ITMI940301A1 - Metodo per elaborazione di dati elettroforetici - Google Patents

Description

METODO PER ELABORAZIONE DI DATI ELETTROFORETICI

La presente invenzione riguarda in generale una tecnica per elaborare ed analizzare dati ottenuti con un dispositivo elettroforetico.

Nei dispositivi elettroforetici, campioni, quali campioni di siero sanguigno, sono applicati su un substrato, quale una pellicola di acetato di cellulosa mediante un applicatore e quindi il substrato viene introdotto in un recipiente elettroforetico. Il substrato viene quindi successivamente colorato, decolorato ed essiccato, per ottenere immagini elettroforetiche. Quindi il substrato viene introdotto in un densitometro contenente una decalina per visualizzare le immagini elettroforetiche di vari componenti dei campioni di siero. L'immagine elettroforetica è chiamata talvolta elettroforegramma. Le immagini elettroforetiche vengono allora analizzate da un fascio luminoso per ricavare segnali di immagini elettroforetiche. I segnali di immagini elettroforetiche vengono allora elaborati per ricavare percentuali di frazioni di albumina (Alb), o^-globulina (c^-G), ^ -globulina (a2~G), β-globulina (β) e ^-globulina un rapporto A/G tra percentuale di frazione di albumina e percentuale totale di a1-G, a2-G B P e 6 valori di concentrazioni assolute di tali proteine vengono calcolati e stampati su un referto di esame insieme ad un’immagine rappresentante 1'elettroforegramma. Questa immagine è detta anche elettroforegramma o densitogramma. I densitogrammi sono anche visualizzati su un dispositivo di visualizzazione quale un tubo a raggi catodici.

Nei dispositivi elettroforetici noti, l elettroforegramma è sottoposto ad un controllo automatico di intervallo in modo che un picco della frazione di albumina che ha normalmente il valore più elevato assuma sempre un livello costante dato. In questo caso non si potrebbero rilevare variazioni di valori assoluti di varie sostanze. Inoltre, nel metodo noto di analisi ed elaborazione dell'immagine elettroforetica è difficile trovare dati o informazioni importanti quali esistenza di proteina monoclonale (proteina M), differenza o variazione di mobilità elettroforetica ed esistenza di configurazioni specifiche quali -soppressione, formazione di ponti β- ed anticipo. Perciò, per diagnosticare vari tipi di malattie con l'ausilio dell'elettroforegramma noto, occorre personale notevolmente specializzato.

Per ovviare a tale problema, nel brevetto U.S. N° 4920 498 emesso il 24 aprile 1990 si propone un metodo di visualizzazione dell 'elettroforegramma di un campione insieme all'elettroforegramma di un campione standard, anch'esso applicato sul substrato sul quale è applicato il campione, mentre una lunghezza di estensione elettroforetica dell'elettroforegramma del campione viene normalizzata con l'ausilio dell'elettroforegramma del campione standard e visualizzata su uno schermo di visualizzazione insieme all'elettroforegramma del campione standard.

In questo metodo, gli elettroforegrammi del campione e del campione standard sono visualizzati sullo schermo di controllo affiancati, cosi che si possa effettuare agevolmente l'analisi visuale di malattie. Tuttavia, in questo metodo, è possibile solo valutare malattia o condizione di un paziente al tempo in cui viene effettuato l'esame elettroforetico, ma non si può controllare con precisione il decorso della malattia. Ad esempio, quando un paziente è in ospedale, è noto che il paziente ha una qualche anormalità, e non è quindi tanto importante valutare se un campione di tale paziente è normale o anormale, quanto piuttosto valutare il decorso della malattia. Inoltre, in un ospedale relativamente grande, si ha una pluralità di dispositivi elettroforetici, così che una pluralità di campioni ottenuti dallo stesso paziente possono essere analizzati da dispositivi elettroforetici differenti. In questo caso, i dati elettroforetici potrebbero essere influenzati da differenze nei vari dispositivi elettroforetici. Benché detti campioni siano analizzati dallo stesso dispositivo, possono variare le condizioni in cui sono analizzate in date differenti. Perciò possono variare le condizioni analitiche per una pluralità di campioni derivanti dallo stesso paziente. Ciò provoca il problema che i risultati di analisi non possono essere comparati direttamente l’uno con l'altro e quindi non può essere controllato esattamente il decorso della malattia del paziente in questione.

La presente invenzione ha lo scopo di fornire un metodo nuovo ed utile di visualizzazione di dati elettroforetici ottenuti con dispositivi elettroforetici nel quale la variazione della densità di immagini di frazioni può essere controllata agevolmente e con precisione anche se variano condizioni analitiche quali quantità di campioni applicati a substrati e lunghezze di estensione elettroforetica, cosi che si possa valutare decorso o cambiamento di malattia in modo agevole, e precisamente controllando densitogrammi visualizzati.

In base ad un primo aspetto dell’invenzione, un metodo per elaborare dati elettroforetici ottenuti sottoponendo almeno un campione di almeno un paziente ed almeno un campione standard applicati entrambi su uno stesso substrato ad elettroforesi per ricavare almeno un elettroforegramma di campione di detto almeno un campione ed almeno un elettroforegramma standard di detto campione standard ed analizzando fotoelettricamente detti elettroforegramma di campione ed elettroforegramma standard comprende le fasi di: immagazzinare segnali di dati di campioni ricavati analizzando fotoelettricamente gli elettroforegrammi di campioni e segnali di dati di riferimento ricavati analizzando fotoelettricamente detti elettroforegrammi standard; reperire una pluralità di segnali di dati di campioni di uno stesso paziente ed una pluralità di segnali di dati di riferimento relativi alla stessa pluralità di segnali di dati di campioni, sia detti segnali di dati di campioni, sia detti segnali di dati di riferimento essendo ottenuti in tempi differenti o in condizioni analitiche differenti; normalizzare ciascuno dei dati di campioni così reperiti dello stesso paziente con riferimento ad uno corrispondente di segnali di dati di riferimento reperiti per ricavare una pluralità di segnali di dati di campioni normalizzati; e visualizzare detta pluralità di segnali di dati di campioni normalizzati su mezzi di visualizzazione come densitogrammi.

In base ad un secondo aspetto della presente invenzione, un metodo per elaborare dati elettroforetici ottenuti sottoponendo uno o più campioni di uno o più pazienti ed almeno un campione standard applicati entrambi su uno stesso substrato ad elettroforesi per ricavare elettroforegrammi di uno o più campioni di detti uno o più campioni ed almeno un elettroforegramma standard di detto campione standard ed analizzando fotoelettricamente detti elettroforegrammi di campioni ed elettroforegramma standard comprende le fasi di: normalizzare segnali di dati di campioni ricavati analizzando fotoelettricamente detti elettroforegrammi di campioni sullo stesso substrato con riferimento ad un segnale di dati di riferimento ricavato analizzando fotoelettricamente detti elettroforegrammi standard.formati sullo stesso substrato per ricavare segnali di dati di campioni normalizzati; immagazzinare detti segnali di dati di campioni normalizzati; reperire una pluralità di segnali di dati di campioni normalizzati di uno stesso paziente, detti segnali di dati di campioni normalizzati essendo ottenuti in tempi differenti o in condizioni analitiche differenti; e visualizzare la così reperita pluralità di segnali di dati di campioni normalizzati su mezzi di visualizzazione come densitogrammi.

In una forma di realizzazione preferibile del metodo secondo l’invenzione, la pluralità reperita e normalizzata di segnali di dati di campioni sono visualizzati sui mezzi di visualizzazione in modo tale che una pluralità di densitogrammi o elettroforegrammi rappresentati da segnali di dati di campioni normalizzati siano visualizzati in modo sovrapposto.

Inoltre, in base ad un'altra forma di realizzazione preferibile, il metodo secondo l'invenzione comprende inoltre le fasi di: rilevare posizione e grandezza o posizione e forma di almeno una porzione specìfica di un elettroforegramma; e classificare un tipo di detta specìfica porzione in base alla posizione e grandezza o posizione e forma.

In base ad un'altra forma di realizzazione preferibile dell'invenzione, detto tipo classificato della porzione specifica e la sua posione sono visualizzati sui mezzi di visualizzazione insieme agli elettroforegrammi.

Nei disegni allegati:

fig. 1 è una vista schematica che mostra un densitometro per analizzare immagini elettroforetiche su un substrato;

fig. 2 è una vista schematica in pianta che illustra un modo per analizzare l'immagine elettroforetica;

fig. 3 è uno schema a blocchi che rappresenta una forma di realizzazione di un dispositivo per applicare il metodo secondo 1'invenzione;

fig. 4 è un diagramma di flusso che rappresenta fasi successive in una forma di realizzazione del metodo secondo l'invenzione;

fig. 5 è un diagramma di flusso che indica il processo di normalizzazione;

fig. 6 è una vista schematica che mostra un modo di determinare punti di riferimento sull'immagine elettroforetica;

figg. 7A e 7B sono viste schematiche che illustrano forme di realizzazione della visualizzazione sovrapposta;

fig. 8 è una vista schematica che mostra un'altra forma di realizzazione della visualizzazione sovrapposta;

fig. 9 è una vista schematica che rappresenta un'altra forma di realizzazione della visualizzazione sovrapposta;

fig. 10 è una vista schematica che rappresenta un'altra forma di realizzazione della visualizzazione sovrapposta;

fig. 11 è una vista schematica che mostra ancora un'altra forma di realizzazione della visualizzazione sovrapposta;

fig. 12 è un diagramma di flusso che rappresenta fasi successive di un'altra forma di realizzazione del metodo secondo 1 'invenzione;

figg. 13A, 13B e 13C sono viste schematiche che mostrano un processo per rilevare la proteina M;

fig. 14 è un diagramma di flusso che rappresenta fasi sue-, cessive per rilevare la proteina M;

fig. 15 è un grafico per esporre un metodo di calcolo del valore di picco;

fig. 16 è un grafico per esporre un altro metodo di calcolo di valore di picco;

fig. 17 è un diagramma di flusso che rappresenta fasi successive per classificare il picco M;

fig. 18 è una vista schematica che mostra una visualizzazione in caso di proteina M maligna;

fig. 19 è una vista schematica illustrante una visualizzazione in caso di rilevazione di una piccola quantità di proteina M;

fig. 20 è una vista schematica che rappresenta una visualizzazione in caso di traccia di applicazione di campione;

fig. 21 è una vista schematica che mostra una visualizzazione in caso di fibrinogeno; e

fig. 22 è una vista schematica che mostra una visualizzazione in caso di complemento C3.

La fig. 1 è una vista che mostra uno schema di principio di costruzione di un densitometro per analizzare fotoelettricamente elettroforegrammi formati su un substrato 1. Sul substrato 1 sono stati applicati, mediante un applicatore adeguato, uno o più campioni di siero di uno o più pazienti ed almeno un campione di siero standard e tali campioni e campioni standard sono sottoposti ad elettroforesi, colorazione, decolorazione ed essiccazione. li sub-, strato 1 è introdotto da rulli di alimentazione in una sezione di fotometria 4 contenente decalina 3 per rendere trasparente il substrato 1. Il substrato 1 è sottoposto a fotometria da parte di un dispositivo fotometro 5 e viene quindi scaricato mediante rulli di scarico 6. Il dispositivo fotometro 5 comprende una sorgente luminosa 5a per emettere un fascio luminoso ed un elemento ricevitore di luce 5b per ricevere un fascio luminoso trasmesso attraverso il substrato 1. Il dispositivo fotometro 5 viene mosso ad una velocità costante, ad esempio di 8 mm/sec in una direzione di scansione b perpendicolare ad una direzione di alimentazione a del substrato 1, come mostrato in fig. 2. In questo modo elettroforegrammi o immagini elettroforetiche 7 di vari componenti contenuti in campioni e campione standard sono formati sul substrato 1 e sono analizzati fotoelettricamente per ricavare segnali di immagini elettroforetiche. Nella presente descrizione, un segnale di immagini elettroforetiche ottenuto analizzando un elettroforegramma di un campione di un paziente è detto segnale di dati di campione ed un segnale di immagini elettroforetiche ottenuto analizzando un elettroforegramma di un campione standard è detto segnale di dati di riferimento.

La fig. 3 è uno schema a blocchi che illustra una forma di realizzazione di un dispositivo per applicare il metodo di elaborazione di dati elettroforetici secondo l'invenzione. Nella presente forma di realizzazione, si devono analizzare vari tipi di proteine contenute in campioni di siero. Una o più serie di elettroforegrammi di uno o più campioni di siero sono formate su un substrato 1 e sono analizzati fotoelettricamente da un densitometro comprendente la sorgente luminosa 5a e l'elemento ricevitore di luce 5b. La sorgente luminosa 5a e l'elemento ricevitore di luce 5b sono spostati nella direzione di scansione rispetto al substrato 1 ad una velocità costante. Un segnale di uscita dell'elemento ricevitore di luce 5b è amplificato da un amplificatore logaritmico 12 ed è convertito in un segnale rappresentante una assorbanza ottica dell'elettroforegramma, cioè immagini di frazioni di vari tipi di componenti. Perciò questo segnale è detto anche segnale di immagini elettroforetiche. Allora il segnale di immagini elettroforetiche viene campionato e convertito in campioni di dati digitali da un convertitore A/D 13 in sincronismo con impulsi di orologio aventi un periodo di ripetizione corrispondente ad un periodo di campionatura che può essere determinato in base a condizioni analitiche quali tempo elettroforetico. In questa forma di realizzazione, il periodo di campionatura è posto uguale a 12 ms ed il tempo elettroforetico è posto uguale a quaranta minuti. I campioni di dati digitali sono forniti ad una memoria 15 ed ivi immagazzinati sotto il controllo di un'unità centrale di elaborazione (CPU) 14. Il dispositivo comprende tastiera 16 ed un dispositivo di visualizzazione 17 per visualizzare vari dati quali elettroforegrammi e per introdurre e controllare vari comandi. Il dispositivo di visualizzazione 17 è formato da un tubo a raggi catodici (CRT). Il dispositivo comprende inoltre disco flessibile 18 e stampante 19.

Nella presente forma di realizzazione, dopo che i campioni di dati immagazzinati nella memoria 15 sono stati sottoposti al trattamento di livellamento ed al trattamento di auto-zero per eliminare ogni fluttuazione di linea di base dovuta a variazione in intensità di luce emessa dalla sorgente luminosa 5a, i campioni di dati sono sottoposti a vari processi quali normalizzazione. Allora le percentuali di frazioni ed il rapporto A/G vengono calcolati e visualizzati su CRT 17 insieme a densitogrammi. I dati sono immagazzinati nel disco flessibile 18.

La fig. 4 è un diagramma di flusso che mostra fasi successive di una forma di realizzazione del metodo secondo l'invenzione. In una data X un campione A viene estratto da un paziente ed applicato su un substrato insieme ad un campione standard, questi campioni sono sottoposti all'elettroforesi ottenendo elettroforegrammi del campione di paziente e del campione standard, gli elettroforegrammi vengono analizzati fotoelettricamente per ricavare una prima serie di segnale di dati di campione e segnale di dati di riferimento e la prima serie di segnali di dati di campione e segnale di dati di riferimento così ottenuta è immagazzinata nel disco flessibile 18. In un'altra data Y un campione B dello stesso paziente viene applicato su un substrato insieme ad un campione standard e questi campioni sono elaborati allo stesso modo esposto sopra ottenendo un'altra serie di segnali di dati di campioni e segnali di dati di riferimento e questi segnali sono immagazzinati nel disco flessibile 18. In tal modo una pluralità di campioni provenienti dallo stesso paziente sono stati sottoposti all’elettroforesi insieme a campioni standard per ricavare una pluralità di serie di segnali di dati di campioni e segnali di dati di riferimento, e queste serie multiple di segnali sono state immagazzinate nel disco flessibile 18 insieme ad un gran numero di serie di segnali di diversi pazienti. Quando occorre controllare la variazione della malattia di un paziente, vengono reperite più serie di segnali di dati di campioni e segnali di dati di riferimento con riferimento ad un nome di paziente o codice di identificazione di paziente ed i segnali di dati di campioni e di riferimento così reperiti sono immagazzinati nella memoria 15. Allora ciascuno di una pluralità di segnali di dati di campioni viene normalizzato con riferimento ad un corrispondente segnale di dati di riferimento per ricavare una pluralità di segnali di dati di campioni normalizzati, infine, la così ottenuta pluralità di segnali di dati di campioni sono forniti a CRT 17 ed elettroforegrammi normalizzati del paziente in questione sono visualizzati su di esso in modo sovrapposto. Un'immagine visualizzata su CRT 17 può essere registrata su un referto di esame 20 mediante la stampante 19. Sul referto di esame 20 sono pure registrate variazioni nelle percentuali di frazioni.

La fig. 5 è un diagramma di flusso che mostra una forma dì realizzazione del processo di normalizzazione secondo 1'invenzione. Nella presente forma di realizzazione un elettroforegramma avente una data lunghezza di estensione elettroforetica è rappresentato da 350 campioni di dati ed un punto di picco stabile di una frazione di albumina è fatto coincidere con un centesimo punto ed un punto di picco stabile della frazione β-globulina è posto ad un duecentesimo punto. Occorre notare che il numero di campioni di dati ottenuti per conversione A/D del segnale di immagine è maggiore di 350.

Nel processo di normalizzazione, in una prima fase SI vengono rilevati punti di riferimento su vari elettroforegrammi. I punti di riferimento sono posti come punti di picco delle frazioni albumina e β-globulina e sono rilevati dai campioni di dati immagazzinati nella memoria 15. Si esporranno ora diversi metodi di rilevazione dei punti di riferimento.

I campioni di dati sono comparati con un livello di soglia per estrarre una serie di campioni di dati che superano il livello di soglia come mostrato in fig. 6. Detto livello di soglia è determinato tale che entrambi i punti estremi delle serie estratte di campioni di dati siano resi sostanzialmente coincidenti con punti estremi della lunghezza di estensione elettroforetica. Allora vengono rilevati picchi rispettivamente negli intervalli 1^ ed 12, gli intervalli l1 ed essendo determinati rispettivamente sulla base dei punti sinistro e destro delle serie estratte di campioni di dati. Un picco avente la concentrazione più elevata nell'intervallo 11 si suppone sia allora il picco della frazione di albumina ed un picco rilevato nell'intervallo 12 viene determinato come il picco della frazione di β-globulina. In questo modo si possono rilevare i punti di riferimento dell'elettroforegramma.

Una serie di campioni di dati vengono accumulati successivamente dai due punti di estremità della serie e, quando i valori accumulati raggiungono valori predeterminati, rispettivamente, vengono determinate posizioni di campioni relative come punti estremi del densitogramma. Allora i picchi di albumina e β-globulìna sono rilevati negli intervalli ^ ed 12 allo stesso modo che nel primo metodo. Ad esempio, quando un valore accumulato di campioni di dati dall'estremità sinistra, cioè da un lato di polarità positiva, alla frazione di albumina diventa uguale a due percentuali di un valore accumulato totale e quando un valore accumulato dall'estremità destra, cioè da un lato di polarità negativa di immagine di if-globulina, diventa uguale ad una percentuale del valore di accumulazione totale, è possibile estrarre campioni di dati che rappresentano l immagine elettroforetica che corrisponde sostanzialmente alla lunghezza di estensione elettroforetica ottenuta dall'ispezione ad occhio nudo.

Sul substrato viene anche applicato un campione normale o standard per formare un'immagine elettroforetica standard del campione normale. Allora l'immagine elettroforetica standard viene analizzata per ricavare una serie di campioni di dati standard. Allora viene rilevata una posizione di picco della frazione di albumina del campione standard e quindi viene rilevata una posizione di picco di β-globulina come terzo picco contato dal picco di albumina verso il lato di polarità negativa. Quindi viene rilevato un punto di picco di frazione di albumina di un campione in esame rilevando un picco prossimo ad una posizione che è spostata verso il lato di polarità negativa di una distanza che e uguale alla distanza fra il picco di albumina e il picco di β-globulina del campione standard. In questo metodo, il punto di picco della frazione di albumina può essere rilevato comparando i campioni di dati con un livello di soglia avente un valore relativamente grande, dato che il picco di albumina ha un'altezza notevolmente grande. Inoltre il picco della frazione di albumina può essere rilevato col metodo descritto nel brevetto U.S. N° 4666 577. In questo metodo, dapprima viene rilevato il valore di picco massimo DJJ fra tutti campioni di dati e quindi viene rilevata una posizione PM di un primo picco che supera un livello di soglia uguale ad un sedicesimo di come picco di albumina dal lato di polarità positiva. Occorre notare che il livello di soglia Dw/16 viene determinato sperimentalmente in modo che si possa ignorare con sicurezza un picco di frazione prealbumina, ed anche se Dw non è il picco di albumina, il picco di albumina possa essere rilevato positivamente. E' possibile usare un valore di soglia diverso da Dj^/16. Cioè il livello di soglia può essere determinato sperimentalmente con riferimento a tipi di malattie ad un valore adatto con cui la posizione P^ può essere rilevata come un picco della frazione di albumina.

Nel modo esposto sopra, è possibile rilevare la posizione di picco della frazione di albumina che ha normalmente un valore notevolmente alto e la posizione di picco della frazione di β-globulina la cui posizione nell elettroforegramma è molto stabile.

In una successiva fase S2 in fig. 5, i campioni di dati sono normalizzati sull'asse X in modo che il picco di albumina ed il picco di β-globulina siano resi coincidenti con punti predeterminati sull'elettroforegramma, ad esempio, rispettivamente il centesimo punto di dati e il duecentesimo punto di dati. Ad esempio, quando il picco di albumina e il picco di β-globulina rilevati del campione di siero sono rispettivamente su un centoventesimo (1202) punto e su un duecentotrentesimo (2302) punto, la distanza fra tali punti è uguale a 230-120=110. Allora i campioni di dati sono spostati sull'asse X secondo un rapporto fra detta distanza 110 ed una distanza standard di 100 (=200-100) ed i picchi di albumina e β-globulina sono resi coincidenti rispettivamente con i punti 1002 e 200fi. Se uno o più campioni di dati corrispondenti a punti di dati sull'asse X sono non esistenti nei campioni di dati rilevati del campione in esame, si devono formare campioni di dati per interpolazione .

In questo modo viene effettuata la normalizzazione dell'asse X. Allora il numero di campioni di dati è reso uguale al valore standard di 350 ed il picco di albumina e il picco di β-globulina sono posti nelle posizioni predeterminate, rispettivamente dei punti 1002 e 2002.

Quindi, in una fase S3 in fig.*5, viene effettuata la normalizzazione sull'asse Y in base al rapporto fra il numero di campioni di dati del campione in esame fra i due punti di riferimento ed il numero di campioni fra i due punti predeterminati sull'asse X. Nell'esempio precedente, il rapporto è uguale a 110/100. Cioè valori di 350 campioni di dati sono moltiplicati per il rapporto 110/100. Allora il valore accumulato dei 350 campioni normalizzati è reso sostanzialmente uguale ad un valore accumulato di campioni non normalizzati del campione in esame fra punti di picco corrispondenti. Cioè, nell'esempio precedente, ciascuno dei 350 campioni di dati viene moltiplicato per 110/100 effettuando la normalizzazione sull'asse Y.

I processi precedenti sono effettuati prelevando i campioni di dati dalla memoria 15 sotto il controllo della CPU 14 ed i campioni di dati normalizzati vengono immagazzinati nel disco flessibile 18.

In una fase successiva S4, viene effettuata la normalizzazione di concentrazione correlando valori di accumulazione di rispettive immagini di frazioni a valori di concentrazioni assolute di proteine rispettive nel campione in esame. A tal fine, una quantità totale delle proteine o una quantità di albumina viene misurata da un analizzatore chimico previsto separatamente dal dispositivo elettroforetico e la quantità così misurata viene introdotta mediante la tastiera 16 o direttamente dall'analizzatore o da un sistema di elaborazione di controllo connesso all'analizzatore in modo in linea o fuori linea. I dati così introdotti sono immagazzinati nel disco flessibile 18. Contemporaneamente, un valore di accumulazione di riferimento per una densità unitaria (1 g/dl) del valore di concentrazione assoluta misurata è pure immagazzinato nel disco flessibile 18. Ad esempio, quando viene introdotto il valore di concentrazione di albumina, il valore di accumulazione di riferimento per concentrazione unitaria {1 g/dl) di albumina è posto uguale, ad esempio, a 15000 (A/Valore convertito) . Allora, se viene introdotta la concentrazione di albumina di 4 g/dl, viene dapprima calcolato un valore di accumulazione di frazione di albumina in base ai campioni di dati normalizzati e quindi si ricava un rapporto fra il valore così calcolato ed il valore di accumulazione di riferimento corrispondente alla concentrazione di albumina. Ad esempio, se il valore di accumulazione della frazione di albumina normalizzata è uguale ad 80 000 (valore convertito A/D), il valore di accumulazione di riferimento diventa uguale a 4 (g/dl)xl5000=60000. Allora viene calcolato il rapporto 60000/80 000=0,75. La normalizzazione per concentrazione viene allora effettuata moltiplicando valori rispettivi dei campioni di dati per detto rapporto di 0,75. Durante questa normalizzazione per concentrazione è anche possibile correggere variazione di colore fra le immagini di frazioni come descritto nella pubblicazione di domanda di brevetto giapponese Kokai Sho 61-196154. Inoltre, nel caso di introduzione della quantità totale di proteine, il rapporto può essere ricavato similmente dividendo il valore di accumulazione di riferimento corrispondente alla quantità totale introdotta per un valore di accumulazione di tutte le frazioni.

Dopo che è stato effettuato il processo di normalizzazione per i campioni A e B nel modo esposto sopra, i densitogrammi di tali campioni vengono visualizzati su CRT 17 in modo sovrapposto e vengono registrati in una data area del referto di esame 20. Contemporaneamente vengono calcolati le percentuali di frazioni ed i rapporti di A/G di vari campioni e vengono visualizzati e registrati rispettivamente su CRT 17 e referto di esame 20.

Si esporranno ora diverse forme di realizzazione di visualizzazione di una pluralità di densitogrammi sul dispositivo di visualizzazione in modo sovrapposto.

In una forma di realizzazione mostrata in fig. 7A un densitogramma I del campione B è rappresentato da una curva tratteggiata e un densitogramma II del campione A è rappresentato da una curva intera. In una forma di realizzazione illustrata in fig. 7B, il densitogramma I del campione B è visualizzato da una linea sottile intera e il densitogramma II del campione A è contraddistinto da una curva spessa intera.

In una forma di realizzazione rappresentata in fig. 8, una area in cui il densitogramma II del campione A supera il densitogramma I del campione B è contraddistinta da un reticolo blu ed un'area in cui il densitogramma I del campione B supera il densitogramma II del campione A è rappresentata da un tratteggio rosso. Occorre notare che tali tipi di disegni e colori possono essere scelti arbitrariamente purché si possano distinguere l'uno dall'altro i due densitogrammi.

La fig. 9 mostra ancora un'altra forma di realizzazione della visualizzazione sovrapposta di una pluralità di densitogrammi dello stesso paziente. Nella presente forma di realizzazione, un densitogramma III di un paziente C e un densitogramma IV dello stesso paziente C che è ottenuto un mese dopo il primo densitogramma III sono visualizzati allo stesso modo della realizzazione mostrata in fig. 8 e, contemporaneamente, un densitogramma di riferimento V di un campione di siero standard viene visualizzato in modo sovrapposto. Occorre notare che il numero di densitogrammi visualizzati simultaneamente non è limitato a due, ma si può visualizzare in modo sovrapposto qualsivoglia numero di densitogrammi .

La fig. 10 mostra un'altra forma di realizzazione della visualizzazione sovrapposta. In questa forma di realizzazione, i densitogrammi I e II sono visualizzati allo stesso modo della forma di realizzazione mostrata in fig. 8 e contemporaneamente, direzioni di cambiamento di concentrazioni di varie frazioni sono indicate da frecce. Frecce dirette verso il basso e verso l'alto rappresentano rispettivamente diminuzione ed aumento di concentrazione ed una freccia orizzontale indica che la concentrazione non varia sostanzialmente. Occorre notare che, invece della freccia, si può usare qualunque segno che possa indicare la variazione di concentrazione.

Nelle forme di realizzazione mostrate nelle figg. 7-10, una pluralità di densitogrammi sono sovrapposti così da avere lo stesso asse X comune, ma, secondo l'invenzione, è anche possibile sovrapporre una pluralità di densitogrammi in modo tale che gli assi X dei densitogrammi siano spostati nella direzione dell'asse Y come illustrato in fig. 11. Cioè i densitogrammi sono sovrapposti su assi X differenti che sono separati fra loro nella direzione verticale di un passo costante. Anche in questo caso i densitogrammi possono essere comparati fra loro in modo agevole e preciso, in quanto sono normalizzati.

Nella presente forma di realizzazione, i campioni di dati dell ’elettroforegramma di campione in esame sono sottoposti alla normalizzazione sull'asse X, alla normalizzazione sull'asse Y ed alla normalizzazione per concentrazione in base alla quantità introdotta di una singola proteina o alla quantità totale introdotta di proteine ed una pluralità di densitogrammi dello stesso paziente sono visualizzati in modo sovrapposto. Perciò, anche se variano quantità di campioni di prova applicati su substrati e fluttuano lunghezze di estensione elettroforetica di elettroforegrammi di campioni di prova, gli elettroforegrammi formati dai ·campioni di dati normalizzati hanno la stessa lunghezza di estensione elettroforetica e le percentuali di frazioni di varie proteine rappresentano concentrazioni assolute di proteine in modo preciso.

E' perciò possibile ottenere 1'elettroforegramma normalizzato che rappresenta esattamente le concentrazioni di varie immagini di frazioni, così che si possa rilevare esattamente differenza di mobilità elettroforetica, esistenza di proteina M ed esistenza di forme d'onda o forme specifiche e si possano avere informazioni utili per diagnosi esatta di malattie.

Inoltre, i densitogrammi di un paziente sono visualizzati assieme ad una configurazione relativa al densitogramma del campione standard, così che è possibile conoscere agevolmente variazioni di concentrazione di varie immagini di frazioni e conrollare l'andamento o il decorso della malattia.

La fig. 12 è un diagramma di flusso che mostra un'altra forma di realizzazione del metodo di elaborazione di dati elettroforetici secondo l'invenzione. In una data X un campione A viene prelevato da un paziente ed applicato ad un substrato insieme ad un campione standard. Allora il substrato viene sottoposto ai processi elettroforetici ottenendo elettroforegrammi del campione A e di campione standard, e le immagini elettroforetiche così ottenute vengono analizzate fotoelettricamente per ricavare segnali di dati di campione e segnali di dati di riferimento. Allora il segnale di dati di campione viene normalizzato con riferimento al segnale di dati di riferimento ed un segnale di dati di campione normalizzato del campione A viene immagazzinato nel disco flessibile 18. In un'altra data Y, un campione B viene prelevato dallo stesso paziente ed applicato su un substrato insieme ad un campione standard che può essere o no identico al campione standard suaccennato. Il substrato viene allora sottoposto al processo elettroforetico per ottenere segnale di dati di campione e segnale di dati di riferimento ed allora il segnale di dati di campione viene normalizzato con riferimento al segnale di dati di riferimento ricavando un segnale di dati di campione normalizzato del campione B. Il segnale di dati di campione normalizzato così ottenuto del campione B viene immagazzinato nel disco flessibile 18.

Quando occorre controllare il procedere della malattia di un paziente, una pluralità di segnali di dati di campioni normalizzati appartenenti allo stesso paziente sono reperiti dal disco flessibile 18 ed i segnali di dati di campioni così reperiti sono forniti al dispositivo di visualizzazione 17 così che densitogrammi dello stesso paziente vengano visualizzati in modo sovrapposto. In questo caso, sono visualizzati anche altri dati, quali percentuali di frazioni e rapporti A/G. Questi densitogrammi e dati sono registrati sul referto di esame 20 mediante la stampante 19 in modo simile alla forma di realizzazione precedente.

Nella presente forma di realizzazione, i segnali di dati di campioni normalizzati sono immagazzinati nel disco flessibile 18, così che l'operazione di visualizzazione può effettuarsi a velocità elevata.

Occorre notare che la presente invenzione non è limitata alle forme di realizzazione esposte sopra, ma i tecnici del ramo possono fornirne variazioni e modificazioni nell'ambito dell'invenzione. Ad esempio, l'operazione di normalizzazione può essere effettuata solo sull'asse X o sugli assi X ed Y. Inoltre la normalizzazione sulla concentrazione può essere effettuata prima della normalizzazione sull'asse X. Inoltre, i punti di riferimento sull'immagine elettroforetica possono essere posti a picchi di immagini di frazioni diverse dalle frazioni di albumina e β-globulina o punti di estremità della lunghezza di estensione elettroforetica. Non è sempre necessario formare il campione standard come campione normale. Inoltre, l'immagine elettroforetica può essere analizzata fotoelettricamente mediante insieme lineare di sensori o insieme bidimensionale di sensori. Inoltre, i segnali di dati possono essere immagazzinati in disco rigido, disco optomagnetico o memoria flash invece che in disco flessibile.

In base ad un altro aspetto della presente invenzione, si rilevano sull'elettroforegramma uno o più punti o configurazioni specifici ed allora i punti o configurazioni specifici così rilevati vengono classificati.

Una delle configurazioni specifiche più importanti del-1 'elettroforegramma è un picco di proteina M. Il picco di proteina M può apparire in ogni punto sull'elettroforegramma, ma normalmente il picco di proteina M appare tra la frazione di β-globulina e la frazione di ^-globulina. Occorre notare che il picco di proteina M è prodotto da proteina monoclonale contenuta nel campione di siero in esame, e così il picco di proteina M appare come una punta monoclonale di larghezza ridotta. La proteina M può essere classificata in proteina M benigna e proteina M maligna. La proteina M benigna appare come una punta che è sovrapposta su un elettroforegrararaa normale, ma nella proteina M maligna una o più sostanze proteiche nell'elettroforegramma sono specificamente soppresse .

Date le suesposte proprietà specifiche della proteina M, è possibile rilevare il picco di proteina M valutando se esiste o no un picco appuntito tra la frazione di β-globulina e la frazione di ^-globulina. Come mostrato in fig. 13A, quando un elettroforegramma non comprende il picco di proteina M tra la frazione p e la frazione Y, vi sono avvallamenti e picchi dolci. Quando un campione in esame contiene proteina M benigna, si ha un picco addizionale tra la frazione p e la frazione Y, come illustrato in fig.

13B, così che l'elettroforegramma ha una forma o configurazione piuttosto complicata. Se un campione in esame comprende la proteina M maligna, appare un picco appuntito come mostrato in fig.

13C. Inoltre, in questo caso, la frazione Yè soppressa su ambo i lati del picco di proteina M.

Per rilevare solamente il picco di proteina M, è sufficiente rilevare se è esistente o no un picco tra la frazione p e la frazione Y , cioè tra il 200s e il 300£ punto di dati. Un tale metodo di rilevazione potrebbe tuttavia non valutare se il picco di proteina M rilevato è benigno o maligno. E' perciò necessario rilevare se la frazione Y è soppressa o no in prossimità del picco di proteina M rilevato con riferimento ai dati di intervallo normale del campione standard normale.

Si esporrà ora il metodo di rilevazione ed elaborazione della proteina M tra la frazione β e la frazione con riferimento ad un diagramma di flusso mostrato in fig. 14. Dopo che i campioni di dati dell'elettroforegramma di campione in esame sono stati normalizzati come esposto sopra, in una prima fase SI, viene rilevato il grado di un picco indicato nel seguito come valore di picco, entro ad un intervallo predeterminato corrispondente alla distanza tra la frazione β e la frazione Si esporranno ora diversi metodi di calcolo del valore di picco.

Nel primo metodo di calcolo di valore di picco si pone dapprima un intervallo di rilevazione avente una larghezza 2k da ambo i lati di un punto di dati i come illustrato in fig. 15. Si suppone che valori di dati in punti i-k, i ed i+k abbiano rispettivamente D^, Si calcola allora un'area S di una porzione circondata dall 'elettroforegramma e da una linea retta che connette il valore di dati <e D>j_+jt· <Ne>^ caso si adotti l'integrazione trapezoidale, detta area S può essere calcolata con la seguente equazione:

Ξ' evidente che l'area S può essere calcolata con metodi diversi dall'integrazione trapezoidale. Ad esempio si può utilizzare la regola di Simpson.

L'inventore ha confermato sperimentalmente che il valore di K può essere posto vantaggiosamente da 3 a 6. Se è posto minore di 3, benché sia possibile rilevare la variazione fine, l'area S è soggetta a piccolo disturbo. Contrariamente a ciò, se K è posto maggiore di 6, benché 1'influenza del disturbo possa essere ridotta per l'effetto di livellamento, non si può rilevare la variazione fine. Il valore di k sarà usato ugualmente in altri metodi che verranno esposti più avanti.

Valutando l'area S così calcolata, è possibile rilevare non solo un picco di proteina M marcato, ma anche un picco di proteina M piccolo, come mostrato in fig. 16.

Nel secondo metodo di calcolo del picco di proteina M si calcola dapprima l'area S nel modo esposto sopra. Quindi viene calcolato un valore di S/2k. Questo valore di S/2k rappresenta un'altezza media nell'intervallo avente larghezza di 2k. Perciò la dipendenza di S/2k dalla larghezza di rilevazione 2k diventa minore di quella di S. Cioè, se si varia la larghezza di rilevazione 2k, varia di conseguenza l'area S, ma varia solo leggermente il rapporto S/2k. Il rapporto S/2k rappresenta perciò più fedelmente il grado di sporgenza del picco di proteina M.

Nel terzo metodo di calcolo del picco di proteina M il grado di sporgenza del picco di proteina M è rappresentato da S/(2k) . Questo valore è il rapporto fra S/2k e la larghezza di rilevazione 2k e rappresenta così il grado di sporgenza per una larghezza di rilevazione unitaria. Perciò, se le sporgenze hanno forme analoghe, i valori S/(2k) diventano identici fra loro. In questo caso, la larghezza di rilevazione 2k determina il grado del liveliamen-. to.

In questi esempi, il grado di sporgenza è calcolato con la derivata seconda. In questo caso (quarto metodo di calcolo del picco di proteina M) è necessario esprimere 1'elettroforegramma con una funzione appropriata. Ciò può effettuarsi, ad esempio, col metodo dei minimi quadrati. Allora viene calcolata una derivata seconda di una funzione approssimata così ottenuta per ricavare un valore di picco. Si mostrano ora diversi esempi di derivate seconde F"(i), rispettivamente per larghezze di rilevazione differenti di 5, 7 e 9 punti di dati. In questi esempi 1'elettroforegramma è rappresentato da una funzione approssimata di equazione parabolica 2

y=ax bx+c. Nel caso di 5 punti di dati (2k=4),

Il valore di picco così calcolato non dipende di per sé dalla larghezza di rilevazione 2k. Perciò la larghezza di rilevazione 2k determina solamente il livellamento.

Dopo calcolato con uno dei metodi sopra esposti il valore di picco rappresentante il grado di sporgenza, in una seconda fase 52 si valuta se il valore di picco è maggiore di un valore di soglia predeterminato SL^. Se il valore di picco è minore o uguale a SL^, si valuta che non vi è picco di proteina M. Al contrario, se il valore di picco è maggiore di SL^, viene effettuata una fase successiva S3. In questa fase III, viene calcolata una mezza larghezza del picco rilevato ed allora la mezza larghezza calcolata viene comparata con limiti superiore ed inferiore SI^ ed SL^. Se la mezza larghezza è fuori dall'intervallo fra SL^ ed SL3, si valuta che non vi è picco di proteina M. Se la mezza larghezza è entro detto intervallo, viene effettuata una fase successiva S4. In questa fase S4 il valore di picco viene comparato con un altro valore di soglia SL^ che è maggiore di SL^. In conseguenza di questa comparazione, se il valore di picco è minore o uguale a SL4, si valuta che vi sia una possibilità che 1'elettroforegramma relativo comprenda il picco di proteina M. Se il valore di picco è maggiore di SL4, si valuta che esista un picco di proteina M definito. In quest'ultimo caso, si effettua un'ulteriore fase S5. In questa fase S5 viene rilevata una posizone di dati del picco.

L'inventore ha effettuato vari esperimenti nei quali gli elettroforegrammi furono normalizzati in modo tale che il valore di accumulazione fosse uguale a 100000 per una quantità totale di proteine di 7 g/dl. I valori di picco furono calcolati allora col secondo metodo, mentre il valore k fu variato da 3 a 6 e da 10 a 30. Fu confermato che, con k=3=6, furono rilevati picchi di proteina M aventi picchi sostanzialmente indipendenti ed il valore di picco di S/2k era maggiore di 30. Per k»10=30, furono rilevati picchi di proteina M molto piccoli, non aventi alcun picco definito.

Come esposto sopra, si rilevano picchi di proteina M, ma fra tali picchi vi sono picchi che non sono dovuti all'aumento monotono dell'immunoglobulina. Cioè, picchi simili sono rilevati per effetto di fibrinogeno, complemento C3 e tracce di applicazione di campione. Se questi picchi M falsi sono segnalati ai medici come vere proteine M, può generarsi confusione. Nella presente forma di realizzazione, per eliminare un tale inconveniente, dopo la rilevazione della proteina M, si verifica se la proteina M rilevata è una proteina M vera o reale. A questo riguardo, occorre notare che il fibrinogeno, complemento C3 e tracce di applicazione di campione possono essere rilevati separatamente dalla vera proteina M se sono stati portati a termine i processi sopra citati, cioè rilevazione del picco di albumina e del picco di β-globulina, normalizzazione della lunghezza di estensione elettroforetica, normalizzazione della concentrazione di proteine, rilevazione di sporgenze e rilevazione di proteina M.

La fig. 17 è un diagramma di flusso che mostra fasi successive per verificare l'esattezza del picco di proteina M. Dapprima si effettua la rilevazione di fibrinogeno per un campione in cui è stato rilevato un picco di proteina M. Normalmente un campione di siero non contiene fibrinogeno ma, se un paziente è sottoposto a dialisi, in un campione di siero può essere contentuo fibrinogeno per effetto di agente anticoagulante. Quando un campione contiene fibrinogeno, si forma un picco simile al picco di proteina M tra l immagine di frazione β e l immagine di frazione . Nella presente forma di realizzazione, la lunghezza di estensione elettroforetica è normalizzata in modo che il picco di albumina sia al 1002 punto ed il picco β sia al 2002 punto, così che il picco di fibrinogeno appare in un intervallo fra 2152 punto e 2402 punto. Il picco di fibrinogeno è molto appuntito ed ha un'altezza circa minore o uguale al picco β. Nella presente forma di realizzazione, ogni picco che appaia fra il 2152 punto e il 2402 punto, abbia un'altezza minore o uguale a 200 ed il cui valore di sporgenza sia minore o uguale a 10, viene rilevato come il picco di fibrinogeno.

Quindi viene rilevato il complemento C3 in un modo simile a quello di rilevazione del picco di fibrinogeno. Il complemento C3 può apparire quando si applica ad un substrato un siero sanguigno fresco ed ha un picco normalmente su una spalla del picco β dal lato prossimo al picco Perciò, quando il picco viene rilevato fra il punto 205® ed il punto 2152, ha un valore minore o uguale ad un picco del picco β ed ha un valore di sporgenza minore o uguale a 10, esso viene valutato come il picco dì complemento C3.

Infine viene valutata la traccia di applicazione. Quando viene applicato su un substrato un campione di siero non fresco o un campione di siero non trasparente, nel .punto su cui sono applicati rimangono sostanze degenerate dopo l'elettroforesi e costituiscono un picco simile al picco di proteina M. La posizione del picco di traccia di applicazione dipende in gran parte dalla penetranza elettrica del substrato. Quando il substrato non ha sostanzialmente alcuna penetranza elettrica, il picco della traccia di applicazione appare fra il punto 2702 ed il punto 3502 ed ha un valore di picco che è minore o uguale a 100 se la normalizzazione è effettuata in modo che un valore accumulato per 7 g/dl diventi 105 000. Perciò, nella presente forma di realizzazione, quando un picco appare in un'intervallo fra il 2702 punto e il 3502 punto sull'asse X ed ha un valore minore o uguale a 100, tale picco viene valutato essere il picco della traccia di applicazione.

Nel modo sopra esposto, i picchi di proteina M rilevati possono essere classificati come vero picco di proteina M, picco di fibrinogeno, picco di complemento C3 e picco di traccia di applicazione. Occorre notare che i valori suaccennati sono forniti come esempi e si possono adottare altri valori a seconda di tipi di substrati e condizioni analitiche.

Dopo che è stato rilevato il punto di dati del picco di proteina M, in una fase S6 del diagramma di flusso mostrato in fig.

14, valori campioni di punti di dati prossimi al punto di picco rilevato sono comparati con l intervallo normale calcolato dall elettroforegramma standard per determinare se i campioni di dati sono o no minori dell'intervallo normale. Con questa comparazione, se vi sono uno o più campioni al di sotto del campo normale, si determina che vi è la soppressione X- Si può allora valutare che il picco di proteina M rilevato è maligno (mieloma). Al contrario, se i campioni di dati sono nell'intervallo normale, la proteina M viene valutata come benigna. L'intervallo normale può essere posto a ±25% di campioni di dati dell'elettroforegramma standard. Occorre notare che i campioni di dati per rappresentare 1'intervallo normale possono essere immagazzinati precedentemente nella memoria 15 o nel disco flessibile 18 e la parte necessaria dei campioni di dati può essere estratta di là.

Nel modo esposto sopra, vengono classificate le proteine M rilevate preliminarmente ed i così classificati proteina M maligna, proteina M benigna, fibrinogeno, complemento C3 e traccia di applicazione di campione vengono visualizzati su CRT 17 e registrati sul referto di esame 20 in modo tale che si possa agevolmente riconoscere la posizione del picco rilevato sul densitogramma. Si esporranno ora diverse forme di realizzazione della visualizzazione .

La fig. 18 mostra un caso in cui viene rilevata la proteina M maligna. In questo caso, viene visualizzata una freccia in un punto in cui viene rilevata la proteina M e, contemporaneamente, viene visualizzato un segno "MPm". "MPm" indica che il picco di proteina monoclonale rilevato appartiene a proteina maligna. Quando si valuta che il picco sia benigno, viene visualizzato un segno "MPb". In questo modo è possibile distinguere l'una dall'altra, in modo agevole e positivo, la proteina M maligna e la proteina M benigna.

La fig. 19 mostra un caso in cui viene rilevata una piccola quantità di proteina M. In questo caso sono visualizzati una freceia ed un segno "MP?" in una posizione in cui è stata rilevata la proteina M. Ciò significa che la quantità di proteina M rilevata è così piccola che è dubbio che esista la proteina M.

La fig. 20 illustra un caso in cui viene rilevata la traccia dell'applicazione di campione. In questo caso viene visualizzata una freccia in una posizione in cui è stata rilevata la traccia e, contemporaneamente, viene visualizzato un segno "org". "org" significa origine di coordinate X-Y.

La fig. 21 rappresenta un caso in cui viene rilevato il fibrinogeno. In questo caso vengono visualizzati freccia e "fib" nella posizione in cui è stato rilevato il picco di fibrinogeno.

La fig. 22 mostra un caso in cui è stato rilevato il complemento C3. In questo caso viene visualizzata una freccia in una posizione in cui è stato rilevato il picco di complemento C3 e viene visualizzato inoltre un segno "CS".

In questo modo, secondo la presente forma di realizzazione, controllando l’immagine visualizzata si possono individuare agevolmente e positivamente punti o configurazioni specifici dei densitogrammi, così da agevolare il lavoro dei medici per diagnosi ed analisi, migliorando la precisione delle stesse.

Claims (14)

1. RIVENDICAZIONI 1) Metodo per elaborare dati elettroforetici ottenuti sottoponendo ad elettroforesi almeno un campione di almeno un paziente ed almeno un campione standard applicati entrambi su uno stesso substrato, per ricavare almeno un elettroforegramma di campione di detto almeno un campione ed almeno un elettroforegramma standard di detto campione standard ed analizzando fotoelettricamente detti elettroforegramma di campione ed elettroforegranvma standard comprendente le fasi di: immagazzinare segnali di dati di campioni ricavati analizzando fotoelettricamente gli elettroforegrammi di campioni e segnali di dati di riferimento ricavati analizzando fotoelettricamente detti elettroforegrammi standard; reperire una pluralità di segnali di dati di campioni di uno stesso paziente ed una pluralità di segnali di dati di riferimento relativi alla stessa pluralità di segnali di dati di campioni, sia detti segnali di dati di campioni, sia detti segnali di dati di riferimento essendo ottenuti in tempi differenti o in condizioni analitiche differenti; normalizzare ciascuno dei dati di campioni così reperiti dello stesso paziente con riferimento ad uno corrispondente di segnali di dati di riferimento reperiti per ricavare una pluralità di segnali di dati di campioni normalizzati; e visualizzare detta pluralità di segnali di dati di campioni normalizzati su mezzi di visualizzazione come densitogrammi.
2. 2) Metodo come in 1), in cui la pluralità reperita e normalizzata di segnali di dati di campioni sono visualizzati sui mezzi di visualizzazione in modo tale che una pluralità di densitogrammi rappresentati da segnali di dati di campioni normalizzati siano visualizzati in modo sovrapposto.
3. 3) Metodo come in 2) , in cui detta pluralità di densitogrammi sono visualizzati in modo da essere sovrapposti su uno stesso asse orizzontale.
4. 4) Metodo come in 3), in cui sono rappresentate in modo percettibile differenze fra detta pluralità di densitogrammi sovrapposti .
5. 5) Metodo come in 2), in cui detta pluralità di densitogrammi sono visualizzati in modo da essere sovrapposti su assi orizzontali differenti che sono separati in direzione verticale.
6. 6) Metodo come in 1), comprendente inoltre le fasi di: rilevare posizione e grandezza o posizione e forma di almeno una porzione specifica in un elettroforegramma; e classificare un tipo di detta specifica porzione in base alla posizione e grandezza o posizione e forma.
7. 7) Metodo come in 6), in cui detto tipo classificato della porzione specifica e la sua posione sono visualizzati sui mezzi di visualizzazione insieme agli elettroforegrammi.
8. 8) Metodo per elaborare dati elettroforetici ottenuti sottoponendo ad elettroforesi uno o più campioni di uno o più pazienti ed almeno un campione standard applicati entrambi su uno stesso substrato, per ricavare elettroforegrammi di uno o più campioni di detti uno o più campioni ed almeno un elettrofore- gramma standard di detto campione standard ed analizzando fotoelettricamente detti elettroforegrammi di campioni ed elettroforegramma standard comprendente le fasi di: normalizzare segnali di dati di campioni ricavati analizzando fotoelettricamente detti elettroforegrammi di campioni sullo stesso substrato con riferimento ad un segnale di dati di riferimento ricavato analizzando fotoelettricamente detti elettroforegrammi standard formati sullo stesso substrato per ricavare segnali di dati di campioni normalizzati; immagazzinare detti segnali di dati di campioni normalizzati; reperire una pluralità di segnali di dati di campioni normalizzati di uno stesso paziente, detti segnali di dati di campioni normalizzati essendo ottenuti in tempi differenti o in condizioni analitiche differenti; e visualizzare la così reperita pluralità di segnali di dati di campioni normalizzati su mezzi di visualizzazione come densitogrammi .
9. 9) Metodo come in 8), in cui la pluralità reperita e normalizzata di segnali di dati di campioni sono visualizzati sui mezzi di visualizzazione in modo tale che una pluralità di densitogrammi rappresentati da segnali di dati di campioni normalizzati siano visualizzati in modo sovrapposto.
10. 10) Metodo come in 9), in cui detta pluralità di densitogrammi sono visualizzati in modo da essere sovrapposti su uno stesso asse orizzontale.
11. 11) Metodo come in 10), in cui sono rappresentate in modo. percettibile differenze fra detta pluralità di densitogrammi sovrapposti.
12. 12) Metodo come in 9), in cui detta pluralità di densitogrammi sono visualizzati in modo da essere sovrapposti su assi orizzontali differenti che sono separati in direzione verticale.
13. 13) Metodo come in 8), comprendente inoltre le fasi di: rilevare posizione e grandezza o posizione e forma di almeno una porzione specifica in un elettroforegramma; e classificare un tipo di detta specifica porzione in base alla posizione e grandezza o posizione e forma.
14. 14) Metodo come in 13), in cui detto tipo classificato della porzione specifica e la sua posione sono visualizzati sui mezzi di visualizzazione insieme agli elettroforegrammi.