IT8109369A1 - Di-n6', 03-demetilistamicina a avente attivita' antibatterica, e sua preparazione - Google Patents

Description

DOCUMENTAZIONE

RILEGATA

DESCRIZIONE

Questa invenzione riguarda un nuovo derivato della ?3tamicina A denominato come di-N ?0 -demetilistami. cina A ( cio? ? ? -N^vO-didemetilistamicina A)^ che ? un antibiotico amminoglicosidico sintetico utile come agente antibatterico, e un procedimento per la preparazi one di questo ed anche usi terapeutici del nuovo deri vato.

Si descrivono e si rivendicano nuovi ed utili antibi otici chiamati is taraina A e i stamina B che sono prodotti per mezzo di coltivazione di una nuova specie di Streptoin.yces , ci o? Streptomyces ten j ima ri ensis ceppo SS-939 (FERM-P 4932 o ATCC 31603 ) e che sono notevolmente attivi contro una grande variet? di batteri gram-negativi e gram-positivi (vedi "Journal of Antibioti cs" 32_, 964-966 ( Settembre 1979 ) ; domanda di brevetto U.K. GB 2048855A pubblicata il 17/12/1980) . Si sono condotti studi estensivi sulla produzi one sin tetica della istamicina A partendo dalla 3 r , 41 -dideossi_ neamina (vedi "Journal of Antibiotics" 3.2 , 1 365-1 366 ( 1979 ) ) ? Durante un ulteri ore sviluppo degli studi estensivi , ? stato preparato con successo un nuovo derivato della istamicina A, di-N ,0 -demetil? stami -cina A in un modo facile, e ? stato trovato che la -di-N 6 1,0 3-demetilistamicina A presenta una elevata attiviti antibatterica contro una larga gamma di batteri gram-negativi e gram-positivi e in particolare una maggiore attivit? contro la Pseudomonas aeruginosa.ohe istamicina A.

Uno scopo di questa invenzione ? fornire un derivato antibiotico della istamicina A che ? utile come agente antibatterico per il trattamento terapeutico di malattie da batteri dell'uomo e degli animali ed anche per la sterilizzazione di materiali e strumenti chirurgici-Un altro scopo dell'invenzione h fornire un procedimento per la sintesi di detto nuovo derivato antibiotico della istamicina A. Ulteriore scopo dell'invenzione ? fornire una composizione farmaceutica comprendente il nuovo derivato antibiotico della istamicina A come ingrediente attivo .

Altri scopi e vantaggi risulteranno dalle seguenti descrizioni .

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE

Secondo un primo aspetto di questa invenzione, sono fornite, come,sostanze antibiotiche, la di-N ,0 -demetilistam?cina A avente formula strutturale (i): 1 ^ ?,

(I)

NH OH

2 0

NCH COCH2NH2

? sali acidi di addizione di questa.

La.istamicina A ha.la seguente formula strutturale:

H3CNH

NH NH OH

OCH.

NCH COCH2NH2

Quindi, il composto di formula (i) ? corrispondente a un derivato della istamicina A da cui sono stati eliminati i due gruppi metile del gruppo metossi in posizione 3 e del gruppo metilammino in posizione 6*.

Il nuovo composto (I ) di questa invenzione ha le seguenti propriet? biologiche e fisico-chimiche :

Il monocarbonato di di-N^ ,?^-demetili stami cina A ? in f orma di polvere incolore che non ha un punto di fusione definito, si decompone a 138-1 45 ?G, d? una rotazione ottica specifica di [4]f+ 136? ( c 0, 36 in acqua) e indica un? analisi elementare : - !Provato : C, 45 , 39 ;

H, 7, 63; N, 1 6, 42% che ? conforme ai valori teorici di C15H31N505 -H2C03 ( C, 45 , 38; H, 7,85 ; N, 1 6, 54%) . La spettrometria di massa del monocarbonato mostra il pie co di (M+1 )+ a m/e = 362 e la cromatografia in strato sottile di questo su gel di silice d? un punto singolo (positivo al reagente ninidr?na) a 0, 06 se sviluppa to con la fase inferiore di un solvente miscela di ci? rof ormi o-metanolo-ammoniaca acquosa al 28% (2:1:1 in volume) o a Rj, 0,46 se sviluppato con un solvente misce la di butanolo-etanolo-clorof ormio-ammoniaca acquosa al 17% (4:5:2: 5 in volume).

Il composto di formula (I) di cui sopra presenta una elevata attivit? antibatterica contro una larga variet? di batteri gram-negativi e gram-positivi; come appare chiaro dagli spettri antibatterici indicati nella tabella 1 qui sotto, dove sono indicati per confronto anche quelli della istamicina A.

Le concentrazioni inibitorie minime (mcg/ml) indicate sono state determinate secondo un metodo standard di diluizione in serie su piastre di agar nutritiva che furono incubate ad una temperatura di 37?C per 17 ore. I risultati della tabella 1 rivelano che la di-demetilistamicina A di questa invenzione ? sostanzialmente pi?.attiva particolarmente contro lo Pseudomonas aeruginosa della istamicina A.

Tabella 1

Concentrazioni inibitorie minime (mcg/ml)_

Di-demetil-Microorganismi di prova istamicina A Istamicina A

Staphylococcus aureus FDA 209P 1.56 0.78

" " Smith < 0.20 < 0.20

" " ApOl 1.56 0.78 Staphylococcus epldermldls 109 1.56 0.78 Mlcrocoecus flavus FDA 16 3.13 3.13 Sarcina lutea PCI 1001 0.78 0.20 Bacillus anthracls 0.39 < 0.20 Baclllus subtllls PCI 219 < 0.20 < 0.20

" " NRRL B-558 <0.20 0.39 Baclllus cereus ATCC 10702 3.13 3-13 Corynebacterlum boyls 1810 1.56 1.56 Mycobacterlum smegmatls ATCC 607 0.39 1.56 Escherlchia coli NIHJ 6.25 3.13

M ? K-12 6.25 1.56

ri " K-12 R5 100 3.13

fi " K-12 R388 1.56 0.78

ft " K-12 J5R11-2 3.13 3.13 n " K-12 ML1629 3.13 3.13

fi " K-12 ML1630 12.5 3.13

tl ? K-12 ML141Q 6.25 3-13

11 " K-12 ML1410 R81 3.13 1.56

ff " K-12 LA290 R55 12.5 3.13

Escherlchia coll K-12 LA290 R56 3.13 1.56

" " K-12 LA290 R64 3.13 1.56

" " W677 3.13 1.56

" " JR66/W677 6.25 3.13

" " K-12 C600 R135 > 100 > 100

" " JR225 3.13 1.56

Klebslella pneumoniae PCI602 3 .13 1.56

" " 22^3038 12.5 3.13

Shlgella dysenterlae JS11910 12.5 3 .13 Shigella flexnerl 4B JS11811 12.5 6 .25 Shlgella sonnel JS11756 6.25 6 .25 Salmonella typhl T-63 3.13 0.78 Salmonella enterltidis 1891 6.25 3 .13 Proteus vulgarls 0X19 1.56 0.78 Froteua rettgerl GN311 50 25

" " GN466 12.5 6.25

Serratla marcescens 12.5 6.25 Serratla sp. SOU >100 > 100 Serratla sp. 50 50 Proyldencla sp. Pvl6 12.5 6.25 Providencia sp. 2991 12.5 25 Pseudomonas aeruginosa A3 3.13 6.25 " T' No.12 25 100

" " H9 12.5 25

" " Hll 50 100

" " TI-13 12.5 25

Pseudomonas aeruginosa GN 315 25 25

" " 99 > 100 > 100

? ? B-13 > 100 > 100

" " 21-75 > 100 > 100

" " PST 1 50 100

" " ROS 134/ 50 100

PV 21

" " K~Ps 102 12.5 50 Pseudomonas maltophilia GN 907 > 100 > 100 Il composto di questa invenzione, di-N ,0 -demetil istamicina A & ottenuto usualmente in forma di base libera o suo idrato o carbonato, che pu? essere convertita nella forma di qualunque sale acido di addizione non tossico farmaceuticamente accettabile per mezzo di reazione con un acido farmaceuticamente accettabile in un.modo convenzionale. Esempi di acidi farmaceuticamente accettabili da usare a questo scopo includono acidi inorganici come l'acido cloridrico, bromidrico, solforico e nitrico e acidi organici come l'acido acetico, malico, citrico, ascorbico e metansolfonico.

In accordo con un secondo aspetto di questa invenzione, viene fornito un procedimento per preparare il composto di formula (I) di cui sopra, che comprende bloccare simultaneamente con un gruppo ammino-protettivo i tre gruppi ammino nelle posizioni 1-, 2?- e 6'- del composto di formula strutturale (Vili):

gi

(Vili)

NHCH

3

5 OH

far reagire il risultante derivato tri-N-protetto del composto (Vili) con glieina o glieina N-protetta il cui gruppo ammino ? stato bloccato con un gruppo ammino-protettivo o con equivalente funzionale di detta glieina per acilare il gruppo1^!^^^ ? non protetto in posizione 4- del composto (VITI); e rimuovere tutti i rimanenti gruppi ammino-protettivi dal prodotto dell'acilazione. Il procedimento di questa invenzione pu? includere inoltre una fase di conversione del composto (I) cosi prodotto nel suo sale acido di addizione o di conversione di un sale acido di addizione del composto prodotto nella base libera o altro sale acido di addizione di questa per mezzo di un metodo convenzionale.

Il composto di partenza avente formula (Vili) da usare nel presente procedimento, che ? designato come N4-deglicil-di-N 6*,03-demetilistamicina A, pu? essere preparato usando come materiale iniziale 3',4'-dideossineamina che, a sua volta, pu? essere fatta con tecnica nota descritta nel "Journal of Antibiotics?' 24, 711-712 (1971) o nel "Bulletin of th? Chemical Society of Japan" 46, 3507-3510 (1973).

Il metodo di preparazione del composto iniziale (Vili) ? riassunto come segue:- I quattro gruppi ammino esistenti nella 3',4'-dideossineamina di formula (II):

H?N

NH (II)

NH

5 OH

sono bloccati con un gruppo ammino-protettivo di un tipo formante uretano e quindi convertiti nel derivato carbammato 1,6-ciclico del composto (II) N-protetto trattando con una base come un idruro di metallo alcalino. Il gruppo idrossile in posizione 5- del derivato carbammato 1,6-ciclico ? bloccato con un gruppo idrossil-protettivo per produrre un composto di formula (III):

R OC-N

OR

CO

NH ( III )

NH CO

0 0

OR

in cui ciascun R 0C0 rappresenta il gruppo ammino-protettivo monovalente di tipo formante uretano dove R ? un gruppo alchile (per es. alchile di 1 - 6 atomi di carbonio), un gruppo cicloalchile (per es. cicloalchi. le di 5-6 atomi di carbonio) o un gruppo aralchile (per ea. fenil-C^ _ alchile come benzile ) e R rappresenta un gruppo alchile (per es. alchile di 1-6 ato mi di carbonio), un gruppo benzile o un gruppo tetraidropiranile come il gruppo idros3il-protettivo. Successivamente, il composto di formula (III) ? trattato con un alcale come idrato acquoso di sodio o'bario per idrolizzare l'anello del carbammato 1,6-ciclico, seguito da protezione del risultante gruppo animino libero in posizione 1- con un gruppo aromino protettivo di tipo formante uretano diverso dal 30pradetto gruppo animino protettivo R 0G0-, e da solfonilazione del risultante gruppo idrossile libero nella posizione 6-con un reagente di solfonilazione avente formula R^SO^H o un equivalente reattivo di questo per produrre un composto di formula (IV):

T

R1OC

0

i

(IV)

NHCOOR OSOnR^

in cui R e R hanno gli stessi significati di cui sopra, R^OCO- rappresenta il gruppo ammino-protettivo monovalente di tipo formante uretano dove ? un gruppo alchile (per es. alchile di 1 - 6 atomi di carbonio), un gruppo cicloalchile (per es. cicloalchile di 5 - 6 atomi di carbonio) o un gruppo aralchile (per es. benzile) ma diverso dal gruppo R , e R^ rappresenta un1/alchile (per es. alchile di 1 - 4 atomi di carbonio), arile (per es. fenile o metilfenile) o aralchile (per es. benzile). Il composto di formula (IV) ? quindi trattato con una base come alcoolato di metallo alcalino ver formare un composto portante un anello aziridinico ed avente la formula (V):

R1OC-N

i H

OR

4? CO OR

(V)

r i, NH

NH

3'

0

OR

1 2 3

in cui R , R e R sono definiti come sopra. Il composto di formula (V) h ulteriormente trattato con un sale di metallo alcalino di un acido organico come un acido alcanoico inferiore o acido "benzoico per aprire l'anello aziridinico, producendo in tal modo un composto di formula (Vi):

R OC-N

1!H

OR

CO

(VI)

NH

3? NH

NHCOOR CO

R 0

in cui R1, R2 e R3 sono come definiti sopra e R5 rappresenta un gruppo acile come il gruppo alcanoil^ o benzoile che trae origine dall?acido organico impiegato. I gruppi idrossil-protettivi (R e R ) nelle posizioni 3- e 5- del composto (Vi) vengono rimossi da quest?ultimo in un modo convenzionale. Se necessario (cio?, quando il gruppo 4-ammino-protettivo -COOR^ ? stato eventualmente rimosso durante il trattamento con il sale di metallo alcalino di acido organico o simultaneamente alla rimozione dei gruppi idrossil-protettivi R_, R_), viene nuovamente introdotto un ulteriore gruppo amminoprotettivo (-COOR^) di tipo formante uretano nel gruppo 4-ammino libero^per dare un composto di formula (VII): Ft1OC-N '6'

OR

CO (VII)

NH

NH

CO 1 NHCOOR3"<5>

OR HO

OH

in cui e R^ sono come definito sopra. Dopodich?, i gruppi ammino-protettivi (-COOR^<">) nelle posizioni 1-, 2'- e 6'- del composto (VII) sono rim?ssi da.questo in una maniera usuale ma mantenendo il gruppo 4-amminoprotettivo (-COOR^) deprotetto, seguito da riduzione con un idruro di metallo per convertire il gruppo 4-animino protetto (-NHCOOR ) nel gruppo metilammino ~A? Viene cos? prodotto il composto avente formula (Vili) di cui sopra.

Viene data di seguito una descrizione di una applicazione preferenziale del metodo per la preparazione del composto di partenza (Vili).

Nella prima fase, i quattro gruppi animino nelle posizioni 1-, 3-, e 6'-della 3<1 >,4'-dideossineamina avente formula (II) sono bloccati con un noto gruppo ammino-protettivo di tipo formante uretano per dare un derivato N-protetto della 3<1 >,4*-dideossineamina avente la formula ( II * )

R1OC-N

OR

( II ' )

NH

3' NH

CO 1

NHCOOR

HO

in cui ciascun R^OCO- sta per il gruppo ammino-prote tivo monovalente di tipo formante uretano dove R"*'? un gruppo alchile, cicloalchile o aralchile come descritto in precedenza. Il gruppo ammino-protettivo da usare per questo scopo ? un tipo capace di far reagire il gruppo idrossile adiacente (dove esiste) per formare un anello carbammato ciclico una volta trattato con una base nella fase seguente. Esempi del gruppo amminoprotettivo atto a questo 3Copo comprendono i gruppi alchiossicarbonile di 2 - 7 atomi di carbonio come il tert-butossicarbonile e il tert-amilossicarbonile ; i gruppi ciclo alchilossicarbonile di 6 - 7 atomi di carbonio come il cicloesilossicarbonile e i gruppi aralchilossicarbonile come il benzilossicarbonile e il para-metossiben^ z?loeetioarbonila. Fra questi ? preferibile usare un gruppo ammino-protettivo di tipo formante uretano che ?

facilmente rimuovibile senza rompere il gruppo am? mino-protettivo -COOR che sar? stato introdotto in seguito nel gruppo 1-ammino del composto di fformula (IV). A.tal fine ? raccomandabile selezionare un gru po aralchilossicarbonile che pu? essere rimosso per idrogenolisi, l'introduzione del gruppo ammino-protettivo -OCOR1 pu? essere eseguita facilmente con qualunque procedura convenzionale, per esempio, per mezzo di reazione con un noto reagente ammino-protettivo in forma di alogenuro acido,asoturo acidooestere attivo.

Nella seconda fase, il composto d? formula (II1) ? trattato con una base come idruro di metallo per da.re un composto in forma di carbammato 1, 6-ciclico avente la formula ( II11 ) : _

R OC-N

")

in cui R1 ? come definito sopra. Fra i quattro gruppi a.mmino-protettivi del composto (II1) N-protetto, il gruppo ammino-protettivo in posizione 1-b fatto reagire facilmente persino a bassa temperatura, per esempio, sotto 0?C con il gruppo idrossile adiacente nella posizione 6- per formare il carbammato ciclico quando sia trattato con una base come un idruro di metallo alcalino, per es. idruro di sodio o idruro di litio in un appropriato solvente organico coire dimetilformammide anidra.

Nella terza,fase, il gruppo idrossile in posizione 5- del composto carbammato ciclico (IIH) ? bloccato con un noto gruppo idrossil-protettivo in un modo usuale per produrre un composto di formula (III) indicato precedentemente. Questa fase ? seguita dal trattamento con un alcale acquoso per idrolizzare l'anello carbammato 1,6-ciclico dando luogo cos? ad un composto di formula (ili?):

R10C-N--\6'

OR

?'

co (III')

NH

co

OR R 0

2

Il gruppo protettivo (R ), per bloccare il gruppo 5-idrossile del composto (II"), deve essere ??? influen zabile dalle condizioni sotto le quali deve essere condetta

dotta\/idrolisi alcalina del composto carbammato

1,6-ciclico (III). Quindi, fra i noti gruppi idrossil-protettivi vengono selezionati quelli di tipo

etere come eteri alchilici ed eteri benzilici e

quelli di tipo acetale come il tetraidropiranile,i quali tutti possono essere introdotti nel gruppo 5-idrossile per mezzo di una qualunque tecnica convenzionale idrossil-protettiva. In particolare, per il gruppo idrossil-protettivo R , si preferisce usare il gruppo tetraidropiranile che ? facilmente rimuovibile per idrolisi in condizioni acide deboli.

La successiva idrolisi del composto carbammato

1,6-ciclico (III) pu? essere ottenuta con trattamento in una soluzione acquosa diluita di un alcale o di idrossido di metallo alcalino terroso come idrossido di sodio o idrossido di barioffa aprire l'anello carbammato 1,6-ciclico in forma di un amminoalcool libero rappresentato dalla formula (III') di cui sopra.

L'idrolisi pu? essere preferibilmente eseguita ad

una elevata temperatura compresa fra 40 e 60?C e

ad una concentrazione di alcale di 0,1 M o minore.

Queste condizioni di reazione non comportano la rimozione degli altri gruppi ammino- e idrossilprotettivi e quindi danno luogo alla formazione preferenziale del composto 1,6-amminoalcool di formula (?li*).

Inoltre, il gruppo l-ammino liberato del composto (III1) ? bloccato con un gruppo ammino-protettivo (-COOR^) di tipo formante uretano;che ? diverso dal gruppo esistente R^OCO- per bloccare i gruppi ammino del composto (II), e il gruppo 6-idrossile ? solfonilato per reazione con un reagente solfonilante, per esempio, un solfonil a.logenuro di formula : R SO^X in cui R ? il gruppo alchile, arile o ar.alchile e X ? un atomo di cloro o di bromo. In tal modo viene prodotto un composto di dormula (IV) di cui sopra.

Come gruppo di tipo formante uretano di protezione del gruppo l-ammino del composto (ili*)? si preferisce usare particolarmente un gruppo alchiossicarbonile^ poich? quest'ultimo pu? essere selettivamente trattenuto nel composto che si deve produrre attraverso il successivo trattamento di rimozione degli altri gruppi ammino-protettivi nelle posizioni 3~? 2'- e 6*- ed ? vantaggioso per la formazione riduttiva del gruppo metilammino in posizione 4- del composto (VII) come descritto pi? avanti.

La summenzionata solfonilazione del gruppo 6-idrossile pu? essere effettuata facilmente a temperatura ambiente con una buona resa per reazione in un opportuno solvente organico^come piridina secca^con un noto reagente di solfonilazione come solfonil alogenuro di formula R S02X, sPecialmen"te metanosolfonil, paratoluenesolfonil o benzilsolfonil cloruro.

Nella fase successiva, il composto di formula (IV) ? trattato con una base per formare un composto avente formula (V) di cui sopra portante l'anello aziridinico, seguito da ulteriore trattamento con un sale di metallo alcalino di un acido organico per aprire l'anello aziridinico.

Il composto di aziridina (V) pu? essere ottenuto con buona resa trattando il composto (IV) con una base come un alcoolato di metallo alcalino per esempio, alcoolato di sodio, specialmente metilato di sodio in un solvente organico anidro come tetraidrofurano secco. La reazione per formare l'anello aziridinico pu? procedere anche a bassa temperatura compresa fra 0 e 10?0fLLla quale temperatura la reazione pu? essere generalmente completata in 24 ore.

Il composto di aziridina (V) cos? prodotto, che ? un importante nuovo intermedio per la preparazione del composto oggetto di questa invenzione, pu? essere sottoposto direttamente (cio? senza purificazione) alla successiva reazione di apertura dell'anello.

L'apertura dell'anello aziridinico nel composto (V) pub essere effettuata con una resa favorevole per reazione con un sale d? metallo alcalino d? un acido organico come un acido alcanoico inferiore o acido benzoico e specialmente, per esemplo, con benzoato di sodio o acetato d? sodio in un solvente organico anidro come d?met?lformammide secca. La reazione d?.una ulteriore forma di amminociclltolo avente la formula (VI)i

R-'-OC-N

(VI)

NHCOOR

in cui R1# R2 e R3 sono come definiti precedentemente 5

e R ? il gruppo acile come il gruppo alcanoile o benzo?le che trae or?gine dall'acido organico impiegato.

Come si vede dalle formule (IV) e (Vi), lo scambio fra la posizione del gruppo ammlno e l? posizione del gruppo idross?le ha luogo per 14apertura dell'anello azirldinico, quando generalmente il gruppo protettivo tipo uretano rimane nel gruppo animino^mentre il gruppo acile derivante dall'acido organico usato nella reazione di apertura dell'anello ? introdotto nel gruppo idroesile^ come indicato dalla formula (Vi) di cui sopra. Rispetto alla nuova forma di amminociclitolo (1,4-diammino-l, 2 ,4-trideossiamminociclitol derivato) di formula (VI), la numerazione della parte caratteristica della molecola di amminociclitolo ? basata su quella della fortimicina e dell'istamicina. La stessa numerazione si applica alle formule (VII), (VII') e (Vili). Per quanto riguarda i composti di amminociclitolo (1,3-diammino-1, 2,3-trideossi-amminociclitol derivati) rappresentati dalle formule (i) - (V) di cui sopra, la numerazione b basata su quella della 2-deossistreptamina.

I gruppi idrossil-protettivi (R e R ) nelle posizioni 3- e 5- del composto (VI) sono quindi rimossi da quest'ultimo per produrre il composto di formula (VII) precedentemente indicato. Il gruppo acile (R ) come gruppo idrossil-protettivo in posizione 3- pu? essere facilmente rimosso per mezzo di idrolisi alcalina con una comune base, per esempio, soluzione di ammoniaca metanolica, mentre il gruppo idrossil-protettivo (R ) in posizione 5- come il gruppo tetraidropiranile pu? essere rimosso per mezzo di idrolisi acida in condizioni acide deboli come gi? menzionato, per esempio, per trattamento con una soluzione acquosa di acido trifluoroacetico ad una bassa temperatura compresa fra 0 e 10?G.

In alcuni casi, il gruppo ammino-protettivo

(-COOR^) in posizione 4- pu? essere rotto nel corso della detta reazione per l'apertura dell'anello aziridinico o qualche volta simultaneamente alla rimozione dei gruppi idrossil-protettivi (R2, R5). E' quindi necessario che il gruppo ammino-protettivo di tipo formante uretano;che ? diverso da quello (-OCOR^) usato per bloccare i gruppi 1-, 2'- e S'-ammino^sia reintrodotto nel gruppo 4-ammino libero. Questo, per esempio, ? il caso in cui il gruppo ammino-protettivo in posizione 4- ? il gruppo tert-butossicarbonile che pu? essere rotto simultaneamente alla rimozione del gruppo idrossil-protettivo (R ) in posizione 5-per mezzo di idrolisi acida debole. Il gruppo ammino-protettivo (-COOR^) di tipo formante uretano da reintrodurre nel gruppo 4-ammino, in questo caso, dovrebbe essere possibilmente insensibile alla reazione successiva per la rimozione degli altri gruppi ammino-protettivi (-OOOR^) nelle posizioni 1-, 2'- e 6'- e dovrebbe essere utilizzabile per la formazione del gruppo metilammino in posizione 4-.

Esempi preferiti di questi sono i gruppi metossicarbonile e etossicarbonile.

Successivamente, i gruppi ammino-protettivi

(-OCOR ) nelle posizioni 1-, 2*- e 6'- del composto (VII) sono rimossi selettivamente da questo per mezzo di una convenzionale tecnica deprotettiva,che ? nota per rimuovere i gruppi protettivi -OCOR^ ? atta 3 ma non^a rimuovere il gruppo protettivo -COOR in posizione 4-, per cui viene prodotta una 4-N-protet-

4 6' 3

ta N -deglicil-tri-N ,N ,0 -demetilistamicina A di formula (VII1):

.

(VII*)

1' 6 NH

NH

1 NHCOOR3

V-HO OH

in cui ? come definito sopra.

Nella fase finale, il composto (VII1) viene ridotto con un idruro di metallo^in modo che il gruppo 4-ammino protetto (-NHCOOR^) sia convertito nel gruppo 4-metilammino (4-N-metilazione), dando

4 6* 3

luogo a N -deglicil-di-N ,0 -demetilistamicina A di formula (Vili):

H_N

NH (Vili)

3? NH NHCH

HO OH

La 4-N-metilazione pu? essere effettuata riducendo il composto (VII') con un idruro metallico litio

come idruro di (alluminio o di boro in un solvente organico anidro come tetraidrofurano secco. La reazione ? generalmente effettuata ad una temperatu ra di 40 fino a 60?C per un periodo di 10 ore o pi? a lungo.

Il composto N -deglicil-di-N ,0 -demetilistamicina A cos? prodotto, che ? usato come materiale iniziale nel procedimento di questa invenzione, ha le seguenti propriet?:-Il monocarbonato di N -deglicil-di-N ,0 -demetilistamicina A ? in forma di polvere incolore che non ha alcun punto di fusione definito, decompone a

115-118?C, d? una reazione ottica specifica di 102? (c 0,65, acqua) ed indica un'analisi elementare:-Trovato: C, 46,15; H, 7,97; N, 15,37$ che ? coincidente con i valori teorici di C_,?^?,? .*-H-C0, (C, 45,89; H, 8,25; N, 15,29%). La spettrometria di massa del monocarbonato mostra il picco M+ a m/e = 304, e La cromatograf?a in strato sottile su gel di silice di questo d? un punto singolo (positivo al reagente ninl_ drina) a R^ 0,12 quando sviluppata con la fase infer o. re di un solvente miscela di clorof ormio-metanolo-am moniaca acquosa al 28% (2:1:1 in volume) o a R^ 0,50 quando sviluppata con un solvente miscela di Lutane; lo-etanolo-clorof ormio-ammoniaca acquosa al 17% (4:5:2:5 in volume).

Secondo il procedimento di questa invenzione, principalmente il composto in oggetto di questa invenzione, di-N^ , 0^-deme ti li stami cina A di formula (I) ? preparato per mezzo di acilazione con glieina (cio? glicilazione ) del gruppo me ti laminino in posizione 4-del composto (Vili). Allo scopo d? fare una selettiva glicilazione del gruppo 4-me ti laminino con un'alta resa, ? necessario bloccare precedentemente gli altri gruppi ammino nelle posizioni 1-, 2?- e 6?- con un gruppo ammi no-protettivo. Fortunatamente, vi ? una considerevole differenza nella reattivit? fra questi tre gruppi ammi no e il gruppo 4-me ti laminino. Quindi pu? essere preparato con alta resa un derivato N-protetto del composto (Vili), i tre gruppi ammino del quale sono stati bloccati in posizi oni 1 -, 2 ' - e 6 ' , per mezzo di un metodo convenzionale per l ' introduzione di un noto gruppo ammino-pro tettivo, per esempio, facendo reagi re il composto (Vili ) con 3 - 3,5 equivalenti molari di un noto reagente ammino-protettivo in forma di alogenuro acido , azoturu acido , estere acida o anidride acida. Esempi di questi noti gruppi ammino-pro tettivi, adatti allo scopo comprendono gruppi alcossi_ carbonile come il tert-butossicarbonile e il tert-anm lossicarbonile; i gruppi cicloalchilossicarbon?le come il cicloesilossicarbonile; i gruppi aralchilossicarbonile come il ben zi lo 3 si carbonile; i gruppi a Cile come trif luoroacetile e G-nitrof enos3iace tile ; i gruppi f osf inotioile come il dif enilf osf inotioile e il dime ti If osf inoti oile ; e i gruppi f osfinile come il dif eni'lf osf inile . Anche noti gruppi bivalenti ammino-pro tettivi possono essere usati per bloccare i gruppi animino in forma di base Schiff .

Il derivato 1 , 2 6 ' -tri -N -protetto della N -deglicil-di-N 6 1 ,0 3 -demetili stami c ina A cos? preparato pu? essere usato direttamente senza purificazione, per la successiva glicilazione del gruppo 4- me ti laminino. La reazione di 4-N-gli oblazione pu? essere effettuata usando la glicina stessa o un equivalente funzionale di questa secondo una qualunque tecnica nota impiegata per la sintesi dei peptidi. L1equivalente funzionale della glieina per il presente uso comprende dicicloesilcarbodiimmidi, anidridi acide miscelate, azoturi ed esteri attivi della glicina. E' preferibile che il gruppo ammino della glicina debba essere x^recedentemente bloccato con un gruppo ammino-pro tettivo che pu? essere lo stesso o diverso da quello usato per i gruppi ammino del composto (Vili). Esempi preferenziali del gruppo ammino-protettivo da usarsi convenientemente sono il gruppo berxzilossicar' donile che ? rimuovibile per idrogenolisi in presen za di un catalizzatore, come l'ossido di palladio o di platino, o il gruppo tert-butossicarbonile che ? rimuovibile con idrolisi acida, per esempio, in soluzione acquosa di acido trifluoroacetico o acetico o soluzione diluita di acido cloridrico.

In una fonaa preferenziale del presente procedi, mento, la reazione di 4-N-glicolazione pu? essere eseguita usando un estere attivo di una glicina N~ -protetta ad una elevata temperatura compresa fra 40 e 60?C in un opportuno solvente organico come il diossano. Come estere attivo di alta reattivit? si pu? menzionare l'estere N-idrosucc?nimmide della N-benzilossi-carbonilglicina; che pu? essere prodotto in un modo convenzionale e che pu? essere usato per la glicilazione in una proporzione di 1 a 1,5 equivalenti molari.

Dopo il completamento della glicilazione, tutti i gruppi ammino-protettivi rimanenti nel prodotto della reazione sono rimossi con un metodo convenzionale, per esempio con idrogenolisi o idrolisi acida come descritto sopra, per cui viene prodotto il composto in oggetto di formula (i).

Come gi? descritto, il nuovo composto (I) di'*.questa invenzione possiede un'elevata attivit? antibatterica contro una larga variet? di batteri. Inoltre, il composto ha una bassa tossicit? verso gli animali^ come viene dimostrato dal fatto che i topi tollerarono una somministrazione endovenosa di 100 mg/Kg del composto, Quindi, il composto ? molto utile come agente antibatterioo e per questo scopo esso ? generalmente formulato in forma di composizione farmaceutica, ohe pu? essere somministrata nell'uomo o nell' animale in un?modo di per s? noto,

Perci?, questa invenzione fornisce anche una composizione farmaceutica comprendente una quantit? terapeuticamente o battericidamente efficace del composto di formula (i) o un sale acido di addizione di questo farmaceuticamente accettabile in combinazione con un veieolo o coadiuvante farmaceuticamente accettabile. Questa invenzione fornisce anche un metodo di inibizione della crescita di batteri in un animale^che comprende somministrare una quantit? terapeuticamente o battericidamente efficace del composto (i) o un sale farmaceuticamente accettabile di questo ad un animale che ? infettato da batteri o fe suscettibile di diventare infetto. Si comprender? che una quantit? appropriata dell'ingrediente efficace da somministrarsi per lo scopo prefisso varier? a seconda della particolare composizione formulata, del modo di somministrazione, delle condizioni di trattamento e della natura del batteri da controllare. Come indicazione orientativa, l'ingrediente efficace potr? essere somministrato in un animale con dosi di 0,5 - 5 mg per Kg di peso corporeo dell'animale.

Questa invenzione ? ulteriormente illustrata ma non limitata dal seguente esempio.

Esempio 1

Sintesi della di-N ,?-demetilistamicina^ A di formula (I) (a) Preparazione di 1,3?2*,6'-tetra-N-benzllossicarbonil^ ',4?-dideossineamina (R^ *? benzile in

formula II 1 )

2,10 g (7, 23 mmoli) di 3 ' , 4 '-dideossineamina furono di sci alti in 100 mi di un miscuglio di acqua e metanolo (1:5 in volume), ed alla soluzione furono aggiunti 11,9 g (4,3 mmoli) d? benzil 4, 6-dimetilpiri. midil-2-tiolcarbonato e' 2,3 mi di trietilammina, facen do seguire agitazione a temperatura ambiente per 15 ore. La soluzione di reazione risultante fu concentra ta fino a secchezza (essiccazione) a pressione ridot ta ed il residuo fu lavato successivamente con 300 mi di acqua e 200 mi di etere etilico per dare 6,0 g ?? (100$) del compostoci titola in forma di polvere gial, lo pallida. Punto di decomposizione 237-238?C.

l?+ 45? (c 2, CHC13).

(b) Preparazione di 3,2? ,6* -tri -N-benziloss? carboni 1-31 ^'-dideossineamina 1 , 6-carbammato (R1 ? benzil in formula II")

1?34 g (1,62 mmoli) del prodotto ottenuto nella fase (a) furono di sciolti in 1 3 mi di dimetilf ormammide anidra, a oui furono aggiunti 235 mg (4,9 mmoli) di idruro di sodio (50$ di sospensione in olio) mediante raffreddamento con ghiaccio in atmosfera di gas argon. La miscela fu agitata a temperatura ambiente per 4 ore, dopo di che la soluzione di reazione risultante fu neutralizzata con acido acetico e versata in 500 mi

di acqua ghiacciata per separare un precipitato. Il precipitato fu raccolto per filtrazione e purificato

per mezzo di cromatografia in colonna su gel di sili

ce (50 g di Walco-gel C-200 prodotta dalla Walcojunyaku

Co., Japan) sviluppato con solventi miscelati di cloroformi o/acetone (2:1 e 1:1 in volume) per dare 683 mg

( 62fo) del composto del titolo, J 58? (c 2, CHCl^).

0,25 in cromatografia in strato sottile (ELC) su

gel di silice sviluppata con cloroformio-etanolo

(20:1).

(c) Preparazione di 3* 2 1 , 6 1-tri-N-benzi los si carboni 1- .

-3 1 ,4,-dideossi-5-0-tetraidr?piranilneamina 1 , 6--carbammato (R 1 = benzile e R 2 = tetraidropiranile

in f ormula III )

3,7 g (5 , 15 mmoli) del prodotto ottenuto nella

fase ( b) d? cui sopra furono dieciolti in 50 mi di

dime ti lf ormammide , e alla soluzione furono aggiunti UF IF me 4 MAEGNIMiCC....

1 , 3 g ( 15 ,5 mmoli ) di 3, 4-diidro-2H-pirano e 156 mg

( 1 , 14 mmoli ) di acido para-toluene-solf onico anidro .

La miscela fu lasciata riposare a temperatura ambien

te per 72 ore, e 1 mi d? trietilammina fu aggiunto alla soluzione di reazione risultante , che fu poi f atta evaporare a pressione ridotta per lasciare un residuo.

Quest'ultimo fu cromatograf ato su gel di silice (300 g di V/ako-gel C-200) usando cloroformio-etanolo (100:1) come solvente di sviluppo per produrre 2,4. g (57$) del composto del titolo. Punto di decomposizione 79 - 83?C.

[4] * 33? (c 0,5, CHC13). Rf 0,51 in TLC su gel di silice sviluppata con cloroformio-etanolo (15:1).

(d) Preparazione di 3, 2 1 , 6 ' -tri-N-benzilossicarbonil-1 -N-tert-butossicarbonil-3 1 , 41 -dideosSi-6-G-mesi 1-5-0-tetraidropiranilneamina (R = benzile, R = te traidropiranile , R 3 = tert-butile e R 4 = metile in f ormula IV)

2,3 g (2,86 mai oli) del prodotto proveniente dal la fase (c) di cui sopra furono di sciolti in 80 mi di diossano, e 25 mi di idrossido di bario 0,05M furono aggiunti alla soluzione risultante. La miscela fu agitata a 60?C per 30 minuti, seguita da ulteriore aggi un ta d? 30 mi di idrossido di bario 0,05M in acqua ed agi fazione per un'ora. Furono poi aggiunti altri 30 mi di idrossido di bario 0,05M e tutta la miscela fu agitata per una ulteriore ora per aprire l'anello carbammato 1,6-ciclico. Dopo il completamento della reazione, il biossido di carbonio gassoso fu passato nella soluzione di reazione per separare il precipitato* che fu filtrato. Il filtrato fu fatto evaporare a pressione ridotta e il residuo fu estratto con 200 mi di cloroformio. l'estratto fu concentrato a secchezza a pressione ridotta per dare 2,24 g di una polvere giallo pallido di 3,2',6'-tri~N-benzilossicarbonil-3* ,4'-dideossi-5^0-tetraidropiranilneamina (R^ = benzile e R = tetraidropiranile in formula III').

La polvere cos? ottenuta fu disciolta in 50 mi di metanolo, al quale furono poi aggiunti 0,4 mi di trietilammina e 1,35 g (5,7??-moli) di tert-butil 4,6-dimetilpirimidil-2-tiolcarbonato . Dopo agitazione per tutta la notte a temperatura ambiente, la soluzione di reazione risultante fu evaporata a pressione ridotta per lasciare un residuo, che fu raccolto in 20 mi di toluene, seguito da aggiunta di n-esano per separare un precipitato. Il precipitato fu raccolto per filtrazione e lavato con acqua per produrre 2,24 g di una polvere d? 3?2',6'-tri-N-benzilossicarbonil-l-N-terfcbutoss?carbonile 3',4'-dideossi-5~0~tetraidropiranilneamina.

Una soluzione di questa polvere disciolta in 50 mi d? piridina fu mescolata con 574 mg (5,7*moli) di metano-sulf onil cloruro, e la miscela fu agitata per tutta la notte a temperatura ambiente. La soluzione di reazione risultante fu concentrata a secchezza e il residuo fu purificato per mezzo di cromatografia in colonna su gel di silice (150 g di Wako-gel C-200) sviluppata con toluene-acetone (5:1) per dare 1,65 g (60$) del composto del titolo. Punto di decomposizione 101-105?C. p] 22 29? (c 0,44, CHCl^).

(e) Preparazione di 3-0-benzoil-1,2',61-tri-N-benzi_ lossicarbonil-4-N-tert-butossicarb onil-5-0-tetraidropi ranil-N -degli ci 1-tri-N ,N ,0 -demetili stamicina A (R = benzile, R = tetraidropirani^ le, R3 = tert-butile e R5 = benzoile in formula VI) 1,37 g (1,43 mmoli) del prodotto della fase (d/J di cui sopra furono disciolti in 55 mi di tetraidrofurano secco, ed alla soluzione furono aggiunti 194 mg (3,6 mmoli) di metilato di sodio a 0?0 in atmosfera di argon. La miscela ottenuta fu agitata per 30 minuti e quindi lasciata riposare a 10?C per 15 ore. La soluzione di reazione risultante fu mescolata oon una quantit? in eccesso di cloruro di ammonio e acqua, se_ guita da estrazione con cloroformio. L'estratto fu concentrato a secchezza per dare 1,23 g di una polvere del derivato di azirldina (R = benzile , R e tetraidropiranile e R = tert-butile in formula V) .

M 22+ 10? ( c 0,5 , CHC13) . Rf 0, 41 in TLC su gel di silice sviluppata con benzene-etil acetato ( 1 : 1 ) *

1,12 g della polvere cosi ottenuta furono disciolti in 50 mi di dimetilformammide, a cui furono poi aggiunti 1,3 g di benzoato di sodio e la miscela fu lasciata riposare a temperatura ambiente per 10 ore per effettuare la fissione dell?anello aziridinico. La soluzione di reazione risultante fu mescolata con 300 mi di cloroformio e lavata due volte con cloruro di sodio acquoso saturato. Lo strato di cloroformio fu separato, essiccato con solfato di sodio anidro e concentrato a secchezza. Il residuo fu purificato per mezzo di cromatografia in colonna su gel di silice (180 g di Wako-gel C-200) sviluppata con toluene-etil acetato (5 :2) per produrre 878 mg (76$) del composto del titolp.Punto di decomposizione 84-86?C, L^JD 61? (c 0,49, CHCl^). Rf 0,54 in TLC su gel di silice sviluppata con benzene-etil acetato (l : l).

(f) Preparazione di tri-N ,N ,N -benzilossicarbonil-N4-tert-butossicarbonil-O 5-tetraidropiranil-N4-deglicil-tri-?^,?^ ,?^-deraitilistamicina A (R = benzile, R = tetraidropiranlle, RJ ? tert-butile e = H in formula IV).

860 mg (0,88 moli) del prodotto ottenuto nella fase (e) furono disciolti in 20 mi di una miscela di ammoniaca metanolica al 12$ e la soluzione fu lasciata riposare a temperatura ambiente per 40 ore per effettuare la rimozione del gruppo 3-0-benzoile. La soluzione di reazione risultante fu concentrata a secchezza e il residuo fu cromatografato su gel di silice (70 g di Wako-gel C 200) usando benzene-etil acetato (1 : l) come solvente di sviluppo per dare 693 mg (90$) del composto del titolo.Punto di decomposizione 88 - 90?C.

[?0*2 440 (c 0>5, OHOl ). Rf 0,18 in TLC su gel di silice sviluppata con benzene-etil acetato (1 : 1). (g) Preparazione di N^-deglicil-di-N^ ,0^-demetilistamicina A (composto di formula Vili)

.680 mg (0,78 moli) del prodotto della fase (f) di cui sopra furono disciolti in 10 mi di acido trifluoroacetico acquoso al 90$ a 0?C e lasciati riposare per due ore per effettuare la rimozione idrolitica del gruppo tetraidropiranile con eventuale rimozione del gruppo terfc-butossicarbonile. La soluzione di reazione fu quindi concentrata a secchezza. Il residuo ottenuto fu messo in 50 mi di cloroformio e lavato successivamente oon idrossido di sodio acquoso IN e acqua. Lo strato di cloroformio fu separato, essiccato con solfato di sodio anidro e concentrato fino a secchezza. Il residuo fu purificato per mezzo di cromatografia in colonna su gel di silice (50 g di Wako-gel C 200) sviluppata con un solvente miscelato di cloroformio-metanolo-ammoniaca acquosa al 17$ (80 : 10 : l) per dare 350 mg ( 65$) di una polvere di N fN , -benzilossicarbonil-N^-deglicil-tri-N^ ,?^ ,0^-deraitilistamicina A.

A una soluzione -di 293 mg (0,42 moli) della polvere ottenuta come sopra in 5 mi di metanolo fu aggiunta, una soluzione di 27 mg di carbonato di sodio in 0,5 mi di acqua, e quindi 55 mg (0,5 moli) di cloroformato di etile a 0?C. La miscela risultante fu agitata a temperatura ambiente per due ore per effettuare l'introduzione del gruppo etossicarbonile, dopo di che la. soluzione di reazione fu concentrata a secchezza e il residuo fu messo in 30 mi di cloroformio e lavato con acqua. Lo strato di cloroformio fu quindi essiccato con solfato di sodio anidro ed ancora concentrato a secchezza per dare 318 mg (98$) di una polvere di tri-N1,N2 ',N6'-bepzilossiearbonile-N 4-etossicarbonil-N4-deglicil-tri-N^ ,?^-demetilistamicina A (R^ = benzile e R^ = etile in formula VII). R^ 0,62 in TLC su gel di silice sviluppata con un solvente miscelato di cloroformio-metanolo-ammoniaca acquosa al 17$ (80 : 10 : 1).

La polvere cos? ottenuta fu disciolta in 8 mi di una miscela di metan?lo, acqua e acido acetico (2 : 1 : 1), a cui furono poi aggiunti 100 mg di palladiocarbonio 5$ come catalizzatore di idrogenolisi e la miscela fu lasciata riposare sotto una corrente di gas idrogeno per due ore per effettuare la rimozione dei gruppi benzilossicarbonilici. Dopo di ci?, il catalizzatore fu rimosso dalla miscela di reazione, che fu quindi concentrata a secchezza. Una soluzione del residuo disciolto in acqua fu passato attraverso una colonna di 11 mi di Amberlite CG--50 (forma NH^, un prodotto della Rohm & Haas Co., USA). La colcnna fu successivamente lavata con acqua e ammoniaca acquosa 0,1M e quindi eluita con ammoniaca acquosa 0,2M.

L'eluato proveniente dalla colonna fu concentrato a secchezza per dare 143 mg (95 $) di una polvere di N^-etossi-carbonil-N -deglicil-tri-N ,N ,0 -demetilistamicina A (R^ ?= etile in formula VII*)? R^ 0*55 in TLC su gel di silice sviluppata con cloroformiometanolo-ammoniaca acquosa al 17$ (3 ? 3 t l).

130 mg (0,36 moli) della polvere preparata come sopra furono disciolti in 6 mi di acido trifluoroacetico anidro a 0?C, la soluzione fu concentrata a secchezza e il residuo fu messo in 3 mi di tetraidrofurano secco. Alla soluzione risultante furono aggiunti 15 mi del complesso tetraidrofurano-idrur0 di loro 1M (un prodotto della Aldorich Co., USA) e la miscela fu agitata a 50?C per 18 ore per effettua re la conversione riduttiva del gruppo etossicarboni^ animino nel gruppo metilammino, Una certa quantit? d'a_c qua fu aggiunta alla soluzione di reazione, che fu quin di concentrata a secchezza e il residuo fu messo in 10 mi di acqua? la soluzione acquosa fu regolata a pH 8 con addizione di ammoniaca acquosa e passata attraverso una colonna di 30 mi di Amberlite CG-50 (for ma NH^). La colonna fu quindi successivamente lavata con acqua e soluzioni di ammoniaca acquosa 0,2 M, 0,3 M e 0,4 M e quindi eluita con ammoniaca acquosa 0,5 M. L'elu?to fu raccolto e concentrato a secchezza per dare 45 mg (40$) di monocarbonato del composto del titolo in fonua di polvere. Punto di decomposizione 115--118?C. [4 ] 22+ 1020 (c 0,65, HgO). Spettrometria di massa: m/e 304 (M+). TLC su gel di silice: R^,0,12 se sviluppata con lo strato inferiore di cloroformio-me tanolo-anunon?aca acquosa al 28$ (2:1:1) e R^,0,50 se sviluppata con butanolo-etanolo-cloroforraio-ammoniaca acquosa al 17$ (4:5:2:5).

Esempio 2

Preparazione di di-N ,0 -demetilistamicm a A (composto finale di formula I)

45 mg (O,123^moli) di N^-deglicil-di-N^ ,0^~ demetilistamicina A monocarbonato ottenuta nella fase (g) dell'esempio 1 di cui sopra furono disciolti in 3 mi di metanolo, e alla soluzione furono aggiunti 0,017 mi (0,123jnolr) di trietilammina e 94,9 mg (0,38 'm-moli) di N-benzilossicarbonilossisuccinaramide

0

N - OOC - 0 -

0

La miscela risultante fu lasciata riposare a temperatur ambiente per 6,5 ore per effettuare l'introduzione dei gruppi benzilossicarbonilicl come gruppo ammino-protettivo. La soluzione di reazione comprendente la tri-N^ N^ ,N^ -benzilossicarbonil-N^-deglicil-di-N^ , O^-demetilistamicina A cos? prodotta fu quindi concentrata a secchezza e il residuo fu raccolto in 3 mi di diossano, facendo seguire l'aggiunta di 67,9 mg (0,18 limoli) di estere N-idrossisuccinimmide di benzilossicarbonllglicina. La miscela cos? ottenuta fu lasciata riposare a 60?C per 6 ore per effettuare l'introduzione del gruppo glicile, dopo di che la soluzione di reazione comprendente la tetra-N ,N ,N ,N -benzilossicarbonil-di-N ,0 -demetilistamicina A cos? formata

Claims (8)

RIVENDICAZIONI :

1. Il composto, designato come di-N ,0 -demetilistamicina A, di formula strutturale

(I)

3

OH

COCH2NH2

e un sale acido di addizione di questo.

2. On procedimento per preparare il composto di formula (I) secondo la rivendicazione 1 che comprend bloccare simultaneamente con un gruppo ammino-protet tavo i tre gruppi ammino nelle posizioni 1-, 2'- e 6*- del composto avente formula strutturale:

(Vili)

far reagire il risultante derivato tri-N-protetto del composto (Vili) con glieina o una glieina N-protettagli cui gruppo ammino h stato bloccato con un gruppo ammino-protettivo o con un equivalente funzionale di detta glieina per acilare il gruppo metilammino non protetto nella posizione 4- del composto (VIII)je rimuovere tutti i rimanenti gruppi amraino-protettivi dal prodotto dell'acilazione.

3. Un procedimento come rivendicato nella rivendicazione 2jin cui il gruppo ammino-protettivo per il "bloccaggio dei tre gruppi ammino ? il gruppo benzilossicarbonile .

4. Un procedimento come rivendicato nelle rivendicazioni 3 o 4^in cui il derivato protetto del composto (Vili) ? fatto reagire con l*estere N-idrossisucainimmide della N-benzilossicarbonilglicina.

5. Un procedimento come rivendicato nella rivendicazione 2, 3 o 4>in cui i rimanenti gruppi ammlnoprotettivi Sono rimossi per mezzo di idrogenolisi.

6. Una composizione farmaceutica comprendente una quantit? terapeuticamente efficace del composto di formula (I) secondo la rivendicazione 1 o un sale di addizione acido farmaceuticamente accettabile di questo, in combinazione con un veieolo o coadiuvante farmaceuticamente accettabile.

7.-' Un metodo di Inibizione della crescita di batteri in un animale che comprende somministrare una quantit? terapeuticamente efficace del composto (I) secondo la rivendicazione 1 o un sale farmaceuticamente accettabile di questo ad un animale infettato da batteri o suscettibile di esserlo .

8. . Il composto, N -deglicil-di-N ,0 -demetilistami cina A avente formula strutturale:

???

4'

(Vili)

??

NH

3' NHCH

HO

DESCRIZI ONE

1. TITOLO DELL 'INVENZIONE

6 ' 3 . .

Di-N , 0 -demetilistamicma A e processo per la sua preparazione.

2. RIVENDICAZIONI

6 ?

1 . Di-N , O^-demetilistamicina A della formula (I )

H?N

(I )

NH OH

3 ? 2 0

NCH COCH2NH2

ed un suo sale di addizione acido.

6 ?

2. Un processo per la preparazione di di-N ,

0 3- 'dimetili st ami cina A della formula (I):

H~N

(I)

1

NH OH

3 2 0

NCH COCH2NH2

che comprende il bloccaggio simultaneo con un gruppo ammino-protettivo dei tre gruppi ammino nelle posizioni 1-, 2'- e 6' del composto di partenza, N4-deglicil-6? 3

-di-N , 0 -demetilistamicina A, della formula (Vili):

H~N

5 NH

(Vili)

NH CH

3

la reazione del risultante derivato protetto del com posto (Vili) con glicina^il cui gruppo ammino ? sta to bloccato con un gruppo ammino protettivo o con un equivalente funzionale di detta glieina per acilare il gruppo metilammino non protetto nella posizione 4- del composto (Vili) e la rimozione di tutti i rimanenti gruppi ammino protettivi dal prodotto di aci_ 1azione.

3. DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE.

Questa invenzione si riferisce a nuovi composti,

6' 3 .

di-N , 0 -demetilistamicina A e suoi sali di addizio= ;ne acidi, che sono utili come antibiotici amminoglicosidici sintetici, nonch? ad un processo per la preparazione dei composti.

Abbiamo scoperto antibiotici della istamicina A e della istamicina B che vengono prodotti con la coltivazione di una nuova specie di Streptomyces, e cio? il ceppo Streptomyces tenjimariensis SS-939 (Domanda di brevetto giapponese N, 52517/79)?

Abbiamo condotto studi approfonditi sulla produzione sintetica della istamicina A partendo dalla 3'? 4'-dideossineamina (vedere "Journal of Antibiotics", 32, 1365-1366 (1979). In un ulteriore sviluppo dei nostri ampi studi ora-abbiamo con successo preparato.f'

. un nuovo composto, di-N ,0 -demetilistamicina A, e . trovato che il composto presenta un'attivit? antibatterica'contro la Pseudomonas aeruginosa pi? alta di quella della istamicina A,

Secondo un primo aspetto di questa invenzione, co me nuovi composti sono forniti di-N ,0 -dimetilista micina A della formula (i):

H?N

(I)

NH

NCH COCH2NH2

6

e suoi sali di addizione acidi.

Il nuovo composto di questa invenzione ha le se guenti propriet? biologiche e fisico? chimiche:

Il monocarbonato di di-N , 0 -demetili stamicina A ? in forma di polvere incolore che si decompone a 138-1 45 ?C, d?- una rotazione ottica specifica di

cTj2p 136? (c 0,36 in acqua) e presenta un'analisi de gli elementi: - Trovato: C, 45,39%$ H, 7*63%; N, 16,42% che ? conforme ai valori teorici di C H N 0 ,H CO. (C, 45*38%; Hf 7,85%; N, 16,54%). La spettrometria di massa del monocarbonato mostra il picco di (M+1 )+ a n/e = 362 e la sua cromatografia in strato sottile su gel di silice d? una macchia singola (positivo al reagente ninidrina) a Rp 0,06 se sviluppato con la fase inferiore di una miscela solvente di cloroformio--metanolo-ammoniaca acquosa al 28% (2:1:1 in volume) o a Rp 0,46 se sviluppato con una miscela solvente di butanolo-etanolo-cloroformio-ammoniaca acquosa al 17% (4:5:2: 5 in volume).

Gli spettri antibatterici della di-N , 0 -deme tilistamicina A secondo questa invenzione sono indicati in tabella 1 per raffronto con quelli della istamicina A

TABELLA 1

Concentr azi oni inibitorie minime (mcrg/ml) Microorganismi di prova Di-demethyl- Istamicina istamicina A A Staphylococcus aureus FDA 209P 1 ,56 ' 0,78 Smith <0,20 <0,20 ApOI 1,56 0,78 Staphylococcus epidermidis 109 1,56 0,78 Micrococcus flavus FDA 16 3,13 3,13 r Sarcina lutea PCI 1001 0,78 0,20 Bacillus anthracis 0,39 <0,20 Bacillus subiilis PCI 219 < 0,20 <0,20 Bacillus subtilis NRRL B-558 < 0,20 0,39 Bacillus cereus ATCC 10702 3,13 3,13 Corynebacterium bovis 1810 1 ,56 1 ,56 Mycobacterium smegmatis ATCC 607 0,39 1,56 Escherichia coli NIHJ 6,25 3,13

11 K-12 6,25 1,56

II K- 12 R5 100 3,13

II K-12 R388 1 ,56 0,78

II K-12 J5R11-2 3,13 3,13

II K-12 ML1629 3,13 3,13

n K-12 ML1630 12,5 3,13

II K-12 ML1410 6,25 3,13

II K-12 ML1410 R81 3,13 1 ,56

il K-12 LA290 R55 12,5 3,13 Escherichia coli K-12 LA290 R56 3,13 1,56

? " K-12 LA290 R64 3,13 1,56

" " W677 3,13 1,56

? " JR66/V677 6,25 3,13

? " K-12 C600 R135 >100 >?100

fcy ?' " JR225 3,13 1 , 56 ? K1ebsiella pneumoniae PCI602 3,13 1 ,56

" " 22 - 3038 12,5 3,13 Shigella dysenteriae JS11910 12,5 3,13 Shigella fiexneri 4B JS11811 12,5 6,25 Shigella sonney JS11756 6,25 6,25

Saimonella typhi .T-63 3,13 0,78 Salmonella enteritidis 1891 6,25 3,13 Proteus vulgaris 0X19 1,56 0,78 Proteus rettgeri GN311 50 25

? ? GN466 12,5 6,25 Serratia marcescens 12,5 6,25 Serratia sp. SOU >100 >100

Serratia sp. 4 50 50 Providencia sp. PV16 12,5 6,25 Providencia sp. 2991 12,5 25 Pseudomonas aeruginosa A3 3,13 6,25

No.12 25 100

H9 12,5 25

HI 1 50 100

Pseudomonas aeruginosa TI-13 12,5 25 GN 315 25 25 99 >100 >100 B-13 > 100 >100 21-75 > 100 >100 PST 1 50 100 ROS 134/ 50 100

PU 21

K-Ps 102 12,5 50 Pseudomonas maltophilia GN 907 >100 >100

Il composto di questa invenzione, diTN ,0 -deme tilistamicina A ? ottenuto usualmente in forma di ba se libera o suo idrato o carbonato, che pu? essere convertita nella forma di qualunque sale acido di ad dizione non tossico farmaceuticamente accettabile per mezzo di reazione con un acido farmaceuticamente accettabile in un modo convenzionale. Esempi di acidi da usare a questo scopo includono acidi inorganici come l'acido cloridrico, bromidrico, solforico, fosforico e nitrico e acidi organici come l'acido aceti_ co, malico, citrico, ascorbico e metansolfonico.

In accordo con un secondo aspetto di questa invenzione, viene fornito un procedimento per preparare la di-N ,0--demetilistamicina A della formula (I): . ? IJ-,??

L^LL

?2

?&d* i>

NH

SS-

l

NCH-ri .

v ? 3

COCH2NH

che comprende: il bloccaggio simultaneo con u

animino protettivo dei tre gruppi animino nelle

4

ni 1-, 2?- e 6?- del composto di partenza, N -deglicilg| o .

-di-N f (J -demetilistamicina A, formula (Vili):

HoW

NH

(Vili) NH CH

OH

protetto

la reazione del risultante derivato del composto (Vili) con glicina^il cui gruppo animino ? stato bloccato con un gruppo ammino-protettivo o con un equivalente funzionale di detta glieina per acilare il gruppo metil ammino non protetto nella posizione 4- del composto (Vili); e la rimozione di tutti i rimanenti gruppi ampino-protettivi dal prodotto dell* acilazione

Il composto di partenza della formula (Vili) da usare nel presente procedimento, e cio? N4-deglicil-6 1 3

-di-N , 0 ??demetilistamicina A, pu? essere preparato usando come materiale iniziale 3* f4'-dideQSsineamina cele, a sua volta, pu? essere ottenuta con una tecnica nota descritta nel 'Journal of Antibiotics" 24, 711-712 (1971 ) o nel "Bulletin of th? Chemical Society of Japan" 46 , 3507-3510 ( 1973) . Il metodo di preparazio ne del composto iniziale ? riassunto come segue:

I quattro gruppi ammino esistenti nella 3' , 4'-dideossiL neamina della formula (II ) :

(II)

sono bloccati con un gruppo ammino-protettivo di tipo formante uretano e quindi convertiti nel derivato carbammato 1,6-ciclico trattando con una base. Il gruppo idrossile in posizione 5-del derivato carbammato 1,6-ciclico ? bloccato con un gruppo idrossil-protet^ tivo per produrre un composto della formula (III): R1QC-N

H OR

4' CO

NH (III)

NH

CO R 0

1

in cui ciascun R OCO rappresenta il gruppo ammino-pro 1 tettivo monovalente di tipo formante uretano^dove R ? un gruppo alchile, un gruppo cicloalchile o un

2

gruppo aralchile e R rappresenta un gruppo alchile^, un gruppo benzile o un gruppo tetraidropiranile come il gruppo idrossil-protettivof Successivamente, il composto della formula (III) ? trattato con un alcale per idrolizzare la forma del carbammato 1,6-cicld^ co, seguito dalla protezione del gruppo ammino libero nella posizione 1- con un gruppo ammino protettivo di tipo formante uretaAo diverso dal sopraddetto gruppo ammino protettivo^e dalla solfonilazione del gruppo idrossile libero nella posizione 6- in forma di estere solfonico per produrre un composto della for mula (IV):

R^OC-N

Il H OR

co (IV)

1 4 NH

3 NH

NHCOOR CO

1 R 0

OR OSO2R4

1 2

in cui R e R hanno gli stessi significati di cui 3

sopra, R OCO- rappresenta il gruppo ammino-protettivo monovalente di tipo formante uretano^dove R ? un gruppo alchile, un gruppo cicloalchile o un gruppo aralchile ma diverso dal gruppo R f e R rappresenta un gruppo alchile, arile o aralchile. Il composto del_ la formula (IV) ? quindi trattato con una base per formare un composto portante un anello aziridinico ed avente la formula (V):

R^OC-N

\ H

OR CO OR

(V) NH

NH

3

R 0

OR

1 2 3

in cui R , R e R sono come definiti sopra. Il composto della formula (V) ? ulteriormente trattato con un sale di metallo alcalino di un acido organico per aprire l ' anello aziridinico, producendo in tal modo un composto della formula (VI ) :

iroc-N-

(VI)

NHCOOR

OR

in cui R , R e R sono come definiti sopra e R rap? presenta un gruppo aci le come il gruppo alcanoile o benzoile. I gruppi idrossil-protettivi nelle posizioni 3- e 5- del composto (VI ) vengono rimossi da quest 'ultimo in un modo convenzionale e, se necessario, viene nuovamente introdotto un gruppo ammino--protettivo di tipo formante uretano nel gruppo 4--ammino libero, per dare un composto della formula (VII ) :

R1OC

NHCOOR

5 OH

in cui R e R sono come definiti sopra? Dopodich?, i ; gruppi ammino-protettivi nelle posizioni 1-, 21- e 6 ?-del composto (VII) sono rimossi da questo in . una maniera usuale, cui fa seguito la riduzione con un idru ro di metallo per metilare il gruppo 4-ammino? Viene cos? prodotto il composto di partenza della formula (Vili ) di cui sopra.

Viene data di seguito una descrizione di una applicazione preferenziale del metodo per la prepar azio ne del composto di partenza (Vili ) ,

Nella prima fase, i quattro gruppi animino nelle posizioni 1-, 3-, 2 ?- e 6?- della 3* ,4'-dideossineamina della suesposta formula (il) sono bloccati con un noto gruppo ammi no-protettivo di tipo formante uretano per dare un derivato ammino-protetto della 3* ,4'-dideossiL neamina avente la formula (II 1 ) !

R-'-OC-N

Il H

OR (??' )

NH NH NHCOOR CO OH

in cui ciascun R OCO- sta per il gruppo ammino-protel: tivo monovalente di tipo formante uretano^dove R ? un gruppo alchile, cicloalchile o aral'chile. Il gru? po ammino-protettivo da usare per questo scopo ? un gruppo capace di formare un anello carbammatq ciclico se trattato con una base nella fase seguente. Esempi del gruppo ammino-protettivo di tipo formante uretano comprendono gruppi alchilossicarbonile come tert-butojs sicarbonile e tert-amilossicarbonile; e gruppi ciclo alchilossicarbonile come cicloesilossicarbohile e gruppi aralchilossicarbonile come benzilossicarbonile e para-metossibenzilossicarbonile. Fra questi ? preferibile usare un gruppo ammino-protettivo di tipo formante uretano^ che ? facilmente rimovibile dal gruppo ammino-protettivo che sar? stato successivamente introdotto nel gruppo 1-ammino della 3'? 4?-dideoss? neamina come esposto di seguito. A tal fine ? raccomandabile scegliere un gruppo aralchilossicarbonile che pu? essere rimosso per idrogenolisi. L 'introduzione del gruppo ammino-protettivo pu? essere eseguii ta facilmente con qualunque procedura convenzionale, per esempio per reazione con un alogenuro acido, azo turo acido o estere attivo.

Nella seconda fase , il composto della formula (II * ) ? tratt?to con una base per dare un composto in ^orma di carbammato 1 ,6-ciclico avente la formula (II" ) iTOC-N

I H OR

(IX? )

CO

5' 2' NH

1' 4

NH 3 6

CO

HO

in cui R ? come definito sopra. Fra i quattro gru? pi ammino-protettivi del derivato (II*) tetra-N--protetto della 3?,4'-dideossineamina, il gruppo am mino-protettivo in posizione 1- ? fatto reagire facil mente persine a bassa temperatura, per esempio infe^ riore a 0?C, con il gruppo idrossile adiacente nella posizione 6- per formare il carbammato ciclico quando sia trattato con una base come idruro di sodio o idruro di litio in un appropriato solvente come dimetilformammide anidra.

Nella terza fase, il gruppo idrossile in posizione 5- del composto carbammato ciclico (II") ? bloccato con un noto gruppo idrossil-protettivo in un modo usuale per produrre uri composto della formu la (III):

R^-OC-N OR

CO

I NH (III)

NH

CO R 0

1 2

in cui R ? come definito sopra e R ? un gruppo al_ chil?, benzile o tetraidropiranile.Questa fase ? seguita dal trattamento con un alcale per idrolizzare l'anello di carbammato 1,6-ciclico,ottenendo ' un _ composto della formula (III1); _ _

R^-QC-N? \6'

H

OR

CO (III1)

NH

3

R 0

in cui R e R sono come definiti sopra.

Il gruppo protettivo per bloccare il gruppo

5-idrossile del composto (II*) di carbammato 1,6 ciclico non deve essere suscettibil^ e condizioni in cui ? condotta detta idrolisi alcalina. Di conseguenza, fra i gruppi idrossili-protettivi noti, vengono scelti_ quelli del tipo etere come alchil eteri e benzil eteri e quelli del tipo acetale come tetraidropirani le, i quali possono essere tutti introdotti nel gru? po 5-idrossile con una tecnica ^convenzionale. In par ticolare, ? preferibile impiegare un gruppo tetraidropiranile che ? facilmente rimovibile per idroli_ si in condizioni moderatamente acide.

La successiva idrolisi del composto carbammato 1,6-ciclico (III) pu? essere ottenuta con trattamene to in una soluzione acquosa diluita, ad esempio di idrossido di sodio o idrossido di bario e porta alla formazione di un amminoalcool libero rappresentato dalla formula (III ' ) di cui sopra. L 'idrolisi pu? es sere preferibilmente eseguita ad una elevata temperatura compresa fra 40 e 60?C e ad una concentrazione di alcale di 0,1 M o minore. Queste condizioni di reazione non hanno alcun effetto sugli altri gruppi ammino- e idrossil- protetivi e danno quindi luogo alla formazione preferenziale del composto 1 ,6-ammi noalcool della formula (??? ' ) .

Inoltre, il gruppo 1-ammino del composto (III * ) ? bloccato con un diverso gruppo ammino-protettivo di tipo formante uretano, e il gruppo 6-idrossile ? solfonilato per reazione con un reagente solfonilan te, per esempio un solfonil alogenuro della formula: R 4 SO^X^in cui R 4 ? come definito sotto e X ? CI o Br. In tal modo viene prodotto un composto della formula (IV) :

R^QC-N ? '

J ?

0 OR

co

.v, . CIV) NH 5 ? . ???? :?? ! ? : ? ; 3? NH

CO NHCOOR'

R O

OSO2R4

1 2

in cui R e R hanno gli stessi significati come so-3

pra^ R ? un gruppo alchile, cicloalchile o aralchile ma differente dal gruppo R1 , e R4 rappresenta un gruppo alchile, arile o aralchile.

Come gruppo di protezione del gruppo 1 -ammiro li_ bero del composto (III * ) 1 ,6-amminoalcool si preferisce usare ancora un gruppo ammino-protettivo di tipo formante uretano e particolarmente un gruppo alchibssicarbonile, poich? quest 'ultimo pu? essere selettiva mente trattenuto nel composto che si deve produrre at traverso il successivo trattamento di rimozione degli altri gruppi ammino-protettivi nelle posizioni 3-* 2 ?- e 6 ' - ed ? molto vantaggioso, come specificato in seguito, per l a reazione di N-metil azione.

La summenzionata solfonil azione del gruppo 6-?droj p ie pu? essere effettuata facilmente a temperatura ambiente con una buona resa per trattamento in un opportuno solvente organico, come piridina secca, con un noto reagente di solfonilazione come solfonil alo

4

genuro della formula R SC^X, specialmente metanosolfonil, parat?luenesolfonil o benzilsolfonil cloruro.

In tal modo, viene prodotto un composto della suesposta formula (IV) che ? un utile composto inter medio nel processo di questa invenzione.

Nella fase successiva, il composto della1formula (IV) ? trattato con una base per trattare un composto che porta l'anello di aziridina della formula seguente (V):

??r?

iif tiW tf.: ?i

2 3

in cui R ? R e R sono come definiti sopra, detta fase essendo seguita da un ulteriore trattamento con un sale di metallo alcalino di un acido organico per aprire l ' anello di aziridina.

Il composto di aziridina pu? essere ottenuto con una buona resa trattando il composto (IV) con un,a base come alcoolato di sodio in un solvente

anidro come tetraidrofurano secco? La?reazione pu? procedere anche a bassa temperatura, compresa ' ;fra 0 e lO?Cyalla quale temperatura la reazione pu? essere generalmente portata a termine in una notte. Il composto di aziridina (V) cosi prodotto, che ? un im portante composto intermedio per la preparazio ne del composto oggetto di questa invenzione, pu? es_ sere sottoposto direttamente (cio? senza puriiicazio ne) alla successiva reazione di apertura dell?anello.

L?apertura dell?anello aziridinico pu? essere ef fettuata con una resa favorevole per reazione con un sale di metallo alcalino di un acido organico come benzoato di sodio o acetato di sodio in un solvente . anidro come dimetilformammide secca, dando luogo alla produzione di una nuova forma di amminociclitolo con trasposizione tra gruppo animino ed il gruppo idrossile? Allora, il gruppo protettivo di ti po uretano rimajier nel gruppo ammino^mentre il gruppo acile derivato dall ? acido organico usato nella reazione di apertura dell ? anello viene introdotto nel gruppo idrossile. Rispetto alla nuova forma di ammino ciclitolo (1 ,4-diammino-1 ,2,4-trideossiamminociclitol derivato) , la numerazione ? data conf ormemente alla r nomenclatura per la fortirnicina e la istamicina come indicato a partire dalla formula (VI ) . Per quanto ri^ guarda i composti di amminociclitolo '( 1 , 3-diammino--1 ,2, 3-trideossiarnminociclitol derivati ) rappresenta ti dalle suesposte formule (I ) e (V) , la numerazione ? data conformemente alla nomenclatura della 2 -deossi streptamina.

L 'apertura dell ' anello di aziridina porta alla formazione di un composto della formula (VI ) :

ROC-N ? 16'

H

OR

CO

(VI)

NH

3' NH

co NHCOOR

R 0

in cui R , R e R sono come definiti in precedenza 5

e R ? un gruppo acile come ad esempio un gruppo alca noile o benzoile.

I gruppi protettivi idrossile nelle posizioni 3-e 5- del composto (Vi) sono quindi rimossi da questo e, se necessario, il gruppo ammino-protettivo di tipo formante uretano viene di nuovo introdotto nel gruppo 4-ammino per la produzione di un composto della formula (VII ) :

RXOC-N

1

OR

CO (VII)

? NH 2

l0

CO NHCOOR

5 OH

1 3

in cui R e R sono come definiti sopra.

Il gruppo acile quale gruppo idrossil-protettivo nella posizione 3- pu? essere facilmente rimorso per mezzo di un comune elicale, per esempio una soluzione di ammoniaca metanolica, mentre il gruppo idrossil--protettivo nella posizione 5- come il gruppo tetraidro piranile pu?, come gi? detto, essere rimosso con l*i drolisi acida in condizioni moderatamente acide per esempio trattandolo con una soluzione acquosa di aci_ do trifluoroacetico ad una temperatura bassa compresa fra 0 e 10?C, Se il gruppo ammino-protettivo del tipo uretano nella posizione 4- ? sensibile all*idrolisi moderatamente acida, come ? il caso del gruppo terbu tossicarbonile, esso sar? rimosso nel corso della rea zione. E? allora necessario che il gruppo ammino-pro tettivo di tipo formante uretano che ? differente da quello usato per bloccare i gruppi 1-, 2?- e 6'- ammi no venga nuovamente introdotto nel gruppo 4- ammino libero. 1 .31 gruppo ammino-protetti_ vo del tipo formante uretano che deve essere nuovamen te introdotto dovrebbe essere preferibiloiente non sensibile alla successiva

* reazione per la rimozione degli altri gruppi ammino--protettivi nelle posizioni 1-, 2'- e 6'- ?d 'essere uti= lizzabile per la N-metilazione nella posizione 4-* E sempi preferiti di ess sono gruppi metossicarbonile e etossicarbonile.

Successivamente, i gruppi ammino-protettivi nel^ le posizioni 1-, 2'- e 6'- del composto (VII) vengono rimossi da esso per produrre un composto della for?

mula (VH '):

H_N

(VII')

1 6 NH

3' NH 1 NHCOOR

HO OH

3

m cui R ? come definito sopra.

Nella suesposta reazione i gruppi ammino-prote;t tivi nelle posizioni 1-, 2?- e 6'- sono rimossi selettivamente per dare il composto (VII')? cio? N^-de

4 6* 3 . .

glicil-tri-N , N , 0 -demetilistamicm a A, in cui sol tanto il gruppo 4-ammino rimane bloccato con il gruppo protettivo del tipo uretano.

- Nella fase finale, il composto (VII1) ? ridotto con un idruro di metallo per metilare il gruppo 4-am mino, producendo N -deglicil-di-N ,o -demetilistami cina A della formula (Vili):

~N

NH

(Vili) \

CH

OH

La 4-N-metilazione pu? essere effettuata riducen do il composto (VII') con un idruro di metallo come idruro di litio-alluminio o idruro di boro in un solvente anidro quale tetraidrofurano secco? La reazione ? preferibilmente effettuata ad una temperatura compresa fra 40 e 60?C per un periodo minimo di 10 ore, Viene cos? prodotto N -deglicil-di-N , 0 -demetil istamicina A (formula Vili) che ? usata come materia le di partenza del processo di questa invenzione,

Il monocarbonato di N -deglicil-di-N , 0 -dem^ tilistamicina A cos? prodotto ? in forma di polvere incolore che si decompone a 115-118?C, d? una reazio ne ottica specifica di Hf 102? (c 0,65, acqua) e presenta un'analisi degli elementi: Trovato: C, 46,15? H, 7?97 ? N, 15,37% che ? coincidente con i valori .teorici di ^ 3H25N404,H2C03 (C ? 45 ,89 ; Hf 8,25 ;

N, 15 ,29%) . La spettrometria di massa del monocarbo nato mostra il picco M a nye == 304f e la sua croma tografia in strato sottile su gel di silice d? una singola macchia ^positiva al reagente ninidrina) , a R^ 0,12 se sviluppata con la fase inferiore di una miscela di solvente di cloro formio-metanolo- ammoni ac a acquo sa al 28% (2: 1 : 1 in volume) o a R^, 0,50 se sviluppa ta con un solvente miscela di butanolo-etanolo-clo roformio-ammoniaca acquosa al 17% (4: 5:2: 5 in '?volume).

Secondo il procedimento di questa invenzione, il composto oggetto di questa invenzione, di-N , 0 --demetilistamicina A (formula I) ? preparato per mez zo di glicilazione, cio? di acilazione con glieina del gruppo metilammino in posizione 4- del composto N -deglicil-di-N , 0 -demetilistamicina A (formula Vili). Allo scopo di acilare il gruppo 4-metilammino con glieina con un'alta resa, ? preferibile bloccare precedentemente i gruppi animino nelle posizioni 1-, 2'- e 6'- con un gruppo ammino-protettivo. Fortunatamente, vi ? una considerevole differenza di reatti_ vit? fra questi tre gruppi animino e il gruppo 4-metil^ animino. Pertanto, pu? essere preparato con alta resa un derivato tri-N-protetto del composto (vili), i cui gruppi animino sono stati bloccati nelle posizioni 1-, 3'--e 6'-, per mezzo di un metodo convenzionale per 1 'introduzione di un noto gruppo ammino-protettivo, per esempio facendo reagire il composto N -deglicil--di-N^ , 0^-demeti?stamicina A con 3 - 3?5 equivalen ti molari di un noto reagente ammino-protettivo in forma di alogenuro acido, azotur acido, estere attivo o anidride acida. Esempi di questi noti gruppi ammi no-protettivi' adatti allo scopo comprendono gruppi alcossicarbonile come il tert-butossicarbonile e il tert-amilossicarbonile; gruppi cicloalchilossi?arbo nile come il cicloesilossicarbonile; gruppi aralchi lossicarbonile come il benzilossicarbonile; gruppi acile come trifluoroacetile e O-nitrofenossiacetile; gruppi fosfinotioile come il difenilfosfinotioile e il dimetilfosfinotioile; e gruppi fosfinile come il difenilfosfinile. Noti gruppi bivalenti ammino-protettivi possono essere usati per bloccare i gruppi ammano in forma di base Schiff.

Il derivato tri?N?protetto cos? preparato pu? es^ sere usato direttamente senza purificazione, per la successiva glicilazione del gruppo 4-metilammino. La reazione di glicilazione pu? essere effettuata usando la glieina stessa o un equivalente funzionale di questa secondo una qualunque tecnica nota impiegata per la sintesi dei peptidi, l'equivalente funzionale creila glieina comprendendo dicicloesilcarbodiimmidi, anidridi acide miscelate, azoturi ed esteri attivi della glieina. E* preferibile che il gruppo animino del la glieina debba essere precedentemente bloccato con un gruppo ammino-protettivo^ che pu? essere lo? stesso o diverso da quello usato per i gruppi ammino del com posto N4-degli cil-di-N 6* , 03 -demetilistamicina A. Esem pi preferenziali del gruppo ammino-protettivo da usar si convenientemente sono il gruppo benzilossicarbonile che ? rimovibile per idrogenolisi in presenza di un catalizzatore, come l ' ossido di palladio o di platino, o il gruppo tert-butossicarbonile che ? rimovibi^ le con idrolisi acida, per esempio in una soluzione acquosa di acido trifluoroacetico o acetico o in una soluzione diluita di acido cloridrico.

In una forma preferenziale del presente procedi^ mento, la reazione di glicilazione pu? essere esegui ta usando un estere attivo di glieina ad una elevata temperatura compresa fra 40 e 60?C in un opportuno solvente organico come il diossano. Come estere attivo di alta reattivit? si pu? menzionare l'estere N-idr? succinimmide della N-benzilossicarbonilglicina, che pu? essere prodotto in un modo convenzionale e che pu? essere usato in una proporzio ne di 1 a 1 ,5 equivalenti molari.

Il seguente riferimento illustra la preparasi? ne del composto di partenza da usare nel procedimento dell1 invenzione, e l'esempio riportato di seguito illustra il presente procedimento.

Riferimento 1

(a) Preparazione di 1 ,3,2' ,6 '-tetra-N-benzilossicar bonil-3' ,4'-dideossineamina (R = benzile nella formula ' II ' ) .

2 , 10 g (7,23 mmoli ) di 3' ,4'-dideossineamina sono sciolti in 100 mi di una miscela di acqua e meta nolo (1 :5 ) ed alla soluzione sono aggiunti 11 f9 g (45, mmoli ) di benzil 4, 6-dimetilpirimid?l-2-tiolcar bonato e 2 , 3 mi di trietilammina, facendo seguire agi. t azione a temperatura ambiente per 15 ore. La soluzione di reazione risultante ? concentrata fino a es_ siccazione a pressione ridotta e, successivamente, il residuo ? lavato con 300 mi di acqua e 200 mi di etere etilico per dare 6 ,0 g del composto del titolo in forma di polvere giallo pallida. Resa 100%. Punto di decomposizione 2 37-2 38 ?C.

MD? 45? (C 2> CHct3)e

(b) Preparazione di 3,2 ' , 6 '-tri -N-benzilossi carbon?i 3' ,4'-dideossineamina 1 ,6-carbammato (R = benzil nella formula II") ?

1 , 34 g ( 1 ,62 mmoli ) di 1 , 3,2* ,6 '-tetra-N-benzi lossicarbonil-3' ,4'-dideossineamina ottenutemeli a suddetta fase (a) sono sciolti in 13 mi di dimetilfor mammide anidra, a cui sono aggiunti 235 mg (4,9 mmoli) di idruro di sodio (50% di sospensione in olio) mediante raffreddamento con ghiaccio in un*atmosfera di gas argon. La miscela ? agitata per 4 ore, dopo di che la soluzione di reazione risultante ? neutra lizzata con ?cido acetico e versata in 500 mi di acqua ghiacciata per separare un precipitato. Il precipitato ? raccolto per filtrazione e depurato peir mezzo di cromatografia in colonna su gel di silice

(50 g di Waho-gel C-200 prodotto dalla WakojunyaJcu Co., Giappone) sviluppato,con miscele di solventi di cloroformio/acetone ?2:1 e 1:1) per dare 683 mg del composto del titolo. Resa 62%.

[?] - 580 (c 2 , CHC13).

R^, 0,25 in cromatografia in strato sottile (TLC) su gel di silice sviluppata con cl or of orini o-etanolo (20: 1 ) .

(c) Preparazione di 3,2 * ,6*-tri-N-benzilossicarbonil--3* ,4' -dideossi-5-0-tetraidropiranilneamina 1 ,6--carbammato (R = benzile e R = tetraidropira nile nella formula III).

3,7 g (5,15 mmoli) di 3,2*,6'-tri-N-benzilossi_ carbonil-3',4'-dideossineamina 1,6 carbammato ottenuti nella fase (b) di cui sopra sono sciolti in 50 mi di dimetilf ormammide, e alla soluzione sono aggiunti 1 , 3 g ( 15 ,5 mmoli ) di 3?4-diidro-2H-pirano e 196 mg ( 1 ,0 mmoli ) di acido para-toluene-solf onico anidro. La miscela ? lasciata riposare a temperatura ambiente per 72 ore, e 1 mi di trietilammina ? aggiunto alla soluzione di reazione risultante, che ? poi fatta eva porare a pressione ridotta per lasciare un residuo? Quest ? ultimo ? cromatogr afato su gel di silice ( 300 g di WaJco-gel C-200) usando cloroformio-etanolo t 100: 1 ) come solvente di sviluppo per produrre 2,4 g del com posto del titolo. Punto di decomposizione 79 - 83?C. Resa 57%. 33? (c 0,5 , CHC1 ) ? R_ 0,51 in TLC su gel di silice sviluppata con clorof ormio-eta nolo (15 : 1 ) .

(d) Preparazione di 3,2 1 ,6 ?-tri-N-benzilossicarbonil_ 1-N-tert-butossicarbonil-3' ,4*-dideossi-6? 0-mesil 5-0-tetraidropiranilneamina (R = benzile, R = = tetraidropiranile, R = tert-butile e R = meti_ le nella formula IV) ,

2 , 3 g (2 ,86 mmoli ) di 3* ,2 ? ,6 *-tri-N-benzilossi_ carbonil-3' ,4,-dideossi-5~0-tetraidropir ani Ine amina 1 ,6-carbammato proveniente dalla fase (c) di cui sopra sono sciolti in 80 mi di diossano, e 25 mi di idrossi_ do di bario 0,0 5M sono aggiunti alla soluzione risultante. La miscela ? agitata a 60? C per 30 minuti, seguita da ulteriore aggiunta di 30 mi di idrossido di bario 0,05M ed agitazione per un' ora. Vengono poi aggiunti altri 30 mi di idrossido di bario 0f 05M e tutta la miscela ? agitata ancora per un'ora. Al termine della reazione, il biossido di carbonio gassoso ? passato nella soluzione di reazione per separare il precipitato, che viene filtrato. Il filtrato ? fajt to evaporare a pressione ridotta e il residuo ? estrat to con 200 mi di cloroformio. L'estratto ? concentrato fino all ' essiccazione a pressione ridotta per dare 2 ,24 g di una polvere giallo pallido di 3,2 ? ,6 ?--tri-N-ben zi los si carbon?i -3' , 4'-dideossi-5-0-tetraidropirani Ine amina (R = benzile e R = tetraidropiranile nella formula III ' ) .

La polvere cos? ottenuta ? sciolta in 50 mi di metanolo, al quale sono poi aggiunti 0,4 mi di tri e tilammina e 1 , 35 g (5,7 mmoli ) di tert-butil 4,6-dime tilpirimidil-2-tiolcarbonato. Dopo l'agitazione, d?lia mi= scela per tutta la notte a temperatura ambiente, la soluzione di reazione risultante ? fatta evaporare a pressione ridotta per lasciare un residuo, che ? assorbito in 20 mi di toluene, seguito da aggiunta di n-esano per separare un precipitato. Il precipitato ? raccolto per filtrazione e lavato con acqua per pr? ?durre 2,24 g di una polvere di 3,2 ' ,6 '-tri-N-benzilos sicarbonil-1-N-tert-but ossi carboni 1-3' ,4'-dideossi--5-0-tetraidropiranilneamina,

Una soluzione di questa polvere sciolta in 50 mi di p?ridina ? mescolata con 574 mg (5,7 mmoli ) di me tano-sulfonil cloruro, e la miscela ? agitata per tutta la notte a temperatura ambiente. La soluzione di reazione risultante ? concentrata fino all 'essiccazione e il residuo purificato per mezzo di cromato grafia in colonna su gel di silice ( 150 g di Wako-gel C-200) sviluppata con toluene-acetone (5 : 1 ) per dare 1 ,65 g del composto del titolo. Resa (60%) ? Punto di decomposizione 101-105?C. ?o(J ^ 2-9? (c 0,44, CHCl^) . (e) Preparazione di 3-0-benzoil-1 ,2 1 ,6 *-tri-N-benzi_ lossicarbonil-4-N-tert-butossicarbonil-5-0-tetra idropiranil-N -degl i ci 1-tri -N ,N ,0 -demetilista m?cina A (R = benzile, R = tetraidropiranile, R 3 = tert-butile e R 5 = benzoile nella formula Vi ) .

1 , 37 g ( 1 ,43 mmoli ) di 3 ,2 ' ,6 '-tri-N-benzilos^ sicarbonil-l-N-tert-butossicarbonil-S' ,4'-dideossi-6--0-mesil-5-0-tetraidropiranilneamina della fase (d) di cui sopra sono sciolti in 55 mi di tetraidrofurano secco, ed alla soluzione sono aggiunti 194 mg ( 3,6 mmoli ) di metilato di sodio a 0?C in un' atmosfera di gas argon. La miscela ottenuta ? agitata per 30 minuti -e quindi lasciata riposare a 10?C per 15 ore. La soluzione di reazione risultante ? mescolata con una quantit? in eccesso di cloruro di amm?nio e acqua, seguita da estrazione con cloroformio. L' estratto ? concentrato fino all 'essiccazione per dare 1 ,23 g di una polvere del derivato di aziridina (R = benzile, R = tetraidropiranile e R = tert-butile nella formula V)e D 10? (c 0,5 , CHC1 )? Rp 0,41 in TLC su gel di silice sviluppata con benzene-etil ace tato (1:1).

1,12 g della polvere cos? Ottenuta sono sciolti in 50 mi di dimetilformammide, a cui sono poi aggiunti 1,3 g di benzoato di sodio e la miscela ? fatta reagire a 105?C per 10 ore. La soluzione di reazione risultante ? mescolata con 300 mi di cloroformio e lavata due volte con cloruro di sodio acquoso saturato. Lo strato di solvente ? separato, essiccato con solfato di sodio anidro e concentrato fino all'essiccazione. Il residuo ? depurato per mezzo di cromatografia in colonna su gel di silice (180 g di Wako-gel C-200) sviluppata con toluene-etil acetato (5:2) per produrre 878 mg del composto del titolo. Resa 76%.

Punto di decomposizione 84-86?c. 1 61 ?

(c 0,49, CHC1 ). Rp 0,54 in TLC su gel di silice sviluppata con benzene-etil acetato (1;1).

(i)' Preparazione di tri-N ? N ? N -benzilossicarbo nil-N -tert-butossicarbonil-0 -tetraidropiranil N -deglicil-tri-N4f?N6'

0 -demitilistamicina A benzile, R tetraidropir amile, R ?butile e R^ = H nella formula IV)

860 mg (0,88 mmoli ) di 0 -benzoil-tri-N ,N benzilossicarbonil-N -tert-butossicarbonil-0 -tetra idropiranil-N -deglicil-tri-N ,N 0 -demetilistamici na A ottenuti nella fase (e) sono sciolti in 20 mi di una miscela di ammoniaca al 12% e metanolo e la soluzione ? lasciata riposare a temperatura ambiente per 40 ore. La soluzione di reazione risultante ? concentrata fino all?essiccazione e il residuo cromatografato su gel di silice (70 g di Wa3co-gel C 200) usando benzene-etil acetato (1:1) come solvente di sviluppo per dare 693 mg del composto del titolo. Resa 90%. Punto di decomposizione 88 - 90?C 44

(c 0,5, CHC1-). R- 0,18 in TLC su gel di silice sviluppata con benzene-etil acetato (1:1).

(g) Preparazione di N ?-deglicil-di-N

istamicina A (composto della formula Vili).

680 mg (0,78 mmoli ) di tri-N ,N ,N -benzilossi carbonil-N 4 -tert-butossxcarbonil? 05 -tetraidropiranil-N -deglicil-tri-N?N , N ,0 -demetilistamicina A, del^ la fase (f) di cui sopra sono sciolti in 10 mi di acido trifluoroacetico al 90% a 0?C e lasciati riposare per due ore, dopo di che ??'soluzione di reazione ? concentrata ad essiccazione? H residuo ottenuto ? assorbito in 50 mi di cloroformio e lavato successi^ vamente con idrossido di sodio acquoso IN e acqua.

Lo strato di cloroformio ? separato, essiccato con solfato di sodio anidro e concentrato fino all'essiccazione. Il residuo ? depurato per mezzo di cromato grafia in colonna su gel di silice (509 di Wako-gel C 200) sviluppata con un solvente miscelato di'ci? roformio-metanolo- ammoniaca acquosa al 17% (80 : 10 : 1) per dare 350 mg di una polvere di N ,N ,N ?benzilos_ sicarbonil-N -deglicil-tri? N ,N ,0 -denotili stamici_ na A. Resa 65%.

A una soluzione di 293 mg (0,42 mmoli) della polvere ottenuta come sopra in 5 mi di metanolo ? aggiunta una soluzione di 27 mg di carbonato di sodio seguendo un'aggiunta di

in 0,5 mi di acqua, A 55 mg (0,5 mmoli) di ci? rocarbonato di etile a 0?C. La miscela risultante ? agitata per due ore, dopo di che la soluzione di rea zione ? concentrata fino all'essiccazione e il residuo ? assorbito in 30 mi di cloroformio e lavato con acqua. Lo strato di cloroformio ? quindi essiccato con solfato di sodio anidro ed ancora concentrato fi no alla essiccazione per dare 318 mg di una polvere di tri-? ,? ,? -benzilossicarbonile-N -etossicarbo nil~N -deglicil-tri-?? ,N fo -demetilistamicina ?

(R = benzile e R = etile nella formula VII). Resa

98%, 0,62 in TLC su gel di silice sviluppata con

una miscela di solvente di cloroformi?-metan.olo-ammo niaca acquosa al 17% (8o : lo : 1),

La polvere cos? ottenuta ? sciolta in 8 mi di

una miscela di metanolo?*?acqua e acido acetico (2 :

1 : 1), a cui sono poi aggiunti 100 mg di palladio-carbonio 'al 5 H e la miscela ? lasciata riposare so_t to una corrente di gas idrogeno per due ore per effe_t tuare la idrogenolisi. Dopo di ci?, il catalizzatore ? rimosso dalla miscela di reazione, che ? quindi concentrata fino all?essiccazione. Una soluzione del residuo sciolto in acqua ? passata attraverso una colonna di Amberlite CG-50 (forma NH^, 11 mi).

La colonna ? successivamente lavata con acqua e ammoniaca acquosa 0,1K e quindi eluita con ammoniaca acquosa 0,2M. L'eluato della colonna ? concentrato

fino alla essiccazione per dare 143 mg di una polvere di N -etossicarbonil-lJ -deglicil-tri-R ,N ,o -de metilistamicina A (R -?etile nella formula VII')?

Resa 95%. Rf 0,55 in TLC su gel di silice sviluppata con cloroformio-metanolo-ammoniaca acquosa al 17%

(3 : 3 : 1).

1 30 mg (0, 36 mmoli ) di questa polvere sono sciol_ ti in 6 mi di acido trifluoroacetico anidro a 0?C , la soluzione ? concentrata fino alla essiccazione e il residuo assorbito in 3 mi di t e traidro furano secco. Alla soluzione risultante sono aggiunti 15 mi del complesso t e traidrofur ano-idruro di boro 1M (un prodotto della Aldorich Co. , USA) e la miscela ? agitata a 50?C per 18 ore. Una certa quantit? d* acqua ? aggiunta alla soluzione di reazione, che ? quindi concentrata fino all ' essiccazione e il residuo ? assorbito in 10 mi di acqua. La soluzione acquosa ? re golata a pH . . 8 e passata attraverso una colonna di Amberlite CG-50 (forma NH^ 30 mi ) . La colonna ? successivamente lavata con acqua e soluzioni di ammoniaca acquosa 0,2 M, 0,3 M e 0,4 M e quindi eluita con ammoni aca acquosa 0, 5 M. L ' eluato ? raccolto e concentrato fino all 'essiccazione per dare 45 mg di monocarbonato del composto del titolo in forma di polvere. Resa 40%. Punto di decomposizione 115-118?G.

ck D 102? (c 0,65 , H^O ) ? Spettrometria di massa: ir /e 304 (M+ ) . TLC su gel di silice: 0,12 se sviluppata con lo strato inferiore di cl oroformi o-me tanolo-ammoniaca acquosa al 28% (2: 1 : 1 ) e R 0,50 se sviluppata con but anolo-etanolo-cl oroformi o-ammoniaca acquosa al 17% (4:5 :2 : 5 ) .

Esempio 1

Preparazione di di-N , 0 -demetilistamicina (formula I),

45 mg (0,123 mmoli ) di monocarbonato di N 4 -de glicil-di-N 6 ' , 0 3-demetilistamicina A ottenuti . nella fase (g) del riferimento 1 sono sciolti in 3 mi di metanolo, e alla soluzione sono aggiunti 0,017 mi (0,123 mmoli) di trietilammina e 94,9 mg (0, 38 mmoli ) di benzilossicarbonil N-idrossisuccinimmide. La miscela risultante ? lasciata riposare a temperatura ambiente per 6,5 ore per effettuare 1 'introduzione del gruppo benzilossicarbonil e come gruppo ammino-- protettivo?. La soluzione di reazione ? quindi concentrata fino all 'essiccazione e il residuo ? raccolto in 3 mi di diossano, facendo seguire l 'aggiunta di 67,9 mg (0,1 8 mmoli ) di estere N-idrossisuccinim mide ? di N-benzilossicarbonilglicina. La miscela co s? ottenuta ? lasciata riposare a 60?C per 6 ore per effettuare 1 'introduzione del gruppo glicile, dopo di che la soluzione di reazione ? concentrata fino all 'essiccazione e il residuo ? sciolto in 4 mi di un solvente miscelato di acido acetico, metanolo e acqua (2 : 1 : 1 ) .

Alla soluzione risultante sono aggiunti 50 mg di palladio? carb?nio al ?)6 e la miscela ? sottopo sta-a idrogenolisi sotto una corrente di gas idrogeno per 4 ore per effettuare la reazione di deprotezione. La miscela di reazione ? filtrata per rimuovere il ca talizzatore, il filtrato concentrato fino all * essicca zione e il residuo versato in acqua. La soluzione acquosa ottenuta ? passata attraverso una colonna di 6 mi di Amberlite CG-50 (forma NH^) e la colonna ? successivamente lavata con acqua, ammoniaca acquosa 0, 1 M e ammon?aca acquosa 0, 3 M e quindi eluita con ammonia ca acquosa 0,4 M* L 'eluato ? raccolto e concentrato fino all 'essiccazione per dare 15 mg del monocarbonato del composto del titolo in forma di polvere. Resa 29%.