JP2000046831A

JP2000046831A - 高用量フック効果を示す側流サンドイッチ免疫検定で分析対象物濃度を測定する方法

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Publication number: JP2000046831A
Application number: JP11207240A
Authority: JP
Inventors: Hai-Hang Kuo; ハイ−ハン・コー; A Merritt Lisa; リサ・エー・メリット
Original assignee: Bayer AG; Bayer Corp
Current assignee: Bayer AG; Bayer Corp
Priority date: 1998-07-27
Filing date: 1999-07-22
Publication date: 2000-02-18
Anticipated expiration: 2019-07-22
Also published as: EP0987551B1; DE69943037D1; EP0987551A2; JP4454071B2; EP0987551A3; CA2269162A1; US6183972B1; AU759407B2; AU4110199A

Abstract

(57)【要約】【課題】サンドイッチ免疫検定でフック効果を防止す
る手段の提供。【解決手段】サンドイッチが形成した別々の捕捉領域
それぞれにおける標識化抗体上の標識からの信号を定量
的に検出して、流体試験媒体中の分析対象物の濃度に対
しユニークである信号パターンを得る工程と、ユニーク
な信号パターンを数学的に合わせて単調用量応答曲線を
作り出して、固定化抗体と分析対象物の第一のエピトー
プとの結合のブロックをファクタから外す工程とを含
む、サンドイッチ免疫検定法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】免疫クロマトグラフィー試験片フォーマッ
トは、目視検出方式を使用する定量的及び半定量的検定
にとってますます一般的になった。このタイプの免疫検
定は、検出すべき分析対象物を含有する疑いのある流体
試料を免疫クロマトグラフィー試験片の適用区域に適用
することを含む。試験片は、流体試験媒体及びその中に
懸濁もしくは溶解した分析対象物が、毛管作用により、
適用区域から、検出可能な信号又はその不在が分析対象
物の有無を示す捕捉区域まで貫流する（flow through）
ことができるマトリックス材料で構成されている。通
常、試験片は、検出すべき分析対象物を、検出可能な標
識を担持するその特異的結合相手と免疫特異的に結合さ
せるための手段を含む。米国特許第４，４４６，２３２
号明細書に開示されている一つのそのような方式では、
試験片は、試験片のうち試料適用区域から下流の区域に
ある、酵素標識された可動性（移動性）の、分析対象物
に対する結合相手を含む。分析対象物が試料中に存在す
るならば、その標識された結合相手と結合して複合体を
形成し、その複合体が試験片に沿って流れて、酵素標識
の存在で色応答を発することができる、酵素標識の基質
を含有する検出区域に達する。試験片は、試料中に十分
な分析対象物が存在しないために分析対象物と結合しな
い標識化結合相手が捕捉され、それにより、検出区域に
達することを妨げられるよう、分析対象物が固定される
別の区域を含む。この技術の多様な変形が発表されてお
り、それらはすべて、試料中の分析対象物の存在又は不
在が、捕捉区域中の標識化結合相手の検出又はその不在
によって決定される、競合特異的結合系を含む。

【０００２】遊離の標識抗体を検出する、上述した免疫
測定検定に代わるものは、捕捉区域が、分析対象物の、
標識抗体が特異性を示すエピトープとは異なるエピトー
プに対する固定化抗体を含有する、いわゆるサンドイッ
チフォーマットである。このフォーマットでは、固定化
抗体と標識化抗体との間に分析対象物を挟んだサンドイ
ッチが形成され、したがって、これは、結合した標識抗
体種を検出する免疫測定検定である。このタイプの免疫
試験片フォーマットは、比較的低濃度の分析対象物の分
析に関してはうまく働くが、高濃度の分析対象物を含有
する流体の分析には限られた用途しかない。この不都合
な作用は、試料中に自由な分析対象物が過剰に存在し、
それが、試験片の捕捉バンド中の固定化抗体との結合を
求めて、試験片のうち捕捉区域から上流の部分での相互
作用によって標識抗体と結合した分析対象物とで競合す
ることによって引き起こされる。この競合の結果、より
少ない分析対象物／標識抗体複合体しか捕捉抗体によっ
て捕捉することができず、したがって、試料中の分析対
象物がより少なかった場合に検出されるであろうよりも
少ない信号しか捕捉区域中で検出されない。このタイプ
の試験片を使用して作成される用量応答曲線は、分析対
象物濃度が固定化捕捉抗体と分析対象物／標識抗体複合
体との相互作用を阻止し始める点まで分析対象物の増加
とともに増大する信号を示す。この点を超えると、試験
流体中の分析対象物の増大が信号の減少をもたらし、そ
の結果、用量応答曲線が、分析対象物の増加とともに減
少する信号を示す。この種の用量応答曲線のスロープ
は、フック効果として知られる、この現象の原因である
フックにいくらか類似している。従来、フック効果が見
られる、又は疑われるとき、結果の妥当性を保証するた
め、流体試料を数希釈度に希釈する。十分な標識化抗体
又は捕捉抗体が検定媒体中に存在するならば、高用量フ
ック効果は起こらないかもしれない。普通、この効果の
存在を立証するためには、完全な用量応答曲線（低濃度
から高濃度の分析対象物）が必要である。したがって、
試料の希釈は一般に、検定がフック効果を示すことを予
期する理由があるときに実施される。本発明の目的は、
効力が試料中の高い分析対象物濃度によって影響され
ず、したがって、高濃度の分析対象物を含有する試料の
希釈又は試料の再検定を要しない、免疫クロマトグラフ
ィー試験片を使用するサンドイッチタイプ検定法を提供
することである。この方法は、少なくとも二つの捕捉バ
ンドと、場合によっては、分析対象物とで複合体を形成
しなかった標識化抗体を拘束し、それにより、捕捉バン
ドの一つにおけるその捕捉を容易にする、標識化抗体の
結合相手が固定されている捕集バンドとを試験片に設け
ることを含む。捕集バンドは、検定法がサンドイッチフ
ォーマットで作用するには必要ないため、場合によって
用いられる。しかし、捕集バンドを含有する試験片を使
用することにより、各試料測定は、より多くの情報を提
供し、それにより、検定の感度及び／又は精度が改善さ
れる。

【０００３】欧州公開特許第０４６２３７６号公報に
は、免疫クロマトグラフィー試験片の捕捉部位及び接合
体捕集部位における信号を検出し、回収部位の信号に対
する捕捉部位の信号の強さによって分析対象物濃度を測
定する手法が開示されている。同じくこれに関連するも
のは、米国特許第５，５６９，６０８号明細書である。

【０００４】同時係属出願（第０８／９００，５８６
号）には、捕捉区域及び捕集区域における検出可能な標
識からの信号を測定し、特定の検定に適した方法で選択
されるアルゴリズム及び多数の信号を使用して最終的な
応答信号を決定して分析対象物濃度の値を提供する、多
数の捕捉及び／又は捕集部位を有する免疫クロマトグラ
フィー試験片を使用する検定が開示されている。

【０００５】本発明は、流体試験媒体中の分析対象物の
濃度を測定する方法である。この方法は、以下の工程を
含む。

【０００６】ａ）分析対象物を含有する疑いのある試験
流体が毛管作用によって貫流することができる多孔質材
料の試験片を提供する工程（試験片は、分析対象物の第
一のエピトープに対して特異的な抗体が固定されている
少なくとも二つの別々の捕捉領域を有している。また、
検出可能な標識を担持し、試験片の、少なくとも二つの
別々の捕捉区域の第一の区域から上流に適用されると、
流体試験媒体とともに試験片を貫流することができる、
分析対象物の第二のエピトープに対して特異的な抗体が
用意されている）。

【０００７】ｂ）流体試験媒体を試験片に適用し、それ
を、標識化抗体を担持する試験片に沿って流れさせ、そ
れにより、別々の捕捉領域中の固定化抗体と接触させる
工程｛流体試験媒体が試験片に沿って流れるとき接触す
る少なくとも第一の別々の捕捉領域中で、固定化抗体と
分析対象物の第一のエピトープとの結合を部分的に妨げ
るのに十分な分析対象物が流体試験媒体中に存在すると
き、流体試験媒体が分析対象物を運んで通過する別々の
捕捉領域中に、固定化抗体と、分析対象物と、標識化抗
体とのサンドイッチ（そのサンドイッチの量は、固定化
抗体の部分的妨害によって制限される）が形成され
る｝。

【０００８】ｃ）サンドイッチが形成した別々の捕捉領
域それぞれにおける標識化抗体上の標識から発される信
号を定量的に検出する工程（これは、流体試験媒体中の
分析対象物の濃度にユニークな信号パターンを提供す
る）。

【０００９】ｄ）ユニークな信号セットを数学的に合わ
せて単調用量応答曲線を生成して、固定化抗体と分析対
象物の第一のエピトープとの結合の妨害をファクタから
外す工程。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明は、まず、流体試料が毛管
作用によって貫流することができるところの試験マトリ
ックスを提供することによって実施される。通常、マト
リックスは、試験流体が水平方向に流れる試験片の形態
にある。マトリックスは、試験流体が垂直方向に上から
下又はその逆に流れることができる積層フォーマットに
組み立てることもできるが、以下の記載は、好ましい試
験片フォーマットを中心に述べる。

【００１１】試験片は、試験流体及びその中に含まれる
分析対象物が毛管作用によって貫流することができ、非
吸収の側流（non-bibulous lateral flow）を支持する
ことができる材料からなることができるいかなるマトリ
ックス材料から調製することもできる。このタイプの流
れは、マトリックス材料が成分の１種以上を吸収するこ
とができる場合に当てはまるであろう１種以上の成分の
優先的保持とは対照的に、液体の溶解又は分散した成分
すべてが実質的に等しい速度かつ比較的弱められない流
れでマトリックス中を運ばれる液流として米国特許第
４，９４３，５２２号明細書に記載されている。そのよ
うな材料の例は、Porex Technologies社から得ることが
できる高密度又は超高分子量ポリエチレンシート材料で
ある。クロマトグラフィー試験片を製造することができ
るマトリックスとして等しく適したものは、吸収性材
料、たとえば紙、ニトロセルロース及びナイロンであ
る。

【００１２】本発明の好ましい実施態様では、領域２
（図１）を有するニトロセルロースの試験片を含む試験
具が提供される。領域２は、検出可能な標識を担持し、
試料を吸収パッドに適用し、それを試験片に沿って領域
２まで流れさせたとき、吸水パッド１に適用された流体
試料中に存在する分析対象物と反応して分析対象物／標
識化結合相手の複合体を形成することができる、分析対
象物に対する可動性の特異的結合相手を含む。領域２で
は、試料中の分析対象物が、分析対象物に特異的な標識
化抗体と結合し、標識化抗体が特異性を示すものとは別
の分析対象物のエピトープに特異的な固定化抗体を含有
する二つ以上の捕捉バンド３′を含有する区域３に流れ
て、一つ以上の捕捉バンドの中で固定化結合相手／分析
対象物／標識化結合相手のサンドイッチを形成する。試
験流体中の分析対象物レベルが低いとき、サンドイッチ
は、干渉なしで、第一の別々の捕捉領域で形成され、標
識化抗体からの信号をさらなる工程なしで読み取ること
ができる。しかし、過剰な分析対象物が存在するとき、
固定化抗体上のいくつかの結合部位のブロックが起こ
り、それにより、第一の捕捉領域におけるサンドイッチ
形成を減らす。この状況で、結合していない分析対象物
−標識化抗体の結合体は、第一の捕捉領域の中を流れ、
第二の捕捉領域で捕捉される。分析対象物濃度が第二の
捕捉領域における結合部位をブロックするのに十分なほ
ど高いとき、分析対象物−標識化抗体の結合体の捕捉
は、第三又はおそらくはその後の捕捉領域で起こる。

【００１３】捕捉バンドの数は一般に、分析対象物の濃
度範囲、各バンド中の固定化抗体の量及び必要な区別の
レベルによって決まる。理論的には、必要であり、試験
片上に十分な空間が利用できる限り、捕捉バンドの数に
制限はない。典型的には、大部分の検定で十分な能力を
提供するため、最大で三つの捕捉バンド３′が試験片の
捕捉領域３に含まれるであろう。標識化抗分析対象物抗
体は、通常、領域２に加えられるが、試料中に存在する
と予想されるすべての分析対象物とで結合体を形成する
のに必要であるよりも過剰には加えられない。過剰な標
識化抗体／分析対象物の結合体は、区域４の捕集バンド
で、標識化抗体の捕集手段、たとえば固定化ＩｇＧによ
って捕捉されるか、中間又は高分析対象物濃度ですべて
が捕捉バンドに結合することもでき、その場合、結合体
は捕捉バンドには達しない。捕集バンドは、検定の内部
対照として働くこともできるし、分析対象物濃度の計算
に関与することもできる。後者の実施態様の場合、より
よい分析対象物測定のために、試験片上に二つ以上の捕
集バンドを有して検定性能を改善することが可能であ
る。試験片は、場合によっては、乾燥させた吸収パッド
５を含んでもよい。このパッドは、試験片を通過する試
験流体の毛管流を促進するための液だめとして働く。パ
ッド中の乾燥剤は、試験片の一番上に達した液体を効果
的に吸収することにより、工程を増強する。

【００１４】分析対象物を含有する流体試料を適用する
ことによって試験片を展開させると、捕捉バンド及び場
合によって使用される捕集バンドの各々中で標識によっ
て発される信号を、たとえば反射分光計の使用によって
定量的に検出して、流体試験媒体中の分析対象物の濃度
にユニークである信号のパターンを得る。次に、この信
号パターンを数学的に合わせて単調な（分析対象物濃度
とともに連続的に上昇する）用量応答曲線を作成する。
この曲線は、検定応答と分析対象物濃度との間に１対１
の関係を設けることによって達成される、固定化抗体と
分析対象物の第一のエピトープとの間の結合のフック効
果ブロックをファクタから外すように作成される。フッ
ク効果によって生じる問題は、二つ以上の分析対象物濃
度から同じ検定応答が生じうるということである。単調
用量応答曲線がこの問題を軽減し、その結果、１回の試
料測定によって明瞭な結果を得ることができる。多数の
捕捉バンドを有するＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）を検
出するための免疫試験片が、Labmedica, April/May 199
0に開示されているが、捕捉バンドからの信号を数学的
に合わせるという提案はない。この参考文献に記載され
た試験片における多数の捕捉バンドは、試験片上の可視
バンドの数に比例する分析対象物濃度レベルを示すため
に使用されると思われる。この検定は、遊離の分析対象
物をブロックすることなく、捕捉区域における分析対象
物−標識化抗体の複合体の逐次的含浸に基づくため、こ
れら多数のバンドは、フック効果が起こる範囲の分析対
象物を測定するようには設計されていない。これは、本
発明における信号パターンの数学的処理と対照的であ
る。この参考文献に記載された免疫試験片とは異なり、
本検定システムは、フック効果が生じるレベルを超える
分析対象物濃度を直接測定するように設計されている。
検定によって発生する信号パターンの数学的処理は、フ
ック効果によって課される制限を超える分析対象物濃度
を評価するための独特なrevenus（単調な用量応答曲
線）を提供する。

【００１５】本発明を実施する好ましい方法では、抗体
標識が所定の波長の光を反射することができ、反射の強
さの検出器を、展開した試験片及び検出器を互いに対し
て動かすための手段、たとえば、試験片が配置され、検
出器の読取りヘッドの下で横方向に動かすことができる
試料テーブルとともに有する反射分光計が得られる。検
出器に対する試験片の位置をマイクロプロセッサによっ
て制御することができ、所望の領域の反射率を測定し、
プログラムされたソフトウェアを使用して合成して単調
用量応答曲線を提供することができるため、この技術
は、正確な定量を提供するのに役立つ。標識に不可欠な
唯一の性質は、それが定量的に検出されうるということ
であるため、他の標識、たとえば放射性同位体及び酵素
が適当である。

【００１６】試験片が三つの捕捉領域及び一つの捕集領
域を含む本発明の好ましい実施態様では、独特な信号パ
ターンは、ｉ）第一の捕捉領域の信号に対する第二及び第三の捕捉
領域の信号の比率を決定する工程と、 ii）二つの比率を、捕集領域からの信号と同じ大きさの
範囲にある数で乗じる工程と、 iii）捕集領域からの信号を、工程iiで導出した二つの
積の和から減じる工程と、によって合わされる。

【００１７】

【実施例】本発明を実施する方法を以下の例によってさ
らに説明する。例Ｉモノクロナールマウス抗Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）
抗体の三つの試験バンド及びポリクロナールロバ抗ヤギ
抗体（ＩｇＧ）の一つの対照バンドを含む側流ニトロセ
ルロース試験片を使用して本発明の多バンド免疫試験片
フォーマットを実証した。試験片は次のようにして調製
した。

【００１８】pH７．０の緩衝液中の既知の濃度の親和力
精製したＣＲＰを含有するＣＲＰ較正基準を、青ラテッ
クス粒子で標識されたポリクロナールヤギ抗ＣＲＰ抗体
０．０４％（w/v）を含有するpH８．２の検定水溶液
０．２％（w/v）ＢＳＡ、０．０５％（w/v）Triton X-1
00、０．７５％（w/v）グリシン、５．８５％（w/v）Ｎ
ａＣｌ及び０．２％（w/v）ＮａＮ₃と混合したのち、そ
れを、ニトロセルロース試験片を含有するカセットにピ
ペットで移すことにより、検定を実施した。５分後、CL
INITEK（登録商標）５０反射分光計を使用して、捕捉バ
ンド及び捕集バンドにおける反射率の変化を測定した。
ΔＲ（ΔＲ＝捕捉（試験）又は捕集（対照）バンド付近
の絶対バックグラウンド反射率読み取り値−試験又は対
照バンドの絶対反射率読取り値）を含む異なるデコード
計算を使用することにより、検定開始後５分で両方の反
射率読取り値を得た。図２及び３に示すような二つの用
量応答曲線を得た。第一の試験バンドの反射率変化から
第一の曲線を導出した。すなわち、デコード１＝第一の
試験バンドのΔＲ。図３の曲線は、すべて三つの捕捉バ
ンド及び捕集バンドからの反射率における変化を利用し
て分析対象物濃度を計算するデータ計算法によって作成
した。すなわち、

【００１９】

【数３】

【００２０】式中、Ｔ１＝第一の捕捉バンドのΔＲＴ２＝第二の捕捉バンドのΔＲＴ３＝第三の捕捉バンドのΔＲＣＬ＝捕集バンドのΔＲ

【００２１】既知の分析対象物濃度に対し、計算したデ
コード値（全検定応答）をプロットし、曲線当てはめに
よって用量応答曲線（図３）を作成した。この曲線は以
下の式によって表される。

【００２２】

【数４】

【００２３】未知の濃度の分析対象物を含有する試験流
体を使用して捕捉バンド及び捕集バンドから得られた検
定応答でこの式を解くことにより、未知の分析対象物濃
度を次のように計算した。

【００２４】

【数５】

【００２５】図２の第一の用量応答曲線によって示すよ
うに、一つのバンドしか読み取られない検定の動的範囲
は、高用量フック効果によって制限される。すなわち、
一定のしきい値を超える分析対象物濃度は、応答信号の
減少のため、試料を希釈せずには測定することができな
い。単一バンド試験とは対照的に、多バンド検定は、１
試験あたり二つ以上の結果を出し、分析対象物濃度レベ
ルごとにユニークなバンド信号パターンを表示する。こ
れらのパターンは、評価のために直接使用することもで
きるし、定量的又は半定量的評価のために、図３の用量
応答曲線のように数値的に表すこともできる。動的範囲
（ダイナミックレンジ）とは、最大検定応答と最小検定
応答との間の範囲である。図３では、動的範囲は約−６
０〜７０である。

【００２６】例II 一つの用量応答曲線による分析対象物測定に加えて、多
バンド検定は、多曲線分析対象物計算の選択肢を提供す
る。この計算方法は、全分析対象物濃度範囲を、多様な
信号の組み合わせから導出される用量応答曲線によって
支配されるいくつかの部分に分割する。これは、指定さ
れた濃度領域の各用量応答曲線のもっとも高感度の部分
を利用し、いかなるレベル（高、中又は低）の分析対象
物をも最小限の誤差で測定することができるように設計
されている。各バンドからの信号に基づくアルゴリズム
を使用して、得られた各検定応答をデータ処理にとって
正しい濃度領域に向ける。

【００２７】二つの用量応答曲線を使用する多曲線分析
対象物計算の例を以下のアルゴリズムによって示す。

【００２８】

【表１】

【００２９】このアルゴリズムは、実験データを比較す
ることによって経験的に導出した。アルゴリズムは、本
発明にしたがって多曲線分析対象物計算を実施する方法
を実証するために設計されている。ステップＣＬ＞８０
？、｜Ｔ１−Ｔ２｜＜３ＣＬ？、Ｔ２＞３ＣＬ？を含む
決定ルーチンが、試料の分析対象物濃度が、図４及び５
に示す用量応答曲線によって支配される二つの領域の境
界であった２５０ng/mlを上回ったか下回ったかを決定
する一つの方法である。デコードは、用量応答曲線に基
づいて分析対象物濃度を計算するために、捕捉及び捕集
バンドの反射率変化から導出される値を表す。デコード
とは、CLINITEK（登録商標）計器によって測定される、
試薬からの色の反射率を表す数である。

【００３０】この実験はまた、既知の分析対象物濃度の
較正基準を使用して実施した。検定応答を、それらの対
応する分析対象物濃度を基準にして二つの群に分割し
た。低い分析対象物濃度（０〜２５０mg/ml）を有する
群の場合、所定のデコード３式デコード３＝Ｃｌによっ
て検定応答を数学的に合わせた。デコード３＝ＣＬの用
量応答曲線を図４に示す。捕捉バンドは濃度範囲の下端
で有意なレベルの区別を示さなかったため、この式は捕
集バンドからの応答のみを含む。そして、既知の分析対
象物濃度に対してデコード値をプロットし、それを使用
して、曲線当てはめによって用量応答曲線を生成した
（図４）。曲線の数式を以下の式によって表した。

【００３１】

【数６】

【００３２】デコード４＝Ｔ１／ＣＬ＋１０_＊Ｔ２／Ｔ
１＋１００_＊Ｔ３／Ｔ１の用量応答曲線を図５に示す。
結果及びデコード値を既知の分析対象物濃度に対してプ
ロットして、曲線当てはめによって用量応答曲線を得
た。そして、いくつかの信号の組み合わせ（デコード計
算）を使用して、異なる分析対象物濃度領域で感度を示
す（分析対象物濃度が変化すると検定応答が有意に変化
する）用量応答曲線の群（たとえば図４及び５）を生成
した。

【００３３】

【数７】

【００３４】を所定のデコード４式と合わせて、

【００３５】

【数８】

【００３６】を得た。

【００３７】次に、この式を、

【００３８】

【数９】

【００３９】に変形し、これを使用して、試料の未知の
分析対象物濃度を測定した。

【００４０】試料を多バンド免疫フォーマットによって
検定するとき、個々のバンドの反射率変化を使用して分
析対象物濃度を推定した。これは、分析対象物評価のた
めの確立された群における適切な用量応答曲線（推定濃
度領域でもっとも高感度であるもの）を示唆するスクリ
ーニングアルゴリズム（経験的又は理論的に開発したも
の）を使用することによって実施される。確立された群
とは、種々の信号組み合わせ（デコード計算）によって
生成され、異なる分析対象物濃度領域で感度を示す、前
段落に記載した用量応答曲線の群である。本例では、確
立された群は、図４及び５に示す用量応答曲線からな
る。スクリーニング過程は、三つの連続決定ステップに
よって達成される。第一のステップでは、捕集バンドの
反射率変化を評価する。８０よりも大きいならば、デコ
ード３式及び図４に示す用量応答曲線を使用して分析対
象物濃度を計算する。８０以下ならば、スクリーニング
過程は第二のステップに続き、第一の捕捉バンドと第二
の捕捉バンドとの反射率変化の差の絶対値を捕捉バンド
の反射率変化×３の積と比較する。前者が後者よりも小
さい（｜Ｔ１−Ｔ２｜＜３ＣＬ）ならば、分析対象物濃
度は、デコード４式及び図５に示す用量応答曲線によ
る。他の場合（｜Ｔ１−Ｔ２｜≧３ＣＬ｜）には、第二
の捕捉バンドの反射率変化が捕集バンドの反射率変化×
３の積よりも大きいかどうかを審査することにより、第
三のスクリーニング工程を実施する。大きいならば（Ｔ
２＞３ＣＬ）、デコード４式を含む数学的方法を分析対
象物評価に使用する。そうでなければ、デコード３式及
びその対応する用量応答曲線を用いる。この方法の利点
は、全分析対象物濃度範囲にわたって高感度の用量応答
曲線を使用することにより、分析対象物測定における誤
差を減らすことにある。単一バンド免疫フォーマット
は、多数の用量応答曲線を生成することができないた
め、この利点を提供することができない。

【００４１】例III これは、一つの捕捉バンドを有する免疫フォーマット
と、多数の捕捉バンドを有する免疫フォーマットとを使
用して分析対象物のサンドイッチ検定を実施する一般化
した例である。一つの捕捉バンドを有する典型的なサン
ドイッチ免疫フォーマットの場合、用量応答曲線は次の
ように確立される。

【００４２】

【表２】

【００４３】式中、式Ｙ＝ｆ（Ｘ）は、曲線当てはめに
よって得られる最良当てはめ用量応答曲線である。

【００４４】本発明は、多数の捕捉バンドを有するサン
ドイッチ免疫フォーマットの使用を含む。既知の分析対
象物濃度の較正基準で検定を実施することにより、二つ
以上の用量応答曲線（捕捉バンドごとに１本）を作成す
る。試料の分析対象物濃度は、それぞれが個々の用量応
答曲線を表す多数の数式を同時に解くことによって計算
される。この複雑な手順を簡素化する一つの方法は、捕
捉バンドの応答と捕集バンドの応答とを所定の式（以
下、デコード式という）によって数学的に合わせて、一
つの捕捉バンドを有する免疫フォーマットの応答に類似
した全検定応答（以下、デコードという）を生成する方
法である。データ処理工程を次のように示す。

【００４５】１）用量応答曲線の確立

【００４６】

【表３】

【００４７】式中、ｇは、Ｙ₁、Ｙ₂、Ｙ₃、……を合わ
せる方法を記載する数学的関数である。

【００４８】

【表４】

【００４９】式中、ｈ＝曲線当てはめによって得られる
最良当てはめ用量応答曲線である。

【００５０】２）未知の分析対象物濃度の計算

【００５１】

【表５】

【００５２】デコード式Ｙ＝ｇ（Ｙ₁、Ｙ₂、Ｙ₃、…
…）と用量応答曲線式ｙ＝ｈ（ｘ）とを合わせると、ｇ
（ｙ₁、ｙ₂、ｙ₃、……）＝ｈ（ｘ）を得ることがで
き、したがって、未知の分析対象物濃度の計算は次のよ
うになる。

【００５３】

【表６】

【００５４】例Ｉ及びIIの両方で、用量応答曲線の確立
及び未知の分析対象物濃度の計算を含むこれらのデータ
処理ステップを踏襲した。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に有用である検定装置を表す図である。

【図２】一つの捕捉バンドしか有しない免疫試験片の反
射率変化を示す用量応答曲線のグラフである。

【図３】本発明にしたがって組み合わされた三つの捕捉
バンド及び一つの捕集バンドを有する免疫試験片の反射
率変化を示す完全用量応答曲線のグラフである。

【図４】多数の数学的方法によって組み合わされた三つ
の捕捉バンド及び一つの捕集バンドを有する免疫試験片
の反射率変化を示す部分的用量応答曲線のグラフであ
る。

【図５】多数の数学的方法によって組み合わされた三つ
の捕捉バンド及び一つの捕集バンドを有する免疫試験片
の反射率変化を示す部分的用量応答曲線のグラフであ
る。

【符号の説明】

１：吸収パッド２：標識化抗体含有バンド３′：別々の捕捉バンド（下から順に、第一、第二及
び第三）４：捕捉領域５：捕集バンド６：吸収パッド

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者リサ・エー・メリットアメリカ合衆国、インデイアナ州、46526、ゴーシェン、ウォータータワー・コート 136

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】流体試験媒体中の分析対象物の濃度を測
定する方法において、ａ）分析対象物を含有する疑いのある試験流体が毛管作
用によって貫流することができる多孔質材料の試験片で
あって、分析対象物の第一のエピトープに対して特異的
な抗体が固定されている少なくとも二つの別々の（dist
inct）捕捉領域と、試験片に対するその適用の際、流体
試験媒体とともに試験片を貫流することができる、分析
対象物の第二のエピトープに対して特異的な標識化抗体
とを有する試験片を提供する工程；ｂ）流体試験媒体を試験片に適用し、それを、標識化抗
体をそれとともに有する試験片に沿って流れさせ、それ
により、別々の捕捉領域中の固定化抗体と接触させ、そ
して、流体が試験片に沿って流れるとき接触する少なく
とも第一の捕捉領域中で、固定化抗体と分析対象物の第
一のエピトープとの結合を部分的にブロックするのに十
分な分析対象物が流体試験媒体中に存在するとき、流体
試験媒体が分析対象物を運んで通過する別々の捕捉領域
中で、固定化抗体と、分析対象物と、標識化抗体とのサ
ンドイッチを形成する工程（そのサンドイッチ形成の量
は、固定化抗体の部分的ブロックによって制限され
る）；ｃ）サンドイッチが形成した別々の捕捉領域それぞれに
おける標識化抗体上の標識からの信号を定量的に検出し
て、流体試験媒体中の分析対象物の濃度に対し特異的
（ユニーク）である信号パターンを得る工程；及びｄ）ユニークな信号パターンを数学的に合わせて単調用
量応答曲線を作り出して、固定化抗体と分析対象物の第
一のエピトープとの結合のブロックをファクタから外す
（factor out）工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】試験片が、標識化抗体の捕集手段が固定
されている少なくとも一つの捕集領域を有する、請求項
１記載の方法。
【請求項３】試験片が、三つの捕捉領域及び一つの捕
集領域を有し、ユニークな信号パターンを、ｉ）第一の捕捉領域の信号に対する第二及び第三の捕捉
領域の信号の比率を決定するステップと、 ii）二つの比率を、捕集領域の信号と同じ大きさの範囲
にある数で乗じるステップと、 iii）捕集領域の信号を、工程iiで得た二つの積の和か
ら減じるステップと、によって合わせる、請求項２記載
の方法。
【請求項４】捕集手段がＩｇＧである、請求項２記載
の方法。
【請求項５】標識化抗体が、所定の波長の光を反射す
ることができる物質で標識されており、試料を適用した
のち捕捉領域及び捕集領域からの反射率（ΔＲ）の変化
を反射分光計によって測定することにより、標識化抗体
からの信号を定量的に検出する、請求項２記載の方法。
【請求項６】試験片上に三つの捕捉領域及び一つの捕
集領域があり、式【数１】（式中、Ｔ１＝第一の捕捉領域のΔＲＴ２＝第二の捕捉領域のΔＲＴ３＝第三の捕捉領域のΔＲＣＬ＝捕集領域のΔＲ）を解くことにより、分析対象物濃度を決定する、請求項
５記載の方法。
【請求項７】試験片上に三つの捕捉領域及び一つの捕
集領域があり、ａ）式【数２】（式中、Ｔ１＝第一の捕捉領域のΔＲＴ２＝第二の捕捉領域のΔＲＴ３＝第三の捕捉領域のΔＲＣＬ＝捕集領域のΔＲ）を解いてデコード値を決定し、ｂ）用量応答曲線上でデコード値を分析対象物濃度に対
してプロットして分析対象物濃度を得ることにより、分
析対象物濃度を決定する、請求項５記載の方法。
【請求項８】全分析対象物濃度範囲が、種々の信号の
組み合わせから導出される複数の用量応答曲線によって
支配される複数の部分に分割されている多曲線計算によ
り、分析対象物濃度を決定する、請求項１記載の方法。
【請求項９】流体試料が尿を含む、請求項１記載の方
法。
【請求項１０】流体試験媒体中の分析対象物の濃度を
測定する方法において、ａ）分析対象物を含有する疑いのある試験流体が貫流す
ることができる多孔質材料の試験片であって、分析対象
物の第一のエピトープに対して特異的な抗体が固定され
ている少なくとも二つの別々の捕捉バンドを有し、捕捉
バンドの上流に、分析対象物の第二のエピトープに対し
て特異的であり、試験片に対するその適用の際、流体試
験媒体とともに試験片を貫流することができる標識化抗
体を有する試験片を提供する工程；ｂ）流体試験媒体を試験片に適用し、それを、標識化抗
体をそれとともに有する試験片に沿って流れさせ、それ
により、捕捉バンド中の固定化抗体と接触させ、そし
て、流体試験媒体が試験片中を流れるとき接触する第一
の捕捉バンド中で、固定化抗体と分析対象物の第一のエ
ピトープとの結合を部分的にブロックするのに十分な分
析対象物が流体試験媒体中に存在するとき、流体試験媒
体が分析対象物を運んで通過する別々の捕捉領域中で、
固定化抗体と、分析対象物と、標識化抗体とのサンドイ
ッチを形成する工程（そのサンドイッチ形成の量は、固
定化抗体の部分的ブロックによって制限される）；ｃ）サンドイッチが形成した別々の捕捉バンドそれぞれ
における標識化抗体上の標識からの信号を定量的に検出
して、流体試験媒体中の分析対象物の濃度に対してユニ
ークである信号パターンを得る工程；ｄ）各捕捉バンドからの信号を数学的に合わせて式Ｙ＝
ｇ（Ｙ₁、Ｙ₂、Ｙ₃、……）（式中、Ｙは、全検定応答
であり、ｇは、Ｙ₁、Ｙ₂、Ｙ₃、……を合わせる方法を
記載する数学的関数であり、各Ｙ₁、Ｙ₂、Ｙ₃、……
は、個々の捕捉バンドそれぞれからの個々の応答であ
る）にする工程；ｅ）Ｘ（Ｘは、既知の分析対象物濃度の較正基準値であ
る）に対するＹのプロットを提供し、式Ｙ＝ｈ（ｘ）
（式中、ｈ＝曲線当てはめによって得られる最適当ては
め用量応答曲線）を解いて用量応答曲線を得ることによ
って最適当てはめ用量応答曲線を生成する工程；及びｆ）捕捉バンドからの結果を数学的に合わせて全検定応
答Ｙ＝ｙ₁＋ｙ₂＋……を得、式Ｙ＝ｈ（Ｘ）を解くこと
によって分析対象物濃度Ｘを計算することによって流体
試料中の分析対象物の濃度を計算する工程を含むことを
特徴とする方法。
【請求項１１】試験片が、二つの捕捉バンドと、標識
化抗体の捕集手段が固定されている一つの捕集領域とを
含み、標識化抗体からの信号を定量的に検出し、式Ｙ＝
ｙ₁＋ｙ₂−ｙ₃（式中、ｙ₁及びｙ₂は、二つの捕捉バン
ドからの信号であり、ｙ₃は、捕集領域からの信号であ
る）を解くことによってＹを決定する、請求項１０記載
の方法。