggttccc 148 Met Leu Leu Gln Arg Ser Ala 35 ggtattttac ggaagcctct gtaaacgcgg tcccaaccac gtttacaaag gttcccttac 208 gggccgggcg cgcgctgcgc acagtgctcg tatcgctgaa ctcactacgg caaaccgcga 268 aagcggcaac aaatgaaacc tcaaaaaagc ataacattgc ttaagggatc aca atg 324 Met 1 cag aac agc gcg atg aag ccc tgg ctg gac tcc tcc tgg ctg gcc ggc 372 Gln Asn Ser Ala Met Lys Pro Trp Leu Asp Ser Ser Trp Leu Ala Gly 5 10 15 gcg aat cag tct tac ata gag caa ctc tat gag gat ttc ctg acc gat 420 Ala Asn Gln Ser Tyr Ile Glu Gln Leu Tyr Glu Asp Phe Leu Thr Asp 20 25 30 cct gac tct gtg gat gca gtg tgg cgc tcg atg ttc caa cag tta cca 468 Pro Asp Ser Val Asp Ala Val Trp Arg Ser Met Phe Gln Gln Leu Pro 35 40 45 ggc acg gga gtg aaa cct gag cag ttc cac tcc gca act cgc gaa tat 516 Gly Thr Gly Val Lys Pro Glu Gln Phe His Ser Ala Thr Arg Glu Tyr 50 55 60 65 ttc cgt cgc ctg gcg aaa gac gca tct cgt tac acc tcc tca gtt acc 564 Phe Arg Arg Leu Ala Lys Asp Ala Ser Arg Tyr Thr Ser Ser Val Thr 70 75 80 gat ccg gca acc aac tcc aaa caa gtg aaa gtg ctg cag ctg att aac 612 Asp Pro Ala Thr Asn Ser Lys Gln Val Lys Val Leu Gln Leu Ile Asn 85 90 95 gcg ttt cgt ttc cgc gga cat cag gaa gca aat ctc gat ccg ctt ggc 660 Ala Phe Arg Phe Arg Gly His Gln Glu Ala Asn Leu Asp Pro Leu Gly 100 105 110 ctg tgg aaa cag gac cgc gtt gcc gat ctc gat cct gcc ttt cac gat 708 Leu Trp Lys Gln Asp Arg Val Ala Asp Leu Asp Pro Ala Phe His Asp 115 120 125 ctg acc gac gcc gat ttt cag gaa agc ttt aac gta ggt tct ttt gcc 756 Leu Thr Asp Ala Asp Phe Gln Glu Ser Phe Asn Val Gly Ser Phe Ala 130 135 140 145 att ggc aaa gaa acc atg aag ctg gcc gat ctg ttc gac gcg ctg aag 804 Ile Gly Lys Glu Thr Met Lys Leu Ala Asp Leu Phe Asp Ala Leu Lys 150 155 160 cag acc tac tgt ggc tcg att ggt gca gag tat atg cac atc aat aac 852 Gln Thr Tyr Cys Gly Ser Ile Gly Ala Glu Tyr Met His Ile Asn Asn 165 170 175 acc gaa gag aaa cgc tgg atc cag cag cgt atc gaa tcc ggt gcg agc 900 Thr Glu Glu Lys Arg Trp Ile Gln Gln Arg Ile Glu Ser Gly Ala Ser 180 185 190 cag acg tca ttc agt ggc gaa gag aaa aaa ggt ttc ctg aaa gag ctg 948 Gln Thr Ser Phe Ser Gly Glu Glu Lys Lys Gly Phe Leu Lys Glu Leu 195 200 205 acc gcg gca gaa ggg ctg gaa aaa tat ctg ggc gcg aaa ttc ccg ggt 996 Thr Ala Ala Glu Gly Leu Glu Lys Tyr Leu Gly Ala Lys Phe Pro Gly 210 215 220 225 gca aaa cgt ttc tcg ctg gaa ggc ggt gat gcg ctg gtg ccg atg ctg 1044 Ala Lys Arg Phe Ser Leu Glu Gly Gly Asp Ala Leu Val Pro Met Leu 230 235 240 cgc gag atg att cgt cat gcg ggc aaa agc ggc aca cgt gaa gtg gta 1092 Arg Glu Met Ile Arg His Ala Gly Lys Ser Gly Thr Arg Glu Val Val 245 250 255 ctg ggg atg gcg cac cgt ggc cgt ctt aac gta ctg att aac gta ctg 1140 Leu Gly Met Ala His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu Ile Asn Val Leu 260 265 270 ggt aaa aag cca cag gat ctg ttc gac gaa ttc tcc ggt aaa cac aaa 1188 Gly Lys Lys Pro Gln Asp Leu Phe Asp Glu Phe Ser Gly Lys His Lys 275 280 285 gag cat ctg ggc acc ggt gat gtg aag tat cac atg ggc ttc tct tcg 1236 Glu His Leu Gly Thr Gly Asp Val Lys Tyr His Met Gly Phe Ser Ser 290 295 300 305 gat att gaa acc gaa ggt ggt ctg gtg cat ctg gcg ctg gcg ttt aac 1284 Asp Ile Glu Thr Glu Gly Gly Leu Val His Leu Ala Leu Ala Phe Asn 310 315 320 ccg tct cac ctg gaa att gtc agc ccg gtg gtc atg gga tcg gta cgt 1332 Pro Ser His Leu Glu Ile Val Ser Pro Val Val Met Gly Ser Val Arg 325 330 335 gca cgt ctc gat cgt ctg gcc gaa ccg gtc agc aat aaa gtg ttg cct 1380 Ala Arg Leu Asp Arg Leu Ala Glu Pro Val Ser Asn Lys Val Leu Pro 340 345 350 atc acc att cac ggt gat gcg gcg gtg att ggt cag ggc gtg gtt cag 1428 Ile Thr Ile His Gly Asp Ala Ala Val Ile Gly Gln Gly Val Val Gln 355 360 365 gaa acc ctg aac atg tct cag gcg cgc ggc tac gaa gtg ggc ggc acg 1476 Glu Thr Leu Asn Met Ser Gln Ala Arg Gly Tyr Glu Val Gly Gly Thr 370 375 380 385 gta cgt atc gtc att aac aac cag gtt ggt ttt acc acc tcc aac ccg 1524 Val Arg Ile Val Ile Asn Asn Gln Val Gly Phe Thr Thr Ser Asn Pro 390 395 400 aaa gat gcg cgt tca acc ccg tac tgt act gac atc ggc aag atg gtg 1572 Lys Asp Ala Arg Ser Thr Pro Tyr Cys Thr Asp Ile Gly Lys Met Val 405 410 415 ctg gca ccg att ttc cac gtc aat gct gac gat ccg gaa gcg gtg gcc 1620 Leu Ala Pro Ile Phe His Val Asn Ala Asp Asp Pro Glu Ala Val Ala 420 425 430 ttt gtt acc cgc ctg gcg ctg gac tat cgc aac acc ttc aaa cgc gat 1668 Phe Val Thr Arg Leu Ala Leu Asp Tyr Arg Asn Thr Phe Lys Arg Asp 435 440 445 gtg ttt atc gat ctg gtg tgc tat cgc cgt cat ggt cac aac gag gcg 1716 Val Phe Ile Asp Leu Val Cys Tyr Arg Arg His Gly His Asn Glu Ala 450 455 460 465 gat gag cca agt gct acc cag ccg ttg atg tac cag aaa atc aaa aag 1764 Asp Glu Pro Ser Ala Thr Gln Pro Leu Met Tyr Gln Lys Ile Lys Lys 470 475 480 cat ccg acg ccg cgt aaa att tac gcc gat cgt ctg gaa ggc gaa ggt 1812 His Pro Thr Pro Arg Lys Ile Tyr Ala Asp Arg Leu Glu Gly Glu Gly 485 490 495 gtc gcg tcg cag gaa gat gcc acc gag atg gtg aac ctg tac cgc gat 1860 Val Ala Ser Gln Glu Asp Ala Thr Glu Met Val Asn Leu Tyr Arg Asp 500 505 510 gcg ctc gat gcg ggc gaa tgc gtg gtg ccg gaa tgg cgt ccg atg agc 1908 Ala Leu Asp Ala Gly Glu Cys Val Val Pro Glu Trp Arg Pro Met Ser 515 520 525 ctg cac tcc ttc acg tgg tcg cct tat ctg aac cac gaa tgg gat gag 1956 Leu His Ser Phe Thr Trp Ser Pro Tyr Leu Asn His Glu Trp Asp Glu 530 535 540 545 cct tat ccg gca cag gtt gac atg aaa cgc ctg aag gaa ctg gca ttg 2004 Pro Tyr Pro Ala Gln Val Asp Met Lys Arg Leu Lys Glu Leu Ala Leu 550 555 560 cgt atc agc cag gtc cct gag cag att gaa gtg cag tcg cgc gtg gcc 2052 Arg Ile Ser Gln Val Pro Glu Gln Ile Glu Val Gln Ser Arg Val Ala 565 570 575 aag atc tat aac gat cgc aag ctg atg gcc gaa ggc gag aaa gcg ttc 2100 Lys Ile Tyr Asn Asp Arg Lys Leu Met Ala Glu Gly Glu Lys Ala Phe 580 585 590 gac tgg ggc ggt gcc gag aat ctg gcg tac gcc acg ctg gtg gat gaa 2148 Asp Trp Gly Gly Ala Glu Asn Leu Ala Tyr Ala Thr Leu Val Asp Glu 595 600 605 ggt att ccg gtt cgc ctc tcg ggt gaa gac tcc ggt cgt gga acc ttc 2196 Gly Ile Pro Val Arg Leu Ser Gly Glu Asp Ser Gly Arg Gly Thr Phe 610 615 620 625 ttc cat cgc cac gcg gtc gtg cac aac cag gct aac ggt tca acc tat 2244 Phe His Arg His Ala Val Val His Asn Gln Ala Asn Gly Ser Thr Tyr 630 635 640 acg ccg ctg cac cat att cat aac agc cag ggc gag ttc aaa gtc tgg 2292 Thr Pro Leu His His Ile His Asn Ser Gln Gly Glu Phe Lys Val Trp 645 650 655 gat tcg gtg ctg tct gaa gaa gcg gtg ctg gcg ttt gaa tac ggt tac 2340 Asp Ser Val Leu Ser Glu Glu Ala Val Leu Ala Phe Glu Tyr Gly Tyr 660 665 670 gcc acg gct gag ccg cgc gtg ctg acc atc tgg gaa gcg cag ttt ggt 2388 Ala Thr Ala Glu Pro Arg Val Leu Thr Ile Trp Glu Ala Gln Phe Gly 675 680 685 gac ttt gcc aac ggt gct cag gtg gtg att gac cag ttc atc agc tct 2436 Asp Phe Ala Asn Gly Ala Gln Val Val Ile Asp Gln Phe Ile Ser Ser 690 695 700 705 ggc gaa cag aag tgg ggc cgt atg tgt ggc ctg gtg atg ttg ctg ccg 2484 Gly Glu Gln Lys Trp Gly Arg Met Cys Gly Leu Val Met Leu Leu Pro 710 715 720 cat ggc tac gaa ggt cag gga ccg gaa cac tcc tct gcc cgt ctg gaa 2532 His Gly Tyr Glu Gly Gln Gly Pro Glu His Ser Ser Ala Arg Leu Glu 725 730 735 cgc tat ctg caa ctt tgc gcc gag cag aac atg cag gtt tgc gtc ccg 2580 Arg Tyr Leu Gln Leu Cys Ala Glu Gln Asn Met Gln Val Cys Val Pro 740 745 750 tcg acg ccg gct cag gtg tat cac atg ctg cgc cgt cag gcg ctg cgc 2628 Ser Thr Pro Ala Gln Val Tyr His Met Leu Arg Arg Gln Ala Leu Arg 755 760 765 ggg atg cgc cgt ccg ctg gtg gtg atg tcg ccg aag tcg ctg tta cgc 2676 Gly Met Arg Arg Pro Leu Val Val Met Ser Pro Lys Ser Leu Leu Arg 770 775 780 785 cat cca ctg gcg atc tcg tcg ctg gat gaa ctg gca aac ggc agt ttc 2724 His Pro Leu Ala Ile Ser Ser Leu Asp Glu Leu Ala Asn Gly Ser Phe 790 795 800 cag ccg gcc att ggt gag atc gac gat ctg gat ccg cag ggc gtg aaa 2772 Gln Pro Ala Ile Gly Glu Ile Asp Asp Leu Asp Pro Gln Gly Val Lys 805 810 815 cgc gtc gtg ctg tgc tcc ggt aag gtt tac tac gat ctg ctg gaa cag 2820 Arg Val Val Leu Cys Ser Gly Lys Val Tyr Tyr Asp Leu Leu Glu Gln 820 825 830 cgt cgt aaa gac gag aaa acc gat gtt gcc atc gtg cgc atc gaa cag 2868 Arg Arg Lys Asp Glu Lys Thr Asp Val Ala Ile Val Arg Ile Glu Gln 835 840 845 ctt tac ccg ttc ccg cat cag gcg gta cag gaa gca ttg aaa gcc tat 2916 Leu Tyr Pro Phe Pro His Gln Ala Val Gln Glu Ala Leu Lys Ala Tyr 850 855 860 865 tct cac gta cag gac ttt gtc tgg tgc cag gaa gag cct ctg aac cag 2964 Ser His Val Gln Asp Phe Val Trp Cys Gln Glu Glu Pro Leu Asn Gln 870 875 880 ggc gcc tgg tac tgt agc cag cat cat ttc cgt gat gtc gtg ccg ttt 3012 Gly Ala Trp Tyr Cys Ser Gln His His Phe Arg Asp Val Val Pro Phe 885 890 895 ggt gcc acc ctg cgt tat gca ggt cgc ccg gca tcg gct tct ccg gcc 3060 Gly Ala Thr Leu Arg Tyr Ala Gly Arg Pro Ala Ser Ala Ser Pro Ala 900 905 910 gtg ggt tat atg tcc gta cac caa caa cag cag caa gac ctg gtt aat 3108 Val Gly Tyr Met Ser Val His Gln Gln Gln Gln Gln Asp Leu Val Asn 915 920 925 gac gca ctg aac gtc aat taattaaaag gaaagata atg agt agc gta gat 3159 Asp Ala Leu Asn Val Asn Met Ser Ser Val Asp 930 935 1 5 att ctc gtt ccc gac ctg cct gaa tcg gtt gca gat gcc aca gta gca 3207 Ile Leu Val Pro Asp Leu Pro Glu Ser Val Ala Asp Ala Thr Val Ala 10 15 20 acc tgg cac aag aaa cca ggc gat gca gtc agc cgc gat gaa gtc atc 3255 Thr Trp His Lys Lys Pro Gly Asp Ala Val Ser Arg Asp Glu Val Ile 25 30 35 gtc gaa att gaa act gac aaa gtc gtg ctg gaa gtg ccg gca tct gcc 3303 Val Glu Ile Glu Thr Asp Lys Val Val Leu Glu Val Pro Ala Ser Ala 40 45 50 gat ggc gtg ctg gaa gcc gtg ctg gaa gac gaa ggg gca acc gtt acg 3351 Asp Gly Val Leu Glu Ala Val Leu Glu Asp Glu Gly Ala Thr Val Thr 55 60 65 tcc cgc cag atc ctg ggt cgc ctg aaa gaa ggc aac agt gcg ggt aaa 3399 Ser Arg Gln Ile Leu Gly Arg Leu Lys Glu Gly Asn Ser Ala Gly Lys 70 75 80 85 gaa agc agt gcc aaa gcg gaa agc aat gac acc acg cca gcc cag cgt 3447 Glu Ser Ser Ala Lys Ala Glu Ser Asn Asp Thr Thr Pro Ala Gln Arg 90 95 100 cag aca gcg tcg ctt gaa gaa gag agc agc gat gcg ctc agc ccg gcg 3495 Gln Thr Ala Ser Leu Glu Glu Glu Ser Ser Asp Ala Leu Ser Pro Ala 105 110 115 atc cgt cgc ctg att gcg gag cat aat ctt gac gct gcg cag atc aaa 3543 Ile Arg Arg Leu Ile Ala Glu His Asn Leu Asp Ala Ala Gln Ile Lys 120 125 130 ggc acc ggc gta ggc gga cgt tta acg cgt gaa gac gtt gaa aaa cat 3591 Gly Thr Gly Val Gly Gly Arg Leu Thr Arg Glu Asp Val Glu Lys His 135 140 145 ctg gcg aac aaa ccg cag gct gag aaa gcc gcc gcg cca gcg gcg ggt 3639 Leu Ala Asn Lys Pro Gln Ala Glu Lys Ala Ala Ala Pro Ala Ala Gly 150 155 160 165 gca gca acg gct cag cag cct gtt gcc aac cgc agc gaa aaa cgt gtt 3687 Ala Ala Thr Ala Gln Gln Pro Val Ala Asn Arg Ser Glu Lys Arg Val 170 175 180 ccg atg acg cgt tta cgt aag cgc gtc gcg gag cgt ctg ctg gaa gcc 3735 Pro Met Thr Arg Leu Arg Lys Arg Val Ala Glu Arg Leu Leu Glu Ala 185 190 195 aag aac agc acc gcc atg ttg acg acc ttc aac gaa atc aac atg aag 3783 Lys Asn Ser Thr Ala Met Leu Thr Thr Phe Asn Glu Ile Asn Met Lys 200 205 210 ccg att atg gat ctg cgt aag cag tac ggc gat gcg ttc gag aag cgt 3831 Pro Ile Met Asp Leu Arg Lys Gln Tyr Gly Asp Ala Phe Glu Lys Arg 215 220 225 cac ggt gtg cgt ctg ggc ttt atg tct ttc tac atc aag gcc gtg gtc 3879 His Gly Val Arg Leu Gly Phe Met Ser Phe Tyr Ile Lys Ala Val Val 230 235 240 245 gaa gcg ctg aag cgt tat cca gaa gtc aac gcc tct atc gat ggc gaa 3927 Glu Ala Leu Lys Arg Tyr Pro Glu Val Asn Ala Ser Ile Asp Gly Glu 250 255 260 gac gtg gtg tac cac aac tat ttc gat gtg agt att gcc gtc tct acg 3975 Asp Val Val Tyr His Asn Tyr Phe Asp Val Ser Ile Ala Val Ser Thr 265 270 275 cca cgc gga ctg gtg acg cct gtc ctg cgt gac gtt gat gcg ctg agc 4023 Pro Arg Gly Leu Val Thr Pro Val Leu Arg Asp Val Asp Ala Leu Ser 280 285 290 atg gct gac atc gag aag aaa att aaa gaa ctg gca gtg aaa ggc cgt 4071 Met Ala Asp Ile Glu Lys Lys Ile Lys Glu Leu Ala Val Lys Gly Arg 295 300 305 gac ggc aag ctg acg gtt gac gat ctg acg ggc ggt aac ttt acc atc 4119 Asp Gly Lys Leu Thr Val Asp Asp Leu Thr Gly Gly Asn Phe Thr Ile 310 315 320 325 acc aac ggt ggt gtg ttc ggt tcg ctg atg tct acg cca atc atc aac 4167 Thr Asn Gly Gly Val Phe Gly Ser Leu Met Ser Thr Pro Ile Ile Asn 330 335 340 ccg cca cag agc gcg att ctg ggc atg cac gcc att aaa gat cgt cct 4215 Pro Pro Gln Ser Ala Ile Leu Gly Met His Ala Ile Lys Asp Arg Pro 345 350 355 atg gcg gtc aat ggt cag gtt gtg atc ctg cca atg atg tac ctg gct 4263 Met Ala Val Asn Gly Gln Val Val Ile Leu Pro Met Met Tyr Leu Ala 360 365 370 ctc tcc tac gat cac cgt tta atc gat ggt cgt gaa tct gtc ggc tat 4311 Leu Ser Tyr Asp His Arg Leu Ile Asp Gly Arg Glu Ser Val Gly Tyr 375 380 385 ctg gtc gcg gtg aaa gag atg ctg gaa gat ccg gcg cgt ctg ctg ctg 4359 Leu Val Ala Val Lys Glu Met Leu Glu Asp Pro Ala Arg Leu Leu Leu 390 395 400 405 gat gtc tgattcatca ctgggcacgc gttgcgtgcc caatctcaat actcttttca 4415 Asp Val gatctgaatg gatagaacat c atg aac tta cac gaa tac cag gct aaa cag 4466 Met Asn Leu His Glu Tyr Gln Ala Lys Gln 1 5 10 ctg ttt gca cgg tat ggc atg cca gca ccg acc ggc tac gcc tgt act 4514 Leu Phe Ala Arg Tyr Gly Met Pro Ala Pro Thr Gly Tyr Ala Cys Thr 15 20 25 aca cca cgt gaa gca gaa gaa gcg gca tcg aaa atc ggt gca 4556 Thr Pro Arg Glu Ala Glu Glu Ala Ala Ser Lys Ile Gly Ala 30 35 40

【００７８】 <210> 2 <211> 39 <212> PRT <213> Enterobacter agglomerans <400> 2 Ala Phe Ser Val Phe Arg Cys His Ser Ile Met Asn Cys Val Ser Val 1 5 10 15 Cys Pro Lys Gly Leu Asn Pro Thr Arg Ala Ile Gly His Ile Lys Ser 20 25 30 Met Leu Leu Gln Arg Ser Ala 35

【００７９】 <210> 3 <211> 935 <212> PRT <213> Enterobacter agglomerans <400> 3 Met Gln Asn Ser Ala Met Lys Pro Trp Leu Asp Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10 15 Gly Ala Asn Gln Ser Tyr Ile Glu Gln Leu Tyr Glu Asp Phe Leu Thr 20 25 30 Asp Pro Asp Ser Val Asp Ala Val Trp Arg Ser Met Phe Gln Gln Leu 35 40 45 Pro Gly Thr Gly Val Lys Pro Glu Gln Phe His Ser Ala Thr Arg Glu 50 55 60 Tyr Phe Arg Arg Leu Ala Lys Asp Ala Ser Arg Tyr Thr Ser Ser Val 65 70 75 80 Thr Asp Pro Ala Thr Asn Ser Lys Gln Val Lys Val Leu Gln Leu Ile 85 90 95 Asn Ala Phe Arg Phe Arg Gly His Gln Glu Ala Asn Leu Asp Pro Leu 100 105 110 Gly Leu Trp Lys Gln Asp Arg Val Ala Asp Leu Asp Pro Ala Phe His 115 120 125 Asp Leu Thr Asp Ala Asp Phe Gln Glu Ser Phe Asn Val Gly Ser Phe 130 135 140 Ala Ile Gly Lys Glu Thr Met Lys Leu Ala Asp Leu Phe Asp Ala Leu 145 150 155 160 Lys Gln Thr Tyr Cys Gly Ser Ile Gly Ala Glu Tyr Met His Ile Asn 165 170 175 Asn Thr Glu Glu Lys Arg Trp Ile Gln Gln Arg Ile Glu Ser Gly Ala 180 185 190 Ser Gln Thr Ser Phe Ser Gly Glu Glu Lys Lys Gly Phe Leu Lys Glu 195 200 205 Leu Thr Ala Ala Glu Gly Leu Glu Lys Tyr Leu Gly Ala Lys Phe Pro 210 215 220 Gly Ala Lys Arg Phe Ser Leu Glu Gly Gly Asp Ala Leu Val Pro Met 225 230 235 240 Leu Arg Glu Met Ile Arg His Ala Gly Lys Ser Gly Thr Arg Glu Val 245 250 255 Val Leu Gly Met Ala His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu Ile Asn Val 260 265 270 Leu Gly Lys Lys Pro Gln Asp Leu Phe Asp Glu Phe Ser Gly Lys His 275 280 285 Lys Glu His Leu Gly Thr Gly Asp Val Lys Tyr His Met Gly Phe Ser 290 295 300 Ser Asp Ile Glu Thr Glu Gly Gly Leu Val His Leu Ala Leu Ala Phe 305 310 315 320 Asn Pro Ser His Leu Glu Ile Val Ser Pro Val Val Met Gly Ser Val 325 330 335 Arg Ala Arg Leu Asp Arg Leu Ala Glu Pro Val Ser Asn Lys Val Leu 340 345 350 Pro Ile Thr Ile His Gly Asp Ala Ala Val Ile Gly Gln Gly Val Val 355 360 365 Gln Glu Thr Leu Asn Met Ser Gln Ala Arg Gly Tyr Glu Val Gly Gly 370 375 380 Thr Val Arg Ile Val Ile Asn Asn Gln Val Gly Phe Thr Thr Ser Asn 385 390 395 400 Pro Lys Asp Ala Arg Ser Thr Pro Tyr Cys Thr Asp Ile Gly Lys Met 405 410 415 Val Leu Ala Pro Ile Phe His Val Asn Ala Asp Asp Pro Glu Ala Val 420 425 430 Ala Phe Val Thr Arg Leu Ala Leu Asp Tyr Arg Asn Thr Phe Lys Arg 435 440 445 Asp Val Phe Ile Asp Leu Val Cys Tyr Arg Arg His Gly His Asn Glu 450 455 460 Ala Asp Glu Pro Ser Ala Thr Gln Pro Leu Met Tyr Gln Lys Ile Lys 465 470 475 480 Lys His Pro Thr Pro Arg Lys Ile Tyr Ala Asp Arg Leu Glu Gly Glu 485 490 495 Gly Val Ala Ser Gln Glu Asp Ala Thr Glu Met Val Asn Leu Tyr Arg 500 505 510 Asp Ala Leu Asp Ala Gly Glu Cys Val Val Pro Glu Trp Arg Pro Met 515 520 525 Ser Leu His Ser Phe Thr Trp Ser Pro Tyr Leu Asn His Glu Trp Asp 530 535 540 Glu Pro Tyr Pro Ala Gln Val Asp Met Lys Arg Leu Lys Glu Leu Ala 545 550 555 560 Leu Arg Ile Ser Gln Val Pro Glu Gln Ile Glu Val Gln Ser Arg Val 565 570 575 Ala Lys Ile Tyr Asn Asp Arg Lys Leu Met Ala Glu Gly Glu Lys Ala 580 585 590 Phe Asp Trp Gly Gly Ala Glu Asn Leu Ala Tyr Ala Thr Leu Val Asp 595 600 605 Glu Gly Ile Pro Val Arg Leu Ser Gly Glu Asp Ser Gly Arg Gly Thr 610 615 620 Phe Phe His Arg His Ala Val Val His Asn Gln Ala Asn Gly Ser Thr 625 630 635 640 Tyr Thr Pro Leu His His Ile His Asn Ser Gln Gly Glu Phe Lys Val 645 650 655 Trp Asp Ser Val Leu Ser Glu Glu Ala Val Leu Ala Phe Glu Tyr Gly 660 665 670 Tyr Ala Thr Ala Glu Pro Arg Val Leu Thr Ile Trp Glu Ala Gln Phe 675 680 685 Gly Asp Phe Ala Asn Gly Ala Gln Val Val Ile Asp Gln Phe Ile Ser 690 695 700 Ser Gly Glu Gln Lys Trp Gly Arg Met Cys Gly Leu Val Met Leu Leu 705 710 715 720 Pro His Gly Tyr Glu Gly Gln Gly Pro Glu His Ser Ser Ala Arg Leu 725 730 735 Glu Arg Tyr Leu Gln Leu Cys Ala Glu Gln Asn Met Gln Val Cys Val 740 745 750 Pro Ser Thr Pro Ala Gln Val Tyr His Met Leu Arg Arg Gln Ala Leu 755 760 765 Arg Gly Met Arg Arg Pro Leu Val Val Met Ser Pro Lys Ser Leu Leu 770 775 780 Arg His Pro Leu Ala Ile Ser Ser Leu Asp Glu Leu Ala Asn Gly Ser 785 790 795 800 Phe Gln Pro Ala Ile Gly Glu Ile Asp Asp Leu Asp Pro Gln Gly Val 805 810 815 Lys Arg Val Val Leu Cys Ser Gly Lys Val Tyr Tyr Asp Leu Leu Glu 820 825 830 Gln Arg Arg Lys Asp Glu Lys Thr Asp Val Ala Ile Val Arg Ile Glu 835 840 845 Gln Leu Tyr Pro Phe Pro His Gln Ala Val Gln Glu Ala Leu Lys Ala 850 855 860 Tyr Ser His Val Gln Asp Phe Val Trp Cys Gln Glu Glu Pro Leu Asn 865 870 875 880 Gln Gly Ala Trp Tyr Cys Ser Gln His His Phe Arg Asp Val Val Pro 885 890 895 Phe Gly Ala Thr Leu Arg Tyr Ala Gly Arg Pro Ala Ser Ala Ser Pro 900 905 910 Ala Val Gly Tyr Met Ser Val His Gln Gln Gln Gln Gln Asp Leu Val 915 920 925 Asn Asp Ala Leu Asn Val Asn 930 935

【００８０】 <210> 4 <211> 407 <212> PRT <213> Enterobacter agglomerans <400> 4 Met Ser Ser Val Asp Ile Leu Val Pro Asp Leu Pro Glu Ser Val Ala 1 5 10 15 Asp Ala Thr Val Ala Thr Trp His Lys Lys Pro Gly Asp Ala Val Ser 20 25 30 Arg Asp Glu Val Ile Val Glu Ile Glu Thr Asp Lys Val Val Leu Glu 35 40 45 Val Pro Ala Ser Ala Asp Gly Val Leu Glu Ala Val Leu Glu Asp Glu 50 55 60 Gly Ala Thr Val Thr Ser Arg Gln Ile Leu Gly Arg Leu Lys Glu Gly 65 70 75 80 Asn Ser Ala Gly Lys Glu Ser Ser Ala Lys Ala Glu Ser Asn Asp Thr 85 90 95 Thr Pro Ala Gln Arg Gln Thr Ala Ser Leu Glu Glu Glu Ser Ser Asp 100 105 110 Ala Leu Ser Pro Ala Ile Arg Arg Leu Ile Ala Glu His Asn Leu Asp 115 120 125 Ala Ala Gln Ile Lys Gly Thr Gly Val Gly Gly Arg Leu Thr Arg Glu 130 135 140 Asp Val Glu Lys His Leu Ala Asn Lys Pro Gln Ala Glu Lys Ala Ala 145 150 155 160 Ala Pro Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Gln Gln Pro Val Ala Asn Arg 165 170 175 Ser Glu Lys Arg Val Pro Met Thr Arg Leu Arg Lys Arg Val Ala Glu 180 185 190 Arg Leu Leu Glu Ala Lys Asn Ser Thr Ala Met Leu Thr Thr Phe Asn 195 200 205 Glu Ile Asn Met Lys Pro Ile Met Asp Leu Arg Lys Gln Tyr Gly Asp 210 215 220 Ala Phe Glu Lys Arg His Gly Val Arg Leu Gly Phe Met Ser Phe Tyr 225 230 235 240 Ile Lys Ala Val Val Glu Ala Leu Lys Arg Tyr Pro Glu Val Asn Ala 245 250 255 Ser Ile Asp Gly Glu Asp Val Val Tyr His Asn Tyr Phe Asp Val Ser 260 265 270 Ile Ala Val Ser Thr Pro Arg Gly Leu Val Thr Pro Val Leu Arg Asp 275 280 285 Val Asp Ala Leu Ser Met Ala Asp Ile Glu Lys Lys Ile Lys Glu Leu 290 295 300 Ala Val Lys Gly Arg Asp Gly Lys Leu Thr Val Asp Asp Leu Thr Gly 305 310 315 320 Gly Asn Phe Thr Ile Thr Asn Gly Gly Val Phe Gly Ser Leu Met Ser 325 330 335 Thr Pro Ile Ile Asn Pro Pro Gln Ser Ala Ile Leu Gly Met His Ala 340 345 350 Ile Lys Asp Arg Pro Met Ala Val Asn Gly Gln Val Val Ile Leu Pro 355 360 365 Met Met Tyr Leu Ala Leu Ser Tyr Asp His Arg Leu Ile Asp Gly Arg 370 375 380 Glu Ser Val Gly Tyr Leu Val Ala Val Lys Glu Met Leu Glu Asp Pro 385 390 395 400 Ala Arg Leu Leu Leu Asp Val 405

【００８１】 <210> 5 <211> 40 <212> PRT <213> Enterobacter agglomerans <400> 5 Met Asn Leu His Glu Tyr Gln Ala Lys Gln Leu Phe Ala Arg Tyr Gly 1 5 10 15 Met Pro Ala Pro Thr Gly Tyr Ala Cys Thr Thr Pro Arg Glu Ala Glu 20 25 30 Glu Ala Ala Ser Lys Ile Gly Ala 35 40

【００８２】 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 6 gtcgacaata gccygaatct gttctggtcg 30

【００８３】 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 7 aagcttatcg acgctcccct ccccaccgtt 30

【図面の簡単な説明】

【図１】 ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子およびｇｄｈ
Ａ遺伝子を有するプラスミドｐＭＷＣＰＧの構築を示す
図。

【図２】 ｇｄｈＡ遺伝子を有するプラスミドｐＳＴＶ
Ｇの構築を示す図。

【図３】 広宿主域プラスミドＲＳＦ１０１０の複製起
点とテトラサイクリン耐性遺伝子を含むプラスミドＲＳ
Ｆ−Ｔｅｔの構築を示す図。

【図４】 広宿主域プラスミドＲＳＦ１０１０の複製起
点、テトラサイクリン耐性遺伝子、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐ
ｐｃ遺伝子およびｇｄｈＡ遺伝子を有するプラスミドＲ
ＳＦＣＰＧの構築を示す図。

【図５】 ｇｌｔＡ遺伝子を有するプラスミドｐＭＷＣ
Ｂの構築を示す図。

【図６】 ｐＴＷＶＥＫ１０１のエンテロバクター・ア
グロメランス由来ＤＮＡ断片の制限酵素地図。

【図７】 エンテロバクター・アグロメランス由来のｓ
ｕｃＡ遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列
と、エシェリヒア・コリ由来のものとの比較を示す図。
上段：エンテロバクター・アグロメランス、下段：エシ
ェリヒア・コリ（以下、同様）。

【図８】 エンテロバクター・アグロメランス由来のｓ
ｕｃＢ遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列
と、エシェリヒア・コリ由来のものとの比較を示す図。

【図９】 エンテロバクター・アグロメランス由来のｓ
ｄｈＢ遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列
と、エシェリヒア・コリ由来のものとの比較を示す図。

【図１０】 エンテロバクター・アグロメランス由来の
ｓｕｃＣ遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列
と、エシェリヒア・コリ由来のものとの比較を示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:425） (Ｃ１２Ｐ 13/14 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 13/14 Ｃ１２Ｒ 1:425） (72)発明者 松井 和彦 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社発酵技術研究所内 (72)発明者 守屋 美加 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社発酵技術研究所内 (72)発明者 伊藤 久生 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社発酵技術研究所内 (72)発明者 原 吉彦 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社発酵技術研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA74 GA19 4B064 AE19 CA02 DA01 DA10 DA16 4B065 AA01X AA48X AC15 BA22 CA17 CA41 CA44

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 エンテロバクター属あるいはセラチア属
   に属し、下記の性質の少なくとも一方を有し、かつＬ−
   グルタミン酸生産能を有する微生物： （ａ）Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素の
   活性が高められている、（ｂ）Ｌ−グルタミン酸の生合
   成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生
   成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損して
   いる。
2. 【請求項２】 Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒す
   る酵素が、クエン酸シンターゼ、フォスフォエノールピ
   ルベートカルボキシラーゼ、およびグルタミン酸デヒド
   ロゲナーゼから選ばれる請求項１記載の微生物。
3. 【請求項３】 Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒す
   る酵素が、クエン酸シンターゼ、フォスフォエノールピ
   ルベートカルボキシラーゼ、およびグルタミン酸デヒド
   ロゲナーゼのすべてである請求項２記載の微生物。
4. 【請求項４】 Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐
   してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触
   媒する酵素がα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼであ
   る請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物。
5. 【請求項５】 微生物がエンテロバクター・アグロメラ
   ンスまたはセラチア・リクエファシエンスに属する請求
   項１〜４のいずれか一項に記載の微生物。
6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか一項に記載の微
   生物を液体培地に培養し、培地中にＬ−グルタミン酸を
   生成蓄積せしめ、これを該培地から採取することを特徴
   とするＬ−グルタミン酸の製造法。