ITMI960834A1

ITMI960834A1 - Nuove formulazioni di diacereina, ottenute per inclusione del principio attivo in idrogel polisaccaridi

Info

Publication number: ITMI960834A1
Application number: IT96MI000834A
Authority: IT
Inventors: Napoli Guido Di
Original assignee: Trans Bussan S A
Priority date: 1996-04-29
Filing date: 1996-04-29
Publication date: 1997-10-29
Also published as: DE69715301D1; EP0809995A1; IT1282381B1; DK0809995T3; ATE223703T1; EP0809995B1; PT809995E; ES2183039T3; ITMI960834A0; DE69715301T2

Description

Domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo:

T' formulazioni di diacereina, ottenute per inclusione del principio attivo in idrogel polisaccaridici"

1. Campo dell'invenzione

La presente invenzione riguarda nuove formulazioni per uso farmaceutico contenenti diacereina, in particolare matrici di idrogel a base di polisaccaridi idrofili, quali pectine e alginati, nelle quali è incorporata la diacereina, che consentono di ottenere una tollerabilità intestinale ed una biodisponibilità migliori rispetto alle preparazioni farmaceutiche in commercio. La diacereina (DAR) è l'acido 9.10-diidro-4,5~diacetossi-9,10-diossiantracene-2-carbossilico, ed è il diacetil derivato della reina, un composto antrachinonico contenuto in alcune varietà di rabarbaro (Rheum Chinense), e costituisce il principio attivo di preparazioni farmaceutiche per uso orale registrate ed in commercio in vari paesi per il trattamento dell'osteoartrosi. A differenza di altri farmaci non steroidei, la diacereina presenta una buona tollerabilità gastrica. Tuttavia, in taluni pazienti particolarmente sensibili ai derivati antrachinonici, o con una anamnesi di disturbi enterocolitici, per dosaggi elevati di diacereina, o per una combinazione di questi fattori , la somministrazione di diacerina mediante le formulazioni commerciali note può provocare un effetto lassativo , che si manifesta con episodi di diarrea più o meno intensi e/o frequenti.

2. Stato della tecnica

Gli alginati sono polisaccaridi lineari costituiti da unità di acido β-D-mannuronico ed α-D-glucuronico legati mediante legami glicosidici ( 1-4 ) , in percentuale e sequenza variabile . Il contenuto di acido mannuronico varia da valori inferiori al 303⁄4 a quasi il 100/t riscontrato in alcuni alginati di origine batterica, e la distribuzione dei due monomeri variando anch'essa notevolmente passando da alginati a sequenze rigorosamente alternate (batterici) , a lunghe sequenze omopolimeriche dei due monomeri presenti in alcuni campioni . L' alginato forma gel per interazione con ioni bivalenti , quali il calcio. Trova impiego nell ' industria alimentare e farmaceutica come addensante , sospendente ed emulsificante, ed in campo biotecnologico come matrice incapsulante di microorganismi e/o cellule.

Le pectine sono costituenti della matrice extracellulare delle piante, costituite principalmente da catene lineari di acido D-galatturonico unite mediante legami glicosidici ( 1-4 ) , parzialmente esterificate con metanolo. La struttura regolare del polimero è tuttavia interrotta da unità di L-ramnosio e dalla presenza di catene laterali che contengono altri zuccheri neutri. Il grado di esterificazione delle pectine (DE) viene espresso come rapporto percentuale fra le unità di acido galatturonico esterificato sul totale delle unità di acido galatturonico, ed influenza sia la solubilità, che la capacità di formare gel. Si distinguono pectine a basso contenuto di metossili (pectine LM), quando il DE è inferiore al 50%, e pectine ad alto contenuto di metossili (pectine HM) quando il DE è superiore al 50%· Questi polisaccaridi, le cui sorgenti commerciali più comuni sono le mele e la buccia degli agrumi, trovano largo impiego nell'industria alimentare sia come componenti fondamentali di marmellate e gelatine, e nella industria alimentare e farmaceutica sia come addensanti e sospendenti. E' nota l'azione antidiarroica della pectina, che agisce come assorbente a livello intestinale, ed è spesso somministrata in associazione con altri agenti attivi, quale il caolino (Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. Ed., l8th Ed., 1990· pag. 795-796). Pectina idrosolubile, ad esempio in polvere, è somministrata come antidiarroico a dosaggi di parecchi grammi al giorno (brevetto francese FR 2996,estratto su banca dati Derwent).

La domanda di brevetto europeo EP-A-648.495 descrive l'uso come antidiarroici di complessi insolubili in acqua di polisaccaridi anionici, quali pectina ed alginati, con cationi, quali ioni Ca++. Questi complessi agiscono in particolare solidificando le feci, e sono somministrati come dispersioni acquose in liquidi nutritivi, a dosaggi corrispondenti per l'uomo a quantità di almeno 5_6 grammi al giorno. Essi trovano indicazione nel trattamento di diarree di origine infettiva, come pure conseguenti a resezione chirurgica parziale del tratto gastrointestinale o a trattamento con antibiotici. Tuttavia, il documento in esame non suggerisce in alcun modo che tali complessi polisaccaridici siano in grado di inibire la diarrea dovuta all'azione di sostanze ad azione lassativa, come i sennosidi, o di sostanze farmacologicamente attive in grado di esplicare azione lassativa come effetto collaterale, come la diacereina, o che possano servire da supporto per l'inclusione di farmaci, aumentandone la biodisponibilità.

Al contrario, è noto che la resistenza all'azione lassativa dei sennosidi è diminuita dalla contemporanea somministrazione di alginati (JP 57145812,estratto banca dati Derwent).

3- Breve descrizione delle Figure

La Figura 1 riporta il grafico dell'andamento dei pesi corporei in ratti trattati con la preparazione commerciale ART50 e con le formulazioni D6, D8 e D9 secondo la presente invenzione.

Le Figure 2 e 3 riportano i risultati di test di tollerabilità gastrointestinale su ratti di formulazioni di diacereina secondo la presente invenzione, espressi come numero di ratti affetti da almeno un episodio di diarrea {Figura 2) e come numero di episodi di diarrea riscontrati sul totale dei ratti affetti da diarrea {Figura 3).

Le Figure 4 e 5 riportano i risultati del test di biodisponibilità su ratti in seguito a somministrazione delle formulazioni secondo la presente invenzione, in quantità corrispondente a 40mg/Kg (Figura 4) o a 2 mg/Kg (Figura 5) di diacereina. I risultati sono espressi come contenuto di diacereina nelle urine delle 24 ore. Ogni colonna del grafico corrisponde al risultato osservato per singolo animale trattato. La Figura 6 riporta la curva di calibrazione per la determinazione del contenuto di diacereina valutata come reina nei fluidi biologici.

4. Sommario

Ora la Richiedente ha inaspettatamente trovato che formulando la diacereina in associazione con un gel a base di polisaccaridi biocompatibili aventi la proprietà di formare gel (gelogenici), in particolare incorporando la diacereina in idrogel di polisaccaridi anionici quali pectine ed alginati parzialmente o completamente convertiti nei rispettivi sali di calcio, si ottengono formulazioni di diacereina che permettono di ridurre drasticamente l'insorgenza e/o l'intensità degli episodi di diarrea in confronto con quelli riscontrati con preparazioni farmaceutiche contenenti lo stesso principio attivo, quali ART-^ e Fisiodai®, senza modificare le proprietà farmacologiche della diacereina, e mantenendo al tempo stesso una buona biodisponibilità di principio attivo.

La Richiedente ha inoltre osservato che l'incorporazione della diacereina in idrogel di polisaccaridi, in particolare di pectine ed alginati, permette di ottenere composizioni che mostrano una biodisponibilità di diacereina inaspettatamente superiore a quella delle composizioni commerciali, quali Fisiodai® ed ART50 (si vedano Figure 5 e 6).

Rappresentano pertanto un aspetto della presente invenzione formulazioni di diacereina, caratterizzate dal fatto che la diacereina è incorporata in una matrice di gel, in particolare un idrogel, comprendente almeno un polisaccaride ionico in grado di formare gel per aggiunta di elettroliti, eventualmente contenente altri eccipienti o diluenti farmaceuticamente accettabili, o altri ingredienti comunque utili, diversi da detti polisaccaridi, o loro miscele.

Un altro aspetto della presente invenzione è rappresentato dal procedimento di preparazione delle presenti formulazioni.

Secondo un ulteriore aspetto della presente invenzione, le suddette formulazioni, eventualmente miscelate con eccipienti e/o diluenti, sono utilizzate per la preparazione di composizioni farmaceutiche, in particolare per uso orale.

4. Descrizione dettagliata

Nelle presenti formulazioni la diacereina è incorporata, cioè dispersa in modo sostanzialmente omogeneo, in una matrice di gel polisaccaridico, in particolare di un idrogel (gel acquoso).

Le formulazioni secondo la presente invenzione sono tipicamente in forma di microgranuli, definiti nel presente testo anche come microsfere o microcapsule, con granulometria (diametro medio delle particelle) generalmente compresa fra 5 e 500 micrometri (pm) , preferibilmente fra 25 e 350 micrometri , e più preferibilmente fra 50 e 100 micrometri (pm) .

Il gel secondo la presente invenzione può essere somministrato come tale, oppure, dopo essere stato eventualmente miscelato con additivi convenzionali utili per migliorarne la lavorabilità, ad esempio con agenti lubrificanti, disgreganti, con filiere, con agenti sospendenti, o con altri ingredienti addizionali comunque utili,può essere formulato secondo tecniche convenzionali a dare composizioni farmaceutiche, specialmente per uso orale, quali sospensioni,emulsioni, capsule, compresse. Gli eccipienti e gli altri ingredienti addizionali diversi dai polisaccaridi gelogenici possono essere inclusi nella matrice del gel, oppure aggiunti ai microgranuli di gel preformato.

Le formulazioni e le composizioni farmaceutiche secondo la presente invenzione sono somministrate in terapia umana a dosaggi tipicamente compresi fra 0,3 e 3·0 mg/Kg di peso corporeo al giorno.

I polisaccaridi adatti alla preparazione delle formulazioni secondo la presente invenzione sono gelogenici, cioè hanno la proprietà di formare gel, e biocompatibili, quali ad esempio quelli riportati nelle farmacopee.

Le condizioni specifiche di formazione del gel variano in relazione al tipo di polimero.

Secondo una forma di realizzazione particolarmente preferita, la matrice di gel delle formulazioni secondo la presente invenzione comprende almeno uno o più polisaccaridi anionici almeno parzialmente salificati (o complessati) con cationi in grado di convertirli in gel.

I polisaccaridi preferibilmente utilizzati per la preparazione delle formulazioni secondo la presente invenzione sono pertanto polisaccaridi anionici in grado di essere gelificati per azione di reagenti cationici, e sono tipicamente polisaccaridi idrofili solubili in acqua, ad esempio naturali o semisintetici. Sono in particolare preferiti i polisaccaridi contenenti gruppi carbossilici, quali pectine, alginati e poligalatturonani, e quelli contenenti gruppi solfato, quali i carragenani.

I polisaccaridi anionici utili come materiali di partenza per la preparazione delle formulazioni secondo la presente invenzione sono preferibilmente in forma di sali solubili, ad esempio di metalli alcalini {sodio e potassio), quali sali solubili di acido alginico (ad esempio sodio alginato), e sali solubili di acido poligalatturonico (ad esempio sodio poligalatturonato).

L’uso come materie prime di polisaccaridi anionici almeno in parte in forma acida (in cui il controione è H ) è possibile, anche se meno pratico per ragioni di scarsa solubilità del polimero. E' comunque preferibile che i polisaccaridi acidi siano neutralizzati e convertiti in sali solubili, ad esempio di sodio o di potassio, prima di essere miscelati con diacereina e gelificati.

Il peso molecolare del polimero può variare entro ampi limiti, purché sia adatto alla formazione di gel. Nella pratica si utilizzano convenientemente polisaccaridi con peso molecolare di almeno 100.000 daltons, anche fino a 200.000-300.000 daltons, anche se possono essere utilizzati polimeri con peso molecolare diverso.

Per gli scopi della presente invenzione sono da considerare particolarmente preferite le formulazioni in cui la matrice di gel deriva da polisaccaridi con gruppi carbossilati, quali alginati, pectine e poligalatturonani.

Sono ulteriormente preferite le formulazioni contenenti gel derivati da alginati, pectine, o loro miscele, e fra queste, quelle in cui il gel è derivato da pectine.

Gli alginati utili allo scopo della presente invenzione sono tipicamente derivati da alghe; può essere utilizzato qualche alginato di origine batterica, purché scelto fra quelli in grado di dar luogo a formaizone di gel per aggiunta di cationi.

Le pectine utili per lo scopo della presente invenzione sono in in particolare di origine vegetale, quali quelle derivate da mele e bucce di agrumi.

Sono maggiormente preferite le pectine ad elevato grado di metilazione, superiore a 50% , preferibilmente compreso fra 70% e 35%, in quanto consentono di incorporare maggiori quantità di diacereina rispetto alle pectine a minore grado di metilazione, e forniscono un prodotto finale dotato di caratteristiche tecnologiche più soddisfacenti.

Si può utilizzare ad esempio pectina commerciale HM, che ha grado di metilazione di circa il 69% e peso molecolare compreso fra circa 100.000 e circa 150.000 daltons.

I cationi utili per complessare i polisaccaridi anionici inducendone la gelificazione sono tipicamente cationi di metalli alcalino-terrosi, ad esempio Ca++, o altri cationi polivalenti, quali A1+++, o cationi di metalli di transizione, in particolare bivalenti, ad esempio Cu++. Sono in particolare preferiti gli ioni Ca++.

Secondo forme di realizzazione preferite delle presenti formulazioni, la matrice di idrogel contiene almeno un polisaccaride anionico contentente gruppi carbossilici scelto fra pectine, alginati e loro miscele, almeno in parte salificato (o complessato) con ioni Ca++, essendo ulteriormente preferite le matrici di idrogel derivate da pectine complessate con ioni Ca++. Secondo forme di realizzazione tipiche delle presenti formulazioni, il polisaccaride ionico gelogenico è l'unico costituente polimerico della matrice di idrogel.

Secondo alcune forme di realizzazione delle presenti formulazioni, gli idrogel contengono i suddetti polisaccaridi anionici, in particolare carbossilati, in parte salificati con i cationi in grado di formare gel, preferibilmente con ioni Ca++, ed in parte in forma H+.

Le formulazioni secondo la presente invenzione sono ottenute mediante un procedimento comprendente la gelificazione di una miscela di diacereina e del polimero prescelto in un adatto diluente acquoso, in particolare acqua, la separazione del gel così formatosi dall’eccesso di fase liquida del diluente, e la essiccazione del gel.

La gelificazione è tipicamente ottenuta mediante miscelazione con elettroliti, ed in particolare facendo mettendo a contatto un polisaccaride anionico con cationi in grado di indurre la formazione di gel.

Preferibilmente, si sottopongono a gelificazione polisaccaridi anionici, preferibilmente alginati e pectine, in forma di sali solubili in acqua, in particolare di sali di metalli alcalini, ed i cationi sono preferibilmente ioni Ca++, tipicamente aggiunti in forma di sali solubili in acqua.

Secondo una forma di realizzazione tipica, il presente procedimento comprende le seguenti fasi: si versa sotto agitazione una sospensione acquosa contenente diacereina ed il polimero prescelto in una soluzione acquosa contenente i cationi in grado di indurre la formazione del gel; si lascia sotto agitazione la miscela così ottenuta per permettere la stabilizzazione del gel che si forma a contatto della soluzione acquosa contenente i suddetti cationi, per un tempo tipicamente compreso fra circa 15 miniti e circa 2 ore, in genere di almeno 30 minuti; si separa il gel dalla fase acquosa e lo si essicca.

Il rapporto ponderale polimero gelogenico/diacereina è tipicamente compreso fra 0,1/1 e 10/1, e preferibilmente fra 1/1 e 3/1-Forme di realizzazione tipiche delle presenti formulazioni contengono una quantità generalmente compresa fra circa il IO# e circa il 50# di diacereina e fra circa il 10# e circa l'80# di polisaccaride, tipicamente anionico.

La quantità di acqua contenuta nelle composizioni secondo l'invenzione può variare entro ampi limiti, essendo determinata dalla modalità di essiccamento, ed è tipicamente compresa fra il 5# ed il 20# in peso.

Anche la quantità di cationi gelificanti può variare entro ampi limiti, essendo determinata ad esempio dalla quantità che salifica i gruppi anionici dei polisaccaridi gelogenici, come pure dalla quantità di sali inorganici, quale il CaC^ , che rimane inglobata nel gel. Forme tipiche di realizzazione della presente invenzione contengono fra l'I# ed il 30 # in peso di cationi gelificanti, tipicamente Ca++, ed inoltre dallo 0# in peso a circa il 10# in peso di cationi di metalli alcalini.

Forme tipiche di realizzazione della presente invenzione contengono lattosio, aggiunto come eccipiente all'interno della matrice di gel, oppure miscelato ai granuli di gel preformati, in quantità ad esempio compresa fra il 10# e l'80# in peso. Le percentuali in peso sono riferite al peso totale della formulazione essiccata.

Secondo una forma di realizzazione tipica della presente invenzione, il gel è direttamente ottenuto in forma di microsfere, definite nel presente testo anche come microcapsule, versando una sospensione acquosa omogenea contenente la diacereina ed il polisaccaride gelogenico nella soluzione acquosa contenente i cationi in grado di indurre la formazione del gel, attraverso l'ago di una siringa o altro alimentatore cavo (ugello) di diametro interno opportuno. Le sferette di gel formatesi a contatto con la soluzione acquosa dei cationi gelificanti, dopo essere state lasciate sotto agitazione nella soluzione contenente i cationi gelificanti per circa 30 minuti, per permettere ai suddetti cationi di penetrare all'interno delle sferette di gel, sono separate dalla fase acquosa, ad esempio per filtrazione su gouch, ed essiccate.

Secondo un'altra forma di realizzazione del presente procedimento, che si presta in modo particolare alla effettuazione su scala industriale e che non richiede apparecchiature speciali di alimentazione delle soluzioni, la matrice di gel delle formulazioni secondo la presente invenzione è ottenuta in forma di microgranuli attraverso un procedimento comprendente le seguenti fasi: si versa sotto vigorosa agitazione una sospensione acquosa omogenea di diacereina e di polisaccaride nella soluzione contenente i cationi gelificanti, si separano gli agglomerati di particelle di gel così formatisi, si essiccano e si convertono in microgranuli mediante macinazione. In particolare, gli agglomerati di particelle di gel formatisi a contatto con la soluzione acquosa di cationi gelificanti sono lasciati sotto agitazione per circa 30 minuti prima di essere separati dall'eccesso di fase liquida, e la macinazione può essere ad esempio effettuata in un mulino a palle o in altro tipo di apparecchiatura adatta per la macinazione di polveri in campo farmaceutico. I microgranuli ottenuti sono quindi sottoposti a setacciatura attraverso setacci aventi pori di dimensione opportuna, separando le frazioni aventi la granulometria desiderata.

La matrice di gel secondo la presente invenzione ottenuta secondo le varianti di procedimento sopra illustrate contiene diacereina uniformemente dispersa nella matrice polimerica, differenziandosi in tal modo da preparazioni in cui microgranuli contententi un principio attivo sono rivestiti con film di varia natura.

La sospensione acquosa contenente diacereina e polisaccaride è tipicamente una sospensione in acqua, ed è tipicamente ottenuta aggiungendo la diacereina solida ad una soluzione tipicamente in acqua contenente almeno un polisaccaride anionico, in concentrazione tipicamente compresa fra lo 0,5# e il 10# in peso, e in quantità corrispondente ad un rapporto ponderale rispetto alla diacereina come prima specificato. La miscela così ottenuta è quindi mantenuta sotto agitazione fino ad ottenere una dispersione omogenea.

La formazione del gel , in particolare per aggiunta di cationi a polisaccaridi anionici , avviene tipicamente a temperatura ambiente, generalmente compresa fra circa 20°C e circa 30°C.

L ' essiccazione del gel avviene tipicamente a pressione atmosferica, a temperature comprese fra 40°C e 100 °C , ed ancora più tipicamente fra 50°C e 80“C, il granulato essendo tipicamente essiccato in apparecchiature a letto fluido . Si descrivono di seguito alcune forme di realizzazione particolari della presente invenzione , a scopo illustrativo , ma non limitativo della stessa.

ESEMPIO 1 : Formulato di diacereina incapsulata in sferette di alginato di calcio (DI) .

20 g di alginato PRONOVA MV vengono sciolti in 1 1 di acqua Milli-Q. 10 grammi di DAR vengono sospesi nella soluzione di alginato mediante vigorosa agitazione. Quando la sospensione risulta omogenea viene fatta gocciolare attraverso l' ago di una siringa (0,25 mm di diametro interno) in 2 1 di CaC^ 0, 1 M secondo la metodologia illustrata in: Smids^od, 0. e Skjàk-Br»k G . TibTech , 8 ( 1990) , 71-78. Le sferette di gel formatasi a contatto con la soluzione di calcio vengono mantenute in agitazione per circa 30 minuti nella soluzione di CaC^ . Il composto viene quindi recuperato mediante filtrazione su gooch e sottoposto ad essiccazione su letto fluido . Il contenuto in diacereina determinato mediante il metodo spettrofotometrico successivamente descritto è del 24/£ in peso.

La soluzione acquosa contenente i cationi gelificanti è tipicamente una soluzione in acqua, e preferibilmente contiene un sale solubile in acqua di detti cationi , quale CaC1, con una concentrazione di detti cationi tipicamente compresa fra 5>10 M e 5 M, più preferibilmente fra 10”^ M e 1 M.

La quantità dei suddetti cationi, tipicamente ioni Ca++, aggiunti rispetto al polisaccaride anionico può variare entro limiti ampi, tipicamente da circa 0,01 moli fino ad un eccesso stechiometrico rispetto ai gruppi anionici del polisaccaride, ad esempio fino a 10, e tipicamente fino a circa 2 moli per mole di gruppi anionici, definita come la quantità di gruppi anionici neutralizzata da una mole di ioni H+.

Per ottenere idrogel misti in forma H+/catione bivalente, in cui gruppi anionici del polisaccaride sono in parte salificati con detti cationi ed in parte in forma H+ si utilizza una soluzione di cationi utilizzati per la formazione del gel contenente anche un acido protico, ad esempio HC1.

Secondo una forma di realizzazione tipica della presente invenzione, la soluzione acquosa contenente i cationi utilizzati per la formazione del gel contiene i cationi gelificanti in difetto stechiometrico rispetto ai gruppi anionici del polimero, ad esempio da circa 0,005 a circa 0,05 moli di cationi per mole di gruppi anionici, ed inoltre un acido protico, ad esempio HC1, in quantità preferibilmente compresa fra 0,5 e 5 moli per mole di gruppi anionici del polimero.

DETERMINAZIONE SPETTROFOTOMETRICA DELLA DIACEREINA NEI FORMULATI. Aliquote di circa 75 mB di ciascun preparato sono state accuratamente pesate all'interno di matracci tarati da 23⁄40 mi. Sono stati quindi aggiunti circa 200 mi di tampone fosfato 0,1 M, pH 6,8. Ciascun matraccio è stato mantenuto a temperatura ambiente per 48 ore fino ad ottenere la dissoluzione completa del composto. Si è quindi proceduto a portare a volume con tampone fosfato ciascun matraccio e di ciascuna soluzione sono state preparate diluizioni in modo tale da ottenere dei valori di assorbimento compresi tra 0,3 e 0,5 unità di assorbanza. Le letture sono state effettuate mediante uno spettrofotometro a doppio raggio, utilizzando come soluzione di riferimento il tampone fosfato e leggendo 1'assorbanza a 432 nm. La curva di calibrazione è stata ottenuta utilizzando una soluzione madre preparata pesando accuratamente circa 25 mg di diacereina in un matraccio da 250 mL e portando a volume con tampone fosfato 0,1 M, pH 6,8. Mediante diluizione sono state preparate una serie di soluzioni a concentrazione di diacereina compresa fra 0,005 e 0,1 mg/ml. Dalla lettura dell’assorbimento a 432 nm viene costruita la curva di calibrazione utilizzata per determinare la concentrazione nelle soluzioni incognite ottenute dai formulati di cui si vuole determinare il contenuto in principio attivo. ESEMPIO 2: Formulato di diacereina incapsulata in gel misto H+/Ca++ di alginato (D2).

20 g di alginato PRONOVA MV vengono sciolti in 11 di acqua Milli-Q. 10 g di DAR vengono sospesi nella soluzione di alginato mediante vigorosa agitazione . Quando la sospensione risulta omogenea viene fatta gocciolare attraverso l ' ago di una siringa (0,25 mm di diametro interno) in 2 1 di HC1 0, 1 N contenenti CaCl2 1 mM . Le sferette di gel formatasi a contatto con la soluzione acida contenente calcio vengono man tenute in agitazione per circa 30 minuti prima di rimuoverle dalla soluzione . Il composto viene quindi recuperato mediante filtrazione su gooch e sottoposto ad essiccazione su letto fluido . Il contenuto di diacereina del preparato determinato mediante il metodo spettrofotometrico precedentemente descritto è del 2f% in peso. ESEMPIO 3 · Formulato di diacereina incapsulata in sferette di poligalatturonato di calcio (D3) .

20 g di acido poligalatturonico da mele ( Sigma) sono stati sciolti in 250 mi di acqua Milli-Q. 10 g di DAR sono stati sospesi nella soluzione di acido poligalatturonico mediante vigorosa agitazione. Quando la sospensione risulta omogenea è stata fatta gocciolare attraverso l ' ago di una siringa {0,25 mm di diametro interno) in 500 mi di CaC1 0, 1 M. Le sferette di gel formatasi a contatto con la soluzione di calcio vengono mantenute in agitazione per circa 30 minuti nella soluzione di CaC1. Il composto viene quindi recuperato mediante filtrazione su gooch e sottoposto ad essicazione su letto fluido. {Le sferette non sono particolarmente rigide e tendono a perdere la forma sferica probabilmente a causa del basso peso molecolare dell ' acido poligalatturonico). Il contenuto di diacereina determinato mediante il metodo spettrofotometrico precedentemente descritto è del 23% in peso.

ESEMPIO 4 : Formulato di diacereina incapsulata in gel misti di alginato/pectina (D4).

Microgranuli di diacereina incapsulata in gel misto di alginato e pectina sono stati preparati seguendo il procedimento riportato nell'Esempio 1, utilizzando una soluzione di 10 g di alginato PRONOVA MV e 10 g di pectina da buccia di limone in 11 di acqua Milli-Q, al posto della soluzione di 20 g di alginato in acqua. Le sferette di gel sono mantenute sotto agitazione per circa 30 minuti, recuperate, essiccate ed analizzate come descritto nell'Esempio 1, ed il loro contenuto di diacereina è risultato pari al 25# in peso.

ESEMPIO 5 : Formulato di diacereina incapsulata in gel misti di alginato/pectina (D5)·

Microgranuli di diacereina incapsulata in gel misto di alginato e pectina sono stati preparati seguendo il procedimento riportato nell'Esempio 1, utilizzando una soluzione di 10 g di alginato PRONOVA MV e 20 g di pectina da buccia di limone in 11 di acqua Milli-Q, al posto della soluzione di 20 g di alginato in acqua, ed utilizzando 15 g di DAR anziché 10 g di DAR.

Il preparato secco ottenuto dopo filtrazione su gouch ed essiccazione su letto fluido è stato quindi mescolato con un uguale peso di D(+)lattosio e macinato. Il contenuto di diacereina del preparato determinato mediante il metodo spettrofotometrico precedentemente descritto è del 15% in peso. ESEMPIO 6 : formulato di diacereina incapsulata in gel misti alginato/pectina (D6).

Microgranuli di diacereina incapsulata in gel misto di alginato e pectina sono stati preparati seguendo il procedimento riportato nell'Esempio 1, utilizzando una soluzione di 10 g di alginato PRONOVA MV e 10 g di pectina da mele ad alto grado di esterificazione in 11 di acqua Milli-Q. al posto della soluzione di 20 g di alginato in acqua, sospendendovi 10 g di DAR, e facendo gocciolare la sospensione così ottenuta, quando risulta omogenea, attraverso l'ago di una siringa (0,25 mm di diametro interno) in 11 di CaCl20,1 M, anziché in 2 litri di CaCl20,1 M. Le sferette di gel sono mantenute sotto agitazione per circa 30 minuti, recuperate, essiccate ed analizzate come descritto nell'Esempio 1, ed il loro contenuto di diacereina è risultato pari al 28 % in peso.

ESEMPIO 7= Formulato di diacereina incapsulata in gel di alginato (D7>-Microgranuli di diacereina incapsulata in gel di alginato sono stati preparati seguendo il procedimento riportato nell'Esempio 1, utilizzando una soluzione di 10 g di alginato PRONOVA MV sciolti in 1 1 di una soluzione di lattosio all'io di acqua Milli-Q al posto della soluzione di 20 g di alginato in acqua, sospendendovi 10 g di DAR, e facendo gocciolare la sospensione così ottenuta, quando risulta omogenea, attraverso l'ago di una siringa (0,25 mm di diametro interno) in 2 litri di CaC^ 0,1 M contenente l'l% di lattosio. Le sferette di gel sono mantenute sotto agitazione per circa 30 minuti, recuperate, essiccate ed analizzate come descritto nell'Esempio 1, ed il loro contenuto di diacereina è risultato pari al 25% in peso.

ESEMPIO 8 : Formulato contenente diacereina in alginato (D8). 20 g di alginato PRONOVA MV vengono sciolti in 11 di acqua Milli-Q. 10 g di DAR vengono sospesi nella soluzione di alginato mediante vigorosa agitazione. Quando la sospensione risulta omogenea viene versata in 21 di CaCl20,1 M mantenuti in agitazione per mezzo di una ancoretta magnetica. Gli agglomerati di gel formatasi a contatto con la soluzione di calcio vengono mantenuti in agitazione per circa 30 minuti nella soluzione di CaCl2 per permettere la diffusione dello ione calcio anche all'interno degli aggregati. Il composto viene quindi recuperato mediante filtrazione su gooch e sottoposto ad essiccazione su letto fluido. Il preparato secco è stato quindi macinato e setacciato su 250 pm.La frazione a granulometria inferiore a 250 pm è stata utilizzata per le successive prove di tollerabilità e biodisponibilità. Il contenuto di diacereina del preparato determinato mediante il metodo spettrofotometrico precedentemente descritto è risultato pari al 22% in peso.

ESEMPIO 9 : Formulato contenente diacereina e pectina (D9).

10 g di pectina HM vengono sciolti in 500 mL di acqua Milli-Q. 10 g di DAR vengono sospesi nella soluzione di pectina mediante vigorosa agitazione. Quando la sospensione risulta omogenea viene versata in 21 di CaCl20,1 M mantenuti in agitazione per mezzo di una ancoretta magnetica. La pectina forma gel a contatto con la soluzione di calcio ed il sistema viene mantenuto in agitazione per circa 30 minuti nella soluzione CaCl2 per permettere la stabilizzazione del gel con la diffusione del calcio anche all'interno degli aggregati. Il composto viene quindi recuperato mediante centrifugazione e ad essiccazione su letto fluido. Il preparato secco è stato quindi macinato e setacciato su 250 pm.La frazione a granulometria inferiore a 250 pm è stata utilizzata per le successive prove di tollerabilità e biodisponibilità. Il contenuto di diacereina del preparato determinato mediante il metodo spettrofotometrico precedentemente descritto è risultato pari al 32% in peso.

TEMPIO 10 : Formulato contenente diacereina e pectina (DIO). 50 g di pectina HM vengono sciolti in 1000 mi di acqua Milli-Q in un mescolatore si aggiungono quindi 25 g di DAR che vengono sospesi nella soluzione di pectina mediante vigorosa agitazione. Quando la sospensione risulta omogenea si aggiungono 500 mi di CaCl20,1 M mantenendo il sistema in agitazione per circa 30 minuti. Il gel formatosi viene quindi recuperato e l'eccesso d'acqua viene allontanato per mezzo di un filtro pressa. Il prodotto viene quindi sottoposto ad essiccazione su letto fluido. Il prodotto secco è stato quindi macinato mediante mulino a palle fino ad ottenere la granulometria desiderata. Il contenuto in diacereina del preparato determinato mediante il metodo spettrofotometrico precedentemente descritto è risultato pari al 31# in peso.

PROVE COMPARATIVE

Le formulazioni secondo la presente invenzione sono state confrontate con due preparazioni farmaceutiche commerciali secondo la tecnica nota, Fisiodai® e Art^ .

Fisiodai®, commercializzato in Italia, è una preparazione per uso orale, in forma di capsule di gelatina, in cui la diacereina è formulata insieme a lattosio e a magnesio stearato.

Un' altra preparazione farmaceutica di diacereina, nota come ART 50 è commercializzata in Francia, e contiene il principio attivo miscelato a lattosio e magnesio stearato, in quantità diversa rispetto a Fisiodaa®.

PROVE DI TOLLERABILITÀ' GASTROINTESTINALE

Gli studi di tollerabilità gastrointestinale delle nuove formulazioni di diacereina sono state eseguite utilizzando il ratto come modello sperimentale animale. Sono stati utilizzati ratti maschi Hsd BrlrWH con un peso basale compreso fra 250 e 300 g. Quali parametri per la valutazione della tollerabilità gastrointestinale delle diverse formulazioni sono stati rilevati l’aumento del peso corporeo degli animali, la comparsa e l’intensità delle reazioni avverse, in particolare la diarrea.

4 gruppi di 10 animali ciascuno sono stati trattati per 14 giorni consecutivi per via orale con 80 mg/Kg/die di diacereina, rispettivamente con ART 50n (formulazione commerciale) e con le preparazioni secondo la presente invenzione D6, D8 e D9. Il farmaco ART 50 è stato somministrato come sospensione in gomma arabica al 10%, mentre le formulazioni D6, D8 e D9 sono state somministrate miscelate con latte condensato.Un quinto gruppo di 5 animali che fungeva da controllo è stato trattato, con le stesse modalità,con una soluzione al 10% di gomma arabica.

Aumento di peso corporeo

I risultati relativi all’aumento di peso medio nei diversi gruppi sono riassunti in Tabella 1 ed in Figura 1. L'analisi statistica dei risultati è stata eseguita con il test t di Student per i dati non appaiati.

Tabella 1:

Analisi dei pesi corporei (PC)

Dall'analisi dei risultati si può osservare che :

a) Alla fine del trattamento l'aumento di peso nel gruppo di controllo è stato di 31 ± 7 g (x 1 D.S.).

b) Nei gruppi trattati con le diverse formulazioni di diacereina, l'aumento di peso è stato inferiore a quello osservato nel gruppo di controllo (31 ± 7)3 grammi) e l'aumento di peso minore è stato osservato nel gruppo trattato con ART 50 :

controllo

c) Relativamente al parametro "aumento del peso corporeo" tutte e tre le nuove formulazioni, D9. D8, D6 hanno dimostrato di essere meglio tollerate di ART 50 con un aumento percentuale del peso che era, alla fine del trattamento, maggiore rispetto ad ART 50:

La differenza in peso nei gruppi trattati con le composizioni D6, D8 e D9 rispetto ai gruppi trattati con ART 50 mostra che le composizioni secondo la presente invenzione sono decisamente migliori di ART 50 per quanto riguarda la tollerabilità gastrointestinale, le composizioni D9 essendo quelle che danno i migliori risultati.

Episodi diarroici

Per quanto riguarda il secondo parametro preso in considerazione per la valutazione della tollerabilità gastrointestinale è stato determinato il numero e 1'intensità degli episodi diarroici nei gruppi trattati con ART 50* D6, D8 e D9, in confronto con il gruppo di controllo. L'incidenza dei fenomeni diarroici, espressa come numero di ratti affetti da almeno un episodio diarroico, e la loro severità, rapportata al numero di episodi diarroici verificatisi nei diversi gruppi di trattamento, sono riportate in grafico nelle Figure 2 e 3i rispettavamente. Si può osservare che:

a) nessuno degli animali del gruppo di controllo ha manifestato la comparsa di reazioni avverse ed in particolare di diarrea. b) 7/10 animali del gruppo trattato con ART 50 ha manifestato la comparsa di episodi diarroici (9 episodi in totale); diarrea è stata osservata in 4/10 animali del gruppo D6 (6 episodi) ed in 2/10 animali dei gruppi D8 e D9-c) la gravità della diarrea è stata mediamente più elevata nel gruppo ART 50 che negli altri gruppi trattati.

Conclusioni

Si può quindi concludere che la tollerabilità gastrointestinale delle nuove formulazioni si è dimostrata più elevata rispetto a quella commercialmente disponibile (ART 50), sia valutata come aumento di peso medio sia come comparsa di episodi diarroici. Le nuove formulazioni sono quindi in grado di minimizzare la comparsa di episodi di diarrea osservata in corso di trattamento di pazienti affetti da osteoartrosi.

PROVE DI BIODISPONUBILITA' PER UNA SINGOLA DOSE DI 40 mg/kg.

L'assorbimento gastrointestinale dell'ART 50 e di alcuni dei nuovi preparati è stato valutato su gruppi di 3 animali (250-300g) ospitati individualmente in gabbie metaboliche ed alimentati normalmente. A ciascun ratto è stata somministrata oralmente una singola dose di preparato corrispondente a 40 mg/kg di diacereina. Le urine delle 24 ore sono state raccolte ed analizzate per determinare il contenuto di diacereina e dei suoi metaboliti secondo il metodo HPLC successivamente descritto. La percentuale di diacereina, valutata come reina escreta nelle urine per ciascun gruppo di trattamento è riportata in Figura 4 . PROVE DI BIODISPONIBILITA'DI UNA SINGOLA DOSE DI 2MG/KG L'assorbimento gastrointestinale dell'ART 50 e dei nuovi preparati D8 e D9 è stato valutato su gruppi di 3 animali (250-300g) ospitati individualmente in gabbie metaboliche e mantenuti digiuni. A ciascun ratto è stata somministrata oralmente una singola dose di preparato corrispondente a 2 mg/kg di diacereina. Le urine delle 24 ore sono state raccolte ed analizzate per determinare il contenuto di diacereina e suoi metaboliti secondo il metodo HPLC successivamente descritto. La percentuale di diacereina valutata come reina, escreta nelle urine per ciascun gruppo di trattamento è riportata in Figura 5·

METODO PER LA DETERMINAZIONE DELLA DIACEREINA E DEI SUOI METABOLITI IN CAMPIONI BIOLOGICI.

Per la determinazione della quantità di diacereina presente nelle urine si è fatto ricorso al metodo basato sulla cromatografia HPLC a fase inversa secondo il metodo già illustrato in letteratura (Springolo, V. e Coppi. G. Journal of Chromatography, 428, 1988, 173"177)· I campioni di urine sono stati trattati enzimaticamente con β-glucoronidasi da Helix pomataia, (Sigma type H£ al fine di idrolizzare i metaboliti (glucuronide e solfato della reina) presenti nel liquido biologico come descritto in Magnard, 0., Louchahi, K. et al., Biopharmaceutics and drug disposition, 14, 1993. 401-108 ed in Debord, P., Louchahi, K. et al., Fund. Clin. Pharmacol. 7. 1993, 435“44l. 100 μΐ di una soluzione enzimatica 500 IU/ml 40 μΐ di tampone acetato pH 4,9 360 μΐ di acqua sono stati aggiunti a 500 μΐ di urina ed incubati a 37 "C per 2 ore. Successivamente i campioni di urina sono stati trattati con un eguale volume di acetonitrile e la miscela è stata agitata su un Vortex per 1 minuto e quindi centrifugata a 5000 rpm per 20 minuti. Il supernatante è stato trasferito in una provetta ed è stato aggiunto un volume adeguato di tampone Mcllvaine, pH 2,2-acetonitrile (55;45)· 20 μΐ della soluzione di campione sono stati iniettati nella colonna a fase inversa Alltima RP-8. La fase mobile è costituita da una miscela tampone Mcllvaine-acetonitrile (55:45) come descritto in Springolo, V. e Coppi, G. Journal of Chromatography, 428, 1988, 173-177· ha lunghezza d'onda del rivelatore UV-visibile è stata impostata a 258 nm per una maggiore sensibilità del metodo. La curva di calibrazione è stata ottenuta mediante aggiunte note di reina a campioni di urina di ratti non trattati con il farmaco. Le soluzioni contenenti lo standard sono state quindi sottoposte allo stesso trattamento descritto per i campioni di urine di ratti trattati con le diverse formulazioni. In Figura 6 è riportata la curva di calibrazione per la determinazione del contenuto di diacereina valutata come reina di fluidi biologici.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Formulazione contenente diacereina, caratterizzata dal fatto che la diacereina è incorporata in una matrice di idrogel comprendente almeno un polisaccaride ionico in grado di formare gel per aggiunta di elettroliti.
2. Formulazione contenente diacereina, comprendente ulteriormente eccipienti o diluenti farmaceuticamente accettabili, o loro miscele.
3. Formulazione secondo la rivendicazione 1 o 2, caratterizzata dal fatto di essere in forma di microgranuli.
4. Formulazione secondo la rivendicazione 3, in cui i microgranuli hanno granulometria compresa fra 5 ® 500 micrometri.
5. Formulazione secondo la rivendicazione 4, in cui i microgranuli hanno granulometria compresa fra 25 e 350 micrometri.
6. Formulazione secondo la rivendicazione 5. in cui i microgranuli hanno granulometria compresa fra 50 e 100 micrometri.
7. Formulazione secondo la rivendicazione 1, in cui la matrice di idrogel comprende almeno un polisaccaride anionico almeno parzialmente salificato con cationi gelificanti.
8. Formulazione secondo la rivendicazione 7. in cui il polisaccaride anionico è scelto fra polisaccaride contenente gruppi carbossilici e polisaccaride contenente gruppi solfato. 9· Formulazione secondo la rivendicazione 7» in cui il polisaccaride contenente gruppi carbossilici è scelto fra pectine , alginati e poligalatturonani , ed il polisaccaride contenente gruppi solfato è un carragenano. 10. Formulazione secondo la rivendicazione 7 o 9. in cui il polisaccaride contiene gruppi carbossilici. 11. Formulazione secondo la rivendicazione 7 * in cui il polisaccaride è scelto fra alginati, pectine e loro miscele. 12. Formulazione secondo la rivendicazione 11 , in cui il polisaccaride è una pectina. 13- Formulazione secondo la rivendicazione 12, in cui la pectina ha grado di metilazione superiore a 50#. 14. Formulazione secondo la rivendicazione 12, in cui la pectina ha grado di metilazione compreso fra 70# e 95#· 15. Formulazione secondo la rivendicazione 7 * in cui i cationi sono scelti fra cationi di metalli alcalino-terrosi e cationi di metalli di transizione. 16. Formulazione secondo la rivendicazione 7 · in cui i cationi sono scelti fra Ca++ , A1+++ e Cu++ . 17. Formulazione secondo la rivendicazione 7. in cui i cationi sono ioni Ca++ . 18. Formulazione secondo la rivendicazione J , in cui il polisaccaride è un plisaccaride anionico scelto fra pectine, alginati e loro miscele, ed i cationi sono ioni Ca++ . 19. Formulazione secondo la rivendicazione 7 · in cui il polisaccaride è una pectina, ed i cationi sono ioni Ca++ . 20. Formulazione secondo la rivendicazione 7 , in cui i gruppi anionici di detto polisaccaride sono gruppi carbossilici in parte salificati con ioni Ca++, ed in parte in forma H+. 21. Formulazione secondo la rivendicazione 1, in cui il rapporto ponderale polimero/diacereina è compreso fra 0.1/1 e 10/1. 22. Formulazione secondo la rivendicazione 21, in cui detto rapporto è compreso fra 1/1 e 3/1· 23- Formulazione secondo le rivendicazioni da 1 a 22, contenente una quantità dal 10% al 503⁄4 in peso di diacereina, dal 10% all'80# in peso di polisaccaride anionico, dal 5% al 20 % in peso di acqua, dall'lji al 30 % in peso di cationi gelificanti, e dallo 0% in peso al 10J£ in peso di cationi di metalli alcalini. 24. Formulazione secondo la rivendicazione 23. contenente inoltre dal 10% all'80/l»in peso di lattosio. 25- Procedimento per la preparazione di una formulazione secondo ognuna delle rivendicazioni da 1 a 24, comprendente la la gelificazione per aggiunta di elettroliti ad una miscela di diacereina e di un polisaccaride ionico in un diluente acquoso, la separazione del gel dall'eccesso di fase liquida, e la essiccazione del gel. 26. Procedimento secondo la rivendicazione 25, in cui il polisaccaride è un polisaccaride anionico e la gelificazione è ottenuta mediante aggiunta di cationi in grado di indurre la formazione di gel. 27. Procedimento secondo la rivendicazione 26, in cui il polisaccaride sottoposto a gelificazione è in forma di sale solubile in acqua ed i cationi gelificanti sono aggiunti in forma di sali solubili in acqua. 28. Procedimento secondo la rivendicazione 26, comprendente le seguenti fasi: si versa sotto agitazione una sospensione acquosa contenente diacereina ed il polisaccaride prescelto in una soluzione acquosa contenente i cationi in grado di indurre la formazione del gel, si lascia sotto agitazione, si separa il gel dalla fase acquosa; si essicca il gel. 29· Procedimento secondo la rivendicazione 28, in cui il gel formatosi a contatto con la soluzione acquosa contenente i cationi gelificanti è lasciato sotto agitazione per un tempo compreso fra 15 minuti e 2 ore. 30. Procedimento secondo la rivendicazione 29, in cui il detto contatto è di circa 30 minuti. 31. Procedimento secondo la rivendicazione 29, in cui il gel è direttamente ottenuto in forma di microsfere, versando una sospensione acquosa contenente la diacereina ed il polisaccaride gelogenico prescelto nella soluzione acquosa contenente i cationi in grado di indurre la formazione del gel, attraverso l'ago di una siringa o altro alimentatore cavo (ugello). 32. Procedimento secondo la rivendicazione 29, adatto ad ottenere il gel in forma di microgranuli, comprendente le seguenti fasi: si versa sotto vigorosa agitazione una sospensione acquosa omogenea di diacereina e di polisaccaride nella soluzione contenente i cationi gelificanti, si separano gli agglomerati di particelle di gel cosi formatisi, si essiccano e si convertono in microgranuli mediante macinazione. 33· Procedimento secondo la rivendicazione 29. in cui la sospensione acquosa contenente diacereina e polisaccaride è ottenuta aggiungendo la diacereina solida ad una soluzione in acqua contenente almeno un polisaccaride anionico, in concentrazione compresa fra lo 0.5# e il 10# in peso, e in rapporto ponderale rispetto alla diacereina compreso fra 0.1/1 e 10/1. 34. Procedimento secondo le rivendicazioni da 29 a 33> in cui il polisaccaride è scelto fra alginati, pectine e loro miscele,ed i cationi sono ioni Ca++. 35· Procedimento secondo la rivendicazione 34, in cui gli ioni Ca++ sono aggiunti come soluzione acquosa di un sale solubile di Ca++, avente una concentrazione di cationi gelificanti compresa fra 5· 10 -4 M e 5 M, ed una quantità di cationi gelificanti compresa fra 0 , 01 e 10 moli per mole di gruppi anionici del polisaccaride. 36. Procedimento secondo la rivendicazione 351 in cui la la concentrazione di cationi gelificanti è compresa fra 10-^ M e i M, e la loro quantità è compresa fra 0,01 e 2 moli per mole di gruppi anionici del polisaccaride. 37 - Procedimento secondo la rivendicazione 29 , per la preparazione di idrogel misti in forma H+/catione gelificante, in cui la soluzione acquosa di cationi gelificanti contiene i cationi gelificanti in difetto stechiometrico rispetto ai gruppi anionici del polisaccarido , e contiene inoltre un acido protico. 38. Procedimento secondo la rivendicazione 37. in cui i cationi gelificanti sono in quantità compresa fra 0,005 e 0,5 moli per mole di gruppi anionici , e la quantità di acido è compresa fra 0,5 e 5 moli per mole di gruppi anionici. 39- Procedimento secondo la rivendicazione 29. in cui la formazione del gel è effettuata a temperatura ambiente. 40. Procedimento secondo la rivendicazione 29, in cui l'essiccazione del gel avviene a pressione atmosferica, a temperature comprese fra 40°C e 100°C. 41. Formulazione contenente diacereina, ottenibili secondo ognuna delle rivendicazioni da 25 a 40. 42. Composizioni farmaceutiche contenenti diacereina, caratterizzate dal fatto di comprendere almeno una formulazione secondo ognuna delle rivendicazioni da 1 a 24 o secondo la rivendicazione 40, eventualmente in presenza di eccipienti o diluenti farmaceuticamente accettabili, o loro miscele. 43· Composizioni farmaceutiche secondo la rivendicazione 42, adatte alla somministrazione orale. 44. Impiego di una formulazione secondo ognuna delle rivendicazioni da 1 a 24, oppure secondo la rivendicazione 40, per il trattamento della osteoartrosi. 45* Impiego di una formulazione secondo ognuna delle rivendicazioni da 1 a 24, oppure secondo la rivendicazione 40, per la preparazione di composizioni farmaceutiche utili per il trattamento della osteoartrosi.