ITMI941134A1 - Antigene capace di conferire immunita' protettiva contro infezioni da elminti nell'uomo e negli animali e processo di vaccinazione per l'app - Google Patents
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Abstract
La presente invenzione si riferisce a materiale antigenico derivato da elminti capace di indurre protezione efficace e di lunga durata contro parassiti, in particolare a antigeni che provocano immunità protettiva contro elminti.
Description
Domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo:
"Antigene capace di conferire immunità protettiva contro infezioni da elminti nell'uomo e negli animali e processo di vaccinazione per l'applicazione nell'immunoprofilassi di malattie elmintiche di interesse medico e veterinario."
CAMPO DELL'INVENZIONE
L'invenzione si riferisce in generale a materiale antigenico derivato da elminti capace di indurre una protezione effettiva e di lunga durata contro parassiti, in particolare ad antigeni che mediano l'immunità protettiva contro elminti.
Gli elminti, trematodi digenetici o distomi, comprendono più di cento famiglie. La maggior parte sono parassiti abbastanza innocui che vivano nell'intestino ed in altri organi di vertebrati ed hanno pertanto ricevuto scarse attenzioni da parte dei parassitologi. Trematodi che causano gravi malattie nell'uomo sono i digenei o schistosomi e distomi epatici trematodi polmonari che sono parassiti molto importanti nell'infezione di animali.
Fasciola è il più importante fra i distomi epatici ed è un parassita principalmente dei ruminanti domestici responsabile di perdite economicamente gravi in tutto il mondo (mucche, pecore e capre).
La caratteristica principale della malattia, responsabile della patologia, morbilità e mortalità degli animali suddetti, è la distruzione dei tessuti epatici dell'ospite e il danneggiamento dei dotti biliari. La morbilità è alta in animali giovani che vengono infettati in particolare e diventano emaciati e muoiono. Fasciola può essere anche un parassita nell'uomo quando ne ha l'opportunità ed è più frequente a Cuba e nei paesi dell'America Latina. Tuttavia il vero distoma epatico umano è un'altro parassita cioè il Clonorchis sinensis che è diffuso in Cina, Giappone, Corea, Vietnam e India. La patologia è sostanzialmente causata dall'ispessimento delle pareti dei dotti biliari e nei casi più gravi causa cirrosi del fegato e morte.
Sia Fasciola che Clonorchis entrano nell'organismo passivamente come metacercariae ingerite con il cibo (foraggio e pesce crudo nel caso di Fasciola e Clonorchis rispettivamente) ma la loro migrazione nel corpo del vertebrato ospite fino ai dotti biliari avviene in modo diverso.
Mentre Clonorchis sale all'albero biliare dall'intestino attraverso l'ampolla di Vater, Fasciola migra attraverso la cavità addominale penetrando in successione attraverso la parete intestinale ed il parenchima epatico causando un danno maggiore ai tessuti dell'ospite.
Per guanto riguarda Fasciola negli animali domestici vi sono risultati contrastanti e poca evidenza che indicano come pecore e capre acquisiscono immunità contro Fasciola hepatica {Sinclair, 1967) dopo immunizzazione con estratti grezzi.
Vi sono anche dati che dimostrano che l'infezione può persistere per almeno 11 anni in pecore sperimentalmente infettate {Durbin, 1952). E' stato inoltre riferito che non vi è reazione, oppure è molto scarsa, dell'ospite contro il parassita, per cui la sopravvivenza della pecora dipende unicamente dal numero di metacercariae ingerite (Boray, 1969) . Le mucche sono considerate essere più resistenti, F.hepatica vive generalmente in questi ospiti 9 ~ 12 mesi ma sono i giovani vitelli che presentano fascioliasi cliniche più gravi.
Molteplici tentativi sono stati effettuati per identificare antigeni immunoprofilattici che potessero costituire un buon punto di partenza per sviluppare vaccini efficienti contro la fascioliasi.
Diversi scienziati hanno principalmente seguite due strategie sperimentali indipendenti (1) immunità indotta da vaccini vivi irraggiati e (2) immunità indotta da vaccini morti.
Tuttavia sono riportati pochi risultati di resistenza acquisita contro Fasciola hepatica in vitelli con l'uso di estratti somatici di distomi (Ross 1967. Hall e Lang 1978, Hillyer 1979) e i dati riportati sono contraddittori.
L'immunità indotta da vaccini vivi irraggiati ha dato pure risultati deludenti in esperimenti condotti su topi, conigli e pecore (Campbell et al. 1978, Hughes, 1963) poiché non c'è evidenza di sviluppo di immunità in questi animali dopo somministrazione di metacercariae irraggiate.
Inoltre esperimenti con estratti diversi o prodotti di escrezione/secrezione da distomi biliari nello stadio adulto non sono immunogenici visto che animali vaccinati presentano una scarsa protezione e lesioni patologiche nel parenchima epatico. Come riportato nello stato dell'arte suddetto si ritiene che le mucche rispondano meglio alla vaccinazione con vaccini morti ma è dubbio che protezione analoga sia ottenibile in pecore vista la mediocre protezione indotta da diversi antigeni in animali da esperimento.
La creazione di immunità protettiva contro F.hepatica per mezzo di immunità eterologa è stata ipotizzata da Campbell et al. (1977) che hanno dimostrato come l'infezione di pecore con Cysticercus tennicollis, cioè lo stadio metacestoide del cestode del cane Taenia hydatigena, induceva protezione parziale contro F.hepatica ma Hughes et al (1978) tuttavia non potevano confermare questo risultato. Altri esperimenti hanno rivelato l'impossibilità di indurre protezione contro fasciola hepatica in animali da esperimento usando questo cestode.
Topi infettati con adulti bisessuali di S. mansoni hanno sviluppato una resistenza significativa a F.hepatica ed un'infezione simultanea con entrambi i parassiti ha prodotto una riduzione del numero di schistosomi e ridotto il numero di uova di Schistosoma prodotte dal parassita (Christensen et al 1973). Vitelli infettati con S.bovis hanno pure mostrato una certa resistenza a F.hepatica e danni ai tessuti del fegato meno pronunciati (Sirag et al. 1981).
Pelley e Hillyer (1978). Hillyer e de Atica (1980) hanno riportato antigeni comuni per F.hepatica e Schistosoma mansoni trovati in uova di Schistosoma. Altri risultati che mostrano immunità reattiva incrociata è il verificarsi di reazioni falsopositive in aree dove entrambi i parassiti sono endemici. Hillyer (1985) e Hillyer et al. (1987) hanno dimostrato che una miscela di antigeni derivati da fasciola hepatica può conferire protezione contro una susseguente infezione sia con F.hepatica che Schistosoma mansoni.
Schistosomiasi o Bilharzia è una vecchia malattia delle zone acquatiche riportata dagli egiziani 4000 anni fa ed è oggi un problema di salute mondiale che si pensa affliggere più di 200 milioni di persone in aree urbane e peri-urbane del Terzo Mondo. I tre principali schistosomi che infettano l'uomo sono trasmessi da vermi d'acqua dolce e le loro larve, chiamate cercariae, che sono disperse nell'acqua e possono penetrare direttamente attraverso la pelle. Dopo migrazione dal derma attraverso i polmoni al sistema portale epatico gli schistosomi vanno a vivere nelle piccole vene mesenteriche o pelviche in cui ogni femmina depone nel flusso sanguigno fino a 100 uova al giorno. La reazione immunitaria dell'ospite a tali uova che vanno ad alloggiarsi nei tessuti è responsabile della debilitazione cronica e della fatalità della malattia. L'estensione dei sistemi di irrigazione, la costruzione di dighe e la concentrazione della popolazione umana contribuiscono oggi all'incremento di distribuzione e di intensità dell'infezione schistosomica. Il controllo dei vermi e la chemioterapia sono i principali, ma non soddisfacenti, mezzi di controllo. Un vaccino efficace sarebbe quindi il mezzo per aiutare considerevolmente i tentativi di sradicare la malattia.
Una varietà di specie ospiti può sviluppare parziale resistenza a Schistosoma mansoni dopo infezione primaria o immunizzazione con cercariae attenuate per irraggiamento (Smithers e Doenhoff, 1982). Lo scoraggiamento iniziale sulla possibilità di immunizzazione sperimentale contro infezione da S.mansoni (Clegg e Smith, 1978) è stato sostituito dall'odierno entusiasmo per la possibilità di produrre un vaccino definitivo ed effettivo contro questo parassita con vaccini morti (Tendler, 1987). Tuttavia la limitazione maggiore è costituita dalla protezione incompleta ottenuta negli animali in molteplici esperimenti con antigeni da parassiti purificati e chimicamente definiti. Come descritto da numerosi autori e riportato da Smithers, 1982 vi è un generale accordo sulla necessità di aumentare il livello di protezione indotto dall'immunoprofilassi sperimentale. Tuttavia si è rivelato difficile stabilire un buon modello animale per lo sviluppo di un vaccino efficiente contro la schistosomiasi. Il progresso nelle ricerche dipende dalla identificazione e purificazione di molecole antigeniche altamente efficaci che impartissero immunità protettiva (Schistosoma mansoni: Protective antigens, M.Tendler - Mem. Inst. Oswaldo Cruz Rio de Janeiro, Voi. 82. Suppl. IV: 125-28 (1987).
In studi precedenti sulla ricerca di antigeni che inducano immunità protettiva contro schistosomi, è stato riportato l'uso di una miscela complessa di componenti di schistosomi (detta SE) rilasciati precocemente durante l'incubazione di parassiti adulti vivi e da poco perfusi con S.mansoni in soluzione salina tamponata (Tendler e Scapin (1979); Kohn et al. 1979)· Concentrandosi sul tentativo di raggiungere un contro l'infezione da cercaria è stato disegnato un modello sperimentale in due animali esogami ospiti diversi il topo SW e il coniglio NZ noti per essere rispettivamente assolutamente sensibili e parzialmente resistenti all'infezione da S.mansoni.
Nel modello coniglio Nuova Zelanda infetto da S.mansoni è stato possibile stabilire uno schema affidabile di infezioni percutanee con presenza omogenea di parassita adulto in termini di numero e misura dei parassiti e rapporti maschio/femmina per un lungo periodo successivo all’infezione (Tendler 1982, 1985, 1986). Recenti esperimenti suggeriscono che l'uso del coniglio come ospite sperimentale per S.mansoni può rappresentare un nuovo modello di immunità per la malattia (Almeida et al. 1987).
Esperimenti di immunizzazione effettuati in conigli con la miscela SE, hanno dato livelli molto alti di protezione alla stimolazione immunologica (Scapin et al., 1980, Tendler 1980; Tendler et al. 1982) (90?! di riduzione della presenza di parassiti in animali immunizzati in confronto a controlli di sesso ed età comparabili, quando stimolati immunologicamente simultaneamente con lo stesso numero e tipo di cercariae attive dal -LE una linea cellulare brasiliana di S.mansoni). Topi SW immunizzati con SE hanno pure mostrato una significativa protezione contro la stimolazione immunologica con cercariae normali e totale resistenza all'infezione letale {Tendler 1986). Per misurare la resistenza, animali vaccinati e stimolati immunologicamente e controlli in parallelo sono stati sottoposti a perfusione epatica e mesenterica per determinare la quantità di parassiti adulti. Il grado di protezione è calcolato in base alla differenza nel numero di parassiti riscontrati nei controlli rispetto agli animali vaccinati (Tendler et al. 182).
Alla luce della prova, in vitro, che anticorpi formati contro diversi stadi del ciclo vitale del parassita sono efficaci nei saggi di citotossicità eosinofili o complemento dipendenti (Grzych et al. 1982; Smith et al. 1982), la caratterizzazione degli antigeni riconosciuti da sieri di ospiti evidentemente immuni, è usata per identificare molecole antigeniche aventi proprietà immunitarie (Bickle et al. 1986; Horowitz e Arnon, 1985 ) . Esperimenti western blot sono stati effettuati per analizzare la risposta anticorpale di conigli vaccinati con SE. Testando antigeni SE con una serie di anti-sieri derivati da conigli immunizzati secondo lo stesso schema (SE-FCA), gli autori sono stati capaci di dimostrare in immunoblot due distinti schemi di riconoscimento di antigeni SE in questi individui. E' interessante notare come alcuni antigeni SE erano strettamente riconosciuti solo da anti-sieri di conigli quasi completamente protetti. Questa scoperta a permesso agli autori di identificare due sotto classi di antigeni SE, una comune a tutti gli antisieri di coniglio ed una seconda limitata ad animali altamente protetti. Questi due schemi sono stati rispettivamente nominati schema a bassa ed alta protezione e usati come anticorpi differenziali. Approfittando di questi due schemi di riconoscimento di componenti SE da parte di anticorpi policlonali da conigli che rispondeva in modo differenziato allo stesso schema di immunizzazione, (probabilmente a seguito di variazioni individuali, che sono ragionevolmente attendibili in popolazioni esogame) è stata applicata la strategia di esaminare librerie cDNA con tali sieri. A causa della incompleta comprensione dei meccanismi critici di risposta protettiva nella schistosomiasi sperimentale ed umana, le procedure di esame adottate da altri implicavano frequentemente l'uso di sieri umani infetti (individui immuno- "putativo" o "suscettibile" di aree endemiche [Carter e Colley 1986] o sieri selezionati monoclonali o policlonali da animali immunizzati [Lanar et al., 1986, Balloul et al. 1987]) che sono diretti contro diversi antigeni noncaratterizzati.
Nei tentativi iniziali verso il clonaggio molecolare di componenti SE potenzialmente protettivi, due librerie cDNA da parassiti adulti in toto di S.mansoni e S. japonicum costruite da Drs. Klinkert, Università di Heidelberg e Donnelson/Henkle, Iowa University, rispettivamente, sono state esaminate con filtri duplicati per esame differenziale. Un parallelo poteva essere stabilito con i risultati degli immunoblots in quanto si determinavano due set di cloni, il che presumibilmente corrisponde alla differenza di riconoscimento da parte di sieri anti-SE di coniglio suscettibile e resistente. In altri esperimenti diretti alla identificazione di componenti SE abbiamo confrontato in immunoblot sieri di coniglio policlonali anti-SE {alta e bassa protezione) con un antisiero di coniglio rispetto a paramiosina schistosomica purificata (gentilmente offerta dal Dr. A. Sher, NIH). Questa proteina è una molecola recentemente identificata parzialmente protettiva contro stimolazioni immunologiche di S.mansoni in topi omogami (Lanara et al. 1986) di Μr(Χ10<-3>)97. sensibile alla degradazione proteolitica a due maggiori prodotti di scissione di Mr (x10<-3>)95 e 78 (Pearce et al. 1986).
Il complesso 97/95/78 kD è stato riconosciuto da sieri anti-SE ad alta e bassa protezione e sieri anti-paramiosina monospecifici. Il siero anti-SE ad alta protezione riconosceva oltre alla paramiosina altri polipeptidi che devono ancora essere ben caratterizzati e determinati per la loro attività protettiva e ruolo immunologico. Il ritrovamento di paramiosina come componente di SE rafforza studi di immunofluorescenza precedenti eseguiti su sezioni di schistosomi adulti con sieri di coniglio anti-SE che reagivano con uova sulla superficie del parassita e fra gli strati muscolari (Mendonga et al. 1987) in modo simile a quello dimostrato per la miosina (Pearce et al, 1986). Questo ritrovamento confermava risultati di immunoesame di librerie cDNA eseguiti, come detto sopra.
Inoltre cloni comuni di paramiosina erano isolati con sieri sia anti-paramiosina che anti-SE, cloni extra essendo riconosciuti solo dai secondi sieri di coniglio (alta protezione). Fra gli altri componenti SE di peso molecolare più basso, è stato identificato anche il doppietto 31/32 KD, descritti come possibili candidati per la diagnosi di schistosomiasi (Klinkert et al. 1987) e recentemente identificati come proteasi localizzate nell'intestino degli schistosomi (Klinkert et al.
1988). Questi antigeni e altri che sono stati identificati nell'estratto salino hanno mostrato una protezione molto bassa. L'incubazione di schistosomi appena perfusi in un mezzo chimicamente definito (PBS) era diretta all'estrazione di antigeni precocemente rilasciati da parassiti adulti vivi (specialmente prodotti di secrezione/escrezione e componenti tegumentali). Questa strategia è stata adottata in vista di primi tentativi falliti di indurre resistenza contro infezione da schistosomi con diversi estratti grezzi di S.mansoni che teoricamente potevano essere dotati di una rilevante azione antigena. Queste premesse erano principalmente influenzate dalle procedure di estrazione comunemente adottate, che derivavano dall'uso di parassiti morti. Infatti usando SE emulsificate in FCA (come adiuvante preferenziale) e somministrate per via sottocutanea/intradermale, siamo riusciti a ottenere una protezione alta e di lungo termine in due animali ospite da laboratorio contro infezione da S.mansoni. Il razionale per l'uso del modello coniglio, inusuale negli esperimenti protettivi, era di effettuare l'identificazione iniziale di antigeni potenzialmente protettivi e discreti in un ospite parzialmente resistente {per essere quindi testato in ospiti suscettibili) che poteva perciò "amplificare" la risposta immunitaria e il meccanismo effettore di uccisione dei parassiti poiché i conigli sono noti produttori di potenti anticorpi.
Studi sulla risposta immuno indotta in animali vaccinati diretti all'identificazione dei componenti SE protettivi funzionalmente rilevanti, siti e meccanismi di morte dei parassiti e markers di protezione sono stati l'obiettivo dei nostri sforzi negli anni recenti, ma informazioni sulla composizione molecolare di SE, come pure sull'identificazione e isolamento dei suoi componenti protettivi è stata disponibile solo recentemente.
Il brevetto americano 4.396.000 concesso il 2 Agosto 1983 a nome di Luigi Messineo e Mauro Scarpin (secondo il certificato di riesame 46lst B14.396.000 emesso l'il febbraio, 1986 è stato cancellato) descriveva un estratto di parassiti adulti di S.mansoni ottenuto per incubazione in 0,15 M di tampone sodio cloruro-sodio fosfato {pH 5.8) che contiene carboidrati proteici e acido nucleico e/o prodotti secondari del secondo componente e che si risolve in quattro frazioni principali per gel cromatografia in colonne G-100 e G-200 Sephadex. Test di immunodiffusione con estratti di siero di coniglio enti-totale rivelano tre linee di precipitazione corrispondenti alle frazione I e II e una con III o IV.
Conigli immunizzati con questo estratto totale sono totalmente o parzialmente (almeno 77%) resistenti all’infezione. Il materiale antigenico dell'estratto salino era un vaccino efficace per il trattamento e l'immunizzazione di schistosomiasi e altre infezioni da schistosomi.
L'azione ufficiale suddetta era basata su due articoli degli inventori usati qui come principio della presente invenzione. Fra i tanti dati corrispondenti allo stato dell'arte della presente invenzione i dati più recenti sono stati il clonaggio e sequenziazione di un derivato di SE identificato come Sm-14.
Lo studio pubblicato più recente è "14-kDa Schistosoma mansoni Polypeptide is homologous to a gene family of fatty acid binding proteine - The Journal of Biological Chemistry - voi. 266, No 13, pubblicato il 5 maggio, p.8447-8454, 1991; D.Moser, M. Tendler, G.Griffiths e Mo-Quen Klinkert". Questo studio descrive la sequenziazione del gene e la dimostrazione dell'attività funzionale del Sm-14 come una proteina che lega lipidi alla struttura del Sm-14.
La completa sequenza nucleotidica che codifica una proteina di Schistosoma mansoni denominata Sm-14 è stata determinata da cloni cDNA propagati nel batteriofago lambda-gt 11 in Escherichia coli. La proteina di 14,8-kDa ha significativa omologia con una famiglia di polipeptidi correlati che legano leganti idrofobici. Membri di questo gruppo di proteine citosoliche sono stati originariamente identificati sulla base della loro affinità per acidi grassi a catena lunga. La proteina ricombinante purificata mostra un’affinità agli acidi grassi in contrasto con la mutazione mancante dell'aminoacido 16 N-terminale. La sequenza nucleotidica completa può essere descritta come un ORF che inizia alla tripletta ATG posizionata ai nucleotidi 123-125. La regione codificante comprende 399 nucleotidi e finisce alla posizione 521. La proteina di 133 aminoacidi residui ha una massa molecolare di 14,847 kDa calcolata sulla base della sequenza. L'Sm-14 è caratterizzato dalla seguente sequenza di aminoacidi: MET - SER - SER - PHE - LEU - GLY - LYS - TRP - LYS - LEU - SER -GLU - SER - HIS - ASN - PHE - ASP - ALA - VAL - MET - SER - LYS -LEU - GLY - VAL - SER - TRP - ALA - THR - ARG - GLN - ILE - GLY -ASN - THR - VAL - THR - PRO - THR - VAL - THR - PHE - THR - MET -ASP - GLY - ASP - LYS - MET - THR - MET - LEU - THR - GLU - SER THR - PHE - LYS - ASN - LEU - SER - CYS - THR - PHE - LYS - PHE -GLY - GLU - GLU - PHE - ASP - GLU - LYS - THR - SER - ASP - GLY -ARG - ASN - VAL - LYS - SER - VAL - VAL - GLU - LYS - ASN - SER -GLU - SER - LYS - LEU - THR - GLN - THR - GLN - VAL - ASP - PRO -LYS - ASN - THR - THR - VAL - ILE - VAL - ARG - GLU - VAL - ASP -GLY - ASP - THR - MET - LYS - THR - THR - VAL - THR - VAL - GLY -ASP - VAL - THR - ALA - ILE - ARG - ASN - TYR - LYS - ARG - LEU -SER.
Inoltre Moser D. et al. riferiscono che sarebbe desiderabile valutare il ruolo che la Sm-14 gioca nella miscela proteica per conferire immunità in animali da laboratorio e se può essere un antigene rilevante per un attacco immunologico al parassita.
Perez J.R. et al. Journal of experimental Parasitology, voi. 74, n° 4, Giugno 1992, riportano che il polipeptide che è crossreattivo all'antisiero contro l'antigene immunoprofilattico Fh 12 condivide una significativa omologia di sequenza di aminoacidi con una proteina di 14,8 KDa di S.mansoni capace di legare acidi grassi denominata Sm-14 (Moser et al. 1991)· Inoltre è descritto che Fh 12 è un potente immunogeno ed una possibile molecola immunoprofilattica per la prevenzione sia di schistosomiasi e fascioliasi (Hillyer et al., 1985; Hillyer et al. 1987) come pure un marcante immunodiagnostico utile nella fascioliasi umana (Hillyer et al. 1992) e che gli autori stavano tentando la preparazione di un antigene ricombinante contenente sottoclassi epitopi di Fh 15 e combinazioni di sotto classi di Fh 15 potrebbero essere la proteina Fh 12 stessa.
Tuttavia anche i lavori più pertinenti (Moser D et al. e Perez J.R. et al.) fino ad ora non valutano il ruolo svolto da Sm 14 nella miscela SE per conferire immunità ad animali da laboratorio e se possa essere un antigene protettivo efficace contro infezioni da schistosomi o altri elminti come F.hepatica.
La presente invenzione è la continuazione di ricerche precedentemente pubblicate in cui è provato che Sm 14 è un componente estremamente protettivo di SE capace di stimolare un alto livello di immunità protettiva in forma ricombinante in animali da laboratorio contro infezioni sia di S. mansoni che F.hepatica.
OGGETTI DELL'INVENZIONE
L'oggetto della presente invenzione è la molecola Sm 14 definita come un antigene protettivo contro infezione da elminti.
Ulteriore oggetto dell'invenzione è una forma ricombinante di Sm-14. rSm-14.
Un altro oggetto dell'invenzione è un vaccino contro l'infezione causata da Fasciola hepatica in mucche, capre e pecore.
Un ulteriore oggetto dell'invenzione è un vaccino contro infezioni causate da Schistosoma mansoni e tutte le altre specie di Schistosoma che sono responsabili di infezioni e malattie in uomini e animali.
Un altro oggetto dell'invenzione è un vaccino contro infezioni causate da tutte le specie di elminti di interesse medico o veterinario.
Un ulteriore oggetto della presente invenzione è un reagente diagnostico per la schistosomiasi e fascioliasi.
SOMMARIO DELL'INVENZIONE
Questi scopi possono essere raggiunti per mezzo di un antigene che conferisce immunità protettiva contro infezioni da elminti di uomini ed animali ed il processo di vaccinazione immunoprofilattica di malattie da elminti di interesse medico e veterinario e procurando un antigene capace di agire come reagente immunodiagnostico.
Secondo la presente invenzione l'antigene consiste di una proteina derivata da Schistosoma mansoni, Sm-14, che ha la capacità di stimolare immunità protettiva contro infezioni da elminti in animali di laboratorio in particolare contro S.mansoni ed F.hepatica.
Inoltre la presente invenzione include una forma ricombinante di Sm-14, rSm-14 che è una proteina di fusione con la proteina del capside del batteriofagio T7.
BREVE DESCRIZIONE DEI DISEGNI
La figura 1 mostra un gel della preparazione dell'antigene finale (purificazione rSm 14) confrontata con SE.
La figura 2 mostra la struttura tridimensionale di Sm 14 predetta da modello al computer.
La figura 3 mostra la valutazione del livello di protezione di rSm-14 secondo l'esperimento 1.
La figura 4 mostra la valutazione del livello di protezione di rSm-14 secondo l'esperimento 2.
La figura 5 mostra la valutazione del livello di protezione di rSm-14 secondo l'esperimento 3·
La figura 6 mostra la valutazione del livello di protezione di rSm-14 secondo l'esperimento 4.
La figura 7 mostra insieme i risultati degli esperimenti 1,2,3 e 4.
La figura 8 mostra la vaccinazione di topi Swiss con rSm 14 contro infezione da Fasciola hepatica.
La figura 9 mostra il fegato di un animale non vaccinato infettato da Fasciola hepatica.
La figura 10 mostra pure il fegato di un animale non vaccinato infettato con Fasciola hepatica.
La figura 11 mostra il fegato di un animale vaccinato che è stato infettato con Fasciola hepatica.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE
Il metodo per sviluppare un vaccino contro specie di Schistosoma umano usando lo stesso antigene vaccinante nell'immunoprofilassi delle malattie causate da differenti parassiti che infettano uomini e vari animali può essere descritta con i passaggi seguenti:
-eseguire l'isolamento di un antigene reattivo incrociato comune (che secondo una realizzazione preferita della presente invenzione è Sm-14) che è altamente protettivo contro malattie di uomini e animali
-testare l'antigene come vaccino per l'immunoprofilassi della malattia in animali sperimentali e ospiti definiti del parassita che causa l'infezione e/o la malattia
-analizzare le informazioni derivanti dalla vaccinazione dell'animale ospite, ruminanti domestici, focalizzando tutte le questioni relative e i prerequisiti richiesti per lo sviluppo finale di un vaccino contro date malattie umane come tossicologia e patologia.
Usando il metodo secondo la presente invenzione è possibile trovare un antigene che è simultaneamente altamente efficace come vaccino contro due malattie da parassiti sia in animali domestici che negli uomini. Secondo la realizzazione preferita dell'invenzione le malattia da parassiti di animali e uomini sono fascioliasi e schistosomiasi rispettivamente, come pure altre malattie da elminti che interessano in particolare uomini e diverse specie di animali.
Uno degli antigeni nella miscela complessa SE, Sm 14, è stato clonato e mostra una omologia elevata con proteine che legano acidi grassi e anche con Fh 15, un antigene di Fasciola hepatica. Questo antigene reattivo incrociato, detto Sm-14, nella sua forma ricombinante, rSm 14, conferisce immunità protettiva sia contro schistosomiasi che contro fascioliasi.
rSm-14 e'una proteina di fusione fra i primi 260 aminoacidi della proteina del capside del batteriofagio T7 ed il polipeptide completo Sm-14 come sopra definito ottenuto per unione fra il 260mo residuo della proteina T7 e la metionina iniziale (MET) del Sm-14 con la sequenza amino acidica che segue
Residuo 260 della proteina capside - LEU - LEU - THR - LEU - THR - LYS - GLY - LYS - ALA - LYS - SER - ALA - GLU - LEU - GLU - PHE - VAL - ASP - LEU - GLU - GLY - SER - VAL - Sm14.
Dimostreremo la capacita' di una forma ricombinante di Sm 14 di conferire un'alta protezione contro Fasciola hepatica, Schistosoma mansoni come pure altre specie di Schistosoma e Echemococcus e probabilmente altri elminti che sono patogeni nell'uomo e negli animali. I livelli di protezione raggiunti con la vaccinazione sperimentale di centinaia di animali ha dimostrato che Sm-14 è la molecola maggiormente protettiva derivata da SE e si candida come possibile vaccino anti-Schistosoma e vaccino anti-Fasciola.
La presente invenzione viene ora descritta alla luce degli esempi che non hanno scopo limitativo.
Esempio 1
La procedura per ottenere, caratterizzare e purificare il Sm-14 ricombinante è descritta qui di seguito:
fase 1
La transizione dell'estratto protettivo salino (SE) a vaccino molecolare è stata effettuata come segue
a) LE una linea brasiliana di libreria S.mansoni lambda-gt 11 cDNA (preparata dal parassita adulto della linea endemica LE di S.mansoni) è stata esaminata con siero immune anti-SE derivato da individui totalmente protetti (in particolare siero di conigli e conigli ad "alta protezione" come descritto prima in questo documento);
b) viene scelta una specie di clone cDNA riconosciuta da siero di conigli anti-SE ad alta protezione che produce segnali molto intensi;
c) la sequenza e caratterizzazione rivela la proteina da 14-kDa denominata Sm-14 (la sequenza nucleotidica ed aminoacidica dedotta è già pubblicata nel lavoro di Moser, Tendler et al.). Un esempio pratico di come condurre la produzione del clone cDNA è descritta nello stato dell'arte,
fase 2
Espressione di Sm-14 in un sistema vettore efficace
Il metodo per arrivare fino al PDS-14 è descritto nello stato dell'arte ("14-kDa Schistosoma mansoni Polypeptide is homologous to a gene family of fatty acid binding proteine - The Journal of Biological Chemistry - voi. 266, No 13, pubblicato il 5 maggio, p.8447-8454, 1991) come pure l'identificazione e i risultati della sequenza di cDNA clonata e qui incorporata come riferimento.
Antisiero prodotto in conigli immunizzati con estratto di schistosoma è stato usato per esaminare la libreria cDNA di S.mansoni adulto (precedentemente descritta). Un clone denominato Sm-14 è stato purificato da una placca dopo tre cicli di immunoesami. Il fago ricombinante è stato lisogenizzato in E.coli Y 1089 ed indotto a esprimere una proteina di fusione betagalattosidasi-Sm-14 di 122 kDa. La proteina è stata purificata per elettroforesi preparativa SDS-gel di poliacrilammide e anticorpi contro la proteina di fusione sono stati moltiplicati in conigli.
La sotto-clonazione di Sm-14 e la sua espressione nel presente vettore in cui sono stati effettuati i saggi di vaccinazione contro S.mansoni e Fasciola sono stati effettuati come qui di seguito descritto.
Escissione di tutto l'ORF codificante per Sm-14 dal costrutto originale pDS-Sm-14 per taglio con Barn HI ed Himd III.
Il frammento ottenuto è stato ligato in pGEMEX-1 (Promega) tagliato con gli stessi enzimi,
fase 3
Il costrutto risultante che a sua volta faceva si che il gene fosse in un costrutto per l'espressione come proteina di fusione con la proteina del gene 10 di T7, sotto controllo di un promotore RNA polimerasi di T7, è stato usato per trasformare la linea E.coli BL 21(DE 3) che contiene il gene per la T7 RNA polimerasi sotto controllo di lac UV. La linea E.coli BL 21 (DE 3) è stata usata per l'espressione di una proteina ricombinante. Altre linee di E.coli possono essere alternativamente impiegate per lo stesso scopo come pure altri sistemi di espressione per esempio PDS-14 come già noto nello stato dell'arte.
fase 4
Colonie contenenti il plasmide ricombinante sono state poste in crscita tutta la notte e l'espressione dell'RNA polimerasi di T7 indotta per addizione di IPTG (Isopropiltio-β-D-galattoside) durante la successiva fase di accrescimento.
Questa procedura porta all'espressione di una proteina di fusione con peso molecolare previsto di 40 kDa (14 kDa da Sm-14 e 26 kDa della proteina del gene 10).
fase 5
Le cellule batteriche sono state raccolte per centrifugazione 5000 gpm/10 min) e risospese in un tampone di lisi (50 mM Tris-HC1, pH 7.5. 2 mm EDTA, 1 mM DTT, 2 mg/ml lisozima) ed incubate in ghiaccio per 15 minuti. I Usati sono poi stati sonicati per 2 cicli di 30 secondi e ricentrifugati. I pellet sono stati risospesi in un tampone di lavaggio (50 mm Tris-HCl, pH 7.5. 10 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,5% Triton x-100) e centrifugati,
fase 6
Successivamente ad un ulteriore ciclo di risospensione e centrifugazione il pellet finale è stato risospeso in acqua. E’stato effettuato un SDS-PAGE, l'antigene purificato per elettroeluizione e immagazzinato ad una temperatura compresa fra -70 e -200”C fino al momento dell'uso.
La figura 1 mostra il grado di purezza di rSm-14 e l'alta efficienza di espressione.
Analisi di elettroforesi su gel di poliacrilammide dell'antigene totale SE di S.mansoni e Sm-14 purificato trasferito su carta di nitrocellulosa. I tracciati 1 - 3. SE e Sm-14 risolti in 10 e 15% rispettivamente di SDS-PGE colorate con blu-C. I tracciati 2 e 4 in immunoblot. Il tracciato 2 è stato testato con antisiero policlonale da coniglio immunizzato con SE. Il tracciato 4, antisiero proteina di fusione anti-Sm-14 di coniglio. Indicatori Standard di peso molecolare sono indicati su entrambi i lati della figura.
La figura 2 mostra la struttura tridimensionale di Sm 14.
Il modello computerizzato della struttura di Sm-14 secondo la presente invenzione è effettuata sulla base della alta omologia conosciuta di Sm-14 con proteine per cui la struttura cristallina è stata già determinata. Ciò dà una struttura tridimensionale dettagliata ed affidabile di Sm-14 da modellare con modellazione al computer.
La struttura tridimensionale mostra che: (1) Sm-14 è una proteina a forma di barile, (2) l'acido grasso si lega all'interno del barile, (3) il barile è formato da una struttura di 10 fogli ripiegati, (4) i fogli sono uniti da corti lacci, (5) i lacci mostrano divergenza fra membri della famiglia delle proteine leganti gli acidi grassi e sono responsabili della antigenicità di Sm-14.
Esempio 2
L'esempio 2 include gli esperimenti da 1 a 4. Protocolli degli esperimenti da 1 a 4 sono effettuati come descritto sotto e mostrano l'attività protettiva di SE e rSm-14 in topi Swiss.
I protocolli di immunizzazione con SE (300 μg/ml per dose/animale) e rSm-14 proteina di fusione (10 μg/ml/dose) sono stati effettuati con il protocollo di immunizzazione seguente che consiste di due dosi dell'antigene con o senza adiuvante di Freund, date a topi ad intervalli di sette giorni per iniezione sottocutanea seguita da una dose di richiamo dopo la seconda dose. Gli intervalli fra l'applicazione delle dosi vaccinanti possono esserre variate. Dopo un intervallo di 60 gironi (che pure può' essere variato, per esempio 45 giorni) l'animale è stato stimolato immunologicamente con 100 cercariae.
La protezione globale per ogni gruppo di animali (animali immunizzati/stimolati immunologicamente e rispettivi controlli) è stata calcolata come segue:
dove C = parassiti recuperati dai controlli e V = parassiti recuperati da animali vaccinati.
I risultati sono mostrati nella Tabella 1
Diversi gruppi di controllo caratterizzati da topi SW di sesso ed età corrispondenti stimolati immunologicamente simultaneamente con lo stesso numero e tipo di cercariae di S.mansoni sono stati usati come controlli di infezione per ogni esperimento individuale . Questi animali hanno ricevuto solo iniezioni parallele di PBS (Tampone fosfato salino) . Altri gruppi di controllo per la proteina di fusione (gene 10) e l' adiuvante (adiuvante completo di Freund) sono stati pure inclusi.
Nell'esperimento 1, l'attività protettiva di Sm-14 con o senza adiuvante (FCA) è stata analizzata in parallelo all'attività della proteina del gene 10 come si può vedere in Tabella II. La quantità media di parassiti recuperata da topi vaccinati con proteina del gene 10 purificata, con o senza FCA, erano essenzialmente le stesse recuperate da animali dei gruppi di controllo PBS.
Nell'esperimento 2 l'attività protettiva indotta da rSm-14 e rSm-14 con FCA è stata testata in confronto alla vaccinazione con SE (con o senza FCA).
Gli esperimenti 3 e 4 sono stati designati per testare l'attività del FCA da solo e la riproducibilità dell'attività protettiva indotta per vaccinazione con rSm-14.
In tutti gli esperimenti l'alta capacità di rSm-14 di indurre livelli sufficientemente alti di immuno-protezione contro ulteriori infezioni dei topi con S.mansoni è definitivamente dimostrata.
L'analisi statistica dei dati presentati mostra che la quantità di parassiti recuperata dal gruppo vaccinato è significativamente più bassa (p<0,05) del numero di parassiti raccolto da animali infetti non vaccinati.
Esempio 3
Questo esempio mostra l'attività protettiva di SE e rSm-14
nei conigli.
I protocolli di immunizzazione sono gli stessi usati nei topi Swiss nell'esempio 2. Le quantità di dose/animale sono indicate in Tabella 11. 1 conigli sono stimolati immunologicamente con 1000 cercariae (invece di 100 come nell'esempio 2).
La Tabella II mostra la capacità di rSm-14 di indurre livelli significativamente alti di immuno protezione contro infezione di conigli con S.mansoni.
Inoltre l'esempio rende chiara l' attività di rSm-14 come antigene isolato in confronto con la miscela SE.
I risultati sono mostrati in Tabella II
Esempio 4
Questo esempio dimostra gli esperimenti 1-4 dell'esempio 2 (il che significa che si sono usati gli stessi protocolli di immunizzazione) ma con una metodologia diversa per valutare la protezione.
La metodologia è basata sulla determinazione di resistenza indotta dal vaccino per mezzo di un'analisi della popolazione delle frequenze di presenza dei parassiti attraverso la distribuzione della presenza di parassiti in una serie di intervalli di parassiti.
I risultati sono mostrati in Tabella III.
Secondo la Tabella III la proteina di fusione ricombinante Sm-14 purificata stimola un livello di protezione che non è significativamente diverso da quello di SE intatto come determinato dai livelli medi di presenza dei parassiti (Tabella I).
I livelli di protezione raggiunti con SE sono consistenti con risultati già pubblicati. Di particolare interesse è il fatto che un livello simile di protezione è raggiunto con o senza adiuvante che depone bene all'uso dell'antigene nell'uomo. Inoltre il fatto che abbiamo protetto con successo gruppi di topi Swiss esogami con l’antigene mostra che la restrizione genetica del sistema immunitario non causa grosse variazioni della risposta protettiva.
Come può essere visto in tabella 111, si sono osservate distribuzioni completamente diverse di distribuzione dei parassiti in gruppi vaccinati e non vaccinati. Particolarmente macroscopica è la differenza nel numero dei topi nel gruppo con 0-10 parassiti. A seguito dell'infezione di 100 cercariae/topo nessuno dei topi non vaccinati aveva livelli di infezione in questo intervallo e picco di frequenza (60%) per animali infetti (non vaccinati) era nell'intervallo 21-30 parassiti. Al contrario il picco di frequenza (64,5%) per topi vaccinati con SE o rSm-14 cadeva all'interno di 0-10 parassiti/topo.
Come si può vedere secondo la presente invenzione è di particolare interesse che essenzialmente la totalità dell'effetto protettivo della miscela complessa SE può essere riprodotto con il singolo antigene. Tentativi con altri antigeni definiti derivati da SE (glutatione-S-transferasi e paramisina) non risultavano in altrettanto alti livelli di protezione. Come detto sopra Sm-14 ha anche un significativo livello di omologia con varie proteine che legano gli acidi grassi.
I risultati, mostrati in Tabella III, degli esperimenti 1 - 4 sono dimostrati graficamente nelle figure 3 ~ 6.
Le figure 3 - 6 corrispondono agli esperimenti 1-4. In queste figure è possibile valutare la protezione attraverso l'analisi dei profili di popolazione della presenza di parassiti di gruppi vaccinati contro non-vaccinati.
La figura 7 mostra risultati complessivi.
Esempio 5
In questo esempio topi vaccinati sono stati stimolati immunologicamente con 500 e 1000 cerc/animale o stimolati immunologicamente 2 o 3 volte (100 cerc/animale/infezione) ad intervalli di una settimana. Come si può notare dimensione e numero delle infezioni variano.
La protezione indotta da tre dosi da 10 ug di proteina (rSm-14) iniettata rimane superiore al 50% contro un'infezione singola di 500 o 1000 cerc/animale. Lo stesso effetto si osserva quando l'infezione di 100 cerc/animale è ripetuta per 2 o 3 volte mantenendo un intervallo di una settimana fra ogni infezione. I protocolli per questo esempio sono come segue.
I dati dell'esempio 5 sono raccolti nelle Tabelle IV e V rispettivamente.
Esempio 6
Per dimostrare la reattività di sieri da pazienti affetti da schistosomiasi contro proteine leganti acidi grassi da Schistosoma mansoni - rSm-14,l'esempio è eseguito come segue. I sieri da pazienti umani da un'area endemica brasiliana e sieri da giovani viventi fuori dell'area endemica sono testati per immunoblot contro l'antigene ricombinante Sm-14. 1 pazienti sono classificati in gruppi secondo la forma clinica e la conta di uova. La diagnosi parasitologica è eseguita con il metodo di Kato-Katz.
I riusltati mostrano che sieri da tutti gli individui infetti riconoscevano rSm-14 all’immunoblotting indipendentemente da età, della presenza di parassita o forma clinica, riflettendo cosi l'immunogenicità di rSm-14.
Esempio 7
Questo esempio mostra la vaccinazione di topi Swiss con rSm-14 contro infezione con Fasciola hepatica e la completa protezione raggiunta contro fascioliasi.
L'esempio 7 è stato condotto come segue.
Due gruppi di 15 topi sono stati immunizzati con rSm-14 con o senza adiuvante. Il protocollo di vaccinazione è: (a) due iniezioni settimanali di antigene (19μg/dose/animale/rSm-14) emulsionato o meno in FCA (adiuvante), (b) applicazione di una nuova dose di iniezioni di antigene tre settimane più tardi, (c) 45 giorni dopo la terza dose gli animali sono stati stimolati immunologicamente con tre metacercariae di Fasciola hepatica e sacrificati 30 giorni dopo l'infezione.
Questo esempio mostra antigeni protettivi reattivo-incrociati fra diversi elminti come Schistosomi e Fasciola hepatica.
E' stato recentemente riportato che un antigene denominato FShl5 clonato da parassiti correlati, il distoma epatico Fasciola hepatica, ha una significativa omologia, a livello della sequenza di aminoacidi predetta, con Sm-14 e presenta risultati che dimostrano che Sm-14 è omologo di questa proteina in Fasciola hepatica.
Sm-14 ricombinante è stato testato come antigene vaccinante contro infezione da Fasciola hepatica come descritto in questo Esempio.
Riferimenti alle figure 9, 10 e 11 seguiranno e mostreranno il fegato di animali non vaccinati (fig. 9 e 10) e quello di animali vaccinati (fig. 11).
Dopo il test parassitologico per valutare l'infezione da Fasciola hepatica degli animali vaccinati con Sm-14 e non vaccinati (controlli), sottoposti ad analoga infezione con tre metacercariae/topo, fegato, intestini e altri organi sono stati esaminati con le classiche modalità istologiche per valutare la patologia sviluppatasi negli animali dei due gruppi. E' bene notare che fegato e intestino sono gli organi principalmente affetti da Fasciola hepatica e quindi questi sono stati esaminati con particolare cura.
Così trenta giorni dopo infezione orale con i metodi classici con tre metacercariae di Fasciola hepatica per topo, gli animali sono stati sacrificati per la valutazione degli effetti causati dall'infezione in presenza della vaccinazione con Sm-14 in confronto agli animali non vaccinati. Gli organi sono fissati in soluzione di Milloning, tagliati, colorati con tecnica ematossilina-eosina, ed esaminati al microscopio ottico.
E' dimostrato in modo definitivo dalle figure 8, 9. 10 ed 11 che rSm-14 è capace di indurre protezione contro Fasciola hepatica sulla base di dati parassitologici e anatomico-patologici. Fra gli animali vaccinati con rSm-14 praticamente nessuno aveva contratto l'infezione dopo esposizione a tre (massima dose permessa per topo) metacercariae di Fasciola hepatica. Al contrario tutti i controlli non vaccinati sono risultati infetti dopo analoga infezione.
Dal punto di vista anatomico-patologico il parenchima epatico di tutti gli individui vaccinati con rSm-14 non mostrava alterazioni dovute a Fasciola hepatica a parte piccole aree fibrotiche a livello della capsula di Glisson. I dati mostrano che i parassiti stimolati immunologicamente sono stati uccisi per effetto della vaccinazione ad uno stadio precoce del loro ciclo vitale nel vertebrato. Al contrario tutti gli animali non vaccinati/infettati mostravano vaste aree di distruzione di epatociti con regioni emoraggiche intense ed estese fino alla capsula di Glisson.
Come si può vedere dalle figure 9 e 10 una estesa distruzione del parenchima poteva essere osservata unitamente alla presenza di parassiti adulti in molti individui
Tabella I
ATTIVITÀ' PROTETTIVA DI SE E rSm 14 IN TOPI SWISS
n° di topi presenza di Protezione Antigene (3dosi) parassita %
Tabella II
ATTIVITÀ' PROTETTIVA DI SE E rSm 14 IN CONIGLI (NUOVA ZELANDA)
Numero di conigli X =sem Protezione Antigena FCA 3 dosi (% )
Tabella III Attività protettiva di rSm 14 in topi esogami Descrizione di frequenza presenza parassiti
Esperimento 1
n
Claims (22)
- RIVENDICAZIONI 1 . Sm-14 , una proteina avente peso molecolare compreso fra 14 e 15 kDa derivata da Schistosoma mansoni la cui sequenza grassi , caratterizzata da antigenicità protettiva contro infezioni da elminti fino al 100 % in animali da laboratorio ottenuta per vaccinazione con fino a 3 dosi di 10 μg 0 meno della proteina in forma nativa, ricombinante o sintetica, in presenza o meno di adiuvante.
- 2. Sm-14 secondo la rivendicazione 1 caratterizzata dal fatto che detta Sm-14 è formata da una catena polipeptidica ripiegata in una struttura a 10 fogli pieghettati uniti da corti lacci come mostrato in figura 2.
- 3.Sm-14 secondo la rivendicazione 1 caratterizzata da antigenicità protettiva contro Schistosoma mansoni fino al 67,9% in topi Swiss esogami ottenuta per vaccinazione con tre dosi di 10μg o meno di proteina in forma nativa, ricombinante o sintetica in assenza di adiuvante.
- 4.Sm-14 secondo la rivendicazione 1 caratterizzato da antigenicità protettiva contro Schistosoma mansoni fino al 72,1% in topi Swiss esogami ottenuta per vaccinazione con 3 dosi di 10 μg o meno di proteina in forma nativa, ricombinante o sintetica in presenza di adiuvante completo di Freund.
- 5-Sm-14 secondo la rivendicazione 1 caratterizzato da antigenicità protettiva contro Schistosoma mansoni fino al 895 in conigli Nuova Zelanda ottenuta per vaccinazione con 3 dosi di 10 μg o meno di proteina in forma nativa, ricombinante o sintetica in presenza di adiuvante completo di Freund.
- 6. Sm-14 secondo la rivendicazione 1 caratterizzato da antigenicità protettiva contro Fasciola hepatica fino al 100% in topi esogami Swiss ottenuta per vaccinazione con 3 dosi di 10 pg o meno di proteina in forma nativa, ricombinante o sintetica in assenza di adiuvante.
- 7.rSm-14 caratterizzato dall'essere una proteina di fusione fra i primi 260 aminoacidi della proteina del capside del batteriofagio T7 ed il polipeptide completo Sm-14 come definito nella rivendicazione 1 ottenuto per legame fra il 260mo residuo di 260 aminoacidi della proteina del capside T7 - LEU - LEU - THR - LEU - THR - LYS - GLY - LYS - ALA - LYS - SER - ALA - GLU - LEU - GLU - PHE - VAL - ASP - LEU - GLU - GLY - SER - VAL - Sml4.
- 8.rSm-14 definito come nella rivendicazione 7 dove la proteina T7 è sostituita da qualsiasi altra proteina.
- 9- rSm-14 secondo le rivendicazioni 7 e 8 ottenuta per espressione in microorganismi e opportuna purificazione.
- 10. rSm-14 secondo le rivendicazioni 7 e 8 ottenuta per espressione in Escherichia coli.
- 11. rSm-14 secondo le rivendicazioni 9 e 10 caratterizzata da purificazione iniziale della proteina di fusione espressa per sonicazione, ripetute lisi e centrifugazioni e purificazione finale per elettroeluizione con gel SDS-PAGE.
- 12. rSm-14 secondo la rivendicazione 7 caratterizzata dall'essere ottenuta per sintesi chimica di tutta o parte della catena polipeptidica.
- 13.Uso di Sm-14 come definita nella rivendicazione 1 caratterizzata dall'essere un vaccino contro malattie causate da elminti
- 14. Uso di Sm-14 come definita nella rivendicazione 1 caratterizzata dall’essere un vaccino contro malattie causate da Fasciola hepatica.
- 15.Uso di Sm-14 come definita nella rivendicazione 1 caratterizzata dall'essere un vaccino contro malattie causate da schistosomi.
- 16.Uso di Sm-14 come definita nella rivendicazione 1 caratterizzata dall'essere un vaccino contro malattie causate da Schistosoma mansoni.
- 17. Uso di Sm-14 come definita nelle rivendicazioni 7 e 8 caratterizzata dall'essere un vaccino contro malattie causate da elminti.
- 18.Uso di Sm-14 come definita nelle rivendicazioni 7 e 8 caratterizzata dall'essere un vaccino contro malattie causate da Fasciola hepatica.
- 19-Uso di Sm-14 come definita nelle rivendicazioni 7 e 8 caratterizzata dall'essere un vaccino contro malattie causate da schistosomi.
- 20.Uso di Sm-14 come definita nelle rivendicazioni 7 e 8 caratterizzata dall'essere un vaccino contro malattie causate da Schistosoma mansoni.
- 21.Uso di proteine di fusione ricombinanti come definite nella rivendicazione 6 in cui Sm-14 è sostituita da qualsiasi altra proteina come vaccino umano o veterinario.
- 22. Uso di Sm-14 come definito nella rivendicazione 1 caratterizzato dall'essere un reagente diagnostico per schistosomiasi e fascioliasi. 24. metodo per l'applicazione un vaccino veterinario nell'uomo che comprende i seguenti passaggi: -effettuare l'isolamento di un comune antigene reattivo incrociato che protegge sia contro malattie dell'uomo che degli animali -testare l'antigene come vaccino per l'immunoprofilassi della malattia negli animali nell'animale ospite per il parassita che causa infezione e/o malattia -analizzare le informazioni derivate dalla vaccinazione dell'animale ospite e -focalizzare tutte le questioni relative e i prerequisiti per l’applicazione del vaccino veterinario contro malattie nell'uomo.
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