JP2000078967A - シトロバクタ―属に属する微生物およびそれを用いたシキミ酸の製造方法 - Google Patents
シトロバクタ―属に属する微生物およびそれを用いたシキミ酸の製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】微生物を用いて経済的にシキミ酸を生産する。
【解決手段】シキミ酸を菌体外に分泌する性質を有す
る、シトロバクター属に属する微生物を用いてシキミ酸
を製造する。
る、シトロバクター属に属する微生物を用いてシキミ酸
を製造する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】シキミ酸は、不斉炭素を３個
持つ光学活性体であり、医薬原料などに利用される。
持つ光学活性体であり、医薬原料などに利用される。
【０００２】
【従来の技術】従来シキミ酸は、植物からの抽出、キナ
酸あるいは糖類を原料とした合成（ケミカル レビュー
（Chemical Review） 65 435(1965)）、大腸菌を用いて
発酵で生成させる方法（ジャーナル バイオロジカル
ケミストリー（Journal Biological Chemistry）191 31
5(1951)）などが知られている。
酸あるいは糖類を原料とした合成（ケミカル レビュー
（Chemical Review） 65 435(1965)）、大腸菌を用いて
発酵で生成させる方法（ジャーナル バイオロジカル
ケミストリー（Journal Biological Chemistry）191 31
5(1951)）などが知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】植物からの抽出法は、
植物中のシキミ酸含量が低く、精製が困難である。キナ
酸あるいは糖類を原料とした合成法は、原料価格が高い
こと、さらに合成ステップも長い問題がある。さらに大
腸菌を用いた発酵による生産法は、シキミ酸の蓄積濃度
が低い問題がある。以上の方法はいづれも工業的、経済
的に問題点が多い。
植物中のシキミ酸含量が低く、精製が困難である。キナ
酸あるいは糖類を原料とした合成法は、原料価格が高い
こと、さらに合成ステップも長い問題がある。さらに大
腸菌を用いた発酵による生産法は、シキミ酸の蓄積濃度
が低い問題がある。以上の方法はいづれも工業的、経済
的に問題点が多い。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
点を解決するため、大腸菌以外にシキミ酸を生産する潜
在能力を持つ微生物を探索し、シキミ酸を菌体外に分泌
する微生物を広く検討した結果、シトロバクター属に属
する微生物の変異株がシキミ酸を菌体外に分泌すること
を見い出した。通常の発酵法、すなわち、炭素源および
窒素源などを添加し、微生物が増殖しながら、生産物を
生成する方法で、シキミ酸が菌体外に生成蓄積されるこ
とは当然であるが、さらに通常の発酵法とは異なり、培
養によって得られた菌体または培養物、もしくはそれら
の処理物を用い、事実上微生物の増殖が停止し、酵素反
応のみが行われる条件で、炭素源からシキミ酸を生成
し、菌体外に分泌することも本発明に含まれる。なお菌
体外にシキミ酸を分泌するというのは、培養液の培地中
にシキミ酸を生成すること、すなわち、培養液から遠心
分離あるいは濾過などの方法で微生物を除いた培養上清
中にシキミ酸が生成蓄積されることを示す。
点を解決するため、大腸菌以外にシキミ酸を生産する潜
在能力を持つ微生物を探索し、シキミ酸を菌体外に分泌
する微生物を広く検討した結果、シトロバクター属に属
する微生物の変異株がシキミ酸を菌体外に分泌すること
を見い出した。通常の発酵法、すなわち、炭素源および
窒素源などを添加し、微生物が増殖しながら、生産物を
生成する方法で、シキミ酸が菌体外に生成蓄積されるこ
とは当然であるが、さらに通常の発酵法とは異なり、培
養によって得られた菌体または培養物、もしくはそれら
の処理物を用い、事実上微生物の増殖が停止し、酵素反
応のみが行われる条件で、炭素源からシキミ酸を生成
し、菌体外に分泌することも本発明に含まれる。なお菌
体外にシキミ酸を分泌するというのは、培養液の培地中
にシキミ酸を生成すること、すなわち、培養液から遠心
分離あるいは濾過などの方法で微生物を除いた培養上清
中にシキミ酸が生成蓄積されることを示す。
【０００５】すなわち、本発明は、シキミ酸を菌体外に
分泌する性質を有する、シトロバクター属に属する微生
物および、それを用いたシキミ酸の製造方法である。
分泌する性質を有する、シトロバクター属に属する微生
物および、それを用いたシキミ酸の製造方法である。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明に使用する微生物は、シト
ロバクター属に属する微生物であるならばいずれでもよ
いが、シキミ酸が芳香族アミノ酸生合成系の代謝中間体
であるため、芳香族アミノ酸の生合成が強いものが望ま
しい。
ロバクター属に属する微生物であるならばいずれでもよ
いが、シキミ酸が芳香族アミノ酸生合成系の代謝中間体
であるため、芳香族アミノ酸の生合成が強いものが望ま
しい。
【０００７】また、シトロバクター属に属する微生物
は、生育に芳香族アミノ酸および／またはパラ−アミノ
酸安息香酸を必要とする微生物であることが好ましく、
さらに好ましくは、シトロバクター・フロインディであ
る。
は、生育に芳香族アミノ酸および／またはパラ−アミノ
酸安息香酸を必要とする微生物であることが好ましく、
さらに好ましくは、シトロバクター・フロインディであ
る。
【０００８】本発明で用いられるシキミ酸分泌株の代表
的なものとして、シトロバクター・フロインディ 4AA-
12（FERM BP-６７２２）株があげられる。この変異株は
シトロバクター・フロインディ IFO13545株から5-フル
オロトリプトファン耐性およびo-フルオロフェニルアラ
ニン耐性の性質を獲得して芳香族アミノ酸生産菌となっ
たＯＦＰＲ36-158株を親株として、通常の変異処理方法
によって得られたもので、シキミ酸分泌性の変異株であ
る。
的なものとして、シトロバクター・フロインディ 4AA-
12（FERM BP-６７２２）株があげられる。この変異株は
シトロバクター・フロインディ IFO13545株から5-フル
オロトリプトファン耐性およびo-フルオロフェニルアラ
ニン耐性の性質を獲得して芳香族アミノ酸生産菌となっ
たＯＦＰＲ36-158株を親株として、通常の変異処理方法
によって得られたもので、シキミ酸分泌性の変異株であ
る。
【０００９】変異株の誘導は親株を紫外線照射するか、
あるいは変異誘発剤（例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホン酸
等）で処理した後、公知の方法でシキミ酸分泌性の変異
株を得ることができる。例えば親株を変異誘発処理の
後、天然培地などの良好に生育する寒天培地に生育さ
せ、生育したコロニーを、あらかじめ芳香族アミノ酸４
種類（L-チロシン、L-フェニルアラニン、L-トリプトフ
ァン）およびp-アミノ安息香酸を含んだ最小培地および
これらのアミノ酸とビタミンを含まない最小培地にレプ
リカし、これらのアミノ酸およびビタミンを含んだ最小
培地上でのみ生育したコロニーを取得する。
あるいは変異誘発剤（例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホン酸
等）で処理した後、公知の方法でシキミ酸分泌性の変異
株を得ることができる。例えば親株を変異誘発処理の
後、天然培地などの良好に生育する寒天培地に生育さ
せ、生育したコロニーを、あらかじめ芳香族アミノ酸４
種類（L-チロシン、L-フェニルアラニン、L-トリプトフ
ァン）およびp-アミノ安息香酸を含んだ最小培地および
これらのアミノ酸とビタミンを含まない最小培地にレプ
リカし、これらのアミノ酸およびビタミンを含んだ最小
培地上でのみ生育したコロニーを取得する。
【００１０】本発明の発酵法における培養方法について
説明する。シキミ酸生産用の培地は、炭素源、窒素源、
無機イオンおよび必要に応じてその他の有機微量成分を
含有する通常の培地が使用できる。
説明する。シキミ酸生産用の培地は、炭素源、窒素源、
無機イオンおよび必要に応じてその他の有機微量成分を
含有する通常の培地が使用できる。
【００１１】炭素源としては、グルコース、フラクトー
ス、でんぷんおよびセルロースの加水分解物、糖蜜など
の糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸のごとき有機
酸、メタノール、エタノール、グリセロールのごときア
ルコール類などを１〜１５％、窒素源として、酢酸アン
モニウムのごとき有機アンモニウム塩、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アン
モニウム、のごとき無機アンモニウム塩、アンモニアガ
ス、アンモニア水、尿素等を０．１〜４．０％、有機微
量成分としては、ビオチン等の被要求性物質が０．００
０００１％〜０．１％、また必要に応じて、コーンステ
ィープリカー、ペプトン、酵母エキス等０〜５％をそれ
ぞれ適当に含有する培地が好ましく用いられる。これら
の他に、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カル
シウム、塩化ナトリウム、硫酸銅、硫酸第１鉄、等が微
量成分として添加されるのが好ましい。また好ましくは
消泡剤なども添加し、培養条件の安定化をはかる。
ス、でんぷんおよびセルロースの加水分解物、糖蜜など
の糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸のごとき有機
酸、メタノール、エタノール、グリセロールのごときア
ルコール類などを１〜１５％、窒素源として、酢酸アン
モニウムのごとき有機アンモニウム塩、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アン
モニウム、のごとき無機アンモニウム塩、アンモニアガ
ス、アンモニア水、尿素等を０．１〜４．０％、有機微
量成分としては、ビオチン等の被要求性物質が０．００
０００１％〜０．１％、また必要に応じて、コーンステ
ィープリカー、ペプトン、酵母エキス等０〜５％をそれ
ぞれ適当に含有する培地が好ましく用いられる。これら
の他に、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カル
シウム、塩化ナトリウム、硫酸銅、硫酸第１鉄、等が微
量成分として添加されるのが好ましい。また好ましくは
消泡剤なども添加し、培養条件の安定化をはかる。
【００１２】培養は通常、好気条件で行う。培養の間、
培地のｐＨ３〜８に、温度は２０〜４０℃に調節し、２
４〜１４４時間振とうまたは通気撹拌培養すれば好まし
い結果が得られる。
培地のｐＨ３〜８に、温度は２０〜４０℃に調節し、２
４〜１４４時間振とうまたは通気撹拌培養すれば好まし
い結果が得られる。
【００１３】培養液あるいは反応液からシキミ酸を単離
採取するには公知の方法で可能である。例えば、菌体を
遠心分離などで除去した後、カチオンおよびアニオン交
換樹脂でイオン性の物質を除き、ヘプタノールなどの有
機溶媒で抽出した後濃縮すれば結晶を取得することがで
きる。
採取するには公知の方法で可能である。例えば、菌体を
遠心分離などで除去した後、カチオンおよびアニオン交
換樹脂でイオン性の物質を除き、ヘプタノールなどの有
機溶媒で抽出した後濃縮すれば結晶を取得することがで
きる。
【００１４】
【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。 実施例１ （シキミ酸分泌変異株の分離）シトロバクター・フロイ
ンディＯＦＰＲ３６−１５８の菌体を常法によりＮ−メ
チル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン処理（３
００μg ／ml）、３０℃１０分）した後、この細胞を適
当に希釈し、表１に示した培地に１５g ／l の濃度に寒
天を加えた平板培地に塗布し、３０℃で２日間培養し
た。
る。 実施例１ （シキミ酸分泌変異株の分離）シトロバクター・フロイ
ンディＯＦＰＲ３６−１５８の菌体を常法によりＮ−メ
チル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン処理（３
００μg ／ml）、３０℃１０分）した後、この細胞を適
当に希釈し、表１に示した培地に１５g ／l の濃度に寒
天を加えた平板培地に塗布し、３０℃で２日間培養し
た。
【００１５】表１に示した培地に生育してきた変異処理
したシトロバクター・フロインディＯＦＰＲ３６−１５
８のコロニーを、常法により表２および表３に示した培
地（平板培地）にレプリカし、３０℃で３日間培養し
た。表２の培地では生育せず表３の培地で生育したコロ
ニー（4AA-12株（FERM BP-６７２２））を単離し、シキ
ミ酸生産候補株とした。
したシトロバクター・フロインディＯＦＰＲ３６−１５
８のコロニーを、常法により表２および表３に示した培
地（平板培地）にレプリカし、３０℃で３日間培養し
た。表２の培地では生育せず表３の培地で生育したコロ
ニー（4AA-12株（FERM BP-６７２２））を単離し、シキ
ミ酸生産候補株とした。
【００１６】
【表１】
【００１７】
【表２】
【００１８】
【表３】 実施例２ （発酵法によるシキミ酸分泌変異株の培養およびシキミ
酸の生産）表５に示す菌株をそれぞれ、表１に示した培
地（表１の培地から寒天を除いた液体培地）で３０℃２
４時間振とうして前培養した後、あらかじめ１１５℃１
０分上記滅菌した表４に示した組成の培地５０mlを含む
５００ml溶三角フラスコに植え継ぎ、１８０rpm 、振幅
３０cmの条件下で１４４時間培養した。
酸の生産）表５に示す菌株をそれぞれ、表１に示した培
地（表１の培地から寒天を除いた液体培地）で３０℃２
４時間振とうして前培養した後、あらかじめ１１５℃１
０分上記滅菌した表４に示した組成の培地５０mlを含む
５００ml溶三角フラスコに植え継ぎ、１８０rpm 、振幅
３０cmの条件下で１４４時間培養した。
【００１９】培養終了後、菌体、炭酸カルシウムを除去
したろ液中のシキミ酸濃度を用いたHPLC法（カラム：島
津SCR-101H、移動相：0.1Mリン酸 1 mL/min.、検出：2
54 nm）で定量したところ、表５に示すような結果を得
た。
したろ液中のシキミ酸濃度を用いたHPLC法（カラム：島
津SCR-101H、移動相：0.1Mリン酸 1 mL/min.、検出：2
54 nm）で定量したところ、表５に示すような結果を得
た。
【００２０】
【表４】
【００２１】
【表５】 実施例３ 実施例２での培養液１リットル分の上清をカチオン交換
樹脂リバチットＳ１００（ロームアンドハース社製）に
通液し、その素通り画分をあつめ、さらにアニオン交換
樹脂ダイヤイオンWA30（三菱化学社製）に通液し、0.1N
NaOHで脱着し、シキミ酸を含有する画分をあつめ100mL
に濃縮した。その液をトリドデシルアミン0.3 Mを含むn
-ヘプタノール100mLで３回シキミ酸を抽出し、その後オ
レイン酸を0.15Mになるように添加して水層へ逆抽出し
た。その水溶液を活性炭処理後、濃縮晶析し、さらにエ
タノールで再結晶し、純度９７％以上のシキミ酸結晶２
g を得た。
樹脂リバチットＳ１００（ロームアンドハース社製）に
通液し、その素通り画分をあつめ、さらにアニオン交換
樹脂ダイヤイオンWA30（三菱化学社製）に通液し、0.1N
NaOHで脱着し、シキミ酸を含有する画分をあつめ100mL
に濃縮した。その液をトリドデシルアミン0.3 Mを含むn
-ヘプタノール100mLで３回シキミ酸を抽出し、その後オ
レイン酸を0.15Mになるように添加して水層へ逆抽出し
た。その水溶液を活性炭処理後、濃縮晶析し、さらにエ
タノールで再結晶し、純度９７％以上のシキミ酸結晶２
g を得た。
【００２２】
【発明の効果】本発明の微生物を用い、本発明の方法に
より、既存の方法と比較し、より経済的なシキミ酸の生
産が可能となる。
より、既存の方法と比較し、より経済的なシキミ酸の生
産が可能となる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:01）
Claims (5)
- 【請求項１】シキミ酸を菌体外に分泌する性質を有す
る、シトロバクター属に属する微生物。 - 【請求項２】シトロバクター属に属する微生物が生育に
芳香族アミノ酸および／またはパラ−アミノ酸安息香酸
を必要とする微生物であることを特徴とする請求項１記
載のシトロバクター属に属する微生物。 - 【請求項３】シトロバクター属に属する微生物がシトロ
バクター・フロインディであることを特徴とする請求項
１または２記載のシトロバクター属に属する微生物。 - 【請求項４】請求項１〜３のいずれか１項に記載のシト
ロバクター属に属する微生物を用いたシキミ酸の製造方
法。 - 【請求項５】請求項１〜３のいずれか１項に記載のシト
ロバクター属に属する微生物を培養して培養液中にシキ
ミ酸を蓄積せしめ、該培養液からシキミ酸を単離採取す
ることを特徴とする発酵法によるシキミ酸の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11187552A JP2000078967A (ja) | 1998-07-02 | 1999-07-01 | シトロバクタ―属に属する微生物およびそれを用いたシキミ酸の製造方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18746498 | 1998-07-02 | ||
| JP10-187464 | 1998-07-02 | ||
| JP11187552A JP2000078967A (ja) | 1998-07-02 | 1999-07-01 | シトロバクタ―属に属する微生物およびそれを用いたシキミ酸の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000078967A true JP2000078967A (ja) | 2000-03-21 |
Family
ID=26504361
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11187552A Pending JP2000078967A (ja) | 1998-07-02 | 1999-07-01 | シトロバクタ―属に属する微生物およびそれを用いたシキミ酸の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000078967A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013035473A1 (ja) | 2011-09-07 | 2013-03-14 | 国立大学法人信州大学 | 糸状菌から有用代謝産物を生産する方法 |
| CN114032197A (zh) * | 2021-11-18 | 2022-02-11 | 河南省科学院生物研究所有限责任公司 | 一种Pseudocitrobacter faecalis B3-1及应用 |
-
1999
- 1999-07-01 JP JP11187552A patent/JP2000078967A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013035473A1 (ja) | 2011-09-07 | 2013-03-14 | 国立大学法人信州大学 | 糸状菌から有用代謝産物を生産する方法 |
| US9834796B2 (en) | 2011-09-07 | 2017-12-05 | Shinshu University | Method for producing useful metabolite from filamentous fungus |
| CN114032197A (zh) * | 2021-11-18 | 2022-02-11 | 河南省科学院生物研究所有限责任公司 | 一种Pseudocitrobacter faecalis B3-1及应用 |
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