ITTO20070066A1 - Anticorpi monoclonali anti-idiotipo mimotopi dell'antigene gp 120 di hiv - Google Patents

Description

DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo: "Anticorpi monoclonali anti-idiotipo mimotopi dell'antigene gp 120 di HIV"

DESCRIZIONE

La presente invenzione si riferisce in generale al campo dell'immunologia e specificamente ad anticorpi monoclonali anti-idiotipo o frammenti da essi derivati, che reagiscono specificamente con anticorpi umani atti a legare la proteina gpl20 del virus dell'Immunodeficienza acquisita umana (HIV)e in grado di indurre una risposta anti-gpl20 quando somministrati a un animale, ivi incluso l'essere umano.

SFONDO DELL'INVENZIONE

L'impatto dell'infezione da HIV ha assunto nel tempo proporzioni globali. Si calcola che nel mondo siano circa 40 milioni gli individui infetti, con un'incidenza di nuove infezioni, in costante crescita, attestata sui 5 milioni di nuovi casi all'anno (UNAIDS - AIDS Epidemie Update - 2005). L'impossibilità di mettere in atto dei meccanismi di controllo dell'infezione, o la loro inefficacia, ha già determinato quadri impressionanti in alcune aree del globo. Si calcola, ad esempio, che in alcune regioni dell'Africa sub-Sahariana (la regione mondiale più colpita dalla pandemia) più del 50% dei soggetti in età lavorativa sia sieropositiva, con ovvie ripercussioni sulle economie già di per sé disastrate di quest'area del mondo. Un simile andamento si sta però verificando anche in aree che stanno vivendo giorni di impressionante crescita economica, come il subcontinente indiano e il sudest asiatico. In queste aree il numero di sieropositivi sfiora i 10 milioni, con un aumento esponenziale annuo di nuovi casi (UNAIDS - AIDS Epidemie Update - 2005).

La terapia antiretrovirale, laddove disponibile, ha migliorato 1'aspettativa di vita dei soggetti infetti. Essa è però associata a una serie di fattori negativi che nel giro di qualche anno potrebbero ridurne l'impatto positivo. Prima di tutto, le terapie ad oggi disponibili non sono curative; in altre parole, i soggetti trattati non riescono ad eliminare completamente il virus, ma restano infetti e quindi esposti al rischio di sviluppare le forme cliniche gravi dell'infezione (AIDS conclamato), e comunque di trasmettere l'infezione ad altri individui. I farmaci a disposizione sono inoltre gravati da pesantissimi effetti collaterali. Ciò causa una bassa adesione (compliance) dei pazienti alla terapia stessa. La bassa compì iance ha, insieme alla elevata adattabilità molecolare del virus e ad altri fattori, favorito l'insorgenza e la diffusione di isolati di HIV completamente resistenti ai farmaci. L'elevato costo della terapia rende inoltre assolutamente improbabile un suo utilizzo su vasta scala nelle aree depresse del mondo che, come detto in precedenza, rappresentano il vero serbatoio esplosivo dell'infezione a livello globale.

L'insieme dei fattori sopra descritti rende prioritaria la necessità di mettere a punto strategie alternative o, nella peggiore delle ipotesi, complementari, alla terapia: nell'ambito del controllo dell'infezione da HIV, un ruolo prioritario sarebbe sicuramente rivestito dallo sviluppo di un approccio vaccinale efficace.

Purtroppo, 1'infezione da HIV è ancora oggi una sfida aperta e di difficile risoluzione da parte della comunità scientifica. Approcci vaccinali tradizionali, basati sulla somministrazione di particelle virali incapaci di infettare ma in grado di stimolare il sistema immune, si sono infatti rivelati completamente inefficaci nei confronti di un virus che fa del polimorfismo molecolare, ovvero della capacità di mutare per sfuggire alla risposta immune, la propria arma vincente (McMichael J., (2006) Armu . Rev. Irrwnunol . 24: 227-55).

Nella descrizione che segue, dopo aver illustrato sinteticamente i principali meccanismi immunologie! stimolati da HIV, verranno ripercorse rapidamente le diverse principali strategie vaccinali finora seguite, soffermandosi in particolare sulla strategia seguita nell'approccio alla base dell'invenzione oggetto della presente domanda di brevetto, ovvero l'ottenimento e la somministrazione di mimotopi anti-idiotipo.

La risposta immune diretta contro HIV

La storia naturale dell'infezione da HIV vede nelle prime settimane successive all'infezione la replicazione incontrollata del virus, con livelli di viremia che nell'arco dei primi 21 giorni superano spesso valori di IO<7>particelle virali per mi di plasma. A questa prima fase ne segue un'altra caratterizzata da una brusca diminuzione dei livelli viremici, dovuta all'attivazione di meccanismi specifici di risposta, rappresentati da cellule T CD8+ citotossiche e dalla produzione di anticorpi neutralizzanti. Questa fase dimostra come il sistema immune, una volta stimolato, sia in grado di controllare almeno parzialmente l'infezione. Il problema principale è però rappresentato, come accennato nella sezione precedente, dalla ipervariabilità di alcune proteine virali, che permettono al virus di superare le difese stimolate e di riprendere quindi a replicarsi in maniera incontrollata. Nel caso dell'infezione da HIV, il sistema immune è quindi chiamato a una continua rincorsa della variabilità del virus: la storia naturale dell'infezione dimostra però come in questa rincorsa il sistema immune risulti costantemente sconfitto .

Scopo principale di un vaccino profilattico efficace sarebbe quindi quello di far trovare al virus, sin dal primo contatto, una risposta immune in grado di bloccarlo e di impedirne quindi la diffusione incontrollata nell'organismo.

Le proteine di superficie di HIV (gp!20 e gp41), che rendono possibile l'infezione delle cellule bersaglio, rappresentano i principali target della risposta immune e in particolare della risposta immune di tipo umorale. Gli anticorpi prodotti nel corso di un'infezione naturale assicurano però una protezione che è limitata al virus che ha stimolato quel tipo di risposta. In altre parole, quegli stessi anticorpi non saranno in grado di proteggere il paziente che li ha prodotti dalle nuove varianti virali che emergeranno, e (elemento più importante dal punto di vista vaccinale) non risulterebbero a maggior ragione protettivi per altri pazienti infettati da altre varianti di HIV.

Lo studio della risposta anticorpale indotta da HIV ha però evidenziato un possibile ruolo svolto da cloni anticorpali con attività neutralizzante ampia nei confronti di un vasto pannello di isolati virali (Pantophlet R. and Burton D.R., (2006) Annu. Rev. Immunol . 24: 739-769). Solo alcuni pazienti sono però in grado di produrre anticorpi con sìmili caratteristiche, che permetteranno loro di controllare molto più a lungo l'infezione, rallentando la progressione verso l'AIDS conclamato (Braibant M. et al . , (2006) AIDS. 20: 1923-30). Questi pazienti sono definiti dalla comunità scientifica long-term non-progressor (LTNP) e rappresentano sicuramente un esempio di risposta immune anti-HIV da studiare per la messa a punto di un vaccino efficace.

Alla luce dei dati raccolti, è infatti ormai pressoché universalmente accettato dalla comunità scientifica che un vaccino profilattico o terapeutico efficace dovrà essere capace di stimolare una adeguata risposta antìcorpale, analoga a quella descritta nei pazienti LTNP. Il principale bersaglio di una risposta umorale potenzialmente efficace è rappresentato, come già accennato, dalle due glicoproteine di superficie (gpl20 e gp41) che, sotto forma di trimeri, costituiscono gli spike che permettono al virus di legarsi e penetrare all'interno delle cellule bersaglio. In particolare però, all'interno di queste proteine dovranno essere evidenziati degli epitopi chiave conservati, e quindi comuni ai diversi isolati virali. Dati sperimentali di laboratorio e clinici hanno evidenziato infatti come la risposta ad ampia attività neutralizzante sia proprio diretta contro questi epitopi (Braibant M. et al., (2006) AIDS. 20: 1923-30). È unanimemente riconosciuto dalla comunità scientifica come la presenza di anticorpi con simili caratteristiche al momento del primo contatto col virus sarebbe con ogni probabilità in grado di neutralizzarne 1'infezione, arrivando ad ottenere quel che nemmeno il protocollo terapeutico più efficace riesce ancora a raggiungere, ovvero la completa eliminazione del virus (Pantophlet R. and Burton D.R., (2006) Annu. Rev. Immunol . 24: 739-769).

Meccanismi di escane virale

La pressione selettiva esercitata dalla risposta immune cellulare ed umorale contro il virus HIV è molto ben studiata in letteratura, anche se non ne sono chiari gli effetti sulla progressione del deficit immunologico e quindi sulla clinica. La pressione selettiva operata dagli anticorpi neutralizzanti è infatti facilmente osservabile sia in vitro che in vivo già nelle fasi precoci dell'infezione. Il virus infatti sfugge mediante una serie di mutazioni che rendono inutili gli anticorpi neutralizzanti, non ad ampio spettro, solitamente prodotti. Tali mutazioni, che a volte interessano un singolo residuo aminoacìdico, sono tipicamente a carico delle glicoproteine di superficie ed in particolare a carico delle cosiddette regioni V (variabili) della proteina gpl20. È facilmente comprensibile, pertanto, come la variabilità delle sequenze di questo antìgene chiave sia uno dei principali motivi dell'incapacità degli anticorpi prodotti nel corao dell'infezione naturale di bloccare completamente il virus. In questo contesto sono altrettanto facilmente comprensibili le ragioni molecolari, a causa delle quali sono risultati infruttuosi tutti i tentativi "classici" di ottenere una risposta protettiva tramite immunizzazione dei soggetti con particelle virali intere o con gpl20 ricombinante {Pantophlet R. and Burton D.R., (2006) Annu. Rev. Immunol . 24: 739-769).

I meccanismi di difesa di HIV non si limitano però alla strategìa, già di per sé efficace, dell'ipervariabilità . Studi strutturali sul virus hanno infatti evidenziato come HIV sfrutti le proprie regione ipervariabili anche per celare al sistema immune epitopi chiave, quale il CD4-bìnding site e il cosiddetto coreceptor-binding site di gpl20, ovvero le porzioni della proteina che legano fisicamente il recettore e i corecettori della cellula bersaglio al momento dell'infezione. In altre parole, il virus esporrebbe queste regioni chiave solo al momento dell'interazione diretta con la cellula bersaglio, limitandone così l'esposizione al sistema immune.

HIV ha inoltre evoluto un'altra strategia per celare gli epitopi più importanti su gpl20: il 50% della molecola è infatti ricoperto da carboidrati, che rendono la superficie della proteina praticamente "invisibile” al sistema immune. Il virus in vivo può anche modificare le posizioni di questo rivestimento glucidico, portando così all'ipotesi di un modello d'evoluzione dinamico, il cosiddetto "schermo di glicani" ( glycan shield) . HIV sarebbe infatti in grado di modulare la glicosilazione, adattandosi continuamente al tipo di risposta immune che di momento in momento si trova a dover contrastare. La capacità di evadere la risposta immune non è quindi un fenomeno generalizzato, una caratteristica intrinseca comune a tutte la particelle virali, ma un adattamento specifico e continuo alla risposta anticorpale neutralizzante stimolata di volta in volta.

La qpl20 come potenziale target vaccinale

Come evidenziato nelle due precedenti sezioni, la gpl20 rappresenta il principale bersaglio della risposta immune neutralizzante il virus HIV. Nelle precedenti sezioni si sono però evidenziate le ragioni molecolari per cui approcci vaccinali classici, pur prevedendo il ricorso ad un antigene così importante per il virus, non hanno portato a risultati positivi. In particolare, il ricorso a particelle virali intere inattivate, o a forme monomeriche ricombinanti dì gpl20, ha portato esclusivamente alla stimolazione di una risposta immune limitata al virus utilizzato nel protocollo vaccinale, o da cui era stata ottenuta la proteina ricombinante. La risposta stimolata risultava ad esempio limitata a isolati di HIV adattati in laboratorio a crescere in colture di linee immortalizzate di cellule T; nessun effetto antivirale era invece riscontrabile nei confronti di isolati virali "primari", ovvero direttamente derivati dai pazienti infetti.

Il fallimento di questi approcci ha portato all'esplorazione di possibili vie alternative che verranno rapidamente descritte in questa sezione della descrizione, e che possono essere sinteticamente distinte in due gruppi:

a) Messa a punto di preparazioni trimeriche di qp!20 che rappresentino meglio la struttura della proteina esposta sugli spike di HIV,

Questo approccio si basa sulla somministrazione della gpl20, non più in forma monomerica ma in forma eterotrimerica, in associazione con l'altra glicoproteina di superficie del virus, la proteina gp4l. Il principio alla base della strategia si fonda sull'osservazione delle diverse caratteristiche antigeniche della gpl20 monomerica rispetto alle forme trimeriche (Pantophlet R. and Burton D.R., (2006) Annu. Rev. Immunol . 24: 739-769). I primi dati raccolti su approcci afferenti a questa strategia hanno però evidenziato una serie di problematiche strettamente correlate fra loro, sia dal punto di vista tecnico, che dal punto di vista dell'efficacia dell'approccio stesso. Dal punto di vista tecnico, il principale ostacolo da superare consiste proprio nella capacità di riuscire ad ottenere delle forme eterotrimeriche stabilì, in grado di mimare al meglio l'organizzazione degli spike dell ' envelope virale. Sulla superficie di HIV, infatti, le interazioni gpl20-gp41 sono mediate da interazioni non covalenti, fondamentali per conferire alla struttura complessiva dello spike l'indispensabile modellabilità strutturale che ne caratterizza la funzione. In laboratorio è risultato particolarmente difficile ottenere molecole di questo tipo che da un lato fossero sufficientemente stabili da non dissociarsi nei singoli monomeri, e che dall'altro fossero comunque in grado di esporre porzioni cruciali delle proteine, e di gpl20 in particolare . Si è dovuto così ricorrere a una serie di artifici tecnici per la stabilizzazione dei trimeri (mutazione nei siti di clivaggio della poliproteina originaria, inserimento di residui di cisteina in porzioni non importanti della struttura), o per la loro esposizione su strutture il più possibile simili all ' envelope virale (incorporazione in proteoliposomi, espressione su virus-like particles) . Nessuno degli approcci seguiti ha però permesso di risolvere del tutto i problemi di stabilizzazione e purificazione dei trimeri, né tanto meno ha portato a risultati decisamente superiori rispetto a quelli ottenuti con le forme monomeriche di gpl20, in termini di efficacia e soprattutto di ampiezza dell'attività neutralizzante. Risultati analogamente insoddisfacenti sono stati ottenuti anche con approcci che prevedevano l'utilizzo di forme ricombinanti di gpl20, mutate in modo da rendere più accessibili al sistema immune porzioni chiave della proteina.

b) Messa a punto di vaccini innovativi epitopebased , ovvero basati sull'esposizione al sistema immune di porzioni conservate, e quindi potenzialmente protettive, di CTP120.

A questo gruppo afferisce la strategia dei mimotopi anti-idiotipo, sulla quale si basa anche l'invenzione illustrata nella presente domanda di brevetto .

Il problema principale di tutte le strategie sopra descritte concerne 1'incapacità di stimolare, oltre a una risposta neutralizzante tipo-specifica, una risposta neutralizzante ad ampio spettro. Nell'ambito dei tentativi di limitare la risposta tipo-specifica e di potenziare quella crossneutralizzante, devono essere considerati i cosiddetti approcci epitope-based.

Per comprendere meglio le strategie afferenti a questo gruppo è utile fare un rapido riferimento alla struttura dell'antigene gpl20. Lo studio di gpl20 basato sulle analisi comparative di sequenza rileva, nell'ambito della glicoproteina, 5 segmenti conservati (Cl- C5) e 5 variabili (V1-V5). Studi successivi hanno dimostrato come le regioni Cl e C5 siano probabilmente impegnate nel contatto con gp41, giacché è stato evidenziato come anticorpi diretti contro questa regione riconoscano solo le forme monomeriche, ma non quelle trimeriche, di gpl20 . Alcune porzioni delle regioni C2, C3 e C4 formerebbero, invece, un nucleo nascosto e relativamente idrofobico all<1>interno della molecola gpl20, probabilmente impegnato nel riconoscimento del recettore CD4. Contrariamente alle regioni conservate, le regioni variabili (in particolare, VI, V2 e V3) sono ben esposte ed accessibili sulla proteina.

Gli approcci epitope-based cercano, per l'appunto, di sfruttare le caratteristiche strutturali di gpl20 al fine di ottenere molecole in grado di indirizzare la risposta immune esclusivamente, o prevalentemente , nei confronti di suoi epitopi chiave. Una strategia in tal senso è stata quella di ricorrere a monomeri di gpl20, da cui erano state eliminate le regioni VI, V2 e V3, al fine di esporre al sistema immune le porzioni conservate leganti il CD4. Un simile approccio non ha ancora portato a risultati soddisfacenti, anche perché l'eliminazione di porzioni così ampie della proteina ha inevitabili ripercussione su tutta la sua conformazione e quindi anche sulla porzione legante il CD4 che potrebbe perdere le proprie caratteristiche peculiari.

Un'altra possibile strategia è quella di sfruttare, a vantaggio del sistema immune, uno dei meccanismi di escape di HIV descritti in precedenza, ovvero 1'iperglicosìlazione di porzioni di gpl20. A tale proposito, sono state ottenute in laboratorio delle gpl20 artificialmente glicosilate, in modo da nascondere siti non protettivi ed indirizzare la risposta esclusivamente verso le porzioni importanti della proteina. I risultati ottenuti con questo approccio sono stati però insoddisfacenti, in quanto questa strategia, pur determinando una diminuzione della risposta immune diretta verso porzioni non conservate della molecola, non è stata in grado di determinare un'ampia risposta nei confronti delle porzioni cruciali di gpl20.

È utile a questo punto ricordare come, in alcuni rari casi ed a titoli molto bassi, nel corso di alcune infezioni naturali vengono prodotti anticorpi in grado di neutralizzare un largo spettro di isolati virali. Questi anticorpi (rarissimi ed estremamente preziosi dal punto di vista scientifico) rappresentano quindi un stampo ideale per un approccio epitope-based estremamente mirato. Sfruttando l'idiotipo di queste molecole (ovvero la porzione dell'anticorpo che riconosce e lega in maniera specifica l'antigene), è possibile, con un approccio di reverse vaccinology, ottenere altre molecole anticorpali (antì-ìdiotipo) specificamente dirette contro l'idiotipo degli anticorpi neutralizzanti ad ampio spettro, e in grado quindi di mimare gli epitopi chiave da essi riconosciuti. In altre parole, anticorpi anti-idiotìpo ben disegnati possono rappresentare un antigene artificiale ineguagliabile in laboratorio, in quanto in grado di esporre al sistema immune solo l'epitopo chiave riconosciuto dagli anticorpi neutralizzanti.

L'analisi della letteratura scientifica e brevettuale anteriore ha permesso di evidenziare come strategie basate sull'utilizzo di anti-idiotipo siano state già applicate all'infezione da HIV.

Tuttavia, per quanto a conoscenza degli inventori, la maggior parte della letteratura anteriore riguarda anticorpi anti-idiotipo ottenuti utilizzando come stampo per il clonaggio delle molecole anticorpali di origine non umana, soprattutto murina, ovvero anticorpi ottenuti immunizzando dei topi di laboratorio con gpl20 ricombinante. Poiché è stato più volte scientificamente dimostrato come uno stesso epitopo possa essere in grado di stimolare una risposta anticorpale specifica in un animale da esperimento ma non nell'essere umano, la scelta di utilizzare preparazioni policlonalì o anticorpi monoclonali di origine non umana come stampo per l'ottenimento di anticorpi anti-idiotipo rende incerto l'ottenimento di anticorpi antiidiotipo utili ai fini vaccinali nell'uomo; ossia capaci di mimare efficacemente porzioni fondamentali dell'antigene gpl20 riconosciute dal sistema immune umano e che, di conseguenza, siano in grado di stimolare una risposta immune efficace nell'essere umano.

Anticorpi stampo di origine umana

Vi sono tuttavia alcuni documenti anteriori che descrivono anticorpi monoclonali umani caratterizzati da attività neutralizzante, che in alcuni casi vengono proposti come stampo per l'ottenimento di molecole anti-idiotipo. La maggior parte di tali documenti anteriori, tuttavia, non descrive concretamente la produzione di molecole anti-idiotipo né le loro proprietà ed applicazioni.

Gli inventori sono a conoscenza di un unico documento brevettuale anteriore in cui è concretamente descritto l'ottenimento di anticorpi antiidiotipo a partire da anticorpi stampo di origine umana . Trattasi della domanda di brevetto internazionale WO 92/15885, pubblicata in data 17 settembre 1992. Questa domanda di brevetto descrive un procedimento di selezione di anticorpi monoclonali anti-idiotipo utili a scopi vaccinali per il trattamento profilattico o terapeutico di infezioni da HIV. Il procedimento prevede, in sintesi, l'ottenimento di anticorpì monoclonali antiidiotipo (Gl-Ab2s) utilizzando come stampo una preparazione policlonale di Ig umane intere anti-gpl20 (Abis), la successiva selezione di un sottogruppo di anticorpi monoclonali anti-idiotipo (G2-Ab2s) caratterizzati dalla capacità di reagire con anticorpi anti-gpl20 neutralizzanti una pluralità di ceppi di HIV in vitro, e la selezione di un ulteriore sottogruppo di anticorpi monoclonali antiidiotipo (G3-Ab2s) atti a generare, in un ospite primate, una risposta di anticorpi anti-antiidiotipo (Ab3) che reagiscono con 1'antigene gpl20 e che hanno proprietà neutralizzanti HIV.

La procedura descritta nella domanda WO 92/15885 presenta un certo numero di svantaggi. In primo luogo, utilizzando come stampo delle ìmmunoglobuline intere, si ottiene un pannello di anticorpi monoclonali anti-immunoglobulina che sono per grandissima parte diretti contro porzioni inutili delle immunoglobuline-stampo, ossia le porzioni esterne all'idiotipo, e che quindi per grandissima parte non sono veri e propri anti-idiotipo. La risposta neutralizzante ottenuta in primati descritta in questa domanda di brevetto è inoltre debole e richiede la preventiva purificazione degli anticorpi usati per l'immunizzazione. Se ne può quindi trarre la conseguenza che gli anticorpì ottenuti con il procedimento di WO 92/15885, oltre a non essere sufficientemente specifici per la porzione utìle delle immunoglobuline anti-gpl20 (l'idiotipo), non sono atti a suscitare una risposta immune neutralizzate intensa (bassi titoli anticorpali) e quindi non sono particolarmente promettenti come vaccini .

SCOPO DELL'INVENZIONE

Lo scopo della presente invenzione è quello di affrontare i problemi della tecnica anteriore sopra illustrati .

Più in particolare, uno scopo dell'invenzione è quello di mettere a disposizione anticorpi monoclonali anti-immunoglobulina, o frammenti anticorpali da essi derivati, che siano capaci di legarsi immunologicamente con l'idiotipo di anticorpi umani anti-gpl20 di HIV e che pertanto siano atti ad essere definiti come "anticorpi anti-idiotipo".

Un altro scopo dell'invenzione è quello di mettere a disposizione anticorpi monoclonali antiidiotipo come definiti in precedenza, o frammenti anticorpali da essi derivati, che siano capaci di inibire il legame immunologico fra 1'antigene gpl20 e anticorpi umani anti-gpl20.

Un altro scopo dell'invenzione è quello di mettere a disposizione anticorpi monoclonali antiidiotipo come definiti in precedenza, o frammenti da essi derivati, che siano capaci di suscitare una rapida ed intensa risposta immune di anticorpì anti-anti-idiotipo diretti contro HIV quando somministrati ad un animale, ivi incluso un essere umano.

Un altro scopo dell'invenzione è quello di mettere a disposizione un procedimento di preparazione dì anticorpi monoclonali anti-idiotipo come definiti in precedenza, o di frammenti da essi derivati, che consenta di ottenere un pannello di anticorpi monoclonali che siano specificamente rivolti verso la porzione utile delle immunoglobuline umane antigpl20 usate come stampo, ossia il loro idiotipo, e che siano atti a neutralizzare il virus HIV.

DESCRIZIONE DELL'INVENZIONE

Questi ed altri scopi sono raggiunti tramite gli anticorpi anti-idiotipo, le loro sequenze nucleotidiche ed amminoacidiche ed il loro procedimento di preparazione come definiti nelle annesse rivendicazioni . Le rivendicazioni formano parte integrante della descrizione.

Più in particolare, l'invenzione riguarda un procedimento di preparazione di anticorpi monoclonali anti-idiotipo adatti per il trattamento profilattico o terapeutico dell'infezione da HIV o di malattie ad essa correlate, che comprende una prima fase in cui viene messa a disposizione una preparazione di anticorpi policlonali umani rivolti verso 1'antigene gpl20 di HIV {e pertanto indicati nel seguito come "anticorpi anti-gpl20"), la quale preparazione verrà successivamente utilizzata come stampo per la preparazione di anticorpi antiidiotipo .

E' importante che la preparazione di anticorpi policlonali umani anti-gpI20 da usare successivamente come stampo venga preselezionata per la sua attività neutralizzante ad ampio spettro nei confronti di HIV. La pre-selezione viene preferibilmente effettuata scegliendo come fonte di anticorpi dei sieri di pazienti HIV-positivi con caratteristiche cliniche di una lenta progressione della malattia ( long-term non-progressors) . Tali pazienti vengono scelti attenendosi ai criteri clinicovirologici estremamente stringenti illustrati nella parte sperimentale della descrizione. Il rispetto di tali criteri consente di ottenere campioni dì siero caratterizzati da una notevole attività di neutralizzazione di HIV ad ampio spettro. La verifica dell'attività neutralizzante può essere effettuata utilizzando procedimenti e tecniche di per sé noti, che il tecnico del settore è in grado dì applicare al caso specifico senza l'esercizio di alcuna attività inventiva e senza eccessiva sperimentazione.

Gli anticorpi policlonali umani anti-gpl20 usati come stampo sono preferibilmente delle immunoglobuline G (IgG) anti-gpl20 purificate. La purificazione viene preferibilmente effettuata mediante procedure di cromatografia di (immuno)affinità, ad esempio utilizzando colonne di sefarosio contenenti proteina G per la purificazione delle IgG e colonne contenenti gpl20 per la purificazione degli anticorpi specificamente rivolti verso 1'antigene gpl20 di HIV.

Un'altra caratteristica importante degli anticorpi policlonali umani anti-gpl20 usati come stampo è che essi siano in forma di frammenti Fab. Pertanto, in una forma di attuazione preferita del procedimento, le IgG antì-gpl20 purificate, aventi attività di neutralizzazione di HIV ad ampio spettro, sono fornite come frammenti Fab. Tali frammenti Fab anti-gpl20 aventi attività neutralizzante verranno indicati nel seguito come "RBIFab".

Nella seconda fase del procedimento gli RBIFab vengono utilizzati come stampo per generare degli anticorpi monoclonali anti-immunoglobulina aventi la caratteristica di essere rivolti verso 1'idiotipo degli stessi RBIFab usati come stampo. Tali anticorpi anti-immunoglobulina vengono indicati nel seguito come "anticorpì anti-idiotipo".

Con le espressioni “rivolti verso" e "diretti contro" si intende indicare che gli anticorpi in questione sono in grado di reagire, ossia legarsi immunologicamente, con l'antigene indicato.

Come è noto, i frammenti Fab sono dei frammenti anticorpali atti a legare 1'antigene, ottenibili mediante digestione dì immunoglobuline intere con l'enzima papaina. Più in particolare, un frammento Fab consiste in una catena leggera intatta associata ad un frammento VH-Cyl di una catena pesante. Dalla digestione di una IgG intera con l'enzima papaina si ottengono due frammenti Fab identici.

L'utilizzo, nell'ambito del procedimento dell'invenzione, di frammenti Fab come stampo per generare anticorpi monoclonali anti-immunoglobulina consente vantaggiosamente di ottenere un pannello di anticorpi che sono più specificamente rivolti verso la porzione utile delle immunoglobuline usate come stampo, ossia il loro idiotipo. Pertanto tali anticorpi vengono indicati come "anti-idiotipo". Il termine "idiotipo" indica l'insieme delle regioni ipervariabili del dominio variabile di una immunoglobulina, vale a dire quelle strutture che caratterizzano una popolazione omogenea di molecole anticorpali, come ad esempio le proteine di un mieloma o un anticorpo monoclonale, e che consentono quindi di distinguere una popolazione omogenea di molecole anticorpali da un'altra popolazione omogenea (ad esempio, un anticorpo monoclonale da un altro).

Per ottenere il pannello di anticorpì monoclonali anti-idiotipo può essere utilizzata qualsiasi tecnologia convenzionale per la preparazione dì anticorpi monoclonali, ad esempio, ma senza limitazione, la tecnica degli ìbridomi, la tecnica del phage display, la tecnica del display su lievito, la tecnica del display su ribosomi. Preferibilmente, gli anticorpi monoclonali anti-idiotipo ottenuti in questa fase sono anticorpi murini, generati con la tecnica degli ibridomi immunizzando topi con gli RBIFab.

Infine, in una terza fase del procedimento, il pannello di antìcorpi monoclonali anti-idiotipo ottenuto nella seconda fase viene sottoposto a screening per selezionare un sottoinsieme di anticorpi che hanno la capacità di inibire il legame di gpl20 con anticorpi umani antì-gpl20, preferibilmente con gli RBIFab usati come stampo. Ciò consente di assicurarsi che gli anti-idiotipo ottenuti con il procedimento dell'invenzione siano dei veri e propri mimotopi, ossia degli antìcorpi antiidiotipo atti a mimare immunologicamente 1'antigene gpl20. Lo screening può essere effettuato con qualsiasi procedimento noto e adatto a tale scopo, ad esempio mediante ELISA come descritto nella sezione sperimentale che segue.

Nell'ambito dell'invenzione rientra inoltre un pannello di anticorpi monoclonali anti-idiotipo, preferibilmente murini, caratterizzati dal fatto di essere diretti specificamente contro 1'idiotipo di anticorpi umani anti-gpl20 e dal fatto di essere atti a inibire il legame fra gpl20 e anticorpi umani anti-gpl20. Tale pannello di anticorpi monoclonali anti-idiotipo è ottenibile con il procedimento dell'invenzione .

Con il termine "pannello di anticorpi anti idiotipo" si intende indicare 1'insieme delle differenti popolazioni dì anticorpi monoclonali antiimmunoglobulina che viene generato con il procedimento di preparazione dell'invenzione. Grazie allo specifico procedimento di preparazione utilizzato, le varie popolazioni di anticorpi monoclonalì antiimmunoglobulina ottenute, pur differenziandosi l'un l'altra proprio in base alla struttura delle regioni leganti 1'antigene, condividono tutte una caratteristica comune, ossia quella di essere rivolte verso l'idiotipo degli RBIFab utilizzati come stampo, e quindi dì poter essere definite come delle popolazioni di anticorpi monoclonali anti-idiotipo.

Da quanto sopra esposto, risulta quindi evidente che, nell'ambito della presente descrizione, il termine "anticorpo anti-ìmmunoglobulina" non è un sinonimo del termine "anticorpo anti-idiotipo", Un anticorpo anti-immunoglobulina è genericamente un anticorpo ottenuto mediante l'immunizzazione di un animale con una immunoglobulina, la quale in questo caso svolge il ruolo di antigene. L'anticorpo antiimmunoglobulina può essere rivolto verso qualsiasi regione dell'immunoglobulina utilizzata come antigene, ivi inclusa, ad esempio, la regione costante dell'Ig od altre porzioni conservate. Un anticorpo anti-idiotipo è invece un antìcorpo antiimmunoglobulìna specificamente rivolto verso l'idiotipo dell'immunoglobulìna utilizzata come antigene. Pertanto, la categoria degli anticorpi anti-idiotipo è più specifica di quella degli anticorpi anti-immunoglobulìna.

La sezione sperimentale della presente domanda di brevetto illustra in dettaglio il procedimento di preparazione di anticorpi monoclonali antiidìotìpo dell'invenzione e le caratteristiche immunologiche che rendono alcuni degli anticorpi ottenuti particolarmente efficaci in applicazioni vaccinali (terapeutiche o profilattiche) contro l'infezione da HIV o malattie ad essa correlate. Nella sezione sperimentale è specificamente illustrato 1'ottenimento di anticorpi monoclonali antìidiotipo sotto forma di frammenti Fab. Sono inoltre descritti due specifici Fab anti-idiotipo (denominati PI e P2), ottenuti tramite tecniche di biologia molecolare a partire da ibridomi, ed identificati tramite le sequenze aminoacidiche e nucleotidiche delle porzioni variabili delle loro catene pesanti e leggere. Tali sequenze sono fornite nella sezione della descrizione intitolata "Lista delle sequenze") .

Naturalmente, gli anticorpi antì-idiotipo dell'invenzione, inclusi PI e P2, possono essere preparati ed utilizzati in forme differenti dai Fab, ad esempio come immunoglobuline intere, oppure sotto forma dì altri tipi di frammenti anticorpali (ad esempio frammenti F(ab')2o frammenti anticorpali più piccoli dei Fab) o ancora come peptidi aventi le stesse proprietà immunologiche dei Fab dell'invenzione .

Ad esempio, anticorpi a catena sìngola ( single chain antibodiea) possono essere costruiti secondo il procedimento descritto nel brevetto US 4,946,778 di Ladner et al., qui incorporato come riferimento. Gli anticorpi a catena singola comprendono le regioni variabili delle catene leggera e pesante unite da una porzione legante flessibile. Il frammento anticorpale chiamato anticorpo a singolo dominio ( single domain antibody) è ancora più pìccolo dell'anticorpo a catena sìngola, in quanto comprende un singolo dominio VH isolato. Le tecniche per ottenere anticorpi a singolo domìnio aventi almeno in parte la stessa capacità di legame dell'anticorpo intatto, sono note nello stato della tecnica. Per esempio, Ward, et al., in "Binding Actìvities of a Repertoire of Single Immunoglobulin Variatole Domains Secreted from Escheria coli, " Nature 341:644-646, descrive un procedimento di screening per ottenere la regione variabile della catena pesante di un anticorpo (VH single domain antibody) con sufficiente affinità per l'epitopo bersaglio da legarsi ad esso in forma isolata.

Nella descrizione che segue, il termine "anticorpo anti-idiotipo" verrà quindi utilizzato per indicare tutte le forme di realizzazione degli anticorpi anti-idiotipo sopra menzionate, ossia immunoglobuline intere, frammenti Fab o altri tipi di frammenti anticorpali, anticorpi a catena singola, antìcorpi a dominio singolo, etc.

Gli anticorpi anti-idiotipo dell'invenzione possono essere prodotti ed utilizzati in forma libera oppure in forma coniugata con un carrier. Un carrier è qualsiasi molecola atta ad essere coniugata con un anticorpo e a renderlo immunogenico o ad aumentarne 1'immunogenìcità.

Esempi non limitativi di carrier sono proteine quali KLH (" keyhole limpet hemocyanin" ) , edestina, tiroglobulina, albumine quali la sìeroalbumìna bovina (BSA) o la sieroalbumina umana (HSA), eritrociti quali eritrociti di pecora (SRBC), 1'anatossina tetanica, 1'anatossina del colera, poliamminoacidi quali ad esempio poli(D-lisina:acido D-glutammico) e simili. Per facilitare il legame dell'anti-idiotipo al carrier, il C-terminale o l'N-terminale dell'anti-idiotipo può essere modificato, ad esempio con l'introduzione di residui amminoacidici aggiuntivi, ad esempio uno o più residui di cisteina che è capace di formare ponti disolfuro.

Date le loro proprietà, che verranno mostrate in dettaglio nella sezione sperimentale, gli antiidiotipo dell'invenzione sono particolarmente adatti ad essere utilizzati in applicazioni terapeutiche e/o diagnostiche, in particolare per la preparazione di un medicamento per il trattamento profilattico o terapeutico dell'infezione da HIV o di malattie ad essa correlate, ed in procedimenti di rivelazione di anticorpi anti-gp 120 di HIV in campioni biologici.

Come accennato in precedenza, l'invenzione mette inoltre a disposizione le sequenze amminoacidiche e nucleotidiche delle regioni variabili della catena pesante e della catena leggera di due specìfici Fab anti-idiotipo dell'invenzione, denominati rispettivamente PI e P2. Come descritto in dettaglio nella sezione sperimentale, i Fab PI e P2 sono stati ottenuti attraverso tecniche di biologia molecolare a partire da due ibridomi, rispettivamente designati come Mabl e Mab2, che erano in grado di produrre anticorpi monoclonali anti-idiotipo atti a inibire il legame immunologico fra gpl20 e gli RBIFab. Le procedure specifiche utilizzate per generare i Fab PI e P2 dell'invenzione sono descritte in dettaglio nella parte sperimentale. In termini generali, l'mRNA dei geni codificanti per le regioni variabili della catena leggera e della catena pesante del monoclonale prodotto dall'ibridoma Mabl è stato clonato in un vettore di espressione di per sé noto, chiamato RBCaf, ed il costrutto ricombinante così ottenuto è stato trasformato all'interno di cellule di E. coli ceppo XLIBlue rese competenti. La stessa procedura è stata applicata per 1'anticorpo monoclonale prodotto dall'ibridoma Mab2 . Per ogni anticorpo monoclonale, sono stati ottenuti circa 40 cloni di batteri ricombìnanti. I cloni di batteri ricombinanti sono poi stati selezionati in base alla loro capacità di produrre Fab di topo capaci di legare gli RBIFab purificati. In tal modo sono stati selezionati due cloni, uno per ogni monoclonale, chiamati rispettivamente Pomonal (PI) e Pomona2 (P2). Le sequenze amminoacidiche e nucleotidiche delle regioni variabili delle catene pesanti e leggere dei Fab murini PI e P2 sono state ottenute. Tali sequenze sono riportate nella sezione intitolata "Lista delle sequenze".

I Fab murini PI e P2 sono vantaggiosamente risultati positivi non solo per la capacità di inibire il legame gpl20-RBlFab, ma anche per la capacità di stimolare in modelli animali diversi dal topo, per esempio in coniglio, una risposta immune specifica anti-gpl20. Gli esperimenti di immunizzazione descritti nella parte sperimentale della domanda di brevetto mostrano come questi Fab siano in grado di suscitare una risposta immune anti-gpl20 specifica, rapida ed intensa, evidente anche ad alte diluizioni di siero (1:1600). Inoltre, in base a risultati sperimentali non mostrati in questa sede, si è potuto verificare che gli anticorpì antì-gpl20 suscitati in coniglio in risposta all'immunizzazione con i Fab PI e P2 dell'invenzione presentano un elevata capacità di neutralizzazione di HIV.

I dati ottenuti fanno ritenere che le molecole PI e P2 dell'invenzione siano potenzialmente molto utili in applicazioni vaccinali, in particolare per il trattamento profilattico o terapeutico dell'infezione da HIV o di malattie ad essa correlate. Tutto ciò è ulteriormente corroborato dalla osservazione che le capacità degli anticorpi dell'invenzione di suscitare una robusta risposta immune antivirale (senza avere utilizzato il virus) è stata verificata in un modello animale filogeneticamente molto lontano dall'uomo, come il coniglio. Quest'ultimo dato rappresenta una caratteristica incoraggiante circa il possibile utilizzo delle molecole in questione nell'uomo; l'epìtopo di gpl20 mimato dagli "anti-idiotipo" è infatti molto probabilmente in grado di stimolare un'efficace risposta immune nell'uomo, come dimostrato dall'origine umana degli anticorpi neutralizzanti selezionati per la generazione degli anti-idiotipo stessi.

Nell'ambito dell'invenzione rientra quindi anche una composizione immunogenica comprendente una quantità immunologicamente efficace di almeno un anticorpo anti-idiotipo dell'invenzione (preferibilmente una molecola PI o P2) ed un veicolo e/o un diluente farmaceuticamente accettabile. Una quantità immunologicamente efficace di almeno un anticorpo anti-idiotipo dell'invenzione è una quantità atta a indurre una risposta immune anti-gpl20 in un ospite animale a cui viene somministrato, ivi ìneluso un essere umano.

Facoltativamente, la composizione immunogenica può inoltre comprendere uno o più adìuvanti. Un adiuvante è un composto avente un'attività di stimolazione non specifica del sistema immunitario. E-sempi non limitativi dì adiuvanti sono l'adìuvante di Freund completo, l'adiuvante di Freund incompleto, la vitamina E, polimeri a blocchi non ionici, i muramìlpeptidi, i complessi immunostimolanti, le saponine, oli minerali, oli vegetali, Carbopol, la tossina termolabile di E. coli (LT), la tossina colerica (CT), l'idrossido di alluminio, il fosfato di alluminio o l'ossido di alluminio, etc.

Altri esempi non limitativi di veicoli o diluenti farmaceuticamente accettabili utili nella composizione immunogenica dell'invenzione includono stabilizzanti quali SPGA, carboidrati (per esempio, sorbitolo, mannitolo, amido, saccarosio, glucosio, destrano), proteine quali albumina o caseìna, agenti contenenti proteine quali siero bovino o latte scremato, e tamponi (per esempio tampone fosfato).

Come verrà descritto in dettaglio nella sezione sperimentale che segue, è stato verificato che i risultati ottenibili tramite immunizzazione degli animali testati (per esempio, conigli) con le molecole Pi e P2 dell'invenzione possono essere ulteriormente migliorati (in termini di intensità della risposta immune anti-gpl20, vedere figura 3) sottoponendo gli animali ad un particolare regime di immunizzazione, che prevede la somministrazione simultanea, separata o sequenziale degli anticorpi PI o P2 dell'invenzione e dell'antigene gpl20.

Pertanto, nell'ambito della presente invenzione rientra anche un corredo dì parti comprendente una molecola PI o P2 dell'invenzione e 1'antigene gpl20 di HIV come preparazione combinata per la somministrazione simultanea, separata o sequenziale in un regime di immunizzazione terapeutica o profilattica contro HIV.

Infine, data la loro dimostrata capacità di reagire specificamente con anticorpi anti-gpl20 dì HIV, le molecole PI e P2 dell'invenzione possono essere utilizzate come reagenti diagnostici in un procedimento in vitro per la rivelazione di anticorpi e/o sottopopolazioni anticorpali anti-gp 120 in un campione biologico, quale ad esempio un campione di siero, plasma, sangue o qualsiasi altro materiale biologico adatto, proveniente da un animale, ivi incluso un essere umano, ad esempio un paziente infettato da HIV o sospettato di essere infettato da HIV.

PARTE SPERIMENTALE

Ottenimento di IgG umane da aieri neutralizzanti il virus HIV

Le IgG umane sono state purificate da sieri di pazienti HIV-positivi con caratteristiche cliniche di una lenta progressione della malattia ( long-term non-progressors) e di una ottima risposta alla terapia antivirale.

Tali pazienti sono stati scelti attenendosi ai criteri clinico-virologici più stringenti nella definizione di " long-term non-progressor" . Tutti i pazienti selezionati erano infatti caratterizzati dai seguenti parametri:

- sieropositività ad HIV da almeno 8 anni;

- livelli di linfociti T CD4+ superiori a 600 cellule/μΐ da almeno 5 anni (questo è un importantissimo parametro per la valutazione dello status immunologie© dei soggetti scelti, non solo al momento dello studio, ma anche per un ampio lasso di tempo antecedente allo studio stesso);

- nessun segno clinico HIV-correlato da almeno 5 anni (si tratta di una indicazione importantissima di controllo nel tempo dell'infezione);

- nessun ricorso a terapie antìretrovirali.

Il rispetto di questi parametri ha permesso di ottenere (con evidenti difficoltà data la severità dei criteri proposti) nel tempo campioni di siero caratterizzati da una sorprendente attività neutralizzante ad ampio spettro, e quindi ottimali per il prosieguo dello studio.

Inoltre, non tutti i campioni di siero dei pazienti selezionati sono stati usati come preparazione policlonale stampo per l'ottenimento di antiidiotipo: solo i sieri in grado di inibire in maniera significativa un ampio pannello di isolati di HIV sono stati scelti per il prosieguo dello studio.

Aliquote di siero di questi pazienti sono state valutate per la capacità neutralizzante nei confronti di HIV-1.

In breve, per quanto riguarda la neutralizzazione virale, un ceppo virale linfotropico di riferimento (HIV-1 IIIB) (Advanced Biotechnologies Ine. - ABI) è stato dapprima titolato con il metodo di Karber (Oxford University Press, Virus Culture - A Practical Approach, ed. A.J. Cann, pag. 84) su una linea cellulare umana trasformata da HTLV-1 (C8166 - ECACC # 88051601), utilizzando 6 replicati per ogni diluizione di virus (range: 1:10 a 1:16000), e ottenendo così un titolo virale espresso in TCID50(ovvero dose in grado di determinare un effetto citopatico nel 50% delle cellule infettate). Nei test di neutralizzazione, 100 TCIDS0sono state quindi preincubate con diluizioni progressive dei sieri scelti, valutando la capacità di questi ultimi di inibire l'infezione delle cellule C8166 da parte del virus. A tale scopo, sono stati eseguiti prelievi del sovranatante di coltura ai giorni 3, 7 e 10 d.p.i. per il dosaggio della p24 virale (Vidas<*>HIV Duo Ultra, Biomerieux).

I sieri dotati di maggiore attività neutralizzante sono stati selezionati, e tutte le aliquote sono state riunite. La purificazione delle IgG dal siero è stata eseguita mediante cromatografia per immunoaffinità. In sintesi, il pool di sieri neutralizzanti è stato diluito con 3 volumi di PBS (phosphate buffered saline·. NaCl 8 mg/ml; KC1 0,2 mg/ml; Na2HP041,44 mg/ml; KH2P040,24 mg/ml) e filtrato con filtri da 0,45 μιη (Millipore Corporation; Bedford, MA). Il filtrato è stato quindi fatto passare attraverso una colonna di sefarosio contenente proteina G (Gammabind Sepharose™, GE Healthcare Life Sciences, UK). Dopo un lavaggio della colonna con 10 volumi di PBS, la componente IgG legata è stata eluita con 10 volumi di acido citrico 0,1 M a pH 3 e rapidamente neutralizzata con una soluzione basica (Tris-Base 1,5 M). Le varie frazioni ottenute sono state quindi lette allo spettrofotometro (O.D. 280 nm) per valutare la quantità di IgG ottenuta.

Purificazione di anticorpi anti-anl20 di HIV

Gli anticorpi diretti contro la glicoproteina gpl20 di HIV sono stati purificati mediante modifiche di una tecnica già descritta (Hariharan et al, 1993). In breve 700 μg di una glicoproteina gpl20 ricombìnante di tipo IIIB (ImmunoDiagnostics Ine., Woburn, MA) sono stati accoppiati mediante legame covalente a del Sefaroso 4B attivato con CNBr (CNBr-activated Sepharose™ 4B, GE Healthcare Life Sciences, UK). La suddetta quantità di antigene sciolta in 4 mi dì couplìng buffer (lOOmM NaHC03; 500 mM NaCl; portato a pH 8,2 con HCl) è stata aggiunta a 4 mi di resina ricostituita al 50%, dopo un lavaggio con HCl ImM. La mistura è stata posta in agitazione rotatoria per una notte a 4°C, e 1'antigene in eccesso non legato è stato lavato con un eccesso di couplìng buffer. La resina è stata poi trasferita in una siringa da 10 mi e lavata con dieci volumi di Tris lOmM, pH 7,5. 10 volumi di glicina ΙΟΟτηΜ (pH 2,5) sono stati quindi applicati alla colonna, seguiti da 10 volumi di lOmM Tris (pH8,8) e da 10 volumi di trietilamina lOOmM (pH 11,2), ed infine la colonna è stata lavata con lOmM Tris (pH7,5) fino a quando il pH ha raggiunto 7,5.

Gli anticorpi dei pazienti, diluiti 1:3 in lOmM Tris (pH7,5), sono stati passati lentamente per 7 volte sulla colonna contenente la resina a 4°C. La colonna è stata quindi lavata con 10 volumi di lOmM Tris (pH7,5) ed infine gli anticorpi sono stati eluiti con glicina lOOmM (pH2,5), ed immediatamente neutralizzati. Le frazioni sono state analizzate per la reattività nei confronti di gpl20 mediante ELISA. In particolare, ogni pozzetto è stato ricoperto con 100 ng di antigene risospeso in 25 mi di PBS, e successivamente le piastre sono state incubate overnight a 4 °C. Analogamente, sono stati ricoperti dei pozzetti con un antigene dì controllo albumina sierica bovina (BSA- #A7030- Sigma, St. Louis, MO). L'antigene in eccesso non legato alla piastra è stato quindi eliminato con una serie di lavaggi con acqua distillata. Le piastre sono state bloccate con PBS/BSA all'1%, ed incubate per 1 ora a 37 °C. Sono state quindi aggiunte diluizioni progressive (da 1:100 a 1:6400) di ognuna delle frazioni purificate come descritto, che sono state quindi lasciate in incubazione sugli antigeni per 2 ore a 37°C. Dopo un ciclo di 10 lavaggi con PBS/Tween 20 allo 0,05%, ad ogni pozzetto sono stati aggiunti 40 μΐ di una diluizione 1:700 in PBS/BSA 1% di una soluzione contenente anticorpi policlonali di capra (Sigma, St. Louis, MO) coniugati con perossidasi di rafano, e diretti contro la porzione Fc di IgG umane. Dopo un'incubazione di 1 ora a 37 °C, sono stati eseguiti altri 10 lavaggi con PBS-Tween. Ai pozzetti è stato quindi aggiunto il substrato dell'enzima (OPD-o-fenilendiammina -Sigma), e il segnale è stato rilevato mediante lettura spettrofotometrica ad una O.D.450 nm., avendo cura di raffrontare i valori sulla gpl20 a quelli riscontrati sulla BSA.

Le frazioni contenenti anticorpi antì-gpl20 sono state unite in un'unica preparazione e concentrate mediante ultrafiltrazione.

L'assenza di anticorpi contaminanti è stata dimostrata analizzando gli anticorpi purificati per la loro reattività nei confronti di antigeni contro i quali erano presenti anticorpi nel siero dei pazienti prima della preparazione (antìgeni di Herpes Simplex Virus e di Virus della Rosolia). A tale scopo, cellule Vero {ATCC # CCL-81) erano state infettate con i due virus (ATCC # VR-733; ATCC # VR-553). Dopo 6 giorni di incubazione a 37°C, le cellule infettate (e come controllo negativo cellule VERO non infettate) sono state prelevate. I pellet cellulari sono stati quindi risospesi in 250μ1 di buffer di lisi (50mM Trìs-HCl pH 8, 150mM NaCl; 0,02% Sodiazide; 0,5% Triton-X), incubati per 20 minuti in ghiaccio e centrifugati a 12 000 g per 2 minuti a 4°C. La concentrazione di proteine presenti nel sovranatante è stata quindi calcolata utilizzando un kit disponibile in commercio (BCATM Protein Assay Kit - Pìerce, Rockford, Illinois).

300 ng di estratto proteico sono stati quindi usati per ricoprire pozzetti di piastre ELISA, seguendo il protocollo precedentemente descritto per la gpl20.

Generazione di frammenti Pab

La generazione di frammenti Fab dalle IgG antigpl20 purificate è stata eseguita utilizzando il Pierce ImmunoPure Fab Preparation Kit (Pierce, Rockford, IL) seguendo le istruzioni d'uso fornite dal produttore. I Fab umani ottenuti da questo esperimento, (denominati RBIFab) sono stati utilizzati per immunizzare i topi e per alcuni saggi ELISA descritti in seguito.

Generazione di anticorpi monoclonali (mAb) di topo anti-idiotipo

Topi Balb/c femmine (Charles River Corporate, Wilmington, MA), dell'età di 4-6 settimane, sono stati immunizzati con un'iniezione settimanale ìntraperitoneale ripetuta tre volte con 0,5 mi di PBS contenente circa 50 pg di Fab umani purificati (RBIFab), uniti ad un ugual volume di adiuvante incompleto di Freund (Gibco). A queste 3 somministrazioni ne sono seguite altre 3, ancora a cadenza settimanale, sempre per via intraperitoneale, ma senza adiuvante incompleto. Prima dell'inizio del protocollo, e dopo questa tabella di immunizzazioni, sono stati eseguiti dei prelievi di sangue e in ELISA è stata valutata la risposta anticorpale di ogni animale nei confronti di Fab derivati da IgG purificate da sieri di pazienti sieronegativi per HIV. In breve, si è proceduto come descritto per gli ELISA precedenti, ricoprendo i pozzetti con 300 ng di Fab. Sono state quindi preparate diluizioni progressive (da 1:100 a 1:6400) del siero preimmune di ogni animale e del siero prelevato dopo il protocollo di immunizzazione. Gli anticorpi di topo legati alle diverse preparazioni sono stati quindi rilevati con una preparazione policlonale di anticorpi di capra (Sigma, St. Louis, MO) diretti contro la porzione Fc degli anticorpi murini. In caso di risposta soddisfacente (O.D. 450 della diluizione 1:1600 del siero immune almeno >1,5 rispetto al valore ottenuto con il siero preimmune), si procedeva così ad un ultimo inoculo di antigene 3 giorni prima del sacrificio degli animali per la fusione.

Produzione di anticorpi monoclonali di topo

La produzione di antìcorpi monoclonali di topo è stata eseguita utilizzando la metodica già descritta (R.Burioni, tesi di dottorato, 1993) con alcune modifiche.

Brevemente, sono state usate come partner di fusione delle cellule derivanti da una linea mielomatosa di topo NS-1 (ECACC # 85011427). Le cellule, così come gli ibridomi da esse derivati, sono state coltivate in terreno RPMI-1640 (Gibco) addizionato del 20% di siero fetale bovino (Flow) scomplementato. Per la fusione sono stati usati 2 terreni. Il primo, detto terreno di fusione, è stato preparato con 5 mi di terreno EMEM (Invitrogen), 0,75 mi di Dimetilsulfossido e 4,75 mi di PEG1540. I terreni selettivi HAT e HT sono stati invece preparati con 375,5 mi dì terreno RPMI-1640, 100 mi di siero fetale bovino scomplementato, 13,5 mi di bicarbonato dì sodio al 7%, e 5 mi di una soluzione HAT lOOx (Ipoxantina 1,36 mg/ml, Tìmidina 0,388 irvg/ml, Aminopterina - non presente nel caso del terreno HT -0,019 mg/ml). Ai terreni è stata anche addizionata penicillina (100 mUI/ml), Streptomicina (100 μg/ml), L-glutamina (concentrazione finale 2 mM) e Anfotericìna B (100μg/ml).

Tre giorni dopo l'ultimo inoculo previsto dalla tabella di immunizzazione, i topi sono stati uccisi attraverso dislocazione delle vertebre cervicali e la loro milza è stata rimossa in condizioni di sterilità. La milza è stata lavata e ridotta in frammenti mediante l'uso di aghi da siringa. Le cellule spleniche sono state quindi divise dai tralci fibrosi connettivali lasciando sedimentare questi ultimi in una provetta per alcuni minuti nella stessa cappa sterile. Le cellule spleniche sono state risospese in terreno EMEM, lavate mediante centrifugazione (1500 rpm per 10') e risospese in terreno EMEM addizionato di penicillina e streptomicina.

Contemporaneamente, cellule mìelomatose NS-1 sono state fatte crescere per 2 giorni in coltura partendo da un inoculo iniziale di circa 500.000 cellule. Le cellule sono state quindi lavate in terreno EMEM mediante centrifugazione {1500 rpm per 10') e rìsospese sempre in EMEM addizionato di penicillina e streptomicina.

I due sedimenti cellulari (uno composto dalle cellule spleniche, l'altro dalle cellule mielomatose ottenute attraverso coltura) sono stati infine risospesi in 10 mi di terreno EMEM, riuniti in una unica provetta e centrifugati per 10' a 1500 rpm, ottenendo un sedimento composto sia da cellule spleniche sia da cellule della linea mielomatosa.

Immediatamente, nell'arco di 1 minuto, le cellule sono state delicatamente risospese in 1 mi di terreno di fusione, al quale sono stati aggiunti 5 mi di terreno EMEM durante i 3 minuti successivi. Nei 3 minuti successivi sono stati aggiunti 7 mi di terreno RPMI contenente siero fetale bovino scomplementato al 20%. Le cellule sono state centrifugate (1200 rpm per 15') ed il sedimento risospeso in 10 mi di terreno HAT per poi essere diluito in 200 mi dello stesso terreno. Dopo 1 ora di incubazione a 36,5 °C in una camera con atmosfera controllata contenente il 5% di C02la sospensione cellulare è stata distribuita in 10 piastre Microtiter a 96 pozzetti (NUNC), 200 μΐ per pozzetto ed incubata nella stessa camera sopra descritta.

Le piastre contenenti le cellule derivate dalla fusione sono state osservate nei giorni successivi per valutare una eventuale crescita di ibridomi. Nel caso di crescita, il sopranatante della coltura cellulare è stato valutato per la presenza di anticorpi mediante ELISA. Gli ibridomi sono stati poi clonati mediante diluizione limite, espansi e, in parte, conservati in azoto liquido.

I cloni che avevano dimostrato in ELISA (seguendo il protocollo descritto) una reattività contro preparazioni di Fab ottenute da sieri di pazienti sieronegativi per HIV sono stati immediatamente scartati. I cloni che avevano dimostrato una negatività nei confronti delle preparazioni ottenute dai sieri di pazienti sieronegativi sono stati saggiati per la loro reattività nei confronti delle preparazioni di IgG anti-gpl20 purificate dai pazienti sieropositivi. I cloni positivi per questa reattività sono stati saggiati in ELISA utilizzando come antigene i frammenti Fab, da esse derivati, e impiegati nell'immunizzazione dei topi (RBlFab). Gli anticorpi monoclonali di topo in grado di reagire contro l'ultima preparazione (RBlFab) sono stati purificati mediante l'utilizzo di colonne Montage PROSEP-A (Fisher) secondo le istruzioni del produttore. Gli anticorpi purificati e concentrati sono stati infine valutati per la loro capacità di inibire il legame dei Fab anti-gpl20 purificati derivati dal siero dei pazienti (RBIFab) con 1'antigene stesso (gpl20) in un esperimento di inhibitlon ELISA modificando per anticorpi di topo metodiche già descritte (Bugli et al, J. Virol.

2001), ovvero ricorrendo ad una preparazione di anticorpi policlonali di capra coniugati con perossidasi e specificamente diretti contro le regioni conservate dei Fab murini (Sigma, St. Louis, MO).

Tra i cloni anticorpali che reagivano contro i Fab umani purificati (RBIFab) ne sono stati identificati 2 che erano anche in grado di inibire il legame tra Fab purificati (RBIFab) e gpl20. Questi cloni sono stati denominati Mabl e Mab2.

Per la preparazione dei frammenti Fab dalle cellule in coltura è stato estratto l'mRNA, sono stati amplificati i cDNA codificanti la catena leggera e la parte della catena pesante che fa parte del Fab mediante metodiche descritte (CSH press, Phage display manual, ed. D.R.Burton, pag. Al.10), e tali cDNA sono stati quindi clonati insieme in un vettore di espressione già descritto denominato RBCaf (Burloni et al, J. Imm. Meth, 1988). In breve, il gene (DNA amplificato) codificante la catena pesante di ogni Fab è stato digerito con gli enzimi di restrizione Xhol e Spel (Roche) per 1,5 ore a 37°C e successivamente ligato all'interno del sito di clonaggio del vettore per le catene pesanti, a sua volta digerito con gli stessi enzimi. Le catene leggere (DNA amplificato) sono state invece digerite con gli enzimi Sacl e XbaI (Roche) e quindi clonate all'interno del vettore analogamente digerito.

I costrutti ricombinanti così ottenuti per ognuno dei 2 cloni sono quindi stati usati per elettrotrasformare il ceppo di E. coli XLIBlue (reso competente mediante lavaggi a freddo in glicerolo), secondo protocolli standardizzati per l'utilizzo di cuvette da 0,2 cm (Voltaggio: 2500 V; Capacitanza: 25 μΡ; Resistenza: 200 Ω).

Valutazione in ELISA dei Fab monoclonali ottenuti dal clonaggio in RBCaf

Cloni di batteri trasformati con il costrutto RBCaf , sono stati inoculati in 10 mi di terreno SB contenente ampìcillina e tetraciclina alle concentrazioni rispettivamente di 50pg/ml , 10pg/ml, e fatti crescere in agitazione a 37°C fino a raggiungere una O.D.600=1. Successivamente è stato aggiunto un induttore specifico (IPTG-isopropiip-Dtiogalattopìranoside) ad una concentrazione finale di ImM, e la coltura è stata lasciata a 30°C in agitazione overnight. Le cellule sono state lisate per shock termico (3 cicli di congelamento e scongelamento, rispettivamente a -80°C e a 37°C) e successivamente centrifugate per separare i detriti cellulari dal sovranatante contenente i Fab. I Fab solubili ottenuti sono stati saggiati in ELISA. Piastre Microtìter a 96 pozzetti (Nunc) sono state ricoperte con i Fab purificati RBl (300 ng per pozzetto) e BSA come antigene di controllo negativo, e incubate overnight a 4°C. Dopo rimozione dell'antigene non legato, la piastra è stata lavata 5 volte con PBS, ed i siti leganti aspecifici sono stati bloccati mediante albumina al 3% in PBS per 1 ora a 37°C. Dopo la rimozione della soluzione bloccante sono stati aggiunti i sovranatanti delle colture cellulari trattate come sopra descritto e contenenti i Fab solubili. È seguita una fase di incubazione a 37° per 2 ore. Dopo un ciclo di 10 lavaggi con PBS/Tween 20 allo 0,05% sono stati aggiunti 40 μΐ di una diluizione 1:700 in PBS/BSA 1% di una preparazione policlonale di immunoglobuline di capra (Sigma), coniugate con la perossidasi di rafano, dirette contro Fab di topo. Dopo una incubazione di 1 ora a 37 °C ed una ulteriore serie di 10 lavaggi, è stato aggiunto ai pozzetti il substrato (OPD-ofenilendiammina) . Le piastre sono poi state incubate per 30 minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce. La reazione è stata bloccata con acido solforico IN e la densità ottica è stata valutata mediante lettura allo spettrofotometro a 450nm.

Al termine del clonaggio, per ogni anticorpo monoclonale 40 cloni di batteri ricombinanti sono stati analizzati come appena descritto e per ognuno di essi è stato selezionato un clone in grado dì produrre Fab di topo atti a legare i Fab umani purificati (RBIFab). Successivamente, le seguenze di DNA della parte variabile della catena leggera e della parte variabile della catena pesante di tali cloni selezionati, chiamati Pomonal e Pomona2 (PI e P2), sono state analizzate. Tali sequenze sono quelle fornite nella sezione relativa alla lista delle sequenze.

Purificazione dei Fab PI e P2

I Fab PI e P2 sono stati successivamente purificati per ìmmunoaffinità, mediante colonne costituite da una resina di sefarosio contenente proteina G (~ 2 mg/ml), a cui è stata covalentemente legata una preparazione policlonale di anticorpi di capra antì-Fab murini (PIERCE, Illinois). In breve, una colonia di ogni clone è stata inoculata in 10 mi di terreno SB contenente ampicillina e tetraciclina alle concentrazioni rispettivamente di 50pg/ml e 10pg/ml. La coltura, fatta crescere overnight a 37°C, è stata subinoculata in una beuta con 500 mi di SB addizionato della stessa concentrazione di antibiotici utilizzata in precedenza. Le cellule, successivamente indotte con IPTG lmM, sono state lasciate in agitazione overnight a 30°C. La coltura è stata centrifugata a 5000 rpm per 25 minuti ed il pellet risospeso con PBS è stato sonicato. Una successiva centrifugazione a 18.000 rpm per 25 minuti è stata necessaria per rimuovere i detriti cellulari ed il sovranatante è stato filtrato e successivamente è stato fatto passare lentamente attraverso la colonna di sefaroso precedentemente descritta. In seguito la resina è stata lavata con 10 volumi di PBS e infine i Fab legati sono stati eluitì con una soluzione acida ( elutìon buffer- H20/ HC1 pH 2,2) e le frazioni raccolte sono state neutralizzate con l'apposita soluzione (Tris 1M pH 9). Le frazioni raccolte sono state concentrate mediante ultrafiltrazione (Centricon, Millipore). La purezza del purificato è stata valutata facendo correre una aliquota su di un gel di poliacrilammide/sodiododecilsolfato (SDS-PAGE) al 12%. Infine, diluizioni progressive di tali Fab purificati sono state saggiate in ELISA come precedentemente descritto. In ogni piastra sono state incluse, come controlli negativi, preparazioni di Fab monoclonali diretti contro la glicoproteina E2 di HCV (e8; e20; el37; e509; Burroni et al, Hepatology, 1998).

I risultati ottenuti sono descritti in figura 1, in cui sono riportati ì valori medi di densità ottica {con relativa deviazione standard) relativi ai Fab monoclonali PI e P2. Tutti i dati riportati sono stati generati da esperimenti ELISA eseguiti in 3 differenti sedute in cui ogni punto di diluizione è stato ripetuto in doppio.

Questi dati mostrano una elevata reattività di entrambi i Fab PI e P2 nei confronti della preparazione di FabRBl, inoltre tali Fab non sono in grado di legare il pannello dì Fab umani caratterizzati da una diversa specificità di legame rispetto a FabRBl. Anche alla concentrazione più alta (~ 30 μg/ml) i due Fab murini, infatti, non sono in grado di riconoscere le preparazioni di Fab con diversa specificità di legarne,· i valori di O.D. 450 sono infatti risultati in tutti gli esperimenti inferiori o pari a 0,5, a fronte dei valori superiori a 2,5 rilevati sulla preparazione RB1. Entrambi ì Fab si sono inoltre dimostrati in grado riconoscere la preparazione REI anche alla concentrazione più bassa (~ 0,5 μ0/πι1) usata negli esperimenti.

Valutazione della capacità delle molecole antiidiotipo ottenute di stimolare in modelli animali un risposta specifica anti-qpl20

Le molecole PI e P2, ottenute come descritto sopra, sono state utilizzate per immunizzare modelli animali diversi dal topo, al fine di valutarne la capacità di stimolare una risposta specifica anti-HIV/gpl20 . In particolare, sono stati utilizzati dei conigli New Zealand femmine di 4-5 settimane (Allevamento Bettinardi, Novara, Italia), compresi fra i 2,3 e i 2,5 Kg di peso. Gli animali (6 per gruppo) sono stati suddivisi in tre coorti:

- Coorte A: animali immunizzati con il Fab antiidiotipo PI;

Coorte B: animali immunizzati con Fab antiìdiotipo P2;

- Coorte C: animali immunizzati con un Fab di controllo (JOl) privo di caratteristiche di antiidiotipo .

Due settimane prima dell'inizio del protocollo di immunizzazione, ad ogni animale sono stati prelevati dall'arteria mediana dell'orecchio fino ad un massimo di 5 mi di sangue per ottenere siero pre-immune . 200 pg di ogni antigene, risospeso in max. 500 pi di soluzione fisiologica e 500 pi di soluzione adiuvante, sono stati quindi somministrati a scadenza trisettimanale mediante iniezioni multiple {max. 10) sul dorso, previa opportuna preparazione antisettica della sede di inoculo. La purezza dì ogni antigene, purificato per immunoaffinità, è stata valutata mediante SDS-PAGE. Inoltre, prima dell'emulsione con l'adiuvante, ogni soluzione di antigene è stata preventivamente filtrata con filtri da 0,2 pm. Dopo 2 settimane dalla terza immunizzazione, ad ogni animale sono stati prelevati un massimo di 5 mi di sangue, per la valutazione della risposta umorale in ELISA. Con approccio analogo a quelli descritti nei precedenti paragrafi, piastre ELISA sono state ricoperte con 50 ng/pozzetto di gpl20 (HIV IIIB) e lasciate overnight a 4°C. Il giorno dopo, l'antigene non legato è stato rimosso mediante lavaggi con soluzione fisiologica. Si è provveduto quindi a saturare i siti aspecifici di ogni pozzetto con una soluzione PBS/BSA 1%, lasciando le piastre in incubazione per 1 h a 37°C. Diluizioni progressive del siero preimmune e di quello post-immune (dopo 3 immunizzazioni) di ogni animale sono state quindi aggiunte ai pozzetti ed incubate 1,5 ore a 37°C. Le piastre sono state quindi lavate in automatico per 5 volte con una soluzione PBS/Tween 200,05%, e gli anticorpi legati all'antigene sono stati successivamente rilevati con un'adatta diluizione di policlonale anti-Ig di coniglio (Pierce) coniugato con perossidasi di rafano. Dopo un'ulteriore ora di incubazione a 37°C, e successivi altri 5 lavaggi, si è provveduto a leggere il segnale ottenuto come precedentemente descritto.

I risultati ottenuti sono descritti nella figura 2, in cui sono riportati i valori medi (con relativa deviazione standard) della risposta antìgpl20 stimolata nei conigli appartenenti ai 3 diversi gruppi di immunizzazione. I dati riportati sono relativi ad esperimenti ELISA ripetuti in doppio in tre diverse sedute per ogni punto di diluizione .

Da questa serie di dati è evidente come ambedue gli anticorpi siano in grado di suscitare una risposta immune anti-gpl20 in animali da esperimento, risultando quindi molecole potenzialmente utili in applicazioni vaccinali. La risposta è evidente anche ad alte diluizioni di siero (1:1600), con un incremento medio di O.D. 450 nm superiore a 1 nel caso degli animali immunizzati con Pi, e pari a circa 0,5 nel caso di P2. Il confronto tra i dati ottenuti dalle coorti immunizzate con gli antiidiotìpo e quelli ottenuti dalla coorte immunizzata con 1'anticorpo murino di controllo (JO-1), ha permesso inoltre di verificare la validità statìstica dei risultati. In particolare, applicando allo studio un test non parametrico per dati non appaiati (test di Mann - Whitney), è stato possibile dimostrare come la distribuzione dei risultati ottenuti per i 3 gruppi di animali non sia affatto casuale, come evidenziato dai valori di p in ogni caso inferiori a 0,05. La significatività aumenta, inoltre, alle diluizioni più alte dei sieri (1/800 e 1/1600), con valori di p inferiori a 0,01. Quest'ultimo dato, oltre a confermare la validità statistica di questo esperimento eseguito su un numero minimo di animali, depone decisamente a favore della specificità del fenomeno osservato.

Immunizzazione con qpl20 dei conigli precedentemente immunizzati con anticorpi monoclonali antiidiotipo

Sei settimane dopo il secondo boost con PI , P2 e Jol, i conigli appartenenti rispettivamente alle coorti A, B e C sono stati immunizzati con gpl20.

200 pg di antigene risospeso in 500 μΐ di soluzione fisiologica e 500 μΐ di adiuvante incompleto di Freund (Gibco) sono stati somministrati seguendo la stessa modalità precedentemente descritta. Dopo 2 settimane dalla immunizzazione, ad ogni animale sono stati prelevati circa 5 mi di sangue, per la valutazione in ELISA della risposta umorale antigpl20, con un approccio analogo a quello decritto in precedenza. I dati sono stati ottenuti da esperimenti ELISA ripetuti in doppio per ogni punto di diluizione e in tre diverse sedute.

I dati rappresentati nella figura 3, in cui sono riportati i valori medi (con relativa deviazione standard) della risposta anti-gpl20 stimolata nei conigli appartenenti ai 3 diversi gruppi di immunizzazione, mostrano come i 3 gruppi di conigli abbiano risposto a gpl20 dopo la prima immunizzazione ed evidenziano inoltre la presenza di una risposta di maggiore entità, nelle coorti di conigli immunizzati con PI e P2 rispetto alla coorte di conigli immunizzati con Jol. Questi dati indicano che gli animali esposti a PI e P2 hanno la capacità di mon tare una risposta immune più efficace nei confronti dì gpl20 rispetto a quelli esposti ad un antigene di controllo.

LISTA DELLE SEQUENZE PI (catena pesante)

Sequenza nucleotidica (SEO ID NO : 5)

GAGCTGGTGAAGCCTGGCGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGT TACTCATTCACTGACTACAACATGAACTGGGTGAAGCAGAGCAATGGAAAG AGCCTTGAGTGGATTGGAGTAATTAATCCTAACTCTGGTACTACTGGCTAC AATCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACCAATCTTCCAGC ACAGCCTACATGCAGCTCAACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTAT TACTGTGCAGAATATTACTACGGCGAGGATCCTTTTGCTTACTGGGGCCAA GGGACTCTGGTCACTGTCTCTACAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTAT CCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACT

Sequenza aminoacidica (SEO ID N0: 1 )

ELVKPGASVKISCKASGYSFTDYNMNWVKQSNGKSLEWIGVINPNSGTTGY NQKFKGKATLTVDQSS STA YMQLNSLTS ELSA VYYCAEYYYGEDPFAYWGQ GTLVTVSTAKTTPPSVYPLAPGSAAQT PI (catena leggera)

Sequenza nucleotidica (SEO ID NO: 6)

TCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATGCAGGGCCAGC CAAAGTGTCAGTACATCTAGCTATAGTTATATGCACTGGTACCAACAGAAA CCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCAAGTATGCATCCAACCTAGAATCT GGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTC AACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATACTGCAACATATTACTGTCAGCAC AGTTGGGAGATTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA Sequenza aminoacidica (SEO ID NO: 2)

SLAVSLGQRATISCRASQSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASNLES GVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDTATYYCQHSWEIPYTFGGGTKLEIK

P2 (catena pesante)

Sequenza nucleotidica (SEO ID NO: 7)

CTGGTGCAGCCTGGAGGATCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCAGGAATT GATTTTAGTAGATTCTGGATGAGTTGGATTCGGCGGGCTCCAGGGAAAGGA CTAGAATGGATTGGAGAAATTGATCCAGATGGCAGTACAATAAACTATGCA CCATCTCTAAAGGATAAATTCATCATCTCCAGAGACAACGCCAAAAATACG CTGTACCTGCAAATGAGCAAAGTGAGATCTGAGGACACAGCCCTTTATTAC TGTGCAAGAGAGGGGGCCTATGGTAACTATGACTGTGCTATGGACTACTGG GGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCT GTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACT

Sequenza aminoacidica ( SEO ID NO: 3)

LVQPGGSLKLSCAASGIDFSRFWMSWIRRAPGKGLEWIGEIDPDGSTINYA PSLKDKF11SRDNAKNTLYLQMSKVRSEDTALYYCAREGAYGNYDCAMDYW GQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQT

P2 (catena leggera)

Sequenza nucleotidica (SEO ID NO: 8)

TCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGT CAGAACATTGTACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAG AGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACÀTGGTTTCCAATCGATTT TCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACA CTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTAGGAGTTTATTACTGCTTT CAAGGTTCACATGCTCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATC AAA

Sequenza aminoacidica (SEP ID NO: 4) SLPVSLGDQASISCRSSQNIVHSNGNTYLEWYLQRPGQSPKLLIYMVSNRF SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHAPPTFGGGTKLEI K RIFERIMENTI

1. Bugli F, et al . J Virol. 2001 Oct;75(20):9986-90 2. Burloni R. Tesi di dottorato, 1993

3. Carlos F. Barbas, et al . Phage display. Cold Spring Harbor Laboratory Press; New York {pag. Al.10)

4. Hariharan K, et al. J Virol. 1993 Feb;67(2}:953-60

5. Burioni R, et al . J. Imm. Methods 217:195-199 (1998)

6. Burloni R., et al. Hepatology 28:810-814 (1998)

Claims (21)

1. RIVENDICAZIONI 1. Anticorpo monoclonale anti-idiotìpo avente le seguenti proprietà immunologiche: - è atto a reagire specificamente con l'idiotipo di anticorpi umani anti-gp!20, - è atto a inibire il legame fra 1'antigene gpl20 e anticorpi umani anti-gpl20, e - è atto a suscitare una risposta immune antì-gpl20 in un animale a cui viene somministrato, comprendente almeno la parte variabile di una catena leggera e almeno la parte variabile di una catena pesante, caratterizzato dal fatto che detta parte variabile della catena leggera ha la sequenza amminoacidica identificata come SEQ ID NO:2 e detta parte variabile della catena pesante ha la sequenza ammìnoacidica identificata come SEQ ID N0:1, oppure caratterizzato dal fatto che detta parte variabile della catena leggera ha la sequenza amminoacidica identificata come SEQ ID NO:4 e detta parte variabile della catena pesante ha la sequenza amminoacidica identificata come SEQ ID NO:3, o frammento o derivato di detto anticorpo monoclonale anti-idiotipo, avente le caratteristiche immunologiche sopra identificate.
2. 2. Anticorpo monoclonale anti-idiotipo avente le seguenti caratteristiche immunologiche: - è atto a reagire specificamente con l'idiotipo di anticorpi umani anti-gpl20, - è atto a inibire il legame fra 1'antigene gpl20 e anticorpi umani anti-gpl20, e - è atto a suscitare una risposta anti-gpl20 in un animale a cui viene somministrato, comprendente almeno la parte variabile di una catena leggera e almeno la parte variabile di una catena pesante, caratterizzato dal fatto che detta parte variabile della catena leggera è codificata dalla sequenza di acido nucleico identificata come SEQ ID NO:6 e detta parte variabile della catena pesante è codificata dalla sequenza di acido nucleico identificata come SEQ ID NO:5, oppure caratterizzato dal fatto che detta parte variabile della catena leggera è codificata dalla sequenza di acido nucleico identificata come SEQ ID NO:8 e detta parte variabile della catena pesante è codificata dalla sequenza di acido nucleico identificata come SEQ ID NO:7.
3. 3. Anticorpo monoclonale anti-idiotipo secondo la rivendicazione 1 o 2, che è una immunoglobulina intera .
4. 4. Anticorpo monoclonale anti-idiotipo secondo la rivendicazione 1 o 2 , che è un frammento Fab.
5. 5. Anticorpo monoclonale anti-idiotipo secondo la rivendicazione 1 o 2, che è un anticorpo a catena singola.
6. 6. Anticorpo monoclonale anti-idiotipo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 5, che è coniugato con un carrier.
7. 7. Sequenza amminoacidica isolata scelta nel gruppo che consiste di SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4, o frammento di detta sequenza di almeno 8 aminoacidi di lunghezza avente le seguenti proprietà immunologiche: - è atto a reagire specificamente con l'idiotipo di anticorpi umani antì-gpl20, - è atto a inibire il legame fra 1'antigene gpl20 e anticorpi umani anti-gpl20, e - è atto a suscitare una risposta immune anti-gpl20 in un animale a cui viene somministrato.
8. 8. Sequenza nucleotidica isolata scelta nel gruppo che consiste di SEQ ID N0:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO:8.
9. 9 . Vettore di espressione comprendente almeno una sequenza nucleotidica secondo la rivendicazione 8.
10. 10. Vettore di espressione secondo la rivendicazio ne 9, comprendente le sequenze nucleotidiche identificate come SEQ ID NO: 6 e 5 o le sequenze nucleotìdiche identificate come SEQ ID NO: 7 e 8.
11. 11. Cellula ospite trasformata con un vettore di espressione secondo la rivendicazione 9 o 10.
12. 12. Composizione immunogenica comprendente una quantità immunologicamente efficace di almeno un anticorpo monoclonale anti-idiotipo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 6 ed un veicolo e/o diluente e/o adiuvante farmaceuticamente accettabile.
13. 13. Corredo di parti comprendente un anticorpo monoclonale anti-idiotipo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 6 e l'antigene gpl20 di HIV come preparazione combinata per la somministrazione simultanea, separata o sequenziale in un regime di immunizzazione terapeutica o profilattica contro HIV.
14. 14. Uso di un anticorpo monoclonale anti-idiotipo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 6, per la preparazione di un medicamento per il trattamento terapeutico o profilattico dell'infezione da HIV o di malattie ad essa correlate, mediante l'induzione di una risposta immune contro HIV.
15. 15. Uso di un anticorpo monoclonale anti-idiotipo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 6, come reagente in un procedimento in vitro per la rivelazione di anticorpi o sottopopolazioni anticorpali anti-gp 120 di HIV in un campione biologico proveniente da un soggetto animale, ivi incluso un essere umano.
16. 16. Procedimento per la preparazione di un pannello di anticorpi monoclonali anti-idiotipo adatti per il trattamento profilattico o terapeutico dell'infezione da HIV o di malattie ad essa correlate, comprendente le fasi di: (i) provvedere una preparazione di anticorpi policlonali umani anti-gpl20, detti anticorpi essendo in forma di Fab, detta preparazione possedendo un'attività neutralizzante HIV ad ampio spettro,-(ii) utilizzando come stampo i Fab anti-gpl20 della fase precedente, generare un pannello di anticorpi monoclonali anti-idiotipo atti a reagire specificamente con 1'idiotipo di anticorpi umani anti-gpl20; e (iii) selezionare, all'interno del pannello di anticorpi monoclonali anti-idiotipo ottenuto nella fase precedente, un sottoinsieme di anticorpi monoclonali anti-idiotipo che sono atti ad inibire il legame immunologico fra gpl20 e anticorpi umani anti-gpl20.
17. 17. Procedimento secondo la rivendicazione 16, in cui i Fab anti-gpl20 utilizzati come stampo per generare anticorpi anti-idiotipo sono Fab di IgG anti-gp 120 umane purificate.
18. 18. Procedimento secondo la rivendicazione 16 o 17, in cui gli anticorpi monoclonali anti-idiotipo generati nella fase (ii) sono anticorpi monoclonali murini.
19. 19. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 16 a 18, in cui detti anticorpi umani anti-gpl20 menzionati nella fase (iii) sono i Fab umani anti-gpl20 precedentemente utilizzati come stampo.
20. 20. Pannello di anticorpi monoclonali antiidiotipo, caratterizzato dal fatto di consistere di anticorpi diretti specificamente contro 1'idiotipo di anticorpi umani antì-gpl20 e dal fatto di essere atti a inibire il legame fra gpl20 e anticorpì umani anti-gpl20.
21. 21. Pannello secondo la rivendicazione 20, in cui detti anticorpi monoclonali anti-idiotipo sono anticorpi murini.