IT201800006089A1

IT201800006089A1 - Dispositivo microfluidico per la concentrazione di particelle

Info

Publication number: IT201800006089A1
Application number: IT102018000006089A
Authority: IT
Priority date: 2018-06-06
Filing date: 2018-06-06
Publication date: 2019-12-06
Also published as: EP3801903A1; CN112703056A; US20210154671A1; US12201981B2; JP7531407B2; EP3801903C0; WO2019234657A1; JP2021525885A; EP3801903B1; CN112703056B

Description

Descrizione dell’invenzione industriale dal titolo:

“Dispositivo microfluidico per la concentrazione di particelle”,

TESTO DELLA DESCRIZIONE

Campo dell’invenzione

La presente invenzione si riferisce in generale alle tecniche per la rilevazione o la stima della quantità di particelle presenti in un campione di fluido, particolarmente particelle in basse concentrazioni ed in piccoli volumi.

L’invenzione è stata sviluppata con particolare riferimento a dispositivi microfluidici atti ad essere sottoposti a centrifugazione, nonché a dispositivi e metodi per esami o analisi di campioni di fluido, preferibilmente contenenti particelle organiche o biologiche o batteri o microrganismi, ad esempio per l’esecuzione rapida di antibiogrammi.

L’invenzione è comunque suscettibile di applicazione anche per la rilevazione di altri tipi di particelle eventualmente presenti in un campione fluido, non necessariamente fluidi o particelle organiche o biologiche, e non necessariamente tramite centrifugazione.

Stato della tecnica

Sono note varie tecniche per il conteggio di particelle, ad esempio cellule, presenti in un campione di un fluido, ad esempio un fluido biologico. I sistemi più comunemente impiegati sono di tipo ottico (con o senza fluorescenza), di tipo impedenziometrico o di tipo statico mediante riconoscimento d’immagine. Questi sistemi noti richiedono in generale quantitativi di campione relativamente elevati e non consentono una efficiente parallelizzazione della misura, quali più misure contemporaneamente (?), ovvero presuppongono un quantitativo importante di campione di partenza per effettuare molte misure in parallelo e/o contemporaneamente.

I sistemi noti basati su tecniche di riconoscimento d’immagine possono essere impiegati per l’analisi di piccoli campioni di fluido, ma essi non consentono la parallelizzazione di più campioni, con conseguente aumento dei tempi di misura, a meno di investimenti spesso antieconomici.

Scopo e sintesi dell’invenzione

Nei suoi termini generali, la presente invenzione si propone di indicare dispositivi e metodi che consentano di effettuare, in modo semplice, rapido ed economico, la quantificazione e/o l’identificazione di particelle presenti in bassa concentrazione e/o in piccoli volumi in campioni di fluido, consentendo in modo altrettanto semplice ed economico la parallelizzazione tra più campioni, con vantaggi in termini di tempi e costi, nonché di efficienza in termini di sensibilità e riproducibilità.

Un ulteriore scopo dell’invenzione è quello di indicare metodologie che consentano l’effettuazione di antibiogrammi (quando l’oggetto della misura siano dei microrganismi), ovvero l’ottenimento di profili di suscettibilità di almeno un microrganismo o un microbo o un batterio ad antibiotici, in tempi relativamente rapidi, indicativamente di alcune ore; uno scopo ausiliario dell’invenzione è quello di indicare metodologie che consentano l’effettuazione contemporanea di una pluralità di antibiogrammi.

Tali scopi sono raggiunti, secondo la presente invenzione, da un dispositivo microfluidico per la concentrazione di particelle, e da relativi supporti e metodi, aventi le caratteristiche indicate nelle rivendicazioni allegate. L’invenzione riguarda altresì dispositivi di centrifugazione e/o di rilevazione, utilizzabili in abbinamento al suddetto dispositivo microfluidico, nonché metodologie di analisi basate sull’impiego di un tale dispositivo.

Come risulterà chiaro in seguito, l’invenzione consente di effettuare in modo semplice e rapido efficaci rilevazioni di quantità di particelle in campioni di volume relativamente modesto del fluido di interesse.

Breve descrizione dei disegni

Ulteriori scopi, caratteristiche e vantaggi dell’invenzione risulteranno chiari dalla descrizione particolareggiata che segue, effettuata con riferimento ai disegni annessi, forniti a puro titolo di esempio non limitativo, nei quali:

- le figure 1 e 2 sono viste prospettiche schematiche di un dispositivo di centrifugazione e/o rilevazione e di un dispositivo microfluidico secondo possibili forme di attuazione dell’invenzione;

- la figura 3 è una vista prospettica schematica di un dispositivo microfluidico secondo possibili forme di attuazione dell’invenzione;

- la figura 4 è una vista schematica in esploso di un dispositivo microfluidico secondo possibili forme di attuazione dell’invenzione;

- la figura 5 è un dettaglio in maggior scala di figura 4;

- la figura 6 è una vista prospettica, parziale e schematica, di una parte di dispositivo microfluidico secondo possibili forme di attuazione dell’invenzione;

- la figura 7 è un dettaglio ingrandito di una porzione di estremità di una disposizione microfluidica secondo possibili forme di attuazione dell’invenzione;

- la figura 8 è una vista prospettica schematica volta ad esemplificare una possibile fase di caricamento di un campione di fluido in una disposizione microfluidica secondo possibili forme di attuazione dell’invenzione;

- la figura 9 è una vista prospettica schematica, parzialmente sezionata, di una disposizione microfluidica secondo possibili forme di attuazione dell’invenzione;

- la figura 10 è un dettaglio in maggior scala di figura 9;

- la figura 11 è una vista schematica in esploso di un dispositivo microfluidico secondo possibili forme di attuazione dell’invenzione;

- le figure 12 e 13sono vista prospettiche schematiche, parzialmente sezionate, di una disposizione microfluidica secondo possibili forme di attuazione dell’invenzione;

- la figura 14 è un dettaglio in maggior scala di figura 13;

- la figura 15 è un dettaglio ingrandito di una regione terminale di una disposizione microfluidica secondo possibili forme di attuazione dell’invenzione;

- la figura 16 è una vista prospettica parzialmente sezionata del dispositivo delle figure 1-2, con un relativo dispositivo microfluidico in condizione operativa;

- la figura 17 è un dettaglio in maggior scala di figura 16;

- la figura 18 è una vista prospettica schematica di un dispositivo di centrifugazione e/o rilevazione e di alcuni dispositivi microfluidici secondo possibili forme di attuazione dell’invenzione;

- la figura 19 è un dettaglio in maggior scala di figura 18;

- la figura 20 è una vista prospettica schematica, parzialmente sezionata del dispositivo di centrifugazione di figura 18, con relativi dispositivi microfluidici in condizione operativa;

- la figura 21 è una vista prospettica schematica di un dispositivo microfluidico secondo possibili forme di attuazione dell’invenzione;

- le figure 22 e 23 sono viste schematiche in esploso di dispositivi microfluidici secondo possibili forme di attuazione dell’invenzione;

- la figura 24 è una vista prospettica schematica volta ad esemplificare una possibile fase di caricamento di un campione di fluido in un dispositivo microfluidico del tipo illustrato in figura 21;

- le figure 25 e 26 sono viste prospettiche schematiche, parzialmente sezionate, di un dispositivo microfluidico secondo possibili forme di attuazione dell’invenzione; e - le figure 27 e 28 sono viste prospettiche schematiche volte ad esemplificare possibili modalità di impiego di un dispositivo microfluidico secondo possibili forme di attuazione dell’invenzione.

Descrizione dettagliata di forme di attuazione

Il riferimento ad una forma di attuazione all’interno di questa descrizione sta ad indicare che una particolare configurazione, struttura, o caratteristica descritta in relazione alla forma di attuazione è compresa in almeno una forma di attuazione. Quindi, frasi come “in una forma di attuazione”, “in varie forme di attuazione” e simili, eventualmente presenti in diversi luoghi di questa descrizione, non sono necessariamente riferite alla stessa forma di attuazione. Inoltre, particolari conformazioni, strutture o caratteristiche definite all’interno di questa descrizione possono essere combinate in ogni modo adeguato in una o più forme di attuazione, anche differenti da quelle raffigurate. I riferimenti numerici e spaziali (quali “superiore”, “inferiore”, “alto”, “basso”, eccetera) qui utilizzati sono soltanto per comodità e non definiscono dunque l’ambito di tutela o la portata delle forme di attuazione. Nelle figure sono utilizzati medesimi numeri di riferimento per indicare elementi analoghi o tra loro tecnicamente equivalenti.

Riferendosi inizialmente alle figure 1 e 2, con 1 è indicato nel suo complesso un dispositivo di centrifugazione e/o di rilevazione, avente una struttura 2 che definisce una camera di trattamento e/o rilevazione 3.

In varie forme di attuazione, il dispositivo 1 include un coperchio o sportello 4, preferibilmente incernierato alla struttura 2, per chiudere la camera 3. Il dispositivo 1 ha un sistema di azionamento o movimentazione, indicato nel complesso con 5 in figura 2, che include un organo rotante 5a nell’ambito della camera 3, destinato a porre in rotazione uno o più dispositivi microfluidici, preferibilmente dispositivi di tipo centrifugabile.

Eventualmente, il coperchio 4 può comprendere una relativa parte 4a di un sistema posizionamento e/o guida di un dispositivo microfluidico centrifugabile, oppure di un supporto configurato per supportare una pluralità di dispositivi microfluidici centrifugabili. Nell’esempio, la parte 4a include una sede per un elemento di bloccaggio e guida, indicato con 5b, che è accoppiabile all’organo 5a con interposto il suddetto dispositivo centrifugabile o il suddetto supporto, onde assicurare il reciproco fissaggio in rotazione tra le parti citate.

Il sistema di attuazione 5 comprende di preferenza un motore elettrico (visibile parzialmente nelle figure 16-17, dove è indicato con 5c), eventualmente provvisto di un motoriduttore e/o di un circuito di controllo elettronico. Le velocità di centrifugazione possono essere indicativamente comprese tra 200 e 1200 rpm, preferibilmente comprese tra 400 e 1000 rpm, per tempi preferibilmente compresi tra 3 e 30 secondi, molto preferibilmente tra 5 e 15 secondi.

In varie forme di attuazione il dispositivo 1 comprende un sistema di controllo della temperatura e/o dell’umidità nell’ambito della camera di trattamento 3. In varie forme di attuazione, tale sistema è configurato per il mantenimento di una temperatura superiore ai 25°C, preferibilmente compresa tra 36 e 38°C, e/o di un’umidità che è preferibilmente superiore al 95%. In varie forme di attuazione preferite il dispositivo 1 comprende un sistema di aspirazione e/o regolazione della pressione, predisposto per mantenere la zona di centrifugazione, o la camera 3, ad una pressione inferiore alla pressione ambiente e/o per forzare un flusso di aria in uscita da tale zona o camera in un sistema filtrante configurato per impedire la diffusione nell’ambiente di aerosol potenzialmente contaminati.

In varie forme di attuazione il dispositivo 1 include un pannello comandi, quale quello rappresentato solo nelle figure 1 e 2, indicato con 6, sul quale si trovano idonei elementi di comando 6a per avviare e/o arrestare un processo di centrifugazione e/o di climatizzazione e/o di regolazione della pressione e/o di rilevazione, ed eventualmente per impostare parametri di tale processo (ad esempio velocità e/o durata della centrifugazione e/o temperatura e/o umidità e/o pressione nella camera 3), nonché eventuali elementi di visualizzazione e/o segnalazione. I suddetti elementi di comando possono essere di qualsiasi tipo idoneo (pulsanti, manopole, cursori, un visualizzatore tattile, eccetera).

Riferendosi anche alla figura 3, con 10 è indicato un dispositivo microfluidico secondo possibili forme di attuazione dell’invenzione. In varie forme di attuazione, quale quella esemplificata, il dispositivo 10 è configurato per integrare o alloggiare almeno una disposizione atta a concentrare, tramite centrifugazione, particelle contenute in un campione di una sostanza fluida; a tale scopo, il dispositivo 10 include o integra almeno una disposizione microfluidica, indicata con M in figura 3, preferibilmente una pluralità di disposizioni microfluidiche. Nel seguito, per semplicità, verrà fatto inizialmente riferimento al caso di un dispositivo 10 provvisto di una pluralità di disposizioni microfluidiche M, ma in altre forme di attuazione in seguito descritte il dispositivo microfluidico 10 in accordo all’invenzione può includere una singola disposizione microfluidica.

In varie forme di attuazione, e come esemplificato in figura 4, il dispositivo microfluidico comprende un substrato 11 ed un elemento di copertura 12, che definiscono rispettive parti di una disposizione microfluidica M, o di ciascuna disposizione microfluidica M.

In varie forme di attuazione il dispositivo 10 è configurato per essere posto in rotazione rispetto ad un centro di rotazione, che qui si assuma essere identificato dall’organo 5a del dispositivo 1 delle figure 1 e 2. A tale scopo, in varie forme di attuazione preferenziali, il dispositivo 10 ha forma di disco ed include di preferenza mezzi per l’accoppiamento al sistema di attuazione di un relativo dispositivo di centrifugazione, ad esempio per l’accoppiamento all’organo 5a del dispositivo 1 delle figure 1-2. Nel caso esemplificato, i suddetti mezzi di accoppiamento comprendono un passaggio o foro centrale 11a del substrato a disco 11. Come si vedrà, in ogni caso, la forma a disco del substrato 11 non costituisce caratteristica essenziale, fermo restando che - in varie forme di attuazione - il substrato stesso è destinato ad essere posto in rotazione rispetto ad un centro di rotazione.

In varie forme di attuazione il substrato 11 ha uno spessore relativamente sottile, ad esempio compreso tra 0.5 e 4 mm. Il substrato 11 può essere ad esempio formato con vetro o plastica (ad esempio policarbonato o polietilene o copolimeri ciclo-olefine o COC) ed avere un diametro indicativamente compreso tra 10 e 30 centimetri, potendo quindi essere simile ad un classico Compact Disc. I materiali impiegati sono di preferenza materiali elettricamente isolanti, molto preferibilmente materiali almeno in parte trasparenti.

In varie forme di attuazione anche l’elemento di copertura 12 ha uno spessore relativamente sottile, ad esempio compreso tra 0,1 e 0,5 mm. L’elemento di copertura 12 può essere ad esempio formato con policarbonato o COC o polietilene o vetro, ed avere un diametro simile a quello del substrato 11, ad esempio indicativamente compreso tra 10 e 30 centimetri.

Il materiale o i materiali impiegati per la realizzazione dell’elemento di copertura é/sono di preferenza sostanzialmente impermeabili all’aria ed ai liquidi. Anche l’elemento di copertura 12 può essere a forma di disco, preferibilmente provvisto di un passaggio centrale 12a destinato ad essere in posizione concentrica rispetto al passaggio 11a del substrato 11 (si veda ad esempio la figura 3). L’elemento di copertura 12 può essere ad esempio ottenuto da un materiale in foglio flessibile, che viene incollato o saldato sul substrato 11.

Riferendosi alle figure 4 e 5, in varie forme di attuazione, l’almeno una disposizione microfluidica di un dispositivo secondo l’invenzione comprende un rispettivo gruppo di micro-canali 13, definiti in una superficie 11b del substrato 11 (qui definita anche convenzionalmente superficie superiore) sulla quale è applicato l’elemento di copertura 12.

In varie forme di attuazione preferenziali, il dispositivo 10 ha una pluralità di disposizioni microfluidiche, non necessariamente uguali tra loro. A tale scopo, sul substrato 11 possono essere previsti più gruppi di micro-canali 13, ciascun gruppo appartenendo ad una rispettiva disposizione microfluidica. I micro-canali 13 di gruppi differenti hanno preferibilmente sostanzialmente la stessa lunghezza, sebbene ciò non costituisca caratteristica essenziale.

In varie forme di attuazione sono previsti più gruppi di micro-canali 13 di varie lunghezze. Ad esempio, nelle figure 4 e 5, con 131 è indicato un gruppo i cui microcanali hanno lunghezza massima, con 132 è indicato un gruppo i cui micro-canali hanno lunghezza minima, e con 133 è indicato un gruppo i cui micro-canali hanno lunghezza intermedia. Gruppi di micro-canali aventi lunghezze diverse possono essere ad esempio utili per ottimizzare l’occupazione dello spazio disponibile sul substrato 11, particolarmente con un substrato di forma circolare e/o con disposizioni microfluidiche o gruppi di canali 13 in posizioni sostanzialmente radiali, onde disporre su di esso di un gran numero di disposizioni microfluidiche e quindi poter eseguire in modo agevole la parallelizzazione di più campioni.

In varie forme di attuazione, quale quella esemplificata, i micro-canali 13 di ciascun gruppo si estendono in rispettive direzioni sostanzialmente radiali rispetto al centro di rotazione del dispositivo 10, ovvero rispetto al passaggio centrale 11a del substrato 11. I micro-canali 13 di ciascun gruppo sono preferibilmente disposti affiancati tra loro, preferibilmente paralleli e/o sono di preferenza sostanzialmente rettilinei. I micro-canali 13 di ciascun gruppo si estendono di preferenza secondo un piano identificato dal substrato 11, ed a tale scopo essi possono essere definiti sulla superficie 11b tramite idonea tecnica, ad esempio tramite microincisione, o stampaggio, o polimerizzazione di resine mediante UV. Non è comunque esclusa dall’ambito dell’invenzione una realizzazione dei micro-canali tramite deposizione di materiale sul substrato 11.

Secondo la forma di attuazione preferenziale raffigurata, i micro-canali 13 di ciascun gruppo comprendono almeno un micro-canale intermedio disposto in posizione radiale rispetto al centro del passaggio 11a del substrato 11, mentre gli altri micro-canali dello stesso gruppo sono paralleli a detto micro-canale intermedio, in una configurazione comunque prossima ad una disposizione radiale, preferibilmente disposti paralleli lungo entrambi i lati del micro-canale assiale.

Secondo una ulteriore forma di attuazione non raffigurata, i micro-canali 13 di ciascun gruppo comprendono tutti i micro-canali disposti radialmente rispetto al centro del passaggio centrale 11a del substrato 11, ovvero i micro-canali 13 di ciascun gruppo sono tra loro leggermente angolati, preferibilmente tra loro divergenti in corrispondenza della estremità più lontana dal passaggio centrale 11 ovvero convergenti in corrispondenza della estremità più vicina al passaggio centrale 11a.

Ciascun micro-canale 13 ha un’estremità di ingresso ed è predisposto per ricevere un fluido campione. A tale scopo, di preferenza ma non necessariamente, ciascuna disposizione microfluidica M comprende anche almeno una camera di caricamento (che può anche essere in forma di condotto o canale) alla quale è collegata in comunicazione di fluido l’estremità di ingresso di ciascun micro-canale di un relativo gruppo 13.

Una tale camera di caricamento è ben visibile ad esempio nei dettagli di cui alle figure 6 e 7, dove è indicata con 14. Dalla figura 7 ben si nota come i micro-canali 13 abbiano le loro estremità di ingresso - alcune indicate con 13a - che sono in comunicazione di fluido con la rispettiva camera 14, e come tali estremità di ingresso 13a siano collegate alla medesima camera 14, preferibilmente con un collegamento o una disposizione in parallelo o tra loro affiancata delle estremità 13a.

In varie forme di attuazione, particolarmente quelle relative a dispositivi microfluidici predisposti per la centrifugazione, la camera 14 e le estremità di ingresso 13a dei micro-canali 13 di un dato gruppo sono destinate ad essere in posizione più prossima al centro di rotazione del substrato 11, l’estremità opposta dei micro-canali essendo invece destinata ad essere in posizione più distanziata rispetto a tale centro di rotazione.

I micro-canali 13 di ciascun gruppo sono preferibilmente almeno in parte uguali tra loro e/o si estendono almeno in parte sostanzialmente paralleli o equidistanti, ad esempio paralleli o equidistanti in una direzione sostanzialmente radiale del substrato 11. In varie forme di attuazione i micro-canali di un medesimo gruppo sono sostanzialmente uguali tra loro in termini di forme e dimensioni. In accordo ad altre forme di attuazione non rappresentate possono invece essere previsti gruppi i cui microcanali hanno sostanzialmente un medesimo andamento o disegno (pattern), ma hanno lunghezze diverse tra loro.

Dalla figura 7 è possibile notare come, in varie forme di attuazione preferenziali, sia la camera 14, sia i micro-canali 13 siano realizzati da cavità o incisioni superficiali del substrato 11, i micro-canali 13 essendo in particolare in forma di micro-scanalature. In termini generali, ciascun micro-canale 13 può avere una larghezza compresa tra 5 e 200 micron, preferibilmente compresa tra 15 e 50 micron e/o una profondità o altezza compresa tra 2 e 100 micron, preferibilmente compresa tra 5 e 40 micron. La lunghezza di ciascun micro-canale 13 - intesa come distanza tra le sue due estremità - può essere indicativamente compresa tra 5 e 50 millimetri. E’ preferibile che i micro-canali 13 di un medesimo gruppo abbiano una sezione di passaggio costante, per omogeneità di analisi. Indicativamente, le pareti o porzioni in rilievo che separano tra loro i microcanali 13 - alcune di tali pareti o porzioni essendo indicate con 11d in figura 7 - possono avere una larghezza compresa tra 5 e 200 micron, preferibilmente compresa tra 15 e 100 micron.

In varie forme di attuazione preferenziali la camera 14 ha una profondità uguale o prossima a quella dei micro-canali 13, ad esempio una profondità o altezza compresa tra 2 e 100 micron, preferibilmente compresa tra 5 e 40 micron.

Come già accennato, ciascuna disposizione microfluidica comprende un elemento di copertura 12, che copre almeno in parte i micro-canali 13 del relativo gruppo di micro-canali. L’elemento di copertura 12 può essere formato almeno in parte con un materiale trasparente, ad esempio vetro o un materiale plastico, onde consentire la visione dei sottostanti micro-canali 13, ad esempio a fini di rilevazione ottica o di illuminazione. Ciò non costituisce tuttavia caratteristica essenziale dell’invenzione, ad esempio quanto il substrato 11 è formato con materiale trasparente, almeno in una sua parte definente un gruppo di micro-canali 13 o in una sua parte definente una regione terminale dei micro-canali 13 di un dato gruppo.

In varie forme di attuazione, quali quelle sinora descritte, un medesimo elemento di copertura è configurato per coprire almeno parzialmente una pluralità di gruppi di micro- canali 13. Riferendosi ad esempio al caso delle figure 3 e 4, sul substrato 11 sono previsti trentasei gruppi di micro-canali 13, ciascuno comprendente una pluralità di micro-canali affiancati o paralleli, aventi differenti lunghezze ed orientati in rispettive direzioni sostanzialmente radiali, i quali sono tutti almeno parzialmente coperti dal medesimo elemento di copertura 12.

In accordo ad altre forme di attuazione ciascuna disposizione microfluidica può includere uno o più elementi di copertura individuale, con l’elemento o ciascun elemento che copre almeno parzialmente un solo gruppo di micro-canali 13.

L’elemento di copertura 12 (o ciascun elemento di copertura) è configurato o dimensionato per lasciare esposta almeno una porzione di ciascuna disposizione microfluidica M, ed in particolare almeno una parte della camera 14. A tale scopo, in varie forme di attuazione, l’elemento di copertura 12 presenta almeno una apertura o passaggio di caricamento che, nella condizione assemblata del dispositivo 10, si trova in sostanziale corrispondenza di una relativa camera 14. Questa caratteristica è ben apprezzabile ad esempio nelle figure 8-10, dove alcuni dei passaggi di caricamento sono indicati con 15. Nell’esempio, ciascun passaggio di caricamento 15 ha profilo circolare, ma tale forma non è evidentemente imperativa. Similmente, il profilo generalmente curvo della camera 14 non costituisce caratteristica essenziale.

In varie forme di attuazione il materiale di cui è costituito l’elemento di copertura 12 è idrofilico, per facilitare l’ingresso del fluido per capillarità in ciascun micro-canale 13 di un gruppo, dalla camera 14 alle estremità di ingresso 13a dei microcanali stessi. Il materiale di cui sono composti i micro-canali 13, ovvero il materiale del substrato 11, può essere in tal caso anche di materiale idrofobico.

E’ anche possibile che almeno una superficie del micro-canale 13 che si estende per tutta la lunghezza dello stesso sia di materiale idrofilico: ad esempio, in un microcanale 13 a sezione rettangolare o trapezoidale, almeno una delle quattro pareti definenti la sezione del micro-canale sarà preferibilmente di materiale idrofilico, ad esempio quella definita dall’elemento di copertura 12.

Come già accennato, sia il substrato 11 che l’elemento di copertura 12 possono essere trasparenti. Ad esempio, il substrato 11 può essere formato almeno in parte con un materiale trasparente per consentire la visione dei micro-canali 13 e l’elemento di copertura 12 può essere trasparente per consentire una retro-illuminazione dei microcanali stessi.

In varie forme di attuazione ciascun micro-canale 13 presenta, lungo tutta la sua estensione, almeno una porzione continua di superficie interna avente caratteristiche idrofiliche. La continuità di una porzione idrofilica lungo la parete interna del microcanale 13 può essere utile nella fase di riempimento, che prevede ad esempio il deposito di una goccia del liquido campione nella camera 14 (come schematizzato in figura 8). Il contatto con la porzione idrofilica provoca il riempimento dei micro-canali 13 per capillarità. A tale scopo, in varie forme di attuazione, la parete di fondo e le pareti laterali dei micro-canali 13, e la corrispondente camera 14, sono formate con un unico materiale idrofobico, mentre una parte prevalente delle pareti superiodi dei micro-canali (ad esempio la loro parte realizzata dall’elemento di copertura 12) è formata con materiale idrofilico. Dall’altro lato, come si vedrà, ciascuna disposizione microfluidica è di preferenza configurata, in corrispondenza della sua regione di estremità opposta alle estremità di ingresso 13a dei micro-canali 13, per contrastare la fuoriuscita del liquido in assenza di sollecitazioni in tal senso. Pertanto, una volta riempito interamente, ciascun micro-canale 13 non è più soggetto a flusso di liquido al suo interno, a meno di sollecitazioni esterne, come in seguito spiegato.

Come in precedenza accennato, il substrato 11 di un dispositivo 10 non deve avere necessariamente forma a disco. Un tale caso è desumibile dalla figura 8, dove è rappresentata una disposizione microfluidica M avente un substrato 11 con forma sezionata sostanzialmente a parallelepipedo, preferibilmente planare, ed un elemento di copertura 12 in forma di lamina anch’essa parallelepipeda.

Come si vedrà, substrati di questo tipo, ovvero non a disco, possono essere vantaggiosamente predisposti per essere trattati - ad esempio tramite idonei supporti o elementi adattatori - in un dispositivo di centrifugazione di tipo commerciale, oppure su di un generico supporto a disco destinato ad essere accoppiato all’organo rotante 5a del dispositivo 1 di figura 1. Si noti comunque che la figura 8 (così come le successive figure 9, 12 e 13) intendono comunque rappresentare anche la porzione di un dispositivo microfluidico più grande, ad esempio la porzione rettangolare indicata con M del dispositivo 10 di figura 3.

La disposizione microfluidica di un dispositivo secondo l’invenzione comprende, in una sua regione terminale generalmente opposta alle estremità di ingresso dei micro-canali, una via di passaggio per consentire almeno l’uscita di aria dai micro-canali stessi. Conformemente all’invenzione, tra tale via di passaggio ed i microcanali è previsto un elemento filtrante permeabile almeno all’aria, che è configurato per trattenere all’interno dei micro-canali stessi le particelle di interesse presenti nel fluido campione.

Le maglie o la porosità dell’elemento filtrante possono quindi essere scelte, in fase di produzione del dispositivo microfluidico, in funzione della dimensione delle particelle che debbono essere oggetto di analisi. In varie forme di attuazione, l’elemento filtrante è anche permeabile alla parte liquida del fluido campione, ad esempio per consentire la fuoriuscita di tale parte liquida dai micro-canali in fase di centrifugazione.

In varie forme di attuazione, l’elemento di copertura può anche essere configurato per definire almeno parte di una sede di alloggiamento per l’elemento filtrante; in alternativa, una sede di alloggiamento per l’elemento filtrante potrebbe essere realizzata nel substrato 11.

L’elemento di copertura, che come detto è configurato per coprire almeno parzialmente i micro-canali di almeno una disposizione microfluidica, può essere dimensionato o configurato al fine di definire la suddetta via di passaggio. Riferendosi ad esempio alle figure 3, 4, 8, 9 e 11, in varie forme di attuazione, l’elemento di copertura 12 definisce una via di passaggio 16 di una corrispondente disposizione microfluidica M, con tale via di passaggio 16 che è ad esempio realizzata da un’apertura passante dell’elemento 12. Nel caso esemplificato nelle figure 3, 4 e 11, posto che sul substrato 11 sono previsti 36 gruppi di micro-canali 13, l’elemento di copertura 12 definisce un numero corrispondente di vie di passaggio 16. In altre forme di attuazione può essere prevista una unica via di passaggio 16 in corrispondenza di una pluralità di gruppi di micro-canali 13.

Sempre riferendosi all’esempio di tali figure, atteso che i micro-canali 13 dei vari gruppi sono sostanzialmente rettilinei, la via di passaggio 16 ed il passaggio di caricamento 15 di una medesima disposizione microfluidica sono sostanzialmente allineate tra loro nella direzione di estensione dei corrispondenti micro-canali 13.

Nelle figure 3, 4, 8, 9 e 11, con 17 sono indicati alcuni dei sopra citati elementi filtranti permeabili almeno all’aria, destinati ad essere posizionati tra i micro canali 13 dei vari gruppi e le corrispondenti vie di passaggio 16. Come visibile particolarmente nelle figure 11 e 12, in varie forme di attuazione, l’elemento di copertura 12 può vantaggiosamente definire una sede 18 configurata per alloggiare almeno parzialmente un relativo elemento filtrante 17. Come esemplificato (si veda ad esempio la figura 11) una tale sede 18 può essere definita in corrispondenza di una relativa via di passaggio 16, particolarmente nel lato dell’elemento di copertura 12 destinato ad essere affacciato al substrato 11.

In varie forme di attuazione, quindi, una disposizione microfluidica è configurata in modo tale per cui un relativo elemento filtrante sia mantenuto in posizione operativa mediante lo stesso elemento di copertura che copre almeno parzialmente i relativi micro-canali.

L’elemento filtrante 17, o ciascun elemento filtrante, è di preferenza conformato in guisa di membrana, con porosità o dimensione di maglia compresa tra 0,02 e 0,45 micrometri, preferibilmente di circa 0.2 micrometri. Una classe di materiali favoriti in tal senso sono i materiali ceramici, ad esempio l’allumina, che può essere ottenuta con porosità controllata. In particolare l’allumina presenta una bassissima tendenza a legarsi in modo aspecifico con i coloranti o i fluorocromi tipicamente utilizzati per la marcatura di cellule. È ovviamente possibile utilizzare altri materiali porosi idonei allo scopo, quali ad esempio materiali plastici, che pur presentando generalmente vantaggi in termini di costi, devono essere valutati caso per caso in relazione alla tendenza a legarsi ai suddetti marcatori coloranti o fluorocromi ed in base alla fluorescenza stessa del materiale polimerico. In generale, nel caso in cui i microrganismi o le cellule oggetto di analisi vengano preventivamente marcati con fluorocromo, l’elemento filtrante 17 sarà di preferenza formato con un materiale che non si lega in modo aspecifico al fluorocromo utilizzato e che non presenti auto-fluorescenza che causerebbe un abbassamento del rapporto segnale rumore.

In varie forme di attuazione lo spessore degli elementi filtranti impiegati è compreso tra 20 e 1000 micrometri, preferibilmente compreso tra 100 e 600 micrometri. L’elemento filtrante è preferibilmente otticamente trasparente. L’allumina porosa tende a disperdere la luce ed appare quindi opaca e poco adatta come substrato di qualità ottica, ma nel caso specifico, quando i suoi nano-pori sono pieni di acqua (indice di rifrazione circa 1,33) o altro fluido con indice di rifrazione più simile all’allumina (indice di rifrazione circa 1,63 misurato a 550 nm), l’effetto di dispersione è notevolmente ridotto e la qualità dell’immagine che si riesce a ottenere attraverso la membrana bagnata in allumina è sufficiente per la rilevazione di particelle micrometriche o cellule in campo chiaro o in fluorescenza.

Nel caso esemplificato, gli elementi 17 hanno forma quadrangolare, ma tale forma non deve essere ritenuta essenziale: la forma dell’elemento filtrante 17 può infatti essere diversa a seconda delle necessità o del tipo di realizzazione del dispositivo microfluidico.

La figura 8 illustra in forma schematica una possibile modalità di immissione di un campione di fluido nella disposizione microfluidica M di un dispositivo secondo possibili forme di attuazione dell’invenzione. Nel caso esemplificato, tramite un idoneo utensile T (quale una pipetta atta a dispensare una quantità controllata di fluido, indicativamente dell’ordine dei microlitri o delle decine di microlitri) un campione FS del fluido che deve essere sottoposto ad esame viene depositato nella camera 14, attraverso il relativo passaggio di caricamento 15, preferibilmente definito almeno in parte nell’elemento di copertura 12.

Il campione FS può essere una semplice goccia del fluido, come nel caso esemplificato, o anche comprendere un volume maggiore.

La camera 14 ed il passaggio 15 agevolano l’immissione del campione di fluido nella disposizione microfluidica M. Inoltre, posto che la disposizione M include una pluralità di micro-canali 13, la camera 14 funge sostanzialmente da collettore per l’immissione in parallelo del fluido in più micro-canali. Detto in altri termini, la previsione di una camera 14 alla quale sono collegate in parallelo le estremità omologhe 13a di più micro-canali 13 ha il vantaggio di evitare di dover immettere singolarmente rispettive frazioni del campione nei singoli micro-canali.

Si noti che, come in precedenza menzionato, la camera 14 potrebbe essere realizzata da un condotto o una canalizzazione, tramite la quale il campione di fluido viene adotto alle estremità di ingresso 13a dei micro-canali.

La possibilità di collegare più micro-canali ad uno stesso ingresso – sia esso una camera, un passaggio o un condotto – consente di aumentare la base statistica della rilevazione, ovvero disporre di più ripetizioni delle stesse condizioni nominali.

Il numero di micro-canali da utilizzare nelle stesse condizioni nominali dipenderà dal tipo di utilizzo del dispositivo e dal volume di ciascun micro-canale: se ad esempio un micro-canale 13 fosse lungo 2 cm, con una larghezza di 50 micrometri e una profondità di 5 micrometri, il volume totale sarebbe di 5*10<6 >micrometri cubi. Con una concentrazione di 10<5 >batteri / ml, si avrebbero allora 10<-7 >batteri per micron cubo. Questo significa che in ogni micro-canale 13 si avrebbero in media 0,5 batteri. Questo significa anche che nei micro-canali 13 che contengono almeno un batterio il segnale potrebbe raddoppiare dopo pochissimo tempo (circa 20-40 minuti), nei casi di proliferazione e rimanere costante in quelli in cui non si ha proliferazione.

Questo tipo di utilizzo può essere battezzato “antibiogramma digitale”. Essendo i micro-canali molto piccoli e potendo essere definiti in posizioni molto prossime tra loro, con un simile andamento, è possibile avere su di un’area molto limitata (quale quella di singolo vetrino da microscopio) una moltitudine di canali, ad esempio compresa tra 250 e 500 micro-canali.

A concentrazioni come quelle poco sopra indicate sarebbe opportuno dedicare a ciascun n-uplicato (gruppo di n micro-canali utilizzati nelle stesse condizioni nominali) a concentrazione nominale uguale un numero di micro-canali compreso tra 100 e 200, al fine di avere una base statistica sufficiente. Su un singolo dispositivo centrifugabile, ad esempio conformato a disco, sarebbe quindi possibile testare una moltitudine (varie decine) di condizioni diverse, ciascuna n-uplicata con n compreso tra 100 e 200. Per concentrazioni maggiori sarà invece possibile raggruppare in un numero inferiore di micro-canali le condizioni nominalmente uguali. Ad esempio, nel caso di concentrazioni dell’ordine di 1 milione di batteri per ml, si potranno utilizzare n-uple di 10-20 microcanali per ogni condizione nominalmente identica.

In varie forme di attuazione, ciascun micro-canale 13 è chiuso alla sua estremità longitudinale opposta rispetto all’estremità di ingresso 13a, ad esempio come rappresentato in figura 15, che illustra una regione terminale CA di un gruppo di microcanali 13, con un relativo elemento filtrante 17 sezionato. Forme di attuazione di questo tipo sono utilizzabili quando ad almeno il tratto terminale dei micro-canali 13 è sovrapposto un elemento filtrante 17, come visibile ad esempio nelle figure 13-15: il fluido può così penetrare dall’estremità di ingresso (13a, figura 10) del micro-canale 13, grazie al fatto che l’aria contenuta in quest’ultimo può progressivamente sfiatare attraverso l’elemento filtrante 17.

Come detto, in varie forme di attuazione, ciascun micro-canale 13 viene preferibilmente riempito per capillarità o sfruttando l’idrofilicità di almeno una delle pareti o superfici che delimitano il micro-canale stesso. Peraltro, come si vedrà, in altre forme di attuazione non rappresentate, il campione fluido potrebbe essere forzato in pressione nei micro-canali, ad esempio utilizzando una pressurizzazione o sovrapressione in ingresso o una depressione in uscita (sempre rispetto alla pressione ambiente). Come detto, nel corso del riempimento di un micro-canale 13, l’aria contenuta in origine in esso può sfiatare attraverso il relativo elemento filtrante 17 e la corrispondente via di passaggio 16, qui definita nell’elemento di copertura 12.

Con riferimento ad esempio al dispositivo 10 di figura 3, dopo che nella camera 14 di almeno una disposizione M è stato introdotto il relativo campione di fluido (come ad esempio in figura 8), lo stesso dispositivo microfluidico viene sottoposto a centrifugazione, ad esempio mediante un dispositivo 1 del tipo rappresentato nelle figure 1 e 2. La figura 16 illustra la condizione di installazione di un dispositivo 10 conformato a disco, quale il dispositivo di figura 3, in un dispositivo di centrifugazione e/o rilevazione 1, con lo sportello 4 di quest’ultimo in condizione chiusa.

A seguito della rotazione del dispositivo 10, e per effetto della forza centrifuga, le particelle presenti nel volume di liquido che occupa un micro-canale 13 tenderanno ad accumularsi nella sua regione terminale CA, rimanendo prevalentemente all’interno del canale stesso; in particolare, le particelle tenderanno ad accumularsi in corrispondenza o in prossimità del fondo chiuso del relativo micro-canale e/o sulla sua parete di fondo e/o sulle sue pareti laterali nella zona terminale CA, in prossimità dell’elemento filtrante 17.

Nel caso in cui l’elemento filtrante 17 sia anche permeabile al liquido, lo stesso liquido del fluido campione potrà fuoriuscire dal micro-canale 13, per effetto della forza centrifuga, passando attraverso l’elemento 17 e la corrispondente via di passaggio 16, ma trattenendo comunque nella regione terminale CA del micro-canale le particelle di interesse.

Secondo varie forme di attuazione, in particolare nel caso di un elemento filtrante 17 permeabile al liquido, almeno parte delle particelle presenti nel volume di liquido contenuto in ogni micro-canale 13 tenderanno ad accumularsi su almeno parte dell’elemento filtrante 17 ubicato nella regione terminale CA del rispettivo micro-canale 13, ovvero sulla porzione di parete del micro-canale delimitato da tale porzione di elemento filtrante 17.

Naturalmente le dimensioni dei micro-canali 13 devono essere sufficienti da permettere l’ingresso delle particelle di interesse all’interno degli stessi. In termini generali sono preferibili micro-canali relativamente “bassi”, ovverosia aventi un’altezza o profondità nell’ordine delle dimensioni delle particelle di interesse o di poco superiore: ciò a motivo del fatto che - a parità di numero e dimensioni di particelle -nella regione terminale CA di un micro-canale 13 “basso” la quantità di particelle accumulate l’una di fianco all’altra formerà un’immagine nel piano di area maggiore rispetto ad un micro-canale più “alto” (ovvero più profondo), in cui le particelle potrebbero sovrapporsi e quindi falsare in una certa misura la rilevazione di quantità e/o tipologia delle particelle. L’impiego di micro-canali “bassi”, preferibilmente con sezione approssimativamente rettangolare, quindi agevola e migliora la qualità di lettura di quantità e/o tipologia mediante sistemi ottici.

Ad esempio, se un dispositivo 10 deve essere impiegato per la separazione di diversi tipi di cellule in sangue intero, è preferibile avere un’altezza (profondità) dei micro-canali 13 compresa tra 10 e 40 micrometri, preferibilmente compresa tra 10 e 20 micrometri. Se l’oggetto di analisi sono invece batteri, i micro-canali potranno avere un’altezza (profondità) compresa tra 3 e 10 micrometri, preferibilmente compresa tra 4 e 8 micrometri. Ancora, nel caso in cui debbano essere misurati dei lieviti, l’altezza dei micro-canali sarà preferibilmente compresa tra 5 e 20 micrometri, preferibilmente compresa tra 8 e 12 micrometri.

In ogni caso, grazie alla disposizione citata, le particelle eventualmente contenute in un volume del fluido che penetra all’interno di un micro-canale 13 tendono a concentrarsi nella relativa regione terminale CA, per effetto della forza centrifuga sia esperita direttamente dalle particelle e determinata da una rotazione del dispositivo 10 attorno al centro di rotazione 5a, sia eventualmente per effetto del flusso del fluido e/o dello svuotamento del micro-canale che trascina con sé le particelle in sospensione.

La rilevazione o lettura può avvenire quantificando in modo ottico la dimensione della massa di particelle che, per effetto della centrifugazione, risulta formata in corrispondenza di ciascuna regione terminale di accumulo CA. E’ anche possibile effettuare una tale rilevazione di quantità e/o tipologia misurando l’intensità di fluorescenza, nel caso in cui le particelle siano state preventivamente marcate con fluorocromi.

In varie forme di attuazione, lo stesso dispositivo 1 può integrare una disposizione ottica di rilevazione. La disposizione ottica può includere un singolo sensore oppure una schiera di sensori (ad esempio come in uno scanner ottico), oppure una matrice rettangolare di sensori, come ad esempio un sensore CCD o un CMOS, con la quale è possibile catturare l’immagine della zona terminale CA del micro-canale e analizzarla in vari modi, ad esempio con programmi di elaborazione automatici per la conta delle particelle. In generale, quindi, un medesimo dispositivo 1 può integrare funzioni di centrifugazione e funzioni di rilevazione o lettura, particolarmente sfruttando la rotazione del supporto 10 sia per tale centrifugazione che per tale lettura mediante la disposizione ottica di rilevazione.

Ad esempio, le figure 16 e 17 esemplificano un dispositivo di centrifugazione 1 avente una disposizione di rilevazione che include almeno un sensore ottico 20, preferibilmente esso stesso costituito da una matrice di sensori ottici. Nell’esempio il sensore 20 è montato stazionario, particolarmente in corrispondenza di una parete di fondo 3a della camera di trattamento 3. Il sensore 20 è ad una distanza rispetto al centro di rotazione 5a del dispositivo 10 tale per cui di fronte al sensore stesso possano transitare le regioni terminali CA (figure 6, 15) di tutte le disposizioni microfluidiche presenti sul dispositivo 10 conformato a disco. Nel caso esemplificato, il sensore 20 è affacciato al lato del substrato 11 opposto all’elemento di copertura 12, ed il substrato 11 è formato con materiale trasparente, almeno in corrispondenza delle suddette regioni terminali CA delle varie disposizioni microfluidiche M: il tal modo, il sensore 20 è comunque in grado di effettuare le necessarie rilevazioni ottiche. Il sensore ottico potrà essere dotato delle opportune ottiche atte a focalizzare e ingrandire la zona di interesse.

Eventualmente, in corrispondenza di una parte generalmente opposta al sensore ottico 20 può essere prevista una sorgente di luce, onde facilitare la rilevazione ottica, oppure un altro sensore ottico di rilevazione. Nel caso esemplificato, una sorgente di luce 21 è associata al lato interno dello sportello 3 del dispositivo 1, in una posizione tale per cui - in condizione di sportello chiuso come rappresentato nelle figure 16-17 – la sorgente 21 illumini almeno la regione terminale CA di volta esposta al sensore 20. Anche a tale scopo l’elemento filtrante 17 può essere realizzato con un materiale trasparente, o con un materiale che risulta trasparente quando a contatto con un liquido. Un materiale preferito per la realizzazione dell’elemento filtrante 17 è, come detto, l’allumina porosa.

Il sistema di controllo del dispositivo 1 può essere predisposto per controllare la posizione angolare del dispositivo microfluidico 10 in funzione delle rilevazioni ottiche da effettuare di volta in volta. Tale sistema di controllo può essere anche predisposto in modo da eseguire le rilevazioni ottiche dopo la fine della fase di centrifugazione, azionando e fermando di volta in volta il supporto 10 nelle varie posizioni angolari di lettura, oppure in modo che le rilevazioni ottiche vengano effettuate con il supporto 10 in movimento, preferibilmente a bassa velocità, quale una velocità in fase di rilevazione o lettura minore della velocità di centrifugazione, ovverosia sincronizzando una rotazione con la lettura.

In altre forme di attuazione, ad esempio con dispositivi microfluidici provvisti di disposizioni microfluidiche orientate in modo diverso dai casi in precedenza esemplificati con riferimento alle figure 1-3, il sensore ottico 20 può essere montato mobile, ad esempio tramite un proprio attuatore, su di una relativa guida, onde essere spostabile, ad esempio nella direzione radiale relativamente al dispositivo 10, per effettuare le necessarie rilevazioni ottiche su più disposizioni microfluidiche. Per tali casi, il sistema di controllo del dispositivo 1 sarà predisposto per controllare la posizione del sensore 21 in funzione delle rilevazioni ottiche da effettuare di volta in volta.

In varie forme di attuazione dell’invenzione, i mezzi sensori ottici 20 di un dispositivo di centrifugazione e/o rilevazione del tipo indicato sono configurati per acquisire un segnale ottico cumulativo o un’immagine cumulativa di una pluralità di regioni di accumulo del dispositivo micro-fluidico, ovvero un segnale o immagine relativo a tutte le regioni di accumulo CA dei micro-canali 13 di una corrispondente disposizione microfluidica M. Il dispositivo di centrifugazione e/o rilevazione è poi predisposto, ad esempio tramite idoneo software, per elaborare, sulla base del suddetto segnale ottico o immagine, informazione rappresentativa di una quantità di particelle accumulate in ciascuna delle singole regioni di accumulo CA dei vari micro-canali di una stessa disposizione microfluidica, particolarmente con un’elaborazione che consente di stimare il numero di particelle per ciascun singolo micro-canale 13.

In altre forme di attuazione, ad esempio quando il sensore ottico 20 include una schiera di sensori, ad esempio come in uno scanner ottico, il sensore stesso può essere configurato per acquisire un segnale ottico individuale o un’immagine individuale della regione di accumulo CA di ogni singolo micro-canale 13 di una corrispondente disposizione microfluidica M. Anche in tal caso il dispositivo di centrifugazione e/o rilevazione è predisposto per elaborare, sulla base del suddetto segnale ottico o immagine, informazione rappresentativa di una quantità di particelle accumulate in ciascuna delle singole regioni di accumulo CA dei vari micro-canali della disposizione microfluidica.

Naturalmente un dispositivo 1 può anche essere realizzato onde poter impiegare entrambe le due tecniche di rilevazione ottica citate (collettiva e individuale).

Le figure 18-20 illustrano possibili varianti di attuazione di un dispositivo di centrifugazione e/o rilevazione 1 e di dispositivi microfluidici 10.

Nel caso esemplificato i dispositivi 10 hanno profilo generalmente quadrangolare ed includono di preferenza ciascuno una singola disposizione microfluidica. Dispositivi di tale forma possono comunque includere anche più disposizioni microfluidiche generalmente parallele tra loro.

Come visibile particolarmente in figura 18, in varie forme di attuazione il dispositivo 1 può essere equipaggiato di un supporto di centrifugazione 30, che definisce una o più sedi 31 – preferibilmente orientate in direzione sostanzialmente radiale rispetto al centro di rotazione 5a – destinate a ricevere ciascuna almeno un dispositivo microfluidico 10. In varie forme di attuazione il supporto 30 presenta, in corrispondenza di ciascuna sede 31, un passaggio 32 (quale una apertura o una finestra o una zona otticamente trasparente) che si trova in posizione corrispondente a quella assunta dalla regione terminale di rilevazione CA dei micro-canali, quando il relativo dispositivo 10 è montato sul supporto stesso, come esemplificato in figura 19. La suddetta posizione del passaggio 32 sul supporto corrisponde altresì – in direzione radiale – alla posizione del sensore 20 del dispositivo 1, di modo che tale sensore sia in grado di effettuare le necessarie rilevazioni ottiche. I passaggi 32 consentono di realizzare il supporto di centrifugazione 30 in un materiale non trasparente, ma possono essere eventualmente presenti in un supporto di centrifugazione 30 realizzato almeno in parte in materiale trasparente.

Nell’esempio non limitativo raffigurato sono previste quattro sedi 31, una per ciascun dispositivo 10, ogni sede 31 essendo dotata di un relativo passaggio per consentire la rilevazione da parte del sensore ottico 20.

In varie forme di attuazione, onde assicurare il posizionamento dei dispositivi microfluidici 10 sul supporto di centrifugazione 30, quest’ultimo può essere dotato di un elemento superiore, indicato con 40 in figura 18, che chiude dall’alto le sedi 31 assicurando il mantenimento della posizione da parte dei dispositivi microfluidici 10. Anche l’elemento superiore 40 può essere dotato di passaggi 41, qual aperture o finestre o zone otticamente trasparenti, in posizioni sostanzialmente corrispondenti alle regioni terminali delle disposizioni microfluidiche dei dispositivi 10, onde consentirne l’illuminazione a mezzo della sorgente di luce 21.

La figura 20 illustra in forma schematica la condizione montata del supporto 30 con il relativo elemento superiore 40, e con interposti i dispositivi microfluidici 10, uno solo dei quali visibile in corrispondenza della parte sezionata dell’elemento superiore 40. Il funzionamento del dispositivo 1 delle figure 18-20 è analogo, in relazione alle sue funzionalità di centrifugazione e/o rilevazione, ai dispositivi 1 descritti con riferimento alle figure 1-2 e 16-17.

La figura 21 illustra un dispositivo microfluidico 10 a profilo quadrangolare, ad esempio idoneo all’impiego su di un dispositivo di centrifugazione e/o rilevazione 1 del tipo mostrato nelle figure 18-20, ovvero atto al montaggio sul relativo supporto di centrifugazione 30. In questo caso il dispositivo include un’unica disposizione microfluidica M che, come si intuisce dalla figura 22 o dalla figura 23, è a sua volta comprensiva di un gruppo di micro-canali 13 definiti su di un substrato 11, nonché di una camera 14, un elemento di copertura 12 ed un elemento filtrante 17.

Nel caso esemplificato in figura 22 l’elemento filtrante 17, di profilo sostanzialmente rettangolare, è dimensionato in modo da ricoprire completamente o pressoché completamente i micro-canali 13, lasciando esposta almeno parte della camera 14. Il materiale che realizza l’elemento filtrante 17 può vantaggiosamente essere un materiale idrofilico o un materiale idrofobico, a seconda delle necessità, in base a quanto spiegato in precedenza. L’elemento filtrante 17 può essere fissato in posizione sul substrato 11 ad esempio tramite incollaggio o saldatura. Sull’elemento filtrante 17, ed eventualmente in parte sul substrato 11, è poi fissato l’elemento di copertura 12, qui anch’esso di profilo sostanzialmente rettangolare.

Nel caso esemplificato in figura 23 l’elemento filtrante 17, di profilo sostanzialmente rettangolare, è dimensionato in modo da ricoprire solo una zona di estremità dei micro-canali 13 che è opposta alla camera 14. Anche in questo caso l’elemento filtrante 17 può essere fissato in posizione sul substrato 11, ad esempio tramite incollaggio o saldatura. Su almeno parte dell’elemento filtrante 17, ed eventualmente in parte sul substrato 11, è poi fissato l’elemento di copertura 12, qui anch’esso di profilo sostanzialmente rettangolare, che in questo caso delimita direttamente i micro-canali 13 nella loro parte superiore, almeno per un loro tratto sostanziale che si estende tra l’elemento filtrante 17 e la camera 14.

Sia nel caso della figura 22, sia nel caso della figura 23, l’elemento 12 è dimensionato in modo da lasciare comunque esposta almeno parte della camera 14, nonché almeno una parte terminale dell’elemento filtrante 17, in modo che risulti comunque definita una via di passaggio 16 per il deflusso dell’aria ed eventualmente del liquido del campione di fluido, secondo quanto già in precedenza spiegato.

Anche in attuazioni del tipo illustrato nelle figure 22 e 23, quindi, l’elemento di copertura 12 si estende almeno parzialmente sopra i micro-canali 13, ma con l’elemento filtrante 17 che è almeno in parte interposto tra gli stessi micro-canali 13 e l’elemento di copertura 12; essendo sostanzialmente impermeabile al fluido, l’elemento 12 consente in tal modo di confinare il fluido stesso all’interno dei micro-canali 13, almeno tra la loro estremità d’ingresso 13a (ovvero la camera 14) e la loro porzione di accumulo CA, in corrispondenza della quale l’elemento filtrante 17 non è sovrastato dall’elemento di copertura 12. Si noti comunque, con riferimento a forme di attuazione del tipo mostrato in figura 23, che l’elemento di copertura 12 non deve necessariamente essere sovrapposto almeno in parte all’elemento filtrante 17, tali due elementi potendo essere eventualmente fissati sul substrato in posizioni adiacenti.

Le figure 23-24 esemplificano una possibile modalità di immissione di un campione di fluido FS in un dispositivo microfluidico secondo le figure 21-22, tramite un idoneo utensile T, similmente a quanto già descritto con riferimento alla figura 8. Dalla figura 24 sono in particolari apprezzabili le estremità di ingresso 13a dei microcanali 13, che possono essere coperte superiormente dall’elemento filtrante 17, come nel caso esemplificato; dalla successiva figura 25 è invece visibile la parte terminale opposta dei micro-canali 13, con la loro estremità longitudinale chiusa, onde definire la regione terminale CA di accumulo delle particelle a seguito di centrifugazione.

Come si intuisce, anche in questo caso la concentrazione delle particelle di interesse in corrispondenza delle regioni terminali CA dei micro-canali 13 si ottiene ponendo in rotazione i dispositivi 10 rispetto ad un centro di rotazione, ad esempio impiegando un dispositivo 1 del tipo mostrato alle figure 18-20.

Come accennato, in altre forme di attuazione, un campione fluido potrebbe essere forzato in pressione attraverso i micro-canali di un dispositivo microfluidico secondo l’invenzione, ad esempio utilizzando una sovrapressione in ingresso o una depressione in uscita, rispetto alla pressione ambiente, e quindi anche in assenza di centrifugazione. Esempi di questo tipo sono mostrati nelle figure 26 e 27, in relazione a dispositivi 10 come alla figura 21.

Nel caso di figura 26 è previsto allo scopo un sistema generatore di pressione, visibile solo parzialmente ed indicato con 60, che è predisposto per generare un flusso in pressione del liquido da trattare oppure un flusso in pressione di aria o altro gas A ed indirizzarlo in corrispondenza della camera 14, dove precedentemente è stato posto un campione del fluido. In tal modo, il campione di fluido nella camera 14 viene forzato a penetrare dapprima nei micro-canali 13 e poi percorrerli sino al loro fondo chiuso, per poi eventualmente fuoriuscire dalla via di passaggio 16 attraverso la corrispondente porzione dell’elemento filtrante 17, che in questo caso sarà permeabile anche al liquido. In tal modo, l’aeriforme o fluido in pressione determinerà l’uscita della frazione liquida del campione dai micro-canali 13, in corrispondenza delle regioni terminali dei quali risulteranno invece accumulate le eventuali particelle oggetto di analisi, secondo quanto in precedenza descritto.

La figura 27 esemplifica invece il caso di un sistema generatore di depressione o vuoto, visibile solo parzialmente ed indicato con 70, quale ad esempio una siringa aspirante o una pompa, che è predisposto per generare il vuoto o un’aspirazione V in corrispondenza della via di passaggio 16 definita dal tratto terminale dell’elemento filtrante 17, che anche in questo caso sarà permeabile al liquido.

In tal modo, il campione di fluido precedentemente posto nella camera 14 viene aspirato grazie alla depressione o vuoto V generato, onde penetrare dapprima nei microcanali 13 e poi percorrerli sino al loro fondo chiuso, per poi fuoriuscire anche in questo caso dalla via di passaggio 16 attraverso la corrispondente porzione dell’elemento filtrante 17. In tal modo, in corrispondenza delle regioni terminali dei micro-canali risulteranno accumulate le eventuali particelle oggetto di analisi, mentre la parte liquida risulterà evacuata dal dispositivo 10.

Si apprezzerà che sistemi generatori di pressione 60 e/ sistemi di aspirazione 70 sono utilizzabili anche nel caso di dispositivi microfluidici 10 del tipo mostrato in figura 3.

In varie forme di attuazione i micro-canali delle disposizioni microfluidiche M sono utilizzati unicamente per la rilevazione di particelle di interesse contenute nel campione di fluido, mentre in altre forme di attuazione i micro-canali possono essere sfruttati anche come pozzetti di coltura, particolarmente nel caso in cui le particelle che si vogliono rilevare siano microorganismi in grado di riprodursi. Alternativamente, possono essere “caricati” micro-canali con materiali biologici (ad esempio batteri) che all’esterno siano stati indotti a proliferare o siano stati inibiti da antibiotici.

In varie forme di attuazione ad almeno un micro-canale, o a ciascun microcanale, possono essere associati almeno due elettrodi, particolarmente almeno in corrispondenza di una rispettiva regione terminale CA. Tali elettrodi possono essere elettrodi di rilevazione oppure elettrodi di manipolazione delle particelle.

Ad esempio, in varie forme di attuazione, almeno una coppia di elettrodi in corrispondenza di una regione terminale CA possono essere impiegati per effettuare una lettura di quantità di particelle, tramite la rilevazione di un’impedenza elettrica. E’ anche possibile effettuare letture differenziali, posizionando altre coppie di elettrodi in porzioni del micro-canale comprese tra le relative estremità, onde consentire di distinguere il contributo all’impedenza elettrica dato dalle particelle rispetto al contributo dato dal fluido del campione. Nei casi in cui il campione fluido è un terreno di coltura o una soluzione fisiologica, la conducibilità elettrica è relativamente elevata a causa degli ioni disciolti nel fluido.

Coppie di elettrodi posizionate in modo che un elettrodo della coppia sia in corrispondenza della parte del micro-canale più prossima alla relativa estremità di ingresso 13a e l’altro elettrodo della coppia sia in prossimità della regione terminale, consentono anche di verificare se il micro-canale sia riempito correttamente con il fluido contenente le particelle da contare (tale verifica è relativamente agevole, considerato che il fluido ha in genere una conducibilità molto maggiore rispetto all’aria, che è isolante). Preferibilmente anche gli elettrodi, quando previsti, sono realizzati almeno in parte con un materiale elettricamente conduttivo trasparente.

Atteso che il dispositivo 10 in accordo all’invenzione può essere impiegato per accumulare cellule in una posizione precisa (ovvero in corrispondenza delle regioni terminali di accumulo CA), elettrodi del tipo indicato possono essere impiegati anche per effettuare manipolazioni sulle cellule stesse, ad esempio elettroporazione, oppure per mantenerle in posizione mediante dielettroforesi.

Come già accennato, un dispositivo microfluidico 10 in accordo all’invenzione può essere impiegato ai fini di semplice conteggio e/o rilevazione della tipologia delle particelle contenute nel campione di fluido, o anche per più complesse funzioni di analisi, ad esempio per l’esecuzione di antibiogrammi (nel qual caso i micro-canali potrebbero anche essere pretrattati, ad esempio immettendo nei medesimi degli antibiotici).

I dispositivi microfluidici ed i dispositivi di centrifugazione e/o rilevazione in accordo all’invenzione sono utilizzabili con vantaggio ai fini della valutazione delle capacità proliferative di batteri e microbi e, in subordine, ai fini di determinarne un profilo di suscettibilità agli antibiotici (antibiogramma) in tempi rapidi e con volumi ridotti del fluido campione.

Le metodologie note a tale scopo si basano sulla valutazione della capacità di un microbo o di un batterio di formare colonie in un terreno adatto alla sua crescita, o sull’intorbidamento di un brodo di coltura a seguito della proliferazione del microbo. La valutazione della capacità di un antibiotico di inibire la proliferazione di un microbo o di un batterio viene valutata classicamente con il conteggio delle relative colonie o sul livello di torbidità del relativo brodo di coltura, che variano in funzione della suscettibilità del microbo o batterio all’antibiotico.

La suscettibilità è legata alla capacità che l’antibiotico ha di inibire la proliferazione efficiente di un ceppo batterico, ed è evidente che i tempi legati a questo tipo di analisi dipendono dalla velocità alla quale il microbo o batterio prolifera. L’approccio seguito secondo la tecnica nota si basa essenzialmente sul fatto che uno strato “bidimensionale” di batteri o microbi (una colonia) può crescere fino ad essere visibile ad occhio nudo, o che la loro proliferazione in un liquido possa essere tale da modificare, in maniera statisticamente significativa, la torbidità del liquido stesso, tale torbidità essendo misurabile mediante fotometria nel range della torbidità (lettura effettuata tipicamente a lunghezza d’onda compresa tra 500 e 600 nm).

Le tecniche qui proposte, che sfruttano i dispositivi microfluidici in precedenza descritti, si basano al contrario su alcuni parametri che non considerano né la crescita bidimensionale dello strato di batteri o microbi, né quella in liquido, letta come aumento della torbidità.

Più in particolare, le metodologie qui proposte prevedono di:

i) realizzare una coltura a breve termine del materiale biologico (per esempio, urine direttamente raccolte dal paziente), con o senza l’aggiunta di fattori di crescita (per esempio brodo di coltura batterica, quale BH);

ii) immettere la suddetta coltura nei micro-canali 13, seminati con la stessa concentrazione di materiale biologico e/o terreno di coltura (a tale scopo può risultare particolarmente vantaggiosa la previsione di micro-pozzetti nei micro-canali 13;

iii) misurare la proliferazione dei batteri nei micro-canali 13;

iv) identificare uno o più micro-canali 13 “negativi”, in cui sarà aggiunto solo il terreno di coltura (per esempio, al 50% con tampone PBS o soluzione fisiologica); v) identificare uno o più micro-canali 13 “positivi”, in grado di verificare le capacità proliferative del ceppo batterico o microbico presente nel sistema di microcanali 13;

vi) identificare una serie di micro-canali 13, contenenti l’antibiotico, in maniera da verificare la resistenza o la suscettibilità agli antibiotici del ceppo batterico o microbico presente nel materiale biologico seminato.

La misura della suscettibilità agli antibiotici potrà essere effettuata con differenti strategie, partendo dalla sedimentazione dei batteri o microbi dopo la proliferazione nelle regioni CA di accumulo 15 dei micro-canali 13, ottenibile tramite centrifugazione di un dispositivo 10, oppure tramite sovrapressione e/o depressione come spiegato in relazione alle figure 26-27. Questo approccio consente vantaggiosamente di effettuare le necessarie comparazioni tra:

- le quantità di batteri o microbi presenti nel materiale di partenza,

- le quantità di batteri o microbi presenti alla fine dell’incubazione, e

- le quantità di batteri o microbi presenti nei micro-canali 13 trattati con antibiotici; l’utilizzo di opportuni fluorocromi può consentire l’individuazione selettiva di batteri vivi e batteri morti.

Per analisi di questo tipo possono risultare particolarmente vantaggiosi supporti 10 provvisti di più disposizioni microfluidiche, come ad esempio il supporto di figura 3. Queste tecniche in microfluidica hanno una sensibilità superiore ad altre tecniche (per esempio torbidità), visto che la sollecitazione esterna (centrifugazione, sovrapressione, depressione) consente di “concentrare” i micro-organismi in un piccolo spazio, rendendoli quindi visibili sia in campo chiaro con luce visibile, sia in trasmissione che in riflessione, oppure in fluorescenza su cellule marcate. Con la tecnica di concentrazione proposta ed una opportuna analisi dell’immagine, sia mediante array lineari di sensori che mediante matrici di sensori rettangolari (ad esempio camere CCD o CMOS o qualsivoglia altra tecnica utilizzata per acquisire immagini) una modificazione del /-20% del numero delle cellule è sicuramente misurata con accuratezza. Variazioni di questa entità, rilevabili con la metodologia proposta ed invece non rilevabili mediante tecniche di torbidità classiche, possono essere determinate da brevi tempi di coltura, ad esempio compresi tra 20 e 40 minuti. La quantificazione o stima può avvenire, come detto, tramite rilevazioni ottiche almeno in corrispondenza delle regioni di accumulo CA dei vari micro-canali 13 di interesse.

In aggiunta o in alternativa, il conteggio dei corpi batterici può essere effettuato con elettrodi posti nelle regioni di accumulo CA, onde rilevare la modificazione dell’impedenza di un campo elettrico che contiene una popolazione “proliferante” di batteri o microbi: tale modificazione può essere impiegata come segnale della suscettibilità (o della resistenza) del ceppo batterico in esame. Anche in questo caso, i tempi di rilevamento possono essere estremamente brevi.

Le metodologie sopra descritte possono essere proficuamente utilizzate in situazioni estremamente differenti da un punto di vista clinico.

Ad esempio, è possibile procedere alla misura del numero “assoluto” di batteri o microbi in un campione di materiale biologico relativamente comune (per esempio, urine per urinocoltura). Se, ad esempio un conteggio > 100.000 batteri/mL è indicativo di infezione delle vie urinarie, la semplice documentazione “numerica” della carica batterica indica la situazione patologica con grande accuratezza.

Anche in assenza dell’identificazione del microbo o batterio (che comunque potrà essere effettuata con tecniche standard, se necessario) il profilo di suscettibilità/resistenza ad un pannello di antibiotici potrà essere facilmente valutato, offrendo al paziente l’opportunità di un trattamento “non empirico”, ma basato sullo studio della suscettibilità antibiotica reale. In questo caso, è importante ricordare che la maggior parte delle urinocolture positive sono caratterizzate da un singolo microbo isolato, mentre una polimicrobismo è più frequente in pazienti ospedalizzati o, per cause pre-analitiche, in pazienti complessi per motivi legati alla tecnica di prelievo.

In una situazione più complessa (per esempio in pazienti ospedalizzati), l’identificazione del batterio comporta un miglioramento delle strategie di trattamento non solo del paziente, ma anche delle infezioni nosocomiali che ad esso possono essere associate. Peraltro, come già detto, per materiali meno “nobili”, come le urine, l’identificazione del patogeno può seguire vie differenti, mentre il profilo di suscettibilità agli antibiotici in tempi non rapidissimi potrebbe comportare un ritardo nell’instaurare una terapia antibiotica salvavita. Per questo motivo, il supporto 10 (eventualmente provvisto di micro-pozzetti, come già accennato) potrebbe essere caricato con una singola colonia (per esempio, isolata da un’emocoltura) di cui non si conosce ancora l’identificazione, ma per la quale diventa necessario un approccio terapeutico immediato. In questo secondo caso, potranno essere seminati batteri isolati da materiali complessi e l’antibiogramma potrebbe essere disponibile entro poche decine di minuti.

Dalla descrizione effettuata risultano chiare le caratteristiche della presente invenzione, così come chiari risultano i suoi vantaggi.

I dispositivi e le metodologie proposte consentono di operare con volumi di campione di partenza relativamente piccoli, ad esempio compresi tra 0,05 e 1 ml. Ad esempio in pediatria, in ricerca su piccoli animali ed in qualsiasi caso sia utile ridurre la quantità di materiale (biologico e reagenti), anche per motivi economici, risulta vantaggioso poter utilizzare volumi relativamente piccoli. La misura di una componente corpuscolata termina quando sono contate un numero di particelle tali da rendere il problema della riproducibilità virtualmente assente: in genere si contano 16000 particelle per avere una stima accurata di sottopopolazioni che sono rappresentate da 1 a 5% del totale. Quindi, se si suppone ad esempio di partire da una concentrazione di 100.000 particelle per ml, in accordo all’invenzione sarà sufficiente un quantitativo di campione di partenza compreso tra 0,2 e 0,4 ml, mentre per concentrazioni superiori, ad esempio di 1 milione di particelle per ml, si potrà scendere a quantitativi di campione compresi ad esempio tra 0,02 e 0,06 ml.

I dispositivi in accordo all’invenzione risultano particolarmente vantaggiosi per l’effettuazione di antibiogrammi.

In termini generali, a tale scopo, una coltura di batteri può essere inoculata nei micro-canali 13 di almeno una disposizione M di un dispositivo 10. Il dispositivo 10 viene poi sottoposto a centrifugazione, o a sovra-pressione o a depressione, come indicato, ed in seguito viene quantificato o stimato il numero di batteri accumulati nelle regioni CA dei micro-canali 13. In applicazioni di questo tipo il dispositivo microfluidico 10 può essere utilizzato esclusivamente per la quantificazione dei microorganismi, ad esempio dei batteri, in quanto la proliferazione in condizioni diverse da confrontare può avvenire in precedenza, utilizzando attrezzature e dispositivi di laboratorio ordinari.

In altre applicazioni un antibiogramma può essere effettuato a partire da una coltura bidimensionale dei batteri su supporto solido. In tal caso, la metodologia può prevedere questi passi:

i) prelievo di una colonia di batteri da una piastra di coltura solida;

ii) inoculo della colonia o di una sua parte in un mezzo liquido, ad esempio un brodo di coltura, preferibilmente formando una dispersione omogenea;

iii) caricamento del mezzo liquido contenente i batteri nei micro-canali 13 di almeno una disposizione M di un supporto 10, con almeno alcuni di tali micro-canali che sono stati in precedenza provvisti di antibiotici, preferibilmente antibiotici liofilizzati di tipi diversi e/o in concentrazioni diverse, ed altri micro-canali che non sono stati provvisti di antibiotico;

iv) incubazione per un periodo di tempo variabile da 10 minuti a 6 ore, preferibilmente compreso tra 1 e 2 ore;

v) trattamento del dispositivo 10 tramite centrifugazione, o sovra-pressione, o depressione;

vi) quantificazione dei batteri accumulati nelle regioni CA dei micro-canali 13, particolarmente una quantificazione relativa tra i micro-canali 13 pretrattati con antibiotico e quelli non pre-trattati, onde ricavare un profilo di suscettibilità dei batteri in questione all’antibiotico o agli antibiotici usati.

In altre applicazioni ancora, i dispositivi in accordo all’invenzione sono utilizzabili con vantaggio per l’effettuazione di un antibiogramma a partire da un campione primario, ovverosia un campione prelevato direttamente da un soggetto o organismo ospite (umano o animale). In tal caso, la metodologia può prevedere questi passi:

i) ottenimento di un concentrato o una massa (o pellet) di batteri dal campione primario, ad esempio urine; a tale scopo, ad esempio, il campione primario può essere sottoposto a centrifugazione, utilizzando attrezzature e dispositivi di laboratorio ordinari, onde separare la suddetta massa di batteri dal surnatante; la centrifugazione avviene preferibilmente in due fasi, una prima fase a bassa velocità per eliminare le cellule ed una seconda fase ad alta velocità per concentrare i batteri; alternativamente, la prima fase di centrifugazione può essere sostituita con una filtrazione per eliminare le cellule;

ii) inoculo della massa di batteri ottenuta o di una sua parte in un mezzo liquido, ad esempio un brodo di coltura, preferibilmente formando una dispersione omogenea; iii) caricamento del mezzo liquido contenente i batteri nei micro-canali 13 di almeno una disposizione M di un supporto 10, con almeno alcuni di tali micro-canali che sono stati in precedenza provvisti di antibiotici, preferibilmente antibiotici liofilizzati di tipi diversi e/o in concentrazioni diverse, ed altri micro-canali che non sono stati provvisti di antibiotico;

v) trattamento del dispositivo 10 tramite centrifugazione, o sovra-pressione, o depressione, e

vi) quantificazione dei batteri accumulati nelle regioni terminali CA dei microcanali 15, particolarmente una quantificazione relativa tra i micro-canali 13 pretrattati con antibiotico e quelli non pre-trattati, onde ricavare un profilo di suscettibilità dei batteri in questione all’antibiotico o agli antibiotici usati.

E’ chiaro che numerose varianti sono possibili per la persona esperta del ramo ai supporti, ai dispositivi ed ai metodi descritti come esempio, senza per questo uscire dall’ambito dell’invenzione. Appare altresì evidente alla persona esperta del ramo che singole caratteristiche descritte in relazione ad una forma di attuazione sono utilizzabili in altre forme di attuazione qui descritte, anche differenti dagli esempi precedenti.

L’applicazione dell’invenzione non è limitata al settore medicale o veterinario, essendo i dispositivi descritti utilizzabili per la concentrazione e/o la quantificazione di particelle presenti in fluidi di qualsiasi tipo, ad esempio anche nei campi dell’industria o dell’agricoltura.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Un dispositivo microfluidico per concentrare particelle contenute in un campione di fluido (FS), comprendente un substrato (11) avente una superficie (11b) in corrispondenza della quale è definita almeno una disposizione microfluidica (M) che comprende: - una camera di caricamento (14), per il caricamento del campione di fluido (FS) nell’almeno una disposizione microfluidica (M), - una pluralità di micro-canali (13), aventi rispettive estremità di ingresso (13a) collegate alla camera di caricamento (14), particolarmente con un collegamento fluidico in parallelo a detta camera (14), - un elemento di copertura (12), che è sostanzialmente impermeabile al campione di fluido (FS) e che si estende almeno parzialmente sopra la pluralità di micro-canali (13), in cui la camera di caricamento (14) ed i micro-canali (13) si estendono sostanzialmente secondo un piano identificato dal substrato (11), in cui i micro-canali (13) sono parzialmente delimitati, almeno in corrispondenza di una loro regione di accumulo (CA) generalmente opposta alle rispettive estremità di ingresso (13a), da mezzi filtranti (17) permeabili almeno all’aria, i mezzi filtranti (17) essendo configurati per trattenere all’interno di ciascun micro-canale (13) eventuali particelle presenti nel campione di fluido (FS), in modo tale per cui particelle eventualmente contenute in un volume di fluido del campione di fluido (FS) che penetra all’interno di ciascun micro-canale (13) tendano a concentrarsi nella rispettiva regione di accumulo (CA) per effetto di una forza applicata ad almeno uno tra il dispositivo microfluidico (10) ed il campione di fluido (FS) caricato nella camera di caricamento (14), quale una forza centrifuga determinata da una rotazione del substrato (11) attorno ad un centro di rotazione (5a), o una pressione positiva applicata sul campione di fluido (FS) in corrispondenza della camera di caricamento (14), o una pressione negativa applicata sul campione di fluido (FS) in corrispondenza delle regioni di accumulo (CA) dei micro-canali (13).
2. Il dispositivo microfluidico secondo la rivendicazione 1, in cui l’elemento di copertura (12) è dimensionato o conformato per definire almeno uno tra: - un passaggio (15) per l’introduzione del campione di fluido (FS) nella camera di caricamento (14), - una via di passaggio (16) per lo sfiato di aria dai micro-canali (13) attraverso i mezzi filtranti (17), e - una via di passaggio (16) per l’uscita di un liquido dai micro-canali (13), i mezzi filtranti (17) essendo permeabili al liquido.
3. Il dispositivo microfluidico secondo la rivendicazione 1 o la rivendicazione 2, in cui i mezzi filtranti (17) comprendono un medesimo elemento filtrante che delimita almeno in parte una pluralità di micro-canali (13) in corrispondenza delle loro regioni di accumulo (CA).
4. Il dispositivo microfluidico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3, in cui: - almeno uno tra il substrato (11) e l’elemento di copertura (12) è configurato per definire almeno parte di una sede (18) per i mezzi filtranti (17), e/o - l’elemento di copertura (12) è configurato per mantenere i mezzi filtranti (17) nella relativa posizione operativa.
5. Il dispositivo microfluidico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4, in cui ciascun micro-canale (13) è chiuso alla sua estremità longitudinale opposta rispetto alla relativa estremità di ingresso (13a), i mezzi filtranti (17) essendo preferibilmente disposti in corrispondenza di almeno una parete laterale del micro-canale (13) o sovrapposti ad un tratto terminale del micro-canale (13) che è definito nel substrato (11).
6. Il dispositivo microfluidico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5, in cui ciascun micro-canale (13): - ha una larghezza compresa tra 5 e 200 micron, preferibilmente compresa tra 15 e 50 micron, e/o - ha una profondità o altezza compresa tra 2 e 100 micron, preferibilmente compresa tra 5 e 40 micron, e/o - ha una lunghezza compresa tra 5 e 50 millimetri, e/o - ha sezione di passaggio sostanzialmente costante.
7. Il dispositivo microfluidico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-6, in cui: - ciascun micro-canale (13) ha almeno una porzione di superficie definita da almeno uno tra un materiale idrofilico ed un materiale idrofobico, il materiale idrofilico e/o il materiale idrofobico preferibilmente appartenendo ad almeno uno tra il substrato (11), l’elemento di copertura (12) ed i mezzi filtranti (17), e/o - il dispositivo (10) è formato almeno in parte con materiale trasparente, il materiale trasparente appartenendo ad almeno uno tra il substrato (11), l’elemento di copertura (12) ed i mezzi filtranti (17).
8. Il dispositivo microfluidico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-7, in cui il substrato (11): - è configurato per il montaggio su di un organo rotante (5a) di un dispositivo di centrifugazione e/o rilevazione (1), particolarmente per il tramite di un supporto adattatore (30, 40), e/o - ha forma sostanzialmente a disco.
9. Il dispositivo microfluidico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-8, in cui in detta superficie (11b) del substrato (11) sono definite una pluralità di dette disposizioni microfluidiche (12), preferibilmente disposte in una direzione almeno approssimativamente radiale rispetto ad un centro di rotazione (11a) del substrato (11).
10. Il dispositivo microfluidico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-9, in cui in i micro-canali (13) sono disposti affiancati tra loro, preferibilmente almeno in parte uguali tra loro e/o si estendono almeno in parte sostanzialmente paralleli o equidistanti e/o comprendono un primo micro-canale (13) disposto radialmente rispetto ad un centro di rotazione (11a) e secondi micro-canali (13) disposti paralleli o equidistanti rispetto al primo micro-canale (13).
11. Il dispositivo microfluidico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-10, in cui i mezzi filtranti (17) comprendono una membrana avente una porosità o dimensione di maglia compresa tra 0.02 e 0.45 micrometri, la membrana essendo preferibilmente formata almeno in parte con un film di materiale ceramico, particolarmente un film di allumina porosa.
12. Un dispositivo microfluidico per concentrare particelle contenute in un campione di fluido (FS), comprendente un substrato (11) avente una superficie (11b) in corrispondenza della quale è definita almeno una disposizione microfluidica (M) che comprende: - una camera di caricamento (14), per il caricamento del campione di fluido (FS) nell’almeno una disposizione microfluidica (M), - una pluralità di micro-canali (13), aventi rispettive estremità di ingresso (13a) collegate alla camera di caricamento (14), in cui la camera di caricamento (14) ed i micro-canali (13) si estendono almeno in parte in almeno uno tra il substrato (11) ed un elemento di copertura (12) del substrato (11), in cui i micro-canali (13) sono delimitati almeno in parte, almeno in corrispondenza di loro regioni di accumulo (CA) generalmente opposte alle rispettive estremità di ingresso (13a), da mezzi filtranti (17) permeabili almeno all’aria, i mezzi filtranti (17) essendo configurati per trattenere all’interno di ciascun micro-canale (13) e/o ciascuna regione di accumulo (CA) le eventuali particelle presenti nel campione di fluido (FS).
13. Un dispositivo di centrifugazione, comprendente un organo rotante (5a) configurato per porre in rotazione un dispositivo microfluidico (10) secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-12.
14. Un dispositivo di rilevazione, comprendente un organo rotante (5a) configurato per sottoporre ad un movimento angolare un dispositivo micro-fluidico (10), particolarmente un dispositivo micro-fluidico (10) secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-12, e mezzi sensori ottici (20) configurati per effettuare rilevazioni ottiche sul dispositivo micro-fluidico (10) e/o rilevare particelle accumulate in regioni di accumulo (CA) del dispositivo micro-fluidico (10), in cui i mezzi sensori ottici (20) sono configurati per acquisire un segnale ottico o un’immagine di una o più regioni di accumulo (CA) del dispositivo micro-fluidico (10), dove preferibilmente il dispositivo di rilevazione (1) è predisposto per elaborare, sulla base di detto segnale ottico o immagine, informazione rappresentativa di una quantità di particelle accumulate nella regione di accumulo (CA) o nelle regioni di accumulo (CA).
15. Un metodo per la rilevazione di particelle eventualmente presenti in un campione di fluido (FS), comprendente i passi di: - provvedere un dispositivo microfluidico (10) secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-12; - immettere un volume del campione di fluido (FS) nella camera di caricamento (14) di almeno una disposizione microfluidica (M) del dispositivo microfluidico (10), - sottoporre il dispositivo microfluidico (10) ad una centrifugazione, o sottoporre il relativo campione di fluido (FS) ad una pressione positiva o negativa, rispettivamente in corrispondenza della camera di caricamento (14) o in corrispondenza delle regioni di accumulo (CA) dei micro-canali (13), e - rilevare le particelle eventualmente accumulate nella regione di accumulo (CA) di ciascun micro-canale (13), particolarmente in modo ottico e/o elettrico.
16. Un metodo per l’esecuzione di un antibiogramma, comprendente: - provvedere un dispositivo microfluidico (10) secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-12; - provvedere un mezzo liquido contenente microrganismi o microbi o batteri di almeno un ceppo batterico; - immettere un volume del mezzo liquido in una pluralità di primi micro-canali (13) di almeno una prima disposizione microfluidica (M) del dispositivo microfluidico (10), - sottoporre il dispositivo microfluidico (10) ad una centrifugazione, o sottoporre il relativo campione di fluido (FS) ad una pressione positiva o negativa, rispettivamente in corrispondenza della camera di caricamento (14) o in corrispondenza delle regioni di accumulo (CA) dei micro-canali (13), e - quantificare il numero di microrganismi o microbi o batteri accumulati nella regione di accumulo (CA) di ciascun micro-canale (13).
17. Il metodo secondo la rivendicazione 16, comprendente: i) pretrattare detti primi micro-canali (13) con almeno un primo antibiotico, preferibilmente con antibiotici liofilizzati di tipi diversi e/o in concentrazioni diverse; ii) ottenere una massa di microrganismi o microbi o batteri; iii) inoculare almeno una parte di detta massa nel mezzo liquido, preferibilmente formando una dispersione omogenea; iv) immettere un volume del mezzo liquido in detti primi micro-canali (13); iv) attendere un periodo di tempo compreso da 10 minuti e 6 ore, preferibilmente compreso tra 1 e 2 ore; v) sottoporre il dispositivo microfluidico (10) ad una centrifugazione, o sottoporre il relativo campione di fluido (FS) ad una pressione positiva o negativa, rispettivamente in corrispondenza della camera di caricamento (14) o in corrispondenza delle regioni di accumulo (CA) dei micro-canali (13); e vi) quantificare il numero di batteri accumulati nelle regioni di accumulo (CA) di detti primi micro-canali (13), particolarmente effettuando una quantificazione relativa tra detti primi micro-canali (13) e secondi micro-canali (13) del dispositivo microfluidico (10) che non sono stati pretrattati con l’almeno un primo antibiotico, onde ricavare un profilo di suscettibilità di detti microrganismi o microbi o batteri all’almeno un primo antibiotico.
18. Il metodo secondo la rivendicazione 17, in cui detta massa di cui al passo ii) è prelevata da una piastra di coltura oppure è ottenuta da un campione prelevato da un organismo ospite, particolarmente ottenuta tramite centrifugazione o tramite filtraggio e centrifugazione del campione.