IT201800003912A1

IT201800003912A1 - N-palmitoil-d-glucosamina in forma micronizzata

Info

Publication number: IT201800003912A1
Application number: IT102018000003912A
Authority: IT
Inventors: Valle Francesco Della; Valle Maria Federica Della; Gabriele Marcolongo; Sofia Parrasia; Salvatore Cuzzocrea
Original assignee: Innovet Italia Srl
Priority date: 2018-03-26
Filing date: 2018-03-26
Publication date: 2019-09-26
Also published as: KR102799249B1; JP7376999B2; US11744840B2; DK3546469T3; LT3546469T; ES2888175T3; US20190290669A1; KR20190112667A; CA3037795A1; HRP20210235T1; HUE053364T2; SI3546469T1; PL3546469T3; US20210308160A1; EP3546469A1; JP2019172663A; EP3546469B1

Description

Titolo: “N-PALMITOIL-D-GLUCOSAMINA IN FORMA MICRONIZZATA”

Descrizione

Campo della tecnica dell’invenzione

Forma oggetto della presente invenzione una composizione a base di N-palmitoil-D-glucosamina in forma micronizzata.

Stato dell’arte

I tessuti che rivestono le superfici libere dell’organismo - da quelle più esterne alle più piccole superfici degli organi interni - si suddividono in epiteli e membrane. Queste ultime rivestono le cavità del corpo in comunicazione o meno con l’esterno. Ne sono tipici esempi la mucosa intestinale e le membrane sinoviali, che tappezzano la superficie interna della capsula articolare, nonché tendini e legamenti contenuti nella cavità articolare.

Si tratta di tessuti a ruolo primariamente protettivo, cui si associano - a seconda della localizzazione - funzioni di scorrimento e lubrificazione (come ad esempio avviene nelle membrane sinoviali di articolazioni mobili) o di assorbimento (come ad esempio avviene nella mucosa intestinale).

Quando la funzionalità difensiva viene compromessa (ad esempio in seguito ad insulti meccanici o condizioni di dismicrobismo), si generano stati disfunzionali ai quali la ricerca biomedica più avanzata sta riservando in questi ultimi anni una attenzione del tutto particolare.

È molto recente l’evidenza che tali disfunzioni si ripercuotono non solo localmente, ma anche a livello sistemico, avviando una risposta infiammatoria cronica (chronic systemic inflammation, CSI). La CSI è stata dimostrata originare sia da alterazioni della membrana sinoviale - in particolare in corso di osteoartrite -che a partire da disfunzioni a carico di differenti epiteli.

Quando le cellule dei tessuti di rivestimento subiscono sollecitazioni (noxae) di differente natura, liberano fattori pro-infiammatori che, attraverso un cross-talk bidirezionale con le cellule immunitarie limitrofe, allargano la risposta ad organi differenti, anche distanti. Tra i fattori primariamente chiamati in causa nell’amplificazione sistemica degli stati infiammatori originati da disfunzioni delle membrane sinoviali e dei tessuti epiteliali, particolare rilevo viene attribuito a particolari citochine e ai radicali liberi o Reactive oxygen species (ROS).

Sia le proteasi rilasciate dalle cellule immunoinfiammatorie che i ROS generati in loco degradano i glicosaminoglicani (GAG) della matrice extracellulare, con conseguente indebolimento della barriera strutturale e funzionale ed aumento del danno.

Queste recenti conoscenze determinano un modo del tutto nuovo, sia sul piano della diagnosi che su quello della prevenzione e della terapia, di considerare le patologie che derivano da disfunzioni di tessuti epiteliali e di membrane con conseguente insorgenza di Chronic Systemic Inflammation (CSI).

La più comune infiammazione sistemica cronica con origine da disfunzioni di membrane sinoviali è l’Osteoartrite (OA), malattia molto frequente sia nell’uomo che negli animali da compagnia. Segni radiologici indicativi di OA sono presenti nel 70% della popolazione umana anziana (over 65) e, in campo veterinario, in poco meno del 30% di quella felina; l’OA sintomatica, invece, affligge il 10% degli uomini e il 13% delle donne sopra i 60 anni, arrivando ad interessare, in campo veterinario, ben il 20% dei cani con più di 1 anno di età. Originariamente classificata come malattia degenerativa e dunque appannaggio della sola cartilagine articolare, l’OA è oggi riconosciuta come disordine ad impronta infiammatoria, che coinvolge non solo la cartilagine ma tutti i tessuti articolari, dalla membrana sinoviale ai tendini, muscoli, legamenti e all’osso subcondrale.

Nel campo dermatologico invece, tra le infiammazioni croniche sistemiche più frequenti con origine da disfunzioni degli epiteli vi sono la dermatite atopica e la psoriasi.

La dermatite atopica è malattia frequente sia nell’uomo che negli animali da compagnia, con prevalenza di circa il 20% nei bambini e di 8-15% nei cani (a seconda delle razze) ed è frequentemente riscontrata anche nel gatto. L’infiammazione cronica sistemica (chronic systemic inflammation, CSI) di origine epiteliale è confermata dalla comorbidità tra dermatite atopica e disordini infiammatori e/o neuroinfiammatori a carico di altri organi.

La psoriasi è una patologia infiammatoria cronica cutanea che colpisce tra il 2 e il 4% della popolazione. Analogamente alla dermatite atopica, molte evidenze recenti riconoscono nella psoriasi l’origine di uno stato di CSI, che si basa sulla produzione di citochine infiammatorie da parte delle cellule cutanee ed immunoinfiammatorie, con aumento dei livelli sistemici di interleuchine come ad esempio la IL-17. A questa citochina in particolare si attribuiscono le ripercussioni extra-cutanee della psoriasi a livello articolare, cardiovascolare, renale, epatico e metabolico.

Le malattie infiammatorie croniche intestinali (inflammatory bowel disease, IBD) sono disordini epidemiologicamente in crescita nell’uomo, e di frequente rilievo anche nel cane e nel gatto. L’IBD è considerata malattia ad origine da infiammazione sistemica cronica: la comorbidità tra IBD e malattie ortopediche rappresenta una importante conferma dell’aspetto infiammatorio cronico sistemico.

Analoghe osservazioni sono state compiute per disordini a carico di altri epiteli di rivestimento, e in particolare dell’urotelio della vescica. Pazienti affetti da cistite interstiziale e da cistiti ricorrenti spesso lamentano concomitante vulvodinia, fibromialgia, reflusso gastroesofageo. La cistite interstiziale e le cistiti ricorrenti, disordini dolorosi presenti sia nella popolazione umana che in quella felina, sono infatti caratterizzati dall’alterazione dell’architettura dell’urotelio vescicale associato ad elevato grado di infiammazione tissutale con aumento dei livelli sistemici (sierici) di markers infiammatori e con attivazione di cellule immunitarie.

N-palmitoil-D-glucosamina (PGA) è stata descritta nella pubblicazione internazionale WO 96/18600 all’interno di una classe di molecole aventi attività in patologie collegate ad un’anomala modulazione del recettore periferico dei cannabinoidi CB2. Tra le patologie potenzialmente trattate sono descritte infiammazioni articolari croniche o acute quali artrite reumatoide. Non sono tuttavia stati riportati dati sperimentali per tale molecola, né è stato indicato un effetto su patologie infiammatorie croniche sistemiche quali osteoartrite, psoriasi, dermatite atopica, patologie epiteliali intestinali o vescicali.

WO 97/18600 inoltre non descrive N-Palmitoil-D-Glucosamina in forma micronizzata.

Sommario dell’invenzione

Un oggetto della presente invenzione è N-palmitoil-D-glucosamina in forma micronizzata.

Un altro oggetto della presente invenzione è una composizione di N-palmitoil-D-glucosamina e Curcumina in forma co-micronizzata.

Un ulteriore oggetto della presente invenzione è N-palmitoil-D-glucosamina in forma micronizzata, o comicronizzata con Curcumina, per l’uso nel trattamento di patologie infiammatorie croniche sistemiche, preferibilmente scelte tra osteoartrite, psoriasi, dermatite atopica e patologie epiteliali intestinali o vescicali.

Ancora un altro oggetto della presente invenzione sono formulazioni farmaceutiche, umane o veterinarie, dietetiche o di integratori, o di mangimi, o di supplementi nutrizionali per animali, comprendenti Npalmitoil-D-glucosamina in forma micronizzata o comicronizzata con Curcumina.

Un altro oggetto dell’invenzione è un procedimento di micronizzazione o co-micronizzazione specificamente studiato per la produzione di N-palmitoil-D-glucosamina in forma micronizzata o co-micronizzata con Curcumina.

Questi ed ulteriori oggetti, come delineati nelle annesse rivendicazioni, verranno descritti nel seguito della descrizione. Il testo delle rivendicazioni deve considerarsi incluso nella descrizione ai fini della valutazione di sufficienza di descrizione.

Ulteriori caratteristiche e vantaggi dell’invenzione risulteranno dalla descrizione di seguito riportata di esempi preferiti di realizzazione, dati a titolo indicativo e non limitativo.

Breve descrizione delle figure

Figura 1 mostra una curva di distribuzione granulometrica V%/dimensione di N-palmitoil-D-glucosamina in forma micronizzata;

Figura 2 mostra una curva di distribuzione granulometrica V%/dimensione di N-palmitoil-D-glucosamina co-micronizzata con Curcumina;

Figura 3 mostra una curva di distribuzione granulometrica V%/dimensione di Curcumina micronizzata; Figura 4 mostra una curva di distribuzione granulometrica I%/dimensione di N-palmitoil-D-glucosamina in forma micronizzata sub-micronica;

Figura 5 mostra una curva di distribuzione granulometrica V%/dimensione di N-palmitoil-D-glucosamina in forma micronizzata sub-micronica;

Figura 6 mostra una curva di distribuzione granulometrica di N-palmitoil-D-glucosamina in forma non micronizzata.

Descrizione dettagliata dell’invenzione

La presente invenzione riguarda in un primo aspetto il composto N-palmitoil-D-glucosamina (di seguito anche indicata come PGA) in forma micronizzata.

Con il termine generico “composto in forma micronizzata” si intende un composto avente una distribuzione granulometrica delle particelle, definita come percentuale in volume e misurata con il metodo della diffusione (“scattering”) della luce laser, rappresentata da una curva di distribuzione avente la moda al di sotto dei 10 micron ma al di sopra di 0,6 micron.

In una forma di realizzazione, la PGA ha una distribuzione granulometrica come sopra definita, misurata con uno strumento Malvern Mastersizer 3000 con algoritmo di calcolo Mie, in cui almeno il 96% in volume di particelle ha una granulometria compresa tra 0,6 e 10 micron.

In una forma di realizzazione preferita, la PGA ha una distribuzione granulometrica come sopra definita, misurata con uno strumento Malvern Mastersizer 3000 con algoritmo di calcolo Mie, avente una moda tra 3,1 e 3,5 micron ed avente almeno 97% in volume di particelle minori di 10 micron e preferibilmente almeno 50% in volume di particelle minori di 3,5 micron. Un esempio di tale distribuzione granulometrica è riportato nel grafico e nella allegata tabella di figura 1.

La micronizzazione può essere effettuata in un impianto a getto fluido (ad esempio, impianto modello Jetmill®) che opera con tecnologia “spiral technology” a getto di aria compressa in grado di sfruttare energia cinetica – in luogo della energia meccanica – per frantumare le particelle di N-palmitoil-D-glucosamina. Tali apparecchiature sono convenzionali e non verranno pertanto ulteriormente descritte.

E’ stato tuttavia trovato che operando la micronizzazione della PGA come tale non è possibile ottenere una distribuzione granulometrica compatibile con un prodotto micronizzato come sopra definito. Si ottiene infatti un prodotto caratterizzato da una curva gaussiana irregolare con moda nettamente superiore ai 10 micron, in particolare compresa tra 31 e 40 micron, come mostrato nella curva di distribuzione granulometrica di figura 6.

E’ stato tuttavia sorprendentemente scoperto che, cristallizzando preventivamente la PGA in presenza di un acido grasso e sottoponendo poi il prodotto cristallizzato ad un procedimento di micronizzazione di tipo convenzionale – ad esempio con impianto a getto fluido che opera con tecnologia “spiral technology” a getto di aria compressa – è possibile ottenere PGA in forma micronizzata con le distribuzioni granulometriche descritte in precedenza.

Preferibilmente, l’acido grasso è acido palmitico. In forme di realizzazione preferite, l’acido grasso è presente in una percentuale ponderale compresa tra 3% e 20% oppure tra 4% e 15% oppure tra 4,5% e 6%, rispetto a PGA, determinata sul prodotto finito con metodo HPLC in fase inversa, contro una soluzione di riferimento contenente acido palmitico autentico.

La cristallizzazione della PGA in presenza di acido grasso prevede una fase di miscelazione intima di PGA con l’acido grasso, in cui quest’ultimo è in percentuali ponderali comprese tra 2% e 20%, preferibilmente tra 4% e 10%, rispetto alla PGA.

In forme di realizzazione preferite, il procedimento di cristallizzazione prevede le seguenti fasi:

a) mettere a disposizione PGA, preferibilmente con purezza >98%, determinata mediante analisi TLC;

b) sospendere la PGA in un solvente polare unitamente all’acido grasso o ad un suo sale, in cui l’acido grasso o suo sale sono presenti in quantità ponderali comprese tra 2% e 20% oppure tra 4% e 10% rispetto alla PGA;

c)riscaldare la sospensione della fase b) ad una temperatura compresa tra 50°C e 90°C oppure a ricadere del solvente, per un tempo maggiore di 15 minuti, oppure maggiore di 30 minuti, oppure maggiore di 1 ora;

d) portare lentamente la miscela di cristallizzazione ad una temperatura inferiore a 10°C;

e) recuperare il cristallizzato in forma di miscela intima di PGA con acido grasso.

Come detto, l’acido grasso è preferibilmente acido palmitico.

Il solvente polare è preferibilmente scelto tra metanolo, etanolo, acetone o acetato d’etile.

La fase d) viene preferibilmente condotta in un tempo maggiore di 20 minuti, più preferibilmente maggiore di 30 minuti.

La sintesi di PGA e la sua cristallizzazione in presenza di un acido grasso sono descritte nel dettaglio nella parte sperimentale che segue.

E’ stato inoltre scoperto che la PGA micronizzata come sopra descritta e definita può essere utilizzata nel trattamento di patologie infiammatorie croniche sistemiche, dell’uomo e dell’animale, derivanti da disfunzioni degli epiteli e delle membrane sinoviali.

In particolare, tali patologie sono preferibilmente scelte tra:

- malattie infiammatorie derivanti da disfunzioni delle membrane sinoviali;

- malattie infiammatorie derivanti da disfunzioni delle mucose intestinali;

- malattie infiammatorie derivanti da disfunzioni della mucosa uroteliale;

- malattie infiammatorie derivanti da disfunzioni degli epiteli cheratinizzati.

Un ulteriore oggetto dell’invenzione è pertanto la PGA in forma micronizzata, preferibilmente PGA in forma micronizzata comprendente da 3% a 20% in peso di un acido grasso, per l’uso nel trattamento di patologie infiammatorie, preferibilmente patologie infiammatorie croniche sistemiche, dell’uomo e dell’animale, derivanti da disfunzioni degli epiteli e/o delle membrane sinoviali.

E’ stato anche sorprendentemente scoperto che l’associazione di PGA con Curcumina presenta un evidente effetto sinergico nel trattamento di patologie infiammatorie.

La Curcumina è una molecola estratta dalla Curcuma longa utilizzata principalmente come colorante vegetale, grazie al suo colore giallo. La Curcumina ha la seguente struttura chimica:

La Curcumina è un prodotto commerciale, ad esempio con un titolo di circa 95% di curcuminoidi totali, contenente dal 60 al 75% di Curcumina tal quale, dal 15 al 25% di desmetossi-curcumina e dal 2 al 5% di bisdismetossi-curcumina.

Un ulteriore oggetto dell’invenzione è pertanto la PGA in associazione con Curcumina, per l’uso nel trattamento di patologie infiammatorie, preferibilmente patologie infiammatorie croniche sistemiche, dell’uomo e dell’animale, derivanti da disfunzioni degli epiteli e/o delle membrane sinoviali.

In certe forme di realizzazione, la PGA e la Curcumina vengono miscelate intimamente a formare una miscela secca, ad esempio per mezzo di un miscelatore per polveri o simili apparecchiature.

PGA e Curcumina (da qui innanzi anche denominata CUR) vengono utilizzate in un rapporto ponderale PGA/CUR compreso tra 3:1 e 1:3, preferibilmente tra 2:1 e 1:1.

In una forma di realizzazione preferita, l’invenzione riguarda PGA, preferibilmente PGA comprendente da 3% a 20% in peso di un acido grasso, in forma co-micronizzata con Curcumina.

In una forma di realizzazione, la miscela PGA/CUR co-micronizzata ha una distribuzione granulometrica come sopra definita, misurata con uno strumento Malvern Mastersizer 3000 con algoritmo di calcolo Mie, in cui almeno il 96% in volume di particelle ha una granulometria compresa tra 0,6 e 10 micron.

In una forma di realizzazione preferita, la miscela PGA/CUR ha una distribuzione granulometrica come sopra definita, misurata con uno strumento Malvern Mastersizer 3000 con algoritmo di calcolo Mie, avente una moda tra 3,1 e 3,8 micron ed avente almeno 98% in volume di particelle minori di 10 micron e preferibilmente almeno 50% in volume di particelle minori di 3,5 micron. Un esempio di tale distribuzione granulometrica è riportato nel grafico e nella allegata tabella di figura 2.

E’ stata inoltre preparata PGA in forma submicronica. Con il termine “PGA in forma sub-micronica” si intende PGA avente una distribuzione granulometrica delle particelle, misurata con il metodo della diffusione (“scattering”) della luce laser e definita come percentuale in volume delle particelle/dimensione, rappresentata da una curva di distribuzione avente la moda al di sotto dei 300 nanometri.

In questa forma di realizzazione, la PGA ha una distribuzione granulometrica come sopra definita, misurata con uno strumento Malvern Mastersizer 3000 con algoritmo di calcolo Mie, in cui almeno il 98% in volume di particelle ha una granulometria compresa tra 0,06 e 1 micron.

Un esempio di tale distribuzione granulometrica è riportato nel grafico e nella allegata tabella di figura 5.

Come ulteriore controllo, è stata anche misurata la distribuzione granulometrica di PGA in forma submicronica utilizzando un diverso strumento, Malvern Nanosizer, specificamente utilizzato per lo studio della granulometria di particelle nell'intervallo di dimensione nanometrica. In figura 4 è riportato il relativo grafico di distribuzione espresso come intensità percentuale di luce diffusa/dimensione, utilizzando l'algoritmo di calcolo Mie. Dal grafico si può notare che la moda ricavabile è compresa tra 170 e 220 nm, il che conferma sostanzialmente la medesima distribuzione granulometrica come determinata dal grafico di figura 5.

La PGA in forma sub-micronica è stata ottenuta mediante un processo di sub-micronizzazione con la tecnica wet milling utilizzando un mulino a microsfere come descritto nella parte sperimentale seguente. Anche in questo caso, la PGA in sub-micronica è stata ottenuta dopo additivazione con un acido grasso, preferibilmente acido palmitico, come descritto in precedenza, utilizzando dal 2-20% in peso, preferibilmente 4-10% in peso, di acido grasso.

La PGA in forma sub-micronica sorprendentemente non ha dimostrato, come era invece prevedibile, una attività migliorativa rispetto alla PGA micronizzata come precedentemente descritta; al contrario, ha invece dimostrato una attività nettamente peggiorativa rispetto alla PGA micronizzata a parità di dose somministrata.

PARTE SPERIMENTALE

Preparazione della N-palmitoil-D-glucosamina ad elevato grado di purezza (HPPGA)

794,3 g di glucosamina cloridrato (3,68 moli) vengono solubilizzati in 6700 ml di acqua sotto agitazione.

La soluzione viene raffreddata a –5°C e 2104 g di sodio carbonato decaidrato (7,36 moli) vengono aggiunti.

1114 g di palmitoil cloruro (4,05 moli), pari a 1228 ml, solubilizzati in 3000 ml di tetraidrofurano, vengono aggiunti alla soluzione della glucosamina, lentamente nell’arco di un’ora, sotto agitazione molto vigorosa. La miscela viene mantenuta in agitazione vigorosa per 2 ore a -5°C, quindi per ulteriori 2 ore a temperatura ambiente.

17500 ml di acqua vengono aggiunti e la miscela viene mantenuta in agitazione blanda per una notte.

Il precipitato formatosi viene recuperato per filtrazione e lavato tre volte con 3000 ml di acqua. Le acque madri e di lavaggio vengono scartate.

Il solido viene cristallizzato da 5000 ml di metanolo mantenendolo in riscaldamento a ricadere sotto continua agitazione per 2 ore, quindi separato per filtrazione a caldo, lavato due volte con 2000 ml di metanolo caldo ed infine essiccato in alto vuoto.

Si recuperano circa 1200 g di prodotto secco.

Il prodotto N-Palmitoil-D-Glucosamina ottenuto ha le seguenti caratteristiche:

‐ stato fisico:polvere bianca

‐ formula molecolare:C22H43NO6

‐ peso formula:417,6

‐ analisi elementare: C=63.28% H=10.38% N=3.35% O=22.99%

‐ punto di fusione:202°C (dec.)

‐ TLC, eluente cloroformio/metanolo/acqua/NH3 (28%) 80:25:2:1 Rf=0.30

‐ purezza TLC: >98%

Preparazione della N-palmitoil-D-glucosamina additivata di sodio palmitato (PGA)

950 g di N-palmitoil-D-glucosamina ad elevato grado di purezza (HPPGA) viene addizionata di 50 g di acido palmitico sale sodico (5% in peso sul peso totale della miscela). La miscela viene sospesa in 4 litri di metanolo sotto efficiente agitazione e scaldata a ricadere per 2 ore. Mantenendo in funzione l’agitazione, la miscela viene quindi raffreddata progressivamente fino a 5°C nell’arco di un’ora. Il solido viene quindi separato per filtrazione ed essiccato in alto vuoto.

Il contenuto di acido palmitico viene controllato mediante analisi HPLC contro uno standard autentico di acido palmitico:

- Colonna ZORBAX SB-C18 4.6 150 mm 5 micron o equivalente;

- Fase mobile: A (tampone ammoniacale 0.01 M -metanolo 2 a 1; B acetonitrile. Tempo 0 min. : A 30% B 70%; Tempo 25 min. A 10% B 90%; Tempo di equilibrio: 5 minuti;

- Flusso: 1.0 ml/min;

- Termostatazione colonna: 40°C;

- Tempo analisi: 25 min;

- Volume iniezione: 50 µl;

- Detector Evaporative Light Scattering Detector: temperatura 40°C, flusso gas 1.5 ml/min, Gain 4.

Procedimento di micronizzazione

La PGA è stata micronizzata come miscela intima PGA/acido grasso come descritto in precedenza.

E' stata preparata anche Curcumina micronizzata come composto di confronto per i successivi esperimenti biologici. E' stata utilizzata Curcumina commerciale con titolo di almeno 90% in curcuminoidi. La distribuzione granulometrica della Curcumina micronizzata così ottenuta è riportata in figura 3.

La micronizzazione e la co-micronizzazione sono state effettuate in tutti i casi in un impianto a getto fluido (in particolare, impianto modello Jetmill®) che opera con tecnologia “spiral technology” a getto di aria compressa.

Condizioni di micronizzazione:

- diametro interno camera di micronizzazione 300 mm;

- pressione getto fluido 8 bar;

- alimentazione prodotto 20-25 kg/h.

Procedimento di sub-micronizzazione

Il processo di sub-micronizzazione di PGA (additivata con acido grasso) è stato condotto con la tecnica di “wet milling” utilizzando un mulino a microsfere DYNO-MILL MULTILAB WA BACHOFEN- Muttenz Switzerland; Beads 1259,7 g Zirconia 0,3 mm diametro.

50 g del prodotto sono sospesi in 1000 ml di acqua distillata e macinati per 4 ore a 40°C. La sospensione attenuta viene scaricata ed essiccata mediante liofilizzazione.

Determinazione della distribuzione granulometrica

La determinazione della distribuzione granulometrica è stata condotta su un campione ad umido, dopo sonicazione di 1 minuto.

E' stato utilizzato uno strumento Malvern Mastersizer 3000 operante con la tecnica LALLS (Low Angle Laser Light Scattering) ed un algoritmo di calcolo Mie. Per la determinazione della distribuzione granulometrica di PGA in forma sub-micronica è stato anche utilizzato, come confronto, lo strumento Malvern Nanosizer.

I grafici di distribuzione granulometrica sono riportati nelle figure 1-6.

Sperimentazione biologica

Effetti farmacologici di N-palmitoil-D-glucosamina (PGA) in differenti forme fisiche su infiammazione dipendente da disfunzione epiteliale

E’ stato utilizzato il modello sperimentale dell’edema da carragenina nella zampa del ratto che determina disfunzione epiteliale a livello della zampa.

Il modello sperimentale di edema da carragenina nella zampa è stato indotto mediante l’iniezione subplantare di una soluzione di carragenina (contenente 50 μl di soluzione salina sterile contenente 1% di carragenina) nella zampa destra dell’animale (ratto).

A specifici intervalli temporali il volume plantare è stato misurato mediante pletismometro (Ugo Basile, Milano, Italia). L’incremento del volume plantare è stato valutato come differenza tra il valore ottenuto negli specifici intervalli temporali e il volume al basale (tempo 0) misurato immediatamente prima della somministrazione di carragenina.

Sono state testate le seguenti forme fisiche di N-palmitoil-D-glucosamina:

- N-palmitoil-D-glucosamina non micronizzata (PGA); - N-palmitoil-D-glucosamina micronizzata (PGA-m); - N-palmitoil-D-glucosamina co-micronizzata con Curcumina (PGACUR-m);

- N-palmitoil-D-glucosamina in forma sub-micronica (PGA-sm).

E’ stata inoltre testata la seguente forma fisica di Curcumina:

- Curcumina micronizzata (CUR-m)

In tutti i casi la PGA è stata testata come miscela PGA/acido grasso.

I ratti (10 animali per gruppo) sono stati suddivisi nei gruppi sperimentali indicati in Tabella 1.

I risultati ottenuti, espressi in percentuale rispetto all’edema prodotto dalla sola carragenina (indicato con un valore di 100), sono i seguenti:

I dati mostrano una totale inattività della PGA non micronizzata ed una quasi totale inattività sia della PGA sub-micronizzata, sia della Curcumina micronizzata.

La PGA micronizzata evidenzia una riduzione del 24,5% dell’edema da Carragenina, mentre la PGA comicronizzata con Curcumina evidenzia, ad una dose dei due principi attivi uguale a quella utilizzata per i test singoli (PGA-m 20 mg/Kg; CUR 10 mg/Kg) una riduzione dell’edema del 51,5%.

E’ quindi stato dimostrato un chiaro effetto sinergico dovuto all’associazione dei due principi attivi.

Infatti:

‐ il trattamento con PGA (non micronizzata) alla dose di 30 mg/kg non produce alcun effetto farmacologico;

‐ il trattamento con PGA-m alla dose di 20 mg/kg produce un evidente effetto farmacologico;

‐ il trattamento con PGA-sm alla dose di 20 mg/kg non produce alcun effetto farmacologico significativo;

‐ il trattamento con sola CUR micronizzata, alla dose di 10 mg/kg non produce alcun effetto farmacologico significativo;

‐ il trattamento con PGACUR-m alla dose di 30 mg/kg (corrispondente 20 mg/kg di PGA-m e 10 mg/kg di CUR-m) produce un effetto farmacologico significativo e nettamente superiore a quello ottenuto con la sola PGA-m.

E’ quindi evidente che la PGA in forma micronizzata o in associazione con Curcumina, in particolare in forma co-micronizzata con Curcumina (ma non la PGA in forma sub-micronica), può essere impiegata nel trattamento di patologie infiammatorie croniche sistemiche, dell’uomo e dell’animale, derivanti da disfunzioni degli epiteli e delle membrane sinoviali, in particolare, patologie preferibilmente scelte tra:

- malattie infiammatorie derivanti da disfunzioni delle membrane sinoviali;

- malattie infiammatorie derivanti da disfunzioni delle mucose intestinali;

- malattie infiammatorie derivanti da disfunzioni della mucosa uroteliale;

- malattie infiammatorie derivanti da disfunzioni degli epiteli cheratinizzati.

La PGA in forma micronizzata o in associazione con Curcumina, in particolare in forma co-micronizzata con Curcumina, può essere inclusa in composizioni farmaceutiche o veterinarie e può essere formulata in forme di dosaggio per una somministrazione orale, buccale, parenterale, rettale o transdermica.

Per la somministrazione orale, le composizioni farmaceutiche si possono trovare, per esempio, sotto forma di compresse o capsule, dure o molli, preparate nel modo convenzionale con gli eccipienti farmaceuticamente accettabili quali agenti leganti (ad esempio amido di mais pregelatinizzato, polivinilpirrolidone o metilcellulosa idrossipropil); agenti di riempimento (ad esempio lattosio, cellulosa microcristallina o idrogeno fosfato di calcio); lubrificanti (ad esempio stearato di magnesio, talco o silice); disintegranti (ad esempio amido di patata o glicolato amido di sodio); o agenti inibenti (ad esempio lauril-solfato di sodio). Le compresse possono essere ricoperte con i metodi ben noti nell’arte. Le preparazioni liquide per la somministrazione orale possono presentarsi, per esempio, sotto forma di soluzioni, sciroppi o sospensioni oppure si possono presentare come prodotti liofilizzati da ricostituire, prima dell’uso, con acqua o altri opportuni veicoli. Tali preparazioni liquide possono essere preparate attraverso i metodi convenzionali con gli additivi farmaceuticamente accettabili quali agenti di sospensione (ad esempio sciroppo di sorbitolo, derivati della cellulosa o grassi idrogenati commestibili); agenti emulsionanti (ad esempio lecitina o acacia); veicoli non acquosi (ad esempio olio di mandorle, esteri oleosi, alcool etilico o oli vegetali frazionati); e conservanti (ad esempio metil- o propil-pidrossibenzoati o acido sorbico). La preparazione può anche opportunamente contenere aromi, coloranti e agenti dolcificanti.

Le preparazioni per la somministrazione orale possono essere formulate in modo opportuno per permettere il rilascio controllato del principio attivo.

Per la somministrazione buccale, le composizioni possono trovarsi sotto forma di compresse o pastiglie formulate nel modo convenzionale, adatte ad un assorbimento a livello della mucosa buccale. Formulazioni buccali tipiche sono le compresse per somministrazione sub-linguale.

La PGA in forma micronizzata o in associazione con Curcumina, in particolare in forma co-micronizzata con Curcumina, può essere formulata per una somministrazione parenterale mediante iniezione. Le formulazioni per le iniezioni possono essere presentate in forma di un’unica dose, ad esempio in fiale, con un conservante aggiunto. Le composizioni possono presentarsi sotto tale forma come sospensioni, soluzioni o emulsioni in veicoli oleosi o acquosi e possono contenere agenti del formulario quali agenti di sospensione, stabilizzanti e/o disperdenti. In alternativa, il principio attivo si può trovare sotto forma di polvere per essere ricostituito, prima dell’uso, con un opportuno veicolo, ad esempio con acqua sterile.

Secondo la presente invenzione, la PGA in forma micronizzata o in associazione con Curcumina, in particolare in forma co-micronizzata con Curcumina, può anche essere formulata secondo composizioni rettali quali supposte o clistere da ritenzione, ad esempio contenenti i componenti base delle comuni supposte come burro di cacao o altri gliceridi.

In aggiunta alle composizioni descritte precedentemente, la PGA in forma micronizzata o in associazione con Curcumina, in particolare in forma comicronizzata con Curcumina, può anche essere formulata come preparazione di deposito. Tali formulazioni a lunga azione possono essere somministrate per impianto (ad esempio in modo sottocutaneo, transcutaneo o intramuscolare) o per iniezione intramuscolare. Quindi, per esempio, la PGA in forma micronizzata o in associazione con Curcumina, in particolare in forma comicronizzata con Curcumina, può essere formulata con appropriati materiali polimerici o idrofobici (per esempio sotto forma di un’emulsione in un olio adatto) o resine a scambio ionico o come derivati minimamente solubili.

Secondo la presente invenzione la dose di PGA in forma micronizzata o in associazione con Curcumina, in particolare in forma co-micronizzata con Curcumina, proposta per la somministrazione ad un uomo (con peso corporeo di circa 70 Kg) va da 1 mg a 7 g oppure da 10 mg a 700 mg del principio attivo per unità di dose. L’unità di dose può essere somministrata, per esempio, da 1 a 4 volte al giorno. La dose dipenderà dalla via prescelta per la somministrazione. Si dovrà considerare che potrebbe essere necessario fare continue variazioni del dosaggio a seconda dell’età e del peso del paziente ed anche della gravità della condizione clinica da trattare. L’esatta dose e la via di somministrazione sarà infine a discrezione del medico curante o del veterinario.

Un ulteriore oggetto dell’invenzione sono anche composizioni dietetiche, integratori alimentari, alimenti a fini medici speciali (AFMS) e composizioni cosmetiche (ad esempio in forma di crema) comprendenti la PGA in forma micronizzata o in associazione con Curcumina, in particolare in forma co-micronizzata con Curcumina.

Con il termine “alimenti a fini medici speciali” si intendono i prodotti autorizzati secondo la Direttiva della Commissione Europea agli Stati Membri n.

1999/21/CE e segg.. Tale termine si riferisce ad un prodotto “destinato a rispondere a particolari esigenze nutrizionali di persone affette da una malattia, un disturbo o uno stato patologico specifico” al fine di curare o di coadiuvare a curare lo specifico stato patologico, assimilando quindi tale prodotto AFMS ad un farmaco.

Le formulazioni secondo l’invenzione possono essere preparate secondo metodiche convenzionali, quali quelle descritte in Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook, Mack Pub. Co., N.Y., USA, 17th edition, 1985.

L’invenzione sarà ora ulteriormente descritta per mezzo dei seguenti esempi di formulazioni.

Esempi di formulazione

Esempio 1– Sciroppo per uso orale

Un flacone da 100 ml contiene

-PGACUR-m 4.000 mg

-Carbossimetilcellulosa 3000 mg

-Noveon AA1 150 mg

-Dolcificante 10 mg

-- Acqua distillata q.b. a 100 ml.

Esempio 2 – Granuli per uso veterinario

100 g di granuli contengono:

-PGACUR-m 6000 mg

-Sorbitolo polvere 400 mg

-Saccarosio Palmitato 20 mg

-Appetizzante per animali mg 30.

Esempio 3 – Compresse per uso orale per uso umano o veterinario

Una compressa contiene:

-PGAm 600 mg

-Cellulosa microcristallina 200 mg

-Croscaramellose sodico 70 mg -Polivinilpirrolidone 10 mg

-Magnesio Stearato 4 mg.

Esempio 4 – Compresse per uso orale per uso umano o veterinario

Una compressa contiene:

-PGACUR-m 600 mg

-Cellulosa microcristallina 200 mg -Croscaramellose sodico 70 mg -Polivinilpirrolidone 10 mg

-Magnesio Stearato 4 mg.

Esempio 5 – Compresse per uso orale per uso umano o veterinario

Una compressa contiene:

-PGACUR- m 300 mg

-Cellulosa microcristallina 180 mg -Croscaramellose sodico 60 mg -Polivinilpirrolidone 10 mg

-Magnesio Stearato 4 mg.

Esempio 6 – Capsule di gelatina rigida per uso orale per uso umano o veterinario

Una capsula contiene:

-PGACUR-m 400 mg.

Esempio 7 – Capsule di gelatina molle

Una capsula contiene:

-PGACUR-m 300mg

-Olio vegetale 200 mg

-Lecitina di soja 50 mg.

Esempio 8 – Capsule di gelatina molle

Una capsula contiene:

-PGACUR-m 400mg

-Olio vegetale 200 mg

-Lecitina di soja 50 mg.

Esempio 9 – Supposte per uso rettale

-PGACUR-m 200mg

-Massa grassa per supposte 1200 mg.

Esempio 10 – Crema per applicazione locale esterna su cute

100 g di crema contengono:

-PGACUR-m 2000 mg

-Acqua demineralizzata 71g

-Olio di vasellina 10g

-PEG-5 Steroli vegetali 4g

-Sodio piroglutammato 2g

-Acido stearico 2.5g

-Alcool cetostearilico 2.5g

-Polisorbato 80 2%

-Glicerile monostearato 1.5g

-Olio di silicone 1% -Carbomer 0.5%

-2-Fenossietanolo 1%.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. N-palmitoil-D-glucosamina in forma micronizzata.
2. N-palmitoil-D-glucosamina secondo la rivendicazione 1, avente una distribuzione granulometrica, misurata con uno strumento Malvern Mastersizer 3000 con algoritmo di calcolo Mie, in cui almeno il 96% in volume di particelle ha una granulometria compresa tra 0,6 e 10 micron.
3. N-palmitoil-D-glucosamina secondo la rivendicazione 2, avente una curva di distribuzione granulometrica con una moda tra 3,1 e 3,5 micron ed avente almeno 97% in volume di particelle minori di 10 micron e preferibilmente almeno 50% in volume di particelle minori di 3,5 micron.
4. N-palmitoil-D-glucosamina secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, in cui N-palmitoil-D-glucosamina è additivata con un acido grasso in una percentuale ponderale compresa tra 3% e 20% oppure tra 4% e 15% oppure tra 4,5% e 6%, rispetto a PGA, ed in cui detto acido grasso è preferibilmente acido palmitico.
5. N-palmitoil-D-glucosamina secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, in cui N-palmitoil-D-glucosamina è in forma co-micronizzata con Curcumina.
6. N-palmitoil-D-glucosamina secondo la rivendicazione 5, in cui N-palmitoil-D-glucosamina e Curcumina sono in rapporto ponderale compreso tra 3:1 e 1:3 oppure tra 2:1 e 1:1.
7. N-palmitoil-D-glucosamina secondo la rivendicazione 5 o 6, in cui la miscela PGA/CUR comicronizzata ha una distribuzione granulometrica, misurata con uno strumento Malvern Mastersizer 3000 con algoritmo di calcolo Mie, avente una curva di distribuzione con una moda tra 3,1 e 3,8 micron ed avente almeno 98% in volume di particelle minori di 10 micron e preferibilmente almeno 50% in volume di particelle minori di 3,5 micron.
8. Composizione farmaceutica umana o veterinaria, comprendente N-palmitoil-D-glucosamina secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7.
9. Composizione secondo la rivendicazione 8, formulata in forme di dosaggio per una somministrazione orale, buccale, parenterale, rettale o transdermica.
10. Composizione dietetica, integratore alimentare o alimento a fini medici speciali (AFMS), o mangimi, o supplementi nutrizionali per animali, comprendente N-palmitoil-D-glucosamina secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7.
11. Composizione cosmetica comprendente N-palmitoil-D-glucosamina secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7.
12. N-palmitoil-D-glucosamina secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7 o composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 8 a 10, per l’uso nel trattamento di patologie infiammatorie croniche sistemiche, dell’uomo e dell’animale, derivanti da disfunzioni degli epiteli e delle membrane sinoviali.
13. N-palmitoil-D-glucosamina secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7 o composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 8 a 10, per l’uso secondo la rivendicazione 12, in cui dette patologie sono scelte tra: - malattie infiammatorie derivanti da disfunzioni delle membrane sinoviali; - malattie infiammatorie derivanti da disfunzioni delle mucose intestinali; - malattie infiammatorie derivanti da disfunzioni della mucosa uroteliale; - malattie infiammatorie derivanti da disfunzioni degli epiteli cheratinizzati.
14. Procedimento di cristallizzazione di N-palmitoil-D-glucosamina in presenza di un acido grasso, comprendente le seguenti fasi: a) mettere a disposizione N-palmitoil-D-glucosamina, preferibilmente con purezza >98%, determinata mediante analisi TLC; b) sospendere la N-palmitoil-D-glucosamina in un solvente polare unitamente all’acido grasso o ad un suo sale, in cui l’acido grasso o suo sale sono presenti in quantità ponderali comprese tra 2% e 20% oppure tra 4% e 10% rispetto alla N-palmitoil-D-glucosamina; c)riscaldare la sospensione della fase b) ad una temperatura compresa tra 50°C e 90°C oppure a ricadere del solvente, per un tempo maggiore di 15 minuti, oppure maggiore di 30 minuti, oppure maggiore di 1 ora; d) portare lentamente la miscela di cristallizzazione ad una temperatura inferiore a 10°C; e) recuperare il cristallizzato in forma di miscela intima di N-Palmitoil-D-Glucosamina con acido grasso.
15. Procedimento secondo la rivendicazione 14, in cui solvente polare è scelto tra metanolo, etanolo, acetone e acetato d’etile.
16. Procedimento secondo la rivendicazione 14 o 15, in cui l’acido grasso è acido palmitico.