JP2000069971A - 新規な耐熱性蟻酸脱水素酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 耐熱性蟻酸脱水素酵素を提供すること。 【解決手段】 超好熱性始原菌KOD1株から耐熱性蟻酸脱
水素酵素をコードするDNAを単離し、このDNAを用いて耐
熱性蟻酸脱水素酵素生産宿主細胞を得、そしてこの宿主
細胞を培養する工程を包含する方法により、耐熱性蟻酸
脱水素酵素を生産する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規な耐熱性蟻酸
脱水素酵素およびそれをコードするDNAに関する。

【０００２】

【従来の技術】蟻酸脱水素酵素は、蟻酸イオンをCO₂に
酸化する反応を触媒する酵素である。その反応は式HCOO
^-＋NAD⁺⇔CO₂＋NADHで表される。ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド（NAD；還元型はNADH）は、酸化還元
酵素反応に関与する補酵素の１つである。蟻酸脱水素酵
素は、NAD→NADHの再生に利用され得る。従って、蟻酸
脱水素酵素は、この補酵素を必要とする酵素反応のため
の補酵素の供給のために有用である。例えば、この補酵
素を必要とする酵素反応と、蟻酸脱水素酵素によるNAD
→NADHの再生を組み合わせれば、連続的酵素反応が可能
になる。

【０００３】上記のような利用のためには（特に、反応
が高温で行われる場合には）、従来の常温生物由来の蟻
酸脱水素酵素よりも構造的に安定である新規な蟻酸脱水
素酵素が（特に、長期間の連続的酵素反応のためには）
所望されていた。

【０００４】超好熱始原菌は、高温で生存するので、こ
の微生物が生産するタンパク質（例えば、酵素）は、一
般に高度に耐熱性である（すなわち、構造的に安定であ
る）。さらに、超好熱始原菌が属する始原菌は従来から
知られていた原核生物および真核生物とは異なる生物で
あると提唱されていることからも明らかなように、進化
的にもこれらの生物とは異なる。従って、たとえ原核生
物および真核生物に由来する公知の酵素などと類似の機
能を有していても、超好熱始原菌由来の酵素は、構造的
にも酵素学的にも従来の酵素とは異なる場合が多い。例
えば、超好熱始原菌KOD1株（Morikawa, M.ら、Appl. En
viron. Microbiol. 60(12), 4559-4566(1994)）から単
離されたシャペロニンは、Escherichia coli由来のGroE
Lと同様の機能を有している。しかし、GroELがこれ自体
が14量体を形成し、さらに７量体を形成しているGroES
とともに複合体を形成して機能するのに対し、KOD1株由
来のシャペロニンは単独で機能する（Yan, Zら、Appl.
Environ. Microbiol. 63:785-789）。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、耐熱性蟻酸
脱水素酵素およびそれをコードするDNAを提供するこ
と、このDNAを含むベクターおよびこのベクターを含む
宿主細胞を提供すること、ならびにこの宿主細胞を培養
する工程を包含する耐熱性蟻酸脱水素酵素の生産方法を
提供することをその目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、配列番
号２のアミノ酸配列を含む耐熱性蟻酸脱水素酵素、また
は配列番号２のアミノ酸配列において１もしくは数個の
アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸を含
みかつ蟻酸脱水素酵素活性を有するその改変体が提供さ
れる。

【０００７】本発明によれば、配列番号４のアミノ酸配
列を含む耐熱性蟻酸脱水素酵素、または配列番号４のア
ミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、
置換もしくは付加されたアミノ酸を含みかつ蟻酸脱水素
酵素活性を有するその改変体が提供される。

【０００８】本発明によれば、配列番号２および４のア
ミノ酸配列を含む耐熱性蟻酸脱水素酵素、または配列番
号２および４のアミノ酸配列において１もしくは数個の
アミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸を含
みかつ蟻酸脱水素酵素活性を有するその改変体が提供さ
れる。

【０００９】１つの実施態様において、前記耐熱性蟻酸
脱水素酵素またはその改変体は、超好熱始原菌KOD1株に
由来する。

【００１０】本発明によれば、前記耐熱性蟻酸脱水素酵
素またはその改変体をコードするDNAが提供される。

【００１１】１つの実施態様において、前記DNAは、配
列番号１の１位〜２１３０位のヌクレオチド配列を含
む。

【００１２】１つの実施態様において、前記DNAは、配
列番号３の１位〜４９８位のヌクレオチド配列を含む。

【００１３】１つの実施態様において、前記DNAは、超
好熱始原菌KOD1株に由来する。

【００１４】本発明によれば、前記DNAを含むベクター
が提供される。

【００１５】本発明によれば、前記ベクターを含む組換
え宿主細胞が提供される。

【００１６】本発明によれば、前記宿主細胞を培養する
工程を包含する、耐熱性蟻酸脱水素酵素またはその改変
体の生産方法が提供される。

【００１７】

【発明の実施の形態】本発明は、超好熱始原菌が産生す
る耐熱性蟻酸脱水素酵素を、本来この酵素を生産する超
好熱始原菌を培養することにより、またはこの酵素をコ
ードするDNAを単離し、このDNAを含むベクターを構築
し、このベクターを含む宿主細胞を作製し、そしてこの
宿主細胞培養することによって耐熱性蟻酸脱水素酵素を
産生する方法に関する。

【００１８】蟻酸脱水素酵素は、蟻酸イオンをCO₂に酸
化する反応を触媒する酵素である。その反応は式HCOO^-
＋NAD⁺⇔CO₂＋NADHで表される。ここで、NAD（ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド；還元型はNADH）は、酸
化還元酵素反応に関与する補酵素の１つである。

【００１９】蟻酸脱水素酵素活性は、例えば、電子受容
体としてNADP⁺（340 nm、ε＝6.22×10³）、メチルビオ
ロゲン（600 nm、ε＝1.13×10⁴）、またはベンジルビ
オロゲン（605 nm、ε＝1.47×10⁴）を用いて測定され
る（Andreesen, J.R.ら (1974) J. Bacteriol., 120:6-
14）。

【００２０】公知の蟻酸脱水素酵素には、αサブユニッ
トのみからなるホモ二量体、αおよびβサブユニットか
らなるヘテロ二量体および四量体、ならびにα、β、お
よびγサブユニットからなる十二量体などがある。

【００２１】本発明の蟻酸脱水素酵素は単一または複数
のサブユニットからなり得る。好ましくは、本発明の蟻
酸脱水素酵素は２種類のサブユニットからなる。

【００２２】本発明の耐熱性蟻酸脱水素酵素は、70℃以
上、好ましくは80℃以上、より好ましくは90℃の至適温
度を有する。

【００２３】本発明において使用される超好熱始原菌
は、90℃以上で生育する微生物であると定義される。好
ましくは超好熱始原菌は、耐熱性蟻酸脱水素酵素を産生
する、本発明者らが単離した耐熱性チオールプロテアー
ゼ産生菌KOD1株（Morikawa, M.ら、Appl. Environ. Mic
robiol. 60(12), 4559-4566(1994)）である。KOD1株は
工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されており、
その受託番号はFERM P-15007号である。なお、このKOD1
株は、上記文献に記載されているように、分離された当
初Pyrococcus属に分類されていた。しかし、DNASIS（日
立ソフトウェアーエンジニアリング社製）に入力されて
いるGenBank R91.0 October, 1995＋DailyUpdateの登録
データを用いた16S rRNAの配列の比較を実施したとこ
ろ、KOD1株はPyrococcus属よりはむしろThermococcus属
に近縁であることが示唆されている。

【００２４】本来の本発明の耐熱性蟻酸脱水素酵素を生
産する超好熱始原菌の培養は、例えばAppl. Environ. M
icrobiol. 60(12), 4559-4566(1994)（前出）に記載の
培養条件下で実施し得る。培養は、静置培養または窒素
ガスによる通気撹拌培養のいずれかであり得、そして連
続的または回分的のいずれかであり得る。

【００２５】組換え宿主細胞を培養する条件は、使用さ
れる宿主細胞の種類に依存して適切に選択される。宿主
細胞としては、組換えDNA技術において使用可能な任意
の宿主細胞が使用され得る。これらは例えば、細菌細
胞、酵母細胞、動物細胞、植物細胞および昆虫細胞など
を包含する。好ましい宿主細胞は細菌細胞である。

【００２６】培養後、得られる培養物から当該分野に公
知の方法により本発明の耐熱性蟻酸脱水素酵素を精製し
得る。発現産物が細胞外に分泌される場合は、例えば培
養物を遠心分離またはろ過することによって上清を得、
これを直接精製するかあるいは沈澱法または限外ろ過な
どにより濃縮してから精製する。発現産物が細胞中に蓄
積される場合は、細胞を、細胞壁溶解酵素、浸透圧の変
化、ガラスビーズ、ホモジナイザーまたは超音波処理な
どを用いて破壊して細胞抽出物を得、これを精製する。
精製は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、ア
フィニティークロマトグラフィー、電気泳動などの当該
分野で公知の方法を組み合わせて実施され得る。

【００２７】耐熱性蟻酸脱水素酵素をコードするDNA
は、例えば、超好熱始原菌から染色体DNAを単離し、こ
の染色体DNAを含むライブラリーを作製し、このライブ
ラリーをスクリーニングすることにより取得され得る。

【００２８】超好熱始原菌の染色体DNAは、培養された
細菌細胞を、界面活性剤（例えば、N-ラウリルサルコシ
ン）などを用いて溶解し、得られた溶解物を塩化セシウ
ムエチジウムブロミド平衡密度勾配超遠心分離法などに
より分画して得ることができる（例えば、Imanakaら、
J. Bacteriol. 147:776-786 (1981)を参照のこと）。ラ
イブラリーは、得られた染色体DNAを各種制限酵素で切
断した後、同一の制限酵素または共通の切断末端を与え
る制限酵素で切断したベクター（ファージまたはプラス
ミドなどのような）にT4 DNAリガーゼなどを用いて連結
することにより得ることができる。

【００２９】ライブラリーのスクリーニングは、このラ
イブラリーから目的の耐熱性蟻酸脱水素酵素をコードす
るDNAを含むクローンを選択することにより行い得る。
選択は、例えば、予め決定された耐熱性蟻酸脱水素酵素
の部分アミノ酸配列に基づいて設計されたオリゴヌクレ
オチド、目的のDNAと相同性を有すると推測されるクロ
ーン化DNAなどをプローブとして用いて実施され得る。
あるいは、選択は、目的の酵素を発現させることにより
実施され得る。例えば、発現の検出は、目的の酵素の活
性が容易に検出され得る場合は、プレートに加えられた
基質に対する発現産物の活性を検出することにより、ま
たは目的の酵素に対する抗体が利用可能である場合は、
発現産物と抗体との反応性を利用して実施され得る。

【００３０】得られたクローン化DNAの解析は、例えば
選択されたDNAを単離し、この制限地図を作製するこ
と、およびヌクレオチド配列を決定することなどにより
実施され得る。クローン化DNAの調製、制限酵素処理、
サブクローニング、ヌクレオチド配列の決定などの技術
は当該分野において周知であり、例えば、「Molecular
Cloning: A Laboratory Manual第２版」（Sambrook, Fr
itschおよびManiatis編, Cold Spring Harbor Laborato
ry Press, 1989）に記載されている。

【００３１】次いで、得られたクローン化DNAを、使用
される宿主細胞に適合性の発現ベクター中に作動可能に
挿入し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、形
質転換された宿主細胞を培養することにより、耐熱性蟻
酸脱水素酵素を発現させ得る。

【００３２】本明細書中以下で、本発明を実施例により
詳細に説明する。しかし、本発明はこれらの実施例によ
り限定されない。

【００３３】

【実施例】（実施例１：蟻酸脱水素酵素をコードするDN
Aの単離）KOD1株を、Appl. Environ. Microbiol. 60(1
2), 4559-4566(1994)に記載の0.5×2216マリンブロース
培地（2216マリンブロース：18.7g/L、PIPES 3.48g/L、
CaCl₂・H₂O 0.725g/L、0.4 mL 0.2%レザズリン、475mL人
工海水（NaCl 28.16 g/L、KCl 0.7 g/L、MgCl₂・6H₂O 5.
5 g/L、MgSO₄・7H₂O 6.9 g/L）、蒸留水500 mL、pH7.0）
1,000mlに接種して、２リットルの発酵槽を用いて培養
した。培養に際しては、発酵槽内を窒素ガスで置換し、
同ガスで内圧を0.1Kg/cm²に維持した。培養は、温度85
±１℃にて14時間培養した。なお、培養は静置培養で実
施し、培養中窒素ガスの通気および撹拌は行わなかっ
た。培養終了後、培養液（約1,000ml）を10,000rpmで10
分間遠心分離することにより菌体を回収した。

【００３４】得られた菌体１gを10mlのＡ溶液（50mM Tr
is-HCl、50mM EDTA、pH8.0）に懸濁し、遠心分離（8,00
0rpm、５分間、４℃）により集菌後、３mlの15％ショ糖
を含むＡ溶液に懸濁し、37℃にて30分間保温後、１％Ｎ
-ラウリルサルコシンを含むＡ溶液３mlを添加した。こ
の液にさらに5.4gの塩化セシウムおよび10mg/mlの臭化
エチジウム溶液300μlを添加し、55,000rpm、16時間、1
8℃にて超遠心分離を行い、染色体DNAを分画した。得ら
れた染色体DNA画分からｎ-ブタノール抽出により臭化エ
チジウムを除去後、TE溶液（10mM Tris-HCl（pH8.0）、
0.1mM EDTA）に対して一夜透析し、染色体DNAを得た。

【００３５】各種生物由来の蟻酸脱水素酵素のアミノ酸
配列間で高度に保存された領域のアミノ酸配列を選択し
て設計したプライマー、および上記で調製した染色体DN
Aを使用してPCR反応を実施した。

【００３６】生じたPCR産物をプローブとして使用し
て、以下のKOD1染色体DNAライブラリーをスクリーニン
グした。

【００３７】上記で調製した染色体DNAを制限酵素EcoRI
で部分消化し、次いでT4 DNAリガーゼを用いてファージ
ベクターλEMBL4（Stratagene）と連結した。この連結
混合物をMax Plax^TM Packaging Extract（EPICENTRE T
ECHNOLOGIES）を用いてパッケージングした。

【００３８】このファージライブラリーをEscherichia
coli XL1-Blue MRA(P2)株に感染させ、出現したプラー
クを上記PCRフラグメントをプローブとして使用して常
法によりスクリーニングした（「Molecular Cloning: A
Laboratory Manual第２版」Sambrook, FritschおよびM
aniatis編, Cold Spring Harbor Laboratory Press,198
9）。

【００３９】ポジティブクローン中のフラグメントを、
各種制限酵素での消化および上記プローブを用いるサザ
ンブロッティングによって解析することにより、蟻酸脱
水素酵素をコードする遺伝子の位置を限定した。

【００４０】（実施例２：蟻酸脱水素酵素の配列）実施
例１で得られたフラグメントのヌクレオチド配列を決定
し、29塩基対の非コード配列を介して連続する２つのオ
ープンリーディングフレームの存在を確認した。上流側
の配列を配列番号１にそして下流側の配列を配列番号３
に示す。また、それぞれの推定アミノ酸配列を配列番号
２および４に示す。これら２つの遺伝子をfdhAおよびfd
hBと命名した。

【００４１】これら２つの遺伝子によりコードされる産
物は、蟻酸脱水素酵素の２種類のサブユニットを構成す
ると考えられる。

【００４２】fdhA遺伝子産物が、データベースに登録さ
れている各種蟻酸脱水素酵素のアミノ酸と相同性を示す
ことを表す解析結果を図１に示す。

【００４３】（実施例３：耐熱性蟻酸脱水素酵素の発
現）上記で得られた２つのオープンリーディングフレー
ムによりコードされる蟻酸脱水素酵素をEscherichia co
li内で発現させるために、以下の操作を実施した。fdhA
およびfdhBの両方を含むフラグメントを、それぞれXba
I部位を含むforward

【００４４】primer 1およびBam HI部位を含むreverse
primer 1を用いて増幅し、プラスミドpET21a(+)（Novag
en）に挿入して、プラスミドpET21a/fdhABを得た（図
２）。このプラスミドを用いてEscherichia coli BL21
(DE3)株を形質転換した。

【００４５】出現したアンピシリン耐性形質転換体をア
ンピシリン（50μg/ml）を含有するNZCYM培地（１％NZ
アミン、0.5％ NaCl、0.5％イーストエキス、0.1％カザ
ミノ酸、0.2％MgSO₄・7H₂O（pH7））に接種し、37℃でO
D₆₆₀が0.4になるまで培養し、次いでイソプロピル-β-D
-チオガラクトピラノシド（IPTG、0.1 mM）を添加し、
さらに４時間37℃で培養を継続した。培養終了後、細胞
を遠心分離により回収し、超音波処理により破砕し、こ
れを再度遠心分離することにより細胞抽出液を得た。こ
の細胞抽出液を80℃で15分間加熱し、次いで遠心分離し
て上清を得、これを粗酵素液とした。

【００４６】この粗酵素液の蟻酸脱水素酵素活性を常法
（Andreesen, J.R.ら (1974) J. Bacteriol., 120:6-1
4）に従って測定したところ、蟻酸脱水素酵素活性が確
認された。また、この酵素は、90℃に至適温度を有して
いた（データは示さず）。

【００４７】

【発明の効果】本発明により、耐熱性蟻酸脱水素酵素お
よびそれをコードするDNAが提供される。また、本発明
により、このDNAを含むベクターおよびこのベクターを
含む宿主細胞が提供される。さらに、本発明により、こ
の宿主細胞を培養する工程を包含する耐熱性蟻酸脱水素
酵素の生産方法が提供される。

【００４８】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Imanaka, Tadayuki <120> Novel heat resistant formate dehydrogenase <130> J198432419 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 2138 <212> DNA <213> KOD1 <220> <221> CDS <222> (1)..(2130) <400> 1 ATG GAT GAA AAG CTC GTC CCT GTG GTC TGC CCC TAC TGC GGT GTG GGG 48 Met Asp Glu Lys Leu Val Pro Val Val Cys Pro Tyr Cys Gly Val Gly 1 5 10 15 TGC AGG CTG TAC ATT AGG AGT TCT GAC GGC CAT CCC CTT GGC ATC GAG 96 Cys Arg Leu Tyr Ile Arg Ser Ser Asp Gly His Pro Leu Gly Ile Glu 20 25 30 TAC GCC AAT GAC ATA CCC GGA ATC TCA AAC GAA AAT GGA AAG CTC TGT 144 Tyr Ala Asn Asp Ile Pro Gly Ile Ser Asn Glu Asn Gly Lys Leu Cys 35 40 45 CCC AAG GGC AAC GCC GTT CTT GAG TAC GTC CTC GCC CGG GAC AGG CTT 192 Pro Lys Gly Asn Ala Val Leu Glu Tyr Val Leu Ala Arg Asp Arg Leu 50 55 60 AAG AAG CCA TTA AAG GCG AAG GAG CAA GGC AAG TTC GTC GAG ATA AGC 240 Lys Lys Pro Leu Lys Ala Lys Glu Gln Gly Lys Phe Val Glu Ile Ser 65 70 75 80 TGG AGT CAG GCC ATA AAG GAG GTC GCC GAG AGG CTT AAG GAG TAT TCA 288 Trp Ser Gln Ala Ile Lys Glu Val Ala Glu Arg Leu Lys Glu Tyr Ser 85 90 95 AAG GAC GAT CCG AAT TCA ATG ATG TTC TTC GGC AGT GCA AAA ACT TTC 336 Lys Asp Asp Pro Asn Ser Met Met Phe Phe Gly Ser Ala Lys Thr Phe 100 105 110 AAC GAG CCA AAC TAC CTT ATA CAG AAG CTG GCC AGA ATG CTC GGA ACC 384 Asn Glu Pro Asn Tyr Leu Ile Gln Lys Leu Ala Arg Met Leu Gly Thr 115 120 125 AAC AAC GTT GAT CAC TGC GCG AGA CTC TGC CAT GCA TCA ACA GTT TCC 432 Asn Asn Val Asp His Cys Ala Arg Leu Cys His Ala Ser Thr Val Ser 130 135 140 GGC CTC AAA GCC GTC TTC GGC GCT GGG GCG ATG ACG AAC ACA TAC AGG 480 Gly Leu Lys Ala Val Phe Gly Ala Gly Ala Met Thr Asn Thr Tyr Arg 145 150 155 160 GAC ATT GAA GAG GCG AAC GTT ATC TTC ATC ATC GGC CAC AAC TTC GCC 528 Asp Ile Glu Glu Ala Asn Val Ile Phe Ile Ile Gly His Asn Phe Ala 165 170 175 GAG ACT CAC CCG GTT GGC TTC CGC TAC GTT CTC AAG GCC AAG GAG AGG 576 Glu Thr His Pro Val Gly Phe Arg Tyr Val Leu Lys Ala Lys Glu Arg 180 185 190 GGA GCT AAG GTC ATA GTG GCC GAC CCG CGC TTT ACA AGG ACA GCC TGG 624 Gly Ala Lys Val Ile Val Ala Asp Pro Arg Phe Thr Arg Thr Ala Trp 195 200 205 TTC GCC GAC ATT TAC CTG CAG CAC TAC CCC GGT ACC GAC ATC GCC CTG 672 Phe Ala Asp Ile Tyr Leu Gln His Tyr Pro Gly Thr Asp Ile Ala Leu 210 215 220 ATA AAC GGC CTC ATT CAT GTC ATC ATA GAG GAG AGG CTC TAC GAC GAG 720 Ile Asn Gly Leu Ile His Val Ile Ile Glu Glu Arg Leu Tyr Asp Glu 225 230 235 240 AAG TTC GTC AGG GAG AGG TGC ACG GGC TTC GAT GAA CTC GCC AAG ACC 768 Lys Phe Val Arg Glu Arg Cys Thr Gly Phe Asp Glu Leu Ala Lys Thr 245 250 255 GTT GAG AAG TTC ACT CCC GGG TAC GTC GAG AAG ATA ACC GGC GTT CCA 816 Val Glu Lys Phe Thr Pro Gly Tyr Val Glu Lys Ile Thr Gly Val Pro 260 265 270 GCA GAT CTG ATA GTC CAG GCC GCG AGG ACG TTT GCA ACG GGG GGG AAG 864 Ala Asp Leu Ile Val Gln Ala Ala Arg Thr Phe Ala Thr Gly Gly Lys 275 280 285 GGC GTA ATA ACG TGG GCG ATG GGA ATA ACC CAG CAT ACC CAC GGA CAC 912 Gly Val Ile Thr Trp Ala Met Gly Ile Thr Gln His Thr His Gly His 290 295 300 GAC AAC GTG AGA CTG CTC GCA ACG CTT TCA GCC ATA TGT GGC TAC CAG 960 Asp Asn Val Arg Leu Leu Ala Thr Leu Ser Ala Ile Cys Gly Tyr Gln 305 310 315 320 GGA AGG GAA GGC TGT GGA GTA TCC CCA ATG CGC GGC CAG AAC AAC GTC 1008 Gly Arg Glu Gly Cys Gly Val Ser Pro Met Arg Gly Gln Asn Asn Val 325 330 335 CAG GGA GCC TGC GAC CTT GGA GTA CTT CCA AAC GTC TTC CCC GGC TAC 1056 Gln Gly Ala Cys Asp Leu Gly Val Leu Pro Asn Val Phe Pro Gly Tyr 340 345 350 AAA GCG GTT TCC GAT CCT GAA GGG AGG AAG TTC TTC AAG GAG TTC TGG 1104 Lys Ala Val Ser Asp Pro Glu Gly Arg Lys Phe Phe Lys Glu Phe Trp 355 360 365 GGA ACC GAG CTG AGC GGA GAG GTG GGA CTT ACA GTC ATC GAG GCT GCC 1152 Gly Thr Glu Leu Ser Gly Glu Val Gly Leu Thr Val Ile Glu Ala Ala 370 375 380 CAC GCC ATA GAG AAG GGG AAG GTC AGG GCC TAC TAC GTC ATG GGT GAG 1200 His Ala Ile Glu Lys Gly Lys Val Arg Ala Tyr Tyr Val Met Gly Glu 385 390 395 400 AAC CCT GTC ATA AGC GAT GCT AAC ACC AAC CAC GTC ATC AAG GCC CTC 1248 Asn Pro Val Ile Ser Asp Ala Asn Thr Asn His Val Ile Lys Ala Leu 405 410 415 CAT AAG CTT GAG TTC ATG GTC GTT CAG GAC ATA GTT CCC ACA CCG ACC 1296 His Lys Leu Glu Phe Met Val Val Gln Asp Ile Val Pro Thr Pro Thr 420 425 430 ATG GAG TTC GCG GAC ATA GTT CTC CCG GCT GCG GCT ATG CTT GAG AAC 1344 Met Glu Phe Ala Asp Ile Val Leu Pro Ala Ala Ala Met Leu Glu Asn 435 440 445 GAG GGC TCC CTC ACG AAC ACC GAG AGA AGG GTT CAG TGG AGT TTC CAG 1392 Glu Gly Ser Leu Thr Asn Thr Glu Arg Arg Val Gln Trp Ser Phe Gln 450 455 460 GCG ATC AAC CCG CCG GGG GAG GCG AGG CCG GAC TGG TGG ATA GTC AGT 1440 Ala Ile Asn Pro Pro Gly Glu Ala Arg Pro Asp Trp Trp Ile Val Ser 465 470 475 480 GAG ATA GGC AAG GCC GCT GGC TTC ACA GGA GAC GGG CCG AAG GGC TTC 1488 Glu Ile Gly Lys Ala Ala Gly Phe Thr Gly Asp Gly Pro Lys Gly Phe 485 490 495 AAC TAT TCC GGC CCA GAG GAC ATT CTG CGT GAG GTC AAC GCC TGC ACC 1536 Asn Tyr Ser Gly Pro Glu Asp Ile Leu Arg Glu Val Asn Ala Cys Thr 500 505 510 CCA CAG TAT CGG GGC ATA ACT CCA GAG AGG CTC AAG GCA AAC TTA GCT 1584 Pro Gln Tyr Arg Gly Ile Thr Pro Glu Arg Leu Lys Ala Asn Leu Ala 515 520 525 GGA ATA CAC TGG CCG TGC CCG AGT GAA GAC CAT CCC GGC ACG AGG GTT 1632 Gly Ile His Trp Pro Cys Pro Ser Glu Asp His Pro Gly Thr Arg Val 530 535 540 CTC TAC AAG GAG AGG TTC CTG ACC AGC GAT GGC AAG GCG CAC CTC GCG 1680 Leu Tyr Lys Glu Arg Phe Leu Thr Ser Asp Gly Lys Ala His Leu Ala 545 550 555 560 GCC GTT GAG TAC CGC GGG CCG GCT GAA ACA CCG GAC GAG GAT TAC CCG 1728 Ala Val Glu Tyr Arg Gly Pro Ala Glu Thr Pro Asp Glu Asp Tyr Pro 565 570 575 TTC CTC CTG ACG ACA GTG AGG TAC GTT GGC CAC TAC CAC ACC CTC ACG 1776 Phe Leu Leu Thr Thr Val Arg Tyr Val Gly His Tyr His Thr Leu Thr 580 585 590 ATG ACC GGA AGG AGC AGG GCC CTC GTC AAG AGG TGG CCC GAG CCC CTC 1824 Met Thr Gly Arg Ser Arg Ala Leu Val Lys Arg Trp Pro Glu Pro Leu 595 600 605 GCT GAG ATA CAC CCT GAG GAC GCC GAG AGA CTT GGA ATA AAG ACC GGG 1872 Ala Glu Ile His Pro Glu Asp Ala Glu Arg Leu Gly Ile Lys Thr Gly 610 615 620 GAC TGG GTC AAA ATC GTC ACA AGA AGA GGA GAG TAT CCG ATC AGG GCA 1920 Asp Trp Val Lys Ile Val Thr Arg Arg Gly Glu Tyr Pro Ile Arg Ala 625 630 635 640 AAG GTC ACG AGG ACA GTC AAG AAG GGG GTT ATA GCG GTT CCC TGG CAC 1968 Lys Val Thr Arg Thr Val Lys Lys Gly Val Ile Ala Val Pro Trp His 645 650 655 TGG GGA GCG AAC GTC GTT ACC AAC GAT GCC CTC GAC CCA GTG GCC AAG 2016 Trp Gly Ala Asn Val Val Thr Asn Asp Ala Leu Asp Pro Val Ala Lys 660 665 670 ATT CCG GAG ACC AAG GCC TGC GCC TGC AAA GTC GTC AAG ATT ACG GAG 2064 Ile Pro Glu Thr Lys Ala Cys Ala Cys Lys Val Val Lys Ile Thr Glu 675 680 685 GAA GAG GCC AGG GAG CTC ATG AAG AAG GTA CCT CCC GTT ATA CCA GAG 2112 Glu Glu Ala Arg Glu Leu Met Lys Lys Val Pro Pro Val Ile Pro Glu 690 695 700 ATT GAA ATT GTT AGG GGG TGACCTGA 2138 Ile Glu Ile Val Arg Gly 705 710 <210> 2 <211> 710 <212> PRT <213> KOD1 <400> 2 Met Asp Glu Lys Leu Val Pro Val Val Cys Pro Tyr Cys Gly Val Gly 1 5 10 15 Cys Arg Leu Tyr Ile Arg Ser Ser Asp Gly His Pro Leu Gly Ile Glu 20 25 30 Tyr Ala Asn Asp Ile Pro Gly Ile Ser Asn Glu Asn Gly Lys Leu Cys 35 40 45 Pro Lys Gly Asn Ala Val Leu Glu Tyr Val Leu Ala Arg Asp Arg Leu 50 55 60 Lys Lys Pro Leu Lys Ala Lys Glu Gln Gly Lys Phe Val Glu Ile Ser 65 70 75 80 Trp Ser Gln Ala Ile Lys Glu Val Ala Glu Arg Leu Lys Glu Tyr Ser 85 90 95 Lys Asp Asp Pro Asn Ser Met Met Phe Phe Gly Ser Ala Lys Thr Phe 100 105 110 Asn Glu Pro Asn Tyr Leu Ile Gln Lys Leu Ala Arg Met Leu Gly Thr 115 120 125 Asn Asn Val Asp His Cys Ala Arg Leu Cys His Ala Ser Thr Val Ser 130 135 140 Gly Leu Lys Ala Val Phe Gly Ala Gly Ala Met Thr Asn Thr Tyr Arg 145 150 155 160 Asp Ile Glu Glu Ala Asn Val Ile Phe Ile Ile Gly His Asn Phe Ala 165 170 175 Glu Thr His Pro Val Gly Phe Arg Tyr Val Leu Lys Ala Lys Glu Arg 180 185 190 Gly Ala Lys Val Ile Val AlA Asp Pro Arg Phe Thr Arg Thr Ala Trp 195 200 205 Phe Ala Asp Ile Tyr Leu Gln His Tyr Pro Gly Thr Asp Ile Ala Leu 210 215 220 Ile Asn Gly Leu Ile His Val Ile Ile Glu Glu Arg Leu Tyr Asp Glu 225 230 235 240 Lys Phe Val Arg Glu Arg Cys Thr Gly Phe Asp Glu Leu Ala Lys Thr 245 250 255 Val Glu Lys Phe Thr Pro Gly Tyr Val Glu Lys Ile Thr Gly Val Pro 260 265 270 Ala Asp Leu Ile Val Gln Ala Ala Arg Thr Phe Ala Thr Gly Gly Lys 275 280 285 Gly Val Ile Thr Trp Ala Met Gly Ile Thr Gln His Thr His Gly His 290 295 300 Asp Asn Val Arg Leu Leu Ala Thr Leu Ser Ala Ile Cys Gly Tyr Gln 305 310 315 320 Gly Arg Glu Gly Cys Gly Val Ser Pro Met Arg Gly Gln Asn Asn Val 325 330 335 Gln Gly Ala Cys Asp Leu Gly Val Leu Pro Asn Val Phe Pro Gly Tyr 340 345 350 Lys Ala Val Ser Asp Pro Glu Gly Arg Lys Phe Phe Lys Glu Phe Trp 355 360 365 Gly Thr Glu Leu Ser Gly Glu Val Gly Leu Thr Val Ile Glu Ala Ala 370 375 380 His Ala Ile Glu Lys Gly Lys Val Arg Ala Tyr Tyr Val Met Gly Glu 385 390 395 400 Asn Pro Val Ile Ser Asp Ala Asn Thr Asn His Val Ile Lys Ala Leu 405 410 415 His Lys Leu Glu Phe Met Val Val Gln Asp Ile Val Pro Thr Pro Thr 420 425 430 Met Glu Phe Ala Asp Ile Val Leu Pro Ala Ala Ala Met Leu Glu Asn 435 440 445 Glu Gly Ser Leu Thr Asn Thr Glu Arg Arg Val Gln Trp Ser Phe Gln 450 455 460 Ala Ile Asn Pro Pro Gly Glu Ala Arg Pro Asp Trp Trp Ile Val Ser 465 470 475 480 Glu Ile Gly Lys Ala Ala Gly Phe Thr Gly Asp Gly Pro Lys Gly Phe 485 490 495 Asn Tyr Ser Gly Pro Glu Asp Ile Leu Arg Glu Val Asn Ala Cys Thr 500 505 510 Pro Gln Tyr Arg Gly Ile Thr Pro Glu Arg Leu Lys Ala Asn Leu Ala 515 520 525 Gly Ile His Trp Pro Cys Pro Ser Glu Asp His Pro Gly Thr Arg Val 530 535 540 Leu Tyr Lys Glu Arg Phe Leu Thr Ser Asp Gly Lys Ala His Leu Ala 545 550 555 560 Ala Val Glu Tyr Arg Gly Pro Ala Glu Thr Pro Asp Glu Asp Tyr Pro 565 570 575 Phe Leu Leu Thr Thr Val Arg Tyr Val Gly His Tyr His Thr Leu Thr 580 585 590 Met Thr Gly Arg Ser Arg Ala Leu Val Lys Arg Trp Pro Glu Pro Leu 595 600 605 Ala Glu Ile His Pro Glu Asp Ala Glu Arg Leu Gly Ile Lys Thr Gly 610 615 620 Asp Trp Val Lys Ile Val Thr Arg Arg Gly Glu Tyr Pro Ile Arg Ala 625 630 635 640 Lys Val Thr Arg Thr Val Lys Lys Gly Val Ile Ala Val Pro Trp His 645 650 655 Trp Gly Ala Asn Val Val Thr Asn Asp Ala Leu Asp Pro Val Ala Lys 660 665 670 Ile Pro Glu Thr Lys Ala Cys Ala Cys Lys Val Val Lys Ile Thr Glu 675 680 685 Glu Glu Ala Arg Glu Leu Met Lys Lys Val Pro Pro Val Ile Pro Glu 690 695 700 Ile Glu Ile Val Arg Gly 705 710 <210> 3 <211> 501 <212> DNA <213> KOD1 <220> <221> CDS <222> (1)..(498) <400> 3 ATG GCC AGA AAG ACC GTT TTT ATA GAC TTT TCA AAG TGC ATC GAG TGC 48 Met Ala Arg Lys Thr Val Phe Ile Asp Phe Ser Lys Cys Ile Glu Cys 1 5 10 15 CGC GCC TGT GAG GTA GCC TGC GAG CGC GAA CAC AAC GGA CGA TCA TTC 96 Arg Ala Cys Glu Val Ala Cys Glu Arg Glu His Asn Gly Arg Ser Phe 20 25 30 ATA AAC GTC TTT GAA TGG CAG GAA ATG GCC GCG ATG GCC CTC AAC TGC 144 Ile Asn Val Phe Glu Trp Gln Glu Met Ala Ala Met Ala Leu Asn Cys 35 40 45 CGC CAC TGT GAG AAG GCT CCC TGC CTC GAG GTC TGC CCG ACA AAC GCA 192 Arg His Cys Glu Lys Ala Pro Cys Leu Glu Val Cys Pro Thr Asn Ala 50 55 60 CTC TAT CGC GAT GGG GAT GGA GCA GTT CTG CTC GCC CCC CAG AAG TGC 240 Leu Tyr Arg Asp Gly Asp Gly Ala Val Leu Leu Ala Pro Gln Lys Cys 65 70 75 80 ATT GGC TGT CTG ATG TGT GGA ATC GTG TGC CCC TTT GGA ATA CCA GAG 288 Ile Gly Cys Leu Met Cys Gly Ile Val Cys Pro Phe Gly Ile Pro Glu 85 90 95 CTT GAC TCC CTT GAC AAG ATA ATG ATG AAG TGC GAC CTC TGC GCC CAC 336 Leu Asp Ser Leu Asp Lys Ile Met Met Lys Cys Asp Leu Cys Ala His 100 105 110 AGG AGA GCC GAA GGA AAG CTC CCG GCG TGT GTG GAA ACC TGC CCG ACC 384 Arg Arg Ala Glu Gly Lys Leu Pro Ala Cys Val Glu Thr Cys Pro Thr 115 120 125 GAT GCC CTT CTC TTC GGC GAC TTC AAC GAC ATC CAA AGG ATG AGG AGA 432 Asp Ala Leu Leu Phe Gly Asp Phe Asn Asp Ile Gln Arg Met Arg Arg 130 135 140 CAA AAG TTC ACC GAA AAG GCG ATA GAG ATA GCC AAG AGC GGC GAG AGA 480 Gln Lys Phe Thr Glu Lys Ala Ile Glu Ile Ala Lys Ser Gly Glu Arg 145 150 155 160 ATA CAG TTC AGG GGT GTG TAG 501 Ile Gln Phe Arg Gly Val 165 <210> 4 <211> 166 <212> PRT <213> KOD1 <400> 4 Met Ala Arg Lys Thr Val Phe Ile Asp Phe Ser Lys Cys Ile Glu Cys 1 5 10 15 Arg Ala Cys Glu Val Ala Cys Glu Arg Glu His Asn Gly Arg Ser Phe 20 25 30 Ile Asn Val Phe Glu Trp Gln Glu Met Ala Ala Met Ala Leu Asn Cys 35 40 45 Arg His Cys Glu Lys Ala Pro Cys Leu Glu Val Cys Pro Thr Asn Ala 50 55 60 Leu Tyr Arg Asp Gly Asp Gly Ala Val Leu Leu Ala Pro Gln Lys Cys 65 70 75 80 Ile Gly Cys Leu Met Cys Gly Ile Val Cys Pro Phe Gly Ile Pro Glu 85 90 95 Leu Asp Ser Leu Asp Lys Ile Met Met Lys Cys Asp Leu Cys Ala His 100 105 110 Arg Arg Ala Glu Gly Lys Leu Pro Ala Cys Val Glu Thr Cys Pro Thr 115 120 125 Asp Ala Leu Leu Phe Gly Asp Phe Asn Asp Ile Gln Arg Met Arg Arg 130 135 140 Gln Lys Phe Thr Glu Lys Ala Ile Glu Ile Ala Lys Ser Gly Glu Arg 145 150 155 160 Ile Gln Phe Arg Gly Val 165

【図面の簡単な説明】

【図１】各種蟻酸脱水素酵素間の相同性を示す図であ
る。

【図２】耐熱性蟻酸脱水素酵素の発現ベクターの構築を
示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 江崎 聡 京都府京都市北区上賀茂池端町64 フロー ラル北山 108 Ｆターム(参考） 4B024 BA08 CA03 DA06 EA03 EA04 GA11 HA01 4B050 CC03 DD02 FF03E 4B065 AA01Y AA26X AB01 AC14 BA02 BD01 BD15 CA28

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号２のアミノ酸配列を含む耐熱性
   蟻酸脱水素酵素、または配列番号２のアミノ酸配列にお
   いて１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付
   加されたアミノ酸を含みかつ蟻酸脱水素酵素活性を有す
   るその改変体。
2. 【請求項２】 配列番号４のアミノ酸配列を含む耐熱性
   蟻酸脱水素酵素、または配列番号４のアミノ酸配列にお
   いて１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付
   加されたアミノ酸を含みかつ蟻酸脱水素酵素活性を有す
   るその改変体。
3. 【請求項３】 配列番号２および４のアミノ酸配列を含
   む耐熱性蟻酸脱水素酵素、または配列番号２および４の
   アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠
   失、置換もしくは付加されたアミノ酸を含みかつ蟻酸脱
   水素酵素活性を有するその改変体。
4. 【請求項４】 超好熱始原菌KOD1株に由来する、請求項
   １〜３のいずれかに記載の耐熱性蟻酸脱水素酵素または
   その改変体。
5. 【請求項５】 請求項１に記載の耐熱性蟻酸脱水素酵素
   またはその改変体をコードするDNA。
6. 【請求項６】 請求項２に記載の耐熱性蟻酸脱水素酵素
   またはその改変体をコードするDNA。
7. 【請求項７】 配列番号１の１位〜２１３０位のヌクレ
   オチド配列を含む、請求項５に記載のDNA。
8. 【請求項８】 配列番号３の１位〜４９８位のヌクレオ
   チド配列を含む、請求項６に記載のDNA。
9. 【請求項９】 超好熱始原菌KOD1株に由来する、請求項
   ５〜８のいずれかに記載のDNA。
10. 【請求項１０】 請求項５〜９のいずれかに記載のDNA
    を含むベクター。
11. 【請求項１１】 請求項１０に記載のベクターを含む組
    換え宿主細胞。
12. 【請求項１２】 請求項１１に記載の宿主細胞を培養す
    る工程を包含する、耐熱性蟻酸脱水素酵素またはその改
    変体の生産方法。