ITUD20010114A1 - Metodo per la distribuzione di liquidi contenenti molecole in soluzione e per la deposizione di tali molecole su supporti solidi, e relativ - Google Patents

Description

Descrizione del trovato avente per titolo:

"METODO PER LA DISTRIBUZIONE DI LIQUIDI CONTENENTI MOLECOLE IN SOLUZIONE E PER LA DEPOSIZIONE DI TALI MOLECOLE SU SUPPORTI SOLIDI, E RELATIVO DISPOSITIVO"

CAMPO DI APPLICAZIONE

La presente invenzione si riferisce ad un metodo per il trasferimento di liquidi contenenti molecole in soluzione, e per la deposizione di queste ultime in modo ordinato su un supporto solido, per uso in saggi immunologici o di ibridazione di acidi nucleici, od in generale di interazione di molecole a scopo diagnostico e di ricerca.

L'invenzione si riferisce anche a dispositivi idonei a realizzare tale metodo.

Il trovato si applica in particolare, anche se non esclusivamente, per molecole costituite da polimeri di interesse biologico, nel seguito denominate in generale biomolecole.

STATO DELLA TECNICA

Sono noti numerosi sistemi per la disposizione in forma ordinata di campioni di molecole e biomolecole .

La tecnologia è particolarmente sviluppata per gli acidi nucleici (si veda, ad esempio, Brown, P.O. and D .Botstein .1999. Exploring thè new world of thè genome with DNA microarrays. Nature Genetics . Suoolement 21: 33-37) , ma trova applicazione anche per proteine ed altri tipi di biomolecole (MacBeath, G.S.L.Schreiber 2000. "Printing proteins as microarrays for high-throughput function determinatìon" , Science 289: 1760-1763).

Nella sua forma più semplice, la deposizione viene realizzata con un sistema di guida dei lìquidi ed una membrana in materiale poroso, tipicamente nitrocellulosa o nylon. Questo sistema è chiamato "dot-blot" se il sistema di guida è formato da canali a sezione circolare, oppure "slot-blot" quando la sezione dei canali è ovalizzata.

Nel "dot-blot", il sistema di guida è costituito da una piastra forata, in materiale acrilico, sotto la quale viene posta la membrana porosa. Esercitando una modesta depressione sotto alla membrana con un sistema di pompaggio a vuoto, una soluzione contenente biomolecole che venga applicata sulla membrana attraverso il foro viene indotta ad attraversare la membrana stessa. Questa funge da filtro trattenendo le biomolecole nelle sue maglie in corrispondenza della superficie definita dall'apertura del foro. In seguito, le biomolecole si fissano irreversibilmente al substrato con un trattamento fisico della membrana.

La disposizione del prodotto finale dipenderà quindi dalla struttura della piastra guida: il formato standard consta di 96 punti ordinati secondo una matrice di 12 per 8 in uno spazio di circa 75 X 110 mm.

L'utilizzo tradizionale di questo sistema implica l'immobilizzazione sul supporto solido dei campioni oggetto di indagine (detti "targete"). Questi vengono saggiati tramite ibridazione (od altro tipo di interazione molecolare) con una biomolecola sonda dalle caratteristiche predeterminate (detta "probe"), marcata in modo da permettere la successiva determinazione dei campioni riconosciuti. Più recentemente si è affermata una variante del sistema descritto che implica l'immobilizzazione non dei campioni da analizzare ma di diverse sonde, che vengono successivamente fatte interagire con un campione, preventivamente adeguatamente marcato, da analizzare. In questo contesto, il supporto solido comprendente i diversi "probes" in disposizione ordinata viene detto "array" . Per l'analisi e la comparazione di diversi campioni è necessario disporre di "arrays" tra loro identici, uno per ogni campione da analizzare.

Principalmente, l'utilizzo degli arrays comprende, nelle applicazioni con acidi nucleici, l'analisi genetica dei polimorfismi a scopo diagnostico, l'esame dell'espressione genica; nelle applicazioni per le proteine, lo studio delle interazioni proteina-proteina e antigene-anticorpo; nelle applicazioni relative a molecole sintetiche, lo screening di prodotti di sintesi.

La produzione di "arrays" può avvenire con la stessa tecnologia descritta per il "dot-blot", cioè per filtrazione, assistita da vuoto, attraverso una membrana porosa. Questa procedura viene chiamata "reverse dot-blot" e gli arrays prodotti vengono generalmente denominati "macroarrays" .

In questo caso, però, la densità dei punti risulta modesta e solo un numero molto limitato di "arrays" può essere prodotto contemporaneamente, in quanto ogni membrana deve essere individualmente montata sul sistema di guida e di vuoto. Sono stati sperimentati sistemi che non necessitano di vuoto, ma la riproducibilità dei trasferimenti è risultata modesta .

Recentemente si è cominciata ad esplorare la possibilità di ottenere densità degli elementi più elevate inglobando oligonucleotidi in gel di poliacri lammide depositato su vetro. Più recentemente si è sviluppata una tecnologia per la produzione di arrays ad elevata densità, detti "microarrays ", con l'utilizzo di materiali di supporto non porosi.

I "microarrays" consistono normalmente in supporti di vetro (quali vetrini per microscopia) o di materiale plastico, opportunamente trattati, sui quali vengono deposte ordinatamente piccole quantità di soluzioni contenenti biopolimeri, prevalentemente acidi nucleici o proteine. Le superfici dei supporti e/o i biopolimeri, a seconda del protocollo, sono preventivamente trattate in modo da reagire producendo il legame delle biomolecole al supporto.

Per contenere le dimensioni, la densità dei punti della griglia deve essere elevata e questo viene ottenuto depositando con precisione quantità molto ridotte di soluzione di acidi nucleici. Tipicamente, un "microarray" viene prodotto depositando gocce di soluzione di circa 5-10 nanolitri (ni) ad una distanza di 100-300 μm l'una dall'altra.

Questa operazione viene condotta da uno strumento robotizzato ad elevata precisione che preleva una quantità di soluzione madre e la distribuisce depositandola su ognuno dei supporti nella determinata posizione.

Poiché la precisione deve essere molto elevata ed i volumi trattati estremamente piccoli, il dispositivo utilizzato per depositare il liquido è estremamente critico. Sono state implementate diverse modalità costruttive basate su diversi principi fisici, allo scopo di ottenere precise e riproducibili deposizioni di volumi molto piccoli; i sistemi si distinguono principalmente in quelli che agiscono attraverso il contatto dello strumento con il substrato ed in quelli che spruzzano il campione sul substrato senza entrare in contatto con esso. Per esempi di tali implementazioni si veda, ad esempio, Granjeaud S., Bertucci F., Jordan B.R. 1999 "Expression profiling: DNA arrays in many guises" BioEssavs 21: 781-790.

Indipendentemente dalla tipologia del meccanismo utilizzato per la deposizione dei campioni, la tecnologia descritta ed attualmente prevalente prevede che l'elemento distributore visiti individualmente tutti i punti di tutti gli arrays. Il numero di movimenti che il braccio meccanico del robot deve effettuare è quindi assai elevato e, dovendo essere completato in tempi compatibili con l'efficienza del processo e per evitare la degradazione delle biomolecole, non permette, anche con un'alta velocità della macchina, di ottenere normalmente più di un centinaio di arrays contemporaneamente, ognuno consistente in 50÷10.000 punti .

E' stato sviluppato (Stimpson D.I., P.W.Cooley, S.M.Knepper e D.B.Wallace, 1998 "Parallel production of oligonucleotide arrays using membranes and reagent jet printing" Biotechniaues 25: 886-890 ) un sistema parallelo per la produzione di arrays di composti chimici. In questa procedura, bastoncini o fogli di materiale poroso vengono impregnati con i diversi composti chimici, quindi assemblati a formare un fascio che viene poi tagliato in fette sottili corrispondenti agli arrays.

In alternativa alla deposizione su un substrato di campioni di molecole pre-esistenti , è stata sviluppata (Lipshutz R.J., S.P.A. Fodor, T.R.Gingeras, D.J.Lockart, 1999 "High densi ty syntetic oligonucleotide arrays" Nature Gene tics Supplement 21: 20-24) una metodologia per la sintesi di oligonucleotidi su un substrato solido usando tecniche fotolitografiche, la quale comporta la produzione di arrays ad altissima densità denominati "DNA chips" . Tale tecnologia, tuttavia, non comprende la distribuzione e deposizione di molecole finite in soluzione, ma la loro sintesi in situ.

La Richiedente, per risolvere gli inconvenienti della tecnica nota ed ottenere ulteriori vantaggi, ha studiato, progettato e realizzato la presente invenzione .

ESPOSIZIONE DELL'INVENZIONE

La presente invenzione è espressa e caratterizzata nelle rivendicazioni principali, altre caratteristiche innovative sono espresse nelle rivendicazioni secondarie.

Scopo dell'invenzione è quello di ottenere una forte riduzione dei costi di produzione degli arrays grazie all 'utilizzo di una tecnologia di deposizione parallela in sostituzione della tecnologia sequenziale attualmente usata.

Con questa terminologia si intende che gli arrays non vengono prodotti depositando lo stesso campione su tutti i singoli supporti con operazioni indipendenti, ma si realizza invece la deposizione di uno specifico campione su tutti i supporti con una singola operazione. Il volume di campione depositato sarà proporzionale al numero di arrays che si vogliono costruire.

In questo modo, si diminuiscono significativamente i movimenti necessari alla macchina per completare il lavoro di deposizione dei campioni e si aumenta significativamente il volume che deve essere manipolato.

In accordo con tali scopi, l'invenzione prevede di utilizzare dei supporti dotati di fori passanti sulla loro superficie, di sovrapporre fra loro un numero voluto di tali supporti (almeno due) allineando i relativi fori passanti, e di distribuire il campione di liquido contenente le molecole o biomolecole in soluzione utilizzando la superficie interna di tali fori quale sito di deposizione, localizzazione e fissaggio dei campioni.

In una soluzione preferenziale, tali supporti sono del tipo a piastra sostanzialmente piana.

I fori allineati dei supporti fra loro sovrapposti formano pertanto un canale di contenimento che rimane aperto nella sua parte superiore e viene chiuso, nella sua parte inferiore, da mezzi di chiusura, vantaggiosamente realizzati in materiale idrofobico .

Due strutture rigide adeguatamente forate, poste rispettivamente sopra il supporto superiore e sotto i mezzi di chiusura, mantengono allineato e saldamente chiuso l'insieme. Tale insieme verrà denominato, nel seguito della descrizione, "sandwich di distribuzione" .

In una soluzione del'invenzione, viene prevista l'applicazione di un pompaggio a vuoto dal sotto ed attraverso i mezzi di chiusura al fine di assicurare il perfetto riempimento del relativo canale di contenimento con una soluzione liquida contenente le biomolecole; grazie all'applicazione del vuoto, l'aria attraversa i mezzi di chiusura ed il liquido forma una colonna perfetta nel relativo canale di contenimento. Quando il canale è riempito, l'applicazione del vuoto viene sospesa ed il canale viene sigillato per permettere il legame delle bìomolecole al substrato.

Avvenuto il legame stabile delle biomolecole sulle pareti dei fori, i supporti vengono separati fra loro in modo che ciascuno di essi presenti, associato alla parete del relativo foro, uno specifico campione di biomolecola da utilizzare in modo indipendente per saggi immunologici , di ibridazione di acidi nucleici, o più in generale a scopo diagnostico e di ricerca.

Utilizzando un numero di supporti che può variare in modo sostanzialmente illimitato si vede come l'invenzione permetta di formare, con una ridotta movimentazione di liquidi, un numero potenzialmente molto elevato di "arrays" identici anche complessi.

Esiste un'ampia varietà di materiali utilizzabili per la realizzazione dei supporti e delle metodologie idonee a produrre il legame agli stessi delle biomolecole.

In una soluzione del trovato, il legame delle biomolecole alla parete dei fori avviene per adsorbimento .

In un'altra soluzione, tale legame è di tipo covalente, e si ottiene utilizzando idonei materiali per la realizzazione dei supporti e/o idonee modifiche delle biomolecole.

In una prima soluzione, il materiale di supporto è costituito in materiale plastico, come ad esempio policarbonato o polis tirene, le biomolecole da depositare sono proteine, e il legame avviene per adsorbimento .

Per polistirene si intendono anche suoi derivati quali stirene/di vinil benzene, stirene/butadiene, stirene/vinil benzil cloruro.

In altre soluzioni, il materiale plastico può essere costituito da nylon o da nitrocellulosa.

Secondo una variante, il materiale di supporto è costituito da policarbonato o polistirene, le biomolecole da depositare consistono in acidi nucleici con una coda di poly-T o di hexadeoxyadenosine e il legame avviene per adsorbimento. Secondo un'altra variante, il materiale di supporto è costituito da policarbonato o polistirene, le biomolecole da depositare consistono in acidi nucleici modificati con biotina e il legame avviene tramite un ponte di streptavidina .

In un'altra variante ancora, il materiale di supporto è costituito da polistirene chimicamente modificato o da resina modificata con linkers terminanti con un gruppo amminico secondario (ad esempio superfici tipo CovaLink™ e NucleoLink™ della Nunc), le biomolecole da depositare consistono in acidi nucleici fosforilati alla loro estremità 5' ed il legame avviene per condensazione carbodiimidica ed è covalente.

In un'altra variante, il supporto è costituito da materiale a base di silicio o suo composto (ossido, nitruro, vetro di vario tipo), trattato adeguatamente ( "epoxy-silanized glass" o "mercaptosilanized glass" o "amino-propyl- silanized glass") e le biomolecole sono acidi nucleici modificati con gruppi amminici o tiolici all'estremità 3' o 5'.

In un'altra variante, il supporto è costituito da materiale plastico (ad esempio polistirene) o a base di silicio (ad esempio vetro), trattato adeguatamente in modo da supportare un film di poly-L-Lysina sulla superficie di adesione e le biomolecole sono acidi nucleici modificati con gruppi amminici o sulfidrilicì all'estremità 3' o 5' .

Secondo altre varianti di realizzazione, il supporto può essere realizzato in grafite vetrosa, oppure in grafite. Secondo un'ulteriore variante, il supporto è realizzato in vetro silanizzato.

Il materiale di cui è composto il supporto può essere modificato con gruppi funzionali reattivi, legati a tale materiale tramite una molecola linker. Tali gruppi funzionali possono essere di tipo amminico, mercapto, tiolo, alchile o carbossile.

Il fatto che il liquido contenente il campione venga deposto internamente al foro di un supporto, e non sulla superficie, ha diverse conseguenze estremamente rilevanti per le applicazioni pratiche. L'area disponibile per l'interazione tra supporto e biomolecola all'interno di un foro risulta maggiore a quella di una superficie planare dello stesso diametro quando lo spessore del materiale è superiore alla metà del raggio della sezione. Questo significa che, in un materiale dallo spessore di 0,25 mm, l'area interna al foro è maggiore di quella superficiale quando il diametro è inferiore ad 1 mm. Nel caso di diametri di 0,2-0, 3 mm (tipici nei microarrays) , l'area interna al foro è da 2 a 5 volte maggiore di quella della sezione superficiale, usando un materiale di spessore pari a 0,125÷0,25 mm. I fori di numerosi supporti indipendenti sovrapposti costituiscono altrettanti canali, ognuno dei quali può essere riempito con un'unica dose di liquido. Si ottengono quindi i seguenti vantaggi: - la quantità di liquido che deve essere gestita dal sistema di distribuzione dei liquidi in una singola operazione non è la quantità necessaria per servire un singolo elemento di un singolo supporto, ma quella corrispondente ad un singolo elemento moltiplicato per il numero di supporti.

Nel caso di produzione di arrays su materiale di spessore 0,25 mm con fori di raggio 0,3 mm, ogni foro di ogni supporto ha un volume di circa 70 nl. Nella produzione di 100÷1000 arrays, i volumi dei singoli trasferimenti di liquidi saranno pari a 7÷70 μl, cioè volumi che possono essere trattati con strumenti manuali o con strumenti automatici di tipo convenzionale caratterizzati da un basso livello di criticità .

- Il numero di movimenti che una macchina deve compiere per servire tutti i punti non è pari al numero dei campioni da trasferire (elementi) moltiplicato per il numero dei supporti, ma al solo numero degli elementi. Questa caratteristica rende estremamente conveniente la produzione di arrays con pochi elementi. Per esempio la produzione dì 1000 arrays di 500 elementi richiede 500 movimenti per distribuire il liquido invece di 500.000; la produzione di 100 arrays di 30 elementi richiede 30 movimenti e può essere agevolmente portata a termine con pipette di distribuzione manuali.

- La dose che viene a contatto con la superficie legante non dipende dal volume trasferito ma dal volume del foro. Quindi, ognuno dei supporti riceve la stessa dose anche in assenza di elevata precisione della macchina distributrice.

- Poiché la superficie superiore della pila di supporti non è interessata dall 'interazione tra supporto e biomolecola, è possibile sovrapporre ai supporti un adeguato dispositivo a forma di imbuto idoneo a concentrare il liquido negli esatti punti di foratura, offrendo nel contempo una superficie più ampia per la deposizione del campione da parte della macchina. In questo modo, si riduce la precisione necessaria per la deposizione del campione, che può quindi essere effettuata manualmente o con l'ausilio di un convenzionale robot dotato di pipette (per esempio i modelli più economici della serie Biomek® della Beckman Coulter, Ine.) anche per le applicazioni che richiedono alta densità degli elementi.

Poiché la disposizione dei campioni di liquido non è planare, si riducono al minimo i fenomeni di interferenza reciproca (per esempio in caso di rilevazione del segnale con mezzi chemiluminescenti o elettrochemiluminescenti o fluorescenti) .

La determinazione del prodotto finale è resa meno critica quando il prodotto viene sviluppato all'interno di un foro. Per esempio, nel caso degli acidi nucleici, gli arrays possono essere ibridati con una sonda marcata, direttamente o indirettamente, con un enzima. Al termine dell'ibridazione, gli arrays vengono messi a contatto con una sostanza che funge da substrato per l'enzima, producendo una reazione colorimetrica o chemi luminescente . Nel caso in cui si applichi la reazione chemiluminescente, si possono utilizzare arrays prodotti in materiale nero (ad esempio policarbonato nero tipo Lexan® FR 700-701) , limitando in tal modo l'interferenza tra l'emissione di luce di un elemento e quella degli elementi adiacenti ed ottenendo una risoluzione spaziale migliore di quanto non sia possibile ottenere quando gli elementi emettenti luce giacciono su un piano. Per la disposizione e l'entità dei volumi caratteristici di questa tecnologia, essa si presta ad essere integrata in un sistema che comprende il trasferimento di liquidi secondo un analogo principio .

Per queste caratteristiche la presente invenzione si presta ad essere integrata in sistemi di rivelazione del segnale che accoppino l'uso di metodi chemiluminescenti ad alta sensibilità (ad esempio con acetate kinase) con sistemi di determinazione del segnale allo stato solido, permettendo lo sviluppo di sistemi integrati economici ma dalle elevate prestazioni.

ILLUSTRAZIONE DEI DISEGNI

Queste ed altre caratteristiche della presente invenzione saranno chiare dalla seguente descrizione di una forma preferenziale di realizzazione, fornita a titolo esemplificativo, non limitativo, con riferimento agli annessi disegni, in cui:

- la fig. la illustra schematicamente, in esploso, il principio di base utilizzato nel metodo secondo l'invenzione;

- le figg. lb e le illustrano rispettivamente i supporti di fig. la sovrapposti ed il particolare di un canale per il liquido contenente le biomolecole costituito dai fori allineati di detti supporti; - le figg. 2a e 2b illustrano in esploso, ed in condizione parzialmente assemblata, il principio realizzativo dell'invenzione; - le figg. 3a e 3b illustrano, in esploso ed in condizione parzialmente assemblata, una forma di realizzazione di un dispositivo che realizza il metodo secondo l'invenzione ;

- la fig. 4 illustra, parzialmente in esploso, una forma realizzativa di un elemento di montaggio per una parte del dispositivo delle figg. 3a e 3b;

- la fig. 5 illustra una possibile applicazione del dispositivo secondo l'invenzione;

- la fig. 6 illustra una forma realizzativa di un elemento di chiusura del dispositivo di fig. 5;

- la fig. 7 illustra, parzialmente in esploso, una forma realizzativa di un elemento di montaggio per una parte del dispositivo di fig. 5.

DESCRIZIONE DI ALCUNE FORME DI REALIZZAZIONE

PREFERENZIALI DEL TROVATO

Nel seguito, vengono descritte in dettaglio alcune forme realizzative di un dispositivo e dei suoi principali componenti che concretizzano il metodo secondo l'invenzione. Altre configurazioni sono possibili, in aggiunta e come varianti a quelle descritte, per esempio con diverse densità, diametro dei canali e numero di punti.

Anche la realizzazione meccanica può differire almeno per quanto riguarda la distribuzione dei campioni di liquidi; ad esempio, una variante può prevedere un sistema dì movimentazione della struttura di contenimento dei campioni, invece che una movimentazione a piastra mobile al di sopra di tale struttura di contenimento, come nella soluzione illustrata .

Anche il numero di posizioni della piastra mobile rispetto alla struttura di contenimento dei campioni può essere variato, permettendo l'ottenimento di differenti densità di punti.

In fig. 1 è illustrato il principio su cui si basa l'invenzione, cioè l'utilizzo dell'area interna di fori 11 ricavati su supporti 12 per la deposizione dei campioni di liquidi contenenti biomolecole in soluzione .

I supporti 12, visti separati in fig. la, vengono sovrapposti ed allineati fra loro, come mostrato in fig. lb, in modo da costituire canali 13 in ciascuno dei quali può essere introdotto il liquido (fig. le) . La superficie interna di tali canali 13 costituisce il supporto fisico al quale le biomolecole vengono legate.

Nelle figg. 2a e 2b si vede come il principio di realizzazione dell'invenzione può essere realizzato mediante una pluralità di supporti 12 sovrapposti fra loro, con interposta almeno una membrana porosa di tipo idrofobico 19, una piastra superiore 20 ed una piastra inferiore 18 di chiusura ed irrigidimento .

A tali elementi viene all'occorrenza associata una piastra superiore di distribuzione dei campioni di liquidi, con foro di scarico conformato ad imbuto, nel modo che sarà spiegato nel seguito.

Con riferimento alle figg. 3a e 3b, un dispositivo 10 secondo l'invenzione, illustrato in esploso in fig. 3a ed allo stato montato in fig. 3b, comprende una camera di vuoto 14, sopra la quale è appoggiato, con un accoppiamento a tenuta, un cosiddetto "sandwich di distribuzione" 15.

Quest'ultimo è un blocco rigido costituito da una pluralità di componenti strettamente tenuti insieme fra loro tramite viti di tenuta 16, ed è collegato alla camera di vuoto 14 mediante viti di chiusura 17. In particolare, il "sandwich di distribuzione" 15 è costituito dalla piastra inferiore 18, dalla membrana porosa 19, dai supporti 12, impilati e fra loro allineati, e dalla piastra superiore 20, anch'essa forata.

Venendo alla descrizione in dettaglio, la camera di vuoto 14 è costituita da un blocco, ad esempio in alluminio, a forma di parallelepipedo. Il blocco viene scavato in modo da ottenere una camera, con pareti ad esempio di circa 10 mm di spessore, aperta sul lato superiore; tale camera presenta, su una parete, un'ulteriore piccola apertura circolare 21 attraverso la quale viene connessa una pompa dì vuoto per creare il vuoto nella camera 14.

La parte superiore della camera 14 viene chiusa con una lastra 22, ad esempio in acciaio inossidabile, sulla quale sono praticate un'apertura 23 a finestra rettangolare e quattro fori 24 predisposti per ricevere le viti di chiusura 17.

Sopra tale apertura 23 viene posta una guarnizione 25 per assicurare la tenuta del vuoto quando il "sandwich di distribuzione" 15 viene messo in opera. Come visto sopra, il "sandwich di distribuzione" 15 è costituito da elementi che vengono trattenuti a stretto contatto fra di loro.

La piastra inferiore di base 18, ad esempio in acciaio inossidabile, presenta quattro fori esterni 26 per il collegamento con la camera di vuoto 14, tramite le viti di chiusura 17, e quattro fori interni 27 per il collegamento con gli altri elementi del "sandwich di distribuzione" 15, tramite le viti di tenuta 16.

Su tale piastra di base 18 sono ricavati ulteriori quattro fori interni 28 per l'assemblaggio e l'allineamento con gli altri elementi del "sandwich di distribuzione 15, mediante utilizzo di piastra di montaggio 36, nel modo che si vedrà in seguito. La piastra 18 presenta trentadue fori 29 costituenti una griglia quattro per otto; tali fori 29, nella soluzione preferenziale, hanno un diametro di circa 1 mm e sono distanziati fra loro di circa 1,5 mm.

Essi definiscono i punti di caricamento dei campioni di liquido con biomolecole in soluzione per la formazione dei singoli "arrays".

Al di sopra dei fori 29 viene collocata la membrana porosa 19 che nella soluzione preferenziale è realizzata in teflon (PTFE) tipo Mitex™ prodotta dalla Millipore Corp.

I supporti 12 per gli arrays sono costituiti, in una soluzione preferenziale, da fogli di policarbonato presentanti film protettivi di polietilene, o di polimero policationico (ad esempio poly-L-Lysine) su entrambe le facce.

Tali supporti sono in numero variabile a seconda delle necessità, e presentano preferibilmente uno spessore compreso tra 0,15 e 0,45 mm, vantaggiosamente di 0,25 mm.

Il numero di tali supporti, nelle normali applicazioni, può variare da 10 a 500, ma sono ipotizzabili utilizzi che prevedono 5-10.000 supporti fra loro sovrapposti senza particolari limitazioni .

Su detti supporti 12 vengono ricavati, nel caso di specie, trentadue fori 11, coniugati ai fori 29 della piastra di base 18, di diametro di circa 1 mm e distanziati tra loro di circa 1.5 mm, che corrispondono ai punti di caricamento dei campioni. I fori 11 costituiscono una griglia 4 per 8, indicata complessivamente con il numero di riferimento 30.

I supporti 12 presentano anche, in prossimità del perimetro, quattro fori 31 per l'allineamento e l'assemblaggio con gli altri elementi del "sandwich di distribuzione" 15.

Il "sandwich di distribuzione" 15 comprende inoltre una piastra superiore 20, vantaggiosamente in acciaio inossidabile, disposta al di sopra dei supporti 12; tale piastra superiore 20 presenta, in prossimità del perimetro, quattro fori 33 per il collegamento con gli altri elementi del "sandwich di distribuzione" 15 tramite le viti di tenuta 16.

Anche la piastra superiore 20 presenta trentadue fori 34, costituenti una griglia quattro per otto, in corrispondenza dei fori 29 della piastra di base 18 e dei fori 11 dei supporti 12.

La piastra superiore 20 presenta inoltre, in corrispondenza del perimetro, quattro fori 35 per l'assemblaggio del "sandwich" 15.

Tale assemblaggio viene realizzato utilizzando una piastra di montaggio 36, illustrata in fig. 4. Essa comprende una piastra 37, realizzata preferenzialmente in materiale acrilico, sulla quale vengono realizzate quattro sedi 38 per l'inserimento delle viti di tenuta 16. Su detta piastra 38 vengono inoltre predisposte quattro guide 39, costituite da cilindretti in acciaio aventi vantaggiosamente un diametro di circa 1 mm.

L'assemblaggio del "sandwich di distribuzione" 15 viene eseguito inserendo i vari elementi, rispettivamente piastra inferiore 18, supporti 12 e piastra superiore 20, capovolti sulle guide 15, tramite i rispettivi fori 28, 31 e 35.

In particolare, una prima fase di assemblaggio prevede che le viti di tenuta 16 vengano inserite nelle rispettive sedi 38 sulla piastra 37; quindi, vengono inseriti, capovolti, la piastra superiore 20 ed i supporti 12, utilizzando le guide 15.

Poi, un pezzo di membrana 19 viene tagliato a misura e posizionato sopra. Infine, si inserisce la piastra inferiore di base 18, si rovescia il sandwich 15 così ottenuto e lo si vincola, serrando le viti di tenuta 16.

Il sandwich 15 viene estratto dalla piastra di montaggio 36 e posto in un forno per permettere la perfetta adesione dei supporti 12 tra loro e con la membrana 19. Vengono quindi ulteriormente strette le viti di tenuta 16 che esercitano la pressione di serraggio sul "sandwich" 15 mentre questo è ancora caldo, in modo da favorire la perfetta adesione dei supporti 12 tra loro e con la membrana 19. Il "sandwich" 15 viene quindi montato sulla camera di vuoto 14.

Quindi, si procede alla preparazione dei campioni da depositare nei supporti 12.

I campioni possono essere biomolecole di vario tipo. In un'applicazione preferenziale del dispositivo 10 secondo l'invenzione, i campioni sono costituiti da frammenti di acidi nucleici marcati con biotina. I singoli campioni di molecole biotinate possono inoltre essere fatti reagire con avidina.

Per eseguire il caricamento dei campioni, la camera di vuoto 14 viene collegata ad una pompa a vuoto. Il primo campione da depositare viene prelevato con una pipetta in quantità determinata dal numero di arrays che si devono preparare, cioè 0,785 microlitri per ogni supporto 12, più un leggero eccesso (circa 3 microlitri) , Nel caso in cui si preparino 20 arrays, vengono prelevati circa 19 microlitri e il puntale della pipetta viene avvicinato al foro corrispondente alla prima posizione. Il puntale viene posizionato verticalmente, inserito per circa un millimetro nel foro della piastra superiore 20 e mantenuto in posizione per permettere al liquido contenuto nel puntale di fluire nell'apparecchio trascinato dalla depressione. Il liquido riempie così il canale costituito dai fori nei supporti 12 e nella piastra superiore. Il puntale viene sostituito ed il processo ripetuto per tutti i campioni.

Al termine del caricamento la piastra superiore 20 viene coperta con un foglio adesivo per evitare l'evaporazione .

Il "sandwich di distribuzione" 15 viene separato dalla camera di vuoto 14 e rovesciato. Un foglio adesivo viene posto anche sulla parte inferiore. Quindi, il "sandwich” 15 viene posto in termostato a temperatura controllata, ad esempio tra 35 e 40°, vantaggiosamente a circa 37 °C, per favorire l'adsorbimento delle biomolecole sulla parete interna dei fori praticati sui "supporti" 12.

Dopo due ore di incubazione, il "sandwich" 15 viene smontato. I supporti 12 vengono separati l'uno dall'altro con l'eliminazione della pellicola polietilenica o polimerica di separazione e, dopo un eventuale processo di lavaggio, sono pronti per l'utilizzo in esperimenti di ibridazione di acidi nucleici .

In fig. 5 viene illustrato un dispositivo 40 atto ad eseguire in automatico il metodo di deposizione descritto in precedenza con un'applicazione manuale. Tale dispositivo 40 verrà descritto per le parti che differiscono da quelle già descritte con riferimento alle figg. 3a e 3b.

La struttura di contenimento dei campioni, concettualmente simile a quella sopra descritta, è posizionata su un piano mobile sull'asse z, montato in una struttura di sostegno sulla parte superiore della quale di trova una piastra mobile sugli assi x ed y.

Tale dispositivo 40 comprende una camera di vuoto 114, simile a quella descritta in precedenza, dalla quale si differenzia per la maggiore dimensione dell'apertura a finestra 23 praticata sulla parte superiore .

Il sandwich di distribuzione 115 è costituito da una piastra di base 118, una membrana 119, una pluralità di supporti 112 per gli arrays, a seconda delle necessità in numero compreso preferenzialmente da 10 a 300, ed una piastra superiore 120.

In questo caso, sia la piastra di base 118, che i supporti 112 che la piastra superiore 120 presentano fori esterni per il collegamento con la camera di vuoto 114, dieci fori interni per il collegamento, tramite le viti di tenuta, con gli altri elementi del "sandwich di distribuzione" 115 e dieci fori interni per l'allineamento con gli altri elementi del "sandwich di distribuzione" tramite le guide della piastra di montaggio 136.

Su tali elementi 118, 112 e 120 sono inoltre ricavati 6144 fori costituenti una griglia 64 per 96, di diametro di circa 0,7 mm e distanziati fra loro di circa 1,1 mm, che corrispondono ai punti di caricamento dei campioni.

I supporti 112 per gli arrays sono in questo caso costituiti da fogli di policarbonato (Lexan®) , dallo spessore 0,125 oppure 0,25 mm, con i loro film protettivi di polietilene su entrambe le facce.

Il montaggio del "sandwich di distribuzione" 115 avviene. in questo caso, con l'ausilio di due piastre di montaggio 136a e 136b, realizzate vantaggiosamente in materiale acrilico ed illustrate in fig. 7.

Sulla prima piastra 136a sono presenti dieci sedi 138 per le viti di tenuta 116, dieci fori 41 di diametro ridotto e quattro fori 42 di diametro maggiore per il primo allineamento con la seconda piastra 136b.

Tale seconda piastra 136b presenta quattro guide larghe 43, sostanzialmente in corrispondenza degli angoli, per il primo allineamento con la prima piastra 136a, e dieci guide sottili 44, disposte lungo i suoi lati.

Sulla prima piastra 136a viene preparato il sandwich di distribuzione 115, inserendone, tramite le guide 43 e 44, i vari elementi capovolti, a partire dalla piastra superiore 120. Al termine del montaggio, la seconda piastra 136b viene inserita dal basso per ottenere il perfetto allineamento dei fori. Quindi le viti di tenuta 116 vengono serrate e le piastre di montaggio 136a e 136b sfilate ed allontanate .

Il dispositivo 40 comprende una struttura di sostegno e direzionamento costituita da un piano di base 45, vantaggiosamente in alluminio; in una soluzione preferenziale, tale piano di base 45 è predisposto per ospitare elementi di collegamento ad un computer, valvole pneumatiche ed altri mezzi necessari per il funzionamento, la gestione ed il controllo del dispositivo 40.

Sul piano di base 45 sono montati, sostanzialmente in corrispondenza dei vertici, alberini di supporto 46 su cui può scorrere un piano intermedio 47, anch'esso vantaggiosamente realizzato in alluminio, grazie all'azione di due attuatori 48, nel caso dì specie cilindri pneumatici, la cui parte fissa è montata su un piano di copertura 49.

Tale piano di copertura 49 è costituito da due piastre, rispettivamente inferiore 50 e superiore 51, vantaggiosamente di alluminio, presentanti rispettive finestre ove è posizionata una piastra mobile 52.

La piastra inferiore 50 contiene il sistema di movimentazione della piastra mobile 52, il quale, come illustrato in fig. 6, comprende sei cilindri pneumatici 53, fissati alla piastra inferiore 50 tramite una cornice 54, i quali azionano coniugati elementi spintori 55 della piastra mobile 52.

Tali elementi spintori 55, anch'essi realizzati preferenzialmente in alluminio, sono atti a scorrere su binari realizzati nella cornice 54 in seguito alla spinta causata dall'estensione dei cilindri 53, provocando il movimento della piastra mobile 52.

Opportune viti di taratura, posizionate nella loro parte posteriore, funzionano da limitatori di corsa per gli elementi spintori 55 stessi.

Sono inoltre presenti elementi meccanici che favoriscono il ritorno della piastra mobile 52 e degli elementi spintori quando i cilindri pneumatici 53 vanno a riposo.

La piastra mobile 52 è realizzata vantaggiosamente in alluminio e presenta, nel caso di specie, 384 fori 56 disposti regolarmente in 24 file di 16 elementi. I fori 56 sono a forma di imbuto, cioè di cilindro sormontato da un cono rovesciato.

Il dispositivo 40 comprende inoltre una piastra di lavaggio 57, realizzata preferenzialmente in materiale acrilico, e comprendente una sottile camera collegata con un sistema di vuoto. Essa può essere mossa tramite l'azione di un pistone pneumatico 58 in modo da inserirsi tra la piastra mobile 52 e la struttura di contenimento dei campioni .

Il dispositivo 40 comprende inoltre almeno un compressore per alimentare i cilindri pneumatici 48, 53, 58, valvole pneumatiche ed un computer con interfaccia e programma per il loro controllo.

Il principio di caricamento dei campioni è simile a quello descritto precedentemente per l'apparato manuale. Si differenzia da esso principalmente per la maggiore densità e numero dei fori sulla piastra superiore 51, che renderebbero problematico e lungo il caricamento manuale.

In questo dispositivo, infatti, la parte superiore del sandwich di distribuzione 115 viene premuta contro una piastra, ossia la piastra mobile 52, che presenta fori 56 a forma di imbuto in numero pari ad un sedicesimo al numero di fori della piastra superiore 51.

La posizione della piastra mobile 52 può essere determinata con precisione dal movimento di detti elementi spintori 55 azionati dai coniugati cilindri pneumatici 53, ed è tale da far corrispondere perfettamente la parte inferiore di tali fori ad imbuto 56 con i canali del "sandwich di distribuzione" 115. Ovviamente, in una certa posizione della piastra mobile 52 i fori ad imbuto 56 saranno simultaneamente in comunicazione con un sedicesimo (384) dei fori della piastra superiore 51 del "sandwich" 115, mentre gli altri risulteranno chiusi .

I fori ad imbuto 56 hanno un diametro inferiore sostanzialmente uguale a quello dei fori della piastra superiore 51 contro la quale sono premuti (nell'intorno di circa 0,7 mm, nella soluzione preferenziale dell'invenzione), mentre nella parte superiore il loro diametro è di circa 3,5 mm.

Grazie a questa disposizione è possibile riempire i canali da 0,7 mm del "sandwich di distribuzione" 115 tramite l'apertura superiore degli imbuti 56, che ha un diametro assai superiore e non richiede quindi un'alta precisione per tale riempimento. Il volume interno all'imbuto è sufficiente a contenere l'eccesso di liquido che si può creare temporaneamente nel momento in cui il liquido della soluzione da caricare esce dal puntale della pipetta ed entra nei canali risucchiato dal vuoto.

La piastra mobile 52 presenta 384 fori 56, posizionati esattamente come le convenzionali piastre per l'immagazzinamento di campioni a 384 pozzetti (ad esempio quelle prodotte da Dynex Technologies) . Usando un distributore a pipette multiplo a 96 canali è quindi possibile, con soli quattro movimenti, riempire i canali corrispondenti a 384 campioni che siano stati disposti preliminarmente in piastre da 384 o da 96 campioni.

Quando i primi 384 campioni sono stati caricati, il piano intermedio scorrevole 47 viene abbassato. In tal modo gli imbuti della piastra mobile 52 possono essere lavati: la piastra di lavaggio 57 viene inserita tramite movimento pneumatico tra il sandwich di contenimento 115 e la piastra mobile 52; il piano intermedio scorrevole 47 viene alzato leggermente, permettendo il perfetto contatto tra le parti e la tenuta al vuoto che viene esercitato per eliminare il liquido di lavaggio.

Il piano intermedio scorrevole 47 viene quindi nuovamente abbassato, la piastra di lavaggio 57 ritirata e la piastra mobile 52 viene posta in un'altra posizione dal movimento degli elementi spintori 55 azionati dai relativi cilindri pneumatici 53 . Tale movimento viene eseguito in modo tale da far corrispondere perfettamente la parte inferiore dei fori ad imbuto 56 con 384 canali del "sandwich di distribuzione" 115 diversi da quelli precedentemente caricati .

Il processo viene ripetuto 16 volte in modo da riempire tutti i canali del "sandwich di distribuzione" 115.

I campioni, in questo caso, possono essere costituiti da oligonucleotidi sintetici di acido desossiribonucleico, marcati con biotina e successivamente fatti reagire con streptavidina.

Altre applicazioni possono prevedere che i campioni siano costituiti da frammenti di acidi nucleici amplificati tramite reazione a catena della polimerasi (PCR) e marcati con biotina - streptavidina, oppure con altro sistema che permetta il successivo adsorbimento delle biomolecole al supporto solido.

Il montaggio del sandwich di distribuzione 115 viene eseguito con operazioni sostanzialmente analoghe a quelle viste in precedenza.

Quando tale sandwich è stato montato in posizione opportuna sul dispositivo 40, il programma imposta 1 'opportuna apertura delle valvole pneumatiche e conseguentemente il movimento dei cilindri 53 e degli elementi spintori 55 relativi, in modo che la piastra mobile 52 venga posizionata in una delle sedici configurazioni possibili.

Il programma imposta l'apertura della valvola pneumatica che permette la salita del piano intermedio scorrevole 47, conseguentemente premendo la piastra superiore 51 del "sandwich di distribuzione" 115 contro la "piastra mobile" 52. I 384 canali del sandwich di distribuzione 115 che risultano così collegati ai fori 56 a forma di imbuto della piastra mobile 52 vengono quindi riempiti o individualmente con l'ausilio di un robot (per esempio quello della serie Biomek® 2000 della Beckman Coulter, Ine.) o in gruppi di 8-96 con un distributore a pipette multicanale.

Il programma imposta l'apertura della valvola pneumatica che permette la discesa del piano intermedio scorrevole 47 e lo scorrimento della piastra di lavaggio 57 tra la piastra mobile 52 e la piastra superiore 51 del sandwich di distribuzione 115. Il piano intermedio scorrevole 47 viene fatto salire in modo da mettere in pressione la piastra di lavaggio 57 contro la piastra mobile 52. La piastra mobile 52 viene riempita di acqua che, richiamata dal vuoto esercitato nella piastra di lavaggio 57, filtra attraverso i fori ad imbuto 56, lavandoli. Questo ciclo viene ripetuto per altre 15 volte, in modo che tutte le 16 configurazioni siano state ottenute. Al termine del caricamento di tutti i 6144 fori della piastra superiore 51, essa viene coperta con un foglio adesivo per evitare l'evaporazione. Il "sandwich di distribuzione" 115 viene separato dalla camera di vuoto 114 e rovesciato. Come visto nel caso manuale in precedenza, un foglio adesivo viene posto sulla parte inferiore, quindi il "sandwich" 115 viene posto in termostato a 37 °C per favorire l'adsorbimento delle biomolecole sulla parete interna dei fori praticati sui supporti 12 e, dopo due ore di incubazione, il "sandwich" viene smontato. I supporti 12 vengono separati l'uno dall'altro con l'eliminazione della pellicola polietilenica di protezione e, dopo lavaggio, sono pronti per l'utilizzo in esperimenti di ibridazione di acidi nucleici.

E' ovvio comunque che a quanto fin qui descritto possono essere apportate modifiche e/o aggiunte di parti, senza per questo uscire dall'ambito del presente trovato.

Claims (1)

1. RIVENDICAZIONI 1 - Metodo per la distribuzione di almeno campione di liquido contenente molecole in soluzione e di deposizione e fissaggio di tali molecole su supporti solidi, caratterizzato dal fatto che prevede di utilizzare almeno due supporti (12; 112) dotati di almeno un foro passante (11) e disposti sovrapposti uno all'altro in modo che i rispettivi fori (11) siano allineati a definire un canale di contenimento (13), e di distribuire detto almeno un campione di liquido all'interno di detto canale di contenimento (13) utilizzando la superficie interna di detti fori (11) come sito dì deposizione, localizzazione e fissaggio delle molecole in soluzione in detto campione di liquido. 2 - Metodo come alla rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che dopo il fissaggio delle molecole su detta superficie interna dei fori (11), prevede che detti almeno due supporti (12) vengano fra loro separati per essere utilizzati in modo indipendente . 3 - Metodo come alla rivendicazione 1 o 2, caratterizzato dal fatto che dette molecole sono costituite da polimeri di interesse biologico, o biomolecole. 4 - Metodo come alla rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che dette biomolecole sono acidi nucleici. 5 - Metodo come alla rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che dette biomolecole sono proteine. 6 - Metodo come alla rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che dette biomolecole sono derivatizzate con gruppi funzionali. 7 - Metodo come alla rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che prevede di utilizzare almeno mezzi selettivi (19; 119), disposti al di sotto del supporto (12; 112) posto inferiormente, per chiudere detto canale di contenimento (13) del campione di liquido definito dai fori passanti (11) allineati di detti almeno due supporti (12; 112). 8 - Metodo come alla rivendicazione 7, caratterizzato dal fatto che detti mezzi (19, 119) sono costituiti da almeno un elemento realizzato in materiale idrofobico. 9 - Metodo come alla rivendicazione 8, caratterizzato dal fatto che detti mezzi (19, 119) comprendono almeno una membrana porosa. 10 - Metodo come alla rivendicazione 7, caratterizzato dal fatto che prevede almeno una fase di applicazione di vuoto almeno dal sotto di detti mezzi di chiusura (19; 119) per ottenere un voluto riempimento del canale di contenimento (13) definito da detti fori passanti (11) allineati di detti almeno due supporti (12; 112). 11 - Metodo come alla rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che terminato il riempimento con detto campione di liquido, prevede che detto canale di contenimento (13) venga sigillato per permettere il legame delle biomolecole alla parete del foro (11) del rispettivo supporto (12; 112). 12 - Metodo come alla rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che prevede che detto supporto (12) sia realizzato in materiale plastico. 13 - Metodo come alla rivendicazione 12, in cui detto materiale plastico è policarbonato . 14 - Metodo come alla rivendicazione 12, in cui detto materiale plastico è polistirene. 15 - Metodo come alla rivendicazione 12, in cui detto materiale plastico è un derivato del polistirene quale stirene/divinil benzene, stirene/butadiene, stirene/vinil benzil cloruro. 16 - Metodo come alla rivendicazione 12, in cui detto materiale plastico è nylon. 17 - Metodo come alla rivendicazione 12, in cui detto materiale plastico è nitrocellulosa. 18 - Metodo come alla rivendicazione 10, caratterizzato dal fatto che prevede che detto supporto (12) sia realizzato in silicio od in suo composto (ossido, nitruro) . 19 - Metodo come alla rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che prevede che detto supporto (12) sia realizzato in grafite vetrosa. 20 - Metodo come alla rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che prevede che detto supporto (12) sia realizzato in grafite. 21 - Metodo come alla rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che prevede che detto supporto (12) sia realizzato in vetro. 22 - Metodo come alla rivendicazione 20, in cui detto supporto (12) in vetro viene silanizzato. 23 - Metodo come ad una o l'altra delle rivendicazioni precedenti da 11 a 22, caratterizzato dal fatto che prevede che il materiale di cui è costituito detto supporto (12) sia ricoperto, almeno internamente ai fori (11) in esso praticati, da un film costituito da un polimero policationico . 24 - Metodo come ad una o l'altra delle rivendicazioni precedenti da 11 a 22, caratterizzato dal fatto che prevede che il materiale di cui è costituito detto supporto (12) sia modificato con gruppi funzionali reattivi. 25 - Metodo come alla rivendicazione 24, caratterizzato dal fatto che detti gruppi funzionali reattivi sono legati al materiale di cui é costituito detto supporto (12) tramite una molecola linker. 26 - Metodo come alla rivendicazione 24 o 25, caratterizzato dal fatto che detti gruppi funzionali sono di tipo epossidico. 27 - Metodo come alla rivendicazione 24 o 25, caratterizzato dal fatto che detti gruppi funzionali sono di tipo amminico. 28 - Metodo come alla rivendicazione 24 o 25, caratterizzato dal fatto che detti gruppi funzionali sono di tipo mercapto. 29 - Metodo come alla rivendicazione 24 o 25, caratterizzato dal fatto che detti gruppi funzionali sono di tipo tiolo. 30 - Metodo come alla rivendicazione 24 o 25, caratterizzato dal fatto che detti gruppi funzionali sono di tipo alchile. 31 - Metodo come alla rivendicazione 24 o 25, caratterizzato dal fatto che detti gruppi funzionali sono di tipo carbossile. 32 - Metodo come alla rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il fissaggio delle biomolecole alla superficie dei fori (11) dei supporti (12) avviene per adsorbimento. 33 - Metodo come alla rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il fissaggio delle biomolecole alla superficie dei fori (11) dei supporti (12) avviene tramite un legame covalente. 34 - Metodo come ad una o l'altra delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che dopo il riempimento del canale di contenimento (13), prevede che detti supporti (12; 112) vengano disposti in ambiente a temperatura controllata per favorire il legame delle biomolecole sulla parete interna di detti fori passanti (11). 35 - Metodo come alla rivendicazione 34, caratterizzato dal fatto che, terminata la fase di deposizione in ambiente a temperatura controllata, detti supporti (12; 112) vengono separati l'uno dall'altro, ognuno di essi definendo una specifica collezione di biomolecole immobilizzate per l'utilizzo in esperimenti e prove diagnostiche e di ricerca. 36 - Metodo come ad una o l'altra delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che prevede che detti canali di contenimento (13) vengano riempiti sequenzialmente in modo manuale . 37 - Metodo come ad una o l'altra delle rivendicazioni precedenti fino a 35, caratterizzato dal fatto che prevede che una pluralità di detti canali di contenimento (13) vengano riempiti in modo simultaneo ed automatico tramite appositi mezzi distributori (52, 53, 55). 38 - Metodo come alla rivendicazione 37, caratterizzato dal fatto che detto riempimento simultaneo di una pluralità di canali di contenimento (13) avviene con un unico movimento di detti mezzi distributori (52, 53, 55). 39 - Dispositivo per la distribuzione e deposizione su supporti solidi di almeno un campione di liquido contenente molecole in soluzione, caratterizzato dal fatto che comprende almeno due supporti (12; 112) dotati di almeno un foro passante (11) e disposti sovrapposti uno all'altro in modo che i rispettivi fori (11) siano allineati a definire un canale di contenimento (13), mezzi (19; 119) disposti al di sotto del supporto (12; 112) posto inferiormente per chiudere detto canale di contenimento (13), e mezzi atti a distribuire detto almeno un campione di liquido all'interno di detto canale di contenimento (13) utilizzando la superficie interna di detti fori (11) come sito di deposizione, localizzazione e fissaggio delle molecole in soluzione in detto campione di liquido. 40 - Dispositivo come alla rivendicazione 39, caratterizzato dal fatto che comprende mezzi (14; 114) atti a creare il vuoto associati almeno al di sotto di detti supporti (12; 112). 41 - Dispositivo come alla rivendicazione 39, caratterizzato dal fatto che comprende almeno una piastra di base inferiore (18; 118) ed almeno una piastra di base superiore (20; 120) , dette piastre (18, 20; 118, 120) presentando rispettivi fori (29, 34) in corrispondenza dei fori (11) realizzati sui supporti (12; 112) ed essendo atte a racchiudere fra di esse detti supporti (12), fra loro sovrapposti ed allineati, e detti mezzi di chiusura (19). 42 - Dispositivo come alla rivendicazione 41, caratterizzato dal fatto che detti elementi (12, 18, 19, 20; 112, 118, 19, 120) sono atti ad essere vincolati l'uno all'altro tramite mezzi di unione (16; 116), formando nel loro insieme un blocco rigido (15; 115), associabile almeno temporaneamente a detti mezzi (14; 114) atti a creare il vuoto per la distribuzione dei campioni di liquido all'interno dei fori (11) di detti supporti (12; 112). 43 - Dispositivo come alla rivendicazione 40, caratterizzato dal fatto che detti mezzi atti a creare il vuoto comprendono almeno una camera (14; 114) presentante almeno una prima apertura (21) per il collegamento a mezzi a pompa atti a creare il vuoto ed almeno una seconda apertura a finestra (23) per il posizionamento di detto blocco rigido (15; 115) tramite mezzi di bloccaggio (17). 44 - Dispositivo come alla rivendicazione 43, caratterizzato dal fatto che tra detta seconda apertura a finestra (23) e detto blocco rigido (15; 115) sono interposti mezzi di tenuta (25). 45 - Dispositivo come ad una o l'altra delle rivendicazioni precedenti da 39 in poi, caratterizzato dal fatto che ognuno di detti supporti (12; 112) presenta uno spessore compreso tra circa 0,15 e 0,45 mm. 46 - Dispositivo come ad una o l'altra delle rivendicazioni precedenti da 39 in poi, caratterizzato dal fatto che detti fori (11) passanti realizzati su detti supporti (12; 112) presentano un diametro massimo di circa 1 mm. 47 - Dispositivo come ad una o l'altra delle rivendicazioni da 42 in poi, caratterizzato dal fatto che comprende mezzi di montaggio (36; 136a, 136b) atti a facilitare l'assemblaggio di detto blocco rigido (15; 115). 48 - Dispositivo come alla rivendicazione 47, caratterizzato dal fatto che detti mezzi di montaggio (36; 136a, 136b) comprendono elementi di guida (39; 43, 44) atti a cooperare con coniugati fori (28, 31, 35) ricavati rispettivamente in detti elementi (18, 12, 20; 118, 112, 120). 49 - Dispositivo come ad una o l'altra delle rivendicazioni da 39 in poi, caratterizzato dal fatto che comprende mezzi di distribuzione automatica di detti campioni di liquido contenenti biomolecole in soluzione all'interno di detti fori (11) realizzati su detti supporti (12; 112). 50 - Dispositivo come alla rivendicazione 49, caratterizzato dal fatto che detti mezzi di distribuzione automatica comprendono almeno mezzi a piastra (52) atti a muoversi almeno su un piano parallelo al piano di giacitura di detto blocco rigido (15; 115), detti mezzi a piastra (52) presentando fori passanti (56) atti a consentire il passaggio di detti campioni di liquido. 51 - Dispositivo come alla rivendicazione 50, caratterizzato dal fatto che detti fori passanti (56) presentano una conformazione sostanzialmente conica rivolta verso il basso. 52 - Dispositivo come alla rivendicazione 50, caratterizzato dal fatto che detti mezzi a piastra (52) sono associati a mezzi a cilindro di movimentazione (53) ed a mezzi spintori (55) di trasmissione del moto. 53 - Dispositivo come alla rivendicazione 50, caratterizzato dal fatto che detti mezzi a piastra mobile (52) e detto blocco rigido (15; 115) comprendente detti supporti (12) sono dotati di un reciproco movimento verticale per essere portati a contatto reciproco almeno nella fase di scaricamento dei campioni di liquido dai fori (56) di detta piastra mobile (52) ai fori (11) di detti supporti (12) . 54 - Dispositivo come alla rivendicazione 53, caratterizzato dal fatto che almeno detto blocco rigido (15; 115) è montato su un piano (47) mobile almeno in altezza. 55 - Dispositivo come alla rivendicazione 50, caratterizzato dal fatto che comprende mezzi di lavaggio (57) atti ad eseguire un ciclo di lavaggio dei fori (56) di detti mezzi a piastra mobile (52) dopo ogni ciclo di distribuzione di detti campioni di liquido. 56 - Dispositivo come alla rivendicazione 50, caratterizzato dal fatto che il numero dei fori (56) presenti su detti mezzi a piastra mobile (52) è pari ad un sottomultiplo del numero dei fori (11) presenti su detti supporti (12). 57 - Metodo e dispositivo per il trasferimento e la distribuzione di liquidi contenenti biomolecole in soluzione in modo ordinato su un supporto solido sostanzialmente come descritti, con riferimento agli annessi disegni .