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JP2000184888A - 突然変異体ｐ５３検出用プロ―ブ - Google Patents

突然変異体ｐ５３検出用プロ―ブ

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JP2000184888A
JP2000184888A JP11320781A JP32078199A JP2000184888A JP 2000184888 A JP2000184888 A JP 2000184888A JP 11320781 A JP11320781 A JP 11320781A JP 32078199 A JP32078199 A JP 32078199A JP 2000184888 A JP2000184888 A JP 2000184888A
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cells
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レビン，アーノルド，ジェイ．
Thomas E Shenk
シェンク，トーマス，イー．
Cathy A Finlay
フィンレイ，キャシー，エー．
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Princeton University
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Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 プローブ類パネルが、前癌および癌細胞
において頻繁に出現するかまたは選択されるヒトｐ５３
遺伝子またはｐ５３タンパク質の変異の組を検出しかつ
識別する。各組が野生型ｐ５３の表現型および少なくと
も他の１組のｐ５３変異体の表現型と異なる表現型を生
成する。 【効果】 前癌および癌細胞の経過及び予後が判定でき
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、癌および前癌状態
の検出における分子プローブ類の使用に関する。さらに
詳細には、本発明は、抗体およびＤＮＡプローブ類によ
る癌および前癌状態の識別に関する。前記癌および前癌
状態は、ｐ５３タンパク質類に関連するものである。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】体細胞
中におけるプロトオンコジーン（癌原遺伝子，proto-on
cogene）類の変異は、ヒト癌の誘発において重大である
としてますます認識されつつある。このような変異によ
って形成されるオンコジーンのいくつかの例として、ne
u, fes,fos, myc, myb, fms, Ha-rasおよびKi-rasがあ
る。プロトオンコジーン類をオンコジーン類に変換する
変異は、しばしば、点突然変異である。オンコジーン類
およびそれらの発現生成物類がどのようにして正常細胞
を癌細胞に形質変換するように作用するのかについて理
解するため、多くのことを知る必要がある。
【０００３】オンコジーン類は、一般に、優性様式で作
用すると考えられている。このことは、一般に、１個の
プロトオンコジーンから１個のオンコジーンへの変換の
結果、新規機能、すなわち形質転換増強の取得を意味す
ると考えられている。
【０００４】癌関連の異なるタイプの変異は、腫瘍抑制
遺伝子の生成物にその腫瘍抑制機能を喪失させるように
この遺伝子が変化したときに出現する。このような腫瘍
抑制遺伝子の例として、網膜芽細胞腫感受性遺伝子Ｒｂ
がある。腫瘍抑制遺伝子類は、時に、劣性オンコジーン
類とも呼ばれるが、但し、厳密に言えば、腫瘍抑制遺伝
子類の生成物は腫瘍形成には寄与しない。両対立遺伝子
類が変異したとき腫瘍抑制遺伝子が欠けている結果腫瘍
化が促進されるので、この表現型は劣性である。
【０００５】あるウイルスオンコジーン類の生成物類
も、また、細胞を形質転換できる。このような生成物類
の例として、ヒトパピローマウイルス由来Ｅ６およびＥ
７タンパク質類、ＳＶ４０由来大きいＴ抗原、およびア
デノウイルス由来Ｅｌａが挙げられる。ウイルスオンコ
ジーンタンパク質類は、網膜芽細胞腫タンパク質のよう
な腫瘍抑制タンパク質類に結合し、それによって、この
腫瘍抑制タンパク質類を不活化すると考えられている。
優性および劣性オンコジーンの両方の特性をいくつか発
現する遺伝子生成物は、５３ｋｄのリンタンパク質、ｐ
５３である。このｐ５３遺伝子における変異が多くの種
類の多数の癌に関連している証拠が増えている。たとえ
ば、Ｉｇｇｏら〔ランセット(Lancet)３３５，６７５−
６７９（１９９０）〕は、ｐ５３が肺癌において変異を
受ける最も一般的なプロトオンコジーンであるという意
見を述べている。
【０００６】ｐ５３について知られていることの多く
は、野生型かつ変異マウスｐ５３をラット胎児線維芽細
胞中に移入する効果を研究することから由来している。
この研究は、Levineら、“ｐ５３プロトオンコジーンお
よびその生成物（The p53 Proto-Oncogene And Its Pro
duct) ”、小さいＤＮＡ腫瘍ウイルスによる形質転換の
一般的メカニズム(Common Mechanisms of Transform
ation By Small DNA Tumor Viruses)、L. Villarreal
編著、アメリカンソサイアティ・フォア・マイクロバイ
オロジー(Ameican Society of Microbiology) 、２章
（１９８９）；Hinds ら、同上、７章；およびLevine、
バイオアッセイズ(BioEssays) １２，６０−６６（１９
９０）によって、レビューされている。
【０００７】簡単に述べれば、ｐ５３の（アミノ酸３９
０個から）アミノ酸１３０および２４０の間のいくつか
の点変異が、表現型における重要な腫瘍促進性変化をも
たらす。野生型および変異ｐ５３の両方で、それらの代
謝安定性増加の故に形質転換細胞におけるレベル増加が
しばしば見られる。変異ｐ５３の安定化は、７０ｋｄの
熱ショックタンパク質、ｈｓｃ７０のような細胞性タン
パク質類との複合体を形成して出現すると考えられてい
る。野生型ｐ５３の安定化は、変異ｐ５３−ｈｓｃ７０
複合体との複合体を形成する能力に関連していると考え
られている。これらの結果は、ｐ５３機能における変化
が細胞性形質転換過程に関与しているという説と矛盾し
ない。変異マウスｐ５３が培養細胞の形質転換に関与し
ていることは、また、野生型ではない変異ｐ５３の活性
化Ｈａ−ｒａｓとの相互作用で初代ラット胎児細胞類を
形質転換する能力からも明らかである。
【０００８】ｐ５３遺伝子は、染色体１７ｐ上にある。
上記で検討したように多くの癌が、染色体１７ｐの欠失
に関連している。このような対立遺伝子の欠失は、しば
しば、腫瘍抑制遺伝子の存在を示唆している。１個の対
立遺伝子の変異は、良性の前癌状態を生じる。第２対立
遺伝子の変異は、悪性腫瘍状態をもたらす。
【０００９】Finlayら〔セル（Cell）５７，１０８３−
１０９３（１９８９）〕は、さらに、野生型マウスｐ５
３が形質転換抑制因子の特性を示すことを発表した。３
つの観察がこの説と一致している。
【００１０】第１に、２種の協同する形質転換遺伝子
類、ｒａｓおよびＥｌａとともに野生型マウスｐ５３を
初代げっ歯細胞へ導入した結果、形質転換された細胞増
殖巣の数が減少する。得られたこの形質転換された細胞
系統は、マウスｐ５３遺伝子を含有することが判明した
が、それを発現することも、また高レベルの改変マウス
生成物を産生することもなかった。したがって、野生型
マウスｐ５３タンパク質の過剰発現は、培養ラット細胞
のオンコジーン類による形質転換過程にとって有害であ
るらしい。
【００１１】第２に、ｐ５３遺伝子の不活化は、フレン
ド（Friend）ウイルス誘発赤白血病細胞のマウスにおけ
る発生に関連していると考えられている〔Mowat ら、ネ
ーチャー（Nature）３１４，６３３−６３６（１９８
５）〕。文献には、ｐ５３遺伝子座における再配列また
は他の変異を含むFriendウイルス複合体感染マウス脾臓
由来腫瘍細胞の例が数多くある〔たとえば、BenDavid,
オンコジーン（Oncogene) ３，１７９−１８５（１９８
８）参照〕。
【００１２】野生型ｐ５３タンパク質が形質転換抑制に
関与しているタンパク質群の１員であるという可能性と
一致する第３の証拠として、上記にも記載したが、ＳＶ
４０の大きいＴ抗原、アデノウイルス５型Ｅｌｂ−５５
ｋｄタンパク質、およびヒトパピローマウイルス（ＨＰ
Ｖ）１６型または１８型Ｅ６生成物のようなウイルスオ
ンコジーン類とのオリゴマータンパク質複合体類を形成
するｐ５３の能力が挙げられる〔たとえば、Werness,サ
イエンス（Science) ２４８，７６−７９（１９９０）
参照〕。網膜芽細胞腫感受性遺伝子の生成物であるｐ１
０５およびＳＶ４０の大きいＴ抗原〔DeCaprioら、セル
（Cell）５４，２７５−２８３（１９８８）〕、アデノ
ウイルスＥｌａタンパク質〔Whyte ら、ネーチャー（Na
ture）３３４，１２４−１２９（１９８８）〕、および
ＨＰＶ−１６または−１８のＥ７タンパク質〔Muenger
ら、EMBOジャーナル(EMBO J.) ８，４０９９−４１０５
（１９８９）〕の間で、同様の複合体類が観察されてい
る。ウイルスタンパク質類とｐ１０５との間のこれらの
相互作用は、ｐ１０５の生長抑制性機能を不活化し、し
たがって、腫瘍細胞中の網膜芽細胞腫遺伝子中によくみ
られる欠失および変異を模倣すると考えられている。同
様に、これらの同一ウイルスタンパク質類とｐ５３との
オリゴマータンパク質複合体形成は、ｐ５３の生長抑制
機能を消失させるかまたは改変させることができる〔Fi
nlayら、同上、参照〕。
【００１３】ｐ５３関連腫瘍類のクローン性質は、野生
型ｐ５３遺伝子および変異ｐ５３遺伝子保持非新生性前
癌細胞が２個の野生型遺伝子類を含有する正常細胞に対
して著明な増殖上の利点を有している腫瘍促進モデルと
一致している。この利点は、変異ｐ５３媒介野生型ｐ５
３機能の干渉による。このような非新生性細胞の増殖能
上昇は、ｐ５３座における第２の不活化変異、すなわ
ち、遺伝子転換または欠失の確率を増大させる。結果と
して生じた細胞類は、ｐ５３対立遺伝子類の両方に現在
変異を有しており、完全に新生性の表現型を発現できる
〔Finlayら、同上、およびBaker ら、サイエンス（Scie
nce)２４４，２１７−２２１（１９８９）参照〕。
【００１４】上記モデルは、１７ｐ染色体対立遺伝子を
欠失したヒト腫瘍細胞類が残りの対立遺伝子中に変異を
有しているという発見によって裏付けられる。この変異
は、前記ｐ５３の最も高度に保存される４領域に一致す
る４個の“ホットスポット”中に密集する（cluster)傾
向があった〔Nigro ら、ネーチャー(Nature)３４２，７
０５−７０８（１９８９）参照〕。
【００１５】Gannonら〔EMBO J. ９，１５９５−１６０
２（１９９０）〕は、全てのヒト変異ｐ５３タンパク質
類がモノクローナル抗体ＰＡｂ２４０によって認識され
ると提案している。これらの著者らは、全てのｐ５３変
異体が共通の構造上の効果を発現し、その結果、ＰＡｂ
２４０エピトープの発現が起こると示唆している。
【００１６】
【課題を解決するための手段】ヒトｐ５３に関連した本
発明者らのこれまで未公表の実験が、本発明の基礎を形
成している。結腸直腸癌由来の異なるヒトｐ５３クロー
ン類は、（総数３９３個の残基から）アミノ酸残基１４
３、１７５、２７３または２８１で変異を有している。
このようなｐ５３変異体が活性化野生型ｒａｓオンコジ
ーン類とともにラット胎児線維芽細胞（ＲＥＦｓ）中に
同時移入されるとき前記オンコジーン類と協同して培養
ＲＥＦｓを形質転換する。これらの実験に由来する形質
転換された細胞系統の全てがヒトｐ５３タンパク質産生
レベルを上昇させる。前記変異を表１に要約した。ヒト
ｐ５３変異タンパク質類の特性に及ぼす変異の効果は、
表２に示した。
【００１７】
【表１】 ヒトｐ５３タンパク質の変異 ＤＮＡ タンパク質 クローン ヌクレオチド 改変 残基 改変 p53-c143A 430 T→C 143 val → ala p53-175H 526 G→A 175 arg → his p53-273H 820 G→A 273 arg → his p53-281G 844 A→G 281 asp → gly
【００１８】
【表２】 ヒトｐ５３変異タンパク質類の特性 相対Tx 半減期 hsc70 p90 クローン内 頻度 タンパク質 結合 結合 ヌードマウス 腫瘍 p53-cWT1 0 20min. − ＋ ＋ p53-c143A1 1.6 1.5-2hrs. ＋ ＋ ＋ p53-WT2 0 ND3 ND3 ND3 ND3 p53-175H2 11.5 3.6-6.4hrs. ＋ ＋ ＋ p53-273H2 4.7 7hrs. − ＋ ＋ p53-281G2 1.9 3.5hrs.4 − ＋ ND3 上記表中、 １：ｃＤＮＡ。イントロンを含まず。 ２：イントロンを含む。 ３：未決定。 ４：ｒａｓ＋Ｅｌａ＋変異ｐ５３発現細胞系統中で推定された半減期。
【００１９】表２の結果を得るため、ｐ５３のｃＤＮＡ
クローン類またはｐ５３の部分的ｃＤＮＡゲノムクロー
ン類と活性化ｒａｓオンコジーンとを、初代ラット胎児
線維芽細胞に同時移入した。各組のトランスフェクショ
ンにおいて、形質転換された細胞増殖巣の点数を二重細
胞培養で２乃至３週後に調べた。
【００２０】表２の結果は、結腸癌由来変異ヒトｐ５３
ｃＤＮＡまたはｃＤＮＡゲノムハイブリッドクローン類
が優性オンコジーン類として挙動し、かつラット胎児線
維芽細胞の形質転換でラットオンコジーンと協同できる
ことを示している。アミノ酸残基１４３、１７５、２７
３および２８１における４つの異なるミスセンス変異が
それぞれ、この形質転換された表現型に寄与していた。
これらの全ての場合において、ヒトｐ５３変異タンパク
質がこの形質転換細胞中で少なくとも部分的に高レベル
に産生され、これらの変異タンパク質類の半減期を延長
した。
【００２１】前記の異なる変異体を含む細胞の表現型が
同一でないことは予測されなかった。たとえば、１実験
では、コドン１７５、２７３および２８１における“ホ
ットスポット”変異を含有する３つのｐ５３ＤＮＡクロ
ーン類、すなわち、ｐ５３−１７５Ｈ、ｐ５３−２７３
Ｈ、およびｐ５３−２８１Ｇは、６：２．４：１の割合
で特徴的かつ再現可能な形質転換頻度（産生された細胞
増殖巣の数）を有しており、これらの“ホットスポッ
ト”変異がそられの表現型において同等でないことを示
唆している。別の実験では、１７５変異対立遺伝子は、
初代ラット培養細胞の形質転換に際し２７３変異対立遺
伝子よりもｒａｓオンコジーンとの協同で３−１０倍効
率的であった。
【００２２】ｐ５３−１７５Ｈおよびｐ５３−ｃ１４３
Ａ変異タンパク質類は形質転換細胞においてｈｓｃ７０
に結合し、一方、ｐ５３−２７３Ｈおよびｐ５３−２８
１Ｇ変異タンパク質類はｈｓｃ７０と検出可能なほど相
互作用しまたは結合することがないことは、いっそう驚
くべきことである。先の実験では、いくつかの変異マウ
スｐ５３タンパク質類が改変構造を有していることが示
された〔Hinds ら、モレキュラー・エンド・セルラーバ
イオロジー(Mol. Cell. Biol.)７，２８６３−２８６９
（１９８７）；Finlayら、同上、８，５３１−５３９
（１９８８）〕。このような改変されたｐ５３分子類が
ｈｓｃ７０に結合しかつｐ５３の適切な折り畳み、集合
または局在を阻害する複合体中において野生型ｐ５３を
隔離することが可能である。したがって、ｐ５３−ｃ１
４３Ａおよびｐ５３−１７５Ｈは、決して正しく折り畳
まれず、したがってそれらのｈｓｃ７０に対する親和性
を保持している変異タンパク質類を代表することができ
る。もし野生型ｐ５３がこの複合体中に補充されると、
このｐ５３変異ｈｓｃ７０−ｐ５３野生型複合体は、野
生型ｐ５３の機能に悪影響を与えるであろう。
【００２３】このことは、ｐ５３−２７３Ｈおよびｐ５
３−２８１Ｇ変異体には当てはまらず、これらは、上記
にも述べたように、ｈｓｃ７０に結合しない。このｐ５
３−２７３Ｈヒト変異タンパク質はラットｐ５３タンパ
ク質と会合でき、ヒト特異的抗体Ａｂ−２との同時免疫
沈降によって証明されるように、オリゴマー複合体を形
成できる。この複合体はｈｓｃ７０によって媒介されて
おらず、ラット細胞性野生型ｐ５３タンパク質を隔離す
る点で効率が劣る。このことは、培養細胞の形質転換能
力がより劣っていることと矛盾しない。
【００２４】活性化ｒａｓと変異ヒトｐ５３との同時ト
ランスフェクションに比較して、活性化ｒａｓと野生型
ヒトｐ５３との同時トランスフェクションは、細胞増殖
巣形成の頻度が極めて低い結果となり、そして、唯一の
細胞増殖巣は、樹立された細胞１系統にクローニングで
きた。したがって、ヒトｐ５３の変異が野生型ｐ５３で
は検出できない優性形質転換機能を活性化するように見
える。
【００２５】要約すれば、ヒトｐ５３変異タンパク質類
の全てが、延長された半減期を有することによって、高
レベルで発現されることによって、および培養細胞を形
質転換する能力を保持していることによって、野生型ヒ
トｐ５３タンパク質と異なるように見える。これらのデ
ータは、ｐ５３の１個の対立遺伝子上における変異が、
インビボで増殖促進性の表現型を有することができ、こ
のことは、このような変異を有する細胞の数を拡大し、
そして腫瘍細胞中における第２の変異事象（欠失または
遺伝子変換）の選択に有利に利用するという示唆を裏付
ける。多くの腫瘍細胞がこの変異ｐ５３対立遺伝子のみ
を保持しているという観察は、これらの変異タンパク質
類が野生型対立遺伝子に対して十分な優性ではないこと
またはこの変異体が野生型ｐ５３の不存在下で細胞に対
して増殖利点を付与し続けることを示唆している。野生
型ｐ５３の不存在下でこのような変異ｐ５３の細胞増殖
に及ぼす正の効果はこの分子に固有の機能でもありうる
が、また、内因性ｐ５３以外の細胞性タンパク質類の滴
定によって、たとえば、タンパク質ｐ９０により媒介さ
れることもありうる。
【００２６】最も重要であるのは、この結果が、異なる
表現型を有する前癌および癌細胞を生成するヒトｐ５３
変異体にクラスがあることを確立したことである。これ
らの異なる表現型が異なる経過をとりかつ異なる予後を
有する癌を発生させることは明らかである。
【００２７】現行の癌検出方法の問題点は、これらの異
なる表現型変化が考慮されていなかったことである。こ
の問題は、本発明によって解明される。
【００２８】本発明によって解明された第２の問題点
は、この異なる表現型変化が癌の経過および予後にどの
ような影響を及ぼすかを決定することである。いったん
この問題が解決されれば、癌がたどる経過を予測しかつ
この癌を治療するための最善の方法を予測できるように
なるため、さまざまな表現型変化を検出可能とすること
がもうひとつの問題である。
【００２９】これらおよびその他の問題は、当業者に明
らかなように、前癌および癌細胞において頻繁に発生す
るかまたは選択される何組かのヒトｐ５３遺伝子または
ｐ５３タンパク質の変異で、その各組が野生型ｐ５３の
それと異なりかつ少なくとも他の１組(set) のｐ５３変
異体のそれと異なる表現型を生成する組を検出しかつ識
別する１パネルのプローブ類(a panel of probes) を提
供することによって解決された。
【００３０】本発明は、さらに、前癌および癌細胞にお
いて頻繁に発生するかまたは選択される何組かのヒトｐ
５３遺伝子またはｐ５３タンパク質の変異で、その各組
が野生型ｐ５３のそれと異なりかつ少なくとも他の１組
のｐ５３変異体のそれと異なる表現型を生成する組を識
別する方法に関し、この方法は、ｐ５３遺伝子類または
ｐ５３タンパク質類試料中でこのような組を検出しかつ
識別する１パネルのプローブ類で変異を決定することか
らなる。
【００３１】本発明は、また、前癌および癌細胞におい
て頻繁に発生するかまたは選択される何組かのヒトｐ５
３遺伝子変異体を識別する方法を提供し、本方法は、こ
のような変異体が存在するかどうか、そして、もしそう
であれば、この変異タンパク質が野生型ヒトｐ５３タン
パク質に比べてそのｈｓｃ７０との結合が弱いかどうか
を決定する段階からなる方法である。
【００３２】
【発明の実施の形態】定義 本発明は、野生型ｐ５３遺伝子類およびｐ５３タンパク
質類中の変異を検出することに関する。本明細書の目的
のため、用語“野生型”ｐ５３は、Matlashewskiら〔EM
BO J. １３，３２５７−３２６２（１９８４）〕；Zaku
t-Houriら〔EMBO J.４，１２５１−１２５５（１９８
５）〕；およびLambおよびCrawford〔モレキュラー・エ
ンド・セルラーバイオロジー(Mol. Cell. Biol.)５，１
３７９−１３８５（１９８６）〕によって報告されたヌ
クレオチドまたはアミノ酸配列を意味する。この配列類
は、ジーンバンク(GenBank) から入手可能である。野生
型ｐ５３には、アミノ酸７２位におけるプロリン／アル
ギニン多形性および対応するヌクレオチド多形性が含ま
れる。野生型ｐ５３遺伝子類およびｐ５３タンパク質類
中における変異の検出は、このような変異が前癌および
癌状態を示唆するので、重要である。ｐ５３変異に関連
する癌の種類に関して明らかな制限は全くない。このよ
うな癌としては、一般に、結腸、直腸、肺、卵巣、子
宮、副腎皮質、骨、膀胱、胸、脳および間葉癌、および
さらに詳細には、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄形成白血
病、骨原性肉腫が挙げられる。
【００３３】１個の前癌細胞とは、１個のｐ５３対立遺
伝子および１個の変異ｐ５３対立遺伝子を有する細胞と
して定義される。変異は、通常、点変異である。癌細胞
において、両方の対立遺伝子が変異を受ける。前癌細胞
について上記したように、１個の変異は、通常点変異で
ある。他の変異は、通常、ｐ５３遺伝子の全体または重
要部分の欠失である。
【００３４】変異 本発明は、異なる構造および異なる表現型の組に対応す
る組の変異がｐ５３中にあるという予測外の発見に基づ
いている。可能な限り多くの変異の組を決定することが
重要である。しかし、ひとつの組内でそれぞれの各変異
を決定することは必要でない。１組の変異は、少なくと
も１個の変異を有しかつ野生型および少なくとも他の１
組の変異と異なる表現型を生成するものとして定義され
る。
【００３５】各組の表現型は、同一疾患について識別可
能な経過および重篤度をもたらす。したがって、何組か
の変異を決定することによって、医師は、患者がある特
定の癌を有することを決定できるばかりでなく、異なる
それらの組の予後を識別しかつ最善の治療を処方するこ
とができる。
【００３６】たとえば、多くの結腸直腸癌は、アミノ酸
１４３位、１７５位、２７３位および２８１位において
またはその近辺で変異を生じる。これらの変異は、表１
に記載されている。
【００３７】リ・フラウメニ(Li-Fraumeni) 症候群に罹
患している家族は、コドン２４５および２５８にクラス
ターを形成するｐ５３変異を含んでいる。コドン２４８
における変異は、特に、罹患率が高い。これらの家族
は、高い癌発生率を有している。
【００３８】リ・フラウメニ症候群で指摘されたのと同
一領域におけるｐ５３変異は、また、肝細胞癌にも頻繁
に見られる。コドン２４９における変異は、肝癌患者で
頻繁に見られる。
【００３９】変異を受けた全ての単一ヌクレオチドまた
はアミノ酸、または、１個以上の変異が起こっているｐ
５３遺伝子のいかなる領域またはタンパク質も、本発明
による変異体の組(set) を構成する。ただし、この変異
の組が上記に述べた定義を満足する限りにおいてであ
る。本発明の１態様において、たとえば、何組かの変異
は、ｐ５３タンパク質の残基１１７−１４２、１７１−
１８１、２３４−２５８、および２７０−２８６、およ
びこのｐ５３遺伝子の対応するヌクレオチド類からな
る。
【００４０】本発明のもうひとつの態様では、１組の変
異は、アミノ酸１４３および１７５における変異からな
る。第２の変異の組は、アミノ酸２７３および２８１に
おける変異からなる。
【００４１】プローブ類パネル 一般に、本発明によるプローブ類パネルは、少なくとも
２つの構成員を含んでいる。例えば、３、４、５または
６組ほどの多くの変異があり、したがって、同一数のプ
ローブがあるかもしれない。８、１０または１２ほどの
多くのプローブがあり、実際にはそれ以上のプローブが
あるかもしれない。
【００４２】１組になった変異は、種々のタイプのヒト
腫瘍で共通に見られる。これらの変異の遍在性は、これ
らの高い発生数、または先にも説明したように、それら
がそれらを含有する細胞に対して増殖利点を提供し、そ
のために選択されるので結果として生じるであろう。
【００４３】前記遺伝子のヌクレオチド配列または前記
タンパク質のアミノ酸配列のいずれかにおける改変は、
本発明による何組かの変異の１組の中で変異が存在する
かどうかを決定するためにアッセイできる。アミノ酸配
列における改変は、抗体類によって探索できる。ヌクレ
オチド配列における改変は、ヌクレオチドプローブ類ま
たはある場合には制限エンドヌクレアーゼによって探索
できる。本文で使用したヌクレオチド類とは、ＲＮＡま
たはＤＮＡを意味する。
【００４４】抗体プローブ類 本明細書による“抗体”とは、特異的にエピトープに結
合するポリペプチドとして広く定義される。この抗体
は、ポリクローナルでもモノクローナルでもよい。さら
に、抗体類には、Huseら〔サイエンス(Science) ２４
６，１２７５−１２８１（１９８９）〕の方法に従って
調製した組換えポリクローナルまたはモノクローナルＦ
ａｂ断片類も含まれる。
【００４５】オンコジーン間の単一のアミノ酸の相違に
対して特異性を示すポリクローナルおよびモノクローナ
ル抗体類の調製方法は、米国特許第4,798,787号にMcCor
mickらによって記載されている。これらの方法は、本文
で参考として引用している。
【００４６】簡単に述べると、ポリクローナル抗体類
は、ウサギ、マウス、ラットまたはヤギのような宿主哺
乳類に対して変異ｐ５３および野生型ｐ５３を識別する
抗体類を産生可能なｐ５３タンパク質またはその断片を
注射して産生できる。注射されるペプチドまたはペプチ
ド断片には、野生型配列またはその変異体配列が含まれ
る。前記哺乳類から血清を抽出しスクリーニング後、ペ
プチドまたはペプチド断片に特異的なポリクローナル抗
体類を得る。
【００４７】モノクローナル抗体類を産生するため、上
述のようにペプチドまたはペプチド断片を宿主哺乳類に
接種しその後ブーストする。接種哺乳類から最終ブース
ト後に脾臓を採取する。脾臓由来細胞懸濁物をKohlerお
よびMilstein、ネーチャー(Nature)２５６，４９５−４
９７（１９７５）に記載の一般的方法に従って腫瘍細胞
と融合する。ペプチド断片は、有用であるためには、検
出しようとするｐ５３分子のエピトープを規定するアミ
ノ酸残基を十分量含有していなければならない。
【００４８】もし断片が余りにも短く免疫原性となりえ
なければ、それを担体分子と連結することもできる。い
くつかの適切な分子類として、カブトガニヘモシアニン
およびウシ血清アルブミンが挙げられる。連結は、当該
技術分野で公知の方法によって実施できる。このような
方法の一つとして、前記断片のシステイン残基を担体分
子上のシステイン残基と結合する方法が挙げられる。
【００４９】ペプチド断片類は、当該技術分野で公知の
方法によって合成できる。いくつかの適切な方法は、St
uartおよびYoung によって“固相ペプチド合成(Solid P
hasePeptide Synthesis) ”、第２版、ピアス化学社(Pi
erce Chemical Company) （１９８４）に記載されてい
る。
【００５０】さまざまなアッセイ手段が、標識抗体でタ
ンパク質類を検出するために利用可能である。このよう
な方法では、１段階ないし２段階を行う。１段階アッセ
イでは、ターゲットｐ５３分子がもし存在するならばそ
れを固定化し、標識抗体とインキュベートする。この標
識抗体は、固定化ｐ５３と結合する。未結合分子類を除
去するために洗浄後、標識の存在をアッセイする。
【００５１】２段階アッセイでは、固定化ｐ５３を非標
識抗体とインキュベートする。ｐ５３非標識抗体複合体
がもし存在すれば、非標識抗体に特異的な２次標識抗体
と結合させる。試料を洗浄し、この標識の存在を上述の
ようにアッセイする。
【００５２】本標識は、放射性原子、酵素、または発色
性分子であることができる。放射性原子のいくつかの例
として、32Ｐ、125Ｉ、3Ｈ および14Ｃ が挙げられる。
酵素のいつくかの例として、西洋ワサビペルオキシダー
ゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、
およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼが挙げ
られる。発色性分子類のいくつかの例として、フルオレ
セインおよびローダミンが挙げられる。この抗体類は、
これらの標識類に当該技術分野で公知の方法によって連
結できる。たとえば、酵素類および発色分子類は、ジア
ルデヒド類、カルボジイミド類、ジマレイミド類等のよ
うな結合剤によってこの抗体類に結合できる。これとは
別に、連結は、リガンド−レセプター対によっても起こ
り得る。いくつかの適切なリガンド−レセプター対とし
て、たとえば、ビオチン−アビジンまたはビオチン−ス
トレプトアビジン、および抗体−抗原が挙げられる。
【００５３】オリゴヌクレオチドプローブ類 本発明のプローブ類は、また、変異ＤＮＡまたはＤＮＡ
から野生型を識別するオリゴヌクレオチド類でもありう
る。オリゴヌクレオチドプローブ類は、当該技術分野で
公知の方法によって調製できる。オリゴヌクレオチドプ
ローブ類を合成する適切な方法は、Caruthers によって
サイエンス(Science) ２３０，２８１−２８５（１９８
５）に記載されている。
【００５４】前記オリゴヌクレオチドプローブ類は、野
生型または変異ｐ５３の配列に相補的に変異した１個の
ヌクレオチドからなる配列を含有していてもよい。たと
えば、そのような変異をしたヌクレオチドは、野生型ま
たは変異ｐ５３の４３０位、５２６位、８２０位、また
は８４４位において変異したものである。
【００５５】オリゴヌクレオチドプローブの長さは、そ
れが、野生型または変異ｐ５３を含有する被験試料にハ
イブリダイズしかつこの２つを識別可能でありさえすれ
ば、問題ではない。前記オリゴヌクレオチドは、少なく
とも６個のヌクレオチド類、好適には少なくとも１０個
のヌクレオチド類、およびさらに好適には少なくとも１
５個のヌクレオチド類を含有すべきである。
【００５６】前記オリゴヌクレオチドプローブ類は、検
出用に標識される。検出用にオリゴヌクレオチドプロー
ブ類に連結可能な標識類は、抗体類に連結するそれらと
同一である。このような標識は上記に記載されている。
オリゴヌクレオチド類に本標識を連結することは、当該
技術分野で公知の方法によって達成される。
【００５７】オリゴヌクレオチドプローブ類の長さには
上限がない。プローブの長さが長ければ調製がより困難
となりかつ長いハイブリダイゼーション時間を必要とす
る。したがって、前記プローブは、必要以上に長くすべ
きでない。オリゴヌクレオチドプローブは、通常、５０
個以上のヌクレオチド類を含有せず、好適には４０個未
満、さらに好適には３０個未満のヌクレオチド類を含有
する。
【００５８】野生型オンコジーン類を単一ヌクレオチド
変化を有する変異体から識別する方法は、ＰＣＴ出願Ｗ
Ｏ ８７／０７６４６に記載されている。これらの方法
は、本文で参考として引用している。
【００５９】簡単に述べれば、野生型または変異配列の
いずれかを含有するオリゴヌクレオチド類は、厳重な条
件下において、適当な制限エンドヌクレアーゼによって
消化したターゲットｐ５３ＲＮＡまたはＤＮＡを含有す
る乾燥アガロースゲル類にハイブリダイズさせる。適切
な条件として、完全二重鎖の計算Tmより２度低いことが
挙げられる。このオリゴヌクレオチドプローブは、前記
プローブおよびターゲットｐ５３が完全に相補性である
ときにターゲットｐ５３により検出可能なようにハイブ
リダイズする。
【００６０】ターゲットｐ５３ＤＮＡは、本アッセイの
感受性を向上させるために、適宜、増幅される。増幅
は、当該技術分野で公知の方法によって達成される。適
切な方法は、Mullisらによって、米国特許第4,683,195
号および同第4,683,202 号に記載のように、ポリメラー
ゼチェーン反応法（ＰＣＲ法）である。
【００６１】オリゴヌクレオチドによって単一点変異を
アッセイするための特に便利な方法は、イムクローンシ
ステムズ社(ImClone Systems, ニューヨーク市）がライ
センスを有しているSegev によるＰＣＴ出願ＷＯ ９０
／０１０６９に記載されている。この方法は、異変を受
ける野生型ｐ５３中のヌクレオチドおよび変異体中の対
応するヌクレオチドが相補性でない場合に限定される。
【００６２】簡単に述べれば、アッセイするそれぞれの
野生型または変異ｐ５３鎖のための２個のオリゴヌクレ
オチドプローブ類を調製する。各オリゴヌクレオチドプ
ローブは、変異を受けるかまたは変異を受けたヌクレオ
チドをまたぐ配列に相補性である。したがって、前記２
個のハイブリダイズされたプローブ類の間にギャップ(g
ap) が生じる。
【００６３】たとえば、ｐ５３の野生型と野生型形態の
５２６位のグアニンがアデニンに変異されている変異形
とを識別するため、５２６位のギャップを残すプローブ
類を調製する。このギャップを、ポリメラーゼ、リガー
ゼ、および５２６位のそれに相補性のヌクレオチドの混
合物によって充填し、連結されたオリゴヌクレオチド生
成物を形成する。たとえば、もし野生型ｐ５３を検出し
ようとするならば、このギャップをシトシンによって充
填する。この変異形は、これらの条件下では検出されな
いであろう。
【００６４】一方、もし変異形を検出しようすとるなら
ば、このギャップをチミンによって充填する。野生型ｐ
５３は、これらの条件下では検出されないであろう。前
記ギャップを充填するオリゴヌクレオチド類またはヌク
レオチドのいずれかが、当該技術分野で公知の方法で標
識できる。
【００６５】連結されたオリゴヌクレオチド生成物は、
それをｐ５３から変性させ、それを追加のオリゴヌクレ
オチド相補体にハイブリダイズさせ、そして、第１段階
でギャップを充填したヌクレオチドの相補体で今度はこ
のギャップを再度充填することによって増幅できる。
【００６６】この方法を下記に模式的に示す。ここで構
造（１）は、５２６位にグアニンを含有する野生型ｐ５
３にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ類
の対を示している。構造（２）は、シトシンで充填した
前記２個のプローブ間のギャップを示している。構造
（３）は、２個の付加相補性オリゴヌクレオチド類にハ
イブリダイズする構造（２）由来連結オリゴヌクレオチ
ド生成物を示している。構造（４）は、グアニンで充填
された構造（３）のギャップを示している。このプロセ
スは、所望するだけ何回でも繰り返すことができる。
【００６７】
【表３】 構造類 （１） ・・・・・・・ ・・・・・・・ ・・・・・・・・・Ｇ・・・・・・・・・ ５２６ （２） ・・・・・・・Ｃ・・・・・・・ ・・・・・・・・・Ｇ・・・・・・・・・ （３） ・・・・・・・Ｃ・・・・・・・ ・・・・・・・ ・・・・・・・ （４） ・・・・・・・Ｃ・・・・・・・ ・・・・・・・Ｇ・・・・・・・
【００６８】連結されたオリゴヌクレオチド生成物の連
結および適宜増幅につづいて、このオリゴヌクレオチド
生成物を大きさによって分離後、標識を当該技術分野で
公知の方法によって検出する。上記操作のＰＣＴ出願Ｗ
Ｏ ９０／０１０６９からの記載は、本文で参考として
引用している。
【００６９】制限エイドヌクレアーゼプローブ類 変異は、また、もしそれらが制限部位を作製するかまた
は消失させるならば検出できる。たとえば、ＨｈａＩ部
位は、ＧＣＧＣである。ヌクレオチド４３０におけるヒ
トｐ５３遺伝子中のチミンからシトシンへの変異は、Ｈ
ｈａＩ部位を作製する。このような変異は、残基１４３
においてバリンからアラニンへアミノ酸配列を変化させ
る（表１参照）。
【００７０】ヒトｐ５３遺伝子のヌクレオチド５２６に
おけるグアニンからアデニンへの変異はＨｈａＩ部位を
消失させる。このような変異は、残基１７５においてア
ルギニンからヒスチジンへの変化を誘発する（表１参
照）。
【００７１】したがって、表１に示した残基４３０およ
び５２６におけるヒトｐ５３遺伝子の変異は、制限分析
によって検出できる〔Baker ら、サイエンス(Science)
２４４，２１７−２２１（１９８９）参照〕。点変異ア
ッセイのための制限分析の使用のその他のいくつかの例
は、Weinbergら、米国特許第4,786,718 号に記載されて
いる。
【００７２】ヌクレオチド１個分だけ異なっているポリ
ヌクレオチド配列類を識別するためのいくつかのその他
の方法は、De Leyら、ジャーナル・オブ・バクテリオロ
ジー(J.Bacteriol.)１０１，７３８−７５４（１９７
０）；Woodら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル
アカデミーオブサイエンシズ米国（Proc. Natl. Acad.S
ci. USA) ８２，１５８５−１５８８（１９８５）；Mye
rs ら、ネーチャー(Nature)３１３，４９５−４９７
（１９８５）；およびMyers ら、サイエンス(Science)
２３０，１２４２−１２４６（１９８５）に記載されて
いる。これらの方法は、本文で参考として引用してあ
る。
【００７３】アッセイ 上記に記載の標識プローブ類は、ｐ５３の野生型および
何組かの変異形態を識別可能である。前記プローブ類の
異なる形態に対する応答を比較することによって、確認
することができる。野生型ｐ５３遺伝子およびタンパク
質は公知であり、Matlashewskiら、EMBO J. １３，３２
５７−３２６２（１９８４）；Zakut-Houri ら、EMBO
J. ４，１２５１−１２５５（１９８５）；およびLamb
およびCrawford、モレキュラー・エンド・セルラーバイ
オロジー(Mol. Cell. Biol.)５，１３７９−１３８５
（１９８６）に記載されているような公知の方法によっ
て得ることができる。変異体は、部位特異的変異によっ
て野生型ｐ５３から調製できる。たとえば、Zollerおよ
びSmith,ヌクレイックアシズリサーチ(Nucl.Acids Re
s.) １０，６４８７−６５００（１９８２）；メソッズ
・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymology) １
００，４６８−５００（１９８３）；およびＤＮＡ３，
４７９−４８８（１９８４）によって野生型ｐ５３から
調製できる。
【００７４】野生型および変異ｐ５３構造遺伝子類は、
同様に、重複する二重鎖オリゴヌクレオチド類を調製す
ること、前記ギャップを充填すること、およびこの末端
類を連結すること等のような公知の方法によって合成で
きる。このＤＮＡは、適切な宿主細胞中にクローニング
され、発現できる。このｐ５３ＤＮＡおよびタンパク質
は、前記宿主細胞から回収できる〔全般的に、Sambrook
ら、“モレキュラクローニング(Molecular Clonin
g）”、第２版、コールドスプリングハーバーラボラト
リプレス(Cold Spring Harbor Press)（１９８７）を参
照〕。
【００７５】抗体およびＤＮＡプローブ類を利用するア
ッセイは、当該技術分野で公知の方法に従って行われ
る。本アッセイは、前記プローブ類が野生型ｐ５３に対
して陽性でありかつ変異ｐ５３に対して陰性であること
を試験するように設計することができる。このような場
合オリゴヌクレオチドプローブを使用することが好適で
あり、特異的変異によって影響を受けないであろう。
【００７６】一方、前記プローブ類は、変異ｐ５３に対
する陽性および野生型ｐ５３に対する陰性を試験でき
る。このような場合、タンパク質を検出する抗体類を使
用するのが好適である。抗体プローブ類を優先すること
は、形質転換細胞中に野生型ｐ５３タンパク質よりも変
異ｐ５３タンパク質がより高濃度に存在するためであ
る。
【００７７】少なくとも１組のヒトｐ５３変異体が検出
可能なほどは熱ショックタンパク質ｈｓｃ７０に結合し
ないこと、または、少なくとも野生型ｐ５３よりも有意
に低い緊密さで結合することを見いだしたことは予測外
であった。この組は、アミノ酸２７３位および２８１位
における変異からなる。したがって、この組は、アミノ
酸１４３位および１７５位における変異体からなる組の
ような他の変異体の組とは、いかなる変異が存在するか
を決定することによって、そして、もしそうであれば、
この変異体がｈｓｃ７０に結合するかどうかを決定する
ことによって、識別できる。相対的結合親和性を決定す
る方法は、当該技術分野で公知の方法で行うことができ
る。たとえば、ｐ５３タンパク質がｈｓｃ７０に結合す
るかどうかを決定するための方法は、Finlayらによっ
て、モレキュラー・エンド・セルラーバイオロジー(Mo
l. and Cell. Biol.)８，５３１−５３９（１９８８）
に；またHinds らによってモレキュラー・エンド・セル
バイオロジー(Mol. and CellBiol.)７，２８６３−２８
６９（１９８７）に記載されている。これらの論文に記
載された方法は本文で参考として引用しており、抗ｐ５
３および抗ｈｓｃ７０抗体類との免疫沈降実験を行って
いる。
【００７８】ｈｓｃ７０に特異的な適切な抗体は、Hind
s らの論文（同上）に記載のようにして、たとえば、７
０ｋｄ 熱ショックタンパク質属のｈｓｐ７０のカルボ
キシ末端の２１個のアミノ酸によって免疫されたウサギ
血清から調製できる。Hindsらの論文に記載のようにし
て抗体を調製する方法は、本文で参考として引用してい
る。
【００７９】ｐ９０ 野生型または変異ｐ５３遺伝子がラット胎児線維芽細胞
（ＲＥＦ）細胞中に移入されたとき、このＲＥＦ細胞
は、ｐ５３タンパク質を発現する（上記参照）。ｐ５３
は、公知の方法によって単離かつ精製できる。たとえ
ば、細胞を溶解して、このｐ５３タンパク質の溶液また
は懸濁液にｐ５３に特異的な抗体類を添加することによ
って、ｐ５３タンパク質を免疫沈降させる。免疫沈降物
は、遠心分離によって回収される〔Hinds ら、セルグロ
ース・エンド・ディファレンシエーション(Cell Growth
and Differentiation) １，５７１−５８０（１９９
０）；Finlayら、セル(Cell)５７，１０８３−１０９３
（１９８９）およびHinds ら、モレキュラー・エンド・
セルラーバイオロジー(Molecular and Cellular Biolog
y)７，２８６３−２８６９（１９８７）参照〕。
【００８０】同時免疫沈降は、同様に、ＰＡｂ４２１イ
ムノアフィニティカラムでｐ５３を精製するために適し
た条件を用いて抗体アフィニティカラムによって行うこ
とができる。〔Clarkeら、モレキュラー・エンド・セル
バイオロジー(Molecular andCell Biology)８，１２０
６−１２１５（１９８８）参照〕。
【００８１】上記操作に供したときに、驚くべきことに
このｐ５３タンパク質はｐ９０といわれる分子量９０ｋ
ｄのタンパク質と同時に免疫沈降することが発見され
た。同時免疫沈降のために適切な抗体類は、ＰＡｂ４２
１およびＡｂ２が挙げられる。ＰＡｂ４２１は、ヒト、
マウスおよびラットｐ５３を含むさまざまな種由来ｐ５
３のカルボキシ末端を認識し、Harolwら、ジャーナル・
オブ・ビロロジー(J. Viol.)３９，８６１−８６９（１
９８１）に記載されている。Ａｂ２は、ヒトｐ５３のア
ミノ末端に特異的であり、ニューヨーク州、マンハセッ
ト(Manhassett)、オンコジーンサイエンス(Oncogene Sc
ience)社から入手可能である。このｐ９０タンパク質
は、ｐ５３を発現しないＲＥＦ細胞を同一抗体で同一処
理したときには免疫沈降しない。
【００８２】遠心分離またはカラムからの溶出後、ｐ９
０は、ＳＤＳ ＰＡＧＥによってｐ５３／ｐ９０系から
分離できる。９０ｋｄにおける単一バンドを切りとり配
列決定する。形質転換ラット胎児線維芽細胞から入手し
たｐ９０の部分配列は、ＶＡＱＭＬＬＳＱＥＳＤＤＹＳ
ＱＰＳＴである。
【００８３】ｐ９０を精製するためのもうひとつの方法
は、Aebersold らプロシーディングズ・オブ・ナショナ
ルアカデミーオブサイエンシズ米国(Proc. Natl. Acad.
Sci. USA)８４，６９７０−６９７４（１９８７）に一
般に記載されているものである。ラット以外の哺乳類
は、ラットｐ９０に相同のタンパク質類を有する。タン
パク質は、それが上述の条件下においてｐ５３と同時免
疫沈降するならば、ｐ９０に相同であり、かつ、ｐ９０
と実質的に同一の配列であり、すなわち、少なくとも約
３０％同一で、好適には少なくとも約５０％同一で、そ
してより好適には少なくとも約７５％ラットｐ９０遺伝
子と同一である。
【００８４】このｐ９０タンパク質またはそのホモログ
は、また、Sambrook, Fritsch およびManiatis（編
著）、モレキュラークローニング(Molecular Clonin
g）、ア・ラボラトリマニュアル(A Laboratory Manua
l）、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリ
プレス（１９８９）に記載されているような周知の組換
えＤＮＡ法によって調製できる。簡単に述べれば、この
方法は、前記タンパク質をコードするＤＮＡを提供する
こと；適切な宿主中でこのＤＮＡを増幅するかまたはク
ローニングすること；このＤＮＡを適切な宿主中で発現
させること；および前記タンパク質を採取することを含
む。
【００８５】ＤＮＡの提供 ｐ９０をコードするＤＮＡは、上記で提供された部分ア
ミノ酸配列またはその断片を使用して単離され、１個以
上のオリゴヌクレオチドプローブ類を調製する。前記プ
ローブを標識し、これを用いてゲノムまたはｃＤＮＡ哺
乳類ライブラリーをファージλのような適切なベクター
中でスクリーニングする。スクリーニングしようとする
種由来ｐ５３のＤＮＡとラットｐ５３のそれとの相同性
をハイブリダイゼーション条件決定の際に考慮する。
【００８６】単離したＤＮＡを配列決定し、この配列を
用いてさらにオリゴヌクレオチドプローブ類を調製す
る。この操作を繰り返して、完全読みとり枠が作製され
るまで重複断片類を得る。
【００８７】オリゴヌクレオチドプローブ類によるゲノ
ムＤＮＡのスクリーニング １個のオリゴヌクレオチドプローブが試料中の特異的核
酸分子を認識するかどうかを決定するための方法は、当
該技術分野で公知である。好適には、ターゲット核酸分
子を固定する。前記ターゲット核酸分子にハイブリダイ
ズしたプローブの存在は、試料中における核酸分子の存
在を示唆する。いくつかの適切なスクリーニング方法の
例は、Dallasら、“熱不安定エンテロトキシン産生をコ
ードする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プラスミド決定因子の
特性解析(The Characterizationof an Escherichia Col
i Plasmid Determinant that Encodes for the Product
ion of a Heat-labile Enterotoxin)"、K. N. Timmisお
よびA. Puehler編著、医療、環境および商業上重要なプ
ラスミド類(Plasmids of Medical、Environmental and
Commercial Importance)、エルスビア／ノース・オラン
ダ出版社(Elsevier/North-Holland Publishing Co.) ，
アムステルダム(Amsterdam),１１３−１２２頁（１９７
４）；Grunstein およびHogness 、プロシーディングズ
・オブ・ナショナルアカデミーオブサイエンシズ米国(P
roc. Natl. Acad. Sci. USA)７２，３９６１−３９６５
（１９７５）；Palva ら、米国特許第4,731,325 号、Or
ion-yhtyma, エスプー(Espoo),フィンランド(Finland)
に譲渡；Mullisら、米国特許第4,683,195 号、シータス
(Cetus) 社、エメリビル(Emeryville)，カルフォルニア
(California)に譲渡；Schneider ら、米国特許第4,882,
269 号、プリンストン大学(Princeton University)に譲
渡；および Segev、ＰＣＴ出願ＷＯ ９０／０１０６９
に記載されている。Schneider らの特許およびSegev 出
願は、両方ともにイムクローンシステムズ(ImClone Sys
tems) 社、ニューヨーク州にライセンス許可されてい
る。
【００８８】ＤＮＡ増幅 得られたＤＮＡは、当該技術分野で公知の方法によって
増幅できる。ひとつの適切な方法は、Saiki ら、サイエ
ンス(Science) ２３９，４８７（１９８８）に、Mullis
ら、米国特許第4,683,195 号に、Sambrook, Fritsch お
よびManiatis（編著）、モレキュラークローニング、ア
・ラボラトリマニュアル(Molecular Cloning、A Labora
tory Manual)、第２版、コールドスプリングハーバーラ
ボラトリプレス（１９８９）に記載されているポリメラ
ーゼチェーン反応（ＰＣＲ）法である。λ−ｇｔ１０ま
たはλ−ｇｔ１１特異的オリゴマー類をアンプリファイ
アーとして使用し、λ−ｇｔ１０またはλ−ｇｔ１１ベ
クター中でこのクローン類を増幅することが便利であ
る。
【００８９】ＤＮＡ配列決定 制限断片類を、プラスミドまたはバクテリオファージの
ような適切なベクター中にクローニングし、当該技術分
野で公知の方法で配列決定する。適切な配列決定方法
は、Sangerら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル
アカデミーオブサイエンシズ米国(Proc. Natl. Acad. S
ci. USA)７４，５４６３−５４６７（１９７７）に記載
のジデオキシチェーン法である。配列決定のための適切
なベクター類およびポリメラーゼ類は、公知である。適
切なベクターは、ストラッタジーン(Stratagene)のブル
ースクリプト(Bluescript)ベクターである。適切なポリ
メラーゼは、シークイナーゼ(Sequenase) （米国バイオ
ケミカル(United States Biochemical) 社、クリーブラ
ンド(Cleveland) 、オハイオ州(Ohio)）である。
【００９０】ＤＮＡ発現 本発明のタンパク質をコードするＤＮＡは複製でき、か
つ、広範囲のクローニングおよび発現ベクター中の広範
囲の宿主細胞中に挿入後組換えタンパク質を発現させる
ために使用できる。宿主は、原核生物または真核生物で
ある。ＤＮＡは天然から入手でき、適宜改変できる。遺
伝子類は、また、全体としてまたは部分として合成でき
る。
【００９１】ベクターをスプライスするベクターは、染
色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列類のセグメントか
らなることができる。いくつかの適切な原核クローニン
グベクター類には、ｃｏｌＥ１、ｐＣＲＩ、ｐＢＲ３２
２、ｐＭＢ９、ｐＵＣ、ｐＫＳＭ、およびＲＰ４のよう
な大腸菌(E.coli)由来プラスミド類が挙げられる。真核
生物ベクター類は、同様に、ｆｄ，Ｍ１３および他の線
状１重鎖ＤＮＡファージ類のようなファージＤＮＡの誘
導体が挙げられる。
【００９２】細菌、特に大腸菌(E.coli)中でタンパク質
類を発現するベクター類もまた、公知である。このよう
なベクター類として、ｐＫＫ２３３プラスミド属（また
はプラスミド類のｔａｃ属の全て）、Ｔ７、およびλＰ
L が挙げられる。融合タンパク質類を発現するベクター
類の例として、Dieckmann およびTzagoloff によって、
ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリ(J. Bio
l. Chem.)２６０，１５１３−１５２０（１９８５）に
記載のＰＡＴＨベクター類が挙げられる。ＰＡＴＨベク
ター類はアンスラニル酸合成酵素（ＴｒｐＥ）をコード
するＤＮＡ配列類を含有し、その後にカルボキシ末端に
ポリリンカーが続いている。他の発現ベクター系は、β
−ガラクトシダーゼ（ｐＥＸ）；マルトース結合タンパ
ク質（ｐＭＡＬ）；グルタチオンＳ−トランスフェラー
ゼ（ｐＧＳＴ）に基づいている〔ジーン(Gene)６７，３
１（１９８８）およびペプチドリチーサ(Peptide Resea
rch)３，１６７（１９９０）参照〕。
【００９３】酵母で有用なベクター類も入手可能であ
る。適切な例は、２ｕプラスミドである。
【００９４】哺乳類細胞中で使用するための適切なベク
ター類も、同様に公知である。このようなベクター類と
して、ＳＶ４０、アデノウイルス、レトロウイルス誘導
ＤＮＡ配列類およびプラスミド類およびファージＤＮＡ
の組み合わせ由来ベクター類の周知の誘導体が挙げられ
る。
【００９５】さらに、真核生物発現ベクター類も当該技
術分野で公知である〔例 P. J. SouthernおよびP. Ber
g, J. Mol. Appl. Genet. １，３２７−３４１（１９８
２）；S. Sabramaniら、モレキュラー・エンド・セルラ
ーバイオロジー(Mol. Cell.Biol.)１，８５４−８６４
（１９８１）；R. J. Kaufman およびP.A. Sharp,"モジ
ュラージヒドロ葉酸レダクターゼ相補性ＤＮＡ遺伝子と
同時移入された配列類の増幅と発現(Amplification and
Expression of Sequences Cotransfected with a Modu
lar Dihydrofolate Reductase Complementary DNA Gen
e)"、ジャーナル・オブ・モレキュラーバイオロジー(J.
Mol. Biol.) １５９，６０１−６６４（１９８２）；
S. I. Scahill ら、“チャイニーズハムスター卵巣細胞
中におけるヒト免疫インタフェロンの産物の発現と特性
解析(Expression and Characterization of the Produc
t of a Human Immune Interferon DNA Gene in Chinese
Hamster Ovary Cells) ”、プロシーディングズ・オブ
・ナショナルアカデミーオブサイエンシズ米国(Proc. N
atl. Acad. Sci.USA) ８０，４６５４−４６５９（１９
８３）；G. Urlaub およびL. A. Chasin, プロシーディ
ングズ・オブ・ナショナルアカデミーオブサイエンシズ
米国(Proc. Natl.Acad. Sci. USA）７７，４２１６−４
２２０（１９８０）〕。
【００９６】有用な発現宿主として、周知の原核生物お
よび真核生物細胞類が挙げられる。いくつかの適切な原
核生物宿主として、たとえば、大腸菌(E.coli)ＳＧ−９
３６、大腸菌(E.coli)ＨＢ１０１、大腸菌(E.coli)Ｗ３
１１０、大腸菌(E.coli)×１７７６、大腸菌(E.coli)
Ｘ２２８２、大腸菌(E.coli)ＤＨＩ、および大腸菌(E.c
oli)ＭＲＣ１のような大腸菌(E.coli)、シュードモナス
(Pseudomonas) 、バチルスサブチリス(Bacillus subtil
is) のようなバチラス(Bacillus)、およびストレプトミ
セス(Streptomyces)が挙げられる。適切な真核生物細胞
として、酵母類および他の真菌類、昆虫、ＣＯＳ細胞類
およびＣＨＯ細胞類のような動物細胞類、ヒト細胞類お
よび組織培養植物細胞類が挙げられる。
【００９７】本発明で有用な発現ベクター類には、発現
されるＤＮＡ配列または断片に操作上連結される少なく
とも１個の発現制御配列を含有する。この制御配列は、
クローニングされたＤＮＡ配列の発現のコントロールお
よび制御のためにベクター中に挿入される。有用な発現
制御配列類の例として、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃ
系、ｔｒｃ系、ファージλの腫瘍オペレータおよびプロ
モータ領域類、ｆｄ皮膜タンパク質の制御領域、たとえ
ば３−ホスホグリセレートキナーゼのためのプロモータ
のような酵母の解糖プロモータ類、たとえばＰｈｏ５の
ような酵母酸ホスファターゼのためのプロモータ類、酵
母α交配因子類のプロモータ類、および、例えばＳＶ４
０の初期および後期プロモータ類のようなポリオーマ、
アデノウイルス、レトロウイルス、およびシミアンウイ
ルス由来プロモータ類、および原核または真核細胞類お
よびそれらのウイルス類またはその組み合わせの遺伝子
類発現を制御することが公知の他の配列類が挙げられ
る。
【００９８】融合タンパク質類 前記タンパク質類は、当該技術分野で公知の方法によっ
て精製できる。たとえば、タンパク質全体またはその部
分が融合タンパク質の形態で適当な融合相手とともに発
現できる。この融合相手は、好適には、精製および同定
を促進する。いくつかの有用な融合相手として、β−ガ
ラクトシダーゼ(Gray ら、プロシーディングズ・オブ・
ナショナルアカデミーオブサイエンシズ米国(Proc. Nat
l. Acad.Sci. USA) ７９，６５９８（１９８２））；ｔ
ｒｐＥ(Itakuraら、サイエンス(Science) １９８，１０
５６（１９７７））；プロテインＡ(Uhlenら、ジーン(G
ene)２３，３６９（１９８３））；グルタチオンＳ−ト
ランスフェラーゼ(Johnson；ネーチャー(Nature)３３
８，５８５（１９８９））；Van Etten ら、セル(Cell)
５８，６６９（１９８９））；およびマルトース結合タ
ンパク質(Guan ら、ジーン(Gene)６７，２１−３０（１
９８７））；Maina らジーン(Gene)７４，３６−３７３
（１９８８））；Riggs 、P., Ausebel, F. M.編著、カ
ラントプロトコールズ・イン・モレキュラーバイオロジ
ー(Current Protocolsin Molecular Biology) 、グリー
ン社／ウイレイインタサイエンス(Greene Associates/W
iley Interscience ）、ニューヨーク(New York)（１９
９０）が挙げられる。
【００９９】このような融合タンパク質は、融合相手に
結合する試薬類を用いてアフィニティクロマトグラフィ
によって精製できる。前記試薬は、この融合相手の特異
的リガンドまたは抗体、好適にはモノクローナル抗体で
ある。たとえば、β−ガラクトシダーゼを含有する融合
タンパク質類は、抗β−ガラクトシダーゼ抗体カラムを
用いてアフィニティクロマトグラフィによって精製でき
る（U11man，ジーン(Gene)２９，２７−３１（１９８
４））。同様に、マルトース結合タンパク質を含有する
タンパク質類は架橋アミロース含有カラムを用いるアフ
ィニティクロマトグラフィによって精製できる〔Guan,
欧州特許出願286,239 参照〕。
【０１００】融合タンパク質をコードするＤＮＡは、適
宜、工学処理され、その結果、この融合タンパク質は、
前記タンパク質と融合相手との間に切断可能な部位を含
有する。化学的および酵素的切断可能部位が両方ともに
当該技術分野で公知である。酵素的に切断可能な部位の
適切な例として、コラゲナーゼ(Keil ら、FEBSレターズ
(Letters) ５６，２９２−２９６（１９７５）；エンテ
ロキナーゼ(Hopp ら、バイオテクノロジー(Biotechnolo
gy) ６，１２０４−１２１０（１９８８））；因子Ｘａ
(Nagaiら、メソッズエンザイモロジー(Methods Enzymo
l.)１５３，４６１−４８１（１９８７））；およびト
ロンビン(Eatonら、バイオケミストリ(Biochemistry)２
５，５０５（１９８６））によって特異的に認識されか
つ切断される部位が挙げられる。コラゲナーゼは、プロ
リンおよびＸが中性アミノ酸であるＰｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ
−Ｐｒｏ配列中のＸの間を切断する。エンテロキナーゼ
は、配列Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ中のリジンの
後で切断する。因子Ｘａは、配列Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌ
ｙ−Ａｒｇ中のアルギニンの後で切断する。トロンビン
は、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ配列中でアルギニ
ンおよびグリシンの間で切断する。
【０１０１】特異的な化学切断剤も公知である。たとえ
ば、臭化シアンは、タンパク質中のメチオニン残基を切
断する。
【０１０２】タンパク質類の精製 前記組換えタンパク質類は、当該技術分野で公知の方法
によって精製できる。このような方法として、特異的抗
体類を用いるアフィニティクロマトグラフィが挙げら
る。これとは別に、組換えタンパク質は、イオン交換、
サイズ排除、および疎水的相互作用クロマトグラフィを
用いて当該技術分野で公知の方法を用いて精製できる。
これらおよび他の適切な方法は、Marston 、“大腸菌
(E.coli)中で発現された真核生物タンパク質類の精製(T
he Purification of Eukaryotic Proteins Expressed i
n E.coli)"、ＤＮＡクローニング（DNA Cloning)、D.
M. Glover編著、第３巻、ＩＲＬプレス、英国、１９８
７に記載されている。
【０１０３】ｐ９０は、ｐ５３を同時免疫沈降可能な抗
体類を調製するために使用できる。ｐ５３は沈澱物から
単離され精製できる。抗ｐ９０抗体類は、ポリクローナ
ルでもモノクローナルでもよい。
【０１０４】ポリクローナルおよびモノクローナル抗体
類は、当該技術分野で公知の方法によって調製できる
〔上記およびCampbell、" モノクローナル抗体技術、げ
っ歯類およびヒトハイブリドーマ類のと産生と特性解析
(Monoclonal Antibody Technology 、The Production a
nd Characterization of Rodent and Human Hybridoma
s)"、Burdon編著、ラボラトリテクニークス・イン・バ
イオケミストリ・エンド・モレキュラーバイオロジー(L
aboratory Techniques in Biochemistry and Molecular
Biology) 、第１３巻、エルスビアサイエンス出版社(E
lsevier Science Publishers) 、アムステルダム（１９
８５）を参照〕。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 シェンク，トーマス，イー. アメリカ合衆国 08540 ニュージャージ ー州，プリンストン，マコッシュ サーク ル 87 (72)発明者 フィンレイ，キャシー，エー. アメリカ合衆国 19067 ペンシルバニア 州，ヤードレイ，ベイベリー レーン 660

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 下記の特性を有するタンパク質： ａ．野生型または変異ｐ５３遺伝子を移入されかつ発現
    するラット胎児線維芽細胞からｐ５３およびｐ５３特異
    的抗体類の存在下においてｐ５３とともに同時免疫沈澱
    することができ、 ｂ．野生型または変異ｐ５３遺伝子を発現しないラット
    胎児線維芽細胞からｐ５３とともに同時免疫沈澱するこ
    とができず、 ｃ．ラットｐ９０と３０％−１００％相同である。
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