HUP0200919A2 - Pseudomycin production by pseudomonas syringae - Google Patents
Pseudomycin production by pseudomonas syringae Download PDFInfo
- Publication number
- HUP0200919A2 HUP0200919A2 HU0200919A HUP0200919A HUP0200919A2 HU P0200919 A2 HUP0200919 A2 HU P0200919A2 HU 0200919 A HU0200919 A HU 0200919A HU P0200919 A HUP0200919 A HU P0200919A HU P0200919 A2 HUP0200919 A2 HU P0200919A2
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- pseudomycin
- medium
- derivatives
- syringae
- strain
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/10—Antimycotics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/14—Nitrogen or oxygen as hetero atom and at least one other diverse hetero ring atom in the same ring
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/38—Pseudomonas
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
73.332/SZE *
PEJLÖAi
PSZEUDOMICIN ELŐÁLLÍTÁSA PSEUDOMONAS SYRINGAE
TENYÉSZETEKKEL
A jelen találmány tárgya eljárás egy vagy több pszeudomicin származék előállítására, továbbá egy vagy több pszeudomicin származékot termelő Pseudomonas syringae tenyészetek.
A gombás fertőzések jelentős számban okozói a megbetegedéseknek, az életminőség romlásának, és különösen immunbetegségben szenvedő egyének esetében az ember halálozási arányának. A gombás fertőzések gyakorisága embernél az utóbbi 20 évben nagymértékben nőtt. Ennek oka részben az, hogy megnőtt a legyengült, vagy szervátültetés, rák kemoterápia, AIDS, életkor és egyéb hasonló betegségek vagy kóros állapotok következtében legyengült vagy elpusztított immunrendszerű egyének száma. Az ilyen betegek hajlamosak olyan patogén gombás betegségekre, amelyek a népességben elterjedtek, de azokat a jól működő immunrendszer ellenőrzés alatt tartja. Ezek a patogének nehezen kezelhetők, mert a létező gombaellenes hatóanyagok egy része nagymértékben mérgező, más részük csak a gomba működését gátolja. Például, a poliének gombaölőszerek, de mérgezőek; míg az azolok sokkal kevésbé mérgezőek, de csak gátolják a gomba növekedését. Fontosabb azonban, hogy a közelmúltban olyan Candida törzsekről számoltak be, amelyek azolokkal és poliénekkel szemben ellenállók, így igen korlátozott a szóbanforgó törzsek elleni terápiás kezelés lehetősége.
Az újszerű gombaellenes anyagok egy csoportja, a pszeudomicinek egyes betegek gombás fertőzéseinek kezelésében nagyon ígéretesek (lásd ezzel kapcsolatban Harrison, L., és mások,
-2Pseudomycins, a family of novel peptides from Pseudomonas syringae possessing broad-spectrum antifungal activity [„Pszeudomicinek, a Pseudomonas syringae által termelt újszerű, szélesspektrumú gombaellenes hatással rendelkező újszerű peptid vegyületcsoport”], J. Gen. Microbiology, 137 (12), 2857-65 (1991) közleményt, valamint az 5,576,298 és 5,837,685 számú egyesült államokbeli szabadalmi bejelentéseket). A pszeudomicinek Pseudomonas syringae izolátumokból származó természetes anyagok. A P. syringae a növényekkel együtt élő baktériumok egy nagy csoportja, amelyek számos biológiailag aktív anyag, mint például a bacitracin és a sziringomicinek forrásai. A P. syringae természetes törzsei, és transzpozonnal átalakított mutáns alakjai gombaellenes hatású vegyületeket termelnek. A P. syringae MSU 174 jelű vad típusú törzsének transzpozonnal átalakított, regulációs (szabályozási) mutáns alakja, ami MSU 16H (ATCC 67028) néven ismert, többféle pszeudomicint termel. Elválasztották és kémiailag jellemezték a pszeudomicin A, B, C és C alkotórészeket, és kimutatták, hogy azok szélesspektrumú gombaellenes hatással rendelkeznek, és többek között a növényekben és az emberben előforduló fontos gombás betegségek ellen hatásosak. A pszeudomicinek szerkezetileg rokonok a sziringomicinnel, de különböznek attól, és a P. syringae izolátumok egyéb gombaellenes anyagaitól. A pszeudomicin A, B, C, C' peptid része L-Ser-D-Dab-L-Asp-L-Lys-L-Dab-L-aThr-Z-Dhb-L-Asp(3-OH)-L-Thr(4-CI)-csoportnak felel meg, melynek láncvégi karboxil csoportja az N-terminális szerin OH-csoportjával makrogyűrűt zár be. Az analógok az N-acil oldallánc alapján különböztethetők meg, azaz, a pszeudomicin A Nacil-csoportja 3,4-dihidroxi-tetradekanoát, a pszeudomicin B N-acilcsoportja 3-hidroxi-tetradekanoát, a pszeudomicin C N-acil-csoportja 3,4-dihidroxi-hexadekanoát, és a pszeudomicin C N-acil
-3csoportja 3-hidroxi-hexadekanoát (lásd ezzel kapcsolatban Ballio, A., és mások, Novel bioactive lipodepsipeptides from Pseudomonas syringae: the pseudomycins, FEBS Letters, 355(1), 96-100, (1994) valamint Coiro, V.M., és mások, Solution conformation of the Pseudomonas syringae MSU 16H phytotoxic lipodepsipeptide Pseudomycin A determined by computer simulations using distance geometry and molecular dynamics from NMR data, Eur. J. Biochem., 257(2), 449-456 (1998) közleményét).
Annak ellenére, hogy növekszik a gombás fertőzések gyakorisága, és a pszeudomicinek ígéretesek, a pszeudomicinek előállítása kereskedelmi mennyiségben nehézkesnek bizonyult. A pszeudomicinek előállítására szolgáló, közleményekben szereplő eljárásokat mozgatás és keverés nélkül, drága burgonya-szőlőcukor táptalaj alkalmazásával végzik. Az ilyen tenyé-szetekben jellemzően laboratóriumi vizsgálatokra elegendő, kis mennyiségű pszeudomicin termelődik olyan koncentrációban, amely nagy méretben, vagy kereskedelmi méretekben való ter-melésre nem alkalmas. Szintén nem alkalmas körülbelül egy liternél nagyobb méretben való alkalmazásra a mozgatás nélküli tenyészet, mert a tápanyagok és gázok, különösen az oxigén diffúziója, és a megfelelő sejtnövekedés fenntartása nehezen valósítható meg.
Szükség van egy olyan eljárásra a pszeudomicin előállításban, amelyben a P. syringae alkalmazása olyan méretben és koncentrációban valósul meg, amely alkalmas a pszeudomicinek, mint gombaellenes anyagok állatok, ember, vagy növények fertőzései elleni alkalmazásra.
A jelen találmány tárgya mikroorganizmusok alkalmazása valamely gombaellenes anyag, mint például egy vagy több pszeudomicin származék előállítására szolgáló eljárásban. Az eljárásban Pseudomonas syringae sejttenyészetet három vagy
-4kevesebb aminosavat tartalmazó táptalajon tenyésztünk, majd a tenyészetből kinyerünk egy vagy több pszeudomicin összetevőt. A ' három vagy kevesebb aminosav lehet többek között glutaminsav, glicin, hisztidin vagy ezek keveréke. Az egyik megvalósításban, a P. syringae sejttenyészet glicint, és adott esetben lipidet, burgonyából származó terméket vagy ezek kombinációját tartalmazó táptalajon tartjuk, a pH pedig 4 - 6,5, amíg egy vagy több pszeudomicin származék körülbelül legalább 10 pg/ml, előnyösebben körülbelül több, mint 40 pg/l koncentrációban termelődik. Az eljárás különösen alkalmas egy vagy több pszeudomicin származék előállítására olyan méretben, amelyben a kinyert egy vagy több pszeudomicin származék állatok, ember vagy növények gombaellenes kezelésére alkalmas hatóanyag. Továbbá, a jelen találmány tárgya a fent leírt eljárással termelt pszeudomicinek.
A jelen találmány tárgya továbbá a P. syringae törzsek olyan biológiailag tisztított tenyészetei, amelyek pszeudomicinek termelésére alkalmasak. A P. syringae törzsek lehetnek vad típusú, környezeti forrásokból, többek között növényekből, mint például árpafélékből, citrusfélékből, orgonafélékből stb. izolált törzsek; az ilyen környezeti izolátumokból kiválasztott törzsek; és az ilyen törzsek mutáns alakjai. Az előnyös környezeti izolátumok növényekből származnak. Az előnyös P. syringae tulajdonságai többek között, hogy képesek burgonyából származó terméket nem tartalmazó, vagy minimális táptalajon egy vagy több pszeudomicin származék termelésére; képesek a pszeudomicineket jelentős, például körülbelül legalább 10 pg/l koncentrációban termelni; képesek a pszeudomicinek kívánt arányának termelésére; és/vagy képesek egy vagy több gomba növekedésének gátlására.
-δ- . ;
« · · 4 · « *· · ·
A jelen találmány szerint a P. syringae három vagy kevesebb aminosavat, és adott esetben lipidet, burgonyából származó terméket vagy ezek kombinációját tartalmazó táptalajon hosszantartó növekedést és anyagcserét mutat, amíg körülbelül legalább 10 pg/ml koncentrációban egy vagy több pszeudomicin származék termelődik. Előnyösebben, a P. syringae törzs körülbelül 40 pg/ml - körülbelül 700 pg/ml koncentrációban termel egy vagy több pszeudomicin származékot, legelőnyösebben körülbelül 200 μ g/ml koncentrációban termel pszeudomicin A-t, vagy körülbelül legalább 100 μg/ml koncentrációban termel pszeudomicin B-t.
Az eljárás egyik előnyös megvalósításában egy P. syringae törzs szakaszos (részletekben adagolt tápanyagmennyiség alkalmazásával létrehozott) vagy folyamatos (a tápanyagok folyamatos adagolásával létrehozott) tenyésztési körülmények közötti növekedése során egy vagy több pszeudomicin származék termelődik. A P. syringae tenyészetek elegendő ideig és elegendő sűrűségben növekednek ahhoz, hogy megnöveljék a pszeudomicin termelést. A tenyészet pH-ját előnyösen körülbelül 4 - körülbelül 6,5, előnyösebben 4,5 - 5,5 közötti értéken tartjuk, hogy biztosítsuk a pszeudomicin stabili-tását.
Meghatározások
A pszeudomicin kifejezés jelentése a jelen találmányban (I) általános képletü vegyület, amely képletben R jelentése lipofil csoport. A pszeudomicin A, A', B, B', C, C vegyületek olyan (I) általános képletű vegyületek, amelyekben R jelentése a következő:
Pszeudomicin A
Pszeudomicin A’
R = 3,4-dihidroxi-tetradekanoil
R = 3,4-dihidroxi-pentadekanoát,
-6Pszeudomicin B
Pszeudomicin B'
Pszeudomicin C
Pszeudomicin C
R = 3-hidroxi-tetradekanoil
R = 3-hidroxi-tetradekanoát
R = 3,4-dihidroxi-hexadekanoil
R = 3-hidroxi-hexadekanoil
Az 1. ábra N21SM vagy burgonyagyöngy táptalajon ~67 órán át tenyésztett több P. syringae törzs pszeudomicin A, B, C és C termelésének szintjeit mutatja.
A 2. ábra N21SM táptalajon, palackokban ~67 órán át tenyésztett több P. syringae törzs pszeudomicin A, B, C és C' termelésének szintjeit mutatja.
A 3. ábra nem rázott palackokban, hozzáadott sókat, glicint, metil-mirisztátot és/vagy oldható keményítőt tartalmazó burgonya-szőlőcukor táptalajon tenyésztett P. syringae MSU 16H törzs pszeudomicin A, B és/vagy C termelését mutatja.
A 4. ábra pszeudomicin termelést mutat a 3. ábránál leírt körülmények között, azzal a különbséggel, hogy a palackokat rázzuk.
Az 5. ábra pszeudomicin termelést mutat glicin tartalmú táptalaj, és a 4. ábránál leírt rázott palackok alkalmazása mellett. Ezek az eredmények szemléltetik a glicin és metil-mirisztát pszeudomicin termelést serkentő hatásában mutatkozó szinergizmust (együtthatást).
A 6. ábra burgonya-szőlőcukrot, glicint, sókat és oldható keményítőt, és 0,1 v/v% koncentrációban a közeghez adagolt különböző zsírsav metil-észtereket tartalmazó táptalajon tenyésztett MSU 16H jelű P. syringae törzs pszeudomicin A, B, és/vagy C termelését mutatja. A zsírsavak mindegyike telített, a sávok alatti számok pedig a szénlánc hosszát mutatják.
-7A 7. ábra a pszeudomicin faktor tartalmat mutatja 150 literes fermentálásban. Az oldott oxigén koncentrációját a keverés és a légáram számítógépes szabályozásával 30%-on tartottuk. A glükóz adagolását 18 óra elteltével kezdtük meg, 200 ml/h sebességgel, az ammónium-hidroxid adagolását a 20. órában 20 ml/h sebességgel. Ebben a fermentációban nem tapasztaltunk pszeudomicin C termelést.
A 8. ábra az oxigénfogyasztást és az oldott oxigént mutatja abban a 150 literes fermentációban, amelynek pszeudomicin termelése a 7. ábrán látható.
A 9. ábra a hozzáadott, burgonyából származó termékeket nem tartalmazó, és metil-mirisztátot tartalmazó vagy nem tartalmazó táptalajon, rázott palackokban tenyésztett különböző P. syringae törzsek pszeudomicin A, B, és/vagy C termelését mutatja.
Pseudomonas syringae
A Pseudomonas syringae csoportba számos, általában a növényekkel kapcsolatban levő baktérium tartozik. Több P. syringae növényi patogén, míg mások csak gyengén patogének, vagy korhadéklakók. Sok különböző P. syringae izolátum egy vagy több olyan citotoxikus anyagot termel, amelyek segítik a baktérium túlélését a természetben, ahol gombákkal és más baktériumokkal kell versengeniük. A P. syringae által termelt citotoxikus anyagok többek között gombaellenes anyagok, mint például pszeudomicinek, sziringomicinek, a sziringotoxinok és a sziringosztatinok.
Egy vagy több pszeudomicint termelő P. syringae törzsek önmagukban ismertek. Például, az MSU 174 jelű (egy Montanabeli árpaföldről elkülönített) vad típusú törzs, és ennek Tn905 jelű transzpozonnal átalakított (MSU 16H jelű) mutáns alakjának leírása
-8G. Strobel és mások, 1996 november 19.-én közzétett 5,576,298 számú egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésében; Harrison és mások, Pseudomycins, a family of novel peptides from Pseudomonas syringae possessing broad-spectrum antifungal activity, J. Gen. Microbiology 137, 2857-2865 (1991); és Lamb és mások, Transposon mutagenesis and tagging of fluorescent pseudomonas: Antimycotic production is necessary for control of Dutch elm disease, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6447-6451 (1987) című közleményében szerepel. MSU 174 és MSU 16H jelű tenyészetek megtalálhatók a Montana Állami Egyetemen (Bozeman, Montana, USA), és beszerezhetők az American Type Culture Collection (Amerikai Törzs Tenyészet Gyűjtemény, Parklawn Drive, Rockville, MD, USA). Az ebben a bekezdésben említett közleményekre a jelen találmány részeként hivatkozunk.
A jelen találmány tárgya többek között olyan P. syringae törzs, izolátum és biológiailag tisztított tenyészet, amely több, mint körülbelül 10 pg/ml, előnyösen körülbelül legalább 10 pg/ml és körülbelül 900 pg/ml közötti, előnyösebben körülbelül 800 pg/ml és körülbelül 900 pg/ml közötti mennyiségben termel egy vagy több pszeudomicin származékot. A mikroorganizmus biológiailag tisztított tenyészete előnyösen MSU 16H, 25-B1, 67H1, 7H9-1M vagy 7D11-6 jelű Pseudomonas syringae törzs, vagy ezen törzsek pszeudomicint termelő mutáns alakja, változata, izolátuma vagy rekombináns alakja. Az MSU 174 és MSU 16H jelű tenyészeteket a fent idézett hivatkozásokban leírt módon állítottuk elő.
Az egy vagy több pszeudomicin származék termelésére alkalmas P. syringae törzs környezeti forrásokból, többek között növényekből, mint például árpafélékből, citrusfélékből, orgonafélékből stb., vagy olyan forrásokból, mint például a talaj, víz, levegő, por stb. izolálható. Az előnyös törzset növényekből
-9izoláljuk. A környezeti forrásból izolált P. syringae törzseket vad típusnak is nevezhetjük. A vad típus kifejezés jelentése a jelen találmányban a P. syringae természetes populációiban természetes módon előforduló domináns genotípus (azaz, a természetben előforduló, és nem laboratóriumban előállított törzsek vagy izolátumok). Mint ahogy más mikroorganizmusok, a jelen találmányban alkalmazott pszeudomicin termelő tenyészetek, a P. syringae törzsei is, mint például az MSU 174, MSU 16H, MSU 206, 25-B1 és 7H9-1 jelű törzsek, változékonyak. így ezen törzsek utódtörzsei, például a rekombinánsok, mutánsok és változatok a szakmában jól ismert eljárásokkal állíthatók elő.
A P. syringae mutáns törzsei is alkalmasak egy vagy több pszeudomicin származék termelésére. A mutáns kifejezés a jelen találmányban valamely törzs fenotípusának olyan hirtelen bekövetkező, öröklődő változására utal, amely lehet spontán, vagy előidézhetik ismert mutagén anyagok, többek között sugárzás, és különböző vegyi anyagok. A jelen találmány szerinti mutáns P. syringae törzsek előállíthatok különféle mutagén hatások, többek között sugárzás; mint például ultraibolya fény, vagy röntgensugárzás; kémiai mutagének, helyspecifikus mutagenezis, és transzpozonnal közvetített mutagenezis alkalmazásával. Kémiai mutagének például az etil metán-szulfonát (EMS), diepoxi-oktán, Nmetil-N-nitro-N'-nitrozo-guanin (NTG), és salétromossav.
A jelen találmány szerinti pszeudomicint termelő mutáns P. syringae törzsek úgy állíthatók elő, hogy a baktériumokat olyan mennyiségű mutagén anyaggal kezeljük, amely elég hatásos ahhoz, hogy egy vagy több pszeudomicin származékot túltermelő mutánsok, egyéb pszeudomicin származékokhoz képest túlsúlyban levő egy pszeudomicin származékot, például pszeudomicin B-t termelő mutánsok, vagy előnyös növekedési körülmények között
- 10egy vagy több pszeudomicin származékot termelő mutánsok keletkezzenek. Míg az alkalmazott mutagén anyag fajtája és mennyisége változhat, egy előnyös eljárásban NTG-oldatokat 1-től 100 pg/ml-ig terjedő koncentráció szintekig sorozatban hígítunk. A jelen találmány szerint előnyös mutánsok azok, amelyek a pszeudomicin B-t túltermelik, és a minimálisnak meghatározott táptalajon is növekednek. A mutánsok egy vagy több pszeudomicin származékot túltermelnek, előnyösen körülbelül legalább 10 pg/ml és körülbelül 900 pg/ml közötti, előnyösebben körülbelül 800 pg/ml és körülbelül 900 pg/ml közötti koncentrációban.
A környezeti izolátumokból, mutáns törzsekből és a P. syringae egyéb kívánt törzseiből kiválaszthatók a kívánalmaknak megfelelő növekedési szokásoknak, növekedési táptalaj, szénforrás, növekedési körülmények, és aminosavigény jellemzőknek megfelelő törzsek. Előnyösen, a pszeudomicin termelő P. syringae törzset a minimálisnak meghatározott táptalajon, például N21 táptalajon való növekedése alapján, és/vagy az alapján választjuk ki, hogy egy vagy több pszeudomicin származékot nagyobb, mint körülbelül 10 pg/ml koncentrációban termel-e. Az előnyös törzsekre egy vagy több pszeudomicin származék termelése jellemző olyan táptalajon, amely három vagy kevesebb aminosavat, és adott esetben lipidet, vagy burgonyából származó terméket, vagy ezek kombinációját tartalmazza.
A rekombináns törzsek a P. syringae törzsek átalakításával a szakmában jól ismert eljárásokkal fejleszthetők ki. A P. syringae törzsek rekombináns DNS technológia alkalmazásával olyanná alakíthatók, hogy az általuk termelt antibiotikumok mellett további géntermékeket is előállítsanak. Például, a törzsek egy olyan rekombináns vektorral átalakíthatok, amely olyan antibiotikummal szembeni ellenállóképességet ad, ami ellen a törzsek
-11 rendesen érzékenyek. Az így nyert transzformált változatok nem csak pszeudomicineket termelnek, hanem azt az ellenállóképességet adó enzimet is, amely lehetővé teszi a transzformált sejtek kiválasztását a vad típusú sejtek közül. Továbbá, hasonló eljárások alkalmazásával a meglévő törzsekbe a belső pszeudomicin bioszintézisért felelős gének többszörös másolata ültethető be, nagyobb pszeudomicin hozam elérése érdekében. A 25-B1, 67H1 és 7H9-1 jelű P. syringae törzseknek a pszeudomicin túltermelés tulajdonságát megtartó utódai, azaz a természetes és létrehozott változatai, mutáns és rekombináns alakjai a jelen találmány részét képezik.
Pszeudomicinek
A pszeudomicin elnevezés a jelen találmányban a gombaellenes anyagok csoportjának olyan tagjaira vonatkozik, amelyek a Pseudomonas syringae baktériumból származnak. A pszeudomicinek lipodepszipeptidek, egy vagy több szokatlan aminosavat tartalmazó olyan gyűrűs peptidek, amelyekhez egy vagy több hidrofób zsírsavlánc kapcsolódik. Részletesebben, a pszeudomicinek olyan lipodepszinonapeptidek, amelyek lakton kötéssel záruló gyűrűs peptid részt, és nem szokványos aminosavakat, azaz 4-klór-treonint, 3-hidroxi-aszparaginsavat, dehidro-2-amino-vajsavat és 2,4-diamino-vajsavat tartalmaznak. Feltételezzük, hogy a szokatlan aminosavaknak szerepük van a pszeudomicinek biológiai tulajdonságai, mint a szérumbeli stabilitás, és a gombaölőképesség kialakításában. A pszeudomicin származékok többek között a pszeudomicin A, a pszeudomicin A', a pszeudomicin B, a pszeudomicin B', a pszeudomicin C és a pszeudomicin C’. Ezen pszeudomicinek mindegyike ugyanazt a
- 12gyűrűs peptid alapvázat tartalmazza, az ehhez a vázhoz kapcsolódó hidrofób oldalláncban különböznek.
A pszeudomicin A, A', B, B', C és C típusok mindegyikét izolálták, tisztították, szerkezetüket többek között aminosav szekvencia meghatározással, NMR és tömegspektrometriás eljárásokkal jellemezték. A pszeudomicin A, B, C és C leírása G. Strobel és mások, 1996. november 19-én közzétett 5,576,298 számú egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésében; Harrison és mások, Pseudomycins, a family of novel peptides from Pseudomonas syringae possessing broad-spectrum antifungal activity, J. Gen. Microbiology 137, 2857-2865 (1991) közleményében; és Ballio és mások, Novel bioactive lipodepsipeptides from Pseudomonas syringae: the pseudomycins, FEBS Lett. 355, 96-100 (1994) közleményében szerepel. A pszeudomicin A' és B’ leírása Palaniappan Kulanthaivel és mások PCT/US00/08727 számú, Pseudomycin Natural Products című, a jelen találmánnyal egyidőben bejelentett egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésében szerepel, ezen anyagok előállítására a példákban kitérünk. A több pszeudomicin származék által mutatott gombaellenes hatást a Tn 903 jelű transzpozont viselő P. syringae törzsnek tulajdonítják, amely transzpozon többek között olyan tulajdonságokat kódol, mint a kanamicin rezisztencia. A Tn 903 jelű transzpozon bázissorrendje, és az azzal végzett átalakítási eljárások ismertek. Lásd ezzel kapcsolatban Oka és mások, Nucleotide sequence of the kanamycin resistance transposon Tn 903, J. Mol. Biol. 147, 217-226 (1981) közleményét. Az ebben a bekezdésben említett hivatkozásokra a jelen találmány részeként hivatkozunk.
A pszeudomicinek szerkezete és tulajdonságai változók. Az előnyös pszeudomicin A, B, C és C számos gomba ellen
- 13hatásos, és általában elfogadható a toxicitásuk is. A pszeudomicin B a többi előnyös pszeudomicinhez képest bizonyos gombák ellen hatásosabb, és toxicitási szintje alacsonyabb. így a pszeudomicin B alkalmazása a jelenlegi eljárások szempontjából előnyösebb. Mindegyik pszeudomicinben nonapeptid gyűrű található, melynek aminosavsorrendje Ser-Dab-Asp-Lys-Dab-aThr-Dhb-HOAsp-CIThr (szerin; 2,4-diamino-vajsav; aszparaginsav; lizin; 2,4-diamino-vajsav; allo-treonin; dehidro-2-amino-vajsav; 3-hidroxi-aszparaginsav; 4-klór-treonin), részletesebben L-Ser-D-Dab-L-Asp-L-Lys-L-Dab-L-aThr-Z-Dhb-L-Asp(3-OH)-L-Thr(4-CI), amelyben a CIThr-csoport karboxilcsoportja és a szerin hidroxilcsoportja zárja a gyűrűt, lakton kötéssel. A pszeudomicinek az N-terminális szerin amincsoportjához kapcsolódó lipofil csoport természetében különböznek. A szerin amincsoportja a pszeudomicin A-ban a 3,4-dihidroxi-tetra-dekanoil-csoport, a pszeudomicin B-ben a 3-monohidroxi-tetradekanoil-csoport, a pszeudomicin C-ben a 3,4-dihidroxi-hexadekanoil-csoport, és a pszeudomicin C'-ben a 3-monohidroxi-hexadekanoil-csoport karboxilcsoportjával képez amid-kötést. A szerin karboxilcsoportja a gyűrű Dab-csoportjával képez amidkötést.
A pszeudomicinek biológiai hatása
A pszeudomicinek számos biológiai hatással rendelkeznek, ilyen többek között különböző gombák, mint például növények és állatok patogén gombái elleni gombaölő hatás. Részletesebben, a pszeudomicinek olyan gombák ellen hatásos anyagok, amelyek a hiányos immunrendszerű egyénekben opportunisztikus fertőzéseket okoznak. Ilyen a Candida nemzetség számos faja, többek között a C. parapsilosis, a C. albicans, a C. glabrata, a C. tropicalis és a C. krusei. Más nemzetségek is ide
- 14sorolhatók, például a Cryptococcus neoformans, az Aspergillus fumigatus és a Histoplasma capsulatum. A pszeudomicinek kívánatos, és előnyös biológiai hatása, különösen patogén gombák esetében, inkább a gombaölő hatás, mint a növekedés gátlása.
A pszeudomicinek számtalan növényi patogén gomba ellen is toxikusnak bizonyultak, ilyenek többek között a Rynchosporium secalis, a Ceratocystis ulmi, a Rhizoctonia solani, a Sclerotinia sclerotiorum, a Verticillium alboatrum, a Verticillium dahliae, a Thielaviopis basicola, a Fusarium oxysporum és a Fusarium culmorum (lásd ezzel kapcsolatban Harrison, L., és mások, Pseudomycins, a family of novel peptides from Pseudomonas syringae possessing broad-spectrum antifungal activity, J. of General Microbiology, 7, 2857-2865 (1991) közleményét). Kimutatták továbbá, hogy az MSU 16H jelű P. syringae törzs a szilfavész kórokozójával, a Ceratocystis ulmi nevű fajjal fertőzött szilfáknak nagyobb védettséget ad, mint a vad típusú törzsek (lásd ezzel kapcsolatban Lám és mtsai, Proc. Natl. Sci. USA, 84, 6447-6451 (1987) közleményét).
A Pseudomonas syringae tenyésztése
A vizes tápközeg kifejezés jelentése a jelen találmányban vízbázisú, a jelen találmányban szereplő mikroorganizmusok tenyésztéséhez szükséges ásványi sókat, szerves vegyületeket és azok sóit tartalmazó készítmény. Az előnyös tápközeg hatásos mennyiségben tartalmaz három vagy kevesebb aminosavat, előnyösen glutaminsavat, glicint, hisztidint vagy ezek kombinációját. Az egyik megvalósításban a közeg hatásos mennyiségű glicint, és adott esetben egy vagy több burgonyából származó terméket és lipidet tartalmaz. A glicin egyszerű aminosav, vagy aminosavak keveréke, mint például hidrolizált
-15fehérje formájában is jelen lehet. Alkalmas lipidek többek között a szójaolaj, 14 vagy 16 szénatomos alifás láncú zsírsavak, és 14 vagy 16 szénatomos alifás láncú zsírsavészterek. Előnyös zsírsavészterek többek között a metil-palmitát és a metil-mirisztát, előnyösen a metil-mirisztát. Alkalmas burgonyából származó termékek többek között a burgonya-szőlőcukor táptalaj, burgonya-dextrin, burgonyafehérje, és a kereskedelemben kapható kevert burgonyapüré por. A tápközegben előnyös ásványi sók többek között a rendszerint sejttenyészetekben és erjesztésnél alkalmazott sókeverékek, mint például a Czapek-féle ásványi só, ami kálium-kloridot, magnézium-szulfátot és vas(ll)szulfátot tartalmaz. A tápközegben előnyös szerves vegyületek többek között a glükóz vagy a szacharóz, vagy adott esetben a keményítő; vagy egyéb szerves vegyületek. A közeg pH-ja előnyösen körülbelül 4-6,5, előnyösebben körülbelül 4,5-5,7, legelőnyösebben körülbelül 5,2.
Bár nem jellemző, hogy a táptalaj alkotórészeinek mennyisége kritikus lenne a baktériumok tenyésztése, vagy egy vagy több pszeudomicin származék termelése szempontjából, a tápanyagok bizonyos koncentrációja előnyös. A glicin mennyisége előnyösen körülbelül 0,1 g/l és körülbelül 10 g/l közötti, előnyösebben körülbelül 0,3 g/l és körülbelül 3 g/l közötti, legelőnyösebben körülbelül 1 g/l. A lipid mennyisége előnyösen körülbelül 1 g/l és körülbelül 10 g/l közötti mennyiségű olaj, például szójaolaj, előnyösebben körülbelül 0,5 g/l és körülbelül 2 g/l közötti mennyiségű szójaolaj. A zsírsav vagy zsírsav-észter mennyisége előnyösen körülbelül 0,5 g/l és körülbelül 5 g/l közötti. A zsírsavészter előnyösen metil-mirisztát, melynek mennyisége körülbelül 0,1 és körülbelül 10 g/l közötti, előnyösen körülbelül 0,3 g/l és körülbelül 3 g/l közötti, előnyösebben körülbelül 1 g/l. A burgonyából származó termékek mennyisége előnyösen körülbelül
-1612 g/l és körülbelül 36 g/l közötti, előnyösebben körülbelül 24 g/l burgonyacukrot tartalmazó táptalaj; körülbelül 5 g/l és körülbelül 50 g/l közötti, előnyösebben körülbelül 30 g/l kereskedelemben kapható kevert burgonyapüré por; körülbelül 1 g/l és körülbelül 30 g/l közötti, előnyösen körülbelül 20 g/l burgonya-dextrin; és/vagy körülbelül 1 g/l és körülbelül 10 g/l közötti, előnyösen körülbelül 4 g/l burgonyafehérje. A tápközegben levő ásványi sók, mint például a kálium-klorid mennyisége előnyösen körülbelül 0,02 és körülbelül 2 g/l közöti, előnyösebben körülbelül 0,2 g/l; a magnézium-szulfát előnyösen heptahidrát formában van jelen, mennyisége előnyösen körülbelül 0,02 és körülbelül 2 g/l közötti, előnyösebben körülbelül 0,2 g/l; a vas(ll)szulfát előnyösen heptahidrát formájában van jelen, mennyisége előnyösen körülbelül 0,4 és körülbelül 40 mg/l közötti, előnyösebben körülbelül 4 mg/l; stb. Az adott esetben jelen levő keményítő mennyisége előnyösen körülbelül 0,5 és körülbelül 50 g/l közötti, előnyösebben körülbelül 5 g/l. A glükóz előnyösen körülbelül 2 és körülbelül 80 g/l közötti, előnyösebben körülbelül 20 g/l mennyiségben van jelen. A szacharóz előnyösen körülbelül 2 és körülbelül 80 g/l közötti, előnyösebben körülbelül 30 g/l mennyiségben van jelen.
A P. syringae törzsek tenyésztése jellemzően a szóbanforgó közegben, a pH, a hőmérséklet, és hasonló paraméterek ellenőrzött vagy szabályozott értékei mellett történik. A P. syringae tenyésztése, és egy vagy több pszeudomicin származék termelése körülbelül 15°C és körülbelül 35°C, előnyösen körülbelül 20°C és körülbelül 30°C, előnyösebben körülbelül 22°C és körülbelül 27°C közötti, legelőnyösebben körülbelül 25°C hőmérsékleten történik. A P. syringae tenyésztése, és egy vagy több pszeudomicin származék termelése körülbelül 4 és körülbelül 7, előnyösebben körülbelül 4 és körülbelül 6, előnyösebben
- 17körülbelül 4,5 és körülbelül 5,5 közötti pH mellett történik. A P. syringae jellemző esetben 37°C feletti, vagy 10°C alatti hőmérsékleten, illetve 9 feletti, vagy 4 alatti pH mellett jellemzően nem növekszik.
Eljárás pszeudomicin termelésére
Egy vagy több pszeudomicin származéknak vad típusú vagy mutáns P. syringae törzzsel történő előállítása céljából a mikroorganizmust keverés mellett három vagy kevesebb, hatásos mennyiségű aminosavat tartalmazó táptalajon tenyésztjük. A három vagy kevesebb aminosav előnyösen glutaminsav, glicin, hisztidin vagy ezek kombinációja. Egy előnyös megvalósításban, az aminosav többek között glicin, adott esetben egy vagy több burgonyából származó termék és lipid mellett. A tenyésztést olyan körülmények között végezzük, amelyek hatásosak a P. syringae növekedése és a kívánt pszeudomicin vagy pszeudomicinek termelése szempontjából. Hatásos körülmények többek között a körülbelül 22°C és körülbelül 27°C közötti hőmérséklet, és a körülbelül 36 óra és körülbelül 96 óra közötti időtartam. A jelen találmányban leírt közegben tenyésztett P. syringae növekedési sejtsűrűsége elérheti a 10-15 g/l száraz tömeget, teljes pszeudomicin termelése legalább 10 gg/ml, előnyösen legalább körülbelül 40 pg/ml, előnyösebben körülbelül 500 pg/ml, vagy több.
A pszeudomicin termelés szempontjából előnyös, ha a P. syringae tenyészet közegének oxigéntartalmát ellenőrzés alatt tartjuk. Az oxigén koncentrációját előnyösen a telített értéknek körülbelül 5%-a és körülbelül 50%-a között, előnyösebben körülbelül 30% értéken tartjuk. A közeg oxigéntartalma levegő, tiszta oxigén, vagy oxigéntartalmú gázkeverék bekeverésével
- leállítható be. Továbbá, az oxigén kicserélődési arány a keverés szabályozásával változtatható.
A pszeudomicin termelés szempontjából előnyös, ha a P. syringae tenyészet közegének pH-ját ellenőrzés alatt tartjuk. A pszeudomicinek lúgos kémhatásnál bomlékonyak, a bomlás jelentős lehet, ha a tenyésztési közeg pH-ja több, mint 12 órán át körülbelül 6 felett van. A tenyésztési közeg pH-ját előnyösen kisebb, mint körülbelül 6, előnyösebben kisebb, mint körülbelül 5,5, legelőnyösebben 4,0 feletti értéken tartjuk. A pH-t előnyösen körülbelül 5 és körülbelül 5,4 közötti, előnyösebben körülbelül 5,0 és körülbelül 5,2 értékek között tartjuk. Bár ez nem korlátozza a jelen találmányt, feltételezéseink szerint a pszeudomicin bomlását lúgos kémhatáson a lakton gyűrű kinyílása, és kloridion lehasadása okozza.
A P. syringae szakaszos tenyészetben egy vagy több pszeudomicin származék termelésére képes. A pszeudomicin termelést azonban elősegíti a glükóz, és adott esetben a pH beállítására szolgáló sav vagy bázis, például ammónium-hidroxid szakaszos, vagy félig folytonos adagolása. A P. syringae pszeudomicin termelése tovább növelhető olyan folyamatos adagolású eljárásokkal, amelyekben a glükóz, és adott esetben a pH beállítására szolgáló sav vagy bázis, mint például ammónium-hidroxid adagolása automatikusan történik.
A P. syringae alkalmazásával egy vagy több pszeudomicin származék nagy mennyiségben termelhető. így egy vagy több pszeudomicin származék teljes mennyisége legalább körülbelül 200 pg/ml és körülbelül 900 pg/ml, előnyösen körülbelül 600 pg/ml és körülbelül 900 pg/ml, előnyösebben körülbelül 800 μ g/ml és körülbelül 900 pg/ml értékek között van. Pszeudomicin A termelés esetén a termelt pszeudomicin A teljes mennyisége
- 19előnyösen legalább körülbelül 10 pg/ml és körülbelül 400 pg/ml közötti, előnyösebben körülbelül 300 pg/ml és körülbelül 400 pg/ml közötti, legelőnyösebben körülbelül 350 pg/ml és körülbelül 400 μ g/ml közötti. Pszeudomicin B termelés esetén a termelt pszeudomicin B teljes mennyisége előnyösen legalább körülbelül 10 gg/ml és körülbelül 300 gg/ml közötti, előnyösebben körülbelül 200 gg/ml és körülbelül 300 pg/ml közötti, legelőnyösebben körülbelül 250 gg/ml és körülbelül 300 pg/ml közötti. Pszeudomicin C termelés esetén a termelt pszeudomicin C teljes mennyisége előnyösen legalább körülbelül 5 pg/ml és körülbelül 100 p.g/ml közötti, előnyösebben körülbelül 5 gg/ml és körülbelül 50 gg/ml közötti, legelőnyösebben körülbelül 10 gg/ml és körülbelül 50 pg/ml közötti. Pszeudomicin C termelés esetén a termelt pszeudomicin C teljes mennyisége előnyösen legalább körülbelül 1 pg/ml és körülbelül 50 μg/ml közötti, előnyösebben körülbelül 10 pg/ml és körülbelül 50 μ g/ml közötti, legelőnyösebben körülbelül 30 pg/ml és körülbelül 50 μg/ml közötti.
A jelen találmányban leírt körülmények között tenyésztett P. syringae törzs kiválasztása hatással lehet a termelt pszeudomicin termelésére és eloszlására. Például, az MSU 16H és 67 H1, és hasonló törzsek mindegyike főként pszeudomicin A-t, emellett pszeudomicin B-t és C-t termel, jellemzően közelítőleg 4:2:1 arányban. A 67 H1 jelű törzs és hasonló törzsek azonban az MSU 16H jelű törzshöz képest jellemzően 3-5-szörös mennyiségben termelnek pszeudomicineket. A 25-B1 jelű törzs, és hasonló törzsek az MSU 16H és 67 H1 jelű törzsekhez képest több pszeudomicin B-t és kevesebb pszeudomicin C-t termelnek. A 7H9-1 jelű, és hasonló törzsek abban különböznek más törzsektől, hogy főként pszeudomicin B-t, és azoktól eltérően nagyobb mennyiségű pszeudomicin B-t termelnek. Ez a törzs például a
-20· *·♦ ♦ · ·*.
pszeudomicin B-t 10-szeres mennyiségben képes termelni a pszeudomicin C-hez vagy pszeudomicin A-hoz képest.
A pszeudomicinek, vagy azok keverékei a szakmában ismert eljárások bármelyikével kimutathatók, meghatározhatók, izolálhatok és/vagy tisztíthatok. Például, a pszeudomicin aktivitás szintje valamely táptalajon, vagy elkülönített vagy tisztított készítményben valamely gomba, például Candida elleni hatás alapján határozható meg. Számos eljárást ismerünk a pszeudomicinek előállítására és elemzésére. Például, egy vagy több pszeudomicin származék kromatográfiás eljárással, például HPLC eljárással izolálható és tisztítható.
A jelen találmány szerinti eljárással előállított pszeudomicinek gyógyászatilag elfogadható sóik formájában is izolálhatok. A gyógyászatilag elfogadható kifejezés jelentése a jelen találmányban a fent leírt vegyületek olyan sói, amelyek az élő szervezetre lényegében nem mérgezők. Jellemző gyógyászatilag elfogadható sók többek között a jelen találmány szerinti vegyületek és szervetlen vagy szerves sav vagy szervetlen bázis reagáltatásával előállított sók. Az ilyen sók savaddíciós és bázisaddíciós sókként ismertek.
Savaddíciós sók előállításánál alkalmazott savak többek között olyan szervetlen savak, mint például a sósav, hidrogén-bromid, hidrogén-jodid, kénsav és foszforsav, és olyan szerves savak, mint például a p-toluol-szulfonsav, a metán-szulfonsav, az oxálsav, a p-bróm-fenil-szulfonsav, a szénsav, a borostyánkősav, a citromsav, a benzoesav és az ecetsav. Ilyen gyógyászatilag elfogadható sók például a szulfát, a piroszulfát, a hidrogén-szulfát, a szulfit, a hidrogén-szulfit, a foszfát, a mono-hidrogén-foszfát, a dihidrogén-foszfát, a metafoszfát, a pirofoszfát, a klorid, a bromid, a jodid, az acetát, a propionát, a dekanoát, a kaprilát, az akrilát, a
formiát, az izobutirát, a kaproát, a heptanoát, a propiolát, az oxalát, a malonát, a szukcinát, a szuberát, a szebacát, a fumarát, a maleát, a butin-1,4-dioát, a hexin-1,6-dioát, a benzoát, a klór-benzoát, a metil-benzoát, a dinitro-benzoát, a hidroxi-benzoát, a metoxi-benzoát, a italát, a szulfonát, a xilol-szulfonát, a fenil-acetát, a fenil-propionát, a fenil-butirát, a citrát, a laktat, a γ -hidroxi-butirát, a glikollát, a tartarát, a metán-szulfonát, a propánszulfonát, az 1-naftalin-szulfonát, a 2-naftalin-szulfonát, és a mandelát sók. Előnyös gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sók az olyan szervetlen savakkal képzett sók, mint például a sósav és a hidrogén-bromid, és az olyan szerves savakkal képzett sók, mint például a maleinsav és a metán-szulfonsav.
A bázisaddíciós sók többek között az olyan szervetlen bázisok származékai, mint például az ammonium- vagy az alkálivagy alkáliföldfém-hidroxidok, a karbonátok és a hidrogén-karbonátok. A jelen találmány szerinti sók előállításához alkalmazhatók többek között például a nátrium-hidroxid, a káliumhidroxid, az ammónium-hidroxid, a kálium-karbonát, a nátrium-karbonát, a nátrium-hidrogén-karbonát, a kálium-hidrogén-karbonát, a kalcium-hidroxid és a kalcium-karbonát. Különösen előnyösek a kálium- és a nátriumsók.
Lényeges felismerés, hogy a jelen találmány bármely sójának részét képező adott ellenion természete nem kritikus természetű, amennyiben maga a só gyógyászatilag elfogadható, és amíg az ellenion következtében a só egészének nincsenek nemkívánatos tulajdonságai.
A jelen találmány jobb megérthetőségét szolgálják az alábbi példák. A példák a jelen találmány különös megvalósításait szemléltetik, és azok semmilyen módon nem korlátozzák a jelen találmány oltalmi körét.
-22*Φ· *··» w
PÉLDÁK
A letétben hozzáférhető biológiai alapanyagok
Az MSU 16H jelű P. syringae törzs nyilvánosan hozzáférhető az American Type Culture Collection (Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) gyűjteményből, ATCC 67028 hozzáférési számon. A 25-B1, 7H9-1 és 67 H1 jelű P. syringae törzseket 2000. március 23.-án helyeztük letétbe az American Type Culture Collection gyűjteménybe, hozzáférési számuk a következő:
25-B1 PTA-1622
7H9-1 PTA-1623
H1 PTA-1621
1. Példa — A pszeudomicinek meghatározása és tisztítása
A pszeudomicinek kimutatása és mennyiségi meghatározása a gombaellenes hatás alapján
A pszeudomicin vagy pszeudomicinek keverékének jelenléte vagy mennyisége valamely készítmény gombaellenes hatásának mérésével határozható meg. A gombaellenes hatás in vitro meghatározása úgy történik, hogy szabványos agar higitási teszt, vagy korong diffúziós teszt alkalmazásával kimutatjuk a készítmény legkisebb gátló koncentrációját (minimum inhibitory concentration, MIC). Az egy vagy több pszeudomicin származékot tartalmazó készítmény lehet sejttenyészetből készült kivonat, vagy nagyobb tisztítási fokú keverék. A gombaellenes hatás meghatározásában használt gomba jellemzően a C. albicans. A gombaellenes hatást akkor tekintjük jelentősnek, ha 50 μΙ vizsgálati készítmény Candida albicans x657 tenyészettel beoltott agarlemezeken 10-12 mm átmérőjű gátlási zónákat eredményez.
-23A pszeudomicinek kimutatása és mennyiségi meghatározása HPLC eljárással
A feltételezések szerint az egy vagy több pszeudomicin származékot tartalmazó mintát először egyenértéknyi mennyiségű acetonitrillel, vagy másfélszeres térfogatú 0,1 térfogat-%-os metanol/ortofoszforsav keverékkel kirázzuk, majd szűréssel vagy centrifugálással tisztítjuk. A tisztított keveréket 60°C hőmérsékletű Zorbax 300SB-C8 oszlopon (3,5 μίτι-βε részecskék, 5,0 x 0,46 cm, MacMod katalógusszám 865973-906) 2 ml/perc áramlási sebességgel kromatografáljuk. Az oszlopot A mozgó fázis (25 mmólos nátrium-foszfát, 7,74 g/l oktán-szulfonsav és 10%-os vizes acetonitril-oldat, pH=6,5) és B mozgó fázis (25 mmólos nátrium-foszfát, 7,74 g/l oktán-szulfonsav és 60%-os vizes acetonitril-oldat, pH=6,5) grádienssel leoldjuk. A pszeudomicinek izolálását és mennyiségi meghatározását 10 perces időtartamban 28%-os kezdeti, és 38%-os végső koncentrációjú B mozgó fázissal végezzük. A pszeudomicin A-t jellemzően körülbelül 10,2 percnél (612 másodperc), a pszeudomicin B-t 10,98 percnél (659 másodperc), a pszeudomicin C-t 11,5 percnél (691 másodperc), a pszeudomicin B'-t 9,6 percnél (576 másodperc), és a pszeudomicin C'-t 12,17 percnél (730 másodperc) oldjuk le. A pszeudomicineket 214 nm hullámhosszon mutatott elnyelésük alapján mutatjuk ki, minőségi meghatározásukat az UV csúcsok egyesítésével végezzük. A pszeudomicinek mindegyikének azonosítását és mennyiségi meghatározását ismert összehasonlító anyagok alkalmazásával végeztük.
A pszeudomicinek tisztítása keveréssel működő fermentorokból
150 literes, 1000 literes vagy egyéb típusú fermentorból származó táptalajt a sejtek eltávolítása céljából szűrjük. A szűrletet
-24HP-20SS oszlopra töltjük, hogy kinyerjük a pszeudo-micineket. Az oszlopot 0,1%-os trifluoro-ecetsavat tartalmazó 15-30%-os acetonitrillel mossuk, miközben összegyűjtjük a részeket. A pszeudomicineket tartalmazó részeket Amberchrom CG300-sd oszlopra töltjük. A pszeudomicin A-t 22-30% acetonitilt tartalmazó 0,2%-os (pH=4,8) nátrium-acetát pufferrel oldjuk le. A pszeudomicin B-t, C-t és C'-t 25-35% acetonitrilt tartalmazó 0,2%-os (pH=4,8) nátrium-acetát pufferrel oldjuk le. UV elnyelése alapján a pszeudomicin A 85% tisztaságú. A pszeudomicin A-t C18 fordított fázisú HPLC oszlopra töltjük, és 30-60%-os acetonitrilt tartalmazó 0,2%-os trifluoro-ecetsavval leoldjuk. A leoldott anyag UV/NMR vizsgálat alapján jobb, mint 95% tisztaságú.
2. Példa — A Pseudomonas syringae elválasztása, jellemzése és mutagenezise
A nagyobb mennyiségű pszeudomicin termelés céljából végzett első lépésként kiválasztunk P. syringae környezeti izolátumokat, majd előállítjuk azok mutáns alakjait. Ezt követően, ezen izolátumokban és mutánsokban vizsgáljuk azokat a tényezőket, amelyek javítják a pszeudomicin termelést, és a tápközeget.
Anyagok és eljárások
Az MSU 174 és MSU 16-H jelű törzseket G. Strobel és mások 1996 november 19.-én közzétett 5,576,298 számú egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésében; Harrison és mások, Pseudomycins, a family of novel peptides from Pseudomonas syringae possessing broad-spectrum antifungal activity, J. Gen. Microbiology 137, 2857-2865 (1991); és Lamb és mások, Transposon mutagenesis and tagging of fluorescent pseudomonas: Antimycotic production is necessary for control of Dutch elm
-25disease, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6447-6451 (1987) című közleményében leírt módon izoláljuk és jellemezzük. Az ebben a bekezdésben említett hivatkozásokra a jelen találmány részeként hivatkozunk.
Az ilyen vad típusú törzsekből és transzpozonnal átalakított mutáns alakokból kémiai mutagenezissel további törzseket hozunk létre. A mutagén hatásnak kitett törzsek többek között az MSU 174, MSU 16H és 25-B1 jelű törzsek. A mutagenizálandó törzset burgonyából származó terméket tartalmazó közegen tenyésztjük, majd az 1-metil-3-nitro-1-nitrozoguanidin (NTG vagy MNNG) kémiai mutagént 0, 1, 2, 4, 16 vagy 32 pg/ml koncentrációban tartalmazó közegbe osztjuk szét. Ezeket a sejteket azután további vizsgálatok és kiválasztás céljából lefagyasztjuk.
A kívánt növekedési tulajdonságok és/vagy pszeudomicin termelés alapján kiválasztjuk a mutagén hatásnak kitenni kívánt sejteket. A kémiai mutagén hatásnak kitett P. syringae sejteket, például a mutagén hatásnak kitett 25-B1 jelű törzset kiolvasztjuk, majd 6 sejt/ml sűrűségben N21SM közegbe hígítjuk (lásd az 1. táblázatot). Ez a közeg időnként egy vagy több kiválasztott alkotórészt, például különböző koncentrációkban foszfátot tartalmaz. A mutagén hatásnak kitett sejtek 50 μΙ térfogatát 96 lyukú, kerek fenekű mikrotiter lemezre osztjuk szét, átlag 0,3 sejt/lyuk sűrűséggel.. A lyukakba rendszerint szilikonolajat töltünk, hogy csökkentsük a párolgást. A lemezeket rázás közben 25°C-on 6-12 napig inkubáljuk.
1. Táblázat — Az N21SM közeg összetétele
| ALKOTÓRÉSZ | GRAMM/LITER |
| glükóz | 20 |
| ammónium-szulfát | 0,5 |
| mononátrium-glutamát vagy L-glutamin-sav | 2 |
| L-hisztidin | 2 |
| glicin | 0,5 |
| oldható keményítő | 5 |
| kh2po4 | 0,2 |
| Czapek-féle ásványi só oldat | 2 ml |
| MES puffer | 9,8 |
| pH beállítása 5,0-re |
Az inkubálást követően minden lyukból kiveszünk jellemzően 5 μΙ térfogatú részletet, sorozatban (például 1:56, 1:196, 1:320, 1:686, és/vagy 1:1715 arányban) hígítjuk, majd Candida albicans elleni hatását folyadékot tartalmazó mikrotiter lemez alkalmazásával végzett biológiai meghatározással érté-keljük. A lemezeket éjszakán át 37°C-on inkubáljuk, majd a lyukakat a C. albicans növekedés gátlása alapján pontozzuk. Kiválasztjuk azokat a törzseket, amelyek szélsőséges (például 1:320, 1:686, és/vagy 1:1715 arányú) hígítások mellett gátlást eredményeztek, és azokat CSM közegre oltjuk (lásd a 2. táblázatot), majd 25°C-on 1-3 napig tenyésztjük.
2. Táblázat: Teljes Streptomyces táptalaj (Complete Streptomyces Medium, CSM) alkotórész koncentráció (g/l) glükóz
| maltóz | 4 |
| Difco Tryptic szója táptalaj Difco élesztőkivonat | 30 3 |
| MgSO4x7H2O | 2 |
pH beállítás nincs
A kiválasztott törzseket tartósítjuk, 13 ml N21SM közeget tartalmazó erjesztő palackokba oltjuk, és 25°C-on körülbelül 66 órán át tenyésztjük. Ebből az erjesztésből kiveszünk egy mintát, ezt a mintával egyenlő mennyiségű acetonitrillel 1 órán át kirázzuk, centrifugáljuk, és a pszeudomicinek 1. példa szerinti HPLC elemzéséhez dekantáljuk. A pszeudomicint megfelelő mennyiségben, jellemzően 10 μg/ml-nél nagyobb koncentrációban termelő törzseket újból izoláljuk, fermentáljuk, és előkészítjük a nagyobb méretben történő tenyésztéshez.
A közeg és a növekedési körülmények hozamra és a pszeudomicinek eloszlására gyakorolt hatását is vizsgáltuk. A közeg több összetevőjét statisztikai alapon felállított kísérletsorozatban egyidejűleg változtattuk. Ezen kísérletek során kiválasztottuk azt a meghatározott kémiai összetételű közeget, amely nem tartalmaz burgonyából származó terméket, foszfát tartalma meghatározott, megnövelt tisztaságú, és amelyben a P. syringae növekedése magas értéket ér el.
Eredmények
A fent leírt eljárások alkalmazásával számos olyan törzset állítottunk elő, amelyek pszeudomicin termelése intenzív, főként egyetlen pszeudomicin származékot termelnek, és/vagy
-28minimális táptalajon is növekednek. Az egy vagy több pszeudomicin származékot megnövekedett mennyiségben termelő törzseket, és a 13 ml-es erjesztéssel előállított pszeudomicinek eloszlását mutatjuk be a 3. táblázatban. A 2. és 3. ábrákon egyes mutáns törzsekre vonatkozó, burgonya közeg és N21SM közeg alkalmazásával termelt pszeudomicinek eloszlása és mennyisége látható.
3. Táblázat - A pszeudomicin termelés és/vagy minimális táptalajon mutatott növekedés alapján kiválasztott törzsek
| törzs | PSZEUDOMICIN (pg/ml) A B C C | sejtsűrűség (od600) | PSA+PSB OD60o | PSB PSA | |||
| 30 E3 | 109 | 69 | 0,759 | 234 | 0,64 | ||
| 40G11 | 81 | 66 | 0,818 | 179 | 0,82 | ||
| 7H9-1 | 3,3 | 60,4 | 0,744 | 86 | 18,58 | ||
| 75F8 | 65 | 57 | 0,884 | 137 | 0,88 | ||
| 18 E6 | 111 | 57 | 0,855 | 196 | 0,51 | ||
| 8 E3 | 38,47 | 55,07 | 0,830 | 113 | 1,43 | ||
| 305H8 | 165,0 | 48 | 39 | 7 | 0,762 | 280 | 0,29 |
| 1 7H9 | 96 | 46 | 0,769 | 185 | 0,48 | ||
| 67H1-1 | 216,9 | 44,2 | 39,9 | 5,8 | 0,817 | 320 | 0,20 |
| 49C5 | 110 | 43 | 0,804 | 190 | 0,39 | ||
| 67H1 | 197 | 42 | 0,817 | 293 | 0,21 | ||
| 67H1-6 | 225,9 | 42,1 | 40,2 | 4,8 | 0,791 | 339 | 0,19 |
| 67H1-6 | 216,4 | 41,5 | 38,6 | 5 | 0,797 | 324 | 0,19 |
| Törzs | PSZEUDOMICIN (pg/ml) A B C 0' | Sejtsűrűség (OD60o) | PSA+PSB OD6oo | PSB PSA | |||
| 67H1-1 | 232,7 | 38,3 | 41,7 | 4,7 | 0,819 | 331 | 0,16 |
| 160G8 | 123,5 | 38 | 27 | 7 | 0,738 | 219 | 0,31 |
| 96C8 | 175,1 | 38 | 44 | 6 | 0,719 | 296 | 0,21 |
| 52G11 | 68 | 36 | 0,822 | 127 | 0,53 | ||
| 11G3 | 110 | 33 | 0,675 | 212 | 0,30 | ||
| 7D11 | 77,13 | 32,73 | 0,706 | 156 | 0,42 | ||
| 8B6 | 72,1 | 32,3 | 0,706 | 148 | 0,45 | ||
| 16E12 | 46,4 | 30 | 10 | 5 | 0,672 | 113 | 0,64 |
| 11B11 | 41 | 29 | 0,779 | 89 | 0,71 | ||
| 49G5 | 61 | 29 | 0,744 | 121 | 0,47 | ||
| 288 E11 | 87,0 | 28 | 20 | 6 | 0,736 | 157 | 0,33 |
| 224H8 | 76,9 | 26 | 20 | 5 | 0,570 | 181 | 0,34 |
| 19D3 | 40 | 24 | 0,804 | 80 | 0,60 | ||
| 37 E9 | 33 | 23 | 0,776 | 72 | 0,68 | ||
| 40B2 | 56 | 23 | 0,420 | 187 | 0,40 | ||
| 13B8 | 38,1 | 21,15 | 9,6 | 0,676 | 88 | 0,56 | |
| 7D10 | 50,95 | 20,4 | 14,05 | 0,898 | 79 | 0,40 | |
| 51D2 | 45 | 20 | 0,817 | 80 | 0,45 | ||
| 49D1 | 41 | 20 | 0,826 | 73 | 0,48 | ||
| 6B7 | 34,35 | 18,3 | 8,55 | 0,698 | 75 | 0,53 | |
| 17G1 | 30 | 17 | 0,848 | 55 | 0,58 | ||
| 159D4 | 30,6 | 15 | 7 | 2 | 0,699 | 65 | 0,50 |
| 1F12 | 47,7 | 14,9 | 0,756 | 83 | 0,31 | ||
| 12E 9 | 64,7 | 14,3 | 0,769 | 103 | 0,22 | ||
| 41G8 | 48 | 14 | 0,850 | 73 | 0,30 | ||
| 37F8 | 43 | 14 | 0,935 | 60 | 0,32 | ||
| 218F10 | 66,0 | 13 | 18 | 1 | 0,619 | 128 | 0,20 |
| 45E10 | 27 | 13 | 0,698 | 58 | 0,50 | ||
| Törzs | PSZEUDOMICIN (pg/ml) A B C C | Sejtsűrűség (OD60o) | PSA+PSB | PSB PSA | |||
| ODeoo | |||||||
| 7G5 | 50,2 | 12,7 | 0,703 | 89 | 0,25 | ||
| 3C11 | 44,4 | 12,5 | 0,895 | 64 | 0,28 | ||
| 18C2 | 29,45 | 12,45 | 7,8 | 0,474 | 88 | 0,42 |
| 8D6 | 19,43 | 11,63 | 0,783 | 40 | 0,60 | ||
| 6D5 | 2,5 | 11,5 | 0,230 | 61 | 4,60 | ||
| 3C3 | 36,0 | 10,4 | 0,622 | 75 | 0,29 | ||
| 4E 12 | 27,6 | 10,3 | 0,695 | 54 | 0,27 | ||
| 25B-1 | 26,6 | 10,2 | 0,38 | ||||
| 25B-1 | 26,5 | 10,1 | 0,38 | ||||
| 40G2 | 26 | 10 | 0,489 | 73 | 0,39 | ||
| 18G1 | 31 | 9 | 0,699 | 58 | 0,30 | ||
| 8H3 | 16 | 0,45 | 3,2 | 0,843 | 29 | 0,53 | |
| 42F2 | 22 | 8 | 0,754 | 40 | 0,37 | ||
| 25B-1 | 22,63 | 7,9 | 6,23 | 0,35 | |||
| 7A10 | 21,8 | 7,7 | 0,731 | 40 | 0,35 | ||
| 102D5 | 9 | 8 | 0,791 | 21 | 0,81 | ||
| 11E9 | 24,85 | 7,2 | 5,25 | 0,561 | 57 | 0,29 | |
| 101 E4 | 16,0 | 7 | 3 | 0 | 0,850 | 27 | 0,44 |
| 18C7 | 28 | 7 | 0,737 | 48 | 0,25 | ||
| 25B-1 | 18,9 | 6,7 | 0,36 | ||||
| 15E 6 | 13,05 | 6,2 | 3,8 | 0,391 | 49 | 0,48 | |
| 263H12 | 13,8 | 6 | 4 | 0 | 0,832 | 23 | 0,40 |
| 40D2 | 32 | 5 | 0,866 | 42 | 0,14 | ||
| 25B-1 | 13,53 | 4,27 | 0,32 | ||||
| 10A4 | 28,1 | 4,2 | 0,190 | 170 | 0,15 | ||
| 6B2 | 8,55 | 4,1 | 2,9 | 0,535 | 24 | 0,48 | |
| 41G6 | 14 | 4 | 0,798 | 23 | 0,29 | ||
| 6C1 | 14,7 | 4,1 | 0,726 | 26 | 0,28 | ||
| Törzs | PSZEUDOMICIN (pg/ml) A B C C’ | Sejtsűrűség (OD6oo) | PSA+PSB | PSB PSA | |||
| ODgoo | |||||||
| 6A4 | 25,7 | 4,0 | 0,865 | 43 | 0,16 | ||
| 7G3 | 17,2 | 3,8 | 0,210 | 100 | 0,22 | ||
| 17G10 | 43,0 | 3,7 | 0,341 | 137 | 0,09 |
| 7C5 | 15,1 | 3,6 | 0,386 | 22 | 0,24 | ||
| 11E 1 | 9,55 | 3,5 | 1,6 | 0,873 | 15 | 0,37 | |
| 97D11 | 12,4 | 3 | 4 | 0 | 0,685 | 23 | 0,26 |
| 16F9 | 7 | 3 | 0,833 | 12 | 0,45 | ||
| 40G6 | 11 | 3 | 0,243 | 57 | 0,27 | ||
| 19H12 | 5 | 3 | 0,703 | 11 | 0,59 | ||
| 6F4 | 8,0 | 2,8 | 0,655 | 16 | 0,35 | ||
| 024 E5 | 14,5 | 2,5 | 3,4 | 0 | 0,697 | 24 | 0,17 |
| 52A3 | 17 | 2 | 0,188 | 102 | 0,13 | ||
| 6H4 | 6,2 | 1,2 | 0,307 | 24 | 0,19 | ||
| 37B28 | 8 | 1 | 0,749 | 12 | 0,15 | ||
| 5H8 | 8,2 | 1,2 | 0,725 | 13 | 0,14 | ||
| 97C3 | 4,9 | 1 | 2 | 0 | 0,740 | 8 | 0,20 |
| 9D7 | 19,07 | 0,00 | 0,626 | 30 | 0,00 | ||
| 7C11 | 5,3 | 0 | 0 | 0,709 | 7 | 0,00 | |
| 18H8 | 10 | 0 | 3,1 | 0,760 | 13 | 0,00 | |
| 11B3 | 2,75 | 0 | 0 | 0,351 | 8 | 0,00 | |
| 7H10 | 6,4 | 0,0 | 0,205 | 31 | 0,00 | ||
| 7B5 | 5,8 | 0,0 | 0,286 | 20 | 0,00 | ||
| 6F1 | 2,6 | 0,0 | 0,719 | 4 | 0,00 | ||
| 6B12 | 4,4 | 0,0 | 0,467 | 9 | 0,00 | ||
| 4C4 | 8,8 | 0,0 | 0,744 | 12 | 0,00 | ||
| 3H7 | 4,2 | 0,0 | 0,777 | 5 | 0,00 | ||
| 3H6 | 4,7 | 0,0 | 0,727 | 6 | 0,00 | ||
| 3G5 | 7,1 | 0,0 | 0,636 | 11 | 0,00 | ||
| 3C12 | 3,1 | 0,0 | 0,711 | 4 | 0,00 | ||
| Törzs | PSZEUDOMICIN (μρ/ΓΠΐ) A B c σ | Sejtsűrűség (OD60o) | PSA+PSB | PSB PSA | |||
| OD6oo | |||||||
| 13G11 | 5,4 | 0,0 | 0,887 | 6 | 0,00 | ||
| 50G10 | 9 | 0 | 0,526 | 18 | 0,00 |
| 50F2 | 12 | 0 | 0,651 | 18 | |||
| 48F3 | 11 | 0 | 0,585 | 19 | |||
| 47C3 | 2 | 0 | 0,123 | 13 | |||
| 46H5 | 8 | 0 | 0,375 | 20 | |||
| 38 E5 | 5 | 0 | 0,803 | 6 | |||
| 12A3 | 6 | 0 | 0,658 | 10 | |||
| 37B11 | 2,2 | 0 | 0 | 0 | 0,158 | 14 | |
| 215B1 | 2,2 | 0 | 0 | 0 | 0,500 | 4 | |
| 25B-1 | 8,4 | 0 | 3,1 | ||||
| 25B-1 | 7,6 | 0 | 3,1 | ||||
| 269A7 | 4,6 | 0 | 0 | 0 | 0,08 | 58 | |
| 7G3 | 0 | 0 | 0 | 0,729 | 0 | ||
| 17C1 | 0 | 0 | 0 | 0,171 | 0 | ||
| 13B10 | 0 | 0 | 0 | 0,103 | 0 | ||
| 10C4 | 0 | 0 | 0 | 0,682 | 0 | ||
| 9B6 | 0,0 | 0,0 | 0,338 | 0 | |||
| 7A9 | 0,0 | 0,0 | 0,509 | 0 | |||
| 52H7 | 0 | 0 | 0,828 | 0 | |||
| 41A6 | 0 | 0 | 0,583 | 0 | |||
| 16F5 | 0 | 0 | 0,224 | 0 | |||
| 277H4 | 0,0 | 0 | 0 | 0 | 0,123 | 0 |
Következtetések
A jelen találmányban leírt kiválasztási eljárások és feltételek hatásosak olyan P. syringae törzsek előállításánál, amelyek minimális táptalajon növekednek, és egy vagy több pszeudomicin származékot megnövekedett mennyiségben termelnek. Találtunk olyan törzseket és körülményeket, amelyek esetén változik a termelt pszeudomicinek eloszlása. A minimális táptalaj alacsonyabb szárazanyag tartalma és megnövekedett tisztasága a
-33közeg gyorsabb szűrését és a sejtsűrűség pontosabb meghatározását teszi lehetővé.
3. Példa — Kísérletek a pszeudomicin termelés növelésére ismert tenyésztési körülmények alkalmazásával Pszeudomicin termelés álló vagy rázott lombikos tenyészetekben
A pszeudomicinek nagy méretben történő termelése céljából végzett első lépésként a P. syringae tenyésztés, és a pszeudomicin termelés ismert laboratóriumi méretű eljárásait kellett reprodukálni.
Anyagok és eljárások
Az MSU 16H jelű P. syringae törzset mozgatás nélkül (álló vagy statikus tenyészetben), illetve 250 ml-es rázott lombikokban 25°C-on, a 4. táblázatban leírt tápoldatban 1-10 napig tenyésztjük. Ez az oldat hasonló a Harrison és mások J. Gén. Microbiol, (lásd alább) által alkalmazott tápoldathoz. A 4. táblázat szerinti tápanyagokat tartalmazó, de burgonya-szőlőcukor táptalajt nem tartalmazó üvegedényeket összehasonlításként P. syringae oltóanyaggal oltjuk be. Egy további, burgonyából származó termékek alkalmazásával végzett kísérletben a burgonya-szőlőcukor táptalajt 20 g/l glükóz-oldatot és 4 g/l-es Alburex burgonyafehérjét tartalmazó táptalajjal, vagy 20 g/l-es glükózoldatot és 20 g/l-es Avebe burgonya-dextrint tartalmazó táptalajjal helyettesítjük. A gombaellenes hatást az 1. példa szerint mérjük.
4. Táblázat - Burgonya-szőlőcukrot és adalékanyagokat tartalmazó táptalaj (Potato Dextrose Broth Plus Additives Medium, PBM Medium)
| összetevő | koncentráció |
| Difco burgonya-szőlőcukor táptalaj oldható keményítő glicin | 24 g/l 5 g/l 1 g/l |
Czapek-féle ásványisó oldat (lásd az 5. táblázatot) 2 ml/l
MES puffer 9,8 g/l pH beállítása 5,0 értékre
5. Táblázat — Czapek-féle ásványisó-oldat
| összetevő A rész | mennyiség |
| KCI | 100 g |
| MgSO4x7H2O ioncserélt víz B rész | 100 g 900 ml |
| FeSO4x7H2O HCI (1 normál) ioncserélt víz | 2 g 2 ml 98 ml |
A B részt lassan adjuk hozzá az A részhez; addig keverjük, amíg az oldat letisztul
Eredmények
A P. syringae törzseket a 4. táblázat szerinti burgonya-szőlőcukor táptalajon tenyésztve, a gombaellenes hatás körülbelül 10,5-29 pg/ml pszeudomicin termelésnek megfelelő értékeket ért el.
| Ha a burgonya-szőlőcukor táptalajt | glükózt és Alburex |
burgonyafehérjét tartalmazó közeggel, vagy glükózt és Avebe burgonya-szőlőcukrot tartalmazó közeggel helyettesítettük, ilyen körülmények között az álló lombikos tenyészetek gombaellenes
-35hatása körülbelül 30 pg/ml pszeudomicin termelésnek felelt meg. Az ilyen körülmények között, burgonyából származó termékeket nem tartalmazó tápoldatban tenyésztett álló palackokban nem mutatkozott gombaellenes hatás.
A pszeudomicin termelés időfüggvénye azt mutatta, hogy a burgonya-szőlőcukor táptalajon (potato dextrose broth, PDB) inkubált tenyészetek esetén mind az álló (lásd a 6. táb-lázatot), mind a 250/min fordulatszámon rázott (lásd a 7. táblázatot) lombikokban termelődött pszeudomicin. A rázott lombikokban az inkubálási idő korai szakaszában termelődtek pszeudomicinek, de azok eltűntek, amikor a tenyészet pH-ja elérte a 7,5, vagy ennél nagyobb értéket. A teljes pszeudomicin termelés csúcspontjánál, álló tenyészetben a pszeudomicinek eloszlása a következő volt: 77% A, 11% B és 12% C. A teljes pszeudomicin termelés csúcspontjánál, rázott tenyészetben a pszeudomicinek eloszlása a következő volt: 67% A, 24% B és 9% C.
6. Táblázat — A pszeudomicin termelés az idő függvényében, PHB közeget tartalmazó álló lombikokban
| inkubálási idő (óra) | a tenyészet pH-ja | pszeudomicin A+B+C (μ g/ml) |
| 0 | 5,1 | 0 |
| 8 | 5,9 | 0 |
| 24 | 5,5 | 0 |
| 48 | 5,5 | 4 |
| 72 | 5,6 | 7 |
| 96 | 5,7 | 14,5 |
| 120 | 5,5 | 19,5 |
| 168 | 4,9 | 21,5 |
| 192 | 4,6 | 23 |
| 312 | 4,9 | 29 |
7. Táblázat — A pszeudomicin termelés az idő függvényében, PHB közeget tartalmazó rázott lombikokban
| inkubálási idő (óra) | a tenyészet pH-ja | pszeudomicin A+B+C (μ g/ml) |
| 0 | 5,1 | 0 |
| 8 | 5,3 | 0 |
| 24 | 5,0 | 4,5 |
| 32 | 4,6 | 9,0 |
| 40 | 4,9 | 10,5 |
| 48 | 7,5 | 6,5 |
| 56 | 7,9 | 0,5 |
| 72 | 8,3 | 0,5 |
| 80 | 8,3 | 0,5 |
A burgonya-dextrin táptalajon végzett inkubálások esetén, a pszeudomicin termelés időfüggvénye alapján mind az álló, mind a 250/min fordulatszámon rázott lombikokban keletkeztek pszeudomicinek (lásd a 8. táblázatot). A tenyésztés megkezdése előtt a pH-t 5,0-re állítottuk be, majd az MSU 16H jelű
-37törzset sterilizált táptalaj 50 ml-es adagjaira oltottuk. Néhány, az utóbbi táptalajt tartalmazó rázott lombikban a pH érték 6,0 alatt maradt, és csak kis pszeudomicin veszteséget tapasztaltunk. Az álló tenyészet teljes pszeudomicin termelésének csúcspontján a pszeudomicinek eloszlása a következő volt: 70% A, 16% B és 14% C. A rázott tenyészet teljes pszeudomicin termelésének csúcspontján a pszeudomicinek eloszlása a következő volt: 62% A, 19% B és 19% C.
8. Táblázat — A pszeudomicin termelés az idő függvényében, burgonya-szőlőcukor táptalajt tartalmazó rázott lombikokban
| inkubálási idő (óra) | pszeudomicin A+B+C az álló lombikokban (gg/ml) | pszeudomicin A+B+C a rázott lombikokban ^g/ml) |
| 0 | 0 | 0 |
| 8 | 0 | 0 |
| 24 | 11 | 13,5 |
| 48 | 22,5 | 15,5 |
| 72 | 28,5 | 11 |
| 96 | 28,5 | 10 |
Következtetések
A pszeudomicin termeléshez ismert, laboratóriumi méretű eljárásokat alkalmaztuk. Az ismert termelési eljárás reprodukálásához alapvetőek a burgonyából származó termékek. A burgonya-szőlőcukor táptalajt helyettesítheti burgonyafehérjét, vagy burgonya-dextrint tartalmazó táptalaj.
Pszeudomicin termelés fermentorokban levő álló vagy kevert tenyészetekben
-38A nagyobb mennyiségű pszeudomicin termelés céljából végzett második lépésként kísérleteket hajtottunk végre a P. syringae tenyésztés és pszeudomicin termelés ismert, laboratóriumi méretű módszereinek 150 literes tartályokban történő megvalósítására.
Anyag és módszer
Az MSU 16H jelű P. syringae törzset mozgatás mellett vagy anélkül 150 literes tartályokban, 5,2 pH-jú, a 4. táblázat szerinti tápoldatban 25°C-on legfeljebb 10 napig tenyésztjük. A 150 literes tartály keverése 75-150/min fordulatszámon történő keverést, és 0,5 SCFM áramlási aránnyal történő légbefúvást jelent. Az egyik, burgonyából származó termékek változtatásával végzett kísérletben a burgonya-szőlőcukor táptalajt glükózt és Alburex burgonyafehérjét tartalmazó közeggel, vagy glükózt és Avebe burgonya-dextrint tartalmazó közeggel helyettesítjük. A gombaellenes hatást az 1. példa szerint mérjük.
Eredmények
A nem mozgatott tartályban levő tenyészetben a P. syringae igen kis növekedést mutatott, és gombaellenes hatás, vagy pszeudomicin nem volt kimutatható. Ha a 150 literes tartályt kis sebességgel kevertük, és a szóbanforgó körülmények között kismértékű légbefúvást alkalmaztunk, a P. syringae szintén igen kis növekedést mutatott, és gombaellenes hatás, vagy pszeudo-micin szintén nem volt kimutatható. Ha a glükózt és Alburex burgonyafehérjét tartalmazó táptalajt, vagy a glükózt és burgonya-dextrint tartalmazó táptalajt burgonya-szőlőcukor táptalajjal helyettesítettük, a P. syringae termelés szintén igen kis növekedést mutatott, és
-39gombaellenes hatás, vagy pszeudomicin szintén nem volt kimutatható.
Következtetés
Az álló P. syringae tenyészettel történő pszeudomicin előállítás ismert módszere 150 literes méretben nem működött.
4. Példa — A pszeudomicin termelés sikeres emelése az ismert tenyésztési körülmények és közeg módosításával
Vizsgáltuk a P. syringae tenyésztés ismert körülményei változtatásainak hatását a pszeudomicin termelésre.
Az oxigén-koncentráció szabályozása
Anyag és módszer
A P. syringae törzset a 3. példa szerinti körülmények között, burgonya-szőlőcukor táptalajon (PDB) tenyésztjük, az oxigén-koncentráció szabályozása mellett. Egy további, burgonyából származó termékek alkalmazásával végzett kísérletben a 9. táblázat szerinti burgonyagyöngy táptalajt (Potato Pearl Medium, PPM) a 4. táblázat szerinti táptalajjal helyettesítjük, és szabályozzuk az oxigén-koncentrációt. A Basic American Foods cégtől származó Classic Country Style Potato Pearls® márkanevű burgonyagyöngyöt alkalmazzuk.
Az oldott oxigén koncentrációját a tenyésztés első 24 órájában 30% értéken tartjuk, egyes kísérletekben pedig a tenyésztés hátralevő 72 órájában 5% értékre csökkentjük. Az oldott oxigén-koncentrációt úgy tartjuk 5% értéken, hogy csökkentjük a légbefúvás sebességét, vagy a tartályba fújt levegőbe nitrogéngázt keverünk. Értékeltük ezen körülmények MSU16H jelű, és a mutáns 25-B1 jelű törzs növekedésére gyakorolt hatását. A gombaellenes
-40hatás mérését, és a pszeudomicin A szintek meghatározását az 1. példa szerint végezzük.
9. Táblázat — Burgonyagyöngy táptalaj (PPM)
| összetevő | mennyiség |
| glükóz | 20 g/l |
| burgonyagyöngy | 30 g/l |
| oldható keményítő | 5 g/l |
| glicin | 1 g/l |
| Czapek-féle ásványisó-oldat | 2 ml/l |
| pH beállítása 5,2-re |
A módosított burgonyagyöngy táptalajon mutatott pszeudomicin termelés időfüggvényének meghatározásához egy 150 literes fermentort megtöltünk 2,3 kg glükózzal, 575 g oldható keményítővel, 3,45 kg, a Basic American Foods cégtől származó Country Style márkanevű burgonyagyöngyös instant burgonyapüré porral, 115 g glicinnel, 23 g magnézium-szulfát heptahidráttal, 23 g kálium-kloriddal, 0,46 g vas(ll)-szulfát heptahidráttal és 115 I vízzel. A pH-t 5,0 értékre állítjuk be. A fermentort gőzzel sterilizáljuk és lehűtjük, majd 1,8 liter 25-B1 jelű törzzsel beoltjuk. A fermentort 150/perc fordulatszámon keverjük, a légáramlást 0,5 SCFM (0,14 vvm. [=14158 cm3/perc]) értékre állítjuk be. A keverés és a légáramlás beállítása kísérlet során automatikusan történik oly módon, hogy az oldott oxigén-koncentráció a telített érték 30%-a legyen. A hőmérsékletet 25°C-on szabályozzuk. A tenyészet pH-ját 30%-os kénsav hozzáadásával 5,5, vagy kisebb értékre állítjuk be.
Még nagyobb méretű kísérlethez egy 1000 literes fermentort 24,0 kg Difco PDB-vel, 5,0 kg oldható keményítővel, 1,0 kg glicinnel, 200 g magnézium-szulfát heptahidráttal, 200 g kálium
-41 kloriddal, 4 g vas(ll)-szulfát heptahidráttal és 1000 liter vízzel töltünk meg. A pH-t 5,0 értékre állítjuk be. A fermentort 50 liter 16 órás MSU 16H jelű törzzsel oltjuk be. A hőmérsékletet 25°C-on, az oldott oxigén-koncentrációt keveréssel és légbefúvással a telített érték 30%-án tartjuk. A pH-t 30%-os kénsav hozzáadásával úgy állítjuk be, hogy nem lépje túl az 5,5 értéket.
Eredmények
150 literes tartályban történő tenyésztés során, az oxigéntartalom ellenőrzése mellett gombaellenes hatás jelentkezett (lásd a 10. táblázatot). Ha az oxigéntartalmat nitrogéngázzal dúsított befújt levegővel állítottuk be, ez nagyobb mennyiségű pszeudomicin termelést eredményezett. Ha a 25-B1 jelű mutáns P. syringae törzset MSU 16H jelű törzzsel helyettesítettük, mind a mikroorganizmus növekedése, mind a gombaellenes hatás körülbelül a kétszeresére növekedett (lásd a 10. táblázatot). Ha a 9. táblázat szerinti tápközeget a 4. táblázat szerinti közeggel helyettesítettük, a növekedés és gombaellenes hatás további körülbelül kétszeres növekedését értük el.
10. Táblázat — A pszeudomicinek termelése két, burgonyából származó terméket tartalmazó táptalajon, az oxigéntartalom szabályozása mellett törzs összes pszeudomicin és pszeudomicin A koncentráció1 ( gg/ml)
| PDB közeg | PDB közeg | PPM közeg | PPM közeg |
| nitrogén | nitrogén | nitrogén | nitrogén |
| befúvással | befúvás nélkül | befúvással | befúvás nélkül |
| MSU 16H 21 (8) | 12 (ND)2 | NT3 | NT |
| 25-B1 49 (27) | 20 (13) | 87 (37) | 75 (44) |
zárójelben a pszeudomicin A koncentrációja 2 az ND jelentése: nem határoztuk meg 3 az NT jelentése: nem vizsgáltuk
A pszeudomicin termelés az idő függvényében a 11. táblázatban látható. A 150 literes fermentációnál ebben a kísérletben tapasztalt pszeudomicin eloszlás a következő volt: 79% A, 10% B és 11% C. A pszeudomicin 0' igen kis mennyiségben termelődött.
11. Táblázat — A pszeudomicin termelés az idő függvényében, burgonyagyöngy táptalajt tartalmazó 150 literes fermentorban
| eltelt fermentálás! idő (óra) | pszeudomicin A+B+C (pg/ml) |
| 0 | 0 |
| 8 | 0 |
| 16 | 17 |
| 24 | 35 |
| 32 | 45 |
| 40 | 41 |
Az 1000 literes fermentorban végzett kísérletben a pszeudomicin termelés időfüggvénye hasonló volt (12. táblázat).
12. Táblázat
| eltelt erjesztést idő (óra) | pszeudomicin A+B+C (pg/ml) |
| 0 | 0 |
| 4 | 0 |
| 16 | 5,2 |
| 28 | 5,6 |
| 40 | 5,9 |
| 52 | 5,8 |
| 76 | 6,0 |
| 100 | 6,3 |
Következtetések
A pszeudomicin hozam jelentősen növelhető olyan tényezők szabályozásával, mint például az oldott oxigén koncentrációja, a kiválasztott törzs, és a táptalaj összetétele.
A táptalaj kiegészítése lipidekkel és további összetevőkkel
A 9. táblázat szerinti burgonyagyöngy táptalajt további összetevőkkel egészítettük ki, hogy meghatározzuk ezek hatását a pszeudomicin termelésre.
Anyag és módszer
A 9. táblázat szerinti burgonyagyöngy táptalajt további összetevőkkel, például lipidekkel (például metil-mirisztát vagy szójaolaj), foszfáttal, nagyobb mennyiségű glicinnel, ammónium-hidroxid adagolásával, és glükóz adagolásával egészítettük ki (13. táblázat). A sejtek tenyésztését a fenti körülmények között végeztük. A gombaellenes hatást az 1. példa szerint mértük.
Eredmények
A fenti kísérletek eredményei az alábbi, 13. táblázatban láthatók.
-4413. Táblázat — Megnövekedett pszeudomicin hozam kiegészített burgonyagyöngy táptalajon
| kiegészítő anyag | pszeudomicin A+B+C hozam (pg/ml) |
| nincs | 80 |
| metil-mirisztát (1 g/l) | 150 |
| glicin (2 g/l) | 110 |
| ammónium-hidroxid hozzáadás (10 ml/óra) | 110 |
| glicin (2 g/l) és metil-mirisztát (1 g/l) | 160 |
| glicin (4 g/l) | 240 |
| glükóz adagolás (200 ml/óra) | 80 |
| glicin (4 g/l), metil-mirisztát (1 g/l) és glükóz hozzáadás | 287 |
| szójaolaj (1 g/l) | 150 |
| KH2PO4 (0,5 g/l) | 60 |
Következtetések
A táptalaj kiegészítése glicinnel és metil-mirisztáttal jelentősen növeli a P. syringae pszeudomicin termelését. Előnyös a glükóz hozzáadása is.
5. Példa — A glükóz és a metil-mirisztát serkentik a pszeudomicin termelést
A nagyobb pszeudomicin termelés érdekében vizsgáltuk a glicin, metil-mirisztát és több más összetevő hatását a pszeudomicin termelésre.
-45t · ·’·<♦· < »«·· <?♦ ··
Anyag és módszer
A P. syringae baktériumokat 50 ml tenyésztési közeget tartalmazó 250 ml-es lombikban tenyésztjük. Az MSU 16H jelű P. syringae oltóanyaggal indított tenyészetet 25°C-on, 70% páratartalom mellett, rázás nélkül 7 napig inkubátorban tartjuk. Az inkubálási idő leteltével a lombikból kivett 4 ml táptalajt 0,1%-os foszforsavat tartalmazó 6 ml metanollal keverjük. Feltételezzük, hogy az alacsony pH stabilizálja a pszeudomicineket. A szilárd részeket szűréssel vagy centrifugálással eltávolítjuk, a pszeudomicineket az 1. példa szerinti HPLC eljárással mutatjuk ki.
A jelen vizsgálatban alkalmazott közegek: burgonyaszőlőcukor táptalaj (PDB, Difco) sterilizált vízben készült 24 g/l koncentrációjú oldata (összehasonlító közeg); 2 ml/l koncentrációban Czapek-féle ásványisó oldatot tartalmazó összehasonlító közeg; 1 g/l koncentrációban glicint tartalmazó összehasonlító közeg; 1 ml/l koncentrációban metil-mirisztátot (Sigma) tartalmazó összehasonlító közeg; 5 g/l koncentrációban oldható keményítőt (Difco) tartalmazó összehasonlító közeg; 2 ml/l koncentrációban Czapek-féle ásványisó oldatot, 1 g/l koncentrációban glicint és 5 g/l koncentrációban oldható keményítőt tartalmazó összehasonlító közeg; és 2 ml/l koncentrációban Czapek-féle ásványisó-oldatot, 1 g/l koncentrációban glicint, 1 ml/l koncentrációban metil-mirisztátot és 5 g/l koncentrációban oldható keményítőt tartalmazó öszszehasonlító közeg.
A vizsgálat napján a P. syringae baktériumokat ugyanazon a táptalajon tenyésztjük 30 órán át, a fent leírt körülmények között, de rázott lombikokban. A lombikokat 250/perc fordulatszámmal rázzuk.
Egy másik, rázott lombikok alkalmazásával végzett kísérletben az összehasonlító közeget glicint és több más
-46adalékanyagot tartalmazó táptalajjal hasonlítottuk össze. A sejteket a fenti, rázott lombikokra leírt eljárással tenyésztjük. Az alkalmazott közegek: összehasonlító közeg; 1 g/l koncentrációban glicint tartalmazó összehasonlító közeg; 1 g/l koncentrációban glicint és 2 ml/l koncentrációban Czapek-féle ásványisó oldatot tartalmazó összehasonlító közeg; 1 g/l koncentrációban glicint és 5 g/l koncentrációban oldható keményítőt tartalmazó összehasonlító közeg; 1 g/l koncentrációban glicint és 1 ml/l koncentrációban metil-mirisztátot tartalmazó összehasonlító közeg; 1 g/l koncentrációban glicint, 2 ml/l koncentrációban Czapek-féle ásványisó oldatot és 5 g/l koncentrációban oldható keményítőt tartalmazó összehasonlító közeg; és 1 g/l koncentrációban glicint, 2 ml/l koncentrációban Czapek-féle ásványisó-oldatot, 1 ml/l koncentrációban metil-mirisztátot és 5 g/l koncentrációban oldható keményítőt tartalmazó összehasonlító közeg.
Eredmények
A nem rázott lombikokkal elért eredményeket a 3. ábra mutatja. Az összehasonlító közeg a Montana állambeli G. Strobel és mások által alkalmazott, P. syringae tenyésztésére szolgáló közeg, amelynek leírása Harrison és mások J. Gen. Microbiol. cikkében (lásd alább) szerepel. A pszeudomicinek kimutatási határa ebben a kísérletben körülbelül 1 pg/ml. A 3. ábrán látható, hogy a G. Strobel munkájában szereplő, ismert közeg és kö-rülmények alkalmazásával a pszeudomicin A termelés körülbelül 5 pg/ml, a pszeudomicin B és C termelés pedig nem kimutatható. Ha az összehasonlító közeget Czapek-féle ásványisó oldattal egészítjük ki, a pszeudomicin A termelés enyhén nő, körülbelül 6,5 pg/ml értékre, a pszeudomicin B és C termelés pedig nem ki-mutatható. Ha az összehasonlító közeget 1 g/l glicinnel egészítjük ki, a
-47pszeudomicin A termelés jelentősen, körülbelül 10,5 pg/ml értékre nő, a pszeudomicin B termelés kimutatható (2,5 pg/ml), de nincs kimutatható pszeudomicin C termelés. Ha az összehasonlító közeget metil-mirisztáttal egészítjük ki, a pszeudomicin A termelés jelentősen, körülbelül 8 pg/ml értékre nő, és a pszeudomicin B és C termelés egyaránt körülbelül 1 μg/ml. Ha az összehasonlító közeget oldható keményítővel egészítjük ki, a pszeudomicin A termelés enyhén visszaesik, a pszeudomicin B és C termelés nem kimutatható. Czapek-féle ásványisó oldatot, glicint és oldható keményítőt tartalmazó összehasonlító közeg alkalmazása esetén a pszeudomicin A, B és C termelés jelentős, nagymértékű növekedése figyelhető meg (3. ábra). További növekedés tapasztalható, ha a Czapek-féle ásványisó oldatot, glicint és oldható keményítőt tartalmazó összehasonlító közeget metil-mirisztáttal egészítjük ki. A nem rázott lombikok esetén minden eredmény 3 lombikra kapott eredmények átlaga.
A 4. ábrán látható, hogy rázott lombikok esetén hasonló eredményeket kaptunk. Rázott lombikok esetén azonban ahhoz, hogy a pszeudomicin A termelés a minimálisnál nagyobb legyen, lényeges glicin vagy metil-mirisztát hozzáadása, és a glicin és metil-mirisztát kombinációja a pszeudomicin A, B és C termelés jelentős, az additívnál nagyobb növekedését okozza. Hasonló eredmények figyelhetők meg a 6. ábra szerinti kombinációk és összetevők alkalmazásával.
Következtetések
Nem rázott lombikok esetén a glicin és/vagy metil-mirisztát egyaránt a pszeudomicin A és B termelés jelentős emelkedését okozza. A metil-mirisztát serkenti a pszeudomicin C termelését. Rázott lombikok esetén, jelentős pszeudomicin A
-48termeléshez glicin vagy metil-mirisztát jelenléte szükséges. Továbbá, a pszeudomicin A, B és C termelés serkentését tekintve a glicin és a metil-mirisztát szinergista (egymás hatását fokozó) hatása figyelhető meg.
6. Példa — A zsírsav metil-észterek közül a metil-mirisztát és a metil-palmitát serkentik a pszeudomicin termelést
A P. syringae baktériumokat különböző lánchosszúságú zsírsav metil-észterek jelenlétében tenyésztjük, annak bizonyítása céljából, hogy a pszeudomicin termelés a szénlánc hosszúságától függ.
Anyag és módszer
A P. syringae baktériumokat az 5. példa szerint, rázás mellett, 0,1 koncentrációban a zsírsavak metil-észtereit, 1 g/l koncentrációban glicint, 2 ml/l koncentrációban Czapek-féle ásványisó oldatot, 5 g/l koncentrációban oldható keményítőt tartalmazó, 5,0 pH-jú táptalajon tenyésztjük. A pszeudomicineket az 1. példa szerinti HPLC eljárással mutatjuk ki.
Eredmények
A 6. ábra a P. syringae inkubálások eredményeit mutatja, 6-22 szénatomszámú, páros számú szénatomos zsírsavak metilészterei jelenlétében. Az 5. példa szerint, metil-mirisztát nélkül végzett inkubálás eredményeihez hasonló pszeudomicin mennyiségeket a 6-12 vagy 18-22 szénatomszámú láncokat viselő zsírsav metil-észterek alkalmazásával értünk el. A pszeudomicin termelés jelentős emelkedése tapasztalható a 14 és 16 szénatomszámú láncok esetén. A metil-mirisztát a 14 szénatomos zsírsav metil-észtere. A 14 és 16 szénatomos zsírsav metil-ész
-49terek mindegyike jelentősen növeli a pszeudomicin A, B és C mindegyikének termelését.
Következtetések
MSU 16H jelű törzs alkalmazása esetén a vizsgált zsírsav metil-észterek közül a metil-mirisztát okozza a legnagyobb pszeudomicin termelést. Lényeges körülmény, hogy a pszeudomicinek peptid gyűrűjéhez kapcsolódó zsírsavlánc 14 szénatomos. Ez arra enged következtetni, hogy a hozzáadott metil-mirisztát lehet a pszeudomicinek egyik kiindulási anyaga.
7. Példa - Tartály méretű pszeudomicin termelésre szolgáló eljárások, burgonyából származó termék alkalmazásával
A 4. és 5. példák szerint összeállított közeg alkalmazható, ha a P. syringae baktériumokat 150 literes és 1000 literes méretben, burgonyából származó terméket tartalmazó közegben tenyésztjük.
Pszeudomicin termelés 150 literes fermentorban
Anyag és módszer
Teljes streptomyces közeget (CSM, 2. táblázat) tartalmazó növekedési (vegetative stage) lombikokat fagyasztott P. syringae tenyészettel beoltjuk, majd 25°C-on 250/perc fordulatszámon 24 órán át rázzuk. A növekedési lombikok 24 órás inkubálása után azok tartalmával szaporító (bump stage) lombikokat oltunk be. A CSM közeget tartalmazó szaporító lombikokat 25°C-on, 250/perc fordulatszámon forgatjuk. A szaporító lombikokat három vagy négy növekedési lombikból származó, egyesített tenyészettel oltjuk be. A szaporító lombikok jellemzően körülbelül 900 ml CSM közeget tartalmaznak, sima, 2,5 literes Tunair®
-50lombikban. Minden fermentort két szaporító tenyészetet tartalmazó Tunair® lombikokkal szerelünk fel. A szaporító lombikokat 16 órán át inkubáljuk.
Ezután két, 1,8 I teljes térfogatú szaporító tenyészetet inkubációs berendezésben (bazooka) egyesítünk. Ezekkel az egyesített tenyészetekkel oltjuk be a 9. táblázat szerinti, 4 g/l koncentrációban (3 g/l koncentrációjú) glicinnel és 1 g/l koncentrációban szójaolajjal kiegészített, 115 I térfogatú közeget. Ezeket a nagy méretű tenyészeteket 25°C-on három-négy napig tenyésztjük. A tenyésztési idő alatt az oldott oxigén koncentrációját keveréssel és a levegő áramoltatásával a telített érték 30%-án tartjuk. A pH-t szükség szerint kénsav vagy nátrium-hidroxid hozzáadásával 5,2 ± 0,2 értéken tartjuk. A nagy méretű tenyésztés megkezdése után 18 órával 200 ml/óra sebességű glükóz adagolást indítunk el. A nagy méretű tenyésztés megkezdése után 20 órával 20 ml/óra sebességű ammónium-hidroxid adagolást indítunk el. A tenyésztés során a visszafojtott nyomás 34 kPa. A keverés kezdeti értéke 150/perc, a légáramlás körülbelül 14158 normál cm3/perc [0,5 scfm]. A tenyészethez szükség szerint habképződést gátló anyagot is adunk. A nagy méretű tenyésztés harmadik-negyedik napján összegyűjtjük a P. syringae baktériumokat. A gombaellenes hatást az 1. példa szerinti eljárással mérjük.
Eredmények
A 8. és 9. ábrán a jelen eljárással folytatott kísérlet több különböző fermentációs paraméterének eloszlásai láthatók.
Következtetések
A jelen eljárással a pszeudomicin jelentős, kereskedelmi mennyiségben állítható elő.
-51 ··· · ··· · I • · · · · · · • · ···· ·· ··
Pszeudomicin termelés 5000 literes fermentorban
A 150 Uteres méretű pszeudomicin termelés eredményes eljárásait tovább nagyítottuk, 5000 literes méretre.
Anyagok és eljárások
A P. syringae oltóanyagot a fentebb leírt 150 literes méretű fermentálásnál alkalmazott eljárással állítjuk elő. A tenyésztés körülményei megfelelnek a 150 literes méretű tenyésztés fent leírt körülményeinek, a 14. táblázatban szereplő módosításokkal. Négy kísérletet hajtunk végre, amelyekből az első három esetén a 150 literes steril tartályban párhuzamos fermentációt végeztünk, a beoltott táptalaj steril körülmények között történő átvitelével. A steril átvitellel végrehajtott párhuzamos fermentáció arra szolgál, hogy a 150 literes és 5000 literes fermentorok teljesítményének összehasonlítása során kiküszöböljük a tápanyag kiegészítés és a sterilizálás változó pa-ramétereit. A gombaellenes hatást az 1. példa szerint mérjük.
Eredmények
A 14. táblázat összefoglalja az 5000 literes méretkel elért eredményeket, és összehasonlítja azokat a párhozamos fermentálácok eredményeivel. Az 5000 literes tartályban elért koncentrációk az 1. kísérlet kivételével alapvetően megegyeztek a 150 literes tartályban elért koncentrációkkal. Az 1. kísérletben az 5000 literes tartály keverését kezdetben 150/perc, majd a 36. órában 50/perc értékre csökkentettük. A sejtek növekedése a 150 literes tartályban végzett párhuzamos fermentációban elért értéknek mindössze 1/3-a volt, a pszeudomicin A tartalom pedig a párhuzamos érték 1/4-e. Az ezt követő kísérletekben az 5000
-52literes tartály keverését 25/perc (kezdeti) értékre csökkentettük, ennek eredményeként a sejtek növekedése és a pszeudomicinek arányai összehasonlíthatók voltak a steril párhuzamos kísérletek és az önállóan működtetett 150 literes tartályok esetén elért eredményekkel. Az adatokból arra lehet következtetni, hogy a 25-B1 jelű P. syringae törzs érzékeny a nyíró igénybevételre.
14. Táblázat — Az 5000 literes fermentorral elért eredmények (PPM)
| kísérlet | 5000 l-es sarzs | tartalom1 | párhuzamos sarzs | tarta -lom | megjegyzés |
| 1 | 055CE7 | 12 | 313CA7 | 45 | 4 g/l glicin, 0,1 g/l metil-mirisztát, a pH nem ellenőrzött, adalék nélkül; az 5000 literes tartályban: magas DO2 koncentráció, a keverés csökkentése a 36. órában a kezdeti 150/perc értékről 50/perc értékre |
| 2 a 14. tá | 060CE7 jlázat folyt | 89 atása | 318CA7 | 77 | az 1. kísérlettel azonos, de a közeg 1 g/l metil-mirisztátot tartalmaz; az 5000 literes tartályban a keverést 25/perc fordulatszámon, a DO2 értéket 30% szinten szabályozzuk |
| 3 | 063CE7 | 50 | 332CA7 | 44 | A közeg az 1. kísérlet szerinti, de 10 g/l burgonyagyöngyöt és karamellizált táptalajt tartalmaz. A pH gyors csökkenését követően azt a 24. órában NH4OH-dal 5,5 értékre növeljük. |
-53··· · ··· · · • · · · · I • · ·*·· ·· · »
| - 4 | 068CE7 | 120 | nem végez-tük el | 135 | a pH-t NaOH és NH4OH adagolással 5,2 értéken tartjuk, glükóz adagolással, a közeg az 1. kísérlet szerinti, de metil-mirisztát helyett szójaolajat tartalmaz |
1 A tartalom pszeudomicin A koncentrációt (pg/ml) jelent.
A glükóz adagolása a fermentorokba 80 vegyes%-os glükózoldat hozzáadását, az ammónia adagolása 58 súly%-os ammónium-hidroxid hozzáadását jelenti.
Következtetések
A jelen eljárás 5000 literes méretben történő alkalmazásával jelentős, kereskedelmi mennyiségben állítható elő pszeudomicin.
8. Példa — P. syrinciae tenyésztése és pszeudomicin termelése nagy méretben, burgonyából származó termékeket nem tartalmazó táptalajon
Ha a P. syringae-t olyan N21 táptalajon tenyésztjük, amely nem tartalmaz az előző példákban szereplő, burgonyából származó termékeket, grammnyi mennyiségű pszeudomicin termelése valósítható meg.
Pszeudomicin termelés rázott lombikokban, N21 táptalajon Anyagok és eljárások
A P. syringae baktériumokat az 5. példa szerinti körülmények között tenyésztjük, azzal a különbséggel, hogy a közeg nem tartalmaz burgonyából származó terméket. Az N21 közeg néven ismert közeg összetétele a 15. táblázatban látható. A
-54közeget 0,2% koncentrációban metil-mirisztáttal egészítettük ki, hogy meghatározzuk a metil-mirisztát hatását a pszeudomicin termelésre.
15. Táblázat — Az N21 közeg összetétele
| ÖSSZETEVŐ | GRAMM/LITER |
| szacharóz | 35 |
| ammónium-szulfát | 0,5 |
| mononátrium-glutamát | 2 |
| L-hisztidin | 2 |
| glicin | 0,5 |
| oldható keményítő | 5 |
| KH2PO4 | 0,2 |
| Czapek-féle ásványisó oldat | 2 ml |
| élesztőkivonat | 1 |
| MES puffer | 9,8 |
| pH beállítása 5,2 értékre |
Több P. syringae törzs pszeudomicin termelését értékeltük metil-mirisztátot tartalmazó, vagy nem tartalmazó N21 közeg alkalmazása mellett. A vizsgált P. syringae törzsek a következők voltak: MSU 16H, 25-B1, 67H1 és 7H9-1.
Eredmények
A metil-mirisztát jelenlétében, vagy hiányában tenyésztett több P. syringae törzs pszeudomicin termelésével kapcsolatos vizsgálati eredményeket mutatja a 16. táblázat és a 9. ábra. Az eredményekből látható, hogy a 67H1 jelű törzs metil-mirisztát jelenlétében, vagy hiányában is nagyobb mennyiségben termeli
-55mindegyik pszeudomicin származékot. A 7H9-1 jelű törzs abban különbözik a többitől, hogy a pszeudomicin A-nál vagy C-nél jóval nagyobb mennyiségben termel pszeudomicin B-t. A metil-mirisztát minden törzsnél serkentette a pszeudomicin termelést.
16. Táblázat — Néhány P. syringae törzs pszeudomicin termelése metil-mirisztát jelenlétében és hiányában
| törzs | metil- -mirisztát | pszeudomicin A μg/ml | pszeudomicin B pg/ml | pszeudomicin C pg/ml |
| MSU 16 H | - | 59 | 19 | 12 |
| 25-B1 | - | 66 | 50 | 15 |
| 67H1 | - | 334 | 173 | 83 |
| 7H9-1 | - | 3 | 110 | 0 |
| MSU 16H | + | 126 | 45 | 27 |
| 25-B1 | + | 154 | 123 | 36 |
| 67H1 | + | 390 | 207 | 95 |
| 7H9-1 | + | 8,5 | 222 | 4,5 |
Következtetések
Különféle P. syringae törzsek burgonyából származó terméket nem tartalmazó közegben kereskedelmi mennyiségben termelnek pszeudomicineket, amely pszeudomicin termelés metil-mirisztáttal serkenthető.
Pszeudomicin termelés 5000 literes méretben, N21 táptalajon
A burgonyából származó termékeket nem tartalmazó táptalajjal végzett pszeudomicin termelés eljárásait 5000 literes méretre nagyítottuk.
-56• · · · · · ··
Anyag és módszer
A pszeudomicin előállítást 5000 literes fermentorban a 7. példa szerinti eljárással végezzük, azzal a különbséggel, hogy N21 táptalajt alkalmazunk (15. táblázat). Az N21 táptalajt 1 g/l koncentrációban élesztőkivonattal egészítjük ki. 67H1 jelű P. syringae törzset alkalmazunk.
Eredmények
Tíz 5000 literes fermentorban végzett kísérlet eredményeinek átlagértékeit mutatja a 17. táblázat.
17. Táblázat — Tíz 5000 literes fermentorban kapott pszeudomicin mennyiségek átlagértékeinek eloszlása
| pszeudomicin | pg/ml begyűjtésnél |
| A | 243 |
| B | 203 |
| C | 71 |
| C | 40 |
Következtetések
A pszeudomicin A, B, C és C 5000 literes méretben, burgonyából származó termékeket nem tartalmazó táptalaj alkalmazásával kereskedelmi szempontból jelentős mennyiségben termelhető.
9. Példa — A pszeudomicin termelés közegének további egyszerűsítése
A P. syringae burgonyából származó termékeket nem tartalmazó N21SM közegben végzett tenyésztése során ered-57ményes pszeudomicin termelést tapasztaltunk. Az N21SM alapú, de annak bizonyos összetevőit nem tartalmazó közegben is jelentős mennyiségű pszeudomicin termelhető.
Anyagok és eljárások
A P. syringae törzset rázott lombikokban, az 5. példa szerinti körülmények között tenyésztjük, azzal a különbséggel, hogy a közeg összetételét az alábbiakban írjuk le. A CNP közeg néven ismert alapközeg összetétele a 18. táblázatban látható. A vizsgált adalékanyagok alkalmazott koncentrációját és kom-binációit lásd az alábbiakban (18. táblázat).
18. Táblázat — A CNP közeg összetétele
| összetevő | MENNYISÉG |
| glükóz | 20 g/l |
| KH2PO4 | 0,41 g/l |
| Czapek-féle ásványisó oldat | 2 ml |
| MES puffer | 9,8 g/l |
| ammónium-szulfát | 1 g/l |
| pH beállítása 5,2-re |
| A CNP KÖZEG ADALÉKANYAGAI | |
| glutamát | 2 g/l |
| glicin | 0,5 g/l |
| L-hisztidin | 2 g/l |
| oldható keményítő | 5 g/l |
| élesztőkivonat | 1 g/l |
-58Néhány P. syringae törzs pszeudomicin termelését értékeltük, egy vagy több felsorolt adalékanyagot tartalmazó, vagy nem tartalmazó CNP közeg alkalmazása esetén. Az egyik értékelt törzs a 25-B1 jelű P. syringae törzs volt.
Eredmények
A P. syringae adalékanyagokkal, vagy anélkül kapott pszeudomicin termelésének eredményeit mutatja a 19. táblázat.
19. Táblázat — Az adalékanyagokat tartalmazó, vagy nem tartalmazó CNP közegben tenyésztett P. syringae pszeudomicin termelése
| Pszeudomicin (pg/ml) | |||||
| adalékanyag | ODeoo | A | B | C | C' |
| nincs | 0,221 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0,222 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| glutamát | 0,943 | 82,6 | 16,3 | 24,5 | 5,9 |
| 0,94 | 87 | 16,7 | 25,7 | 6 | |
| glicin | 0,628 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0,567 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| hisztidin | 0,331 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0,354 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| glutamát, glicin és hisztidin | 0,984 | 153 | 41 | 44 | 12 |
| a 19. táblázat folytatása | 0,98 | 149 | 40 | 42 | 12 |
| glutamát, glicin, hisztidin és oldható keményítő | 0,985 | 134 | 29 | 34 | 9 |
| 0,996 | 125 | 34 | 35 | 1 1 | |
| oldható keményítő | 0,28 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0,289 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| élesztőkivonat | 0,441 | 40 | 6 | 11 | 2 |
| 0,449 | 39 | 6 | 11 | 2 | |
| glutamát, glicin, hisztidin, oldható keményítő és élesztőkivonat | 0,998 | 215 | 52 | 55 | 17 |
| 1,001 | 197 | 52 | 56 | 19 |
Következtetések
A P. syringae tenyésztésére, és kereskedelmi szempontból jelentős pszeudomicin termelésre számos különböző minimális táptalaj alkalmazható.
10. Példa Pszeudomicin A' és B* termelése
Olyan tenyésztési eljárást dolgoztunk ki, amelyben egy Pseudomonas syringae törzs a táptalajban pszeudomicin A'-t és/vagy B'-t termel.
Anyagok és eljárások
Az oltóanyag előállítása: Folyékony nitrogén gőzfázisában tartott, sejteket tartalmazó felülúszó mintát felengedünk, majd ezzel beoltunk két adag 900 ml CSM táptalajt. A CSM táptalaj összetétele (g/l): glükóz (5), maltóz (4), Difco Tryptic Soy Broth (30), Difco élesztőkivonat (3) és magnézium-szulfát heptahidrát (2). A kétliteres lombikokban levő két adag 900 ml táptalajt körülbelül 0,5 ml térfogatú sejtszuszpenzióval oltjuk be. A lombikokat rázás mellett 25°C-on 24 órán át inkubáljuk. A két lombik egyesített tartalmát 150 literes fermentorban levő 115 liter steril fermentációs táptalajra oltjuk.
Fermentációs szakasz: A fermentációs táptalaj összetétele (g/l): szőlőcukor (20), oldható keményítő (5), Basic American Foods Country Style Burgonyagyöngy instant burgonyapüré (30), glicin (1), magnézium-szulfát heptahidrát (0,2), kálium-klorid (0,2)
-60és csapvízben készült vas(ll)-szulfát heptahidrát (0,004). A pH-t a sterilizálás előtt 5,2 értékre állítjuk be. A fermentálást 25°C-on 68 óráig végezzük. Az oldott oxigén koncentrációját a légáramlás és a keverő lapátjának fordulatszáma folytonos szabályozásával a telített érték 30%-án, vagy afelett tartjuk. A pH-t kénsav vagy nátrium-hidroxid hozzáadásával 4,0-5,4 értékek között tartjuk.
Változatok az adagolási eljárásokban: Az egyszerű szakaszos adagolási eljáráshoz képest számos olyan változatot találtunk, amelyek alkalmasak pszeudomicin A' és/vagy B' termelésére. A szőlőcukor a beoltás megkezdését követő 24. órától 60 ml/óra sebességgel adagolható. Az adagolás a fermentálás folyamán végig folytatható. Másik eljárás szerint a folyamatban az oldott oxigén koncentrációját a beoltást követő 24. órától a fermentálás! folyamat befejeződéséig a telítési érték 5%-án tartjuk. Az oldott oxigén koncentrációját úgy tartjuk 5% értéken, hogy a fermentorba vezető légáramba semleges nitrogéngázt (N2) keverünk. A gázt minden esetben egy egyszerű, süllyesztett bekeverő csövön keresztül adagoljuk a fermentorba, amely cső nyílása éppen a fermentor alján levő keverőlapát alatt található.
Eredmények és következtetések
A P. syringae alkalmazásával több fermentációs eljárásban termelődik pszeudomicin A' és/vagy B'.
A pszeudomicin A' és B' izolálása és tisztítása
Kidolgoztuk a pszeudomicin A' és B' Pseudomonas syringae törzs táptalajából való izolálására és tisztítására szolgáló eljárásokat.
Anyagok és eljárások
-61 A begyűjtést követően a teljes fermentációs táptalaj mennyiséget (4x100 ml) 0,45 pm lyukátmérőjű Membralox kerámiaszűrőn szűrjük, így szűrletet (A rész) és szilárd szuszpenziót (B rész) kapunk. A 135 I térfogatú B részt 0,1% trifluoro-ecetsavat tartalmazó, egyenlő térfogatú acetonnal kirázzuk 120 percig, majd állni hagyjuk. A tiszta acetonos szerves részt szűréssel elkülönítjük, majd az acetont csökkentett nyomáson elpárologtatjuk, így 88 ml C részt kapunk. Elsőként az A részt gyantával töltött, vízzel átitatott 10 I HP20ss oszlopra töltjük, majd az oszlopot 0,1% trifluoro-ecetsavat tartalmazó 15%-os acetonitrillel mossuk. Ezután a C részt ugyanerre az oszlopra töltjük, majd az oszlopot az előzőekhez hasonlóan 20 I, 0,1% trifluoro-ecetsavat tartalmazó 15%-os acetonitrillel mossuk.
Az oszlopot ezután 30 percen keresztül 15 és 20% között egyenletesen változó koncentrációjú, 0,1% TFA-t tartalmazó acetonitrillel, majd 60 percen keresztül 20-35% között egyenletesen változó koncentrációjú, 0,1% TFA-t tartalmazó, 1 l/perc áramlási sebességű acetonitrillel leoldjuk. Egy liternyi részeket gyűjtünk össze. A 6-9. részeket (4I) egyesítjük, így 24 g D részt kapunk. A D rész egy részét (~1 g) fordított fázisú oszlopon (Dynamax C18 41,4 X 250 mm) pH=3 trietil-ammónium-fosztát puffer és acetonitril-metanol mozgófázis alkalmazásával kromato-grafáljuk (a leoldás során a 40ml/perc áramlási sebességű oldó-szer aránya 45 percen keresztül 65:17:18 és 30:35:35 között változik). A megfelelő részeket egyesítjük, a térfogatot 75 ml-re csökkentjük, majd az előzőekhez hasonlóan C18 oszlopon, 80:10:10 és 46:27:27 között változó arányokkal újból kroma-tografáljuk, így 113 mg E részt, és 116 mg F részt kapunk. Az E és F részek további, C18 oszlopon (Dynamax 21,4 X 250 mm) történő kromatografálása 45 mg pszeudomicin A'-t és 62 mg pszeudomicin B'-t eredményez.
-62Eredmények és következtetések
A fermentációs táptalajból más pszeudomicin származékok tisztítási eljárásaihoz hasonló HPLC eljárással eredményesen tisztítottuk a pszeudomicin A'-t és B'-t.
A jelen találmányt különféle specifikus és előnyös megvalósítások és eljárások segítségével írtuk le. Nyilvánvaló azonban, hogy a jelen találmány szellemében és annak oltalmi körén belül számos változtatás és módosítás végezhető. Valamennyi, a jelen találmány részletes leírásában szereplő közlemény és szabadalmi bejelentés a jelen találmány részét képezi.
Claims (25)
- -63• · · · ·· »»«· ♦·SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás egy vagy több pszeudomicin származék előállítására, amely eljárás a következő lépéseket tartalmazza:egy vagy több pszeudomicin származék kinyerése a szóbanforgó táptalajból.biológiailag tiszta Pseudomonas syringae tenyészet fermentálása olyan táptalajon, amelyben az aminosav glutamát, vagy glutamát, glicin és hisztidin keveréke, pH-ja körülbelül 4 és körülbelül 6,5 közötti, amíg egy vagy több pszeudomicin származék legalább 10 pg/ml koncentrációban termelődik; és
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szóbanforgó aminosav glutamát, glicin és hisztidin keveréke.
- 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a táptalaj oldható keményítőt tartalmaz.
- 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szóbanforgó aminosav glicin, és a szóbanforgó táptalaj lipidet, burgonya-dextrint vagy ezek kombinációját tartalmazza.
- 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szóbanforgó lipid szójaolaj, 16 szénatomos zsírsav, 16 szénatomos zsírsav észtere, 14 szénatomos zsírsav, vagy 14 szénatomos zsírsav észtere.
- 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szóbanforgó lipid metil-mirisztát vagy metil-palmitát.
- 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pH kisebb, mint körülbelül 6,0.
- 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pH körülbelül 5,5.
- 9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szóbanforgó tenyésztés során az oldott oxigén koncentrációját körülbelül 5% és körülbelül 30% értékek között tartjuk.
- 10. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szóbanforgó tenyésztést glükóz, ammónium-hidroxid vagy ezek kombinációjának hozzáadása mellett végezzük.
- 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szóbanforgó pH-t ammónium-hidroxid adagolásával 5,0 és 5,7 értékek között tartjuk.
- 12. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szóbanforgó táptalaj glükózt vagy szacharózt, ammónium-szulfátot, foszfátot, Czapek-féle ásványisó oldatot és MES puffért tartalmaz, és a szóbanforgó pH körülbelül 5,2.
- 13. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szóbanforgó egy vagy több pszeudomicin származék pszeudomicin A, pszeudomicin A', pszeudomicin B, pszeudomicin B', pszeudomicin C, pszeudomicin C, vagy azok keveréke.
- 14. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szóbanforgó egy vagy több pszeudomicin származék pszeudomicin B.
- 15. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szóbanforgó Pseudomonas syringae vad típusú törzs, transzpozonnal átalakított mutáns törzs, vagy kémiai mutációval létrehozott mutáns törzs.
- 16. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szóbanforgó Pseudomonas syringae árpaféléből, citrusféléből vagy orgonaféléből származó környezeti izolátum.
- 17. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szóbanforgó Pseudomonas syringae MSU 16H, MSU 174, MSU 206 jelű, vagy ezekből származtatott törzs.
- 18. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szóbanforgó Pseudomonas syringae 25-B1 (ATTC PTA-1622), 67H1 (ATCC PTA-1621), vagy 7H9-1 (ATCC PTA-1623) jelű törzs.
- 19. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szóbanforgó Pseudomonas syringae törzset a 25-B1 (ATCC PTA-1622) jelű törzsből származtatják.
- 20. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 25-B1 (ATCC PTA-1622) jelű törzset kémiai mutációval hozzuk létre, és a mutánsokat kiválogatjuk.
- 21. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szóbanforgó egy vagy több pszeudomicin származék legalább 300 μ g/ml koncentrációban termelődik.
- 22. Az 1. igénypont szerinti eljárással előállított pszeudomicin.
- 23. Olyan biológiailag tiszta, 25-B1 (ATCC PTA-1622), 67H1 (ATCC PTA-1621), 7H9-1 (ATCC PTA-1623) jelű Pseudomonas syringae törzs, vagy ezek pszeudomicin termelő mutánsa vagy változata, amely nagyobb, mint körülbelül 10 pg/ml koncentrációban termel egy vagy több pszeudomicin származékot.
- 24. Eljárás egy vagy több pszeudomicin származék előállítására, amely eljárás a következő lépéseket tartalmazza:Egy vagy több pszeudomicin származékot nagyobb, mint körülbelül 10 μg/ml koncentrációban termelő, biológiailag tiszta, MSU 16H, MSU 174, MSU 206, 25-B1 (ATCC PTA-1622), 67H1 (ATCC PTA-1621), 7H9-1 (ATCC PTA-1623) jelű Pseudomonas syringae törzs, vagy ezek pszeudomicin termelő mutáns alakja vagy változata tenyésztése glükózt, KH2PO4-ot, Czapek-féle ásványisó oldatot, MES puffért, ammónium-szulfátot és aminosavakat tartalmazó táptalajon, amely eljárásban a szóbanforgó aminosav glutamát, vagy glutamát, glicin és hisztidin keveréke, amely eljárásban, abban az esetben, ha a szóbanforgó aminosav glutamát, glicin és hisztidin keveréke, akkor a táptalaj adott esetben oldható keményítőt tartalmazhat, amely eljárásban a szóbanforgó közeg pH-ja körülbelül 4 és körülbelül 6,5 közötti,-67amely eljárásban a szóbanforgó tenyésztést körülbelül 15 és körülbelül 35°C hőmérséklet között, az oxigén-koncentrációnak a telített érték körülbelül 5 és körülbelül 50%-a közötti értéke mellett végezzük, amíg egy vagy több pszeudomicin származék legalább körülbelül 10 μg/ml koncentrációban termelődik; és egy vagy több pszeudomicin származék kinyerése a szóbanforgó tenyészetből.
- 25. Eljárás egy vagy több pszeudomicin származék előállítására, amely eljárás a következő lépéseket tartalmazza:Egy vagy több pszeudomicin származékot nagyobb, mint körülbelül 10 μg/ml koncentrációban termelő, biológiailag tiszta, MSU 16H, MSU 174, MSU 206, 25-B1 (ATCC PTA-1622), 67H1 (ATCC PTA-1621), 7H9-1 (ATCC PTA-1623) jelű Pseudomonas syringae törzs, vagy ezek pszeudomicin termelő mutáns alakja vagy változata tenyésztése 20 g/l koncentrációban glükózt, 0,41 g/l koncentrációban KH2PO4-ot, 2 ml Czapek-féle ásványisó oldatot, 9,8 ml MES puffért, 1 g/l koncentrációban ammónium-szulfátot és aminosavakat tartalmazó táptalajon, amely eljárásban a szóbanforgó aminosav 2 g/l koncentrációjú glutamát, vagy 2 g/l koncentrációjú glutamát, 0,5 g/l koncentrációjú glicin és 2 g/l koncentrációjú hisztidin keveréke, amely eljárásban, abban az esetben, ha a szóbanforgó aminosav glutamát, glicin és hisztidin keveréke, akkor a táptalaj adott esetben, 5 g/l koncentrációjú oldható keményítőt tartalmazhat, amely eljárásban a szóbanforgó közeg pH-ja 5,2, amely eljárásban a szóbanforgó tenyésztést körülbelül 15 és körülbelül 35°C közötti hőmérsékleten, az oxigén-koncentrációnak a telített érték körülbelül 5 és körülbelül 50%-a közötti értéke mellett-68végezzük, amíg egy vagy több pszeudomicin származék legalább körülbelül 10 pg/ml koncentrációban termelődik; és egy vagy több pszeudomicin származék kinyerése a szóbanforgó tenyészetből.A meghatalmazott
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US12943199P | 1999-04-15 | 1999-04-15 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP0200919A2 true HUP0200919A2 (en) | 2002-08-28 |
Family
ID=22439900
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0200919A HUP0200919A2 (en) | 1999-04-15 | 2000-04-14 | Pseudomycin production by pseudomonas syringae |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1171576B1 (hu) |
| JP (1) | JP2002542262A (hu) |
| CN (2) | CN100350050C (hu) |
| AT (1) | ATE366798T1 (hu) |
| AU (1) | AU4188800A (hu) |
| BR (1) | BR0010614A (hu) |
| CA (1) | CA2370239A1 (hu) |
| DE (1) | DE60035494T2 (hu) |
| EA (2) | EA006119B1 (hu) |
| HU (1) | HUP0200919A2 (hu) |
| MX (1) | MXPA01010246A (hu) |
| NO (1) | NO20014989L (hu) |
| WO (1) | WO2000063345A1 (hu) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000063237A2 (en) * | 1999-04-15 | 2000-10-26 | Eli Lilly And Company | Pseudomycin analogs |
| MXPA03001493A (es) * | 2000-08-18 | 2003-06-06 | Univ Montana Res Dev Inst | Seudomicinas utiles contra enfermedades de plantas. |
| CN106467922B (zh) * | 2016-08-26 | 2021-04-02 | 上海交通大学 | 一种基于绿针假单胞菌的脂肽的合成方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1292199C (en) * | 1986-12-22 | 1991-11-19 | Shirley Y. Lynn | Fermentation of microorganisms having ice nucleating activity using a defined medium |
| US5576298A (en) * | 1992-11-30 | 1996-11-19 | Research And Development Institute, Inc. At Montana State University | Peptides from pseudomonas syringae possessing broad-spectrum antibiotic activity |
-
2000
- 2000-04-14 MX MXPA01010246A patent/MXPA01010246A/es active IP Right Grant
- 2000-04-14 HU HU0200919A patent/HUP0200919A2/hu unknown
- 2000-04-14 EA EA200101091A patent/EA006119B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2000-04-14 JP JP2000612424A patent/JP2002542262A/ja active Pending
- 2000-04-14 AT AT00921594T patent/ATE366798T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-04-14 AU AU41888/00A patent/AU4188800A/en not_active Abandoned
- 2000-04-14 BR BR0010614-3A patent/BR0010614A/pt not_active Application Discontinuation
- 2000-04-14 CN CNB200510065718XA patent/CN100350050C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-04-14 CN CNB008062625A patent/CN1206343C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-04-14 WO PCT/US2000/008728 patent/WO2000063345A1/en not_active Ceased
- 2000-04-14 EP EP00921594A patent/EP1171576B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-04-14 EA EA200500905A patent/EA010054B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2000-04-14 CA CA002370239A patent/CA2370239A1/en not_active Abandoned
- 2000-04-14 DE DE60035494T patent/DE60035494T2/de not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-10-12 NO NO20014989A patent/NO20014989L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EA200500905A1 (ru) | 2006-02-24 |
| CA2370239A1 (en) | 2000-10-26 |
| EP1171576A1 (en) | 2002-01-16 |
| MXPA01010246A (es) | 2002-03-27 |
| EA200101091A1 (ru) | 2002-04-25 |
| EA006119B1 (ru) | 2005-08-25 |
| NO20014989D0 (no) | 2001-10-12 |
| DE60035494T2 (de) | 2008-03-20 |
| CN1206343C (zh) | 2005-06-15 |
| DE60035494D1 (de) | 2007-08-23 |
| WO2000063345A1 (en) | 2000-10-26 |
| JP2002542262A (ja) | 2002-12-10 |
| CN100350050C (zh) | 2007-11-21 |
| EA010054B1 (ru) | 2008-06-30 |
| BR0010614A (pt) | 2002-02-13 |
| CN1348492A (zh) | 2002-05-08 |
| NO20014989L (no) | 2001-11-09 |
| EP1171576B1 (en) | 2007-07-11 |
| AU4188800A (en) | 2000-11-02 |
| CN1680566A (zh) | 2005-10-12 |
| ATE366798T1 (de) | 2007-08-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ138194A3 (en) | Lipopeptides produced by bacteria of actinoplanes strain exhibiting pharmacological activity, processes of their preparation and their use | |
| HUP0200919A2 (en) | Pseudomycin production by pseudomonas syringae | |
| MXPA01010244A (es) | Agentes antifungosos aislados de pseudomonas syringae. | |
| US7556960B2 (en) | Pseudomycin production by pseudomonas syringae | |
| EP1198471A1 (en) | Process for deacylation of lipodepsipeptides | |
| JP5220862B2 (ja) | 新規化合物シグナマイシン、その製造方法、及びその用途 | |
| US6793925B2 (en) | Pseudomycin natural products | |
| Fukatsu et al. | Interkingdom host shift in the Cordyceps fungi | |
| JP5636179B2 (ja) | 新規化合物ウォークマイシン、その製造方法、及びその用途 | |
| JP4095815B2 (ja) | トリプシンの新規インヒビターｔｕ−５３５０物質とその製造法及び用途 | |
| Schardl | West Virginia University, Morgantown, West Virginia, USA |