IT201800003279A1 - Peptide neurotrofico per il trattamento terapeutico di patologie neurodegenerative e/o infiammatorie. - Google Patents
Peptide neurotrofico per il trattamento terapeutico di patologie neurodegenerative e/o infiammatorie. Download PDFInfo
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Description
Descrizione dell’invenzione industriale dal titolo: “Peptide neurotrofico per il trattamento terapeutico di patologie neurodegenerative e/o infiammatorie”
DESCRIZIONE
La presente invenzione rientra nel campo dei trattamenti terapeutici delle patologie neurodegenerative, acute o croniche, e delle patologie infiammatorie.
Le patologie neurodegenerative sono malattie di estrema rilevanza clinica ed epidemiologica, con un notevole impatto socio-economico, ma caratterizzate allo stesso tempo dalla mancanza di trattamenti terapeutici efficaci.
La malattia di Alzheimer, il morbo di Parkinson e la Corea di Huntington sono tra gli esempi più rappresentativi di forme neurodegenerative croniche che tendono ad instaurarsi ed aggravarsi con il progredire dell’età. Poiché sono associate ad una progressiva alterazione strutturale e funzionale del sistema nervoso centrale (SNC), tali patologie comportano un graduale e progressivamente invalidante deterioramento delle facoltà mentali e cognitive del paziente nonché delle sue funzioni motorie.
Processi neurodegenerativi si instaurano anche in seguito ad un danno cerebrale acuto che può essere di origine vascolare o traumatica. Tra questi, l’ictus ischemico rappresenta una delle principali cause di disabilità e morte nel mondo, e anche per questa patologia l’incidenza aumenta con l’aumentare dell’età. Nella maggioranza dei casi l’ictus è provocato da una trombosi delle arterie cerebrali principali. L’evento ischemico condivide diversi meccanismi fisiopatologici con il danno cerebrale da trauma (TBI, traumatic brain injury) che le statistiche indicano quale principale causa di morte tra gli individui di età inferiore ai 44 anni, ed entrambi questi fenomeni patologici scatenati da episodi acuti conducono a gravi deficit debilitanti di tipo sia motorio sia cognitivo.
Negli ultimi anni, un numero sempre crescente di evidenze sperimentali ha dimostrato che le patologie neurodegenerative acute e croniche, pur differendo sulla base dei sintomi, delle cause iniziali scatenanti e delle aree cerebrali interessate dal danno, presentano meccanismi patogenetici comuni i quali concorrono congiuntamente a determinare l’elevato grado di morte neuronale che caratterizza primariamente l’insorgenza e la progressione di queste patologie.
Un altro gruppo di patologie con elevata diffusione e con un significativo impatto sulle condizioni di vita dei pazienti sono le malattie infiammatorie croniche. Pur comprendendo patologie molto diverse tra loro, tra cui ad esempio l’artrite reumatoide e il lupus eritematoso sistemico, questi disordini sono comunque legati a un malfunzionamento del sistema immunitario e accomunati da una condizione infiammatoria cronica con conseguenti importanti lesioni a carico di organi diversi. I pazienti affetti da questa tipologia di malattie sono in genere sottoposti ad un costante monitoraggio della loro condizione, spesso per tutto il decorso della loro vita, e delle possibili complicazioni associate alla cronica esposizione alle terapie farmaceutiche cui si sottopongono.
Il fattore Nerve Growth Factor (NGF) rappresenta la prima neurotrofina ad essere stata identificata negli anni ‘50 e i suoi effetti biologici sulla proliferazione e sopravvivenza neuronale e sulla crescita delle fibre nervose sono ben noti. Il fattore NGF, al pari di altre proteine secrete, è sintetizzato a partire da un precursore proteico, il pro-nerve growth factor (proNGF), che può essere processato in neurotrofina matura all’interno della cellula o, alternativamente, può essere secreto e soggetto al taglio ad opera di proteasi extracellulari. La molecola proNGF è dotata di attività biologica propria e studi diversi hanno evidenziato un dualismo tra l’azione di questo precursore e quella della neutrofina matura (Fahnestock, M., et al. ProNGF: a neurotrophic or an apoptotic molecule? Prog Brain Res, 2004. 146: p. 101-10). Il proNGF può infatti esercitare un effetto neurotossico, legato all’attivazione del complesso recettoriale p75-sortilina, e pro-apoptotico, quest’ultimo responsabile di morte cellulare sia in condizioni fisiologiche, ad esempio durante lo sviluppo, che nel contesto di patologie neurodegenerative. Per contro, al NGF viene attribuito anche un ruolo neurotrofico, responsabile del differenziamento e del mantenimento delle caratteristiche fenotipiche di neuroni colinergici nel sistema nervoso centrale e catecolamminergici nel sistema nervoso periferico. È stata anche suggerita l’ipotesi che l’attività del proNGF possa essere mediata dall’attivazione del recettore neurotrofico TrkA. Sinora nell’uomo è stato identificato un solo precursore proNGF, designato come proNGF-B, mediante clonaggio del corrispondente gene codificante (Ullrich A et al.; Human beta-nerve growth factor gene sequence highly homologous to that of mouse Nature. 1983 303(5920):821-5). Dalla porzione carbossiterminale di questa proteina, che è lunga 221 aminoacidi, origina per taglio proteolitico il fattore NGF maturo. È stata anche ipotizzata la presenza nell’uomo di un’altra variante proNGF sulla base di analisi computazionali automatiche del genoma umano, la cui predetta sequenza codificante è accessibile sul database NCBI al seguente link: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/XM_011541518.
Tuttavia, la suddetta variante non è mai stata isolata né tantomeno caratterizzata sperimentalmente.
Negli ultimi anni l’impiego del peptide NGF è stato posto al vaglio quale opportunità terapeutica per la cura delle malattie neurodegenerative, sulla base appunto del potenziale neurotrofico e neurotropico esercitato da questo peptide. Attualmente sono in corso studi clinici per verificare la potenziale applicazione terapeutica del peptide NGF nel campo oftalmologico, la cui efficacia terapeutica è stata già approvata per il trattamento delle cheratiti neurotrofiche. Recentemente il peptide NGF è stato anche impiegato nel trattamento di un grave caso clinico di trauma cerebrale, mediante somministrazione intranasale.
L’impiego terapeutico di questa neutrofina soffre però di alcune importanti limitazioni, che da una parte derivano dall’effetto iperalgesico del peptide NGF e dalla sua suscettibilità alla degradazione da parte delle proteasi di matrice extracellulare e dall’altra dalla sua pericolosa potenziale attività pro-tumorale.
In tale contesto si pone pertanto la drammatica necessità dello sviluppo di strategie terapeutiche che, pur sortendo i benefici effetti della somministrazione del peptide NGF, non presentino gli inconvenienti sopramenzionati.
Tale necessità è stata ora soddisfatta dai presenti inventori, i quali hanno isolato per la prima volta una nuova variante del peptide umano proNGF e trovato sorprendentemente che detta variante proNGF umana è dotata di attività neuroprotettiva ed anti-infiammatoria.
Forma quindi oggetto della presente invenzione un peptide isolato, da ora denominato human proNGF isoforma A (hproNGF-A) che consiste della sequenza aminoacidica SEQ ID NO. 1.
Rientra altresì nell’ambito dell’invenzione una variante del peptide hproNGF-A, comprendente una o più sostituzioni aminoacidiche rispetto a SEQ ID NO. 1, che non alterano l‘attività biologica del peptide hproNGF-A come caratterizzata dai presenti inventori e descritta nel seguito.
Il peptide hproNGF-A che forma oggetto dell’invenzione è caratterizzato da un peso molecolare di 34 kDa, una elevata resistenza alla degradazione da parte delle proteasi extracellulari plasmina e MMP, da una lunghezza di 296 aminoacidi e un punto isoelettrico teorico di circa 9.5. A differenza della variante hproNGF-B umana già nota, il peptide oggetto dell’invenzione contiene un frammento polipeptidico aggiuntivo di 55 aminoacidi altamente idrofobico nella regione amino-terminale (Figura 1C).
Come sarà descritto in dettaglio nella parte sperimentale che segue, i presenti inventori sono arrivati ad identificare il peptide dell’invenzione mediante isolamento da campioni di DNA umano della corrispondente sequenza di acido nucleico codificante. In particolare, l’approccio seguito si è basato sull’utilizzo di una sequenza di DNA in silico, predetta attraverso analisi computazionale di DNA genomico, come templato per il disegno di una coppia di primer di amplificazione. Detta coppia di primer è stata poi impiegata in una reazione PCR condotta su campioni di cDNA umano che ha consentito per la prima volta di amplificare ed isolare il trascritto corrispondente alla nuova isoforma del peptide proNGF umano. Successivamente, la sequenza completa della molecola di cDNA codificante il peptide dell’invenzione è stata isolata da tessuti umani cerebrali e periferici e sottoposta a sequenziamento.
Pertanto, forma ulteriore oggetto dell’invenzione una sequenza di acido nucleico isolata (cDNA) comprendente o consistente della SEQ ID NO. 2 o 3.
Nell’ambito della presente invenzione rientra altresì un anticorpo monoclonale o policlonale isolato che lega specificamente il peptide dell’invenzione. Le tecniche per l’ottenimento di anticorpi policlonali e monoclonali sono consolidate e l’esperto del settore è in grado di applicarle, senza dover ricorrere ad alcuna attività inventiva, in modo tale da ottenere l’anticorpo dell’invenzione.
Formano altresì oggetto della presente invenzione un vettore di espressione comprendente una sequenza di acido nucleico come sopra definita (ossia SEQ ID NO: 2 o 3) e opzionalmente comprendente altresì una sequenza promotore e una sequenza segnale di poliadenilazione, nonché una cellula ospite comprendente il suddetto vettore di espressione.
Vettori di espressione ricombinanti per l’impiego nella produzione di peptidi o proteine sono noti e descritti nello stato della tecnica, per cui la loro scelta e il loro impiego rientrano nelle capacità del tecnico medio del settore. Tali vettori possono essere procariotici od eucariotici. A titolo di esempio non limitativo si citano i vettori eucariotici per espressione in cellule di insetto quali pBacPAK8, pBacPAK9, pAcG2T, pAcHLT A, pAcHLT B, pAcHLT C, pAcGHLT A, pAcGHLT B, pAcGHLT C, pAcSG2, pBAC-1, pFastBac1, pFastBacHT, pFastBac-Dual, pAcP(+)IE1, pAcP(-)IE1, pAcUW31, pBAC-1, pBAC-2cp, pBAC-3, pBAC4x-1, pBAC-7, pBAC-8, pBAC-9, pBAC-10, pBacPAK8, pBacPAK9, pBACsurf-1, pBlueBac4.5, pBlueBacHis2, pMbac, pMelBac, pPbac, pTriEx-1, pVL1392, pVL1393. Alternativamente, il vettore secondo l’invenzione può essere idoneo per l’espressione nelle cellule di mammifero, ad esempio pcDNA3, pcDNA3.1(-),pcDNA3.1(-)_myc-His A, pcDNA3.1(-)_myc-His B, pcDNA3.1(-)_myc-His C, pcDNA3.1(+), pcDNA3.1(+)_myc-His A, pcDNA3.1(+)_myc-His B, pcDNA3.1(+)_myc-His C, pcDNA3.1/Hygro(-), pcDNA3.1/Hygro(+), pcDNA3.1/V5-His A, pcDNA3.1/Zeo (-), pcDNA3.1/Zeo (+), pcDNA3.1+C-6His, pcDNA3.1+C-DYK, pcDNA3.1+C-DYK-P2A, pcDNA3.1+C-HA, pcDNA3.1+C-Myc, pcDNA3.1+N-6His, pcDNA3.1+N-DYK-P2A, pcDNA3.1+N-GST, pcDNA3.1+N-HA, pcDNA3.1+N-Myc, pcDNA3.1-C-eGFP, pcDNA3.1-N-eGFP, pcDNA3.1-P2A, pcDNA3.1-P2A-eGFP, pcDNA5/FRT, pcDNA5-TO pcDNA6/V5-His A, pCI-Neo, pCMV-3Tag-1°, pCMV-3Tag-1a-P2A, pCMV-3Tag-2°, pCMV-3Tag-3°, pCMV-3Tag-3a-P2ApCMV-3Tag-4°, pEGFP-N1, pGen2.1, pGL3-Basic, pGL4.10[luc2], pGL4.14[luc2/Hygro], pGL4.17, pHLSec). In alternativa, il vettore secondo l’invenzione può essere idoneo per l’espressione nelle cellule di lievito, ad esempio pETCON, pYES2, pAO815, pGAPZ, pGAPZa, pHIL-D2, pHIL-S1, pPIC3.5K, pPIC9K, pPICZ, pPICZa, o per l’espressione nelle cellule batteriche, ad esempio pBluescript II KS(-), pBluescript II KS(+), pBluescript II SK(-), pBluescript II SK(+), pBluescript SK(+), pCDFDuet-1, pCOLADuet-1, pColdII, pET-11°, pET-11b, pET-11c, pET-11d, pET-14b, pET-15b, pET-16b, pET-17b, pET-19bpET-20b(+), pET-21a(+), pET-21b(+), pET-21d(+), pET-22b(+)pET-23a(+), pET-24a(+), pET-24b(+), pET-24c, pET-24c(+), pET-24d , pET-24d(+), pET-25b(+), pET-26b(+), pET-27b(+), pET-28a(+), pET-28b(+), pET-28c(+), pET-29a(+), pET-29b(+), pET-29c(+), PET-30a(+), PET-30b(+), PET-30c(+), PET-31b(+), pET32a(+), pET-32b(+), pET-3°, pET-3b, pET-3c, pET-3d, pET-41a(+), pET-41b(+), pET-41c(+), pET-42a(+), pET-42b(+), pET-42c(+), pET-43.1a(+), pET-43.1b(+), pET-45b(+), pET-50b(+), pET-51b(+), pET-52b(+), pET-9°, pETDuet-1, pGEX-2TK, pGEX-4T-1, pGEX-4T-1-H(RBS), pGEX-4T-1-M(RBS), pGEX-4T-2pGEX-4T-3, pGEX-5X-1, pGEX-5X-1-H(RBS), pGEX-5X-1-M(RBS), pGEX-5X-2, pGEX-5X-3, pGEX-6P-1, pGEX-6P-1-H(RBS), pGEX-6P-1-M(RBS), pGEX-6P-2, pGEX-6P-3, pGS-21°, pMAL-c4x, pMAL-c4x-1-H(RBS), pMAL-c4x-1-M(RBS), pMAL-c5E, pMAL-c5x, pMAL-p5E, pMAl-p5g, pMAl-p5x, pQE-1, PQE30, pQE32, pQE-60, pRSFDuet-1, pUC18, pUC19.
Allo scopo di operare il clonaggio della sequenza nucleotidica codificante il peptide dell’invenzione in un vettore idoneo come sopra descritto, possono essere impiegate reazioni di restrizione, sia con tecnologie blunt-end, ad esempio il Topo-cloning, sia attraverso metodologie quali il TA cloning, GATEWAY Cloning Technology, In-Fusion, Ligation independent cloning (LIC), Di- o multi-cistronic cloning, GenEZ™ cloning. In aggiunta, possono essere impiegate sequenze tags all’estremità N- e/o C-terminale nonché specifiche sequenze promotore e specifiche sequenze segnale di poliadenilazione. Preferibilmente, il sistema cellulare impiegato per l’espressione del vettore di espressione dell’invenzione è scelto tra sistemi eucariotici, ad esempio cellule di insetto quali SF-9, SF-21, High Five, Mimic, Drosophila S2, cellule di lievito, ad esempio S. cerevisiae e Pichia pastoris, cellule di mammifero, ad esempio cellule CHO e BHK, cellule di protozoi parassiti, come Leishmania tarentolae. Alternativamente, il sistema cellulare di espressione può essere un sistema procariotico, ad esempio cellule batteriche di E. coli.
Forma oggetto della presente invenzione anche un procedimento per la preparazione del peptide dell’invenzione, secondo il quale la cellula ospite trasformata viene coltivata in condizioni idonee e per un tempo sufficiente per l’espressione del peptide dell’invenzione. Tipicamente le condizioni ed i tempi di coltura idonei dipendono dal sistema cellulare impiegato e possono riguardare, ad esempio, la composizione del mezzo di coltura, il pH, l’umidità relativa, la componente gassosa di O2 e CO2, nonché la temperatura. La selezione delle condizioni e dei tempi di coltura più idonei ad essere impiegati nel procedimento dell’invenzione rientra ampiamente nelle conoscenze e capacità del tecnico medio del settore.
In una forma di realizzazione preferita, il procedimento secondo l’invenzione prevede in aggiunta il passaggio di recuperare dalla coltura cellulare il peptide prodotto. Il passaggio di recupero può essere condotto impiegando metodiche di purificazione proteica che fanno parte della tecnica nota, ad esempio attraverso la denaturazione, solubilizzazione e/o rinaturazione della proteina, oppure mediante uno o più passaggi cromatografici e/o di desalting oppure mediante ultrafiltrazione, dialisi e/o liofilizzazione.
Come verrà illustrato più in dettaglio nella parte sperimentale che segue, i presenti inventori, mediante studi condotti sia in vitro (come illustrato nella Figura 2) che in vivo (come illustrato nelle Figure 3-5), hanno dimostrato che il peptide dell’invenzione ha la capacità di favorire la sopravvivenza di cellule responsive al fattore NGF e la loro differenziazione in fenotipi neuronali.
I risultati presentati nelle Figure 3-5 dimostrano inoltre che, a seguito della somministrazione intranasale del peptide dell’invenzione nei ratti affetti da encefalopatia diabetica, noto modello animale di neurodegenerazione, è stato possibile rilevare il recupero delle funzionalità neurofisiologiche di specifiche aree del cervello, l’ippocampo in particolare, misurata ad esempio come long-term potentiation (LTP) e correlata a fenomeni di plasticità sinaptica e a funzioni cognitive, nonché la stimolazione del processo della neurogenesi nel giro dentato ippocampale.
Oltre agli effetti protettivi, neuroproliferativi e neuro-differenziativi sopra descritti, il peptide dell’invenzione è dotato anche di attività di contrasto dei fenomeni infiammatori, in quanto il suo impiego induce una significativa diminuzione nella produzione di citochine pro-infiammatorie nei sinoviociti prelevati da pazienti con artrite reumatoide. Ad ulteriore supporto di quanto sopra illustrato sono i risultati di studi comparativi condotti dai presenti inventori, in cui è stato dimostrato che la variante umana proNGF-B già nota è invece dotata di attività neurotossica e proinfiammatoria (come illustrato nelle Figure 3-5).
Senza voler essere legati ad alcuna teoria, i presenti inventori hanno evidenziato che le attività biologiche opposte esercitate dal peptide dell’invenzione e dal proNGF-B della tecnica nota potrebbero essere riconducibili all’attivazione di recettori cellulari diversi, in particolare il recettore pan-neurotrofinico p75 (p75NTR) da parte del peptide dell’invenzione ed il complesso recettoriale pro-apoptotico p75NTR-sortilina da parte del pro-beta-proNGF. Entrambe le varianti di proNGF umano risultano invece capaci di legare il recettore TrkA.
Forma quindi oggetto della presente invenzione il peptide dell’invenzione per l’impiego nel trattamento terapeutico di una patologia neurodegenerativa e/o neuro-traumatica e/o una patologia infiammatoria.
Nell’ambito degli eventi patologici scatenati da un insulto cerebrale acuto che può essere di natura traumatica o vascolare, si citano ad esempio, ma non esclusivamente: ictus cerebrale (ischemico ed emorragico), lesioni cerebrali da trauma cranico, ipertensione intracranica, edema intracranico, ipossia/ischemia (perinatale, pediatrica o nell’adulto), ipossia/ischemia da arresto cardiocircolatorio, da annegamento o da ipotermia.
Con riferimento ai quadri patologici neurodegenerativi di natura cronica, si citano ad esempio, anche se non esclusivamente: la malattia di Alzheimer, il morbo di Parkinson e la Corea di Huntington, la sclerosi laterale amiotrofica (SLA), la paralisi sopranucleare progressiva, la demenza frontotemporale, la demenza da corpi di Lewy, la Malattia di Creutzfeldt-Jakob (MCJ), la Malattia di Gerstmann-Sträussler-Scheinker (GSS).
Tra le malattie infiammatorie, in particolare le malattie infiammatorie croniche, si annoverano ad esempio, ma non esclusivamente, l’artrite reumatoide, l’artrite giovanile, il lupus eritematoso sistemico, le malattie infiammatorie croniche intestinali, le vasculiti, le malattie infiammatorie croniche cutanee.
Nell’ambito dell’invenzione rientra inoltre una composizione farmaceutica comprendente il peptide dell’invenzione come definito in precedenza, in combinazione con veicoli, eccipienti e/o diluenti farmaceuticamente accettabili.
La composizione farmaceutica della presente invenzione può essere formulata in qualsivoglia forma idonea ad esempio per la somministrazione per via enterale (orale o gastroenterica, rettale, sublinguale), via parenterale (percutanea, inalatoria, oculare, intravenosa, intra-arteriosa, intramuscolare, intradermica, intranasale, sottocutanea, intraperitoneale), via topica (contatto diretto del farmaco con il sito d’azione e/o con la cute e/o con le mucose e/o con la superficie oculare). Naturalmente la scelta dei veicoli, eccipienti e/o diluenti idonei è effettuata in dipendenza della forma di somministrazione desiderata e tale scelta rientra nelle capacità del tecnico medio del settore.
Nell’ambito della presente invenzione rientra altresì l’impiego diagnostico del peptide dell’invenzione e della corrispondente sequenza codificante. Preferibilmente, la valenza diagnostica di detto peptide e/o della corrispondente sequenza di acido nucleico codificante si applica nel contesto delle patologie neurodegenerative e/o infiammatorie, in particolare allo scopo di controllare l’insorgenza di dette patologie nonché monitorare la loro progressione clinica e l’effetto di approcci terapeutici mirati.
Per la determinazione in un campione biologico del peptide dell’invenzione e/o della sequenza nucleotidica codificante può essere impiegata qualsiasi metodica in vitro idonea all’applicazione diagnostica. Tra le metodiche di più largo impiego per l’analisi qualitativa (presenza o assenza) e/o quantitativa delle proteine si citano, ad esempio, le procedure immunologiche, più particolarmente i saggi ELISA e Western blot, le metodiche di spettrometria di massa e le procedure cromatografiche quali la cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC). Preferibilmente, per l’identificazione ed il dosaggio immunologico del peptide dell’invenzione viene impiegato un reagente di affinità atto a legare specificamente detto peptide, più preferibilmente un anticorpo come definito nell’annessa rivendicazione 10.
Come indicato in precedenza, l’approccio diagnostico può mirare, in alternativa o in aggiunta, all’isolamento e/o alla quantificazione dei livelli della molecola di trascritto codificante il peptide dell’invenzione. A tale scopo possono essere impiegate metodiche molecolari basate, ad esempio, sull’amplificazione degli acidi nucleici, preferibilmente la tecnica PCR, la tecnica PCR real-time quantitativa, il metodo Gene Expression Array. La selezione della metodica in vitro più adeguata ad essere impiegata nell’ambito della presente invenzione rientra ampiamente nelle capacità del tecnico medio del settore.
Per l’esecuzione del procedimento diagnostico dell’invenzione può essere impiegata qualsiasi tipologia di campione biologico idoneo al dosaggio del contenuto proteico e/o trascrizionale, preferibilmente campioni di sangue e suoi derivati quali siero e plasma, liquido amniotico, essudati, espettorati, saliva, liquido cerebrospinale, liquido e/o plasma seminale, biopsie di tessuto, tessuto prelevato durante pratiche chirurgiche e tessuto tumorale. Inoltre la valenza diagnostica del peptide dell’invenzione si estende ai quadri clinici nei quali è già stata descritta una variazione generica dei livelli del peptide NGF, che è riconducibile ad una variazione specifica del peptide oggetto dell’invenzione e/o del trascritto ad esso corrispondente. In particolare, ma non esclusivamente, si fa riferimento a patologie quali la malattia di Alzheimer, il morbo di Parkinson, la corea di Huntington, la SLA, i traumi cerebrali e spinali, le sindromi ipossicoischemiche, l’infarto del miocardio, la sindrome dell’ovaio policistico, l’asma allergica, la sindrome di Rett, la sindrome di Sjogren, la rinite allergica, le cheratiti neurotrofiche dell’occhio, il glaucoma, la retinite pigmentosa, la sindrome dell’occhio secco, l’infertilità maschile, la degenerazione maculare retinica, le neuropatie periferiche da diabete, da infezione virale o da esposizione a chemoterapici, i tumori della mammella, del polmone, della prostata, delle ovaie, i tumori cerebrali e del sistema nervoso, ad esempio il neuroblastoma, il glioblastoma, l’ependimoma, il feocromocitoma, i tumori pituitari, le ulcere da pressione (piaghe da decubito), le ulcere cutanee secondarie al diabete, le vasculiti, le malattie autoimmuni, le malattie genetiche caratterizzate da ipofunzionalità dei sistemi trofici degli epiteli e delle mucose.
La parte sperimentale che segue è fornita a scopo puramente illustrativo e non limitativo della portata dell’invenzione come definita dalle annesse rivendicazioni. Nella parte sperimentale viene fatto riferimento ai disegni annessi, in cui:
La figura 1A mostra le sequenze nucleotidiche dei primers utilizzati per il sequenziamento del cDNA codificante per hproNGF-A. La figura 1B mostra la sequenza nucleotidica del cDNA codificante per hproNGF-A, suddivisa nei 3 esoni che la compongono. Sono evidenziate le regioni non codificanti (UTR) e quella codificante a partire dal codone di start ATG. La figura 1C mostra la struttura schematica della proteina hproNGF-A e sua sequenza amminoacidica.
La figura 2A mostra una serie di microfotografie indicative del differenziamento di cellule PC12 dopo esposizione a terreno senza siero (prima foto da sinistra), a NGF maturo (mNGF, seconda foto da sinistra), a hproNGF-A (terza foto da sinistra) ed a hproNGF-B (quarta foto da sinistra). La figura 2B mostra un istogramma con i risultati del test di vitalità eseguito su cellule PC12 in sospensione dopo aggiunta dei fattori elencati al punto A di cui sopra.
La figura 3 illustra l’effetto del trattamento con hproNGF-A o hproNGF-B sul numero di cellule ippocampali in ratti sani e diabetici. La figura 3A mostra una microfotografia rappresentativa di cellule marcate con l’intercalante del DNA Hoechst. Le linee tratteggiate evidenziano le regioni del Giro Dentato (DG-Ilo e DG-Strato Granulare) dove sono state effettuate le conte cellulari, riportate nei grafici della figura 3B. La figura 3B mostra quattro serie di microfotografie e relativi istogrammi sottostanti rappresentativi dei risultati dell’analisi stereologica quantitativa condotta sul numero di cellule totali in ratti sani (parte superiore del pannello B) e in ratti diabetici (parte inferiore del pannello B), rispettivamente nel DG-Ilo (sinistra) e DG-Strato Granulare (destra). Media ± SEM, n=8 campi, 4 animali per gruppo sperimentale, ANOVA ad una via seguita da test post-hoc di Bonferroni (i valori di P calcolati rispetto ai corrispettivi animali trattati con salina, sono riportati in figura).
La figura 4 illustra l’effetto del trattamento con hproNGF-A o con hproNGF-B sulla plasticità sinaptica ippocampale. La parte destra della figura 4 mostra due grafici box-plot in cui sono rappresentati i risultati del Long Term Potentiation (LTP) condotto in bath perfusion a livello del Giro Dentato su ratti sani (A) e diabetici (B) espressi come percentuale del basale pre-tetano prima e 60 minuti dopo dall’induzione dell’LTP mediante stimolazione ad alta frequenza (HFS) del pathway perforante mediale (Media ± SEM, n=8 animali per gruppo sperimentale). La parte sinistra della figura 4 mostra due inserti corrispondenti rispettivamente ai suddetti grafici in cui è riportato l’incremento del DG-LTP 50-60 minuti dopo l’HFS. Mediana ± interquartile. ANOVA ad una via seguita da test post-hoc di Bonferroni (i valori di P calcolati rispetto ai corrispettivi animali trattati con salina, sono riportati in figura).
La figura 5 illustra l’effetto del trattamento con hproNGF-A o con hproNGF-B sulla neurogenesi ippocampale nei ratti sani (A) e nei ratti diabetici (B). La parte superiore della figura mostra una serie di microfotografie rappresentative di ratti sani (A) e diabetici (B) trattati con hproNGF-A o proNGF-B. Nella parte centrale della figura 5, i grafici box-plot circondati da un riquadro a linea continua rappresentano i risultati delle analisi quantitative nei ratti sani (A) e nei ratti diabetici (B) delle cellule totali che hanno incorporato BrdU, come illustrato nello schema tra i due riquadri che descrive i diversi tipi cellulari che sono stati inclusi nelle analisi riportate nei differenti grafici. La parte inferiore della figura 5 mostra i grafici box-plot in cui sono rappresentati i risultati delle analisi quantitative nei ratti sani (A) e nei ratti diabetici (B) delle cellule che hanno incorporato BrdU e sono contemporaneamente positive per Doublecornin (DCX)(grafici circondati da un riquadro a linea tratteggiata) o NeuN (grafici circondati da un riquadro a linea puntinata). Mediana ± interquartile. n=4 animali per gruppo sperimentale. ANOVA ad una via seguita da test post-hoc di Bonferroni (i valori di P sono riportati in figura).
ESEMPIO 1: Isolamento e sequenziamento della sequenza codificante il peptide hproNGF-A
Allo scopo di isolare la sequenza codificante il peptide dell’invenzione, è stata allestita una reazione PCR impiegando una coppia di primer di amplificazione aventi le sequenze di seguito riportate:
Forward: TGGCCTCATCTAATGGACACT (SEQ ID NO:4)
Reverse: GAAAGCTGCTCCCTTGGTAA (SEQ ID NO:5)
I primer suddetti sono stati disegnati in modo da poter discriminare nel saggio PCR l’espressione tissutale del putativo trascritto codificante il peptide dell’invenzione, denominato hproNGF-A, dal trascritto già descritto in letteratura codificante l’isoforma hproNGF-B. Le sequenze della coppia di primer impiegata per l’amplificazione selettiva della variante hproNGF-B sono le seguenti:
Forward: AGAGAGCGCTGGGAGCCGGA (SEQ ID NO:6)
Reverse: GGACGCTGAGCTGAGCTTGGG (SEQ ID NO:7)
I risultati dell’analisi PCR condotta su campioni di cDNA retro-trascritto da mRNA ottenuto da biopsie di cervello e di tessuto sinoviale umano, hanno dimostrato la presenza del trascritto codificante per la nuova variante proNGF, denominata hproNGF-A, in diversi tessuti umani, sia nel sistema nervoso centrale che nei tessuti periferici.
Il cDNA corrispondente al trascritto hproNGF-A isolato da biopsie cerebrali umane è stato sequenziato mediante metodo Sanger 5'-, internalreverse- e 3'-UTR (Eurofins Genomics) e la sua struttura è illustrata nella Figura 1.
ESEMPIO 2: Costruzione di un sistema di espressione Baculovirus per la produzione del peptide hproNGF-A
I campioni di cDNA ottenuti da tessuto cerebrale umano sono stati sottoposti ad amplificazione mediante PCR impiegando una coppia di primer specifici (primer di clonaggio) disegnati come segue:
Forward: ATGGCCTCATCTAATGGACA (SEQ ID NO:8) Reverse: GGCTCTTCTCACAGCCTT (SEQ ID NO:9)
Il prodotto di amplificazione è stato poi inserito in un plasmide vettore specifico, pFastBac ™ /CT-TOPO<®>, linearizzato e contenente Vaccinia virus DNA topoisomerasi I legata covalentemente all'estremità 3' di ciascun filamento di DNA (riferito come vettore "attivato TOPO<®>") utilizzando il Bac-to-Bac<® >C.HIS TOPO<® >Cloning Kit commercializzato da Thermo Scientific (Numero di catalogo: A11098) seguendo le istruzioni fornite con il prodotto. L’inserimento del frammento codificante nel plasmide è stato ottenuto in provetta tramite ricombinazione blunt-end catalizzata dall’enzima topoisomerasi. Attraverso la reazione sopra-descritta, è stato ottenuto un plasmide codificante il peptide dell’invenzione, a cui è stata aggiunta una “coda” (tag) di sei residui dell’amminoacido istidina (6xHis), necessari nelle fasi di purificazione della proteina ricombinante.
Il prodotto della reazione è stato poi utilizzato per trasformare con il metodo “heatshock” batteri One Shot<® >Mach1™ T1R E. coli chimicamente competenti, utilizzati per la moltiplicazione del plasmide vettore, seguendo le istruzioni contenute nel Bac-to-Bac<® >C-HIS TOPO<® >Cloning Kit (numero di catalogo: A11098, Thermo Scientific). I batteri trasformati sono stati poi seminati su piastre Petri contenenti terreno solido a base di agarosio addizionato di ampicillina, necessaria per la selezione dei batteri ricombinanti, che hanno incorporato attraverso il plasmide anche il gene della resistenza a questo antibiotico. Dopo il tempo necessario per la crescita batterioca (una notte a 37°C), sono state selezionate le colonie resistenti all’ampicillina, che sono state prelevate ed utilizzate per l’isolamento del DNA plasmidico utilizzando il kit PureLink<® >HiPure Mini Plasmid Purification Kit (Numero di catalogo: K210002 Thermo Scientific), seguendo le istruzioni contenute nel kit. L’analisi della correttezza della direzionalità di inserzione è stata effettuata mediante il sequenziamento dei cloni di espressione con i primer forniti nel kit di clonaggio, secondo le istruzioni fornite con il kit stesso. Il plasmide purificato è stato utilizzato per trasformare, mediante “heat shock”, cellule batteriche competenti MAX Efficiency<® >DH10Bac™, fornite con il kit Bac-to-Bac<® >TOPO<® >Expression System (Numero di catalogo: A11100, Thermo Fisher). Queste cellule, attraverso le proteine codificate da un plasmide helper in esse contenuto, effettuano una ricombinazione incorporando il plasmide pFastBac ™ /CT-TOPO<® >in un plasmide più grande, denominato bacmide, che verrà successivamente incorporato per trasfezione in cellule di insetto (SF-9), rendendole abili a produrre un baculovirus ricombinante contenente la sequenza che codifica hproNGF-A. Dopo la reazione di ricombinazione le cellule batteriche sono state coltivate in terreno liquido LB-AGAR secondo le istruzioni fornite con il kit e successivamente il bacmide da queste prodotto è stato purificato utilizzando il PureLink™ HiPure Plasmid Maxiprep Kit (Numero di catalogo: K210007, Thermo Scientific) seguendo le istruzioni ivi incluse. La presenza e il corretto orientamento della sequenza di DNA codificante per il peptide dell’invenzione è stata verificata mediante PCR con i primer di sequenziamento specifici presenti nel kit Bac-to-Bac<® >TOPO<® >Expression System (Numero di catalogo: A11100 Thermo Fisher).
ESEMPIO 3: Produzione del peptide hproNGF-A nelle cellule SF-9
Il bacmide ottenuto come descritto nell’Esempio 2 è stato usato per trasfettare, mediante il reagente Cellfectin<® >II (Numero di catalogo: 10362100, Thermo Scientific), cellule di insetto SF-9 coltivate in medium serum-free SF-900 II SFM (Numero di catalogo: 10902088, Thermo Scientific).
Allo scopo è stata seguita la metodologia indicata nel protocollo di utilizzo del reagente Cellfectin<® >II (Numero di catalogo: 10362100, Thermo Scientific) e nel Bac-to-Bac<® >TOPO<® >Expression System (Numero di catalogo: A11100, Thermo Fisher). Dopo un tempo di circa 72 ore successivo alla trasfezione, il terreno di coltura delle cellule, contenente il baculovirus ricombinante generato dalle cellule stesse, è stato chiarificato per centrifugazione e sottoposto a plaque assay, secondo quanto descritto nelle istruzioni del kit Bac-to-Bac<® >TOPO<® >Expression System (Numero di catalogo: A11100, Thermo Fisher), per verificare il titolo infettivo del virus prodotto. Dopo aver verificato che il virus avesse un titolo minimo di 10<7 >CFU, questo primo stock virale (P1) è stato utilizzato per infettare una quantità più grande di cellule SF-9 che hanno prodotto con modalità analoghe a quelle sopra descritte un secondo stock virale (P2) e contestualmente hanno espresso il peptide hproNGF-A ricombinante che è stato rilasciato nel mezzo di coltura e purificato come descritto di seguito.
ESEMPIO 4: Purificazione del peptide hproNGF-A Per la purificazione del peptide dell’invenzione, il terreno di coltura è stato centrifugato a 10000g per 45 minuti e filtrato con filtri 0,2 micron a bassa ritenzione di proteine (Millex GP, Millipore), per rimuovere le particelle virali e i frammenti cellulari, ed è stato messo a contatto con una resina Ni-Sepharose (GE-Healthcare), che lega selettivamente i frammenti di 6xHis presenti all’estremità C-terminale della proteina ricombinante. La resina, equilibrata con tampone fosfato 20 mM 0,5M NaCl 30 mM Imidazolo (tampone di legame), e il medium di coltura sono stati miscelati in rapporto 1:5 v/v e lasciati in agitazione orbitale a 200 rpm per una notte a 4°C, per permettere ai residui 6xHIS di legarsi ai gruppi attivati presenti sulla resina. Dopo il legame, la resina è stata impaccata in una colonna cromatografica (XK 16/20, GE Healthcare) ed è stato effettuato un lavaggio con 5 volumi di colonna mediante il tampone di legame. La proteina è stata quindi eluita applicando alla colonna un gradiente da 30 mM a 500 mM di imidazolo in 20 volumi di colonna. La proteina eluita è stata dializzata contro acqua ultrapura per 24 ore, quindi il materiale dializzato è stato congelato e sottoposto a liofilizzazione.
Dopo la liofilizzazione, la proteina è stata risospesa alla concentrazione di 1 mg/ml in apposito buffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5 150 mM NaCl 0,5 mM EDTA 1 mM DTT) e successivamente la proteasi Tobacco Etch Virus (TEV) protease (Catalog Number T4455, Sigma Aldrich) è stata aggiunta in rapporto 100U di proteasi per ogni milligrammo di proteina. La reazione mediata dalla proteasi TEV serve a rimuovere la coda (tag) di 6xHIS, legata all’estremità C-terminale della proteina attraverso un piccolo ponte di aminoacidi contenete il sito riconosciuto dalla proteasi TEV. Per la reazione di taglio enzimatico, la miscela di reazione è stata incubata a 30°C per due ore, e successivamente è stata dializzata contro tampone fosfato 20 mM 0,5 M NaCl 30 mM Imidazolo (tampone di legame) per una notte. Il dializzato è stato quindi caricato su una resina Ni-Sepharose (GE-Healthcare), che lega selettivamente i frammenti di 6xHis presenti all’estremità N-terminale della proteina TEV ricombinante. La resina, equilibrata con tampone fosfato 20 mM 0,5M NaCl 30 mM Imidazolo (tampone di legame), e il dializzato sono stati miscelati nel rapporto 1:5 v/v e lasciati in agitazione orbitale a 200 rpm per 4 ore a 4°C, per permettere ai residui 6xHis della TEV di legarsi ai gruppi attivati presenti sulla resina. Dopo il legame, la resina è stata impaccata in una colonna cromatografica (PD10, GE Healthcare) ed è stato effettuato un lavaggio con 5 volumi di colonna mediante il tampone di legame. In questo lavaggio è presente il hproNGF-A umano ricombinante a cui sono stati eliminati i frammenti C-terminali 6xHis. La proteina eluita è stata dializzata contro acqua ultrapura per 24 ore, quindi il materiale dializzato è stato congelato e sottoposto a liofilizzazione.
Il liofilizzato è stato risospeso in Sodio Acetato 25 mM pH 5,0 NaCl 0,2 M per una notte. Il dializzato è stato quindi caricato su una colonna SP-Sepharose FF 16/10 (GE Healthcare) per purificare ulteriormente il hproNGF-A mediante cromatografia a scambio cationico. Dopo il carico in colonna ed un lavaggio con 10 volumi di colonna con buffer sodio Acetato 25 mM pH 5,0 NaCl 0,2 M, il hproNGF-A è stato eluito con un gradiente 0,2-1 M di NaCl in 20 volumi di colonna. Il picco cromatografico corrispondente al hproNGF-A è stato raccolto, dializzato per 24 ore contro 20 litri di acqua ultrapura e successivamente congelato e liofilizzato.
ESEMPIO 5: Analisi SDS-PAGE, Coomassie e Western-blot
L’analisi della purezza e specificità della proteina purificata è stata effettuata attraverso SDS-PAGE, colorazione di Coomassie e Western blot.
In breve, un totale di 1 μg di proteina purificata è stato trattato con tampone di caricamento 4X (62,5 mM Tris HCl pH 6,8, 20% (v/v) glicerolo, 8% (p/v) SDS, 0,025% (w/v) blu di bromofenolo e ditiotreitolo 100 mM) e scaldato a 90°C per 5 minuti. I campioni sono stati risolti con SDS-PAGE in un gel di poliacrilammide a gradiente 8-12% mediante elettroforesi a 25-30 mA nel tampone di corsa (25 mM Tris HCl, 190 mM Glicina regolato a pH 8,3 e 0,1% (v/v) SDS). Dopo l’elettroforesi, il gel è stato sottoposto a colorazione di Coomassie oppure le proteine sono state trasferite su una membrana di nitrocellulosa per una notte a 30 V in tampone di trasferimento (Tris HCl 25 mM, glicina 190 mM regolata a pH 8,3 e 20% (v/v) metanolo) per effettuare il Western blot. Le membrane su cui sono state trasferite le proteine dal gel di poliacrilammide sono state sciacquate in PBS 1% Tween 20 (T-PBS), bloccate in T-PBS contenente 5% di latte liofilizzato non grasso per 1 ora a temperatura ambiente e quindi incubate con anticorpi primari appropriati anti proNGF, per una notte a 4°C. Le membrane sono state quindi lavate estesamente in T-PBS a temperatura ambiente ed incubate con anticorpo secondario coniugato a perossidasi di rafano (HRP). Dopo l’incubazione, il legame dell’anticorpo secondario al primario è stato rilevato con il sistema di chemiluminescenza potenziato (cod WBKLS0500, Millipore).
ESEMPIO 6: Valutazione dell’attività biologica in vitro
Allo scopo di condurre un’analisi comparativa tra l’attività biologica del peptide dell’invenzione e le attività del peptide mNGF e dalla isoforma proNGF-B, è stato eseguito uno studio in vitro mediante l’uso di cellule PC12, che differenziano in fenotipo neuronale a contatto con fattori neurotrofici quali, ad esempio, il peptide mNGF. Le cellule PC12 sono state coltivate nel terreno di coltura RPMI 1640 integrato con siero di cavallo al 10% e siero di vitello al 5% in un'atmosfera umida del 5% di CO2 a 37 ° C. Le cellule in crescita esponenziale sono poi state seminate su piastre a 6 pozzetti contenenti poli-L-lisina, per permettere l'adesione cellulare al fondo del pozzetto. Le cellule sono state lavate tre volte per eliminare qualsiasi traccia di siero, mantenute nel terreno di coltura senza siero per un’ora e poi esposte a terreno senza siero contenente 50 ng/ml di mNGF o 100 ng/ml di hproNGF-A o hproNGF-B. Dopo un’incubazione di cinque giorni nelle condizioni di coltura sopradescritte, solamente le cellule esposte a mNGF e a hproNGF-A hanno emesso i caratteristici prolungamenti (neuriti) che testimoniano l’avvenuto differenziamento neuronale, mentre le cellule esposte a hproNGF-B hanno mostrato evidenti segni di sofferenza, testimoniati dalla loro piccola dimensione, dalla tendenza a staccarsi dal fondo del pozzetto e dalla presenza di numerosi detriti cellulari nel terreno di coltura (come illustrato nella Figura 2A). Inoltre, il test di vitalità effettuato esponendo le cellule PC12 in sospensione alle condizioni di coltura descritte in precedenza ha evidenziato che, mentre il peptide hproNGF-B induce la diminuzione della percentuale di cellule vive dopo 48 ore di coltura, sia il peptide mNGF che il peptide dell’invenzione hproNGF-A mantengono una quota rilevante di cellule vive dopo deprivazione da siero, testimoniando la loro azione neuroprotettiva (come illustrato nell’istogramma della Figura 2B).
ESEMPIO 7: Valutazione dell’attività biologica in vivo
Allo scopo di valutare l’attività biologica in vivo del peptide dell’invenzione a confronto con l’attività del peptide hproNGF-B, è stato impiegato un modello animale di neurodegenerazione indotta da diabete in ratti maschi del ceppo Wistar, del peso di 250-300 grammi. Il diabete nei ratti è stato indotto attraverso una singola iniezione intraperitoneale (i.p.) di streptozotocina 65 mg / kg (Cat. S0130, Sigma-Aldrich, Milano, Italia), sciolta in tampone citrato, pH 4,5. Dopo un periodo di trattamento con streptozotocina pari ad una e quattro settimane, è stata verificata l'insorgenza del diabete con un analizzatore di glucosio Accutrend ™ GC (Roche Diagnostic, Germany). Ratti con livelli di glucosio nel sangue superiori a 300 mg/dl sono stati assegnati ai gruppi sperimentali diabetici. Gli animali sono stati sacrificati quattro settimane dopo l’induzione del diabete.
All'interno del disegno sperimentale descritto sopra e quattro giorni prima dell'eutanasia, i ratti di controllo e quelli diabetici sono stati esposti alle somministrazioni intranasali di peptide hproNGF-A purificato (n = 12 ratti), peptide hproNGF-B (n = 12 ratti) o soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) come veicolo (n = 12 ratti), una volta al giorno per quattro giorni. La somministrazione intranasale è un metodo eletto per la somministrazione di agenti terapeutici al sistema nervoso centrale poiché non è invasivo e consente di superare le problematiche legate all’attraversamento della barriera ematoencefalica del sistema nervoso centrale (SNC) da parte di molecole di grandi dimensioni. In aggiunta, i farmaci somministrati per via intranasale sono direttamente mirati al sistema nervoso centrale, riducendo l'esposizione sistemica e quindi gli eventuali effetti collaterali sistemici indesiderati. La somministrazione intranasale è un metodo ampiamente accettato ed è attualmente utilizzato nelle sperimentazioni cliniche umane.
Per verificare se la natura opposta delle due diverse isoforme di hproNGF potesse influenzare il numero di cellule dell'ippocampo e se la somministrazione di proNGF intranasale potesse avere un effetto sulla perdita neuronale indotta dal diabete, sono state analizzate attraverso microscopia confocale, in entrambi gli strati cellulari del giro dentato dell’ippocampo, granulare (GL) e ilo (HL), le cellule con marcatura positiva al colorante Hoechst (come illustrato nella Figura 3A). I ratti sono stati profondamente anestetizzati e perfusi per via transcardiaca con tampone fosfato 0,1 M seguito da fissativo paraformaldeide al 4% in tampone fosfato 0,1 M. I cervelli sono stati rimossi e sottoposti a crioprotezione con saccarosio al 30% in tampone fosfato. Sezioni coronali da 40 μm di spessore di entrambi gli emisferi, che si estendevano -2,40 / -3,72 mm rispetto al bregma, secondo l'atlante Rat Brain di Paxinos, sono state tagliate su un criostato e poi processate. Le sezioni cerebrali sono state pre-incubate con PBS contenente siero di asino al 10% (v/v), BSA all'1% (p/v) e Triton X-100 allo 0,3% (v/v) per 2 ore a temperatura ambiente (RT). Dopo il lavaggio con PBS, le sezioni sono state incubate (2 h, RT) con anticorpi secondari specifici. Successivamente, le sezioni sono state risciacquate tre volte in PBS e incubate per 10 minuti con colorante di Hoechst per la colorazione specifica dei nuclei. Sia nello strato ilo che in quello granulare, i ratti di controllo trattati con il peptide dell’invenzione hproNGF-A hanno mostrato un numero di cellule simile a quello osservato nei ratti trattati con soluzione salina, mentre il numero di cellule diminuiva significativamente nei ratti trattati con il peptide hproNGF-B rispetto agli animali trattati con soluzione salina (come illustrato nella Figura 3B, pannello superiore). I risultati dell’analisi in vivo sopra descritta concordano con le osservazioni in vitro illustrate nel paragrafo dell’Esempio 6, secondo cui le due isoforme dei peptidi hanno effetti fondamentalmente diversi sulla vitalità delle cellule.
Dal momento che è noto da tempo l’effetto negativo del diabete sul potenziamento a lungo termine (Long-Term Potentiation, LTP), un correlato neurofisiologico della funzionalità dell'ippocampo, è stata successivamente esplorata la possibilità che la somministrazione delle due isoforme distinte di hproNGF modulasse la plasticità neurale dell'ippocampo. Per le registrazioni extracellulari del LTP, fette di ippocampo (350 μm di spessore) sono state tenute immerse a 30 ° C e superfuse (2-3 ml / min-1) con fluido cerebrospinale ossigenato (95% O2, 5% CO2) (ACSF; 126 mM NaCl , 2 mM KCl, 1 mM NaH2PO4, 24 mM NaHCO3, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM glucosio). La stimolazione è stata applicata al pathway perforante mediale del giro dentato (DG) usando un elettrodo a filo di tungsteno isolato bipolare ed i potenziali postsinaptici eccitatori di campo sono stati registrati ad una frequenza di test di controllo di 0,033 Hz dal terzo medio dello strato molecolare della DG con un microelettrodo di vetro. Il potenziamento a lungo termine (LTP) è stato evocato dalla stimolazione ad alta frequenza (HFS) composta da otto treni di impulsi, ciascuno di otto stimoli a 200 Hz e un intervallo intertreno di 2 s, con la tensione di stimolazione aumentata durante il protocollo HFS. Le misurazioni di LTP sono state effettuate 60 minuti dopo l'HFS. Tutte le soluzioni contenevano 50 μM di picrotossina (P1675, Sigma-Aldrich) per bloccare l'attività mediata da GABA-A e facilitare l'LTP.
Come illustrato nella Figura 4A, nei gruppi di controllo (animali sani), la somministrazione del peptide dell’invenzione hproNGF-A non ha influenzato il DG-LTP che è paragonabile a quello del gruppo trattato con soluzione salina, mentre l'entità di DG-LTP negli animali trattati con il peptide hproNGF-B risulta ridotta del 28% rivelando un danno indotto dalla somministrazione di hproNGF-B. Nei gruppi di animali diabetici, la somministrazione di hproNGF-A ha migliorato del 38% la diminuzione di DG-LTP indotta da streptozotocina, riportandola a livello dei controlli. Lo studio condotto ha dimostrato, invece, che il DG-LTP nei ratti trattati con hproNGF-B non è diverso da quello misurato nei ratti diabetici trattati con soluzione fisiologica (come illustrato nella Figura 4B).
I risultati sperimentali sopra esposti dimostrano che nei ratti diabetici il trattamento con il peptide dell’invenzione hproNGF-A è in grado di migliorare la funzionalità compromessa dell'ippocampo.
È noto inoltre che l'encefalopatia diabetica compromette il processo di neurogenesi ippocampale. Per verificare gli effetti indotti dalla somministrazione esogena delle due isoforme peptidiche hproNGF sulla neurogenesi dell'ippocampo, sono stati somministrati a ratti sani e diabetici il peptide dell’invenzione hproNGF-A ed il peptide noto hproNGF-B.
Allo scopo di valutare gli effetti dei trattamenti sulla neurogenesi del giro dentato, al momento dell’induzione del diabete, i ratti sono stati inoculati con bromodeossiuridina (BrdU), intercalante del DNA neoformato, andando a marcare specificamente cellule che proliferano al momento dell’inoculo. Successivamente è stata eseguita un’analisi di microscopia confocale effettuando marcature con anticorpi anti-BrdU ed anticorpi specifici per rilevare la presenza di neuroni immaturi (anticorpi contro doublecortin, DCX) o maturi (anticorpi contro NeuN).
L’analisi di microscopia sui campioni da ratti sani ha rivelato l’assenza di effetto sul numero di cellule immunopositive per BrdU da parte del peptide dell’invenzione hproNGF-A. Di contro, come illustrato nella Figura 5A, a seguito del trattamento con hproNGF-B, è stata riscontrata una riduzione significativa del numero di cellule che hanno incorporato BrdU. Negli stessi animali sani, la somministrazione intranasale di hproNGF-A non ha avuto effetti significativi sulla percentuale di cellule contemporaneamente immunopositive per BrdU e per DCX. Il trattamento con il peptide hproNGF-B ha invece indotto una significativa diminuzione della percentuale di cellule immunopositive per DCX (come illustrato dal grafico box-plot nella Figura 5A, riquadro a linea tratteggiata).
I risultati sopra descritti evidenziano l'effetto negativo dell'isoforma peptidica hproNGF-B sulle cellule appena generate.
Negli animali diabetici, a seguito dei trattamenti con i peptidi hproNGF-A e hproNGF-B, non è stata riscontrata alcuna influenza sull'alterazione indotta dal diabete nel numero di cellule BrdU+ (come illustrato dal grafico boxplot della Figura 5B, riquadro a linea continua), né sulla percentuale di cellule BrdU+ che esprimono DCX (come illustrato dal grafico boxplot della Figura 5B, riquadro a linea tratteggiata). Tuttavia, nei ratti diabetici trattati con il peptide dell’invenzione hproNGF-A è stata riscontrato un significativo incremento nella percentuale delle cellule immunopositive per BrdU che risultano anche immunopositive per NeuN (come illustrato dal grafico box-plot della Figura 5B, riquadro a linea punteggiata). Questa osservazione indica che la variante peptidica hproNGF-A, oggetto dell’invenzione, ha un potenziale ruolo neuroprotettivo nelle patologie neurodegenerative caratterizzate da diminuzione di neurogenesi ippocampale, come ad esempio l’encefalopatia diabetica e il morbo di Alzheimer, promuovendo la sopravvivenza e il differenziamento terminale in neuroni maturi delle cellule staminali ippocampali.
Claims (13)
- RIVENDICAZIONI 1. Peptide isolato che consiste della sequenza aminoacidica SEQ ID NO:1.
- 2. Peptide secondo la rivendicazione 1, che è codificato dalla sequenza di acido nucleico SEQ ID NO:3.
- 3. Sequenza isolata di acido nucleico comprendente SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO: 2.
- 4. Vettore di espressione comprendente una sequenza di acido nucleico secondo la rivendicazione 3.
- 5. Cellula ospite comprendente un vettore di espressione secondo la rivendicazione 4.
- 6. Procedimento per la preparazione di un peptide secondo la rivendicazione 1 o 2, comprendente il passaggio di coltivare una cellula ospite secondo la rivendicazione 5 in condizioni idonee e per un tempo sufficiente per l’espressione del peptide e, opzionalmente, il passaggio di recuperare il peptide dalla coltura.
- 7. Peptide secondo la rivendicazione 1 o 2 per l’impiego nel trattamento terapeutico di una patologia neurodegenerativa e/o una patologia infiammatoria.
- 8. Peptide secondo la rivendicazione 7, in cui la patologia è una patologia neurodegenerativa acuta o cronica scelta dal gruppo che consiste di ictus cerebrale ischemico o emorragico, lesioni cerebrali da trauma cranico, ipertensione intracranica, edema intracranico, ipossia/ischemia perinatale, pediatrica o adulta, ipossia/ischemia da arresto cardiocircolatorio, da annegamento o da ipotermia, malattia di Alzheimer, morbo di Parkinson, Corea di Huntington, sclerosi laterale amiotrofica (SLA), paralisi sopranucleare progressiva, demenza frontotemporale, demenza da corpi di Lewy, Malattia di Creutzfeldt-Jakob (MCJ), Malattia di Gerstmann-Sträussler-Scheinker (GSS).
- 9. Peptide secondo la rivendicazione 7, in cui la patologia è una patologia infiammatoria cronica scelta dal gruppo che consiste di artrite reumatoide, artrite giovanile, lupus eritematoso sistemico, malattie infiammatorie croniche intestinali, vasculiti, malattie infiammatorie croniche cutanee.
- 10. Anticorpo che lega specificamente il peptide secondo la rivendicazione 1 o 2.
- 11. Composizione farmaceutica comprendente un peptide secondo la rivendicazione 1 o 2 oppure un anticorpo secondo la rivendicazione 10 ed almeno un veicolo, eccipiente e/o diluente farmaceuticamente accettabile.
- 12. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 11, per l’impiego nel trattamento terapeutico di una patologia neurodegenerativa e/o una patologia infiammatoria.
- 13. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 11 o 12, che è in una forma idonea alla somministrazione per via enterale, parenterale o topica.
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