ITTO990882A1 - Procedimento e dispositivo per la determinazione della concentrazionedi eparina in un campione di fluido. - Google Patents
Procedimento e dispositivo per la determinazione della concentrazionedi eparina in un campione di fluido. Download PDFInfo
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Description
Descrizione dell'invenzione industriale dal titolo: «Procedimento e dispositivo per la determinazione della concentrazione di eparina in un campione di fluido»
DESCRIZIONE
La presente invenzione si riferisce a un procedimento per la determinazione della concentrazione di eparina in campione di fluido, e a un dispositivo per tale determinazione.
L'eparina è un eteropolisaccaride del tipo dei mucopolisaccaridi acidi, dotato di attività anticoagulante derivante dalla sua capacità di catalizzare la reazione tra antitrombina III e trombina. Sulla base di tale attività, l'eparina viene ampiamente utilizzata come anticoagulante nella chirurgia cardiovascolare, ad esempio nel corso di interventi in circolazione extra corporea, e in altre applicazioni diagnostiche e terapeutiche .
Nell'impiego dell'eparina in qualità di anticoagulante può risultare assai utile disporre di un procedimento che permetta di ottenere una misurazione rapida, riproducibile e accurata della concentrazione di eparina presente nel campione di interesse, e di un dispositivo atto ad effettuare tale misurazione.
Allo scopo di effettuare tale misurazione è noto l'impiego di coloranti della serie delle tiazine cationiche . In seguito alla reazione di tali colpranti con l'eparina, è possibile osservare una variazione dello spettro di assorbimento (o di trasmissione) del colorante, vale a dire la diminuzione dell'assorbimento dovuto al colorante libero in soluzione e la comparsa di una banda di assorbimento del complesso eparina-colorante formatosi. Lo spettro di assorbimento delle tiazine cationiche in soluzione acquosa diluita è infatti caratterizzato da una banda principale di assorbimento dovuta al contributo del monomero e del dimero del colorante in soluzione; quando a tale soluzione diluita viene aggiunta eparina, nello spettro di assorbimento della soluzione così ottenuta compare una seconda banda (denominata banda μ) che corrisponde al complesso eparinacolorante formatosi. L'aggiunta dì eparina alla soluzione di colorante non solo causa la comparsa della banda μ, ma provoca anche la diminuzione dell'assorbanza della banda principale. La diminuzione dell'assorbanza del colorante libero in soluzione e l'aumento dell'assorbanza del complesso colorante-eparina costituiscono le due componenti di un fenomeno indicato con il termine «metacromasia», la cui entità, nelle adatte condizioni di reazione, è correiabile con la concentrazione di eparina presente nel campione.
Sulla base di tale principio sono stati sviluppati saggi per la misurazione della concentrazione di eparina in campioni d'interesse.
Il brevetto US 4911549 descrive un procedimento per la determinazione della concentrazione di eparina in plasma sanguigno mediante reazione metacromatica con il colorante Azure A, appartenente alla serie delle tiazine cationiche; tale saggio è basato sulla misurazione di due distinti segnali di trasmittanza in corrispondenza di due distinte lunghezze d'onda, una delle quali è sostanzialmente insensibile alla diluizione dell'eparina.
Ε' stato da noi sorprendentemente trovato che la misurazione in un saggio metacromatico per l'eparina dell'intero spettro di assorbimento del colorante invece della misurazione di distinti segnali di assorbanza a singole lunghezze d'onda predeterminate, permette di ottenere risultati maggiormente accurati e riproducibili, e soprattutto indipendenti dall'ambiente di reazione. Nel caso di saggi effettuati su campioni di fluidi biologici, quali plasma sanguigno, contenenti proteine ed altre specie chimiche che possono potenzialmente interferire con l'accurata misurazione dell'assorbenza a tali lunghezze d'onda predeterminate, tale ultima caratteristica è di sostanziale importanza, soprattutto nell'ottica dello sviluppo di un dispositivo atto all'esecuzione automatizzata del saggio che non necessiti di ripetute calibrazioni.
Costituisce pertanto oggetto della presente invenzione un procedimento, d'ora in avanti indicato come «saggio metacromatico*, per la determinazione della concentrazione di eparina in un campione di fluido, preferibilmente siero o plasma sanguigno, comprendente l'aggiunta a detto campione di fluido di una soluzione di un colorante atto ad interagire con l'eparina in modo tale che il suo spettro di assorbimento nella regione del visibile vari in seguito a tale interazione in maniera quantitativamente dipendente dalla concentrazione di eparina, comprendente le operazioni di:
- determinare gli spettri di assorbimento di una composizione comprendente detto fluido e detto colorante in presenza ed in assenza di eparina; e
- calcolare la variazione di un parametro spettrale rappresentativo di entrambe le componenti del fenomeno della metacromasia in presenza ed in assenza di eparina, detta variazione essendo indicativa della concentrazione di eparina presente nel campione di fluido, allo scopo di determinare la concentrazione di eparina presente nel campione di fluido.
Tale procedimento, per il fatto di sfruttare entrambe le componenti del fenomeno della metacromasia, permette di ottenere una elevata sensibilità e un basso limite di rivelabilità del saggio stesso.
Nel procedimento secondo l'invenzione, la concentrazione di eparina viene preferibilmente espressa in Dl/ral.
Il saggio metacromàtico della presente invenzione prevede l'uso di una sorgente atta ad emettere una radiazione elettromagnetica avente uno spettro di lunghezze d'onda sostanzialmente continuo nella regione del visibile. Ciò permette sia di ottenere l'intero spettro di assorbimento del campione di interesse (vale a dire, i valori dell 'assorbanza in corrispondenza di tutto lo spettro di lunghezze d'onda delle radiazioni emesse della sorgente utilizzata) che, successivamente, di selezionare lunghezze d'onda che risultano particolarmente significative nelle specifiche condizioni di saggio. E' evidente che la selezione di specifiche lunghezze d'onda a partire dall'intero spettro di assorbimento non equivale all'impiego di specifiche lunghezze d'onda predeterminate.
Secondo una forma di attuazione della presente invenzione, la variazione di detto parametro spettrale ottenuta in seguito all'interazione tra eparina e colorante è la variazione dell'area sottesa allo spettro di assorbimento nella regione del visibile di una composizione comprendente detto fluido e detto colorante in presenza ed in assenza di eparina. Tale variazione è indicativa della concentrazione di eparina presente nel campione di fluido.
Con il termine «area» s'intende sia l'area sottesa a ciascuno spettro di assorbimento nell'intera regione del visibile, sia una porzione di tale area scelta in modo tale che essa sia rappresentativa di entrambe le componenti del fenomeno della metacromasia e la sua variazione sia comunque indicativa della concentrazione di eparina presente nel campione di fluido.
Prestazioni equivalenti del saggio secondo l'invenzione possono essere ottenute misurando la variazione in presenza e in assenza di eparina di un diverso parametro spettrale, anch'esso indicativo della concentrazione di eparina presente nel campione di fluido, vale a dire la variazione del parametro RD, definito come:
RE = Aλ1/Aλ2
in cui Aλ1 e Aλ2 sono i valori di assorbanza misurati rispettivamente alle lunghezze d'onda λ1 e λ2, ed in cui λ1 è scelta in modo tale che il valore di Aλ1 diminuisca proporzionalmente alla concentrazione di eparina, mentre λ2 è scelta in modo tale che il valore di Aλ2 aumenti proporzionalmente alla concentrazione di eparina.
In altre parole, all'interno dello spettro di assorbimento nella regione del visibile della composizione comprendente il fluido e il colorante, vengono selezionate due lunghezze d'onda (λ1 e λ2) in modo tale che ciascuna sia rappresentativa di una delle due componenti del fenomeno della metacromasia precedentemente identificate.
I valori di λ1 e λ2 vengono selezionati dallo spettro di assorbimento in modo da essere ottimali in relazione al colorante impiegato e alle specifiche condizioni di saggio.
Valori preferiti di λ1 e λ2 rientrano per esempio nell'intervallo di 560 a 610 nm e 480 a 530 nm, rispettivamente; valori maggiormente preferiti all'interno di tali intervalli di lunghezze d'onda sono per esempio 590 nm e 510 nm, rispettivamente.
Nell'ambito della presente invenzione rientra inoltre un procedimento come descritto precedentemente in cui vengono effettuate misurazioni di trasmittanza, essendo la trasmittanza (T) legata all'assorbanza (A) mediante la seguente equazione:
A = log10(1/T)
Nel procedimento dell'invenzione la soluzione di colorante può inoltre comprendere un tensioattivo non ionico.
La concentrazione del colorante presente in tale soluzione è preferibilmente compresa nell'intervallo di 1x10<-3 >M a 1x10<-6 >M, più preferibilmente 5x10<-5 >M. La forza ionica della soluzione di colorante è preferibilmente minore di 0,1.
Inoltre, la soluzione di colorante viene aggiunta al campione di fluido preferibilmente in proporzione di 5:1 a 100:1 in termini di volume, a seconda del colorante utilizzato e del range dinamico desiderato.
Più preferibilmente, detta proporzione è di 10:1.
Il colorante impiegato nel saggio metacromatico dell'invenzione è preferibilmente una tiazina cationica scelta tra tionina, Azure A, Azure B, Azure C, blu di metilene, blu di toluidina e loro miscele, preferibilmente a composizione nota. Le strutture di tali molecole sono rappresentate nella figura 1.
Viene maggiormente preferito l'impiego di Azure A, ancora più preferibilmente con un grado di purezza di 90 a 100%.
Come riportato nel brevetto US 4 003 892, le tiazine cationiche commerciali della serie omologa del blu di metilene sono infatti in realtà composizioni comprendenti almeno due membri del gruppo consistente di tionina, Azure A, Azure B, Azure C e blu di metilene in proporzioni variabili. Ciascuno di tali coloranti viene infatti ottenuto mediante demetilazione ossidativa a partire dal blu di metilene {la molecola della serie con il grado di N-metilazione più elevato) che produce una miscela complessa comprendente la molecola desiderata ed altre tiazine della stessa serie in proporzioni variabili.
La purificazione di tali coloranti della serie omologa del blu di metilene è stata eseguita mediante cromatografia su colonna di gel di silice impiegando come eluente una miscela di acqua, acido acetico e acido formico come descritto nel brevetto sopracitato ed illustrato in maggior dettaglio nell'eserrqpio 1.
Ciascuna delle cinque frazioni in tal modo ottenute (ciascuna delle quali rappresenta una singola tiazina cationica), è stata ulteriormente sottoposta a cromatografia HPLC in fase inversa impiegando un gradiente a polarità decrescente allo scopo di valutarne il grado di purezza. Nel caso dell'Azure A è stato valutato un grado di purezza superiore a 90%. Nel procedimento secondo l'invenzione risulta pertanto ancor più preferito l'impiego di Azure A con un grado di purezza da 95 a 99%.
Analizzando lo spettro del colorante Azure A purificato si osserva la comparsa di una nuova banda di assorbimento con un massimo a circa 590 nm. Tale banda, denominata banda β, è dovuta all'assorbimento del solo dimero del colorante in soluzione. Inoltre, nello spettro dell'Azure A purificato la banda con massimo di assorbimento a 630 nm (banda a), già visibile nello spettro del colorante non purificato nel quale era stata indicata come banda principale, risulta notevolmente più stretta. Nello spettro del colorante purificato, pertanto, i contributi del dimero (banda β) e del monomero (banda a) del colorante risultano chiaramente distinguibili. Analizzando gli spettri del colorante Azure A purificato in presenza di eparina, diviene evidente che la regione corrispondente alla banda β è anch'essa coinvolta nel fenomeno della metacromasia, poiché l'assorbanza all'interno di tale regione varia in modo quantitativamente dipendente dalla concentrazione di eparina presente nel campione di fluido. Nella figura 2a sono rappresentati gli spettri ottenuti da una soluzione comprendente Azure A purificato e diverse concentrazioni di eparina, comprese in un intervallo di 0 a 10 Ol/ml.
L' impiego del colorante.Azure A purificato come descritto in precedenza ed in maggior dettaglio nell'esempio 1 che segue, permette di ottenere un aumento della sensibilità del saggio. La figura 2b è un confronto tra le curve di calibrazione ottenute facendo uso del procedimento basato sul calcolo del parametro RD ed impiegando Azure A purificato e non purificato. La maggiore pendenza della curva ottenuta impiegando Azure A purificato illustra l'aumento di sensibilità ottenuto a parità di condizioni di saggio.
Un secondo.oggetto della presente invenzione è un dispositivo per la determinazione della concentrazione di eparina in un campione di fluido secondo il procedimento descritto in precedenza, comprendente:
mezzi atti a contenere, separatamente, il campione di fluido e la soluzione di colorante come precedentemente definiti;
- mezzi atti a mescolare detto campione di fluido e detta soluzione di colorante;
mezzi atti ad irraggiare la composizione contenente detto fluido e detto colorante con una radiazione elettromagnetica avente uno spettro sostanzialmente continuo di lunghezze d'onda nella regione del visibile;
- mezzi atti a rivelare e registrare lo spettro di assorbimento di detta composizione in detto intervallo sostanzialmente continuo di lunghezze d'onda; e
mezzi atti a calcolare la variazione di un parametro spettrale come precedentemente definito in presenza e in assenza di eparina, allo scopo di determinare la concentrazione di eparina nel campione di fluido.
Nel dispositivo secondo l'invenzione, detti mezzi atti ad irraggiare la composizione comprendono almeno un diodo emettitore di luce avente lunghezze d'onda multiple sostanzialmente continue nella regione del visibile, eventualmente in combinazione con almeno un diodo emettitore di luce nella regione del rosso (per esempio, tra 620 e 750 nm).
Gli esempi che seguono vengono forniti a scopo di illustrazione e non sono intesi a limitare in alcun modo la portata della presente invenzione. Esempio 1: Purificazione del colorante Azure A
La purificazione dei componenti della serie omologa del blu di metilene è stata eseguita facendo uso del metodo descritto da Lohr, W. et al. nel brevetto US 4003892, modificato in modo da migliorarlo soprattutto in termini di resa e di recupero dell'eluente.
2,5 g di Azure A commerciale (Aldrich) disciolti in 75 ml di eluente (soluzione acquosa al 10% di acido acetico e al 5% di acido formico) vengono applicati ad una colonna di silica gel 60240-400 mesh della Merck. Le dimensioni della colonna sono pari a 50 irai di diametro e 1000 mm di altezza. Il flusso è di 6 ml/min.
In queste condizioni si separano sei frazioni, ciascuna corrispondente ad un colorante della serie omologa del blu di metilene:
Frazione 1 Violetto di Bemthsen A = 580 nm Frazione 2 Tionina A = 600 nm Frazione 3 Azure C A = 613 nm Frazione 4 Azure A A = 630 nm Frazione 5 Azure B A = 650 nm Frazione 6 Blu di metilene A = 670 nm La frazione 4 (Azure A) viene deviata e fatta adsorbire su una colonna di XAD 2 Supelco ad un flusso di 1 mi/min. Le dimensioni della colonna sono di 40 mm di diametro e 350 min di altezza. Soprattutto durante questa fase di adsorbimento, è preferibile evitare il più possibile la luce: ciò può essere ottenuto ricoprendo l'apparato e specialmente le colonne con fogli di alluminio.
Dopo che l'Azure A è completamente adsorbito, la colonna viene lavata con 11 di una soluzione di NaCl 5% in modo da scambiare gli anioni organici con Cl-. Segue un lavaggio della colonna con acqua distillata fino a reazione negativa per i cloruri (reazione con AgNO3). Tale lavaggio viene effettuato in controcorrente per evitare la perdita di colorante. Dopo il lavaggio il colorante Azure A viene eluito con metanolo puro. La soluzione metanolica di Azure A viene evaporata fino a circa 10 mi, filtrata e sgocciolata in un eccesso di etere (circa 500 mi) dal quale precipita l'Azure A solido.
La resa del procedimento in peso è circa del 50%.
E' possibile rigenerare la colonna di silica gel lavando con acqua distillata, una soluzione al 3% di permanganato di potassio in acqua, seguita da una soluzione di ditionito o solfito o metabisolfito di sodio al 3%, ancora acqua distillata, e infine riequilibrazione con la soluzione di acido acetico 10%/acido formico 5%.
E' inoltre possibile rigenerare il 70-80% dell'eluente facendo passare le frazioni contenenti i coloranti ad esclusione dell'Azure A in una colonna di carbone attivo (30x250 mm) che cattura i coloranti lasciando pulito l'eluente.
Esempio 2: Saggio metacromatico per l'eparina mediante l'impiego del colorante Azure A purificato Metodo delle aree
Ad un campione di 100 μΐ di siero di cavallo (Horse Serum, Sigma) contenente una concentrazione ignota di eparina sodica aggiunta (Liquemin, Roche) espressa in Ul/ml, è stato aggiunto 1 ml di una soluzione in acqua deionizzata di Azure A 5x10<-5 >M (Aldrich) purificato secondo l'esempio 1, comprendente inoltre un tensioattivo non ionico.
La composizione così ottenuta è stata mescolata per alcuni secondi e trasferita in una cuvetta ottica per la rivelazione dello spettro di assorbimento. A questo scopo è stato utilizzato uno spettrofotometro Perkin Elmer modello Lambda 2 dotato di una lampada al tungsteno. Lo spettrofotometro era collegato ad un personal computer per l'acquisizione e l'elaborazione dei dati. Mediante integrazione è stata calcolata l'area sottesa allo spettro di assorbimento del campione tra 400 nm e 800 nm.
Lo stesso procedimento è stato ripetuto con una composizione comprendente 100 μΐ dello stesso siero privo di eparina aggiunta e 1 ml di una soluzione di colorante come precedentemente definita.
E' stata calcolata la variazione dell'area sottesa ai due spettri di assorbimento ottenuti, e tale valore numerico è stato impiegato per calcolare la concentrazione di eparina presente nel campione di siero, facendo uso di una curva di calibrazione costruita in precedenza impiegando campioni di siero contenenti differenti concentrazioni note di eparina.
La figura 3a rappresenta la curva di calibrazione ottenuta.
La figura 3b mostra 4 grafici che rappresentano la variazione dell'area sottesa allo spettro di assorbimento di una soluzione di Azure A in assenza e in presenza di eparina ad una concentrazione di 2, 5, 7 e 10 Ul/ml, rispettivamente.
Il limite di rivelabilità del saggio, definito come la concentrazione di analita che produce un segnale di intensità pari a 2,58σ0 (in cui σ0 è la deviazione standard del segnale ottenuto in assenza di eparina), è risultato di 0,1 Ul/ml.
Nell'intervallo di concentrazione di eparina 0 Ul/ml a 10 Ul/ml è stata calcolata una sensibilità del saggio di 3,44 (Unità di area)x (Ul/ml)<-1>;
Esempio 3: Saggio metacromatlco per l'eparina mediante l'impiego del colorante Azure A purificato Metodo basato sul calcolo del parametro RD
Il colorante Azure A purificato come descritto nell'esempio 1 è stato utilizzato per la determinazione della concentrazione di eparina in un campione di fluido (siero) facendo uso del metodo basato sul calcolo del parametro RD come definito in precedenza. Sono stati impiegati valori di λ1 e λ2 dimostratisi ottimali per le specifiche condizioni di saggio, vale a dire 590 nm e 510 nm, rispettivamente.
Il valore di RD è stato pertanto calcolato mediante la formula:
<“ >A590nm/A510nm
I valori di A590nm e Α510nm sono stati inoltre entrambi corretti per il valore dell'assorbanza in corrispondenza della linea di base dello spettro
(A800nm).
La figura 4 mostra la curva di calibrazione ottenuta .
Il limite di rilevabilità del saggio è risultato di 0,1 Ul/ml.
La sensibilità del saggio, calcolata nell'intervallo di concentrazione di eparina da 0 Ul/ml a 3 Ul/ml, è risultata di 2,54 (Unità di RD)x (Ul/ml)<-1>.
Esempio 4: Saggio metacromatico per l'eparina mediante l'impiego di blu di toluidina
Metodo delle aree
Il saggio metacromatico secondo il procedimento descritto nell'esempio 2 è stato effettuato facendo uso del colorante commerciale blu di toluidina (Aldrich). Le condizioni di saggio erano quelle descritte nell'esempio 2 precedente, ad eccezione del fatto che la determinazione è stata effettuata in un campione di plasma bovino.
La figura 5 mostra la curva di calibrazione ottenuta.
La sensibilità del saggio metacromatico secondo tale forma di attuazione nell'intervallo di concentrazione di eparina da 0 Ul/ml a 10 Ul/ml è risultata di 1,19 (Unità di area)x(Ul/ml)<-1>.
Esempio 5: Sistema integrato
Nella figura 6 è rappresentato un esempio di realizzazione di un dispositivo secondo l'invenzione. Tale dispositivo, denominato «sistema integrato», è particolarmente adatto alla esecuzione del saggio metacromatico per l'eparina secondo l'invenzione su di un campione di plasma sanguigno proveniente da un paziente sottoposto ad un intervento chirurgico in circolazione extracorporea. Il dispositivo è costituito da quattro distinte sezioni:
(1) Sezione di trattamento del sangue: è costituita da un filtro, per esempio un filtro a fibre cave in polipropilene con un diametro dei pori di 0,55 pm ed un'area effettiva di filtrazione di 0,1 m<2 >(Hemaplex X<® >BT 900, Dideco), inserito in parallelo ad un circuito di circolazione extracorporea. Tale filtro separa la parte corpuscolare del sangue dal plasma senza interferire sulla concentrazione di eparina presente nel plasma stesso.
(2) Sezione di dosaggio: è costituita da una pompa peristaltica a due canali (P1) e due valvole a pinza (VI e V2). I sottopompa utilizzati sono in Tygon con sezioni: ID3/32", OD5/32" , WALL1/32" per la soluzione di colorante; IDl/32'', OD3/32'', WALL1/32'' per il plasma. Questa sezione ha la funzione di dosare sia il plasma proveniente dal filtro che la soluzione di colorante, allo scopo di ottenere una composizione comprendente plasma e coloreulte, nonché di immettere all'interno del dispositivo una soluzione di un detergente per la pulizia del dispositivo stesso quando necessario. (3) Sezione di misura: è costituita da un supporto portacuvetta, una cuvetta, una sorgente di radiazioni elettromagnetiche nella regione del visibile, uno spettrofotometro a fibre ottiche. Il supporto è congegnato in maniera tale da permettere di alloggiare la cuvetta, innestare la sorgente di radiazioni elettromagnetiche e lo spettrofotometro a fibre ottiche, collimare il fascio di radiazioni elettromagnetiche nella cuvetta.
(4) Sezione liquidi: è costituita da un contenitore per la soluzione di colorante, un contenitore per la soluzione di detergente ed un contenitore di raccolta delle soluzioni di scarico.
La sezione di dosaggio del dispositivo è pilotata elettronicamente, preferibilmente mediante due schede elettroniche.
Tale dispositivo è inoltre connesso ad un personal computer per il pilotaggio della sezione di dosaggio e l'acquisizione e l'elaborazione dei dati provenienti dallo spettrofotometro.
Claims (18)
- RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per la determinazione della concentrazione di eparina in un campione di fluido comprendente l'aggiunta a detto campione di fluido di una soluzione di un colorante atto ad interagire con l'eparina in modo tale che il suo spettro di assorbimento nella regione del visibile vari in seguito a tale interazione in maniera quantitativamente dipendente dalla concentrazione di eparina, comprendente le operazioni di: - determinare gli spettri di assorbimento nella regione del visibile di una composizione comprendente detto fluido e detto colorante in presenza ed in assenza di eparina; e - calcolare la variazione di un parametro spettrale rappresentativo di entrambe le componenti del fenomeno della metacromasia in presenza ed in assenza di eparina, detta variazione essendo indicativa della concentrazione di eparina presente nel campione di fluido, allo scopo di determinare la concentrazione di eparina presente nel campione di fluido.
- 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1 in cui detto parametro spettrale è l'area sottesa allo spettro di assorbimento nella regione del visibile, oppure una porzione di tale area scelta in modo tale che la sua variazione sia comunque indicativa della concentrazione di eparina presente nel campione di fluido.
- 3. Procedimento secondo la rivendicazione 1 in cui detto parametro spettrale è il parametro RD definito mediante la formula:in cui Aλ1 e Aλ2 sono i valori di assorbanza misurati a due diverse lunghezze d'onda, rispettivamente λ1 e λ2, ed in cui λ1 è scelta in modo tale che il valore di Aλ1 diminuisca proporzionalmente alla concentrazione di eparina mentre λ2 è scelta in modo tale che il valore di Aλ2 aumenti proporzionalmente alla concentrazione di eparina.
- 4. Procedimento secondo la rivendicazione 2 oppure 3 in cui il colorante è una tiazina cationica scelta tra tionina, Azure A, Azure B, Azure C, blu di metilene, blu di toluidina e loro miscele a composizione nota.
- 5. Procedimento secondo la rivendicazione 4 in cui il colorante è Azure A.
- 6. Procedimento secondo la rivendicazione 5 in cui il colorante è Azure A con un grado di purezza di 90 a 100%, preferibilmente di 95 a 99%.
- 7. Procedimento secondo la rivendicazione 6 in cui λ1 è scelta nell'intervallo di 560 a 610 nm e λ2 è scelta nell'intervallo di 480 a 530 nm.
- 8. Procedimento secondo la rivendicazione 7 in cui λ1 è 590 nm ed λ2 è 510 nm.
- 9. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 5 a 8 in cui la concentrazione dell'Azure A in detta soluzione di colorante è preferibilmente compresa nell'intervallo di 1x10<-3 >M a 1x10<-6 >M, più preferibilmente 5x10<-5 >M.
- 10 .Procedimento secondo la rivendicazione 9 in cui la soluzione di colorante viene aggiunta al campione di fluido in proporzione di 5:1 a 100:1 in termini di volume, preferibilmente di 10:1.
- 11 .Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui la soluzione di colorante comprende inoltre un tensioattivo non ionico.
- 12 .Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detto campione di fluido è siero o plasma sanguigno.
- 13.Dispositivo per la determinazione della concentrazione di eparina in un campione di fluido mediante il procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, comprendente: - mezzi atti a contenere, separatamente, detto campione di fluido e detta soluzione di colorante; - mezzi atti a mescolare detto campione di fluido e detta soluzione di colorante; mezzi atti ad irraggiare detta composizione comprendente detto fluido e detto colorante con una radiazione elettromagnetica avente uno spettro sostanzialmente continuo di lunghezze d'onda nella regione del visibile; - mezzi atti a rivelare e registrare lo spettro di assorbimento di detta composizione in detto intervallo sostanzialmente continuo di lunghezze d'onda; e - mezzi atti a calcolare la variazione di detto parametro spettrale in presenza e in assenza di eparina, detta variazione essendo indicativa della concentrazione di eparina presente nel campione di fluido, allo scopo di determinare la concentrazione di eparina presente nel campione di fluido.
- 14.Dispositivo secondo la rivendicazione 13 in cui detti mezzi atti ad irraggiare detta composizione comprendono almeno un diodo emettitore di luce avente lunghezze d'onda multiple sostanzialmente continue nella regione del visibile.
- 15.Dispositivo secondo la rivendicazione 14 in cui detti mezzi atti ad irraggiare detta composizione comprendono inoltre almeno un diodo emettitore di luce nella regione del rosso.
- 16.Dispositivo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 13 a 15, in cui detti mezzi atti a contenere detto campione di fluido comprendono un filtro a fibre cave con porosità tale da separare la parte corpuscolare del sangue dal plasma.
- 17.Dispositivo secondo la rivendicazione 16, che comprende inoltre mezzi atti a contenere, separatamente, una soluzione di detergente ed una soluzione di scarico.
- 18.Dispositivo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 13 a 17, che è connesso ad un personal computer.
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