ITMI982634A1 - Composizioni farmaceutiche a base di proteine. - Google Patents

Description

La presente invenzione ha per oggetto l'uso di proteine note come proteindisolfuro isomerasi nella terapia e nella profilassi di patologie neoplastiche.

Le protein-disolfuro isomerasi costituiscono una famiglia di enzimi che, oltre a funzioni ancora non del tutto delucidate, possiedono attività endoproteinasica e chaperoninica.

L'attività endoproteinasica è modulabile da ioni calcio ed è inibita da inibitori delle Cys-proteasi ed è pertanto simile a quella di altre Cys-proteasi note, quali la calpaina, con le quali non esistono peraltro significative omologie di sequenza, a parte la presenza del motivo della tioredoxina CGHC comune e molte Cys-proteasi.

L'attività chaperoninica è stata evidenziata nel refolding del frammento Fab di alcuni anticorpi monoclonali e non è modulabile da ioni calcio.

Le protein-disolfuro isomerasi, catalizzando la formazione di legami disolfuro fra catene proteiche, sono implicate nei processi di "folding" delle proteine e svolgono pertanto un ruolo di controllo centrale nel mantenimento di processi cellulari fondamentali.

Esempi di protein-disolfuro isomerasi sono le proteine del reticolo endoplasmatico (umane, da ratto e topo) ERp72 descritte in J. Biol. Chem. 268(29).

22004-22009; 1993: ibidem 269(4). 2501-2507, 1994; ibidem 266, 5353, 1991 e la proteina P5 da fegato di criceto descritta in Biochem. J. 281. 645-650, 1992.

Rupp et al. (J. Biol. Chem. 269(4), 2501-2507, 1994) hanno definito alcune di queste proteine con le sigle CaBPl e CaBP2, da "Calcium binding protein".

Altri membri della famiglia delle PDI comprendono le proteine note come calsequestrina, Bpl, Erp60.

Si è ora trovato che protein-disolfuro isomerasi (PDI) e proteine correlate, iniettate sottocute in topi Balb/c e in conigli, inducono una risposta anticorpale di tipo IgM caratterizzata da una citotossicità evidenziabile in vitro su linee cellulari di tumori umani, quali le linee Jurkat e Kato III. L'invenzione riguarda pertanto le protein-disolfuro isomerasi come agenti profilattici e terapeutici, in particolare come agenti antitumorali.

Le stesse proprietà immunologiche e citotossiche sono state riscontrate per una proteina isolata da fegato di capra con metodiche analoghe a quelle· descritte per le proteine sopra citate. Tale proteina, che presenta un peso molecolare di circa 72 Kda in SDS-PAGE e un'elevata omologia (>90%) di sequenza con le proteine ERp72 costituisce un ulteriore oggetto dell'invenzione.

Detta proteina è ottenibile per estrazione di fegato di mammiferi con PBS seguita da purificazione per cromatografia su colonne di gel a scambio idrofobico.

Il processo di estrazione e purificazione della proteina dell'invenzione, di seguito indicata con la sigla p72, è illustrato nell'allegata Figura ,! .

La citotossicità è quantificabile in vitro su cellule Jurkat e Kato III utilizzando metodi convenzionali, basati ad esempio all'uso di kit commerciali quali il kit CDCpK (Pharmaproduct). In particolare, si notava la comparsa di citotossicità nel siero di conigli già dopo un primo trattamento con p72 (1 mg/animale in soluzione fisiologica) su cellule Jurkat e Kato III. La citotossicità rimaneva costante o aumentava dopo un mese da un secondo trattamento effettuato dopo due settimane dal primo, con valori che raggiungevano talvolta l'85%-89%.

Le PDI o la p72 sono utili come agenti terapeutici o profilattici nei confronti di tumori di varia origine, in particolare nei confronti di carcinomi e adenocarcinomi .

Le PDI o la p72 potranno essere somministrate a dosaggi compresi tra 1 e 10 mg/paziente, utilizzando le vie di somministrazione convenzionali per proteine e polipeptidi, ad esempio la via sottocutanea o intramuscolare. Il trattamento può essere ripetuto ed è preferibile un trattamento che prevede somministrazioni distanziate di una-due settimane.

Si è inoltre sorprendentemente trovato che è possibile indurre elevata citotossicità anche somministrando le PDI o p72 a dosaggi molto bassi, dell'ordine di 1 . IO<"4 >- 1 . IO<'10 >g, per via sublinguale, sotto forma di granuli o gocce di soluzioni o sospensioni idroalcoliche aH'1% di etanolo, con concentrazioni di principio attivo variabili da IO<"6 >a IO<"10 >M

Claims (8)

1. RIVENDICAZIONI 1. Protein-disolfuro isomerasi come agenti terapeutici.
2. 2. Protein-disolfìiro isomerasi come agenti antitumorali.
3. 3. Protein-disolfuro isomerasi secondo la rivendicazione 1 o 2 scelte fra ERp72, ERpóO, P5, calsequestrina.
4. 4. Proteina estraibile da fegato di mammifero con PBS avente un peso molecolare di 72 Kda in SDS-PAGE, omologia di sequenza superiore o uguale al 90% con ERp72 umana e capacità di indurre citotossicità nel siero quando somministrata in animali o uomini.
5. 5. Composizioni farmaceutiche contenenti come principio attivo le proteine delle rivendicazioni 1-4.
6. 6. Vaccini anti-tumorali contenenti come principio attivo le proteine delle rivendicazioni 1-4.
7. 7. Composizioni secondo la rivendicazione 5 o 6 in forma adatta alla somministrazione parenterale o orale-sublinguale.
8. 8. Composizioni secondo la rivendicazione 7, sotto forma di soluzioni sterili iniettabili, gocce o granuli.