ITMI952285A1

ITMI952285A1 - Procedimento per la preparazione di polimeri autoreticolati e/o co-reticolati di forma predefinita e relativi impieghi

Info

Publication number: ITMI952285A1
Application number: IT95MI002285A
Authority: IT
Inventors: Pasquale Desideri; Mariella Dentini; Vittorio Crescenzi
Original assignee: Consiglio Nazionale Ricerche
Priority date: 1995-11-07
Filing date: 1995-11-07
Publication date: 1997-05-07
Also published as: IT1276085B1; ITMI952285A0

Abstract

Procedimento per la preparazione di polimeri autoreticolati e/o co-reticolati di forma predefinita realizzato a partire da almeno un composto polimerico provvisto di funzionalità acide attivabili e di funzionalità nucleofile e che si trovi allo stato di gel fisico, il suddetto procedimento comprendente: una fase di preparazione dello stato di gel fisico del composto polimerico, la eventuale equilibrazione del gel nel mezzo di reazione opportuno, l'attivazione del sistema equilibrato e la conseguente reazione di reticolazione.I polimeri autoreticolati e/o co-reticolati di forgia predefinita così ottenibili vengono impiegati principalmente in campo biomedico.

Description

OGGETTO DELL'INVENZIONE

La presente invenzione ha per oggetto un procedimento per la preparazione di polimeri autoreticolati e/o coreticolati, in particolare polisaccaridi autoreticolati e/o co-reticolati, di forma predefinita.

Pure oggetto della presente invenzione e' l'impiego di detti polimeri autoreticolati e/o co-reticolati di forma predefinita, ad esempio in campo biomedico e/o farmacologico .

Sempre oggetto della presente invenzione sono gli stessi polimeri autoreticolati e/o co-reticolati di forma predefinita, ottenibili mediante il suddetto procedimento di preparazione.

STATO DELLA TECNICA

Come e' noto, nel caso di alcune classi di composti polimerici, e' possibile effettuare reazioni di reticolazione attraverso l'utilizzo di nucleofili bi/polifunzionali, con ottenimento di reticoli polimerici in cui le catene polimeriche sono unite da ponti intercatena di varia tipologia a seconda del tipo di reticolante impiegato. In questo caso, il polimero sara' provvisto di gruppi funzionali adatti a reagire con il reticolante, ad esempio gruppi carbossilici sulla catena polimerica potranno reagire, in condizioni di reazione opportune, con gruppi ossidrilici o con gruppi amminici presenti sul reticolante. I ponti intercatena cosi' realizzati, possono tuttavia costituire un impedimento all'applicazione dei suddetti reticoli polimerici ad esempio in campo biomedico, in quanto e' possibile la lisi chimica o enzimatica dei legami coinvolti, con il conseguente rilascio di specie non accettabili dal punto di vista biochimico e/o farmacologico.

La necessita' di non alterare il profilo di biocompatibilita' di molti polimeri che sono ad esempio impiegati come veicoli per il rilascio controllato di principi attivi o come additivi per formulazioni alimentari, ha contribuito allo sviluppo della ricerca verso la preparazione di derivati cosiddetti "autoreticolati", cioè' derivati polimerici nei quali le reazioni di condensazione avvengono tra gruppi funzionali presenti sulle stesse catene del polimero, senza necessita', ad esempio, di aggiunta di un reticolante esterno. In questo modo, gli unici prodotti di idrolisi del polimero autoreticolato sono le stesse catene del polimero.

Nella maggior parte dei casi, la preparazione di polimeri autoreticolati prevede la reazione in opportune condizioni di un gruppo funzionale presente sulla catena polimerica con un ulteriore gruppo funzionale adatto, pure presente sulla catena polimerica. Tipico esempio sono catene polimeriche provviste allo stesso tempo di gruppi carbossilici e di adatti nucleofili, quali ad esempio gruppi ossidrilici o gruppi amminici, che possono reagire a dare rispettivamente esteri e ammidi.

Il punto di partenza per la preparazione di polimeri autoreticolati e', ad esempio nel caso di polimeri acidi, la iniziale modifica del gruppo carbossilico. La modificazione del gruppo carbossilico ad esempio nei poliuronani, nei glicosamminoglicuronoglicani , nelle proteine, nei polipeptidi e nei policarbossilati in generale, può' essere effettuata sfruttando numerose tecniche sintetiche la cui efficacia e' strettamente legata al tipo di polimero, alla necessita' piu' o meno stringente di preservare l'integrità delle catene, alla presenza di reazioni collaterali di varia entità' e natura i cui sottoprodotti possono generare problematiche relative alle necessita’ applicative.

Nel caso dei poliuronani e dei glicosamminoglicuronoglicani particolare attenzione va adottata nella scelta di vie sintetiche che non interferiscano con la stabilita' del legame glicosidico, essendo essa minore in ambiente acido, e che inoltre non coinvolgano reazioni collaterali a carico dei gruppi ossidrilici e/o amminici presenti, tenendo presente che le proprietà e le applicazioni dei prodotti ottenuti possono dipendere dal loro peso molecolare e dalla presenza di funzionalità' libere e intatte.

In letteratura sono noti molti processi volti ad ottenere derivati esterei o ammidici della funzione carbossilica o dello ione carbossilato, la cui applicazione nel campo della derivatizzazione dei poliuronani e' stata tentata. Nella maggior parte dei casi, le condizioni operative ed i reagenti utilizzati trascurano le problematiche sopraesposte, ne' si e' assegnata particolare attenzione alla biocompatibilita’ della sintesi. Il metodo convenzionalmente usato e' quello di far reagire la funzione carbossilica in ambiente alcolico acido [Jansen E.F., Jang R. (1946), J.Am.Chem.Soc. 68, 1475] o in solventi polari aprotici in presenza di agenti eterificanti come gli esteri di vari acidi inorganici (carbonati, silicati, fosfiti) o di acidi organici solfonati (tosilati,metil o etil clorosolfonati), di diazometano [Lucas H.J., Stewart W.T., (1940), J.Am.Soc., 62, 1070], di epossidi [Steiner A.B., McNeely W.H., (1951), Ind.Eng.Chem. 43,2073], utilizzando come catalizzatori resine a scambio ionico di tipo acido, oppure come condensanti ossidi basici o basi organiche azotate. Processo innovativo per le condizioni meno drastiche e' senza dubbio 1'alchilazione dei sali di tetrabutilammonio dei poliuronani in solventi polari aprotici (metilsolfossido, metilformammide) ad opera di agenti alchilanti quali alogenuri alchilici [Domanda di Brevetto Italiano N. PD91A000033J.

Tale sintesi tuttavia non tiene conto delle innumerevoli reazioni collaterali cui ad esempio DMSO ed alogenuri alchilici partecipano e necessita di processi multistadio nel caso di composti aventi funzionalità' ossidriliche presenti su centri chirali.

Un notevole passo avanti si e1 avuto con l'introduzione di metodologie operative che prevedono l'utilizzo di attivatori della funzione carbossilica nei confronti dell'attacco nucleofilo. Queste sintesi utilizzano la formazione di un intermedio, instabile nelle condizioni adottate, proveniente dalla reazione nucleofila dello ione carbossilato con attivatori aventi funzionalità' suscettibili di sostituzione o di addizione.

L'instabilità' di tale intermedio e' legata alla presenza nel mezzo di reazione di specie nucleofile in grado di interagire prontamente con il carbonile attivato dal precedente passaggio. Lo schema generale può' essere cosi' riassunto:

dove X e' un sostituente elettron-attrattore che aumenta la frazione di carica positiva presente sul carbonio carbonilico. In tal senso sono intermedi i cloruri acidi, le anidridi miste e le azidi. L'opportunità' di attivazione e' anche fornita dai cosiddetti "esteri attivati", per i quali interviene un meccanismo di transesterificazione e nel quale il nucleofilo presente e' in grado di formare composti piu' stabili attraverso una sostituzione nucleofila al carbonio insaturo. Tra le sostanze in grado di attivare la funzione carbossilica ricordiamo le carbodiimmidi [Danishevsky I., Siskovich E., (1971) Carbohydr.Res. 16, 199], l'N-idrossisuccinimmide, la piridina, l'imidazolo, l'etossiacetilene, il reagente di Woodward [Woodward R.B., Olofson R.A. (1961), J.Am.Chem.Soc., 83, 1007], alogenuri alifatici, cicloalifatici, aromatici od eterociclici quali cloroacetonitrile e i sali di 2-cloro- N -alchilpiridinio, in cui l'alogeno e' reso mobile dalla presenza di gruppi attivanti. In tutti questi processi di attivazione, condotti prevalentemente in solvente polare aprotico, il numero delle funzioni carbossiliche derivatizzate e' in stretta relazione con il numero degli "esteri attivati" formati, dipendente direttamente dal tipo di attivatore utilizzato. E' necessario perciò' un eccesso di attivatore nel caso di una derivatizzazione totale, o altrimenti un dosaggio accurato per conversioni intermedie. Nel caso dei polisaccaridi, sono noti in letteratura derivati autoreticolati ottenuti a partire da polisaccaridi acidi per attivazione della funzione carbossilica con alogenoderivati dei sali di piridinio [Chemical Abstracts, 121, 182279V (1994)] o con attivatori carbodiimmidici [EP 0341745]; tuttavia la suddetta procedura sintetica presenta alcuni inconvenienti, in quanto prevede l'impiego di solventi organici tossici.

SCOPI DELL'INVENZIONE

Scopo della presente invenzione e' quello di mettere a disposizione un procedimento per la preparazione di polimeri autoreticolati e/o co-reticolati di forma predefinita, detta forma essendo ottenibile direttamente al termine della reazione di reticolazione, senza necessita’ di sottoporre il polimero, una volta reticolato, ad ulteriori reazioni per l'impostazione della forma.

Pure scopo della presente invenzione e' quello di mettere a disposizione un procedimento per la preparazione di polimeri autoreticolati e/o co-reticolati derivatizzati di forma predefinita, detta forma essendo ottenibile direttamente al termine della reazione di reticolazione, senza necessita' di sottoporre il polimero, una volta reticolato, a reazioni di derivatizzazione successive.

Ancora, scopo della presente invenzione e1 quello di mettere a disposizione un procedimento per la preparazione di polimeri autoreticolati e/o co-reticolati di forma predefinita che sia realizzato in mezzo prevalentemente acquoso e/o in mezzo atossico o in mezzo a bassa tossicità .

Pure scopo del presente trovato e' quello di mettere a disposizione un procedimento per la preparazione di polimeri autoreticolati e/o co-reticolati di forma predefinita che comporti una percentuale trascurabile di prodotti indesiderati.

Sempre scopo della presente invenzione e' quello di mettere a disposizione un procedimento per la preparazione di polimeri autoreticolati e/o co-reticolati di forma predefinita con conservazione della chiralita' di eventuali centri chirali presenti.

Ancora, scopo del presente trovato e' quello di mettere a disposizione un procedimento per la preparazione di polimeri autoreticolati e/o co-reticolati di forma predefinita che consenta di realizzare detti polimeri con prestabilite caratteristiche chimico-fisiche, quali ad esempio idrofilia, idrofobia, grado di reticolazione, proprietà' meccaniche, rigonflabilità' nei fluidi, cattura o rilascio di specie chimiche particolari e simili.

Pure scopo del presente trovato e' quello di mettere a disposizione polimeri autoreticolati e/o co-reticolati di forma predefinita ottenibili con il procedimento oggetto della presente invenzione.

DESCRIZIONE DELL'INVENZIONE

Questi ed altri scopi ancora e relativi vantaggi che meglio saranno chiariti dalla descrizione che segue, vengono raggiunti da un procedimento per la preparazione di polimeri autoreticolati e/o co-reticolati di forma predefinita, detto procedimento di preparazione essendo realizzato a partire da almeno un composto polimerico che comprende funzionalità' acide attivabili e funzionalità' nucleofile e che e' allo stato di gel fisico.

In particolare, secondo il presente trovato, detto procedimento di preparazione comprende le seguenti fasi:

- preparazione dello stato di gel fisico di almeno un composto polimerico e formatura di detto gel, con ottenimento di un gel formato,

- attivazione di detto gel formato per mezzo di almeno un opportuno attivatore, con ottenimento di un composto polimerico reticolato o polimero reticolato.

Detto polimero reticolato e', nel caso di un solo composto polimerico impiegato in detto procedimento, un polimero autoreticolato.

In particolare, detto gel formato può essere sottoposto ad equilibrazione nel mezzo di reazione prescelto prima di detta fase di attivazione.

Piu' particolarmente, detta attivazione del sistema equilibrato può essere totale o parziale, a seconda delle condizioni di reazione, con conseguente ottenimento di un polimero totalmente o parzialmente reticolato. Detto procedimento di preparazione consente inoltre di realizzare polimeri reticolati derivatizzati di forma predefinita, mediante opportuna derivatizzazione delle funzionalità' presenti sul composto polimerico eventualmente non coinvolte nella reazione di reticolazione. Ancora, secondo il presente trovato, detto procedimento per la preparazione di polimeri reticolati di forma predefinita, può' essere realizzato a partire da due o piu' composti polimerici diversi tra loro ed allo stato di gel fisico; in questo caso il corrispondente polimero reticolato ottenuto, che e' del tipo "co-reticolato", comprenderà' unita' diverse derivanti dai diversi composti polimerici di partenza.

Anche in questo caso la reazione di attivazione potrà* essere totale o parziale, con ottenimento di un polimero "misto" o polimero co-reticolato totalmente o parzialmente reticolato. Inoltre, sempre secondo il presente trovato, detto polimero "misto", potrà essere opportunamente derivatizzato, analogamente a quanto già' detto sopra.

Secondo il presente trovato, detti polimeri autoreticolati e/o co-reticolati provengono dalla reazione parziale o completa della funzione carbossilica presente sull'unita* ripetitiva del polimero, con gruppi funzionali a carattere nucleofilo presenti sulla stessa catena o su altra catena. In particolare, viene descritto il procedimento per la sintesi di polimeri autoreticolati e/o co-reticolati dell*esopolisaccaride microbico gellano aventi forma predefinita, detto procedimento essendo realizzato a partire da una fase gel del polimero ottenibile per aggiunta di soluti ionici, cosoluti o frazioni di solventi organici.

Il gellano e* una gomma costituita da un polisaccaride microbico esocellulare, prodotto da linee cellulari precedentemente classificate come Auromonas (Pseudomonas) elodea, ma ora identificate come Sphingomonas paucimobilis [Pollok, T. (1993), J.Gen.Microbiol. 139, 1939], ed appartiene ad una famiglia di otto polisaccaridi aventi una struttura strettamente correlata. Nella sua forma nativa il gellano e' costituito da una catena lineare avente la seguente unita' ripetitiva tetrasaccaridica:

nella quale sono presenti sulla prima unita' glucopiranosidica alternativamente o un gruppo O-acetile sul carbonio C6, oppure un gruppo O-L-glicerile sul carbonio C2. Questi sostituenti possono essere allontanati per blanda idrolisi basica, ed il prodotto e' commercialmente venduto con il nome "Gelrite" dalla ditta Kelco Co. (San Diego, California, USA) come sostituto dell'agar nelle colture di microorganismi.

L'utilizzo del gellano per formulazioni terapeutiche ed alimentari e' stato approvato nel 1988 dagli organi sanitari giapponesi e recentemente anche da Food and Drug Administration negli USA.

Le proprietà' gelogeniche del gellano sono profondamente diverse in relazione alla presenza o meno dei sostituenti. La forma nativa, a concentrazione e forza ionica sufficienti, fornisce un gel debole e gommoso, mentre la forma deacilata permette, nelle stesse condizioni, la formazione di un gel duro e fragile, autoclavabile, generalmente resistente alla digestione enzimatica.

I suddetti polimeri autoreticolati e/o co-reticolati (o idrogeli autoreticolati e/o co-reticolati) provengono quindi dalla reazione parziale o completa della funzione carbossilica presente sull'unita' ripetitiva del polisaccaride sotto forma di acido glucuronico, con gruppi funzionali ossidrilici presenti sulle unita' saccaridiche della stessa catena (esterificazione intramolecolare o lattone) o di altra catena (esterificazione intermolecolare o "esteri interni").

Non e' possibile discriminare le quantità' relative di esteri interni e lattoni, se non attraverso una modificazione complessiva in soluzione diluita che coinvolga una frazione bassa dei gruppi carbossilici, in modo da poter apprezzare, mediante la variazione del peso molecolare ed in maniera del tutto approssimativa, il peso delle due reazioni. Infatti, nel caso della lattonizzazione, essendo presente un ciclo intramolecolare, non si ha variazione del peso molecolare del derivato; al contrario, nel caso di formazione degli esteri interni, il peso molecolare del derivato aumenta in progressione aritmetica di ragione pari al peso molecolare della singola catena.

Nel caso del presente procedimento non ha senso la discriminazione in base al peso molecolare, poiché' la sintesi di questi idrogeli comporta, per definizione, il raggiungimento di un peso molecolare considerabile come infinito. Nel caso di reticolazione parziale, le funzioni carbossiliche ed ossidriliche libere possono essere totalmente o parzialmente derivatizzate utilizzando lo stesso procedimento con composti aventi ulteriori funzionalità' con cariche positive o negative. Le cariche presenti sul prodotto finale, possono essere salificate con specie terapeuticamente attive, tollerabili o inattive.

La reazione di sintesi dei polimeri autoreticolati e/o co-reticolati viene efficacemente realizzata attraverso l'impiego di attivatori della funzione carbossilica di natura carbodiimmidica che possono essere scelti sia tra quelli solubili in acqua, che tra quelli solubili in solventi organici o misti.

Il medesimo procedimento può' essere vantaggiosamente applicato anche a miscele binarie di polimeri, in cui uno dei componenti può' ad esempio essere il gellano, presente in varie percentuali, ed il secondo componente può' essere scelto tra: un polisaccaride ionico, come i glicosamminoglicuronoglicani, i poliuronani naturali o sintetici; i vari policarbossilati ottenibili per ossidazione chimica o enzimatica dei polisaccaridi; polimeri ionizzabili come i vari glicosamminoglicani; neutri come il pullulano o lo scleroglucano; un oligo/polipeptide naturale o di sintesi; altro materiale polimerico provvisto di funzionalità' carbossiliche e nucleofile sulla catena o pendenti condensabili con le funzionalità' presenti sull'unita' ripetitiva del gellano.

Tali miscele binarie possono inizialmente assumere lo stato di complessi polielettrolitici o di gel fisici, stante il fatto che la possibilità' di impartire a tali sistemi forma predefinita resta legata alle proprietà' gelogeniche e ordinanti caratteristiche di alcuni polimeri e tipiche del gellano. Anche nel caso di miscele binarie la possibilità' di regolazione della reazione di reticolazione consente di ottenere composti aventi gradi di reticolazione intermedi, in cui le restanti funzionalità' possono essere contemporaneamente derivatizzate in maniera piu' o meno completa con composti appartenenti alle piu' disparate categorie di sostanze biologicamente e farmacologicamente attive, restando disponibile l'opportunità' di salificare i gruppi ionici liberi con controioni aventi o meno attività' biologica o farmacologica intrinseca.

Nel caso di polimeri reticolati nei quali il composto polimerico di partenza e' il gellano, sfruttando le proprietà' gelogeniche del prodotto commerciale "Gelrite", si può' congelare la struttura ordinata di partenza del polisaccaride e contemporaneamente derivatizzare il prodotto insolubile per i fini applicativi richiesti. Alla stessa maniera sono ugualmente utilizzabili nella reazione di reticolazione tutti quei derivati del gellano (esteri semplici o sali) ancora in grado di fornire, con le stesse metodologie, una fase gel da soli oppure in miscela a varie percentuali con il polisaccaride di partenza, mantenendo inalterata la possibilità' di utilizzo di tutte o di parte delle funzionalità' libere inizialmente presenti.

Quanto detto, viene efficacemente traslato ad altri polisaccaridi acidi, purché' essi esibiscano la capacita' di fornire, attraverso metodiche variabili da caso a caso, una fase gel che consenta di impartire forma desiderata ed alla quale sia possibile applicare il procedimento oggetto del presente trovato.

E' il caso, ad esempio, di glicosamminoglicuronoglicani, poliuronani naturali o sintetici, oligo/polipeptidi, polimeri naturali o sintetici che posseggono funzionalità' carbossiliche e nucleofile in catena o pendenti.

Pure oggetto del presente trovato sono le miscele binarie di polimeri le cui funzionalità di catena o pendenti sono in grado di interagire efficacemente a formare una fase gel, al fine di rendere possibile l'applicazione della reazione di reticolazione.

Come già' detto, la possibilità' di associare, dal punto di vista fisico e/o chimico, un ampio spettro di sostanze biologicamente e/o farmacologicamente attive, unita all'opportunità' di modulare le proprietà' chimiche e fisiche sia con una derivatizzazione mirata che con una scelta accurata del polimero da impiegare nel caso di sintesi di reticolati "misti" o co-reticolati, consente la realizzazione di sistemi "intelligenti" in grado di rispondere agli stimoli chimici, biologici e fisici dell'ambiente in cui si trovano.

Come già' detto, il procedimento oggetto del presente trovato e' vantaggiosamente realizzato impiegando polisaccaridi acidi, in particolare gellano.

Particolare attenzione e' rivolta a miscele tra gellano ed altri polisaccaridi o polimeri sintetici, in quanto la presenza in esse di un componente polisaccaridico può impartire alle stesse migliori caratteristiche di biocompatibilita ', anche se il secondo componente e' un polimero sintetico. Gli effetti sinergici ottenibili impiegando macromolecole aventi proprietà' differenziate sono oggetto di attento studio in campo scientifico e tecnico, poiché' la possibilità' di sviluppo di "sistemi intelligenti" in grado di rispondere agli stimoli ambientali in qualità' di sensori e attori secondo meccanismi prefissati, apre settori applicativi di ampio respiro, sia per quanto riguarda le opportunità' fornite dai gel fisici, sia per quanto riguarda la formazione di polimeri autoreticolati di forma predefinita.

La formazione del gel fisico del gellano avviene in due passaggi:

- in soluzione diluita, per aumento della forza ionica o diminuzione della temperatura, due molecole in conformazione di gomitoli statistici sottostanno ad una transizione disordine-ordine, formando una ipotizzata doppia elica in cui le interazioni sono mediate dal catione del sale aggiunto e da molecole del mezzo acquoso [Crescenzi V., Dentini M., Dea I.C. (1987) Carbohydr.Res . 160,283; Dentini M., Coviello T., Burchard W., Crescenzi V. (1988) Macromolecules, 21, 3312];

- aumentando la concentrazione, la forza ionica o alternativamente diminuendo la temperatura, si ottiene l'aggregazione di segmenti di catene in conformazione ordinata a formare "zone di giunzione" rigide, stabilizzate anch'esse da interazioni elettrostatiche mediate dai cationi aggiunti, e connesse tra di loro da porzioni di catene essenzialmente in conformazione disordinata [Grasdalen H., Smidsrod 0. (1987), Carbohydr.Pol., 7, 371]. La stabilita' di questi stati ordinati dipende dalla temperatura, dalla natura dei controioni del gellano e dalla quantità' dei sali aggiunti, come anche dalla concentrazione e dalla densità' di carica del polisaccaride che può' essere variata attraverso la derivatizzazione delle funzioni carbossiliche, fatto che impartisce allo stato gel del gellano uno spettro di modulabilita' delle proprietà chimico-fisiche certamente notevole.

Altre metodiche che consentono la formazione di strutture ordinate sono l'aggiunta al mezzo acquoso di frazioni di non-solventi a bassa costante dielettrica quali gli alcoli, gli eteri, i chetoni, gli esteri, le ammidi, oppure il semplice effetto di aumento della concentrazione del polisaccaride, ottenibile anche mediante cosoluti quali il saccarosio.

La procedura standard di preparazione dei gel e' la seguente:

ad una soluzione acquosa di concentrazione voluta del polimero o di un suo derivato, portata e mantenuta a 90°C fino a completa scomparsa di materiale sospeso, si aggiunge a caldo la quantità' necessaria del soluto ionico, scelto in maniera da fornire al gel finale le caratteristiche di maglia e forza auspicate. La soluzione calda si versa nello stampo adatto per ottenere la forma desiderata e si lascia raffreddare.

La temperatura alla quale avviene la formazione del gel dipende dalla concentrazione del polimero o del suo derivato e dalla quantità' e tipo di sale aggiunto. Una volta formato il gel, lo si estrae dallo stampo e si può' procedere con la reazione di autoreticolazione. Un'altra via per ottenere lo stato gel e' quella di porre la soluzione del polimero o di un suo derivato in tubi da dialisi (Mw tagliato circa = 12.000 Da) e metterli a dializzare in una soluzione di opportuna forza ionica.

Per ottenere stati ordinati del polimero o dei suoi derivati, nel caso ad esempio dei polisaccaridi, si possono aggiungere alle loro soluzioni, a temperatura ambiente, frazioni di non-solventi per le catene polisaccaridiche . L'effetto del non solvente e' quello di favorire sia la transizione conformazionale che l'aggregazione delle catene a formare il gel.

Una volta portata a termine la preparazione del gel, e' possibile effettuare cambi di solvente o equilibrare lo stesso in soluzioni opportune secondo le necessita' del caso.

Lo stato gel del polimero e dei suoi derivati e' il punto di partenza per la sintesi di polimeri autoreticolati secondo la presente invenzione. Una volta formato il gel, sono possibili varie strade:

a) sintesi di polimeri autoreticolati, anche indicati in seguito come PAR, nei quali la reazione di autoreticolazione e' avvenuta in modo completo, in mezzo acquoso mediante impiego di attivatori carbodiimmidici ivi solubili;

b) sintesi di PAR parziali in mezzo acquoso mediante l'utilizzo di attivatori carbodiimmidici ivi solubili con la possibilità1 di salificare i restanti gruppi carbossilici liberi con composti ionici aventi o meno attività' terapeutica propria;

c) sintesi di PAR parziali in mezzo acquoso mediante l'utilizzo di attivatori carbodiimmidici ivi solubili con la contemporanea derivatizzazione di tutte le restanti funzionalità' con composti ivi solubili ed aventi o meno attività' biologica e/o farmacologica intrinseca e con la possibilità' di salificare le cariche presenti con composti ionici aventi o meno attività' terapeutica propria;

d) sintesi di PAR parziali in mezzo acquoso mediante l'utilizzo di attivatori carbodiimmidici ivi solubili con la contemporanea derivatizzazione di parte delle restanti funzionalità' con composti nucleofili ivi solubili, aventi o meno attività biologica e/o farmacologica intrinseca e con la possibilità' di salificare le cariche presenti con composti ionici aventi o meno attività' terapeutica propria;

e) sintesi di PAR totali in mezzo misto mediante l'utilizzo di attivatori carbodiimmidici ivi solubili;

f) sintesi di PAR parziali in mezzo misto mediante l'utilizzo di attivatori carbodiimmidici ivi solubili con la possibilità’ di salificare i restanti gruppi carbossilici liberi con composti ionici aventi o meno attività' terapeutica propria;

g) sintesi di PAR parziali in mezzo misto mediante l'utilizzo di attivatori carbodiimmidici ivi solubili con la contemporanea derivatizzazione di tutte le restanti funzionalità' con composti ivi solubili aventi o meno attività' biologica e/o farmacologica intrinseca e con la possibilità' di salificare le cariche presenti con composti ionici aventi o meno attività' terapeutica propria;

h) sintesi di PAR parziali in mezzo misto mediante l'utilizzo di attivatori cerbodiimmidici ivi solubili con la contemporanea derivatizzazione di parte delle restanti funzionalità' con composti ivi solubili, aventi o meno attività biologica e/o farmacologica intrinseca e con la possibilità' di salificare le cariche presenti con composti ionici aventi o meno attività' terapeutica propria;

i) sintesi di PAR totali in mezzo organico mediante l'utilizzo di attivatori carbodiimmidici ivi solubili; l) sintesi di PAR parziali in mezzo organico mediante l'utilizzo di attivatori carbodiimmidici ivi solubili con la possibilità' di salificare i restanti gruppi carbossilici liberi con composti ionici aventi o meno attività terapeutica propria;

m) sintesi di PAR parziali in mezzo organico mediante l'utilizzo di attivatori carbodiimmidici ivi solubili con la contemporanea derivatizzazione di tutte le restanti funzionalità' con composti ivi solubili aventi o meno attività' biologica e/o farmacologica intrinseca e con la possibilità' di salificare le cariche presenti con composti ionici aventi o meno attività' terapeutica propria;

n) sintesi di PAR parziali in mezzo organico mediante l'utilizzo di attivatori carbodiimmidici ivi solubili con la contemporanea derivatizzazione di parte delle restanti funzionalità' con composti ivi solubili, aventi o meno attività' biologica e/o farmacologica intrinseca e con la possibilità' di salificare le cariche presenti con composti ionici aventi o meno attività' terapeutica propria.

Le problematiche relative alla diffusione dei solventi e dei reattivi all'interno della matrice del gel consigliano il preventivo equilibrio della stessa nelle condizioni operative prescelte, ottenibile mediante processi di scambio per immersione dei gel in soluzioni opportunamente preparate e contenenti tutte le specie chimiche necessarie alla sintesi, tranne che la specie scelta per attivare la reazione di autoreticolazione, da aggiungere una volta avuta la certezza del raggiunto equilibrio.

Nel caso di sintesi di PAR totali e' necessario un eccesso di attivatore, mentre nel caso di sintesi di PAR parziali e' necessario un dosaggio opportuno di attivatore.

Altrettanto opportunamente devono essere scelti i rapporti dei solventi e le quantità' di nucleofili aggiunte nel caso di sintesi di PAR parziali effettuate in solventi misti con contemporanea derivatizzazione di parte o di tutte le restanti funzionalità'. Le condizioni operative di reazione per l'uso di attivatori carbodiimmidici possono essere ricavate da dati di letteratura che forniscono come intervallo ottimale di pH quello compreso tra 4 e 5. Nel caso di sostanze acidolabili si può' tuttavia operare anche a valori di pH prossimi alla neutralità', stante il fatto che in tal modo risultano tempi di reazione maggiori. Sono sconsigliati ambienti alcalini, a meno che non si voglia aumentare la frazione di sottoprodotti provenienti dalla reazione di trasposizione della O-acilisourea ad N-acilurea. La temperatura influisce sui prodotti ottenuti in maniera opportunamente ottimizzabile, essendo essa stessa un parametro di regolazione del grado di autoreticolazione. Aumentandone il valore infatti, si privilegia la reazione di esterificazione interna, in modo da ottenere PAR aventi un maggior grado di reticolazione e/o di contemporanea derivatizzazione. La scelta della temperatura operativa dipende essenzialmente dal mezzo di reazione adottato, in quanto i gel del gellano, ad esempio, sono, come già' detto, stabili in mezzo acquoso per un intervallo sufficientemente ampio della stessa, compreso tra 0 e 120°C. Efficace nella modulazione delle caratteristiche finali del prodotto può' anche essere l'uso di radiazioni luminose, che per scelta opportuna della sorgente e della lunghezza d'onda, soprattutto nell'UV, aumenta la quantità di esteri interni formati.

I sali aggiunti per ottenere il gel fisico di partenza possono influire in maniera sensibile sul decorso della reazione.

In letteratura [UPSTILL C., ATKINS E.D.T., ATTWOOL P.T., (1986), Int.J.Biol.Macromol. 8,275; CHANDRASEKA-RAN R., PUIGJANER L.C., JOYCE K.L., ARNOTT S., (1988) Carbohydr.Res. 181, 23] sono riportati studi di diffrazione di raggi x da fibre stirate del sale potassico o di litio del gellano che hanno evidenziato una differenza nelle interazioni nel passaggio da cationi monovalenti a cationi bivalenti, fenomeno che potrebbe verificarsi anche nello stato gel del polisaccaride. Con i sali dei cationi bivalenti, essendo possibile l'interazione elettrostatica non mediata da molecole di acqua, come avviene per i sali di potassio, con due gruppi carbossilici si può' diminuire il peso della reazione di idrolisi dell'attivatore, fornire una maggiore stabilita' meccanica al polimero allo stato gel formato, variare il coefficiente di diffusione dei soluti a basso peso molecolare introdotti nel mezzo di reazione o fatti assorbire in seguito.

La variazione di volume ipotizzabile e riscontrata durante il procedere della reazione può' essere altresì' resa minima con la preparazione del gel effettuata per addizione di cationi bivalenti: la loro capacita' di interagire elettrostaticamente con due gruppi carbossilici potrebbe creare un intorno favorevole per un decorso della reazione che preveda, successivamente alla formazione dell'intermedio "estere attivato", un peso maggiore della reazione di sintesi dell'anidride, che e' anch'essa un intermedio attivato alla sostituzione nucleofila al carbonile carbossilico.

Un utile parametro che può' dare informazioni circa il decorso della reazione, nonché' circa il grado di reticolazione massimo ipotizzabile, e' fornito dagli equivalenti di acido necessari per mantenere costante il pH del mezzo di reazione: infatti, solo nel caso di sostituzione nucleofila al carbonio carbossilico dell'"estere attivato" o dell'anidride si ha consumo netto di idrogenioni, mentre ciò' non avviene per le reazioni competitive.

La purificazione dei prodotti sintetizzati viene vantaggiosamente effettuata, sempre secondo il trovato, per dialisi degli stessi contro volumi appropriati di soluzioni in cui sono solubili anche i sottoprodotti, per un numero di volte sufficiente ad allontanarli completamente, determinabile con metodi spettrofotometrici. L'aspetto dei prodotti ottenuti varia in relazione al grado di reticolazione raggiunto, e può' variare da quello di una massa gelatinosa frammentata, per i bassi gradi, fino al mantenimento della forma esatta impartita al gel di partenza per gradi piu' elevati. E* ipotizzabile la presenza di un effetto sinergico tra reticolazione chimica e fisica, dovuto al fatto che le catene sono costrette dalla auto-reticolazione a trovarsi in stretta prossimità l'una all'altra e per effetto di ciò' potrebbero non essere necessari gradi di reticolazione spinti per ottenere il mantenimento della forma originaria, in aggiunta all'effetto di setaccio molecolare che la reazione induce per contrazione degli elementi di volume situati sulla superficie del gel.

Il solvente può' essere allontanato per essiccazione a caldo sotto vuoto, oppure, dopo dialisi contro acqua distillata a valori di pH e forza ionica desiderati, per congelamento e successiva liofilizzazione.

Il procedimento oggetto della presente invenzione e' vantaggiosamente applicabile a tutte quelle macromolecole in grado di fornire, in condizioni che possono variare da caso a caso, uno stato gel utilizzabile come punto di partenza per la sintesi di polimeri autoreticolati e/o co-reticolati di forma predefinita, e che sono provviste di funzionalità' opportunamente condensabili mediante l'uso degli attivatori carbodiimmidici. Sempre secondo il presente trovato, il procedimento viene anche vantaggiosamente realizzato a partire dallo stato gel di due o più composti polimerici diversi.

In questo caso il procedimento consiste nel portare una soluzione dei due polimeri, a concentrazioni e rapporti prescelti ed opportuni, a 90°C sotto agitazione e mantenerla a tale temperatura per il tempo necessario alla completa scomparsa di particelle sospese. A questa soluzione si aggiunge una quantità di soluto ionico efficace ad ottenere il gel, si attende l’omogeneizzazione della stessa e quindi si travasa nello stampo desiderato, che può essere lasciato a temperatura ambiente o inferiore a seconda dei casi. Anche in questa procedura è possibile effettuare scambi di solvente o portare i gel all'equilibrio in soluzioni a valori prescelti di pH e/o forza ionica.

Sono stati ottenuti gel fisici utilizzando diversi polimeri, naturali e sintetici, quali ad esempio l'acido alginico, l'acido ialuronico, l'acido poligalatturonico, lo scleroglucano ossidato, l'acido poliacrilico, lo scleroglucano, il pullulano, il polivinilalcol. Menzione a parte merita il caso del chitosano, un glicosamminoglicano proveniente dalla parziale deacetilazione della chitina, con il quale è possibile ottenere, per effetto dell'interazione elettrostatica tra i suoi gruppi amminici protonabili ed il gruppo carbossilico del gellano, dei complessi polielettrolitici stabili in assenza di sali aggiunti. Queste interazioni di carica permettono la formazione di perle, aventi una pellicola esterna costituita dal complesso stesso ed inglobanti una soluzione di polisaccaride utilizzabile per l'immobilizzazione fisica o covalente di molecole, o la formazione di film idrofili per l'assorbimento di fluidi, biologici e non, e/o il contemporaneo rilascio di specie biologicamente e/o farmacologicamente attive.

Una volta ottenuto il gel fisico misto, questo può essere sottoposto a procedure di reazione assolutamene simili a quelle precedentemente esposte per la sintesi dei PAR, con ottenimento dei polimeri autoreticolati "misti" di forma predefinita, in seguito indicati come CRP, con l'unico accorgimento da adottare, in questo caso, di non interferire con la stabilità dei gel fisici misti preparati.

Si possono così sintetizzare CRP totali o parziali, con contemporanea derivatizzazione totale o parziale della residue funzionalità libere ed in cui i gruppi carbossilici non coinvolti nella reticolazione e non esterificati possono essere salificati con composti aventi o meno attività biologica o farmacologica intrinseca. E' inoltre possibile derivatizzare le funzioni nucleofile libere con agenti acilanti o alchilanti passibili essi stessi di attivazione ad opera degli attivatori utilizzati.

Vi sono numerose opportunità di scelta in merito al tipo di solvente utilizzabile ed al tipo di composto adatto per la voluta derivatizzazione totale o parziale delle funzionalità non coinvolte nella sintesi dei PAR e dei CRP.

Ad esempio, alcoli della serie alifatica utili come solventi o per esterificare i gruppi carbossilici dei PAR e dei CRP secondo la presente invenzione sono, per esempio, quelli con un massimo di 34 atomi di carbonio, che possono essere saturi o insaturi e che possono essere anche sostituiti da altri gruppi liberi o gruppi modificati funzionalmente, come l'ammino, l'ossidrile, l'aldeide, chetone, mercapto, gruppi carbossilici o da gruppi derivanti dagli stessi, come idrossicarbil, o diidrocarbilammino (in seguito il termine "idrocarbil" dovrà essere preso per indicare non solo porzioni idrocarburiche monovalenti come -cnH2n+1, ma anche divalenti o trivalenti come gli "alchileni" -CnH2n- o "alchilideni" =CnH2n), eteri o gruppi esterei, acetali o gruppi chetalici, tioeteri o gruppi tioesterei o gruppi carbossilici esterificati o gruppi carbammidici o gruppi carbammidici sostituiti da uno o da due gruppi ossidrili, da gruppi nitrile o da alogeni.

Nel suesposto gruppo contenente sostituenti idrocarburici sono preferibili quelli con catene alifatiche più corte, come gli alchili con un massimo di 6 atomi di carbonio. Questi alcoli possono essere interrotti nella catena di atomi di carbonio da eteroatomi, come l'ossigeno, l'azoto o lo zolfo. Preferenza è data agli alcoli sostituiti con uno o due dei già citati gruppi funzionali.

Alcoli del suddetto gruppo da usarsi preferenzialmente nell'ambito della presente invenzione sono quelli con un massimo di 12 e specialmente con un massimo di 6 atomi di carbonio e in cui i sostituenti nei citati gruppi ammino, etere, estere, tioetere, tioestere, acetale, chetale, rappresentano gruppi alchilici con un massimo di 4 atomi di carbonio, e anche nei gruppi carbossilici esterificati o nei gruppi carbammidici sostituiti i gruppi sostituenti sono alchili con lo stesso numero di atomi di carbonio, e in cui i gruppi ammino o carbammidico possono essere gruppo alchileneammino o gruppo alchilencarbammidico con un massimo di 8 atomi di carbonio. Di questi alcoli quelli citati innanzitutto sono quelli saturi e non sostituiti come gli alcoli metilico, etilico, propilico, isopropilico, alcoli n-butilico, isobutilico, terbutilico, amilico, pentilico, esilico, ottilico, nonilico e alcol dodecilico e inoltre tutti quelli con una catena lineare come gli alcoli n-ottilico o n-dodecilico. Tra gli alcoli sostituiti di questo gruppo, possono essere utilizzati gli alcoli bivalenti, come l'etilenglicole, propileneglicole, o butilenglicole, gli alcoli trivalenti come la glicerina, gli alcoli aldeidici come l'alcol tartronico, alcoli carbossilici come gli acidi lattici, per esempio l'acido α-ossipropionico, l'acido glicolico, l'acido malico, gli acidi tartarici, l'acido citrico, gli amminoalcoli, come l'amminoetanolo, l'amminopropanolo, l'n-amminobutanolo e i loro dimetil e dietil derivati nella funzione amminica, colina, pirrolidiniletanolo, piperidiniletanolo, piperaziniletanolo e i corrispondenti derivati degli alcoli n-propilici o nbutilici, monotioetilenglicoli o i suoi derivati alchilici, per esempio il derivato etilico nella funzione mercaptanica.

Per quanto riguarda gli alcoli saturi superiori, quelli degni di particolare menzione sono, per esempio, l'alcol cetilico, ma altrettanto importanti sono gli alcoli superiori insaturi aventi uno o due doppi legami, e segnatamente quelli contenuti in molti olii essenziali ed aventi affinità con terpeni come geranioio, farnesolo, fitolo, senza dimenticare, tra gli omologhi inferiori, l'alcol propargilico.

Tra gli alcoli arilalchilici sono utilizzabili quelli contenenti un solo anello benzenico, nei quali la catena alifatica ha un massimo di 4 atomi di carbonio, l'anello può essere sostituito con gruppi metilici variabili da 1 a 3, con gruppi ossidrilici o alogeni, specialmente cloro, bromo o iodio e nei quali la catena alifatica può essere sostituita con uno o più gruppi amminici mono o di-sostituiti, o da gruppi pirrolidino o piperidino. Restano preferiti, nell'ambito di detta categoria, l'alcol benzilico e il feniletilico.

Gli alcoli della serie cicloalifatica e alchilcicloalifatica possono derivare da idrocarburi mono o policiclici fino ad un massimo di 34 atomi di carbonio. Tra gli aventi un solo anello, preferibilmente tra i 5 e i 7 atomi di carbonio, sono da considerare particolarmente quelli recanti fino a tre sostituenti alchilici, per un massimo complessivo di 12 atomi di carbonio. A questa categoria appartengono il cicloesanolo, cicloesandiolo, 1,2,3-cicloesantriolo, 1,3,5-cicloesantriolo (floroglucitolo) , inositolo, carvomentolo, mentolo e i terpineoli .

Alcoli contenenti anelli condensati sono, ad esempio, il D ed L-borneolo, il D ed L-isoborneolo.

Particolare menzione tra gli alcoli aventi anelli policiclici condensati meritano gli steroli, gli acidi colici e gli steroidi.

Altrettanto utilizzabili sono poi i composti appartenenti alla categoria delle genine (agliconi) dei glicosidi cardioattivi, le vitamine e tutti quei composti eterociclici terapeuticamente tollerabili o attivi o inattivi che contengono almeno una funzione ossidrilica.

Per quanto concerne una derivatizzazione delle funzionalità carbossiliche diversa da quella esterea sono utilizzabili tutti i gruppi nucleofili, diversi da quello ossidrilico, utilizzati nella sintesi organica e che non interferiscano con la stabilità della matrice gel di partenza. Essi possono appartenere a composti mono o polifunzionali come nel caso degli alcoli, a categorie terapeuticamente inattive, attive o tollerabili ed in più possono portare gruppi carichi positivi o negativi la cui salificazione può essere effettuata similmente a quella dei gruppi carbossilici non derivatizzati con composti ionici dotati o meno di attività terapeutica o biologica intrinseca. Ulteriore opportunità di derivatizzazione delle funzionalità delle catene è quella di utilizzare i gruppi nucleofili (ossidrilici e/o amminici) presenti su esse in un mezzo di reazione in cui siano presenti anche dei composti elettrofili attivabili mediante lo stesso attivatore. Ad esempio sono utilizzabili i composti contenenti gruppi carbossilici, solfonici, solfinici, fosforici, fosfonici e fenolici, nonché comuni agenti eterificanti quali gli alogenuri organici, il diazometano, gli epossidi, o acilanti come le anidridi, gli acilimidazoli, il complesso piridina-S03.

Per quanto concerne la sintesi dei PAR e dei CRP parziali, gruppi carichi presenti alla fine del processo possono essere salificati con composti scelti in funzione dell'utilizzo ultimo del prodotto. Sali inorganici possono essere formati con metalli alcalini, come il potassio e in particolare il sodio e l'ammonio, o con metalli alcalini terrosi come i sali di calcio, di magnesio o con alluminio. Di particolare interesse sono i sali con le basi organiche, specialmente le basi azotate e, quindi, alifatiche, arilalifatiche, cicloalifatiche e ammine eterocicliche. Questi sali di ammonio possono derivare da ammine accettabili terapeuticamente o da ammine non tossiche ma inattive dal punto di vista terapeutico, o da ammine con un'azione terapeutica. Per il primo tipo sono preferite le ammine alifatiche, per esempio mono-, di- e tri-alchilammine con gruppi alchilici con un massimo di 8 atomi di carbonio o arilalchilammine con lo stesso numero di atomi di carbonio nella parte alifatica e dove per arii s'intende un gruppo benzene possibilmente sostituito con un numero di gruppi metilici variabili da 1 a 3 o da atomi di alogeno o da gruppi idrossilici. Le basi inattive biologicamente per la formazione dei sali possono essere anche cicliche, come le alchilenammine monocicliche, con cicli costituiti da atomi di carbonio compresi tra 4 e 6, possibilmente interrotte nel loro ciclo da eteroatomi scelti dal gruppo formato da azoto, ossigeno e zolfo, come la piperazina o la morfolina, o possono essere sostituiti, per esempio, da funzioni amminiche o ossidriliche come l 'amminoetanolo, etilendiamolo, l'etilendiammina, l'efedrina o la colina.

E' anche possibile formare sali ammonici quaternari o esteri parziali, per esempio i sali di tetraalchilamraonio con i predetti atomi di carbonio e preferibilmente sali di questo tipo in cui il quarto gruppo alchilico ha un numero di atomi di carbonio compreso tra 1 e 4, per esempio il gruppo metile.

Le animine attive biologicamente da usarsi per la salificazione e la cui azione terapeutica può essere utilizzata sono tutti i farmaci conosciuti azotati e basici, come quelli dei seguenti gruppi:

alcalodi, peptidi, fenotiazine, benzodiazepine, tioxanteni, ormoni, vitamine, anticonvulsanti, antipsicotici, antiemetici, anestetici, ipnotici, anoressizzanti, tranquillanti, rilassanti muscolari, vasodilatatori coronarici, antineoplastici, antibiotici, antibatterici, antivirali, antimalarici, inibitori dell'anidrasi carbonica, antiinfiammatori non steroidei, vasocostrittori, agonisti colinergici, antagonisti colinergici, agonisti adrenergici, antagonisti adrenergici, antagonisti narcotici.

Nel caso poi di derivatizzazione con composti che dopo aver reagito mantengono una carica positiva, quest'ultima può essere salificata altrettanto efficacemente ed utilmente con specie anioniche opportune appartenenti alla categoria dei composti inorganici o organici attivi o meno terapeuticamente.

I gruppi farmacologici di appartenenza sono quelli precedentemente esposti, per i quali è così possibile trovare la giusta coppia ionica in grado di salificare sia le funzionalità cariche positivamente che quelle cariche negativamente. A titolo di solo esempio riportiamo il caso del salicilato di colina, utilizzato come analgesico ed antipiretico, oppure quello del teofillinato di colina, efficace nella terapia delle vie respiratorie come broncodilatatore.

II procedimento di sintesi dei PAR e dei CRP oggetto del presente trovato consente la preparazione di una vasta gamma di articoli e prodotti ingegnerizzabili per i più disparati utilizzi.

La base polisaccaridica dei prodotti sintetizzabili è un sicuro lasciapassare per preparazioni e formulazioni in cui il principale requisito sia la biocompatibilità e la tollerabilità da parte dell'organismo umano o animale.

Le ulteriori possibilità di funzionalizzazione fornite dal processo consentono di coniugare l'accettabilità di tali matrici con gli effetti terapeutici legati in larga misura al principio attivo introdotto con la derivatizzazione .

La rara opportunità di impartire al prodotto una forma voluta fin dai primi passaggi del processo è poi un elemento fondamentale nel progettare e nel realizzare quelli che vengono definiti "sistemi intelligenti", ovvero in grado di interagire con l'ambiente in cui si trovano, rilevando variazioni delle variabili presenti ed agendo in funzione di tali variazioni secondo schemi prefissati. Esistono varie possibilità quali ad esempio: a) il PAR o il CRP viene a costituire un veicolo per specie attive, legate covalentemente o intrappolate fisicamente, la cui azione avviene in ambito biologico e/o farmacologico;

b) il PAR o il CRP stesso è la specie attiva in quanto opera biologicamente e/o farmacologicamente attraverso la sua natura chimica intrinseca o attraverso le proprietà chimico-fisiche ottenute nella sintesi.

Un esempio appartenente alla prima categoria è quello dei sistemi di rilascio controllato dei farmaci; in questo caso la specie attiva viene rilasciata per diffusione o per idrolisi e successiva diffusione secondo farmacocinetiche che consentono una somministrazione ridotta nei dosaggi e nelle frequenze, con evidente risparmio economico e salutare riduzione dell'incidenza di effetti collaterali.

Un esempio appartenente alla seconda categoria è fornito dalla possibilità di ottenere, utilizzando come stampo per la formazione del gel fisico una capsula di Petri, dischi di altezza e diametro variabile che, una volta reticolati e privi del solvente, mantengono inalterate le capacità proprie dei composti polisaccaridici di assorbire notevoli quantità di fluidi acquosi. Attraverso una opportuna derivatizzazione è possibile esaltare le interazioni di natura idrofobica, in modo da favorire l'assorbimento di fluidi organici. Un terzo esempio può gettare luce sulla possibilità di progettare dei sistemi che operino come sensori ed attori in relazione ad uno stimolo esterno: la natura polielettrolitica di molti dei composti polisaccaridici può essere sfruttata per il superamento del tratto gastrico e per un successivo rilascio nel tratto intestinale.

In questa maniera può essere ridimensionato l'uso di macromolecole sintetiche per il rivestimento di principi attivi acidolabili.

A titolo indicativo, sono identificabili i settori applicativi seguenti:

1) Settore biomedico: rilascio controllato di principi attivi (possono essere gli stessi polimeri utilizzati nei gel fisici misti e nei co-reticolati come ad esempio lo Scleroglucano, l'Acido Ialuronico, il Chitosano); assorbimento di fluidi biologici (riduzione degli effetti infiammatori legati alla degradazione della membrana cellulare grazie all'allontanamento dei prodotti di degradazione); matrice tridimensionale per la crescita dei condrociti nella terapia di recupero di lesioni epiteliali non altrimenti rimarginabili (soprattutto per il gel fisico misto Gellano-Acido Ialuronico) ; aumento della biocompatibilità di materiali sintetici utilizzati per impianti fissi; materiali monouso; materiali per impianti sottocutanei.

2) Settore analitico: sintesi di fasi stazionarie per colonne cromatografiche (la derivatizzazione consente non solo esclusione per effetto setaccio ma anche adsorbimento selettivo).

3) Settore agro-alimentare: prodotti edibili a differente tessitura con eventuali fragranze legate chimicamente o fisicamente; rilascio di fitofarmaci e/o pesticidi.

4) Settore cosmetico: creme solari con filtri per lunga protezione; creme antirughe con collagene immobilizzato; rilascio di essenze profumate.

5) Settore industriale: immobilizzazione di enzimi o linee cellulari; disidratazione di solventi; concentrazione di soluzioni.

In generale, secondo il presente trovato, gli idrogeli autoreticolati e/o co-reticolati del polisaccaride microbico Gellano sono preparati da una fase gel ottenuta a partire da soluzioni a diversa concentrazione di polimero per effetto della stessa o per aggiunta di sali o di frazioni di solvente organico o di cosoluti. Tali idrogeli si ottengono per esterificazione dei gruppi carbossilici presenti nelle catene del polisaccaride utilizzato, da parte ad esempio di un gruppo ossidrilico appartenente alla stessa o ad un'altra catena polimerica.

La reazione di esterificazione viene facilitata attraverso l'utilizzo di attivatori della funzione carbossilica, di natura carbodiimmidica, consentendo un efficace controllo del grado di reticolazione al fine di ottenere una sostanziale modulabilità sia nella forma che nelle proprietà chimico-fisiche di questi derivati insolubili.

La versatilità del processo consente di partire anche da catene polisaccaridiche precedentemente funzionalizzate in soluzione diluita (esteri semplici di alcoli monofunzionali o polifunzionali, ammidi semplici di ammine monofunzionali o polifunzionali, acilazione o solfonazione degli ossidrili), o di funzionalizzarle contemporaneamente, al fine di ottenere prodotti rispondenti a predeterminate caratteristiche di reattività, chimico-fisiche, biochimiche, ingegneristiche. I rimanenti gruppi carbossilici non coinvolti in esteri interni od esterni possono essere liberi o salificati con un ampio spettro di controioni (cationi dei metalli alcalini, alcalino-terrosi, alluminio, ferro o ioni ammonio variamente sostituiti), aventi o meno attività farmacologica .

Non ultima, la possibilità di ottenere una gelazione guidata da parte del gellano di macromolecole, in grado e non di fornire, da sole, fasi ordinate in condizioni fisiologiche, rende questo processo applicabile per la sintesi di co-reticoli polimerici di sicuro impatto positivo nella progettazione e nello sviluppo di sistemi "intelligenti" in grado di agire e reagire sugli/agli stimoli ambientali secondo uno schema prefissato.

Questi idrogeli reticolati, grazie alla loro sicura biocompatibilità, riservano promettenti applicazioni quali: matrici per il rilascio controllato di farmaci nel settore biomedico; matrici per l'immobilizzazione fisica e/o chimica di sistemi enzimatici e/o ormonali; fasi fisse per colonne cromatografiche; settori dove si richiedono particolari proprietà chimico-fisiche (in dipendenza del pH, forza ionica e/o temperatura) e/o meccaniche; cosmetica; articoli sanitari e chirurgici; settore agroalimentare.

A solo titolo indicativo e non limitativo del presente trovato, vengono qui di seguito riportati alcuni esempi di pratica realizzazione.

Esempio 1

Gel fisico del gellano con sale di sodio.

Si solubilizzano 1.5 g di Gelrite in 150 mi di acqua distillata (Cp= 1% g/100 ml) sotto agitazione in una bottiglia di vetro con tappo ermetico, mantenendo la soluzione a 90° C per il tempo necessario alla completa scomparsa di materiale sospeso. A questa soluzione si aggiungono a caldo 150 mg di NaCl (Cs= 0.1% p/p), si omogeneizza il tutto per circa un minuto sotto agitazione vigorosa, quindi si versa nello stampo e si lascia raffreddare a temperatura ambiente per la formazione del gel.

Esempio 2

Par del Gellano.

Si estrae il gel fisico precedentemente descritto dallo stampo e lo si pone ad equilibrare in 250 mi di una soluzione di NaCl 0.1% (p/p) portata a pH=4.

Dopo aver cambiato due volte la soluzione nella prima ora, si porta a 30° C sotto blanda agitazione e si aggiungono 0.9 g di EDC pari ad un rapporto R (eq. attivatore/eq. gellano) =2. Il mezzo viene portato a pH = 4.7 e tale valore mantenuto costante per aggiunta di HCl 0.01 N. Dopo circa 10 ore (VHC1 aggiunto = 35 mi) si toglie il gel dal mezzo e lo si mette a dializzare contro acqua distillata a pH = 7, fino alla scomparsa del segnale UV relativo all'assorbimento dell'urea disostituita. Si congela e si liofilizza. Sono stati recuperati 0,95 g di prodotto avente GA (grado di autoreticolazione) = 0.15, determinato per idrolisi basica e retrotitolazione della base in eccesso.

Esempio 3

Par del Gellano funzionalizzato con alcol benzilico. Si estrae il gel fisico precedentemente descritto dallo stampo, lo si pone in una sospensione di acqua+CaCl2 2% (p/p)/alcol benzilico 50:50 portata a pH=4 sotto agitazione e si aggiungono 0.5 g di DCC pari ad un rapporto R (eq. attivatore/eq. gellano) di circa 1.1. Il mezzo viene portato a pH=4.7 e tale valore mantenuto costante per aggiunta di HC1 0.01 N. Dopo circa 10 ore (VHC1 aggiunto=40 ml) si toglie il gel dal mezzo e lo si mette a dializzare contro acqua distillata a pH=7, fino alla scomparsa dei segnali UV relativi all'assorbimento dell'urea disostituita e dell'alcol. Si congela e si liofilizza.

Sono stati recuperati 1.3 g di prodotto avente GE (grado di esterificazione totale)=0.22, determinato per idrolisi basica e retrotitolazione della base in eccesso, e GA (grado di auto-reticolazione)=0.12, ricavato per differenza tra il GE ed il grado di funzionalizzazione calcolato dall'assorbimento UV dell'alcol mediante retta di taratura.

Esempio 4

Gel fisico del Gellano con sale di calcio e procaina. Si solubilizzano 1.5 g di Gelrite in 150 mi di acqua distillata (Cp=l% g/100 mi) sotto agitazione in una bottiglia di vetro con tappo ermetico, mantenendo la soluzione a 90°C per il tempo necessario alla completa scomparsa di materiale sospeso. A questa soluzione si aggiungono a caldo 1.5 g di CaCl2 (Cs=l% p/p) ed 1.5 g di procaina cloridrato (Cf=l% p/p) si omogeneizza il tutto per circa un minuto sotto agitazione vigorosa, quindi si versa nello stampo e si lascia raffreddare a temperatura ambiente per la formazione del gel.

Esempio 5

Par del Gellano funzionalizzato con procaina.

Si estrae il gel fisico precedentemente descritto dallo stampo e lo si pone ad equilibrare in 250 mi di una soluzione di CaCl2 1% (p/p) portata a pH=4.

Dopo aver cambiato due volte la soluzione nella prima ora, sotto blanda agitazione si aggiungono 0.5g di EDC pari ad un rapporto R (eq. attivatore/eq. gellano) di circa 1.1. Il mezzo viene portato a pH=4.7 e tale valore mantenuto costante per aggiunta di HCl 0.01 N. Dopo circa 10 ore (VHCl aggiunto=42 ml)* si toglie il gel dal mezzo e lo si mette a dializzare contro acqua distillata a pH=7, fino alla scomparsa dei segnali UV relativi all’assorbimento dell'urea disostituita e del farmaco. Si congela e si liofilizza.

Sono stati recuperati 1,2 g di prodotto avente GE (grado di esterificazione totale)=0.2, determinato per idrolisi basica e retrotitolazione della base in eccesso, e GA (grado di auto-reticolazione)=0.11, ricavato per differenza tra il GE ed il grado di funzionalizzazione calcolato dall'assorbimento UV del farmaco mediante retta di taratura.

Esempio 6

Gel fisico colorato del Gellano con sale di calcio.

Si solubilizzano 1.5 g. di Gelrite in 150 mi di acqua distillata (Cp=l% g/100 mi) sotto agitazione in una bottiglia di vetro con tappo ermetico, mantenendo la soluzione a 90° per il tempo necessario alla completa scomparsa di materiale sospeso. A questa soluzione si aggiungono a caldo 1.5 g di CaCl2 (Cs=l% p/p) e 15 mg di "Coomassie Brillant Blue R-250 (Ccol= 1x10<-2% >p/p), si omogeneizza il tutto per circa un minuto sotto agitazione vigorosa, quindi si versa nello stampo e si lascia raffreddare a temperatura ambiente per la formazione del gel.

Esempio 7

Par colorato del Gellano.

Dopo aver cambiato due volte la soluzione nella prima ora, sotto blanda agitazione si aggiungono 0.5 g di EDC pari ad un rapporto R (eq. attivatore/eq. gellano) di circa 1.1. Il mezzo viene portato a pH=4.7 e tale valore mantenuto costante per aggiunta di HCl 0.01 N. Dopo circa 10 ore (VHCl aggiunto=31 ml) si toglie il gel dal mezzo e lo si mette a dializzare contro acqua distillata a pH=7, fino alla scomparsa dei segnali UV relativi all'assorbimento dell'urea disostituita e del colorante. Si congela e si liofilizza.

Sono stati recuperati 0.9 g di prodotto avente GE (grado di esterificazione totale)=0.22, determinato per idrolisi basica e retrotitolazione della base in eccesso.

Esempio S

Gel fisico dell'acido poligalatturonico con sale di calcio.

Si solubilizzano 500 mg di acido poligalatturonico-sale sodico in 100 mi di acqua distillata (C =0.5% g/100 mi) sotto agitazione fino alla completa scomparsa di materiale sospeso. A questa soluzione si aggiungono 500 mg di complesso Ca-EDTA (Cs=0.5% p/p) e 600 mg di D(+)-δgluconolattone (C=0.6% p/p), si omogeneizza il tutto per circa un minuto sotto agitazione vigorosa, quindi si versa nello stampo e si lascia raffreddare a temperatura ambiente per la formazione del gel. L'idrolisi acida del gluconolattone diminuisce il valore della costante di complessazione del complesso Ca-EDTA, favorendo il rilascio del calcio. Con l'utilizzo di questa procedura si ottiene una gelazione omogenea in tutta la massa del gel.

Esempio 9

Par dell'acido poligalatturonico.

Dopo aver cambiato quattro volte la soluzione ad intervalli di 30 minuti, si porta a 50°C sotto blanda agitazione e si aggiungono 0.5 g di EDC pari ad un rapporto R (eq. attivatore/eq. carbossilici)=4. Il mezzo viene portato a pH=4.7 e tale valore mantenuto costante per aggiunta di HC10.01 N. Dopo circa 10 ore (VHC aggiunto=75 mi) si toglie il gel dal mezzo e lo si mette a dializzare inizialmente contro una soluzione acquosa di Na3EDTA 2% (p/p) per allontanare gli ioni calcio presenti rimpiazzandoli con ioni sodio, quindi contro acqua distillata a pH=7, fino alla scomparsa del segnale UV relativo all'assorbimento dell'urea disostituita. Si congela e si liofilizza. Sono stati recuperati 0,45 g di prodotto avente GA (grado di autoreticolazione)=0 .2, determinato per idrolisi basica e retrotitolazione della base in eccesso.

Esempio 10

Gel fisico dell'acido alginico con sale di calcio.

Si solubilizzano 250 mg di acido alginico-sale sodico in 100 mi di acqua distillata (Cp=0.25% g/100 mi) sotto agitazione fino alla completa scomparsa di materiale sospeso. A questa soluzione si aggiungono 300 mg di complesso Ca-EDTA (Cs=0.3% p/p) e 400 mg di D(+)-δgluconolattone (C=0.4% p/p), si omogeneizza il tutto per circa un minuto sotto agitazione vigorosa, quindi si versa nello stampo e si lascia a a temperatura ambiente per la formazione del gel. L'idrolisi acida del gluconolattone diminuisce il valore della costante di complessazione del complesso Ca-EDTA, favorendo il rilascio del calcio. Con l'utilizzo di questa procedura si ottiene una gelazione omogenea in tutta la massa del gel.

Esempio il

Par dell'acido alginico.

Si estrae il gel fisico precedentemente descritto dallo stampo e lo si pone ad equilibrare in 250 mi di una soluzione di CaCl21% (p/p) portata a pH=4.

Dopo aver cambiato quattro volte la soluzione ad intervalli di 30 minuti, si porta a 50°C sotto blanda agitazione e si aggiungono 0.5 g di EDC pari ad un rapporto R (eq. attivatore/eq. carbossilici totali)=2. Il mezzo viene portato a pH=4.7 e tale valore mantenuto costante per aggiunta di HC1 0.01 N. Dopo circa 10 ore (VHCl aggiunto=35 ml) sì toglie il gel dal mezzo e lo si mette a dializzare inizialmente contro una soluzione acquosa di Na3EDTA 2% (p/p) per allontanare gli ioni calcio presenti rimpiazzandoli con ioni sodio, quindi contro acqua distillata a pH=7, fino alla scomparsa del segnale UV relativo all'assorbimento dell'urea disostituita. Si congela e si liofilizza. Sono stati recuperati 0,2 g di prodotto avente GA (grado di autoreticolazione)=0 .3, determinato per idrolisi basica e retrotitolazione della base in eccesso.

Esempio 12

Gel fisico misto del gellano con acido poligalatturonico.

Si solubilizzano 3 g di Gelrite (Cpl =2% g/100 mi) e 1.5 g di acido poligalatturonico-sale sodico (Cp2= 1% g/100 mi) in 150 mi di acqua distillata sotto agitazione in una bottiglia di vetro con tappo ermetico, mantenendo la soluzione a 90°C per il tempo necessario alla completa scomparsa di materiale sospeso. A questa soluzione si aggiungono a caldo 1.5 g di NaCl (Cg= 1% p/p) , si omogeneizza il tutto per circa un minuto sotto vigorosa agitazione, quindi si versa nello stampo e si lascia raffreddare a temperatura ambiente per la formazine del gel.

Esempio 13

Gel fisico misto del gellano con acido alginico

Si solubilizzano 3.0 g di Gelrite (Cp1= 1.5% g/100 mi)e 1.5 g di acido alginico-sale sodico (Cp2= 1% g/100 mi di acqua distillata sotto agitazione in una bottiglia di vetro con tappo ermetico, mantenendo la soluzione a 90°C per il tempo necessario alla completa scomparsa di materiale sospeso. A questa soluzione si aggiungono a caldo 1.5 g di NaCl (Cs= 1% p/p), si omogeneizza il tutto per circa un minuto sotto vigorosa agitazione, quindi si versa nello stampo e si lascia raffreddare a temperatura ambiente per la formazione del gel.

Esempio 14

Gel fisico misto del gellano con acido ialuronico

Si solubilizzano 0.5 g di Gelrite (Cpl= 1% g/100 mi) e 0,5 g di acido ialuronico-sale sodico (Cp2= 1% g/100 mi) in 50 ml di acqua distillata sotto agitazione in una bottiglia di vetro con tappo ermetico, mantenendo la soluzione a 90°C per il tempo necessario alla completa scomparsa di materiale sospeso. A questa soluzione si aggiungono a caldo 50 mg di NaCl (Cg= 0.1% g/100 mi), si omogeneizza il tutto per circa un minuto sotto vigorosa agitazione, quindi si versa nello stampo e si lascia raffreddare a temperatura ambiente per la formazione del gel.

Esempio 15

Gel fisico misto del gellano con xanthano

Si sciolgono 1.5 g di Gelrite (Cp1= 1% g/100 mi) e 1.5 g di xanthano (Cp2= 1% g/100 mi) in 150 mi di acqua distillata sotto agitazione in una bottiglia di vetro con tappo ermetico, mantenendo la soluzione a 90°C per il tempo necessario alla completa scomparsa di materiale sospeso. A questa soluzione si aggiungono a caldo 1.5 g di CaCl2 (Cs= 1% p/p), si omogeneizza il tutto per circa un minuto sotto vigorosa agitazione, quindi si versa nello stampo e si lascia raffreddare a temperatura ambiente per la formazione del gel.

Esempio 16

CRP gellano-xanthano

Si estrae il gel fisico misto precedentemente descritto dallo stampo e lo si pone ad equilibrare in 250 mi di una soluzione di CaCl2 1% (p/p) portata a pH=4. Dopo aver cambiato due volte la soluzione nella prima ora, sotto blanda agitazione si aggiunge 1 g. di EDC pari ad un rapporto R (eq. attivatore/eq.carbossilici totali) di circa 1. Il mezzo viene portato a pH=4.7 e tale valore mantenuto costante per aggiunta di HC1 0.01 N. Dopo circa 20 ore il pH cessa di salire (VHC1 aggiunto=40 ml ' si toglie il gel dal mezzo e lo si mette a dializzare contro acqua distillata a pH=7, fino alla scomparsa del segnale UV relativo all’assorbimento dell'urea disostituita. Si congela e si liofilizza. Sono stati recuperati 2.4 g di prodotto avente GC (grado di co-reticolazione)=0.1, determinato per idrolisi basica e retrotitolazione della base in eccesso. Esempio 17

Gel fisico misto del gellano con pullulano.

Si solubilizzano 1.5 g di Gelrite (Cp1= 1% g/100 mi) ed 1.5 g di pullulano (Cp2= 1% g/100 mi) in 150 mi di acqua distillata sotto agitazione in una bottiglia di vetro con tappo ermetico, mantenendo la soluzione a 90°C per il tempo necessario alla completa scomparsa di materiale sospeso. A questa soluzione si aggiungono a caldo 150 mg di NaCl (Cg= 0.1% p/p), si omogeneizza il tutto per circa un minuto sotto agitazione vigorosa, quindi si versa nello stampo e si lascia raffreddare a temperatura ambiente per la formazione del gel.

Esempio 18

CRP gellano-pullulano

Si estrae il gel fisico misto precedentemente descritto dallo stampo e lo si pone ad equilibrare in 150 mi di una soluzione di CaCl2 1% (p/p) portata a pH=4.

Dopo aver cambiato due volte la soluzione nella prima ora, si porta a 50°C sotto blanda agitazione e si aggiungono 0,9 g di EDC pari ad un rapporto R (eq. attivatore/eq. Gellano) di circa 2. Il mezzo viene portato a pH=4.7 e tale valore mantenuto costante per aggiunta di HC10.01 N. Dopo circa 24 ore il pH cessa di salire (VHCl aggiunto=70 ml)' si toglie il gel dal mezzo e lo si mette a dializzare contro acqua distillata a pH=7, fino alla scomparsa del segnale UV relativo all'assorbimento dell'urea disostituita. Si congela e si liofilizza. Sono stati recuperati 2.8 g di prodotto avente GC (grado di co-reticolazione)= 0.3 determinato per idrolisi basica e retrotitolazione della base in eccesso.

Esempio 19

Gel fisico misto del gellano con scleroglucano

Si solubilizzano 3.0 g di Gelrite (Cp1 1-2% g/100 mi) e 1.5 g di scleroglucano (Cp2= 0.6% g/100 mi) in 250 mi di acqua distillata sotto agitazione in una bottiglia di vetro con tappo ermetico, mantenendo la soluzione a 90°C per il tempo necessario alla completa scomparsa di materiale sospeso. A questa soluzione si aggiungono a caldo 0.25 g di NaCl (Cg= 0.1% p/p) si omogeneizza il tutto per circa un minuto sotto vigorosa agitazione, quindi si versa nello stampo e si lascia raffreddare a temperatura ambiente per la formazione del gel.

Esempio 20

Crp gellano-scleroglucano

Si estrae il gel fisico misto precedentemente descritto dallo stampo e lo si pone ad equilibrare in 400 mi di una soluzione di CaCl2 1% (peso/peso) portata a pH=4. Dopo aver cambiato due volte la soluzione nella prima ora, si porta a 50°C sotto blanda agitazione e si aggiungono 1,8 g di EDC pari ad un rapporto R (eq. attivatore/eq. gellano) di circa 2. Il mezzo viene portato a pH=4,7 e tale valore mantenuto costante per aggiunta di HCl 0.01 N. Dopo circa 24 ore il pH cessa di salire (VHCl aggiunto=11 ml ) , si toglie il gel dal mezzo e lo si mette a dializzare contro acqua distillata a pH=7, fino alla scomparsa del segnale UV relativo all'assorbimento dell'urea disostituita. Si congela e si liofilizza. Sono stati recuperati 4 g di prodotto avente GC (grado di co-reticolazione) = 0.25, determinato per idrolisi basica e retrotitolazione della base in eccesso.

Esempio 21

Gel fisico misto del gellano con scleroglucano ossidato (sclerox).

Si sciolgono 200 mg di Gelrite (Cp1= 1% g/100 mi) e 100 mg di sclerox (campione avente grado di ossidazione pari al 100%; Cp2= 0.5% g/100 mi) in 20 mi di acqua distillata sotto agitazione in una bottiglia di vetro con tappo ermetico, mantenendo la soluzione a 90°C per il tempo necessario alla completa scomparsa di materiale sospeso. A questa soluzione si aggiungono a caldo 200 mg di CaCl2 (C3- 1% p/p), si omogeneizza il tutto per circa un minuto sotto vigorosa agitazione, quindi si versa nello stampo e si lascia raffreddare a temperatura ambiente per la formazione del gel.

Esempio 22

CRP gellano-scleroglucano ossidato (sclerox).

Si estrae il gel fisico misto precedentemente descritto dallo stampo e lo si pone ad equilibrare in 75 mi di una soluzione di CaCl2 1% (p/p) portata a pH=4. Dopo aver cambiato due volte la soluzione nella prima ora, si porta a 50°C sotto blanda agitazione e si aggiungono 0.24 g di EDC pari ad un rapporto R (eq. attivatore/eq. carbossilici totali) di circa 2. Il mezzo viene portato a pH=4.7 e tale valore mantenuto costante per aggiunta di HCl 0.01 N. Dopo due ore il pH cessa di salire (VHCl aggiunto= 12·6 ml), si toglie il gel dal mezzo e lo si mette a dializzare contro acqua distillata a pH=7, fino alla scomparsa del segnale UV relativo all'assorbimento dell'urea disostituita. Si congela e si liofilizza. Sono stati recuperati 0.28 g di prodotto avente GC (grado di coreticolazione)=0.15, determinato per idrolisi basica e retrotitolazione della base in eccesso. Esempio 23

Gel fisico misto del gellano con acido poliacrilico.

Si solubilizzano 0.75 g di Gelrite (Cp1= 0.5% g/100 mi) e 0.75 g di acido poliacrilico-sale sodico (Cp2= 0,5% g/100 mi) in 150 mi di acqua distillata sotto agitazione in una bottiglia di vetro con tappo ermetico, mantenendo la soluzione a 90°C per il tempo necessario alla completa scomparsa di materiale sospeso. A questa soluzione si aggiungono a caldo 1.5 g di NaCl (Cs= 1% p/p), si omogeneizza il tutto per circa un minuto sotto agitazione vigorosa, quindi si versa nello stampo e si lascia raffreddare a temperatura ambiente per la formazione del gel.

Esempio 24

Gel fisico misto del gellano con acido poliacrilico e procaina.

Si solubilizzano 1.5 g di Gelrite (Cp1= 1% g/100 mi) e 0.45 g di acido poliacrilico-sale sodico (Cp2= 0-3% g/100 mi) di acqua distillata sotto agitazione in una bottiglia di vetro con tappo ermetico, portando a 90°C per il tempo necessario alla completa scomparsa di materiale sospeso. A questa soluzione di aggiungono a caldo 0.75 g di NaCl (Cs= 0.5% p/p) e 0.75 g (Cf= 0.5% p/p) di procaina cloridrato, si omogeneizza il tutto per circa un minuto sotto agitazione vigorosa, quindi si versa nello stampo e si lascia raffreddare a temperatura ambiente per la formazione del gel.

Esempio 25

CRP gellano-acido poliacrilico funzionalizzato con procaina.

Si estrae il gel fisico misto precedentemente descritto dallo stampo e lo si pone ad equilibrare in 250 mi di una soluzione CaCl2 1% (p/p) portata a pH=4. Dopo aver cambiato due volte la soluzione nella prima ora sotto blanda agitazione si aggiungono 1.86 g di EDC pari ad un rapporto R (eq. attivatore/eq. carbossilici totali) di circa 2. Il mezzo viene portato a pH=4.7 e tale valore mantenuto costante per aggiunta di HCl 0.01 N. Dopo circa 20 ore il pH cessa di salire (VHCl aggiunto=145 ml), · si toglie i gel dal mezzo e lo si mette a dializzare contro acqua distillata a pH=7, fino alla scomparsa dei segnali UV relativi all'assorbimento dell'urea disostituita e del farmaco. Si congela e si liofilizza. Sono stati recuperati 2 g di prodotto avente GE (grado di esterificazione totale)= 0.15, determinato per idrolisi basica e retrotitolazione della base in eccesso, e GC (grado di coreticolazione)= 0.09, ricavato per differenza tra il GE ed il grado di funzionalizzazione calcolato dall'assorbimento UV del farmaco mediante retta di taratura.

Esempio 26

Gel fisico misto del gellano con alcol polivinilico. Si solubilizzano 3 g di Gelrite (Cp1= 2% g/100 mi) ed 1.5 g di alcol polivinilico (Cp2= 1% g/ioo ml) in 150 mi di acqua distillata sotto agitazione in una bottiglia di vetro con tappo ermetico, mantenendo la soluzione a 90°C per il tempo necessario alla completa scomparsa di materiale sospeso. A questa soluzione si aggiungono a caldo 150 mg di NaCl (Cs= 0.1% p/p) si omogeneizza il tutto per circa un minuto sotto agitazione vigorosa, quindi si versa nello stampo e si lascia raffreddare a temperatura ambiente per la formazione del gel.

Esempio 27

CRP gellano-alcol polivinilico.

Si estrae il gel fisico misto precedentemente descritto dallo stampo e lo si pone ad equilibrare in 250 mi di una soluzione di CaCl21% (p/p) portata a pH=4.

Dopo aver cambiato due volte la soluzione nella prima ora, sotto blanda agitazione si aggiungono 0.9 g di EDC pari ad un rapporto R (eq. attivatore/eq. gellano) di circa 2. Il mezzo viene portato a pH=4.7 e tale valore mantenuto costante per aggiunta di HCl 0.01 N. Dopo circa 10 ore (VHC1 aggiunto=19 ml) si toglie i gel dal mezzo e lo si mette a dializzare contro acqua distillata a pH=7, fino alla scomparsa del segnale UV relativo all'assorbimento dell'urea disostituita. Si congela e si liofilizza. Sono stati recuperati 2.5 g di prodotto avente GC (grado di co-reticolazione)= 0.1, determinato per idrolisi basica e retrotitolazione della base in eccesso.

Esempio 28

Gel fisico misto del gellano con lipasi.

Si sciolgono 1 g di Gelrite in 150 mi di acqua distillata sotto agitazione, in una bottiglia di vetro ermetico, per il tempo necessario alla completa scomparsa di materiale sospeso e 0.5 g di lipasi in 50 mi di acqua distillata. Si uniscono le due soluzioni ed alla soluzione finale (Cp1= 0.5% g/100 mi, Cp2= 0.25% g/100 mi) si aggiungono 1 g di complesso Ca-EDTA (Cc= 0.5% p/p) e 1.2 g di D(+)-ί-gluconolattone (Cg= 0.6% p/p), si omogeneizza il tutto per circa un minuto sotto moderata agitazione, quindi si versa nello stampo e si pone a 4°C per la formazione del gel. L'idrolisi acida del gluconolattone diminuisce il valore della costante di complessazione del complesso Ca-EDTA, favorendo il rilascio del calcio. Con l'utilizzo di questa procedura si ottiene la gelazione della matrice costituita dal gellano con il conseguente intrappolamento dell'enzima. Esempio 29

CRP gellano-lipasi

Si prepara il gel fisico misto solubilizzando a 90°C sotto agitazione, fino a scomparsa di materiale sospeso, 1 g di Gelrite in 75 mi di acqua distillata portata a pH=7, aggiungendo a questa soluzione, lasciata raffreddare fino a circa 40°C, 25 mi di una soluzione 0.25% (g/loo mi) di lipasi in acqua distillata portata a PH=7 e ponendo infine la soluzione finale a 4°C nello stampo per la formazione del gel. Una volta formato, si estrae e si pone ad equilibrare, sempre a 4°C, in 250 mi di una soluzione di CaCl2 1% (peso/peso) portata a pH=6. Dopo aver cambiato due volte la soluzione nella prima ora sotto blanda agitazione si aggiungono 1.5 g di EDC pari ad un rapporto R (eq. attivatore/eq.gellano) di circa 5. Il mezzo viene portato a pH=6,5 e tale valore mantenuto costante per aggiunta di HCl 0.01 N. Dopo circa 4 ore (VHC1 aggiunto=4° ml), si toglie il gel dal mezzo e lo si mette a dializzare contro acqua distillata a pH=7, fino alla scomparsa del segnale UV relativo all'assorbimento dell'urea disostituita. Si congela e si liofilizza. Sono stati recuperati 1.05 g di prodotto avente GC (grado di co-reticolazione)= 0.25, determinato per idrolisi basica e retrotitolazione della base in eccesso.

Esempio 30

Perle di gellano sale di tetrabutilammonio avvolte dal complesso polielettrolitico con chitosano.

Preparazione del sale di tetrabutilammonio del gellano. Si solubilizzano 2.5 g di Gelrite in 1 1 di acqua distillata (Cp= 0.25% g/100 mi), mantenendo la soluzione a 90°C per il tempo necessario alla completa scomparsa di materiale sospeso. A questa soluzione si aggiungono a caldo 2.5 g di TBABr (Cs= 0.25% p/p), si omogeneizza il tutto e si lascia raffreddare. La soluzione viene poi disposta in tubi da dialisi (taglio a M=10000), dializzata inizialmente contro acqua distillata e bidistillata successivamente fino al raggiungimento dello stesso valore di conducibilità dell'acqua bidistillata utilizzata (1.2 μS), quindi neutralizzata con TBAOH fino a pH=7,5 e filtrata su filtri di acetato di cellulosa fino ad un diametro dei pori di 0.8 μιη. Infine si congela e si liofilizza.

Preparazione delle perle.

Si prepara una soluzione di gellano-TBA al 2.5% (g/100 mi) solubilizzando 0.5 g di sale in 20 ml di acqua distillata. La soluzione viene fatta cadere goccia a goccia da una siringa in una soluzione di chitosano-HCl 0.5% (g/100 mi) ottenuta solubilizzando 0.5 g di chitosano in 100 mi di HCl 0.2 N. Le gocce, sulla cui superficie si forma nel giro di pochi secondi una pelle costituita dal complesso polielettrolitico gellanochitosano, vengono recuperate per filtrazione su carta da filtro, ripetutamente dializzate contro acqua distillata per allontanare l'eccesso di acidità, quindi congelate e liofilizzate.

Esempio 31

Perle di gellano auto-reticolato avvolte dal CRP gellano-chitosano.

Si preparano le perle come precedentemente descritto e si equilibrano in 100 ml di acqua distillata a pH=4, cambiando due volte la soluzione nella prima ora. Si mettono quindi a reagire sotto blanda agitazione in 50 mi di acqua distillata a PH=4 cui si aggiungono 0.55 g di EDC pari ad un rapporto R (eq. attivatore/eq. carbossilici) di circa 5. Il mezzo viene portato a pH=4.7 e tale valore mantenuto costante per aggiunta di HC1 0.01 N. Dopo circa 6 ore (VHC1 aggiunto=20 ml), si tolgono le perle dal mezzo e si mettono a dializzare contro acqua distillata a pH=7 fino alla scomparsa del segnale UV relativo all'assorbimento dell'urea disostituita. Si congela e si liofilizza. Sono stati recuperati 0.7 g di prodotto avente GC (grado di coreticolazione)= 0.38 determinato per idrolisi basica e retrotitolazione della base in eccesso.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per la preparazione di polimeri autoreticolati e/.o co-reticolati di forma predefinita, caratterizzato dal fatto che e' realizzato a partire da almeno un composto polimerico che comprende funzionalità' acide attivabili e funzionalità' nucleofile e che e' allo stato di gel fisico.
2. Procedimento per la preparazione di polimeri autoreticolati e/o co-reticolati secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che comprende le seguenti fasi: - preparazione dello stato di gel fisico di almeno un composto polimerico e formatura di detto gel, con ottenimento di un gel formato, - attivazione di detto gel formato per mezzo di almeno un opportuno attivatore, con ottenimento di un composto polimerico reticolato o polimero reticolato.
3. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che e' realizzato a partire da un singolo composto polimerico allo stato di gel fisico, con ottenimento di un polimero autoreticolato di forma predefinita.
4. Procedimento secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che detto gel formato viene sottoposto ad equilibrazione nel mezzo di reazione prescelto, con ottenimento di un sistema equilibrato.
5. Procedimento per la preparazione di polimeri autoreticolati e/o co-reticolati secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che detta attivazione del gel formato e' totale o parziale, con ottenimento di un polimero totalmente o parzialmente reticolato.
6. Procedimento secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che, durante detta attivazione del gel formato viene effettuata una contemporanea derivatizzazione di funzionalità' presenti su detto composto polimerico e non coinvolte nella reticolazione.
7. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che e' realizzato a partire da due o piu' composti polimerici diversi tra loro ed allo stato di gel fisico, con ottenimento di un polimero reticolato "misto" o polimero co-reticolato di forma predefinita.
8. Procedimento secondo la rivendicazione 7, caratterizzato dal fatto che detti composti polimerici diversi tra loro sono gellano e Chitosano, con ottenimento di un polimero reticolato "misto" o polimero co-reticolato.
9. Procedimento secondo la rivendicazione 8, caratterizzato dal fatto che detto polimero reticolato "misto" ο polimero co-reticolato è in forma di perle.
10. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto composto polimerico e' un polisaccaride acido.
11. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto composto polimerico e' un polisaccaride microbico esocellulare prodotto da linee cellulari classificate come Sphingomonas paucimobilis ed e' comunemente indicato come "gellano".
12. Procedimento secondo la rivendicazione il, caratterizzato dal fatto che detto composto polimerico indicato come "gellano" e' in forma di derivato salino e/o di derivato funzionale.
13. Procedimento secondo la rivendicazione 10, caratterizzato dal fatto che detto polisaccaride acido e' scelto tra: poliuronani naturali o di sintesi e loro derivati, glicosamminoglicuronoglicani naturali o di sintesi e loro derivati, glicosamminoglicani solfatati naturali o di sintesi e loro derivati.
14. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto composto polimerico e' un polimero sintetico comprendente sia funzionalità' acide che funzionalità' nucleofile.
15. Procedimento secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto che detto gel fisico viene modellato in forma opportuna prima di detta equilibrazione.
16. Procedimento secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che detto attivatore e' un attivatore della funzione acida ed e' scelto tra: carbodiimmidi solubili in mezzo acquoso, carbodiimmidi solubili in mezzo misto quale acqua e frazioni di solvente organico miscibile, carbodiimmidi solubili in mezzo organico.
17. Procedimento secondo la rivendicazione 16, caratterizzato dal fatto che detto solvente organico miscibile e' scelto tra le categorie di: chetoni, ammidi disostituite, esteri, tioesteri, eteri, tioeteri e detto mezzo organico e' scelto tra le categorie di: chetoni, ammidi disostituite, esteri, tioesteri, eteri, tioeteri.
18. Procedimento secondo la rivendicazione 16, caratterizzato dal fatto che detta carbodiimmide solubile in mezzo acquoso e' 1-etil -3- (3-dimetilamminopropil) carbodiimmide (EDO), detta carbodiimmide solubile in mezzo misto o mezzo organico e1 dicicloesilcarbodiimmide (Dee).
19. Procedimento secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che detto attivatore e' lo ione idrossonio.
20. Procedimento secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che e' realizzato a valori di pH compresi tra 3 e 7 ed a valori di temperatura compresi tra 0°C e 120°C.
21. Procedimento secondo la rivendicazione 20, caratterizzato dal fatto che e' realizzato a valori di pH compresi tra 4 e 5.
22. Procedimento secondo la rivendicazione 20, caratterizzato dal fatto che e' realizzato a temperatura ambiente .
23. Procedimento secondo la rivendicazione 5, caratterizzato dal fatto che detto polimero parzialmente reticolato e' salificato con metalli alcalini quali sodio e potassio, con metalli alcalino-terrosi quali calcio e magnesio, con alluminio, con ioni ammonio.
24. Procedimento secondo la rivendicazione 23, caratterizzato dal fatto che detti ioni ammonio costituiscono funzionalizzazione di ammine farmacologicamente inattive, terapeuticamente accettabili, scelte tra: ammine mono-, di- e trisostituite aventi un massimo di 18 atomi di carbonio, arilalchilammine aventi un massimo di 18 atomi di carbonio nella porzione alifatica ed un anello benzenico come porzione arilica ed in cui tale anello può essere sostituito con gruppi metilici in numero da 1 a 3 o alogeni, alchilenammine aventi cicli da 4 a 6 atomi di carbonio, contenenti o meno altri eteroatomi quali zolfo e ossigeno, ammine appartenenti ai suddetti gruppi sostitutite con funzionalità' amminiche oppure ossidriliche.
25. Procedimento secondo la rivendicazione 23, caratterizzato dal fatto che detti ioni ammonio costituiscono funzionalizzazione di ammine farmacologicamente attive scelte tra alcaloidi, feniletilammine, peptidi, benzodiazepine, fenotiazine, tioxanteni, ormoni, vitamine, anticonvulsivi, antipsicotici, antiemetici, anestetici, ipnotici, anoressizzanti , tranquillanti, analgesici, rilassanti muscolari, vasodilatatori coronarici e periferici, antineoplastici, antibiotici, sulfamidici, antiasmatici, antibatterici, antivirali, antimalarici, inibitori dell 'anidrasi carbonica, antiinfiammatori non steroidei e steroidei, vasocostrittori, agonisti e antagonisti colinergici, agonisti ed antagonisti adrenergici, antiulcera.
26. Procedimento secondo la rivendicazione 25, caratterizzato dal fatto che dette ammine farmacologicamente attive sono scelte tra salicilato di colina e teofillinato di colina.
27. Procedimento secondo la rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto che detta derivatizzazione viene realizzata mediante impiego di alcoli mono- o polivalenti scelti tra alcoli alifatici, arilalif atici, cicloalifatici, eterociclici.
28. Procedimento secondo la rivendicazione 27, caratterizzato dal fatto che detti alcoli alifatici hanno un numero massimo di 34 atomi di carbonio e sono sostituiti con uno o due gruppi funzionali amminici, ossidrilici, tiolici, aldeidici, chetonici, carbossilici, idrossialchilici, amrainoalchilici, eterei, tioeterei, esterei, tioesterei, acetalici, chetalici, carbammidici, carbammidici mono- o disostituiti con sostituenti alchilici con un massimo di 6 atomi di carbonio funzionalizzati o meno, con la possibilità’, per tali alcoli della serie alifatica, di avere la catena interrotta da eteroatomi del gruppo formato da ossigeno, azoto, zolfo.
29. Procedimento secondo la rivendicazione 27, caratterizzato dal fatto che detti alcoli alifatici sono provvisti di sostituenti alchilici recanti gruppi amminici, eterei, esterei, tioeterei, tioesterei, acetalici, chetalici, detti sostituenti alchilici avendo un massimo di 4 atomi di carbonio con i sostituenti alchilici dei gruppi esterei, carbammidici ed amminici costituiti da catene alchiliche o alcheniliche aventi un massimo di 8 atomi di carbonio.
30. Procedimento secondo la rivendicazione 27, caratterizzato dal fatto che detti alcoli alifatici sono scelti tra alcol etilico, propilico, isopropilico, butilico, amilico, pentilico, esilico, ottilico, alcol tartronico, acidi lattici, acido glicolico, acido malico, acido tartarico, acido citrico.
31. Procedimento secondo la rivendicazione 27, caratterizzato dal fatto che detti alcoli arilalifatici hanno un solo anello benzenico sostituito o meno con gruppi metilici , ossidrilici, alogeni in numero da 1 a 3, ed in cui la porzione alifatica e' a sua volta sostituita con uno o due gruppi ammminici mono- o disostituiti, con un gruppo pirrolidino o piperidino.
32. Procedimento secondo la rivendicazione 27, caratterizzato dal fatto che detti alcoli cicloalifatici sono mono- o policiclici con un massimo di 34 atomi di carbonio.
33. Procedimento secondo la rivendicazione 27, caratterizzato dal fatto che detti alcoli eterociclici sono cicloalifatici mono- o policiclici o alifaticocicloalifatici interrotti o meno nella catena o nell'anello da eteroatomi del gruppo formato da ossigeno, azoto e zolfo.
34. Procedimento secondo la rivendicazione 27, caratterizzato dal fatto che detti alcoli eterociclici sono scelti tra alcaloidi, feniletilammine, peptidi, benzodiazepine, fenotiazine, tioxanteni, ormoni, vitamine, anticonvulsivi, antipsicotici, antiemetici, anestetici, ipnotici, anoressizzanti , tranquillanti, analgesici, rilassanti muscolari, vasodilatatori coronarici e periferici, antineoplastici, antibiotici, sulfamidici, antiasmatici, antibatterici, antivirali, antimalarici, inibitori dell'anidrasi carbonica, antiinfiammatori non steroidei e steroidei, vasocostrittori, agonisti e antagonisti colinergici, agonisti ed antagonisti adrenergici, antiulcera.
35. Miscela comprendente almeno due composti polimerici ciascuno dei quali comprende funzionalità' acide attivabili e funzionalità' nucleofile, detta miscela essendo allo stato di gel fisico o complesso polielettrolitico.
36. Polimero reticolato di forma predefinita ottenibile mediante il procedimento di cui alla rivendicazione 1.
37. Impiego del polimero reticolato di forma predefinita di cui alla rivendicazione 36, come veicolo per specie farmacologicamente/biologicamente attive.
38. Impiego del polimero reticolato di forma predefinita di cui alla rivendicazione 36, per la realizzazione di sistemi operanti come sensori ed attori in relazione ad uno stimolo esterno.
39. Impiego del polimero reticolato di forma predefinita di cui alla rivendicazione 36, per la realizzazione di un sistema provvisto di elevata capacita' di assorbire fluidi.
40. Polimero reticolato di forma predefinita secondo la rivendicazione 36, per l'uso in campo biomedico.
41. Impiego del polimero reticolato di forma predefinita di cui alla rivendicazione 36 nel settore analitico, per la sintesi di fasi stazionarie per colonne cromatografiche.
42. Impiego del polimero reticolato di cui alla rivendicazione 36 nel settore agro-alimentare per la realizzazione di prodotti edibili a differente tessitura, per il rilascio controllato di fitofarmaci e/o pesticidi.
43. Impiego del polimero reticolato di cui alla rivendicazione 36 nel settore cosmetico per la realizzazione di creme solari e/o creme antirughe (anti-aging).
44. Impiego del polimero reticolato di cui alla rivendicazione 36 nel settore industriale per la immobilizzazione di enzimi o linee cellulari, per la disidratazione di solventi, per la concentrazione di soluzioni.