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ITTO20060365A1 - Uso di sostanze parasimpaticolitiche per potenziare ed accelerare il differenziamento di cellule staminali, relativo procedimento e relativi prodotti - Google Patents

Uso di sostanze parasimpaticolitiche per potenziare ed accelerare il differenziamento di cellule staminali, relativo procedimento e relativi prodotti Download PDF

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Publication number
ITTO20060365A1
ITTO20060365A1 IT000365A ITTO20060365A ITTO20060365A1 IT TO20060365 A1 ITTO20060365 A1 IT TO20060365A1 IT 000365 A IT000365 A IT 000365A IT TO20060365 A ITTO20060365 A IT TO20060365A IT TO20060365 A1 ITTO20060365 A1 IT TO20060365A1
Authority
IT
Italy
Prior art keywords
scopolamine
atropine
hydrochloride
parasympatholytic
cells
Prior art date
Application number
IT000365A
Other languages
English (en)
Inventor
Tetyana Denysenko
Nardo Paolo Di
Luisa Gennero
Gian Piero Pescarmona
Antonio Ponzetto
Maria Augusta Roos
Roberto Sangiorgio
Original Assignee
Univ Degli Studi Torino
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Degli Studi Torino filed Critical Univ Degli Studi Torino
Priority to IT000365A priority Critical patent/ITTO20060365A1/it
Priority to EP07705967A priority patent/EP2026807A1/en
Priority to US12/301,392 priority patent/US20100130544A1/en
Priority to PCT/IB2007/050644 priority patent/WO2007135574A1/en
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Description

DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo: "Uso di sostanze parasimpaticolitiche per potenziare ed accelerare il differenziamento di cellule staminali, relativo procedimento e relativi prodotti"
TESTO DELLA DESCRIZIONE
La presente invenzione concerne un nuovo uso di sostanze parasimpaticolitiche e, più in particolare, l'uso di sostanze parasimpaticolitiche per potenziare ed accelerare il differenziamento di cellule staminali, preferibilmente cellule staminali pluripotenti, in cellule con fenotipo tessutospecifico, il relativo procedimento ed i relativi prodotti .
E' noto dal 1998 [1, 2] che le cellule staminali possono essere mantenute in vitro indefinitamente in uno stadio indifferenziato, ovvero lasciate proliferare amplificandone il numero, o anche essere "guidate" a differenziarsi in cellule epatiche, miocardiche, neurali, pancreatiche ecc. utilizzando terreni di coltura inducenti diversi, principalmente a base di fattori di crescita [3-6].
La presente invenzione si prefigge lo scopo di individuare sostanze capaci di stimolare, potenziare ed accelerare il differenziamento e la proliferazione delle cellule staminali in cellule con fenotipo tessuto-specifico rispetto a quanto operato attualmente.
Secondo la presente invenzione, tale scopo è raggiunto grazie alla soluzione richiamata in modo specifico nelle rivendicazioni che seguono. Le rivendicazioni formano parte integrante dell'insegnamento tecnico qui fornito in relazione all'invenzione .
L'invenzione riguarda l'uso di sostanze parasimpaticolitiche capaci di stimolare, potenziare ed accelerare il differenziamento e la proliferazione delle cellule staminali in cellule aventi un fenotipo tessuto-specifico.
In una forma di attuazione l'invenzione concerne l'uso di almeno una sostanza parasimpaticolitica per la preparazione di un medicamento per stimolare, potenziare ed accelerare il differenziamento e la proliferazione delle cellule staminali in cellule aventi un fenotipo tessuto-specifico in un soggetto che ne abbisogni.
In un'altra forma di attuazione la presente invenzione concerne mezzi di coltura addizionati di almeno una sostanza parasimpaticolitica aventi la capacità di stimolare, potenziare ed accelerare il differenziamento e la proliferazione delle cellule staminali in cellule aventi un fenotipo tessutospecifico.
Ancora la presente invenzione riguarda un procedimento per stimolare, potenziare ed accelerare il differenziamento e la proliferazione delle cellule staminali in cellule aventi un fenotipo tessuto-specifico, dove le cellule staminali sono coltivate in presenza di almeno una sostanza parasimpaticolitica e di un fattore di crescita inducente tessuto-specifico.
L'invenzione sarà ora descritta in modo dettagliato, a puro titolo di esempio non limitativo, facendo riferimento ad alcune forme di attuazione particolarmente preferite.
E' nota l'osservazione in vivo di un particolare stimolo proliferativo esercitato da alcune sostanze simpaticomimetiche [6-10].
La presente invenzione si fonda sull'osservazione in vitro di un particolare stimolo al differenziamento cellulare di cellule staminali esercitato da sostanze parasimpaticolitiche. Tali sostanze addizionate al terreno di coltura fenotipo inducente sulle cellule staminali oggetto di studio inducono un accelerato differenziamento e di seguito una proliferazione cellulare; le sostanze parasimpaticolitiche sono, infatti, state utilizzate per la prima volta come attivatori di fattori di crescita (HGF, fattore di crescita epatocitario; MCSF, fattore di crescita di macrogafi) e come induttori di un accelerato differenziamento e proliferazione di cellule staminali in un fenotipo tessuto-specifico. L'accelerazione rispetto ai terreni di coltura inducenti precedentemente studiati dai presenti inventori (e.g. domande di brevetto italiano n. T02005A000800 e T02005A000819) è dimostrata dal minor tempo occorso per ottenere il differenziamento: 7-10 giorni invece di 15-28 giorni.
Le composizioni oggetto della presente invenzione forniscono i seguenti vantaggi:
eccellente crescita e recupero del trofismo fisiologico quando le composizioni vengano addizionate ai comuni terreni di coltura specifici per cellule staminali;
rapido differenziamento in vitro delle cellule staminali nel fenotipo tessuto-specifico, quando si utilizzi un terreno di coltura tessutospecifico-inducente;
tutti i fenotipi tessuto-specifici ottenuti sono stati congelati a -80°C, scongelati, e riattivati in coltura per un altro mese, constatandone sempre la isto-normo funzionalità.
MATERIALI E METODI
Le composizioni oggetto della presente invenzione sono state preparate impiegando tra le altre le sostanze riportate di seguito:
1. Aminoacidi
Metionina, cistina, N-acetilcisteina, cisteina, glieina, leucina, isoleucina, prolina, glutamina, arginina, acido glutamico, istidina, istidina-HCl-H20, lisina, lisina-HCl, fenilalanina, serina, treonina, triptofano, tirosina, tirosina-sale disodico, vaiina, prolina, idrossiprolina, soluzione contenente tutti gli aminoacidi non essenziali.
2. Peptidi
Glutatione, collagene, elastina, estratto di frumento, polipeptidi cui sono attribuite funzioni trofiche.
3.Vitamine
Acido retinoico, retinolo, acido ascorbico, acido pantotenico, D-calcio pantotenato, piridoxina, piridoxina-HCl, acido folico, niacinamide, riboflavina, cobalamina, acido para-aminobenzoico e biotina.
4. Fattori vitaminici
Inositolo, mio-inositolo, colina cloruro, acido piruvico, piruvato di sodio, putresceina e putresceina-HCl.
5. Fattori di crescita
TGF-Beta (fattore di crescita di trasformazione Beta), LIF (fattore inibitore della leucemia), ITS (insulina-transferrina-selenio), insulina, HGF (fattore di crescita stimolatore epatocitario), M-CSF (fattore di crescita stimolatore di macrofagi), IL-2 (Interleuchina 2), IL-6 (Interleuchina 6), PMA (forbolo 12-miristato 13-acetato), acido linoleico, siero autologo.
6. Sali
Gluconato di calcio, desametasone 21-fosfato disodico, fosfato di calcio, bicarbonato di sodio, calcio cloruro, magnesio cloruro, magnesio solfato, potassio cloruro, potassio fosfato, sodio cloruro, calcio nitrato, zinco cloruro, nitrato ferrico, piruvato di sodio, D-calcio pantotenato, tirosina sale disodico, sodio selenite, zinco selenite.
7. Enzimi proteolitici
Papaina, collagenasi (preferibilmente di tipo la, tipo II, tipo IV), serratiopeptidasi, eparanasi, DNAsi, elastasi, bromelaina, bradichinasi, Clostridium peptidasi, enzimi espressi da Lactobacillus acidophilus, enzimi espressi dal genere Aspergillus, proteasi, aliinasi, fibrinolisina .
8. Mucopoli saccaridi
Acido ialuronico, condroitinsolfati.
9. Zuccheri, loro alcoli derivati e loro miscele
Glucosio, saccarosio, glucani, mannani, glucomannani , fucosio, fruttosio, eparansolfati, pectine, amidi, loro alcoli derivati.
10. Soluzioni per coltura cellulare
RPMI 1640 (terreno per colture cellulari), DMEM-LG (terreno per colture cellulari), FBS (siero bovino fetale per colture cellulari), F12 (soluzione per colture cellulari contenente una fonte aminoacidica completa), HANK'S solution (soluzione per colture cellulari contenente bicarbonato di sodio), SyntheChol (NSO Supplement Sigma).
11. Emoderivati
Siero autologo da sangue periferico del soggetto donatore e ricevente di tessuti, cellule e mezzi di coltura.
12. Sostanze parasimpaticolitiche
Adifenina, amminocarbof luorene, anisotropina, anticolinesterasici, atropina, benzatropina, ciclopentolato, clidinio, diciclomina, dicicloverina, diossilina, esociclio, etaverina, glicopirrolato, imbacina, ipratropio, mcn-a-343 (mclorofenil-carbamolo-ossibutinil -trimetil-ammoniocloruro), metil-scopolamina, metocramina, mepenzolato, metantelina, muscarina, omatropina, ossifenciclimina, ossifenonio, oxotremorina, piperidolato, poldina, pipenzolato, pirenzepina, pirenzepina analogo (AF-DX 116), pralidossina, propantelina, propantelina bromuri, prifinio, tiemonio, tiotropio, tolterodina, tripitramina, tropicamina, trospio, scopolamina; tutti i derivati e loro alcaloidi naturali e di sintesi delle sostanze elencate. E preferibilmente, secondo la classificazione IUPAC:
1) Anisotropina
[(8-metil-8-azabiciclo [3.2.1]otto-3-il)-2-propilpentanoato];
2) Anisotropina metilbromuro;
3) Atropina
[(8-metil-8-azabiciclo [3.2.1]otto-3-il) 3-idrossi-2-fenil-propanoato];
4) Atropina idrocloruro;
5) Atropina iperdurica (hyperduric);
6) Atropina metilbromuro;
7) Atropina metilnitrato;
8) Atropina N-ossido;
9) Atropina solfato;
10) Clidinio
[ (4-metil-4-azoniabiciclo [2.2 .2] otto- 2 -il) -2-idrossi-2 , 2-difenil-acetato] ;
11) Clidinio bromuro;
12) Ciclopentolato
[2-dimetilaminoetil-2-(1-idrossiciclopentil)-2-fenil-acetato];
13) Ciclopentolato idrocloridrato;
14) Diciclomina
[2-dietilaminoetill-cicloesilciclo-esano-1-carbossilato];
15) Glicopirrolato
[(1,1-dimetil-2,3,4,5-tetraidropirrolo-3-il)-2-ciclo pentil-2-idrossi-2-fenil-acetato] ;
16) Isopropamide
[(3-carbamoil-3,3-difenil-propil)-metil-dipropano-2-il-ammonio] ;
17) Esociclio metilsolfato
[l-cicloesil-2(4,4-dimetil-2,3,5,6 tetraidropirazina -1-il)-1-fenil-etanolo; solfonato-ossimetano];
18) Mepenzolato
[ (1 , 1-dimetil-3 , 4 , 5 , 6-tetraidro-2H-piridina-3-il) 2-idrossi-2 , 2-difenil-acetato] ;
19) Metantelina
[dietil-metil- [2 - (9H-xanten-9-il-carbonil-ossi) -et il] ammonio] ;
20) Metilatropina
[(8,8-dimetil-8-azoniabiciclo [3.2.1]otto-3-il) 3-idrossi-2-fenil-propanoato];
21) Metilatropina nitrato;
22) Omatropina;
[(8-metil-8-azabiciclo [3.2.1]otto-3-il) 2-idrossi-2-fenil-acetato];
23) Omatropina idrobromuro;
24) Omatropina metilbromuro;
25) Omatropina idrocloruro;
26) Ossifenciclimina
[(1-metil-5,6-didro-4H-pirimidina-2-il)metil-2cicloesil-2-idrossi-2-fenil-acetato] ;
27) Ossifenonio
[2-(2-cicloesil-2-idrossi-2-fenil-acetile)ossietiltrietil-ammonio] ;
28) Ossifenonio bromuro ;
29) Pirenzepina
[5 , 11-Diidro-11- [ (4-metil-1-piperazinil) acetile] -6H-piridolo [2 , 3b] [1 , 4] benzodiazepina-6-one] ;
30) Propantelina
[metil-dipropano-2-il- [2- (9H-xanten-9-ilcarbonilossi) etil ammonio] ;
31) Metilscopolamina
[7 (S) - ( 1α, 2β , 4β, 5α, 7β) ] -7- (3 -idrossi -1-oso-2-fenilpropossi) -9, 9-dimetil-3-osa-9-azoniatriciclo
[3 . 3 . 1 . 0<2>'<4>] nonano bromuro] ;
32) Scopolamina
[[7(S)-(1α,2β,4β,5a,7β)]-a-(idrossimetil) acido benzenacetico-9-metil-3-osa-9-azatriciclo
[3.3.1.0<2,4>]non-7-il-estere] ;
33) Scopolamina idrobromuro;
34) Scopolamina idrocloruro;
35) Scopolamina metilbromuro;
36) Scopolamina metilnitrato;
37) Scopolamina N-ossido;
38) Tifenamil
[1-(2-dietilaminoetilsolfanil)-2,2-difenil-etanone] ; 39) Tifenamil idrocloruro;
40) Tridiexetil
[(3-cicloesil-3-idrossi-3-fenil-propil)-trietilammonio];
41) Tridiexetil cloruro ;
42) Tropicamide
[N-etil-3-idrossi-2-fenil-N- (piridina-4-ilmetil)propanamide] ;
43) Tropicamide idrobromuro ;
44) Tropicamide idrocloruro.
COMPOSIZIONI
Le composizioni oggetto della presente invenzione (denominate con i seguenti acronimi: PSL-BASE-1, PSL-BASE-2, PSL-BASE-FARMA, PSL-BASE-INFUS) per uso in vitro ed in vivo sono state preparate impiegando le sostanze nelle quantità indicate nelle tabelle da 1 a 4.
Tabella 1. Composizione PSL-BASE-1
Colture cellulari
Isolamento dei monociti da sangue periferico Eseguito un prelievo di 40 mi di sangue periferico (sei provette con EDTA da 7 ml), si separa la popolazione linfo-monocitaria come segue.
Il sangue intero viene ripartito in due aliquote da 20 mi e ogni aliquota viene stratificata goccia a goccia su 25 mi di Ficoll-Paque (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Svezia) in provette da 50 mi (Lab-Tek, Nunc, Kamstrup, Denmark) . Si centrifuga nuovamente a 1800 rpm per 25 minuti, si elimina il surnatante lasciandone 1 centimetro e si procede con la raccolta dell'anello trasparente di monociti che si forma dopo l'ultima centrifugazione. L'anello così ottenuto viene diluito in 10 mi di RPMI 1640 (Life Technologies, Grand Island, NY) e centrifugato a 1300 rpm per 10 minuti. Quindi si elimina il sopranatante e si lava ancora 2 volte, centrifugando a 1000 rpm per 10 minuti, ed infine, si risospende il pellet in 10 mi RPMI 1640 con 10% di FBS (Fetal Bovine Serum) . Le cellule così ottenute vengono contate con l'ausilio della camera di Burker al fine di ottenere una sospensione finale di 5x10<5>cellule/ml. A questo punto si seminano le cellule in capsule Petri, piastre da 100 millimetri di diametro (Falcon, Becton Dickinson, Labware Europe, Milano, Italia) . Si sottopongono i campioni ad una incubazione di 30 minuti a 37°C con una tensione di CO2del 5%. 30 minuti è il tempo necessario perché i monociti ottenuti aderiscano alla piastra, le cellule non vanno lasciate per un tempo più lungo per evitare l'adesione anche dei linfociti. Le cellule sono state lavate, risospese e coltivate come di seguito dettagliato.
Linea cellulare monocitoide e monociti isolati da sangue periferico
Le cellule sono state lavate tre volte con centrifugazione a 160 g per 10 min a temperatura ambiente in terreno RPMI 1640 (Life Technologies, Grand Island, NY) e risospese dentro piastre (Lab-Tek chamber slides, Nunc, Kamstrup, Denmark) di 15-cm alla concentrazione finale di 1x10<6>/ml cellule in terreno composto come segue:
100 unità/ml di penicillina
100 ug./ml streptomicina
160 mg/L gentamicina (Schering-Plough, Milano, Italy)
2 mM L-glutammina (Life Technologies; growth medium) 50 ng/ml M-CSF (Fattore di crescita dei macrofagi, Peprotech Inc., America, New Jersey)
1000 unità/ml LIF (Fattore inibitore della leucemia, Santa Cruz Biotechnology, America, California) 1000 unità/mL IL-2 (Interleuchina 2 umana ricombinante)
3 nM forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA, (Santa Cruz Biotechnology, America, California).
Sono state preparate tre tipologie di controlli, un controllo negativo (1) di cellule non trattate, un controllo (2) di cellule trattate solo con LIF (fattore anti-leucemico, Fattore inibitore della leucemia) ed un controllo (3) di cellule trattate con LIF (fattore anti-leucemico, Fattore inibitore della leucemia), con M-CSF (Fattore di crescita dei macrofagi, Peprotech Ine., America, New Jersey), con PMA (3 nM forbolo 12-miristato 13-acetato, Santa Cruz Biotechnology, America, California) e con IL-2 (Interleuchina 2 umana ricombinante) come descritto in dettaglio di seguito.
1. Controllo 1: le cellule di controllo non sottoposte a condizioni sono state lavate tre volte con centrifugazione a 160 g per 10 min a temperatura ambiente in terreno RPMI 1640 (Life Technologies, Grand Island, NY) e risospese dentro piastre (Lab-Tek chamber slides, Nunc, Kamstrup, Denmark) di 15-cm alla concentrazione finale di I X 10<6>/ml cellule in terreno RPMI 1640 supplementato con:
10% FCS (Celbio, Milano, Italy)
100 unità/ml di penicillina
100 ug/ml streptomicina
160 mg/L gentamicina (Schering-Plough, Milano, Italy)
2 mM L-glutammina (Life Technologies; growth medium).
2. Controllo 2: le cellule sono state lavate tre volte con centrifugazione a 160 g per 10 min a temperatura ambiente in terreno RPMI 1640 (Life Technologies, Grand Island, NY) e risospese dentro piastre (Lab-Tek chamber slides, Nunc, Kamstrup, Denmark) di 15-cm alla concentrazione finale di IX 10<6>/ml cellule in terreno RPMI 1640 supplementato con:
10% FCS (Celbio, Milano, Italy)
100 unità/ml di penicillina
100 ug/ml streptomicina
160 mg/L gentamicina (Schering-Plough, Milano, Italy)
2 mM L-glutammina (Life Technologies; growth medium) 50 ng/ml M-CSF (Fattore di crescita dei macrofagi, Peprotech Inc., America, New Jersey)
1000 unità/ml LIF (Fattore inibitore della leucemia, Santa Cruz Biotechnology, America, California) 1000 unità/mL IL-2 (Interleuchina 2 umana ricombinante)
3 nM forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA, Santa Cruz Biotechnology, America, California).
Tutti i campioni sono stati incubati per 15 giorni in un incubatore Heraeus termostaticamente controllato alla temperatura di 37°C con una atmosfera contenente il 5% di apporto costante di C02 (v/v in aria). Si precisa che in tutti i campioni il terreno è stato regolarmente sostituito ogni 7 giorni lasciando il 30% del vecchio terreno per non portare via tutte le citochine prodotte dalle cellule e necessarie per la crescita.
Campioni di tutte le cellule oggetto di studio, sono stati lavati tre volte con centrifugazione a 160 g per 10 min a 37°C e sono stati sottoposti ad una analisi al citofluorimetro (Epics Profile II, Coulter, Hialeath, FL) dopo marcatura con i seguenti anticorpi monoclonali di topo (Mabs) anti uomo coniugati con R-ficoeritrina (PE) o Fluoresceina-IsoTioCianato (FITC): anti CD14 umano (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anti CD34 umano (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anti CD45 (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anti c-Kit (Santa Cruz Biotechnology, America, California) ed anti c-Met (Santa Cruz Biotechnology, America, California). Le cellule, testate con tecnica citofluorimetrica cellulare (Facs), presentavano tutti i marcatori di espressione staminale (CD14, CD34, CD45, CD90, c-Kit, c-Met) ampiamente positivi.
Trascorsa l'incubazione le cellule si presentavano in uno stato di semi adesione/sospensione con morfologia mista ovalare e fibroblastoide. Le cellule staccate con lidocaina al 2% (Sigma Aldrich, Milano, Italia) in PBS [17, 21] sono state lavate tre volte con centrifugazione a 160 g per 10 min a 37°C in RPMI 1640 (Life Technologies, Grand Island, NY) e sono state poste in una seconda incubazione come da seguente descrizione.
3. Controllo 3: i controlli trattati destinati a restare cellule staminali indifferenziate pluripotenti (es. PSC-THP1, ICLC PD No. 05005) sono stati risospesi alla concentrazione finale di 1 X 10<5>cellule per ml in piastre da sei pozzetti (Lab-Tek chamber slides, Nunc, Kamstrup, Denmark) in 0.5 mi per pozzetto di soluzione finale composta da terreno RPMI 1640 supplementato con:
10% FCS (Celbio, Milano, Italy)
100 unità/ml di penicillina
100 ug/ml streptomicina
160 mg/L gentamicina (Schering-Plough, Milano, Italy)
2 mM L-glutammina (Life Technologies; growth medium) 50 ng/ml M-CSF (Fattore di crescita dei macrofagi, Peprotech Ine., America, New Jersey)
1000 unità/ml LIF (Fattore inibitore della leucemia, Santa Cruz Biotechnology, America, California) 1000 unità/mL IL-2 (Interleuchina 2 umana ricombinante)
3 nM forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA, Santa Cruz Biotechnology, America, California).
4. Controllo 4: i controlli di monociti e di cellule monocitoidi destinati ad essere stimolati in modo usuale verso la specializzazione epatocitaria sono stati risospesi in provette da 50 mi (Lab-Tek , Nunc, Kamstrup, Denmark) alla concentrazione finale di 2x10<6>cellule per mi in una soluzione finale composta come segue:
100 unità/ml di penicillina
100 ug/ml streptomicina
160 mg/L gentamicina (Schering-Plough, Milano, Italy)
2 mM L-glutammina (Life Technologies; growth medium) 50 ng/ml M-CSF (Fattore di crescita dei macrofagi, Peprotech Ine., America, New Jersey)
1000 unità/ml LIF (Fattore inibitore della leucemia, Santa Cruz Biotechnology, America, California) 1000 unità/mL IL-2 (Interleuchina 2 umana ricombinante)
3 nM forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA, (Santa Cruz Biotechnology, America, California)
HGF (hepatocyte growth factor, Peprotech Ine., America, New Jersey) 100 ng/ml
5 uL/ml di soluzione di aminoacidi non essenziali (Sigma Aldrich, Milano, Italia).
5. Campione 1: i campioni di monociti e di cellule monocitoidi destinati ad essere stimolati in modo accelerato con l'addizione di sostanze parasimpaticolitiche verso la specializzazione epatocitaria sono stati risospesi in provette da 50 mi (Lab-Tek , Nunc, Kamstrup, Denmark) alla concentrazione finale di 2x10<6>cellule per ml in una soluzione finale composta come segue:
100 unità/ml di penicillina
100 ug/ml streptomicina
160 mg/ml/L gentamicina (Schering-Plough, Milano, Italy)
2 mM L-glutammina (Life Technologies; growth medium) 50 ng/ml M-CSF (Fattore di crescita dei macrofagi, Peprotech Inc., U.S.A., NJ)
1000 unità/ml LIF (Fattore inibitore della leucemia, Santa Cruz Biotechnology, America, California) 1000 unità/mL IL-2 (Interleuchina 2 umana ricombinante)
3 nM forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA, (Santa Cruz Biotechnology, America, California)
100 ng/ml HGF (hepatocyte growth factor, Peprotech Ine., America, New Jersey)
5 uL/ml di soluzione di aminoacidi non essenziali (Sigma Aldrich, Milano, Italia)
addizione di sostanze parasimpaticolitiche:
0,2 ug/ml scopolamina (Buscopan<®>, Boehringer Ingelheim, Italia).
Tutti i campioni ed i controlli sono stati allestiti in triplice copia. Tre copie sperimentali, ciascuna formata da quattro controlli (1, 2, 3, 4) ed un campione, sono state incubate a 37°C con una atmosfera contenente il 5% di apporto costante di C02 (v/v in aria), per 30 giorni totali.
Isolamento e coltura di cellule mesenchimali pluripotenti staminali umane
Cellule mesenchimali pluripotenti staminali umane (MSCs, Mesenchinal Stem Cells) sono state ricavate da campioni di midollo osseo (BM, Bone Marrow) derivanti da testa femorale (prelievo di spongiosa e midollo osseo) durante interventi chirurgici di protesizzazione totale dell'articolazione coxo-femorale. Le cellule nucleate sono state separate con gradiente di densità (Ficoll -Paque, Amersham) e risospese in terreno di coltura Dulbecco's modified Eaglès medium-low glucose (DMEM-LG, Gibco, Grand Island, NY) supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS, Sigma), 10 U/ml penicillina G, e 40 μg/ml gentamicina. Dopo 24 ore il terreno con le cellule in sospensione è stato aspirato ed è stato aggiunto terreno fresco sulle cellule adese. Le cellule sono state coltivate in fiasche da 75-cm<2>e poste in incubatore al 5% CO2ad una temperatura di 37°C. Quando le cellule raggiungono una confluenza del 80%, vengono staccate mediante tripsina-EDTA (5 minuti ad una temperatura di 37°C; scaduta l'incubazione si addizionano 5 mi di FBS puro e si raccolgono le cellule ormai staccate ed in sospensione), lavate 2 volte mediante centrifugazione a 160 g per 7 minuti a 37°C in solo terreno DMEM-LG (Gibco; Grand Island, NY) privo di addizionanti. Le cellule contenute nei pellet così ottenuti vengono risospese ad una concentrazione di 1x1O<6>in terreno fresco DMEM-LG (Gibco; Grand Island, NY) supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS, Sigma), 10 U/ml penicillina G, e 40 μg/ml gentamicina. Le cellule riseminate dopo diluizionel:4 (concentrazione finale 2.5x10<4>). In questo lavoro sono state utilizzate cellule al terzo passaggio in coltura continua.
Controllo 1: i controlli (1) destinati a restare cellule staminali indifferenziate pluripotenti sono stati coltivati in piastre da 60 millimetri di diametro (Falcon, Becton Dickinson, Labware Europe, Milano, Italia) per 15 giorni addizionando a 10 mi di terreno di coltura originale (terreno fresco DMEM-LG, Gibco; Grand Island, NY) supplementato con 10% siero bovino fetale, Sigma, 10 U/ml penicillina G, e 40 μg/ml gentamicina.
Controllo 2: i campioni destinati ad essere stimolati in modo usuale verso la specializzazione epatocitaria, staccati e raccolti come sopra descritto, sono stati risospesi in provette da 50 mi (Lab-Tek, Nunc, Kamstrup, Denmark) alla concentrazione finale di 2x10<6>cellule per ml in una soluzione finale composta come segue:
100 unità/ml di penicillina
100 ug/ml streptomicina
160 mg/ml/L gentamicina (Schering-Plough, Milano, Italy)
2 mM L-glutammina (Life Technologies; growth medium) 50 ng/ml M-CSF (Fattore di crescita dei macrofagi, Peprotech Inc., America, New Jersey)
1000 unità/ml LIF (Fattore inibitore della leucemia, Santa Cruz Biotechnology, America, California) 1000 unità/mL IL-2 (Interleuchina 2 umana ricombinante)
3 nM forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA, (Santa Cruz Biotechnology, America, California)
100 ng/ml HGF (hepatocyte growth factor, Peprotech Ine., America, New Jersey)
5 uL/ml di soluzione di aminoacidi non essenziali (Sigma Aldrich, Milano, Italia).
Campione 1: i campioni destinati ad essere stimolati in modo accelerato verso la specializzazione epatocitaria, staccati e raccolti come sopra descritto, sono stati risospesi in provette da 50 mi (Lab-Tek , Nunc, Kamstrup, Denmark) alla concentrazione finale di 2x10<6>cellule per ml in una soluzione finale composta come segue: 100 unità/ml di penicillina
100 ug/ml streptomicina
160 mg/ml/L gentamicina (Schering-Plough, Milano, Italy)
2 mM L-glutammina (Life Technologies; growth medium) 50 ng/ml M-CSF (Fattore di crescita dei macrofagi, Peprotech Ine., America, New Jersey)
1000 unità/ml LIF (Fattore inibitore della leucemia, Santa Cruz Biotechnology, America, California) 1000 unità/mL IL-2 (Interleuchina 2 umana ricombinante)
3 nM forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA, (Santa Cruz Biotechnology, America, California)
100 ng/ml HGF (hepatocyte growth factor, Peprotech Ine., America, New Jersey)
5 uL/ml di soluzione di aminoacidi non essenziali (Sigma Aldrich, Milano, Italia)
addizione di sostanze parasimpaticolitiche:
0,2 ug/ml scopolamina (Buscopan<®>, Boehringer Ingelheim, Italia).
Tutti i campioni ed i controlli sono stati allestiti in triplice copia. Tre copie sperimentali, ciascuna formata da quattro controlli (1, 2, 3, 4) ed un campione, sono state incubate a 37°C con una atmosfera contenente il 5% di apporto costante di CO2(v/v in aria), per 30 giorni.
Isolamento e coltura di cellule sinoviali Cellule sinoviali (SynCs, Synovial Cells) sono state ottenute da pazienti durante interventi di exeresi e couretage della membrana sinoviale all'interno della cavità articolare femoro-tibiale. Porzioni di tessuti sinoviali freschi sono stati dispersi in collagenasi (10μg per ml di terreno, Sigma) per 2 ore a 37°C. Il pellet lavato due volte in solo terreno DMEM-LG (Gibco; Grand Island, NY) privo di addizionanti mediante centrifugazione a 160 g per 10 minuti e viene poi risospeso in terreno completo Dulbecco's modified Eaglès medium-low glucose ([DMEM-LG] GIBCO; Grand Island, NY) supplementato con 10% di siero fetale bovino ([FBS] Sigma), 10 U/ml penicillina G, e 40 μg/ml gentamicina; infine seminato in fiasche da 75-cm<2>e posto in incubatore al 5% C02ad una temperatura di 37°C. Dopo 24 ore il terreno con le cellule in sospensione è stato aspirato ed è stato aggiunto terreno fresco (DMEM-LG, Gibco; Grand Island, NY, supplementato con 10% di FBS, Sigma, 10 U/ml penicillina G, e 40 μg/ml gentamicina) sulle cellule adese. Le cellule sono state coltivate in fiasche da 75-cm<2>e poste in incubatore al 5% CO2ad una temperatura di 37°C. Quando le cellule raggiungono una confluenza del 80%, vengono staccate mediante tripsina-EDTA (5 minuti ad una temperatura di 37°C; scaduta l'incubazione si addizionano 5 ml di FBS puro e si raccolgono le cellule ormai staccate ed in sospensione), lavate 2 volte mediante centrifugazione a 160 g per 7 minuti a 37°C in solo terreno DMEM-LG (Gibco; Grand Island, NY) privo di addizionanti. Le cellule contenute nei pellet così ottenuti vengono risospese ad una concentrazione di lxlO<6>in terreno fresco DMEM-LG (Gibco; Grand Island, NY) supplementato con 10% siero bovino fetale ([FBS] Sigma), 10 U/ml penicillina G, e 40 μg/ml gentamicina. Le cellule sono state riseminate dopo diluizionel:4 (concentrazione finale 2.5x10<4>). In questo lavoro sono state utilizzate cellule al secondo passaggio in coltura continua.
Campione 1: i campioni destinati ad essere stimolati verso la specializzazione epatocitaria, staccati e raccolti come sopra descritto, sono stati risospesi in provette da 50 mi (Lab-Tek , Nunc, Kamstrup, Denmark) alla concentrazione finale di 2x10<6>cellule per mi in una soluzione finale composta come segue:
100 unità/ml di penicillina
100 ug/ml streptomicina
160 mg/ml/L gentamicina (Schering-Plough, Milano, Italy)
2 mM L-glutammina (Life Technologies; growth medium) 50 ng/ml M-CSF (Fattore di crescita dei macrofagi, Peprotech Ine., America, New Jersey)
1000 unità/ml LIF (Fattore inibitore della leucemia, Santa Cruz Biotechnology, America, California) 1000 unità/mL IL-2 (Interleuchina 2 umana ricombinante)
3 nM forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA, (Santa Cruz Biotechnology, America, California)
HGF (hepatocyte growth factor, Peprotech Inc., America, New Jersey) 100 ng/ml
5 uL/ml di soluzione di aminoacidi non essenziali (Sigma Aldrich, Milano, Italia).
Controllo 2: i campioni destinati ad essere stimolati in modo usuale verso la specializzazione epatocitaria, staccati e raccolti come sopra descritto, sono stati risospesi in provette da 50 mi (Lab-Tek, Nunc, Kamstrup, Denmark) alla concentrazione finale di 2x10<e>cellule per ml in una soluzione finale composta come segue:
100 unità/ml di penicillina
100 ug/ml streptomicina
160 mg/ml/L gentamicina (Schering-Plough, Milano, Italy)
2 mM L-glutammina (Life Technologies; growth medium) 50 ng/ml M-CSF (Fattore di crescita dei macrofagi, Peprotech Inc., America, New Jersey)
1000 unità/ml LIF (Fattore inibitore della leucemia, Santa Cruz Biotechnology, America, California) 1000 unità/mL IL-2 (Interleuchina 2 umana ricombinante)
3 nM forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA, (Santa Cruz Biotechnology, America, California)
100 ng/ml HGF (hepatocyte growth factor, Peprotech Ine., America, New Jersey)
5 uL/ml di soluzione di aminoacidi non essenziali (Sigma Aldrich, Milano, Italia).
Campione 1: i campioni destinati ad essere stimolati in modo accelerato verso la specializzazione epatocitaria, staccati e raccolti come sopra descritto, sono stati risospesi in provette da 50 mi (Lab-Tek, Nunc, Kamstrup, Denmark) alla concentrazione finale di 2x10<6>cellule per ml in una soluzione finale composta come segue:
100 unità/ml di penicillina
100 ug/ml streptomicina
160 mg/ml/L gentamicina (Schering-Plough, Milano, Italy)
2 mM L-glutammina (Life Technologies; growth medium) 50 ng/ml M-CSF (Fattore di crescita dei macrofagi, Peprotech Inc., America, New Jersey)
1000 unità/ml LIF (Fattore inibitore della leucemia, Santa Cruz Biotechnology, America, California) 1000 unità/mL IL-2 (Interleuchina 2 umana ricombinante)
3 nM forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA, (Santa Cruz Biotechnology, America, California)
100 ng/ml HGF (hepatocyte growth factor, Peprotech Ine., America, New Jersey)
5 uL/ml di soluzione di aminoacidi non essenziali (Sigma Aldrich, Milano, Italia)
addizione di sostanze parasimpaticolitiche:
0,2 ug/ml scopolamina (Buscopan<®>, Boehringer Ingelheim, Italia).
Tutti i campioni ed i controlli sono stati allestiti in triplice copia. Tre copie sperimentali, ciascuna formata da quattro controlli (1, 2, 3, 4) ed un campione, sono state incubate a 37°C con una atmosfera contenente il 5% di apporto costante di CO2(v/v in aria), per 30 giorni totali.
Sospensioni cellulari preliminari
Durante tutto l'esperimento e dopo la stimolazione ad assumere il fenotipo epatocitario, come sopra descritta, da tutti i campioni in studio si sono ottenuti campionature di cellule ogni 7 giorni di incubazione.
Per le linee cellulari monocitoidi ed i monociti da sangue periferico in semi adesione, tutti i campioni, ogni 3 giorni di incubazione, sono stati testati con metodica di immunofluorescenza nelle campionature in adesione sui vetrini per coltura cellulare.
Inoltre, campionature delle medesime cellule, ogni 7 giorni di incubazione, sono state incubate per 5-8 min con 2% di lidocaina (Sigma Aldrich, Milano, Italia) in PBS; raccolta la soluzione così ottenuta, come descritto in bibliografia [24-26], le cellule sono state lavate tre volte mediante centrifugazione a 160 g per 10 min a 37°C con RPMI 1640 senza addizionanti (Life Technologies, Grand Island, NY). Le cellule ottenute dai pellets di campioni e relativi controlli sono state risospese in tubi (Lab-Tek chamber slides, Nunc, Kamstrup, Denmark) da 15 mi alla concentrazione finale di 5 X 10<5>/ml cellule finale per le successive analisi fenotipiche (Western Blott, immunofluorescenza diretta e FACS).
Per le cellule MSCs e SynCs in confluenza, ogni 7 giorni di incubazione, sopra descritta in dettaglio, tutti i campioni sono stati testati con metodica di immunofluorescenza nelle campionature in adesione sui vetrini per coltura cellulare. Inoltre, campionature delle medesime cellule sono state staccate, ogni 7 giorni di incubazione, mediante tripsina-EDTA (5 minuti ad una temperatura di 37°C; scaduta l'incubazione si addizionano 5 mi di FBS puro e si raccolgono le cellule ormai staccate ed in sospensione), lavate 2 volte mediante centrifugazione a 160 g per 7 minuti a 37°C in solo terreno DMEM-LG (Gibco; Grand Island, NY) privo di supplementi. Le cellule ottenute dai pellets di campioni e relativi controlli sono state risospese in tubi (Lab-Tek chamber slides, Nunc, Kamstrup, Denmark) da 15 mL alla concentrazione finale di 5 X 10<5>/ml cellule finale per le successive analisi fenotipiche (Western Blott, immunofluorescenza diretta e FACS).
Western Blot
La tecnica Western sfrutta prima una elettroforesi denaturante (SDS-Page) per far separare le varie proteine in funzione della massa molecolare, annullando le cariche degli amminoacidi che influenzerebbero la migrazione. I campioni di cellule sospesi in tampone lisante (1% SDS, 30 mM Tris pH 6,8, 5% glicerolo) al quale sono stati aggiunti gli inibitori delle proteasi (Protease Inhibitor Cocktail, Calbiochem, San Diego,CA), hanno subito una incubazione per 30 minuti a 4°C. I lisati ottenuti sono stati centrifugati a 12.000 rpm per 20 min a 4°C ed è stato raccolto il surnatante; la concentrazione proteica dei campioni è stata valutata con metodo Bio-Rad (Benchmark Plus assay, Bio-Rad). Prima della corsa elettroforetica, i campioni sono stati fatti bollire per 5 minuti in presenza di beta-mercapto etanolo e blu di bromofenolo. I campioni sono stati sottoposti a corsa elettroforetica in un gel al 12% (SDS-PAGE) e trasferiti su membrana PVDF (Perkin Elmer Ine.). Le membrane sono state saturate con metanolo a temperatura ambiente e successivamente incubate per tutta la notte a 4° C con i seguenti anticorpi primari diluiti con titolo di 1:500 in PBS con 5% di latte in polvere scremato: anti-CD 34 (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anti-CD 14 (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anti-CD 45 (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anti-CD 71 (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anti-CD 90 (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anti-CD 29 (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anti-CD 105 (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anti CD 117/c-KIT (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anti c-MET (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anti citocheratina 7 (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anti citocheratine 8 (Santa Cruz Biotechnology, America, California) , anti citocheratine 18 (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anti citocheratine 19 (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anti citocheratine 7/17 (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anti albumina (Rockland Immunochemicals, America, Pennsylvania) , anti alfafetoproteina (Monosan Europa, Netherlands). Dopo cinque lavaggi, le membrane sono state incubate con i relativi anticorpi secondari (1:1000) coniugati con perossidasi di rafano (HRP, SantaCruz Biotechnologies Ine., Santa Cruz, California USA) per Ih a temperatura ambiente. Le bande corrispondenti sono state evidenziate con liquidi di chemiluminescenza (Super Signal Western Pico solution, Pierce Biotechnology Inc., Rockford, Illinois, USA) e fissate su lastre fotografiche.
Protocollo di immuno fluorescenza
Cellule in sospensione sono state incubate con MitoTracker Red 0,2 mM per 10 minuti a 37°C. Dopo tre lavaggi con centrifugazione a 160 g per 10 min a temperatura ambiente in PBS (pH 7,4), i pellets cellulari sono stati risospesi in una soluzione fissante di paraformaldeide al 4% in RPMI 1640 con pH 7,4, per un ora a temperatura ambiente. Dopo tre lavaggi in PBS, le cellule sono state risospese in una soluzione di PBS e Tryton allo 0,1 % per un ora a 4°C. Dopo tre lavaggi in PBS le cellule sono state seminate su vetrini portaoggetti e il liquido è stato fatto evaporare all'aria. Le cellule sono state bloccate con siero di capra normale (normal goat serum) al 20 % per un'ora, incubate con anticorpi monoclonali anti uomo anti-CD 34 (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anti-CD 14 (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anti-CD 45 (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anti-CD 71 (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anti-CD 90 (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anti-CD 29 (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anti-CD 105 (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anti CD 117/c-KIT (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anti c-KIT (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anti c-MET (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anti citocheratina 7 (Santa Cruz Biotechnology, America, California) , anti citocheratine 8 (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anti citocheratina 18 (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anti citocheratina 19 (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anti citocheratina 7/17 (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anti albumina (Rockland Immunochemicals, America, Pennsylvania), anti alfafetoproteina (Monosan Europa, Netherlands), coniugati con Fluoresceinaisothiocianato (FITC) per 30 minuti. Per ogni anticorpo monoclonale sono stati allestiti controlli specifici con i relativi isotipi (Santa Cruz Biotechnology, America, California). I coprioggetti montati su vetrino con moviol sono stati osservati al microscopio ottico. I nuclei sono stati marcati con soluzione Hoechst (diluizione 1:1000). I coprioggetti montati su vetrino con moviol sono stati osservati al microscopio ottico [24-25].
RISULTATI
Microscopia ottica : incubazione a 7 gg
I controlli trattati con terreno specifico per colture staminali dopo 7 giorni di incubazione con terreno RPMI 1640, addizionato come descritto in precedenza, e contenente 1000 unità/ml di LIF, 50 ng/ml M-CSF e 3 nM forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) mostravano la trasformazione morfologica da rotondeggiante ad una forma fibroblastoide allungata adesa alla piastra in coltura. I controlli non trattati mostravano unicamente una morfologia tondeggiante ed erano esclusivamente in sospensione.
Monociti da sangue periferico (controllo 1) non trattati (terreno RPMI 1640, 10% FCS 100 unità/ml di penicillina, 100 g/ml streptomicina, 160 mg/L gentamicina, 2 mM L-glutammina PanLeuKine).
Monociti da sangue periferico (controllo 2) trattati esclusivamente con il fattore (LIF, Fattore inibitore della leucemia) anti-leucemico (terreno RPMI 1640, 10% FCS 100 unità/ml di penicillina, 100 g/ml streptomicina, 160 mg/L gentamicina, 2 mM L-glutammina, LIF 1000 unità/ml).
Monociti da sangue periferico (controllo 3) a 166 ore (giorno 7) dalla stimolazione con MCSF (terreno RPMI 1640, addizionato come descritto in precedenza, e contenente 1000 unità/ml di LIF, 50 ng/ml M-CSF e 3 nM forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA).
Cellule THP-1 (controllo 1) non trattate (terreno RPMI 1640, 10% FCS 100 unità/ml di penicillina, 100 g/ml streptomicina, 160 mg/L gentamicina, 2 mM L-glutammina).
Cellule THP-1 (controllo 2) trattate esclusivamente con il fattore (LIF, Fattore inibitore della leucemia) anti-leucemico (terreno RPMI 1640, 10% FCS 100 unità/ml di penicillina, 100 g/ml streptomicina, 160 mg/L gentamicina, 2 mM L-glutammina, LIF 1000 unità/ml).
Cellule THP-1 (controllo 3, PSC-THP-1) a 166 ore (giorno 7) dalla stimolazione con MCSF (terreno RPMI 1640, addizionato come descritto in precedenza, e contenente 1000 unità/ml di LIF, 50 ng/ml M-CSF e 3 nM forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA).
Cellule MSCs (controllo 1) a 166 ore, giorno 7 di incubazione (DMEM-LG, Gibco, Grand Island, NY), supplementato con 10% siero bovino fetale, Sigma, 10 U/ml penicillina G, e 160 mg/L gentamicina).
Cellule isolate da liquido e membrane sinoviali (controllo 1) a 166 ore, giorno 7 di incubazione (DMEM-LG, Gibco, Grand Island, NY), supplementato con 10% siero bovino fetale. Sigma, 10 U/ml penicillina G, e 40 μg/ml gentamicina).
Microscopia ottica : incubazione a 15 gg
I campioni di monociti da sangue periferico e cellule monocitoidi (linea cellulare THP-1) dopo 15 giorni di incubazione (sette con induzione staminale e sette terreno specifico addizionato a sostanze parasimpaticolitiche acceleranti il differenziamento) con terreno RPMI 1640, addizionato come descritto in precedenza, e contenente 1000 unità/ml di LIF, 50 ng/ml M-CSF, 100 ng/ml HGF e 3 nM forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) e 0,2 ug scopolamina mostravano la trasformazione morfologica delle cellule da rotondeggiante ad una forma tetraedrica adesa alla piastra in coltura, positiva per la produzione di albumina, alfafetoproteina, glicogeno, citocheratine 7, 8, 17, 18 19, OV-6, recettore per c-MET (FACS, Immunoistochimica, WB, PCR). I controlli mostravano unicamente una morfologia tondeggiante ed erano esclusivamente in sospensione con risultati negativi per albumina, alfafetoproteina, glicogeno, citocheratine 7, 8, 17, 18 e 19, OV-6.
Monociti da sangue periferico (controllo 4) a 344 ore (giorno 14 di incubazione totale: 7 giorni di induzione alla staminalità 7 giorni di induzione al differenziamento verso il fenotipo epatocitario), trattate con terreno specifico (RPMI 1640, addizionato come descritto in precedenza, e contenente 1000 unità/ml di LIF, 50 ng/ml M-CSF e 3 nM forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) e con addizione di 5 uL/mL di soluzione di aminoacidi non essenziali e di HGF 100 nanogrammi/mL) dal giorno 7 al giorno 14 di incubazione.
Monociti (campione 1) da sangue periferico a 344 ore (giorno 14 di incubazione totale: 7 giorni di induzione alla staminalità 7 giorni di induzione al differenziamento verso il fenotipo epatocitario), trattate con terreno specifico (RPMI 1640, addizionato come descritto in precedenza, e contenente 1000 unità/ml di LIF, 50 ng/ml M-CSF e 3 nM forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) e con addizione di 5 uL/mL di soluzione di aminoacidi non essenziali e di HGF alla concentrazione di 100 nanogrammi/mL 0,2 ug scopolamina) dal giorno 7 al giorno 14 di incubazione.
Cellule THP-1 (controllo 4) a 344 ore (giorno 14 di incubazione totale: 7 giorni di induzione alla staminalità 7 giorni di induzione al differenziamento verso il fenotipo epatocitario), trattate con terreno specifico (RPMI 1640, addizionato come descritto in precedenza, e contenente 1000 unità/ml di LIF, 50 ng/ml M-CSF e 3 nM forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) e con addizione di 5 uL/mL di soluzione di aminoacidi non essenziali e di HGF 100 nanogrammi/mL) dal giorno 7 al giorno 14 di incubazione.
Cellule (campione 1) THP-1 a 344 ore (giorno 14 di incubazione totale: 7 giorni di induzione alla staminalità 7 giorni di induzione al differenziamento verso il fenotipo epatocitario), trattate con terreno specifico (RPMI 1640, addizionato come descritto in precedenza, e contenente 1000 unità/ml di LIF, 50 ng/ml M-CSF e 3 nM forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) e con addizione di 5 uL/mL di soluzione di aminoacidi non essenziali e di HGF alla concentrazione di 100 nanogrammi/mL 0,2 ug scopolamina) dal giorno 7 al giorno 14 di incubazione.
Cellule MSCs (campione 1) a 344 ore (giorno 14 di incubazione totale: 7 giorni di induzione alla staminalità 7 giorni di induzione al differenziamento verso il fenotipo epatocitario), trattate con terreno specifico (RPMI 1640, addizionato come descritto in precedenza, e contenente 1000 unità/ml di LIF, 50 ng/ml M-CSF e 3 nM forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) e con addizione di 5 uL/mL di soluzione di aminoacidi non essenziali e di HGF alla concentrazione di 100 nanogrammi/mL 0,2 ug scopolamina) dal giorno 7 al giorno 14 di incubazione.
Cellule isolate da liquido e membrane sinoviali (campione 1) a 344 ore (giorno 14 di incubazione totale: 7 giorni di induzione alla staminalità 7 giorni di induzione al differenziamento verso il fenotipo epatocitario) , trattate con terreno specifico (RPMI 1640, addizionato come descritto in precedenza, e contenente 1000 unità/ml di LIF, 50 ng/ml M-CSF e 3 nM forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) e con addizione di 5 uL/mL di soluzione di aminoacidi non essenziali e di HGF alla concentrazione di 100 nanogrammi/mL 0,2 ug scopolamina) dal giorno 7 al giorno 14 di incubazione.
Inumino fluorecenza
Le cellule sono state trattate con anticorpi monoclonali anti uomo anti albumina (Rockland Immunochemicals, America, Pennsylvania ), coniugati con Fluoresceina-isotiocianato (FITC) per 30 minuti. Per ogni anticorpo monoclonale sono stati allestiti controlli specifici con i relativi isotipi (Santa Cruz Biotechnology, America, California).
Monociti da sangue periferico (controllo 4) a 344 ore (giorno 14 di incubazione totale: 7 giorni di induzione alla staminalità 7 giorni di induzione al differenziamento verso il fenotipo epatocitario), trattate con terreno specifico (RPMI 1640, addizionato come descritto in precedenza, e contenente 1000 unità/ml di LIF, 50 ng/ml M-CSF e 3 nM forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) e con addizione di 5 uL/mL di soluzione di aminoacidi non essenziali e di HGF alla concentrazione di 100 nanogrammi/mL) dal giorno 7 al giorno 14 di incubazione. Marcatura con Mabs anti albumina FITC.
Monociti da sangue periferico (campione 1) a 344 ore (giorno 14 di incubazione totale: 7 giorni di induzione alla staminalità 7 giorni di induzione al differenziamento verso il fenotipo epatocitario), trattate con terreno specifico (RPMI 1640, addizionato come descritto in precedenza, e contenente 1000 unità/ml di LIF, 50 ng/ml M-CSF e 3 nM forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) e con addizione di 5 uL/mL di soluzione di aminoacidi non essenziali e di HGF alla concentrazione di 100 nanogrammi/mL+0,2 ug/ml scopolamina) dal giorno 7 al giorno 14 di incubazione. Marcatura con Mabs anti albumina FITC.
Cellule THP-1 (controllo 4) a 344 ore (giorno 14 di incubazione totale: 7 giorni di induzione alla staminalità 7 giorni di induzione al differenziamento verso il fenotipo epatocitario), trattate con terreno specifico (RPMI 1640, addizionato come descritto in precedenza, e contenente 1000 unità/ml di LIF, 50 ng/ml M-CSF e 3 nM forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) e con addizione di 5 uL/mL di soluzione di aminoacidi non essenziali e di HGF alla concentrazione di 100 nanogrammi/mL) dal giorno 7 al giorno 14 di incubazione. Marcatura con Mabs anti albumina FITC.
Cellule THP-1 (campione 1) a 344 ore (giorno 14 di incubazione totale: 7 giorni di induzione alla staminalità 7 giorni di induzione al differenziamento verso il fenotipo epatocitario), trattate con terreno specifico (RPMI 1640, addizionato come descritto in precedenza, e contenente 1000 unità/ml di LIF, 50 ng/ml M-CSF e 3 nM forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) e con addizione di 5 uL/mL di soluzione di aminoacidi non essenziali e di HGF alla concentrazione di 100 nanogrammi/mL 0,2 ug/ml scopolamina) dal giorno 7 al giorno 14 di incubazione. Marcatura con Mabs anti albumina FITC.
Cellule MSCs (controllo 4) a 344 ore (giorno 14 di incubazione totale: 7 giorni di induzione alla staminalità 7 giorni di induzione al differenziamento verso il fenotipo epatocitario), trattate con terreno specifico (RPMI 1640, addizionato come descritto in precedenza, e contenente 1000 unità/ml di LIF, 50 ng/ml M-CSF e 3 nM forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) e con addizione di 5 uL/mL di soluzione di aminoacidi non essenziali e di HGF alla concentrazione di 100 nanogrammi/mL) dal giorno 7 al giorno 14 di incubazione. Marcatura con Mabs anti albumina FITC.
Cellule MSCs (campione 1) a 344 ore (giorno 14 di incubazione totale: 7 giorni di induzione alla staminalità 7 giorni di induzione al differenziamento verso il fenotipo epatocitario), trattate con terreno specifico (RPMI 1640, addizionato come descritto in precedenza, e contenente 1000 unità/ml di LIF, 50 ng/ml M-CSF e 3 nM forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) e con addizione di 5 uL/mL di soluzione di aminoacidi non essenziali e di HGF alla concentrazione di 100 nanogrammi/mL 0,2 ug/ml scopolamina) dal giorno 7 al giorno 14 di incubazione. Marcatura con Mabs anti albumina FITC.
Cellule isolate da liquido e membrane sinoviali (controllo 4) a 344 ore (giorno 14 di incubazione totale: 7 giorni di induzione alla staminalità 7 giorni di induzione al differenziamento verso il fenotipo epatocitario) , trattate con terreno specifico (RPMI 1640, addizionato come descritto in precedenza, e contenente 1000 unità/ml di LIF, 50 ng/ml M-CSF e 3 nM forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) e con addizione di 5 uL/mL di soluzione di aminoacidi non essenziali e di HGF alla concentrazione di 100 nanogrammi/mL) dal giorno 7 al giorno 14 di incubazione. Marcatura con Mabs anti albumina FITC.
Cellule isolate da liquido e membrane sinoviali (campione 1) a 344 ore (giorno 14 di incubazione totale: 7 giorni di induzione alla staminalità+7 giorni di induzione al differenziamento verso il fenotipo epatocitario) , trattate con terreno specifico (RPMI 1640, addizionato come descritto in precedenza, e contenente 1000 unità/ml di LIF, 50 ng/ml M-CSF e 3 nM forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) e con addizione di 5 uL/mL di soluzione di aminoacidi non essenziali e di HGF alla concentrazione di 100 nanogrammi/mL 0,2 ug/ml scopolamina) dal giorno 7 al giorno 14 di incubazione. Marcatura con Mabs anti albumina FITC.
Western blot
I campioni sono stati sottoposti ad analisi fenotipiche con Western Blot per i marcatori anti-CD 34 (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anti-CD 14 (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anti-CD 45 (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anti-CD 71 (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anti-CD 90 (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anti-CD 29 (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anti-CD 105 (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anti CD 117/c-KIT (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anti c-MET (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anti citocheratina 7 (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anti citocheratina 8 (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anti citocheratina 18 (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anti citocheratina 19 (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anti citocheratine 7/17 (Santa Cruz Biotechnology, America, California), anti albumina (Rockland Immunochemicals, America, Pennsylvania) , anti alfafetoproteina (Monosan Europa, Netherlands). Dopo cinque lavaggi, le membrane sono state incubate con i relativi anticorpi secondari (1:1000) coniugati con perossidasi di rafano (HRP, SantaCruz Biotechnologies Ine., Santa Cruz, California USA) per Ih a temperatura ambiente,come riportato nelle tabelle che seguono.
Caratterizzazione di monociti circolanti versus monociti staminali pluripotenti e differenziati
I risultati relativi all'espressione del CD34, del CD14, di c-KIT e di c-Met delle citocheratine 7, 8, 18, 19, 7/17, di albumina e di alfafetoproteina sono stati espressi come segue:
Ta bella 5
= assenza di fluorescenza
= 1-5 cellule fluorescenti per campo ottico
+ = 6-10 cellule fluorescenti per campo ottico
++ = 10-20 cellule fluorescenti per campo ottico
+++ = 20-50 cellule fluorescenti per campo ottico
++++ > 50 cellule fluorescenti per campo ottico Caratterizzazione delle THP-1 versus PSCs-THP e PSC-THPl-like liver cells
I risultati relativi all'espressione del CD34, del CD14, di c-KIT, di c-Met, delle citocheratine 7, 8, 18, 19, 7/17, di albumina e di alfafetoproteina sono stati espressi come segue:
Tabella 6
= assenza di fluorescenza
= 1-5 cellule fluorescenti per campo ottico
+ = 6-10 cellule fluorescenti per campo ottico
++ = 10-20 cellule fluorescenti per campo ottico
+++ = 20-50 cellule fluorescenti per campo ottico
++++ > 50 cellule fluorescenti per campo ottico Caratterizzazione delle cellule mesenchimali di controllo e trattate
I risultati relativi all'espressione del CD34, del CD14, del CD45, del CD29, del CD117/c-KIT, del CD71, del CD90, del CD105, di albumina e di alfafetoproteina sono stati espressi come segue:
Tabella 7
= assenza di fluorescenza
= 1-5 cellule fluorescenti per campo ottico
+ = 6-10 cellule fluorescenti per campo ottico
++ = 10-20 cellule fluorescenti per campo ottico
+++ = 20-50 cellule fluorescenti per campo ottico
++++ > 50 cellule fluorescenti per campo ottico
Caratterizzazione delle cellule sinoviali
I risultati relativi all'espressione del CD34,
del CD14 , del CD45, del CD29, del CD117/c-KIT, del
CD71, di albumina e di alf af etoproteina sono stati
espressi come segue:
Tabella 8
assenza di fluorescenza
1-5 cellule fluorescenti per campo ottico
+ 6-10 cellule fluorescenti per campo ottico
++ 10-20 cellule fluorescenti per campo ottico
+++ 20-50 cellule fluorescenti per campo ottico
++++ > 50 cellule fluorescenti per campo ottico
Naturalmente, fermo restando il principio del trovato, i particolari di costruzione e le forme di realizzazione potranno ampiamente variare rispetto a quanto descritto ed illustrato a puro titolo di esempio, senza per questo uscire dall'ambito della presente invenzione.
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Claims (27)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Uso di almeno una sostanza parasimpaticolitica per accelerare il differenziamento di cellule staminali in cellule con fenotipo tessuto-specifico.
  2. 2. Uso secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detta sostanza parasimpaticolitica è selezionata fra Adifenina, amminocarbofluorene, atropina, anisotropina, anticolinesterasici, benzatropina, ciclopentolato, clidinio, diciclomina, dicicloverina, diossilina, esociclio, etaverina, glicopirrolato, imbacina, ipratropio, mcn-a-343 (m-clorofenil-carbamoloossibutinil-trimetil-ammonio-cloruro) , metilscopolamina, metocramina, mepenzolato, metantelina, muscarina, omatropina, ossifenciclimina, ossifenonio, oxotremorina, piperidolato, poldina, pipenzolato, pirenzepina, pirenzepina analogo (AF-DX 116) , pralidossina, propantelina, propantelina bromuri, prifinio, tiemonio, tiotropio, tolterodina, tripitramina, tropicamina, trospio, scopolamina e loro alcaloidi derivati naturali e di sintesi.
  3. 3. Uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detta sostanza parasimpaticolitica è selezionata preferibilmente fra Anisotropina, Anisotropina metilbromuro, Atropina, Atropina idrocloruro, Atropina iperdurica (hyperduric), Atropina metilbromuro, Atropina metilnitrato, Atropina N-ossido, Atropina solfato, Clidinio, Clidinio bromuro, Ciclopentolato, Ciclopentolato idrocloridrato, Diciclomina, Glicopirrolato, Isopropamide, Esociclio metilsolfato, Mepenzolato, Metantelina, Metilatropina, Metilatropina nitrato, Omatropina, Omatropina idrobromuro, Omatropina metilbromuro, Omatropina idrocloruro, Ossifenciclimina, Ossifenonio, Ossifenonio bromuro, Pirenzepina, Propantelina, Metilscopolamina, Scopolamina, Scopolamina idrobromuro, Scopolamina idrocloruro, Scopolamina metilbromuro, Scopolamina metilnitrato, Scopolamina N-ossido, Tifenamil, Tifenamil idrocloruro, Tridiexetil, Tridiexetil cloruro, Tropicamide, Tropicamide idrobromuro, Tropicamide idrocloruro.
  4. 4. Uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detta sostanza parasimpaticolitica è impiegata in una quantità 0,001 mg/L - 10 mg/L.
  5. 5. Uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detta sostanza parasimpaticolitica è impiegata in una quantità fra 0,02 mg/L - 1 mg/L.
  6. 6. Uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detta sostanza parasimpaticolitica è scopolamina, ed è impiegata in una quantità 0,01 mg/L - 0,4 mg/L.
  7. 7. Uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detto fenotipo-tessuto specifico è preferibilmente selezionato fra epatocitario, condrocitario, cardiomiocitario, endoteliale, epiteliale, osteocitario, ematopoietico, pancreatico, neuronaie, gliale, adiposo, miocitario.
  8. 8. Uso di almeno una sostanza parasimpaticolitica per la preparazione di un medicamento per indurre un'accelerazione del differenziamento di cellule staminali in cellule con fenotipo tessuto-specifico da somministrare ad un paziente che ne abbisogni.
  9. 9. Uso secondo la rivendicazione 8, caratterizzato dal fatto che detta sostanza parasimpaticolitica è selezionata fra Adifenina, amminocarbofluorene , atropina, anisotropina, anticolinesterasici , benzatropina, ciclopentolato, clidinio, diciclomina, dicicloverina, diossilina, esociclio, etaverina, glicopirrolato, imbacina, ipratropio, mcn-a-343 (m-clorofenil-carbamoloossibutinil-trimetil-ammonio-cloruro) , metilscopolamina, metocramina, mepenzolato, metantelina, muscarina, omatropina, ossifenciclimina, ossifenonio, oxotremorina, piperidolato, poldina, pipenzolato, pirenzepina, pirenzepina analogo (AF-DX 116), pralidossina, propantelina, propantelina bromuri, prifinio, tiemonio, tiotropio, tolterodina, tripitramina, tropicamina, trospio, scopolamina e loro alcaloidi derivati naturali e di sintesi.
  10. 10. Uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 8 e 9, caratterizzato dal fatto che detta sostanza parasimpaticolitica è selezionata preferibilmente fra Anisotropina, Anisotropina metilbromuro, Atropina, Atropina idrocloruro, Atropina iperdurica (hyperduric), Atropina metilbromuro, Atropina metilnitrato, Atropina N-ossido, Atropina solfato, Clidinio, Clidinio bromuro, Ciclopentolato, Ciclopentolato idrocloridrato, Diciclomina, Glicopirrolato, Isopropamide, Esociclio metilsolfato, Mepenzolato, Metantelina, Metilatropina, Metilatropina nitrato, Omatropina, Omatropina idrobromuro, Omatropina metilbromuro, Omatropina idrocloruro, Ossifenciclimina, Ossifenonio, Ossifenonio bromuro, Pirenzepina, Propantelina, Metilscopolamina, Scopolamina, Scopolamina idrobromuro, Scopolamina idrocloruro, Scopolamina metilbromuro, Scopolamina metilnitrato, Scopolamina N-ossido, Tifenamil, Tifenamil idrocloruro, Tridiexetil, Tridiexetil cloruro, Tropicamide, Tropicamide idrobromuro, Tropicamide idrocloruro.
  11. 11. Uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 8 a 10, caratterizzato dal fatto che detta sostanza parasimpaticolitica è impiegata in una quantità 0,001 mg/L - 10 mg/L.
  12. 12. Uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 8 a 11, caratterizzato dal fatto che detta sostanza parasimpaticolitica è impiegata in una quantità fra 0,02 mg/L - 1 mg/L.
  13. 13. Uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 8 a 12, caratterizzato dal fatto che detta sostanza parasimpaticolitica è scopolamina, ed è impiegata in una quantità 0,01 mg/L - 0,4 mg/L.
  14. 14. Uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 8 a 13, caratterizzato dal fatto che detto fenotipo-tessuto specifico è preferibilmente selezionato fra epatocitario, condrocitario, cardiomiocitario, endoteliale, epiteliale, osteocitario, ematopoietico, pancreatico, neuronaie, gliale, adiposo, miocitario.
  15. 15. Mezzo di coltura per accelerare il differenziamento di cellule staminali in cellule con fenotipo tessuto-specifico, caratterizzato dal fatto che comprende almeno una sostanza parasimpaticolitica .
  16. 16. Mezzo di coltura secondo la rivendicazione 15, caratterizzato dal fatto che detta sostanza parasimpaticolitica è selezionata fra Adifenina, amminocarbofluorene, atropina, anisotropina, anticolinesterasici, benzatropina, ciclopentolato, clidinio, diciclomina, dicicloverina, diossilina, esociclio, etaverina, glicopirrolato, imbacina, ipratropio, mcn-a-343 (m-clorofenil-carbamoloossibutinil-trimetil-ammonio-cloruro) , metilscopolamina, metocramina, mepenzolato, metantelina, muscarina, omatropina, ossifenciclimina, ossifenonio, oxotremorina, piperidolato, poldina, pipenzolato, pirenzepina, pirenzepina analogo (AF-DX 116), pralidossina, propantelina, propantelina bromuri, prifinio, tiemonio, tiotropio, tolterodina, tripitramina, tropicamina, trospio, scopolamina e loro alcaloidi derivati naturali e di sintesi.
  17. 17. Mezzo di coltura secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 15 e 16, caratterizzato dal fatto che detta sostanza parasimpaticolitica è selezionata preferibilmente fra Anisotropina, Anisotropina metilbromuro, Atropina, Atropina idrocloruro, Atropina iperdurica (hyperduric), Atropina metilbromuro, Atropina metilnitrato, Atropina N-ossido, Atropina solfato, Clidinio, Clidinio bromuro, Ciclopentolato, Ciclopentolato idrocloridrato, Diciclomina, Glicopirrolato, Isopropamide, Esociclio metilsolfato, Mepenzolato, Metantelina, Metilatropina, Metilatropina nitrato, Omatropina, Omatropina idrobromuro, Omatropina metilbromuro, Omatropina idrocloruro, Ossifenciclimina, Ossifenonio, Ossifenonio bromuro, Pirenzepina, Propantelina, Metilscopolamina, Scopolamina, Scopolamina idrobromuro, Scopolamina idrocloruro, Scopolamina metilbromuro, Scopolamina metilnitrato, Scopolamina N-ossido, Tifenamil, Tifenamil idrocloruro, Tridiexetil, Tridiexetil cloruro, Tropicamide, Tropicamide idrobromuro, Tropicamide idrocloruro.
  18. 18. Mezzo di coltura secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 15 a 17, caratterizzato dal fatto che detta sostanza parasimpaticolitica è impiegata in una quantità 0,001 mg/L - 10 mg/L.
  19. 19. Mezzo di coltura secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 15 a 18, caratterizzato dal fatto che detta sostanza parasimpaticolitica è impiegata in una quantità fra 0,02 mg/L - 1 mg/L.
  20. 20. Mezzo di coltura secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 15 a 19, caratterizzato dal fatto che detta sostanza parasimpaticolitica è scopolamina ed è impiegata in una quantità 0,01 mg/L - 0,4 mg/L.
  21. 21. Mezzo di coltura secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 15 a 20, caratterizzato dal fatto che detto fenotipo-tessuto specifico è preferibilmente selezionato fra epatocitario, condrocitario, cardiomiocitario, endoteliale, epiteliale, osteocitario, ematopoietico, pancreatico, neuronaie, gliale, adiposo, miocitario.
  22. 22. Procedimento per accelerare il differenziamento di cellule staminali in cellule con fenotipo tessuto-specifico, comprendente le seguenti operazioni: a. provvedere cellule staminali; b. provvedere un mezzo di coltura secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 15 a 21; c. addizionare a detto mezzo di coltura almeno un fattore di differenziamento tessutospecifico-inducente; d. coltivare dette cellule staminali in detto mezzo di coltura, così da ottenere cellule con fenotipo tessuto-specifico.
  23. 23. Procedimento secondo la rivendicazione 22, caratterizzato dal fatto che detto mezzo di coltura comprende inoltre almeno uno fra un fattore di crescita stimolatore di macrofagi e un fattore inibitore della leucemia.
  24. 24. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 22 a 23, caratterizzato dal fatto che detto mezzo di coltura comprende inoltre almeno una interlecuchina, preferibilmente interleuchina-2 o interleuchina-6.
  25. 25. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 22 a 24, caratterizzato dal fatto che detto mezzo di coltura comprende inoltre almeno un antibiotico, preferibilmente gentamicina, penicillina o streptomicina.
  26. 26. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 22 a 25, caratterizzato dal fatto che detto mezzo di coltura comprende inoltre forbolo 12-miristato 13-acetato.
  27. 27. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 22 a 26, caratterizzato dal fatto che detto fattore di differenziamento tessuto-specificoinducente è selezionato fra TGF-Beta (fattore di crescita di trasformazione Beta), LIF (fattore inibitore della leucemia), ITS (insulinatransferrina-selenio), insulina, HGF (fattore di crescita stimolatore epatocitario), M-CSF (fattore di crescita stimolatore di macrofagi), desametasone 21-fosfato disodico, gluconato di calcio, acido retinoico, retinolo, acido linoleico, siero autologo.
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