IT201800001123A1 - Un dispositivo ed un metodo per coltura cellulare tridimensionale - Google Patents
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Description
D E S C R I Z I O N E
Campo di applicazione
L'invenzione riguarda un dispositivo ed un metodo per coltura cellulare tridimensionale generalmente utilizzabile per coltivare cellule in un ambiente extracorporeo e verificare all'interno del dispositivo l'azione di principi attivi su cellule coltivate.
Stato della Tecnica
Sono noti dispositivi per la coltura di cellule che consistono in un contenitore all'interno del quale è disposto un supporto o substrato tridimensionale sul quale possono attecchire le cellule da coltivare.
Il contenitore ha la forma sostanzialmente di una scatola che può essere di forma parallelepipeda oppure cilindrica e che comprende un ingresso ed una uscita per introdurre un flusso di un fluido nel quale sono trasportate le cellule da coltivare e per scaricare il fluido dopo che ha rilasciato le cellule sul supporto tridimensionale.
La scatola ha un elemento di chiusura ermetica per garantire l'isolamento dall'esterno.
Un dispositivo di questo tipo è noto dal brevetto americano US5,843,766 che insegna un apparato per la coltura ed il confezionamento di coltivazioni di tessuti organici tridimensionali.
Tipicamente, il dispositivo comprende un corpo scatolare di base dotato di coperchio ed in cui è definita una camera di coltura e nella quale sono coltivate cellule per ottenere tessuti organici tridimensionali, come ad esempio, lembi di epidermide, che possono essere conservati in ambiente surgelato e trasportati al destinatario nello stesso contenitore, mantenendoli in ambiente asettico.
Il contenitore comprende un substrato tridimensionale che è posto all'interno della camera di coltura definita nel corpo scatolare di base, per favorire la crescita delle cellule e, quindi, del lembo tridimensionale di epidermide da creare.
Il contenitore, come detto, è dotato di due porte che mettono in comunicazione la camera di coltura con l'esterno e precisamente una porta di ingresso di un fluido che trasporta le cellule da coltivare ed una porta di uscita del fluido dopo che ha rilasciato le cellule sul substrato.
Per garantire la asetticità all'interno della camera di coltura, sono previste guarnizioni di tenuta nei punti di congiunzione dei componenti del contenitore, in particolare tra il corpo di base ed il coperchio di chiusura.
L'interno della camera di coltura è attrezzata con i deflettori e/o paratie per creare un percorso specifico del flusso di fluido, in modo tale che questo in modo uniforme il substrato tridimensionale e distribuisca uniformemente su esso le cellule da coltivare.
L'interno della camera di coltura è anche dotata di perni in rilievo per il supporto ed il bloccaggio del substrato, in modo sia da evitare che questo possa muoversi accidentalmente durante la coltura, sia che resti posizionato equidistante dalle pareti del corpo scatolare e del coperchio.
Quest'ultimo permette l'accesso all'interno della camera di coltura per prelevare i lembi di epidermide ottenuti. Questo stato della tecnica ha alcuni inconvenienti.
Un primo inconveniente consiste nel fatto che questo dispositivo deve essere dotato di specifici deflettori e/o paratie interne alla camera di colture per realizzare un percorso sagomato in modo tale da deviare il flusso del fluido in ingresso in direzioni prestabilite.
Inoltre devono essere anche previsti perni in rilievo per supportare e bloccare il substrato nella sua corretta posizione di impiego.
Tipicamente, questa esigenza rende complicata la struttura complessiva del dispositivo di coltura.
Un secondo inconveniente consiste nel fatto che il substrato deve essere conformato in modo tale da poter supportare i lembi di epidermide ottenuti con la coltura, senza che questi si danneggino a causa della loro struttura molto delicata.
Inoltre, per evitare che parte dell'epidermide da ottenere si generi in zone non idonee, è necessario prevedere che sia il corpo scatolare, sia il coperchio siano realizzati in modo tale da inibire su questi la crescita cellulare. È anche nota una tecnica per valutare la efficacia di farmaci su cellule sane o affette da patologie, in particolare patologie tumorali, utilizzando saggi in-vitro oppure saggi in-vivo.
Nel caso dei saggi in-vitro sono utilizzate colture cellulari note come in mono-strato o anche colture bidimensionali .
Nel caso dei saggi in-vivo sono invece utilizzati trapianti di cellule che, se nel caso specifico sono cellule tumorali umane o cellule primarie normali limane, avvengono in topi immuno-compromessi xenotrapiantati.
Queste tecniche note sono attualmente le sole a disposizione per valutare l'attività farmacologica o biologica e la sicurezza di un trattamento terapeutico, come ad esempio, un trattamento anti-tumorale.
Tuttavia, questa tecnica di valutazione nota presenta diversi inconvenienti.
Un primo inconveniente consiste nel fatto che le colture cellulari in mono-strato sono fisiologicamente molto diverse dai tessuti tridimensionali che originano le cellule stesse, come i tessuti tumorali, ragione per la quale i farmaci anti-tumorali hanno mostrato una efficacia e potenza sensibilmente diversa se valutati su colture cellulari bidimensionali o tridimensionali.
La ragione di questa diversità è determinata dalla diversa crescita cellulare che si ottiene in-vitro su colture mono-strato, rispetto alla crescita cellulare in colture tridimensionali , a causa di alcuni fattori critici.
Un primo fattore critico è di tipo meccanico, poiché, nelle colture mono-strato, le cellule sono sottoposte ad una condizione di maggiore rigidità rispetto alle colture tridimensionali che rispecchiano più fedelmente le condizioni meccaniche tra le forze esercitate sulle cellule in-vivo e, quindi, le condizioni maggiormente aderenti alla realtà.
Un secondo fattore critico delle colture in-vitro è di tipo biochimico, in quanto l'accesso alle sostanze nutrienti, cioè ossigeno, ioni, gradienti e farmaci, risulta critico per i tessuti in-vivo e differisce notevolmente in-vitro per la diversa disposizione delle cellule nelle colture mono-strato rispetto alle colture tridimensionali .
Un terzo fattore critico è di tipo ambientale, in quanto le interazioni fisiologiche tra cellula e cellula e la loro conformazione spaziale risultano altamente compromesse nelle colture mono-strato.
Tutti i fattori critici indicati sopra possono influenzare in modo significativo i meccanismi intracellulari di risposta agli stimoli esterni, alterando la espressione genica, antigenica e impattando sulla conformazione della struttura delle cellule e sul loro stato fenotipico e differenziativo .
È pertanto auspicabile riuscire ad avvicinarsi quanto più possibile alle condizioni di crescita delle cellule invivo, simulando il loro microambiente naturale, nel caso il microambiente tumorale, in modo tale da poter aumentare la capacità predittiva di risposta di un principio attivo oppure di un trattamento terapeutico.
Va inoltre considerato che la valutazione dell'efficacia di un trattamento farmacologico nei modelli animali invivo si discosta notevolmente dal saggio in-vitro anche in termini di numero di cellule tumorali sottoposte a trattamento .
In aggiunta, poiché i saggi in-vitro sono miniaturizzati per comodità, essi coinvolgono un numero di cellule significativamente minore e meno rappresentativo rispetto al numero di cellule che costituiscono una massa tessutale in-vivo, compromettendo in molti casi la predittività di risposta ad un trattamento, generando falsi riscontri positivi o falsi riscontri negativi, impattando negativamente sulla specificità e la sensibilità del test.
Presentazione dell'invenzione.
Scopo dell'invenzione è quello di superare gli inconvenienti della tecnica nota.
Un altro scopo dell'invenzione è mettere a punto un dispositivo ed un metodo per coltura cellulare tridimensionale che permettano di realizzare colture cellulari all'esterno di un essere vivente che siano quanto più possibile simili alle condizioni di vita delle cellule nei tessuti di origine in-vivo.
Un ulteriore scopo dell'invenzione e mettere a punto un dispositivo ed un metodo per coltura cellulare tridimensionale che permettano di fornire una predizione altamente attendibile sulla sicurezza o sulla efficacia di un principio attivo e di un trattamento terapeutico, prima della loro applicazione su un essere vivente.
Un altro scopo dell'invenzione è mettere a punto un dispositivo ed un metodo per coltura cellulare tridimensionale che risulti di agevole applicazione e manipolazione, mantenendo un livello elevato di sicurezza per gli operatori sanitari che ne fanno uso e per le stesse cellule contenute nel dispositivo.
Secondo un aspetto dell'invenzione è previsto un dispositivo per coltura cellulare tridimensionale, in accordo con le caratteristiche della rivendicazione 1. Secondo un altro aspetto dell'invenzione è previsto un kit per coltura cellulare tridimensionale secondo la rivendicazione 9.
Secondo un ulteriore aspetto dell'invenzione è previsto un metodo per coltura cellulare tridimensionale, in accordo con le caratteristiche della rivendicazione 10.
Altri aspetti dell'invenzione sono indicati nelle rivendicazioni indipendenti.
L'invenzione permette di ottenere i seguenti vantaggi: - ottenere colture cellulari tridimensionali in condizioni molto simili a quelle naturali;
predire con elevata attendibilità la sicurezza o l'efficacia di farmaci e/o trattamenti terapeutici su cellule sane o affette da patologie, prima del loro impiego su un essere vivente.
Breve descrizione dei disegni.
Ulteriori caratteristiche e vantaggi dell'invenzione risulteranno maggiormente evidenti dalla descrizione dettagliata di forme di realizzazione preferite, ma non esclusive, di un dispositivo ed un metodo per coltura cellulare tridimensionale, illustrati a titolo di esempio non limitativo nelle unite tavole di disegno in cui:
la FIG. 1 è una vista schematica ed in prospettiva di un dispositivo per la coltura cellulare tridimensionale secondo l'invenzione;
la FI6. 2 è una vista di una prima semi-porzione che forma il dispositivo di Figura 1;
la FIG. 3 è una vista di una seconda semi-porzione che forma il dispositivo di Figura 1.
La FIG. 4 è una vista schematica in sezione longitudinale del dispositivo di Figura 1.
La FIG. 5 è una vista schematica in sezione longitudinale del dispositivo di Figura 1 in cui sono indicate colture cellulari e percorsi di ossigenazione delle cellule in coltivazione ;
La FIG. 6 è una vista esplosa ed in prospettiva del dispositivo di coltura cellulare tridimensionale di Figura 1.
La FIG. 7 è una vista dal basso del dispositivo di Figura 1;
La FIG. 8 è una vista in prospettiva di un adattatore destinato ad accogliere una coppia di dispositivi di coltura tridimensionale secondo l'invenzione, per posizionarli in una zona di osservazione di uno strumento di osservazione;
La FIG. 9 è un'immagine ottenuta al microscopio a fluorescenza che permette di visualizzare cellule di sarcoma di Ewing modificate geneticamente per esprimere una proteina fluorescente rossa (dsRED) e caricate sul dispositivo ;
La FIG. 10 è un'immagine ottenuta al microscopio a fluorescenza che permette di visualizzare cellule di adenocarcinoma pancreatico marcate con il colorante fluorescente verde Calcein-AM (Invitrogen Inc) e caricate sul dispositivo;
La FIG. 11 è un diagramma di crescita di una linea tumorale di adenocarcinoma duttale pancreatico all'interno del dispositivo; il monitoraggio della crescita è ottenuto attraverso un saggio luminometrico Real Time GLO
e consente di misurare la crescita attraverso la valutazione della luce emessa (RLU = unità di luce relativa) che è direttamente proporzionale al numero di cellule vitali presenti; le RLU vengono rilevate con un luminometro;
La FIG. 12 è un diagramma di crescita di una linea tumorale di carcinoma mammario all'interno del dispositivo; il monitoraggio della crescita è ottenuto attraverso Real Time GLO e consente di misurare la crescita attraverso la valutazione della luce emessa (RLU = unità di luce relativa) che è direttamente proporzionale al numero di cellule vitali presenti; le RLU vengono rilevate con un luminometro;
La FIG. 13 è un istogramma che permette di visualizzare il numero di cellule di adenocarcinoma duttale pancreatico cresciute all'interno del dispositivo alle 48, 72 e 96 ore; il numero di cellule e stimato in base alle unità di luce relativa (RLU) ottenute tramite Real Time GLO e rilevate con un luminometro; le RLU sono proporzionali al numero di cellule vitali;
La FIG. 14 è un istogramma che permette di visualizzare il numero di cellule di carcinoma mammario cresciute all'interno del dispositivo alle 48, 72 e 96 ore; il numero di cellule è stimato in base alle unità di luce relativa (RLU) ottenute tramite Real Time GLO e misurate al luminometro; le RLU sono proporzionali al numero di cellule vitali;
La FIG. 15 è un diagramma che rappresenta le curve di linearità ottenute caricando nel dispositivo numeri crescenti di cellule tumorali e misurando al luminometro le unità di luce relativa (RLU) dopo diversi tempi di incubazione (10, 20, 40 e 60 minuti) con il reagente Real Time GLO; per ogni curva è stata calcolata la linea di tendenza e generato il valore di R<2 >della curva che indica un andamento di crescita costante (alta affidabilità della linea di tendenza se R<2 >si avvicina o è uguale a 1), come ci si aspetta nel momento in cui il reagente luminometrico riesce a supportare e rilevare numeri crescenti e anche molto elevati di cellule;
La FIG. 16 è un istogramma che mostra la crescita dicellule tumorali all'interno del dispositivo alle 72 ore, attraverso la misura al luminometro delle unità di luce relativa (RLU) ottenute aggiungendo alla coltura il reagente luminometrico Real Time GLO;
La FIG. 17 è un istogramma che mostra il numero di cellule presenti all'interno del dispositivo dopo 72 ore di coltura, stimate utilizzando le unità di luce relativa (RLU) generate dalle cellule caricate inizialmente (numero noto) e le RLU generate dalle cellule dopo che sono cresciute per 72 ore, considerando che le RLU sono proporzionali al numero di cellule vitali;
La FIG. 18 è un istogramma che mostra la valutazione dell'efficacia dell'agente biologico antitumorale TNF-related apoptosis inducing ligand - solubile (sTRAIL) addizionato alle cellule cresciute all'interno del dispositivo (tempo 0 = inizio del trattamento) in comparazione con le cellule che non hanno subito nessun tipo di trattamento (NT = non trattato); la valutazione viene effettuata tramite aggiunta del reagente Real Time GLO e successiva misurazione al lurninometro delle unità di luce relativa (RLU) che sono proporzionali al numero di cellule vitali; la misurazione delle RLU viene eseguita dopo 6 ore e 24 ore di trattamento;
La FIG. 19 è un istogramma che mostra il numero di cellule tumorali, presenti all'interno del dispositivo in assenza di trattamento (NT) o in seguito a trattamento con l'agente biologico (sTRAIL) al tempo 0 (inizio del trattamento) e dopo 6 ore e 24 ore di coltura; il numero di cellule è stimato utilizzando le unità di luce relativa prodotte in seguito all'aggiunta del reagente luminometrico Real Time GLO e conoscendo il numero di cellule presenti a inizio del trattamento (tempo 0);
La FIG. 20 è un istogramma che mostra la crescita di cellule tumorali luciferasi positive (cioè modificate geneticamente per esprimere l'enzima luciferasi) all'interno del dispositivo dopo 72 ore di coltura, attraverso la misura al luminometro delle unità di luce relativa (RLU) ottenute aggiungendo alla coltura il substrato luciferina (Perkin Elmer Inc);
La FIG. 21 è un istogramma che mostra il numero di cellule tumorali luciferasi positive (cioè modificate geneticamente per esprimere l'enzima luciferasi) presenti all'interno del dispositivo dopo 72 ore di coltura; il numero di cellule viene stimato utilizzando le unità di luce relativa (RLU) generate in seguito all'aggiunta del substrato luciferina dalle cellule caricate inizialmente (numero noto) e le RLU generate dalle cellule dopo che sono cresciute per 72 ore, considerando che le RLU sono proporzionali al numero di cellule vitali ed esprimenti luciferasi ;
La FIG. 22 è un istogramma che mostra il numero di cellule tumorali luciferasi positive (cioè modificate geneticamente per esprimere l'enzima luciferasi) presenti all'interno del dispositivo in assenza di trattamento (NT) o in seguito a trattamento con l'agente biologico (sTRAIL) al tempo 0 (inizio del trattamento) e dopo 24 ore di coltura; il numero di cellule è stimato utilizzando le unità di luce relativa prodotte in seguito all'aggiunta del substrato luciferina e conoscendo il numero di cellule presenti a inizio del trattamento (tempo "0");
La FIG. 23 è un istogramma che mostra il numero di cellule tumorali luciferasi positive presenti all'interno del dispositivo in assenza di trattamento (NT) o in seguito a trattamento con l'agente biologico (sTRAIL) al tempo 0 (inizio del trattamento) e dopo 24 ore di coltura; il numero di cellule è stimato utilizzando le unità di luce relativa prodotte in seguito all'aggiunta del substrato luciferina e conoscendo il numero di cellule presenti a inizio del trattamento (tempo 0);
La FIG. 24 è un istogramma che mostra i risultati in termini di vitalità cellulare ottenuti rispettivamente con l'utilizzo di Real Time GLO su cellule tumorali e del substrato luciferina su cellule tumorali luciferasi positive, in seguito al trattamento con sTRAIL; a parità di trattamento entrambe le metodiche sono in grado di produrre un risultato comparabile;
La FIG. 25 è un istogramma che mostra la crescita di cellule di carcinoma mammario caricate sul dispositivo in confronto alle stesse cellule caricate e trattate dopo 24 ore dalla semina con il chemioterapico NAB paclitaxel (PTX; Abraxane®, Celgene) a una concentrazione 200hM; il monitoraggio della crescita viene effettuato aggiungendo il Reai Time GLO e rilevando al luminometro le unità di luce relativa (RLU) che sono proporzionali al numero di cellule vitali;
La FIG. 26 è un diagramma che mostra il recupero dal dispositivo della matrice tridimensionale sulla quale sono cresciute le cellule, tramite incisione con un bisturi della membrana di ossigenazione;
La matrice contenente le cellule viene inclusa in una resina a base di metacrilato originando un cubetto polimerizzato chimicamente e inglobante la matrice con le cellule; il cubetto di resina viene tagliato al microtomo e la parte sezionata viene quindi fatta aderire ad un vetrino da microscopia che può essere colorato tramite varie colorazioni istologiche o immunoenzimatiche e visualizzato al microscopio;
La FIG. 27 è un'immagine al microscopio di una parte sezionata ricavata dal taglio di un cubetto di metacrilato contenente la matrice tridimensionale su cui sono state fatte crescere le cellule; il vetrino su cui è stata fatta aderire la fettina è colorato con ematossilina e eosina e permette di osservare la sezione sagittale della matrice tridimensionale colonizzata dalle cellule;
La FIG. 28 è un'immagine al microscopio a fluorescenza che mostra la co-cultura all'interno del dispositivo di cellule tumorali modificate geneticamente per esprimere una proteina fluorescente rossa e cellule stromali colorate con un colorante fluorescente verde, ad esempio la Calcein-AM;
La FIG. 29 è un'immagine al microscopio a fluorescenza che mostra la co-cultura all'interno del dispositivo di cellule tumorali modificate geneticamente per esprimere una proteina fluorescente rossa e linfociti colorati con un colorante fluorescente verde, ad esempio la Calcein-AM ; La FIG. 30 è un diagramma che mostra la possibilità di dissociare una biopsia tumorale o tessuto sano allo scopo di isolare le cellule e caricarle nel dispositivo per farle crescere sulla matrice tridimensionale e in seguito visualizzarle e poi trattarle con uno o molteplici principi attivi per predire in maniera personalizzatapaziente specifica, la risposta al trattamento in termini di efficacia (su cellule tumorali) o di sicurezza (su cellule sane).
Descrizione dettagliata di un esempio di realizzazione preferito .
Il dispositivo di coltura 1 comprende un corpo 2 contenitore di forma scatolare che è formato da due semiporzioni 3 e 4 uguali ed unite tra loro, che hanno forma sostanzialmente quadrangolare e che sono realizzate preferibilmente in materiale polimerico.
Ognuna delle due porzioni 3 e 4 è dotata di una zona di cornice perimetrale 3A, 4A, che racchiude al proprio interno una membrana 5 e 6 di tipo permeabile ai gas, ma impermeabile ai liquidi.
Le membrane 5 e 6 possono essere incollate alle rispettive cornici perimetrali 3A, 4A, oppure, preferibilmente, essere ricavate contemporaneamente alla realizzazione di queste ultime, durante una fase di stampaggio per la realizzazione delle due porzioni 3 e 4.
Tra le due porzioni 3 e 4, quando sono unite tra loro, è tesa e bloccata una matrice tridimensionale 7 che destinata a ricevere e trattenere su di sé un numero di cellule "C" da coltivare.
La matrice tridimensionale 7 può essere realizzata con un materiale noto come TNT, che è l'acronimo di Tessuto-Non-Tessuto .
Le cellule "C" sono introdotte nel corpo 2 contenitore attraverso una apertura 8 di carico che è dotata di una imboccatura 9 che si prolunga all'esterno e che è associata ad una delle due porzioni 3 oppure 4 mentre, l'altra porzione è associata all'altra porzione ed è anch'essa dotata di una propria apertura 10 di scarico, dotata di imboccatura 11 che si prolunga all'esterno come la imboccatura 9, ma in direzione opposta rispetto a questa .
Si deve notare che le due aperture 8 e 10 e le rispettive imboccature 9 ed 11 sono disassate tra loro, pur avendo assi longitudinali "X1" ed ”X2" paralleli, questo per favorire la espansione di un flusso della soluzione che trasporta in sospensione le cellule "C" da coltivare che occupi interamente ed in modo omogeneo lo spazio delimitato tra le due porzioni 3 e 4 e definito come esonera 12 di coltura.
Attraverso la imboccatura 9 viene introdotta nel corpo 2 contenitore una soluzione di coltura nella quale si trovano in sospensione le cellule "C" che sono destinate ad essere rilasciate sulla matrice tridimensionale 7 per la loro coltura, mentre attraverso la apertura 10 e la relativa imboccatura 11 è invece scaricata la soluzione di trasporto dopo che questa è stata privata delle cellule "C" trasportate.
La camera 12 di coltura in configurazione assemblata del dispositivo di coltura 1, risulta suddivisa in due semicamere dalla matrice tridimensionale 7.
Come si nota nelle Figure, ognuna delle aperture 8 e 10 sbocca in corrispondenza di una rispettiva semi-camera della camera di coltura 2, in modo tale che il flusso di soluzione che trasporta in sospensione le cellule "C" da coltivare segua in modo obbligato un percorso che attraversa la matrice tridimensionale 7, rilasciandole su quest'ultima secondo una distribuzione sostanzialmente omogenea ed espandibile tridimensionalmente.
Per mantenere a contatto reciproco le due porzioni 3 e 4 in configurazione assemblata del dispositivo di coltura 1 secondo l'invenzione, e previsto un bordo 13 perimetrale che è applicato per mezzo di una fase di stampaggio e che mantiene aderenti tra loro le due porzioni 3 e 4.
Il dispositivo 1 è anche dotato su almeno una delle due porzioni 3 oppure 4 di una serie di piedini 18 per mantenerlo leggermente sollevato quando è appoggiato su una superficie.
Vantaggiosamente, il materiale polimerico utilizzato per la realizzazione del bordo 13 ha un temperatura di fusione inferiore al temperatura di fusione del materiale polimerico con il quale sono realizzate le due porzioni 3 e 4, questo per permettere, nella fase di applicazione per mezzo di pressatura a caldo, di far rammollire il bordo 13 per renderne completa la applicazione e la adesione, senza, tuttavia, raggiungere temperature di riscaldamento nella pressa tali da rammollire anche le due porzioni 3 e 4.
Con riferimento alle Figure 2 e 3, si nota anche che le due porzioni 3 e 4 sono dotate, sulle rispettive zone di cornice perimetrale 3A e 4A, di una serie di denti 14 e di corrispondenti fori 15 che sono predisposti per incastrarsi tra loro, mantenendo l'accoppiamento e l'allineamento affacciato tra le due porzioni 3A, 4A.
Inoltre, per permettere l'accoppiamento tra le due porzioni 3 e 4, senza che le imboccature 9 e 11 interferiscano con le rispettive zone di cornice perimetrale 3A, 4A, in corrispondenza di queste sono ricavati rispettivi incavi 16 e 17, uno in ciascuna porzione, per accogliere le corrispondenti imboccature 9 e 11 in configurazione assemblata del dispositivo 1.
Quest'ultimo può essere corredato opzionalmente di un adattatore 19, come visibile nella Figura 8, che, nella versione esemplificativa illustrata, forma due sedi concave 20 e 21 sagomate secondo il contorno del dispositivo 1 ed in ognuna delle quali è destinato ad essere ricevuto un rispettivo dispositivo 1 di coltura cellulare tridimensionale.
Questo adattatore 19 è utilizzato quando è necessario porre uno o più dispositivi 1 di coltura in una zona di osservazione di lino specifico strumento di osservazione, ad esempio un microscopio, o di acquisizione, ad esempio un lettore di micro-piastre, strumenti non illustrati perché noti alla persona esperta, per analizzare il contenuto dello stesso dispositivo 1 di coltura.
In accordo con il metodo di coltura secondo l'invenzione, il dispositivo 1 di coltura, se richiesto può essere preventivamente caricato con solo terreno di coltura allo scopo di bagnare la matrice 7 tridimensionale, per facilitare la successiva distribuzione delle cellule "C" contenute all'interno della soluzione sospensione cellulare (cosiddetto "priming").
Le cellule vengono risospese in un terreno di coltura ottenendo una sospensione cellulare che viene caricata all'interno del dispositivo 1 di coltura utilizzando una siringa.
Il numero di cellule caricate è compreso in un range che va dalle 30.000-1.000.000 per ogni cm<2 >di superficie di semina del dispositivo di coltura 1.
Le cellule "C" all'interno di quest'ultimo possono essere osservate attraverso un microscopio a fluorescenza, secondo le seguenti modalità:
- cellule "C" fluorescenti, ossia modificate geneticamente per esprimere una proteina fluorescente inclusa ma non limitata alla GFP, YFP, CyanFP, DsRED; queste cellule possono essere direttamente osservate all'interno del dispositivo di coltura 1 come si nota nella Figura 9;
- cellule "C" non fluorescenti: queste cellule possono essere visualizzate utilizzando traccianti cellulari in grado di rendere le cellule "C" fluorescenti, come si nota nella Figura 10.
In dettaglio, questi traccianti sono tipicamente sonde o proteine fluorescenti che entrano nelle cellule "C", previa incubazione delle stesse con una soluzione contenente il tracciante selezionato.
Una tale incubazione viene eseguita prima del caricamento delle cellule "C" nel dispositivo di coltura 1, oppure è fatta direttamente all'interno di quest'ultimo.
Nella soluzione possono essere utilizzati traccianti che rendono le cellule "C" fluorescenti per un breve periodo (1-3 giorni), scelte, ma non limitate alla Calceina-AM, CFSE, al green CMFDA, all'orange CMRA, al violet BMQC, CMTPX, al Deep Red, oppure per un periodo più lungo (5-14 giorni), per mezzo dell'utilizzo del QTracker® cell labeling kit.
Per rendere fluorescenti le cellule "C" possono essere utilizzate anche proteine fluorescenti che sono fatte entrare nelle cellule "C" attraverso una incubazione di 12-16 ore, e che le rendono fluorescenti fino a 2 settimane (CellLight® Nucleus-GFP).
Tutti i traccianti sopra citati sono distribuiti dalla società .
Il monitoraggio della crescita cellulare avviene attraverso un reagente luminometrico, ad esempio il Real Time GLO.
Il reagente contiene un substrato che viene metabolizzato da cellule vitali ed un enzima in grado di reagire con il substrato metabolizzato rilasciato dalla cellula; questa reazione produce un segnale luminoso proporzionale al numero di cellule vitali e metabolicamente attive; questo segnale viene rilevato da un luminometro ed espresso in unità di luce relativa (RLU).
Il reagente (costituito da due soluzioni, enzima e substrato, che vengono miscelate al momento dell'uso) viene addizionato al terreno di coltura ad una concentrazione finale 1X, partendo da uno stock 1000X. Dopo una incubazione che va dai 10 ai 60 minuti, a seconda del tipo di cellule "C" , il segnale luminoso viene rilevato attraverso un comune luminometro.
Il segnale luminoso è direttamente proporzionale al numero di cellule "C" vitali e metabolicamente attive.
Nel sistema tridimensionale secondo l'invenzione vengono caricate da 30.000-1.000.000 per cm<2 >di superficie di semina di cellule "C" per ciascun dispositivo di coltura 1.
Il reagente Real Time GLO viene aggiunto direttamente alla sospensione cellulare e caricato insieme alle cellule "C", oppure è aggiunto in un secondo momento insieme a terreno di coltura fresco, dopo che le cellule "C" sono state caricate nel dispositivo di coltura 1.
La rilevazione del segnale luminoso viene eseguita in tempo reale fino alle 96 ore previa aggiunta del reagente ogni 24 ore alla concentrazione IX (da stock 1000X).
Poiché l'entità del segnale è variabile a seconda del tipo cellulare ed è dipendente dalla dimensione della cellula, per alcuni tipi cellulari può essere necessaria una concentrazione 2X (da stock 1000X) alle 96 ore, in modo da garantire una sufficiente quantità di reagente anche in presenza di altissime densità cellulari.
Nei diagrammi visibili nelle Figure 11 e 12 sono illustrate rispettivamente la curva di crescita di una linea tumorale di adenocarcinoma duttale pancreatico (BxPC3) e di una linea di timore mammario (Bt549).
I valori di intensità luminosa acquisiti al luminometro ed espressi in "unità di luce relativa" (RLU), sono rilevati ogni 24 ore previa aggiunta di terreno di coltura addizionato di reagente Real Time GLO IX per le prime 72 ore e 2X alle 96 ore.
Poiché i valori di RLU sono direttamente proporzionali al numero di cellule "C" vitali, conoscendo il numero di cellule "C" caricate inizialmente (in questo caso indicativamente 560.000 cellule per ciascun dispositivo di coltura 1), è possibile effettuare una stima del numero di cellule "C" cresciute all'interno del dispositivo di coltura 1, come visibile nei diagrammi mostrati nelle Figure 13 e 14 rispettivamente per 1'adenocarcinoma duttale pancreatico e per il tumore mammario.
I diagrammi mostrati in Figura 15 dimostrano che è possibile correlare il segnale luminoso al numero di cellule "C" vitali anche in presenza di alte densità cellulari, possibilità che non sono solitamente previste dal protocollo fornito con il reagente.
Nella presente invenzione, la curva di linearità permette di stabilire se vi sia una correlazione direttamente proporzionale tra numero di cellule e segnale luminoso; la curva è ottenuta caricando un numero progressivo di cellule (in questo caso cellule A673, linea di Sarcoma di Ewing) all'interno del dispositivo di coltura 1 (560.000; 2.240.000; 8.960.000).
La linea di tendenza indica che un elemento ha un andamento crescente o descrescente in modo costante; una linea di tendenza è più affidabile quando il relativo valore di R al quadrato (R<2>) è uguale o vicino a 1.
Il monitoraggio del segnale nel tempo (rilevato alle scadenze di 10, 20, 40 e 60 minuti) permette di identificare la stabilizzazione del segnale che può tuttavia variare a seconda del tipo cellulare.
Nei diagrammi visibili in Figura 16, il dispositivo di coltura 1 è stato caricato con una linea tumorale di Sarcoma di Ewing e la crescita cellulare all'interno è stata monitorata con il reagente Real Time GLO fino alle 72 ore.
Il reagente viene aggiunto alla sospensione cellulare caricata nel dispositivo di coltura 1 ed il segnale luminoso è acquisito dopo 40 minuti di incubazione e correlato al numero di cellule "C" caricate (560.000 cellule totali).
Il terreno di coltura viene cambiato con terreno fresco ogni 24 ore.
Dopo 72 ore di coltura viene aggiunto insieme al terreno il reagente Reai Time GLO e dopo un'incubazione di 40 minuti viene acquisito il segnale luminoso.
Tipicamente, il segnale luminoso è direttamente proporzionale al numero di cellule "C" vitali e, pertanto, è possibile anche effettuare una stima del numero di cellule "C" presenti all'interno del dispositivo di coltura 1, come si può osservare nel diagramma di Figura 17.
Dopo 72 ore di coltura, le cellule "C" tumorali vengono trattate con un agente citotossico biologico (sTRAIL) che viene aggiunto al terreno di coltura e caricato all'interno del dispositivo di coltura 1.
L'efficacia dell'agente viene determinata misurando il segnale luminoso dopo 6 ore, senza rabboccare il reagente, e 24 ore di trattamento, rabboccando il reagente, come visibile nel diagramma di Figura 18.
Utilizzando gli RLU e conoscendo il numero di cellule "C" caricate, è possibile stimare il numero di cellule "C" vitali presenti nel dispositivo di coltura 1 a varie tempistiche dopo il trattamento come mostrato nel digramma di Figura 19.
Un altro metodo di monitoraggio della crescita all'interno del dispositivo prevede l'utilizzo di cellule "C" tumorali modificate geneticamente per esprimere l'enzima luciferasi .
In presenza del substrato luciferina queste cellule "C" sono in grado di metabolizzare il substrato generando un segnale luminoso che viene rilevato per mezzo di un comune luminometro .
Questa modalità viene generalmente utilizzata in-vivo: si induce la formazione di una massa tumorale in una cavia da esperimento utilizzando cellule "C" tumorali umane (xenotrapianto) che esprimono luciferasi.
Dopo aver raggiunto una massa tumorale palpabile, la cui formazione richiede 1-6 settimane a seconda del tipo tumorale, si procede con il trattamento antitumorale.
La valutazione dell'efficacia del trattamento viene valutata inoculando sottocute il substrato luciferina e monitorando il segnale luminoso con un sistema di in-vivo "imaging" che permette di localizzare e quantificare la massa tumorale, ma che, tuttavia, non permette di stimare il numero di cellule "C" tumorali.
Nel dispositivo di coltura 1 le cellule "C" tumorali che sono luciferasi-positive vengono fatte crescere per 72 ore ed è possibile monitorare l'entità della crescita e stimare il numero di cellule "C" tumorali cresciute all'interno del dispositivo di coltura 1 aggiungendo il substrato luciferina e rilevando il segnale luminoso, come mostrato nel diagramma di Figura 20.
Nella Figure 20 e 21 si può notare come l'andamento della crescita e la stima del numero di cellule "C" tumorali presenti all'interno del dispositivo, valutata alle 72 ore, siano in accordo con i dati acquisiti con il diverso metodo di rilevazione basato sull'utilizzo del Real Time GLO e mostrato nelle Figura 16 e 17.
Su questa massa tumorale presente all'interno del dispositivo di coltura 1 valutata alle 72 ore viene testata l'efficacia dell'agente biologico sTRAIL che viene aggiunto al terreno di coltura e viene caricato all'interno del dispositivo di coltura 1.
L'efficacia del trattamento viene determinata dopo 24 ore aggiungendo il substrato luciferina che viene metabolizzato dalle cellule "C" tumorali vitali per mezzo dell'azione della lucifarasi.
Poiché le cellule "C" morte o in apoptosi non producono più l'enzima, queste non riescono a metabolizzare il substrato e, di conseguenza, non sono più in grado di generare un segnale luminoso.
Pertanto, il segnale luminoso risulta ridotto di intensità come conseguenza dell'azione di sTRAIL l'entità della riduzione permette di quantificare l'efficacia del trattamento, come si nota nel diagramma di Figura 22.
Utilizzando gli RLU e conoscendo il numero di cellule "C" caricate, è possibile stimare il numero di cellule "C" vitali residue presenti nel dispositivo di coltura 1 a varie scadenze di tempo dopo il trattamento, come è mostrato nella Figura 23.
Analizzando gli RLU ottenuti con entrambi i metodi di rilevazione viene calcolata la percentuale di vitalità cellulare in seguito al trattamento con l'agente biologico, ponendo il controllo non trattato uguale al 100% e ricavando la percentuale di vitalità dei campioni trattati.
Come visibile nel digramma di Figura 24 entrambi i metodi di rilevazione generano una rispettiva percentuale di vitalità che è paragonabile con l'altra percentuale.
La possibilità di ottenere il medesimo risultato con due diversi metodi di rilevazione conferma un alto grado di attendibilità del metodo secondo l'invenzione e permette di sottolinearne la versatilità, cioè l'applicabilità di diversi sistemi di valutazione della risposta farmacologica .
Alla persona esperta è inoltre noto che il monitoraggio della crescita delle cellule "C" caricate e la quantificazione delle cellule "C" vitali presenti all'interno del dispositivo viene ricavata anche utilizzando mezzi fluorimetrici.
Attraverso l'utilizzo di un comune fluorimetro, la fluorescenza emessa da cellule "C" rese fluorescenti attraverso una modifica genica o attraverso l'uso di coloranti fluorescenti, viene quantificata generando un valore di intensità di fluorescenza (FI).
Il valore di FI permette di stimare il numero di cellule "C" vitali residue presenti nel dispositivo di coltura 1 a varie scadenze di tempo dopo il trattamento.
Per queste caratteristiche e per l'aumentato numero di cellule che costituiscono la massa tumorale tridimensionale il dispositivo ed il metodo di coltura cellulare tridimensionale secondo l'invenzione si collocano ad un livello intermedio tra i modelli di coltura cellulare bidimensionali miniaturizzati cosiddetti in-vitro, ed i modelli di coltura cellulare invivo .
L'invenzione permette di superare le problematiche dovute ad over-efficacia e bassa predittività generati da colture cellulari bidimensionali miniaturizzate, nelle quali non è rispettata la struttura tridimensionale della cellula invivo e, al contrario si associa un limitato numero di cellule "C" tumorali che è possibile far crescere all'interno di una piastra multi-pozzetto.
In accordo con l'invenzione, oltre a farmaci a bersaglio molecolare, può essere testata l'efficacia di agenti chemioterapici convenzionali.
Nell'esempio mostrato in Figura 25, cellule di carcinoma mammario (Bt549) vengono caricate all'interno del dispositivo di coltura secondo l'invenzione e coltivate per 24 ore prima di essere trattate con NAB paclitaxel (PTX, nome commerciale Abraxane®, prodotto dalla Celgene), un chemioterapico convenzionale anche utilizzato per il trattamento di carcinomi della mammella, che è addizionato al terreno di coltura.
Il monitoraggio della crescita con il reagente Real Time GLO fino alle 72 ore di trattamento permette di quantificare l'efficacia del chemioterapico che agisce come citostatico, rallentando dapprima la crescita -tumorale e inducendo infine apoptosi.
Per effettuare studi istologici, il dispositivo di coltura I viene inciso nella sua parte centrale con un bisturi, in modo da recuperare la matrice tridimensionale 7 interna che alloggia la massa cellulare.
La matrice tridimensionale 7 viene disidratata per mezzo di soluzioni acquose a concentrazioni crescenti di etanolo (scala alcolica) fino a etanolo 100% e successivamente inclusa in metacrilato, come mostrato dal diagramma in Figura 26.
All'interno di una soluzione liquida di metacrilato viene inserita la matrice contenente le cellule; la soluzione viene fatta polimerizzare in seguito alla reazione chimica promossa da un catalizzatore, ottenendo un blocchetto solido di resina di metacrilato inglobante la matrice con le cellule.
Il blocchetto viene poi tagliato al microtomo in sezione sagittale e le fettine che si ottengono vengono fatte aderire ad un comune vetrino da microscopia e possono essere colorate per analizzare la morfologia del tessuto (ematossilina ed eosina) oppure utilizzate per reazioni immunoenzimatiche volte a individuare antigeni specifici (immunoistochimica) .
In Figura 27 è mostrata una ematossilina eosina relativa a cellule di sarcoma coltivate all'interno del dispositivo di coltura 1 secondo l'invenzione, successivamente incluse in metacrilato in modo poi da ricavarne una sezione sagittale che permette di verificare la colonizzazione dello spessore della matrice da parte delle cellule tumorali .
All'interno del dispositivo di coltura 1 vengono caricati anche diversi tipi cellulari, allestendo una co-cultura tridimensionale che può essere utilizzata per:
- valutare l'efficacia di principi attivi e trattamenti su cellule tumorali anche in presenza di componenti del microambiente tumorale comprendenti ma non limitati alla matrice extracelluare ed agli elementi stromali, ematopoetici e vascolari in modo da avvicinare la complessità del microambiente alla situazione in-vivo con l'obiettivo di aumentare la predittivita di risposta;
- valutare l'effetto di effettori cellulari comprendenti, ma non limitati a, linfociti, linfociti CAR-T, cellule mesenchimali, cellule mesenchimali geneticamente modificate sulle cellule target;
- ricreare colture organotipiche complesse comprendenti diversi tipi cellulari.
Nelle Figure 28 e 29 sono mostrati alcuni esempi di cellule in co-cultura all'interno del dispositivo di coltura 1 secondo l'invenzione.
I diversi tipi cellulari possono essere marcati con traccianti fluorescenti di diverso colore per poterne distinguere le diverse componenti.
Possono essere anche utilizzate cellule "C" tumorali che sono luciferasi-positive, in modo da poter determinare l'effetto dell'effettore sul target attraverso l'utilizzo del substrato luciferina, come detto in precedenza.
Il dispositivo di coltura 1 può essere caricato con cellule "C" di tumore primario isolate da biopsia.
La biopsia viene dissociata in modo automatico e le cellule "C" tumorali isolate vengono caricate nel dispositivo di coltura 1 permettendo di testare principi attivi e ponendo le basi per un processo di terapia personalizzata, come indicato schematicamente in Figura 30.
Tutte le procedure descritte in precedenza possono essere anche applicate su cellule "C" sane incluse, ma non limitate a, cellule da tessuto epatico, splenico, pancreatico-biliare , cardiaco, tracheo-bronco-polmonare, epiteliale-pilifero, gastro-intestinale, osteo-midollare, adiposo, cartilagineo, nervoso centrale e periferico, orofaringeo, tiroideo, vascolare, gonadico, uterino, cutaneo e sotto-cutaneo.
Le cellule "C" possono essere non modificate o modificate geneticamente per alternarne le proprietà, come nel caso di progenitori somatici indotti (iPS) indifferenziati o differenziati in linee mesodermica, endodermica o ectodermica .
Le cellule "C" sono fatte crescere nel dispositivo di coltura 1 per effettuare studi di citotossicità e valutare i possibili effetti collaterali di principi attivi, di trattamenti oppure per studi di biocompatibilità.
Il funzionamento del dispositivo di coltura 1 secondo l'invenzione è il seguente:
in una prima fase operativa, si procede al priming della camera 12 di coltura con terreno di coltura con il quale si imbibisce la matrice tridimensionale 7.
Successivamente, attraverso la apertura 8 si introduce la soluzione che trasporta le cellule "C" la quale occupa la camera 12 rilasciando le cellule "C" sulle superfici della matrice tridimensionale 7.
Contestualmente, avviene lo scarico della soluzione attraverso la apertura 10.
La ossigenazione delle cellule "C" durante la coltura con ossigeno proveniente dall'esterno avviene attraverso le membrane permeabili 5 e 6.
Le cellule "C" in coltura sono marcate con coloranti fluorescenti e sono visualizzate al microscopio con il quale si valuta anche la loro crescita.
L'efficacia oppure la tossicità di un principio attivo da testare è valutata utilizzando saggi di vitalità delle cellule "C" .
Nel caso fosse richiesto, è possibile prelevare dal dispositivo di coltura 1 la matrice tridimensionale 7 recidendo una delle membrane 5 oppure 6.
Si è in pratica constatato come l'invenzione raggiunga gli scopi prefissati.
L'invenzione come concepita è suscettibile di modifiche e varianti, tutte rientranti nel concetto inventivo.
Inoltre, tutti i dettagli sono sostituibili con altri elementi tecnicamente equivalenti.
Nella attuazione pratica, i materiali impiegati nonché le forme e le dimensioni potranno essere qualsiasi, a seconda delle esigenze, senza per questo uscire dall'ambito di protezione delle seguenti rivendicazioni.
Claims (17)
- R I V E N D I C A Z I O N I 1. Un dispositivo (1) per coltura cellulare tridimensionale comprendente: -Un corpo contenitore (2) di cellule da coltivare formato da una prima semi-porzione (3) ed una seconda semi-porzione (4) affacciate combacianti e fissate tra loro con mezzi di fissaggio (13); -Un vano di coltura (12) che è definito tra dette prima semi-porzione e seconda semi-porzione; -Un substrato tridimensionale (7) di attecchimento e/o supporto di cellule da coltivare che è sistemato in detto vano di coltura; -Un ingresso (8) di una soluzione di trasporto di cellule da coltivare, ed una uscita (10) che collega detto vano di coltura con l'esterno, per lo scarico di detta soluzione di trasporto; caratterizzato dal fatto che almeno una di dette prima semi-porzione e seconda semi-porzione comprende mezzi di ossigenazione (5, 6) di dette cellule da coltivare.
- 2. Il dispositivo secondo la rivendicazione 1, in cui detti mezzi di ossigenazione comprendono una prima membrana (5) associata a detta prima semi-porzione (3) ed una seconda membrana (6) associata a detta seconda semiporzione (4), dette prima membrana e seconda membrana essendo permeabili ai gas ed impermeabili ai liquidi.
- 3. Il dispositivo secondo la rivendicazione 2, in cui dette prima e seconda membrana (5, 6) sono in un solo pezzo con le rispettive prima e seconda semi-porzione (3, 4)-
- 4. Il dispositivo secondo la rivendicazione 1, in cui detti mezzi di fissaggio comprendono un bordo (13) perimetrale che ha sezione trasversale a "C" e nella cui cavità sono ricevute cornici perimetrali (3A, 4A) di dette prima e seconda semi-porzione.
- 5. Il dispositivo secondo una qualunque delle rivendicazioni precedenti, in cui tra dette prima e seconda semi-porzione (3, 4) sono interposti elementi di incastro (14, 15) destinati a mantenerle accoppiate tra loro.
- 6. Il dispositivo secondo la rivendicazione 1, in cui detto substrato (7) tridimensionale ha bordi trattenuti tra dette prima semi-porzione (3) e seconda semi-porzione (4) e suddivide detto vano di coltura (12) in un primo semi-vano ed un secondo semi-vano simmetrici tra loro.
- 7. Il dispositivo secondo la rivendicazione 6, in cui detti primo semi-vano e secondo semi-vano sono privi di elementi interni deviatori e/o di supporto.
- 8. Il dispositivo secondo la rivendicazione 1, in cui detto corpo contenitore (2) comprende una pluralità di piedi (18) di appoggio su una superficie di appoggio.
- 9. Un kit per la coltura cellulare tridimensionale, caratterizzato dal fatto che comprende un dispositivo per coltura cellulare tridimensionale (1) secondo una o più delle rivendicazioni precedenti ed un adattatore (19) che conforma almeno una sede cava (20, 21) di alloggiamento rimuovibile di detto dispositivo di coltura (1).
- 10. Un metodo per coltura cellulare tridimensionale che comprende: -Caricare in un dispositivo per coltura cellulare tridimensionale (1) un numero noto di cellule da coltivare, ottenendo un numero noto di cellule coltivate su di un substrato tridimensionale contenuto in detto dispositivo per coltura cellulare tridimensionale; caratterizzato dal fatto che prima di detto caricare è previsto: - Eseguire un riempimento preventivo di detto dispositivo per coltura cellulare tridimensionale (1) con solo terreno di coltura e dal fatto che dopo detto caricare è previsto: -Monitorare ad intervalli di tempo prestabiliti la vitalità delle cellule; -Rilevare da detto monitorare una crescita di cellule in detti intervalli di tempo; -Introdurre in detto dispositivo per coltura cellulare (1) almeno un principio attivo da testare; -Rilevare con detto monitorare una percentuale di cellule vitali residue e presenti in detto dispositivo per coltura cellulare tridimensionale dopo detto introdurre detto almeno un principio attivo da testare; -Dedurre un grado di efficacia/tossicità di detto almeno un principio attivo da testare in rapporto/proporzione tra detta percentuale di cellule vitali residue e detta quantità nota di cellule.
- 11. Il metodo secondo la rivendicazione 10, in cui detto monitoraggio è eseguito scegliendo tra saggi luminometrici o fluorimetrici.
- 12. Il metodo secondo la rivendicazione 11, in cui detti saggi luminometrici sono scelti tra saggi luminometrici applicati a cellule non modificate o saggi luminometrici basati su cellule modificate geneticamente per esprimere il gene della luciferasi.
- 13. Il metodo secondo la rivendicazione 11 in cui detti saggi fluorimetrici sono scelti tra saggi fluorimetrici applicati a cellule fluorescenti modificate geneticamente e destinate ad esprimere una proteina fluorescente o saggi fluorimetrici applicati a cellule originariamente non fluorescenti e rese fluorescenti con mezzi traccianti cellulari.
- 14. Il metodo secondo la rivendicazione 10 in cui detto principio attivo comprende agenti a base di cellule.
- 15. Il metodo secondo la rivendicazione 10, in cui dette cellule sono cellule umane o animali.
- 16. Il metodo secondo la rivendicazione 10, in cui dette cellule sono cellule sane oppure tumorali
- 17. Il metodo secondo la rivendicazione 10, in cui dette cellule sane sono cellule di derivazione pantissutale includenti cellule modificate geneticamente.
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