ITMI20090887A1 - "nuove particelle ibride e loro uso in diagnosi e terapia" - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE
La presente invenzione h per oggetto delle nuove particelle che trovano impiego nella diagnosi e nella terapia di alcune patologie, in particolare di nanoparticelle da utilizzarsi nella diagnosi e nella terapia di tumori.
Sono note da tempo le tecniche di diagnosi basate sulla raccolta di immagini (in inglese “imaging†) che permettono di effettuare esami diagnostici altamente affidabili e non invasivi. A titolo di esempio sì possono citare la risonanza magnetica, la tomografia a emissione di positroni, ia tomografia assiale computerizzata, Pecotomografia, i’angiografia e fa tomografia ottica a coerenza di fase.
Alcune di queste tecniche impiegano agenti marcanti, che permettono la visualizzazione selettiva dei diversi tessuti durante l'elaborazione delle immagini. Detti agenti marcanti sono spesso adsorbiti su nanoparticelle di silice, che sono considerate dei nuclei particolarmente adatti per supportare tali agenti diagnostici. Sono note infatti nanoparticelle con agenti fuoruscenti o degli agenti magnetici, che vengono comunemente impiegate in diagnostica come mezzi dì contrasto per la visualizzazione di tessuti e cellule.
Sono altresì note delle nanostruttnre che comprendono dei metalli, in particolare dejl’oro, che possono essere utilizzate per applicazioni biomcdiche (non diagnostiche) grazie alia loro bassa tossicità generale e alle loro proprietà ottiche. In particolare, à ̈ noto che delle particelle comprendenti dell'oro, quando adeguatamente eccitate da una fonte luminosa a particolari lunghezze d’onda, possono essere usate per convertire in modo efficace la luce assorbita in calore e possono così aumentare la temperatura deH’ambiente in cui si trovano.
Uno scopo della presente invenzione à ̈ di fornire delle particelle di duplice uso, cioà ̈ delie particelle qui definite “ibridi†, che permettano di svolgere delle attività diagnostiche e, quando necessario, anche degli interventi terapeutici, che consentano cioà ̈ di effettuare le due operazioni (diagnostica e terapeutica) con la somministrazione di un solo tipo di particelle.
Così, secondo uno dei suoi aspetti, l'invenzione ha per oggetto delle particelle di materiale inerte che comprendono almeno un agente fluorescente e che sono rivestite da uno strato di almeno un metallo che rilasci calore quando eccitato da una fonte di luce ad opportune lunghezze d’onda. Secondo la presente invenzione, per “particelle" si intende designare delie nanopartieellc aventi una dimensione media di 30-70 nm, preferibilmente 40-60 nin, ad esempio circa 50-60 nm, detta dimensione essendo riferita alla particella finale, ivi compreso lo strato metallico.
Secondo la presente invenzione, per “materiale inerte†si intende indicare un materiale che non interviene attivamente nelle operazioni di diagnosi per immagini e di terapia durante l'uso delle dette particelle. Un materiale inerte particolarmente preferito à ̈ la silice.
Secondo la presente invenzione, per “agente fluorescente†si intende indicare una o più molecole fluorofore, cioà ̈ molecole in grado di emettere fluorescenza quando eccitate da una fonte di luce ad opportune lunghezze d’onda. A titolo illustrativo, come fonte di luce per fare emettere fluorescenza ai detti agenti fuorescemi à ̈ possibile utilizzare una lampada o laser convenzionale, che emetta luce nel UV-visibile, ad esempio che emetta luce a lunghezze d'onda comprese tra 380 e 500 nm, vantaggiosamente intorno a 400-450 nm, per esempio intomo ai 440 nm, dove lo strato metallico non assorbe o assorbe in maniera trascurabile. Le nanoparti celle dell'invenzione cosi eccitate divengono fluorescenti consentendo la visualizzazione delle cellule tumorali in cui sì sono accumulate.
Diversi materiali sono comunemente utilizzati come agenti di contrasto nelle tecniche di diagnosi che si basano sulla diagnostica ottica, ad esempio nella tomografia a emissione di positroni (PET), nella risonanza magnetica, la tomografia a emissione di positroni, la tomografia assiale computerizzata e la tomografìa ottica a coerenza di fase. Degli agenti fuorescenti adatti includono delle molecole organiche, ad esempio ma non solo, con funzioni amminiehe, come Pamminoacridina, l’amminoacridone, ramminoperilene, aminoantracene e loro derivati.
Secondo la presente invenzione, l’almeno un “metallo†utilizzato nelle particelle à ̈ un metallo non tossico, che non si degradi, e che sia in grado di rilasciare calore dopo assorbimento di luce. Possono essere altresì utilizzate delle leghe metalliche. Un metallo preferito à ̈ Poro, che quando eccitato a lunghezze d’onda ne! vicino infrarosso (Near-InfraRed) rilascia calore nell'ambiente circostante.
Lo strato di metallo secondo la presente invenzione ha uno spessore di circa 5-15 nm, preferibilmente di circa 7-10 nm.
Le particelle dell’invenzione possono comprendere inoltre altri componenti utili, ad esempio possono essere funzionalizzate con molecole che favoriscono l'attacco dello strato metallico al nucleo della particella, o ancora possono comprendere agenti adatti al targeting delia particella verso il tessuto o verso le cellule bersaglio. Tali agenti per il targeting sono noti alla tecnica, in particolare nel campo della diagnosi e terapia del cancro.
Te particelle dell’invenzione sono destinate all’impiego nella diagnosi e, quando necessario, nella immediata successiva terapia di vari tipi di tumori.
A titolo illustrativo, come fonte di luce à ̈ possibile utilizzare un laser convenzionale, che emetta luce nel vicino infrarosso (dove il nucleo fluorescente non assorbe), ad esempio che emetta luce a lunghezze d’onda comprese tra 800 e 1200 nm, vantaggiosamente intorno a 800-1000 nm, per esempio intorno ai 970 nm. Le nanoparticelie dell'invenzione così irradiale convertiranno la luce assorbita in calore e provocheranno la morte delle cellule tumorali in cui si sono concentrate.
Grazie alle loro multiple proprietà , per il fatto cioà ̈ di essere marcate con agenti fluorescenti e di comprendere al contempo un componente (il metallo) in grado dì distruggere le cellule c i tessuti circostanti mediante rilascio di calore, le particelle delTinvenzione rappresentano una nuova e versatile soluzione tecnica nel campo della diagnosi e della terapia di varie forme di cancro e delie altre patologie che richiedono come trattamento la distruzione dei tessuti malati.
Così, ad esempio le particelle dell’invenzione che comprendono agenti fluorescenti e uno strato di oro possono essere impiegate come mezzo di contrasto per l’esecuzione di diagnosi mediante tecniche ottiche. In questo caso, grazie aU’eccitazione con luce visibile à ̈ possibile procedere una diagnosi per “imaging†e immediatamente dopo, se necessario, à ̈ possibile attivare la distruzione delle cellule maligne, previamente identificate.
Pertanto, con una sola somministrazione delle particelle dell’invenzione à ̈ possibile procedere alla diagnosi e alla terapia, con particolare utilità nelle patologie tumorali, eliminando i tempi di attesa tra la fase di accertamento c la fase di trattamento. Il trattamento à ̈ inoltre reso selettivo, essendo otticamente guidato.
Secondo una forma di realizzazione preferita deSÌ’invenzione, le particelle sono delle nanoparticelle di 40-50 mn che comprendono amminoacridma come agente fluorescente e che sono ricoperte da uno strato di oro di circa 7-10 mn.
L<'>uso delie particelle dell'invenzione nella diagnosi e/o terapia del cancro costituisce un ulteriore aspetto dell’invenzione.
Secondo un altro dei suoi aspetti l’invenzione ha per oggetto una composizione diagnostica e/o farmaceutica che comprende le particelle dell’invenzione, da sole o in combinazione con eccipienti e veicoli farmaceuticamente accettabili.
Delle composizioni adatte, secondo l’invenzione sono ad esempio delle composizioni liquide, preferibilmente a base acquosa, in cui le nanoparticelle sono sospese. Tali composizioni sono vantaggiosamente sterili, in particolare quando se ne prevede la somministrazione per iniezione, infusione o inalazione.
A titolo di esempio, le particelle dell’invenzione possono essere disperse in una soluzione sterile, salina, ad esempio ipotonica e tamponata, di tipo convenzionale.
Le particelle dell’invenzione possono essere preparate miscelando l’agente o gli agenti fluorescenti in una soluzione acquosa e un opportuno derivato silanico come ad esempio trietilsilano, in ambiente alcalino. Dopo agitazione si formano delle particelle di silice marcate con gli agenti fluorescenti. Dette particelle possono essere, se desiderato o necessario, ulteriormente funzionai izzate con gruppi amtninici per facilitare il successivo attacco del metallo. Le particelle inarcate cosi preparate possono essere rivestite di uno strato metallico, ad esempio di oro, per riduzione di sali del detto metallo, ad esempio per riduzione di cloruro di oro idrato usando sodio citrato tribasico, in un solvente opportuno quale l’acqua.
Dei dettagli di preparazione sono fomiti nella sezione sperimentale che segue e nella figura allegata alla presente descrizione.
Ulteriori funzionalizzazioni, ad esempio con agenti adatti per il targeting, ad esempio specìfici anticorpi, verso le differenti cellule e i differenti tessuti da raggiungere, possono essere effettuate secondo i metodi noti alla tecnica.
Un metodo diagnostico e/o terapeutico che comprende l’uso delle particelle dell’ invenzione in un soggetto che necessita di un tale trattamento costituisce un ulteriore oggetto della presente invenzione.
Le nanopartieelle dell'invenzione possono essere marcale con agenti magnetici, invece che con agenti fuorescenti, per essere impiegate nelle tecniche di imaging basate sulla risonanza magnetica nucleare. Alternativamente, le nanopartieelle dell'invenzione possono essere simultaneamente marcate con agenti fluorescenti e con agenti magnetici, in modo da poter essere utilizzate in differenti tecniche di imaging.
Sezione sperimentale
Esempio 1
Preparazione di nanopartieelle comprendenti un lucro foro e uno stato di oro
Materiali
(3-Aminopropil)trietossisilano (APTES, 98%, Sigma); Cloruro di oro (Ili) idrato (HAuCU, 99,9%, Sigma); Sodio citrato tribasico idrato (NajCit, Fluka); Trietilsilano (UTES, 97%, Aldrieh), Idrossido di ammonio, marcatori tuorescenti come i derivati deH’acridina; Acqua Mil!i-Q nanopurificata (>18.0 ΜΩ) con un sistema gradiente Millipore
Procedura
Fase 1 - Preparazione di nanoparticelle marcate
Le nanoparticelle sono state preparate usando il metodo Stober sciogliendo 8.0x10<">M di marcatore e 1.3x10 M di HTES in 50 mL di etanolo. Sono stati poi aggiunti, goccia a goccia e sotto vigorosa agitazione, 3 mL di idrossido di ammonio (32% NED). La soluzione à ̈ stata lasciata in agitazione per una notte, dopodiché à ̈ diventata torbida per la formazione delle particelle di silice. 1 residui non reagiti sono stati rimossi per lavaggio con etanolo. Le particelle sono state ridisperse in 50 mL di etanolo e la loro superficie à ̈ stata am minata per aggiunta di 20 pL di APTES agitando per ulteriori 5 ore. Le particelle amminate sono state centrifugate, lavate con etanolo e poi ridisperse in acqua MilliQ (ca, 50 mi). Si ottiene così una soluzione di particelle comprendenti degli agenti nuore fori, Fase 2 - Preparazione delio strato di metallo
Dei colloidi di oro sono stati previamente formati per riduzione di cloruro di oro (ili) idrato (6.3X10<0>M) usando sodio citrato tribasico idrato (4.8x1 CT<1>M) in acqua MilliQ a 95-100<?>C. 2 mL della soluzione di particelle sopra preparata sono stati aggiunti a 20 mL della soluzione colloidale di oro sopra descritta sottoagitazione continua per almeno 2 ore . Il colore della soluzione à ̈ virato da un rosso rubino a violaceo. Si aggiunge quindi goccia a goccia una soluzione 5.0χ 10° M di I IauG4 alla miscela e si scalda a 95-100°C. La soluzione vira da un colore violaceo al porpora e inime ad un colore blu scuro. Il procedimento sopra descritto à ̈ schematicamente descritto nella Figura I . Esempio 2
Caratterizzazione delle nanoparticelle
Gli spettri UV-VIS sono stati registrati con uno spettrometro Perkin Elmer Lambda a doppio raggio, il test di fotostabilità à ̈ stato condotto monitorando gli spettri di assorbimento in funzione del tempo di irradiazione (λ^ = 530, 650 and 850 nm per irradiamento continuo e Xcxc= 532 airi per irradiazione pulsata) usando la soluzione di particelle dell’esempio I con 0,4 assorbimenti alla lunghezza d’onda di eccitazione. L<'>irradiamento à ̈ stato effettuato con una lampada Xenon di 450 W o con un laser Nd:YAG (Continuum, Surei ite 11-10, ampiezza impulso ca. 7 ns e energia ≤ 10 mJ impulso<'1>).
Si à ̈ usato un microscopio Philips mod. 208 a trasmissione di elettroni (operante a 80 kV di accelerazione del fascio di elettroni) per analizzare la dimensione e la distribuzione dimensionale delle particelle. Le nanoparticelle sciolte in acqua MilliQ sono state depositate su una griglia di rame da 400 mesh, con supporto di forni var e lasciate una notte in essiccatore per evaporare il solvente.
Un microscopio a l<'>orza atomica (Solver-Pro P47H, NT-MDT) à ̈ stato usato per registrare la topografia e le immagini delle nanoparticelle. Le misurazioni sono state condotte in condizioni di semi-contatto usando sonde (cantilever) con frequenza di oscillazione di 190-325 kHz. Una goccia del campione sospesa in acqua à ̈ stata posata su mica mediante spìn coating in modo da ottenere una deposizione omogenea e rendere il solvente facilmente evaporabile.
Esempio 4
Sperimentazione delle particelle delPinvenzione su membrane fosfolipidiche
L'interazione tra le nanoparticelle e le membrane fosfolipidiche e le cellule sono state testate attraverso imaging ottica registrata con un microscopio confocale a scansione laser (Nikon, PCM20Q0) usando un Ar- laser < λ.Α. = 488 nm) o un He-Ne-laser (λ,_-χε= 543 nm) come fonte di eccitazione. Ue immagini sono state registrate in condizioni di media confocalità e con un obiettivo ad immersione di olio όΠ̧χ, 1 .4 N.A. (512x5 12 pixels).
Delle dispersioni di nanoparticelle e membrane fosfolipidiche, entrambe in soluzioni saline ipotoniche tamponate, sono state mescolate e una goccia della miscela stata posata su un vetrino. Le membrane sono state velocemente evidenziate per imaging perché divenivano luminescenti.
L’analisi ha mostrato una omogenea distribuzione della parte interna di ogni membrana, dimostrando così una distribuzione uniforme.
Esempio 5
Sperimentazione deiie particelle dell’invenzione su fìbrobiasti
Delle cellule di fìbrobiasti sono state incubate una notte con le nanoparticeìle dell’esempio 1 poi fissate su un copri-oggetto e lavate molte volte. 0 confronto con le cellule non trattate indicava che le nanoparticeìle si accumulavano nel nucleo rendendolo molto luminoso.
Esempio 6
Sperimentazione delle particelle delTinvenzione su cellule tumorali
Le nanoparticeìle dell’invenzione sono state testate con successo su cellule tumorali secondo la procedura descrìtta in Lapotko, D. O.; Lukianova, E.; Potapnev, M.; Aleinikova, O.; Oraevsky, A. Cancer Leti (2006) 239, 36-45.
Claims (5)
- Rivendicazioni 1. Particelle di materiale inerte che comprendono almeno agente fluorescente e che sono rivestite da uno strato di almeno un metallo che rilasci calore quando eccitato da una fonte dì luce ad opportune lunghezze d'onda.
- 2. Particelle secondo la rivendicazione 1, caratterizzate da! fato che la loro dimensione media à ̈ 30-70 nm.
- 3. Particelle secondo le rivendicazioni 1 o 2, caratterizzate dai fatto che detto materiale inerte à ̈ silice.
- 4. Particelle secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, caraterizzate dal fatto che detti agenti fluorescenti sono scelti tra Pamminoacridina, Pamminoacridone, j'ainminopcriiene, aminoantracene c loro derivati.
- 5. Particelle secondo la rivendicazione 4, caratterizzate dal fato che detti agenti fluorescenti sono la ammìnoacridina e i suoi derivati, 6. Particelle secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5, caraterizzate da! fatto che detto metallo à ̈ l’oro. 7. Particelle secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, caratterizzate dal fatto che detto strato di deto metallo ha uno spessore di circa 5-15 nm. 8. Particelle secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7, caratterizzate da! fiuto che comprendono ammìnoacridina come agente fluorescente e che sono ricoperte da uno strato di oro di circa 7-10 nm. 9. Particelle secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8, caratterizzate dal fatto che comprendono molecole adatte per il targeting verso cellule e tessuti specifici. 10. Uso delle particelle secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da I a 9, per la preparazione di una composizione diagnostica e terapeutica per la diagnosi e il tratamento del cancro. 1 1. Composizione diagnostica e terapeutica per la diagnosi e il trattamento del cancro che comprende le particelle secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da ! a 9
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