[go: up one dir, main page]

HUP0104697A2 - Bináris, víruseredetű expressziós rendszer növényekben - Google Patents

Bináris, víruseredetű expressziós rendszer növényekben Download PDF

Info

Publication number
HUP0104697A2
HUP0104697A2 HU0104697A HUP0104697A HUP0104697A2 HU P0104697 A2 HUP0104697 A2 HU P0104697A2 HU 0104697 A HU0104697 A HU 0104697A HU P0104697 A HUP0104697 A HU P0104697A HU P0104697 A2 HUP0104697 A2 HU P0104697A2
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
site
gene
viral
expression
replication
Prior art date
Application number
HU0104697A
Other languages
English (en)
Inventor
Narendra S. Yadav
Original Assignee
E.I. Du Pont De Nemours And Co.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by E.I. Du Pont De Nemours And Co. filed Critical E.I. Du Pont De Nemours And Co.
Publication of HUP0104697A2 publication Critical patent/HUP0104697A2/hu
Publication of HUP0104697A3 publication Critical patent/HUP0104697A3/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8203—Virus mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8217—Gene switch
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8237—Externally regulated expression systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8237—Externally regulated expression systems
    • C12N15/8238—Externally regulated expression systems chemically inducible, e.g. tetracycline
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/12011—Geminiviridae
    • C12N2750/12022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

A találmány tárgyát képezi kétkomponensű, transzgenikus expressziósrendszer, amelynek mindkét komponense kromoszomálisan integrált ésfüggetlenül öröklődik. Az egyik komponens egy inaktív replikon, amelyepiszomálisan nem képes replikálódni addig, amíg távolra ható módonnem biztosítanak egy távolra ható módon aktiváló fehérjét. A másikkomponens egy kiméra, távolra ható módon aktiváló gén, amelyben egytávolra ható módon aktiváló fehérje kódolószekvenciáját szabályozottpromoterhez kapcsolják, működőképesen. A távolra ható módon aktiválófehérje víruseredetű replikációs fehérje vagy helyspecifikusrekombinációs fehérje. Az expressziós rendszer feltételes, episzomálisreplikációra, transzgénexpresszióra, vírus által kiváltottgénelfojtásra és vírusrezisztencia kialakítására alkalmazható. Atalálmány tárgyát képezik továbbá eljárások a találmány szerintiexpressziós rendszerek alkalmazására idegen fehérjék magasabb szintűtermelésére és vírusrezisztencia biztosítására. Ó

Description

Képviselő:
Danubia
Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft.
Budapest
Bináris, viruseredetű expressziós rendszer növényekben
A találmány tárgya a molekuláris biológia és növényeknek idegen génfragmensekkel történő genetikai transzformációja területére tartozik. Közelebbről a találmány tárgyát képezi növényekben transzgének feltételes expressziójára szolgáló bináris expressziós rendszer. A találmány tárgyát képezik továbbá eljárások a találmány szerinti expressziós rendszerek alkalmazására idegen fehérjék expressziós szintjének megváltoztatására, génelfojtásra vagy virusrezisztencia kialakítására.
A transzgénikus növényeknél két komoly technikai probléma áll fenn. Az egyik az, hogy a növényi transzgénexpresszió csak alacsony és nem megbízható szintet biztosít. Ez a gyenge expressziós szint részben a véletlenszerű kromoszómális integrációnak (pozícióhatásnak) tulajdonítható és részben annak, hogy az expresszió nem függ a génkópiaszámtól. Az episzómális vektoroktól várják ezeknek a problémáknak a legyőzését. A növényekkel ellentétben a mikrobáknál magas szintű expresszió érhető el episzómális
Aktaszámunk: 93950-7450E/SG (plazmid) vektorokkal, mivel ezek a vektorok szelekcióval fenntarthatok. Episzómális expressziós vektorokként növényi vírusokat is alkalmaznak, ezek alkalmazása azonban a szelekció hiánya és/vagy sejtes toxicitásuk miatt az átmeneti expresszióra szorítkozik (US 4.855.237, WO 9534668).
A másik probléma az, hogy a transzgének nem specifikus expressziója a nem kívánt sejtekben és szövetekben akadályozza a növényi transzgénikus expressziót. Ez akkor fontos, ha az a cél, hogy fitotoxikus anyagokat magas szinten állítsunk elő transzgénikus növényekben. A feltételes transzgénexpresszió a kívánt vegyi anyagok, monomerek és polimerek gazdaságos előállítását teszi lehetővé azon a szinten, amely valószínűleg fitotoxikus hatású a fejlődő növény számára, oly módon, hogy a termelődésüket a transzgénikus növények produkciós szöveteire korlátozza akár közvetlenül a betakarítás előtt, akár utána. Növényekben a transzgénexpresszió fejlesztését továbbra is korlátozza tehát mind a kereskedelmileg alkalmazható, feltételes expressziós rendszer hiánya, mind pedig a megbízhatóan magas szintű expresszió elérésének nehézsége.
Növényi vírusok
A vírusok viszonylag egyszerű szerveződésű és egyedülálló módon replikálódó, fertőző ágensek. Egy adott növényi vírus akár RNS-t, akár DNS-t tartalmazhat, és egyszálú vagy kettős szálú lehet.
Növényi RNS-vírusok
Növényi, kettős szálú RNS-vírusok például rizstörpülés vírusa (RDV, rice dwarf virus) és sebtumor-vírus (WTV, wound tumor virus). Növényi, egyszálú RNS-vírusok dohánymozaik-vírus (TMV, tobacco mosaic virus), burgonyaX-vírus (PVX, potato virus X), tarlórépamozaik-vírus (TYMV, turnip yellow mosaic virus), rizsnekrózis-vírus (RNV, rice necrosis virus) és rozsnokmozaik-vírus (BMV, brome mosaic virus). Az egyszálú RNS-vírusokban lévő RNS akár plusz (+), akár mínusz (-) szál lehet.
Sok növényi vírusnak van RNS-genomja, azonban a genetikai információ szerveződése eltér a különböző csoportok között [a fő csoportokat egyrészesként, kétrészesként vagy három részesként („monopartite, „bipartite és „tripartite) jelölik]. A legtöbb egyrészes növényi RNSvírus genomja (+)-szensz, egyszálú molekula. Legalább 11, ilyen genomtípusú, fő víruscsoport létezik. Ilyen vírusok például a TMV és a PVX. A növényi RNS-vírusok legalább hat fő csoportjának kétrészes a genomja. Ezekben a genom általában két különböző, (+)-szensz, egyszálú RNS-molekulából áll, amelyek elkülönülő részecskékbe vannak zárva. Mindkét RNS szükséges a fertőzőképességhez. A tehénborsómozaikvírus példa (CPMV, cowpea mosaic virus) a kétrészes, növényi vírusokra. A növényi vírusok legalább hat fő típusát tartalmazó, harmadik nagy csoport a három részes növényi vírusok, amelyekben három (+)-szensz, egyszálú RNS-molekula található. Mindegyik szál egymástól külön zárva helyezkedik el, és mind a három szükséges a fertőzőképességhez. A három részes növényi vírusok egyik példája a lucernamozaik-vírus (AMV, alfalfa mosaic virus). Sok növényi vírusnál kisebb, szubgenomi mRNS-ek találhatók, amelyek egy konkrét géntermék amplifikálása érdekében szintetizálódnak.
Növényi DNS-vírusok
Kettős szálú DNS-genomot tartalmazó, növényi vírus például a karfiolmozaik-vírus (CaMV, Cauliflower Mosaic virus)»
Egyszálú DNS-genomú, növényi vírusok például a geminivírusok, konkrétabban az afrikai cassavamozaik-vírus (ACMV, African Cassava Mosaic Virus), a paradicsom aranymozaik-vírusa (TGMV, Tomato Golden Mosaic Virus) és kukoricacsikosság-vírus (MSV, Maize Streak Virus). A geminivírusok tovább oszthatók azon az alapon, hogy egyszikűeket vagy kétszikűeket fertőznek-e, és hogy a rovarvektoruk sáska vagy molytetű. A geminivírusok I. alcsoportját sáska közvetíti, és egyszikű növényeket fertőz (pl. búzatörpülésvírus, Wheet Dwarf Virus), a geminivírusok II. alcsoportját sáska közvetíti, és kétszikű növényeket fertőz (pl. répa levélcsúcs-fodrosodást okozó vírusa Beet Curly Top Vírus), a geminivírusok III. alcsoportját molytetű közvetíti és kétszikű növényeket fertőz (pl. paradicsom aranymozaik-vírusa, TGMV és afrikai cassavamozaik-vírus, ACMV).
A geminivírusok I. és II. alcsoportjának egyetlen (egyrészes) genomja van. A geminivírusok III. alcsoportjának kétrészes a genomja. Például a geminivírusok III. alcsoportjába tartozó TGMV és ACMV két, cirkuláris, egyszálú
DNS-genomból áll, a körülbelül 2,8-2,8 kB nagyságú A- és B genomból. Egy adott III. alcsoportba tartozó A-DNS és B-DNS között kicsi a szekvenciahasonlóság egy csaknem azonos, körülbelül 200 bp nagyságú, közös szakasztól eltekintve. Mind az A-DNS, mind a B-DNS szükséges a fertőzéshez, azonban csak az A-DNS szükséges (és elégséges is) a replikációhoz, a B-DNS által kódolt funkciók pedig a vírusnak a fertőzött növényben történő mozgásához szükségesek.
Mind a TGMV, mind az ACMV vírusokban az A-DNS négy nyitott leolvasási keretet (ORF) tartalmaz, amelyek két irányban expresszálódnak és hasonló módon vannak elrendezve. Az ORF-eket a közös szakaszhoz viszonyított elhelyezkedésük szerint nevezik, azaz ACMV-ben komplementer (C, complementer) a virálissal (V) szemben, míg TGMV-ben baloldali (L, leftward) vagy jobboldali (R, rightward). A TGMV ALI-, AL2-, AL3- és ARl-ORF-jei homológok az ACMV AC1-, AC2-, AC3- és AV1-ORF-jeivel. Az ACMV A-DNS-ében három fő transzkriptumot azonosítottak, és ezek az AVI- és ACl-ORF-ekre külön-külön és az AC2/AC3-ORF-ekre együtt térképezhetek. Ezeknek az ORF-eknek a működésére kísérletes bizonyítékok vannak. Az ACMV-ben lévő AC1 egy replikációs fehérjét kódol, amely a replikációhoz alapvetően fontos és elegendő, az AC2 a köpenyfehérjegén távolra ható módon történő aktiválásához szükséges, az AC3 egy, a replikációhoz nem alapvetően fontos fehérjét kódol, amely azonban a vírus-DNS felhalmozódását fokozza, az AVI pedig a köpenyfehér jegén. A létfontosságú, víruseredetű replikációs fe hérje kivételével (amelyet ACMV-ben az AC1 és TGMV-ben az ALI kódol) a geminivírus replikációja a gazda replikációs és transzkripciós mechanizmusára támaszkodik. Habár a geminivirusok egyszálú, növényi DNS-vírusok, kettős szálú DNS-intermedieren keresztül replikálódnak guruló kör („rolling circle) replikációval.
Az AC2-t kódoló szekvencia hozzájárulását, ha az ACMV genomi környezetéből eltávolítjuk, és egy burgonya Xvirusán (PVX) alapuló vektorból expresszáljuk, Hong és munkatársai vizsgálták [Hong és mtsai., Transactivation of dianthin transgene expression by African cassava mosaic virus AC2, Virology 228 (2), 383-387 (1997)]. A PVXvektornak növényekben AC2-fehérje expresszálására történő alkalmazása során azt tapasztalták, hogy az AC2-expresszió nekrózist válthat ki transzgénikus növényekben.
Mind az A-DNS, mind a B-DNS szükséges a fertőzéshez, azonban csak az A-DNS szükséges és elegendő a replikációhoz, és a B-DNS által kódolt működések a vírusnak a fertőzött növényeken keresztül történő mozgásához szükségesek. Ezt részletesebben Hayes és munkatársai vizsgálták [Hayes és mtsai., Replication of tomato golden mosaic virus DNA B in transgenic plants expressing open reading frames ORFs of DNA A - Requirement of ORF AL2 for production of single-stranded DNA, Nucleic Acids Res. 17(24) , 10213-10222 (1989)]. Kiderült, hogy a TGMV AL1-ORFre transzgénikus növények támogatják a B-DNS kettős szálú formáinak replikációját, de ezen kívül az AL2-ORF is szük séges az egyszálú B-DNS előállításához.
Vírusok, mint expressziós vektorok
Növényi vírusok készítését nem víruseredetű, idegen gének növényekbe történő bevitelére és expresszálására már leírták [US 4.855.237 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat, WO 9534668 számú nemzetközi közzétételi irat). Ha a vírus DNS-vírus, a készítmények magával a vírussal készíthetők. Egy másik lehetőségként a vírus először egy bakteriális plazmidba klónozható a kívánt vírusvektor idegen DNS-sel történő elkészítésének megkönnyítése érdekében. Ha a vírus RNS-vírus, a vírust általában cDNS-ként klónozzuk és egy plazmidba inszertáljuk. A plazmid-DNS alkalmazható azután minden konstrukció készítésére. Az RNSvírus azután a plazmid víruseredetű szekvenciájának átírásával és a vírusgének transzlációjával állítható elő, hogy a vírus-RNS-t burkoló köpenyfehérjé(ke)t előállítsuk. Az RNS-vírusgenom cDNS-e heterológ növényi promoter mögé klónozható. Egy ilyen kiméra gén, úgynevezett amplikon növényi sejtbe juttatható és a vírus-RNS átírására alkalmazható, amely autonóm módon replikálódhat [Sablowski és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 6901-6905 (1995)].
A geminivírusoknak lehetséges növényi expressziós vektorokként számos előnyük van. Például: 1) nagy kópiaszámig replikálódnak, 2) kicsi, jól jellemzett genomjuk van, 3) nukleoszómákba szerveződnek, és 4) magi replikációs és transzkripciós mechanizmusuk van. Ezen vírusok A-DNSkomponense növényi sejtekben autonóm replikációra képes a B-DNS hiányában. Kifejlesztettek olyan vektorokat, amelyekben a köpenyfehérje-ORF-et heterológ, kódoló szekvenciával helyettesítették, és a heterológ kódoló szekvenciát a köpenyfehér je-promóterről expresszálták [Hayes és mtsai., Stability and expression of bacterial genes in replicating geminivirus vectors in plants, Nucleic Acids Res. 17, 2391-403 (1989); Hayes és mtsai., Gene amplification and expression in plants by a replicating geminivirus vector, Nature (London) 334, 179-82 (1988)].
Az érdeklődés tárgyát képező nukleinsavfragmens ellenőrzött expressziójára szolgáló, geminivíruson alapuló vektorrendszerről már beszámoltak (WO9419477). Ezzel a vektorrendszerrel olyan transzformált növények állíthatók elő, amelyeknek sejtjei, szövetei vagy részei megváltozott genotípust mutatnak és/vagy megváltozott fenotípusú tulajdonságokat expresszálnak. Transzfektált növényi sejt a növényi sejtnek a rekombináns geminivírus-transzfervektorral történő kapcsolatba hozásával állítható elő.
Transzgénexpresszió kiváltására korlátozott mértékben fejlesztettek ki eljárásokat. A WO9525801 számú nemzetközi közzétételi iratban kitanítást közölnek egy vírusreplikonra, amelynek konstrukciója lehetővé teszi, hogy a replikon egy vírus vagy víruseredetű komponensek hiányában ne legyen kódoló. Egy vírus vagy víruseredetű komponensek jelenlétében viszont a replikon víruseredetű replikáz által aktiválódik, amely a nem kódoló, negatív-szensz DNS-t pozitív-szensz RNS-é alakítja, ezáltal lehetővé teszi a gén(ek) expresszióját. Továbbá, ahogy a vírusreplikáció fokozódik, a rezisztenciaválasz is növekszik.
A vad típusú TGMV A- és B-genomok teljes hosszúságú kópiáinál nagyobb DNS-sel transzformáltak petúniát [Rogers és mtsai., Tomato golden mosaic virus A component DNA replicates autonomously in transgenic plants, Cell (Cambridge, Mass.) 45, 593-600 (1986)]. Replikációról beszámoltak az elsődleges transzformánsokban, és az önmegtermékenyített utódok némelyikében a mendeli öröklődéssel összhangban, amely jelzi, hogy a kromoszómálisan integrálódott mesterkópia és nem a replikon öröklődik. Ez azt mutatja, hogy gametofita és/vagy fejlődő magszövetekben hiányzik a képesség a replikáció támogatására. A közleményben nem számolnak be arról, hogy vajon a vírus replikálódik-e nem csírázó magszövetben. A technikában korábban kimutatták, hogy a geminivírusok a természetben nem magon keresztül közvetítődnek [Goodman, R. M., Geminivirus, J. Gén. Virol. 54, 9-21 (1981)]. így nincs arra bizonyíték, hogy gametofita szövetben és fejlődő magban replikálódni tudnak.
Paradicsom aranymozaik-vírusának (TGMV) A-DNS-ét a köpenyfehérje kódoló szekvenciájának NPTII- vagy GUSriportergén vagy 35S:NPTII-gén kódoló szekvenciájával történő helyettesítésével módosították, és a módosított vírusok teljes hosszúságú kópiájánál nagyobb DNS-sel transzformáltak dohánynövényt [Hayes és mtsai., Stability and expression of bacterial genes in replicating geminivirus vectors in plants, Nucleic Acids Res. 17, 2391-403 (1989); Hayes és mtsai., Gene amplification and expression in plants by a replicating geminivirus vector, Nature (Lon don) 334, 179-82 (1988)]. A transzgénikus növények levelei ben a riporterenzimek magas szintje a génkópiaszámtól függött. A magokban azonban a vektor replikációjáról és a riportergén expressziójáról nem számoltak be, és a transzgénikus növényekben az egymást követő generációkban a vektor genetikai stabilitásáról sem számoltak be. Az afrikai cassavamozaik-virus (ACMV) hasonló módon történő alkalmazásáról nem jelent meg közlemény, és az sem ismert, hogy ACMV-DNS vagy a replikációs fehérje/fehérjék stabilan fenntarthatók-e az utódnövényekben, és hogy vajon replikálódnak-e magszövetekben.
Egy közlemény szerint egy kiméra gént (amelyben a konstitutív növényi promótert, a 35S-t az ALI-, AL2- és AL3-0RF-eket tartalmazó TGMV-szekvenciával fuzionálták) Nicotiana benthamianába transzformáltak. A különböző transzgénikus vonalak szignifikánsan különböztek a 35S:AL13 génexpresszió szintjében, valamint abban a képességükben, hogy kiegészítsék a vírusreplikációt [Hanley-Bowdoin és mtsai., Functional expression of the leftward open reading frames of the A component of tomato golden mosaic virus in transgenic tobacco plants, Plant Cell 1, 1057-67 (1989)]. Egy másik közlemény szerint kiméra géneket (amelyekben a konstitutív növényi promótert, a 35S-t TGMV ALI replikációs fehérje kódoló szekvenciájával fuzionálták) transzformáltak dohánynövénybe. Az elsődleges transzformánsokban a TGMV replikációs fehérje expressziója segítette a replikációs fehérjében hiányos, mutáns A-genom replikációját. [HanleyBowdoin és mtsai., Expression of functional replication protein from tomato golden mosaic virus in transgenic · « ♦ · * <* * tobacco plants, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1446-50 (1990)]. Egyik publikációban sem számoltak be a kiméra replikációs fehérjegén genetikai stabilitásáról az egymást követő generációkban, sem pedig arról a képességükről, hogy támogatják-e a virusreplikációt magszövetben. Egy másik közlemény szerint kiméra géneket (amelyekben a konstitutív növényi promotert a 35S-et külön-külön TGMV ALI, AL2 és AL3 replikációs fehérjék kódoló szekvenciáihoz fuzionálták) dohánynövénybe transzformáltak [Hayes és mtsai., Replication of tomato golden mosaic virus DNA B in transgenic plants expressing open reading frames (ORFs) of DNA A: requirement of ORF AL2 for production of single-stranded DNA, Nucleic Acids Res. 17, 10213-22 (1989)]. A TGMV replikációs fehérjét expresszálták az utódokban, de a kiméra replikációs fehérjegén genetikai stabilitásáról az egymást követő generációkban nem számoltak be. Továbbá arról sem közöltek adatokat, hogy a transzgénikus növények támogatják-e a replikációt a magszövetben.
Egy másik kitanításban Rogers és munkatársai (EP 221044) idegen fehérjék expresszióját mutatták ki növényi szövetben a TGMV geminivírus módosított A-genomjának alkalmazásával. Az idegen gént a vírus köpenyfehérjéjét kódoló gén helyére építették be, és a képződő plazmidot transzformálták növényi szövetbe. Rogers és munkatársai nem számoltak be az idegen fehérje szövetspecifikus expressziójáról, valamint a transzformáló plazmid genetikai stabilitásáról sem írnak.
Az összes ismertetett vírusvektornak van hátránya. Vagy nem mutatták ki róluk, hogy stabilan fennmaradnak a transzgénikus növényekben vagy nem alkalmazhatók a gyakorlatban, vagy mindkettő fennáll. A növényi, víruseredetű vektorok és vírusok kifejlesztése érdekében tett hatalmas erőfeszítések ellenére tehát kereskedelmileg alkalmas, növényi, vírusalapú rekombináns vektorokat még nem fejlesztettek ki, amelyek örökíthetők és episzómális replikációra és a transzgénikus gazdanövény kívánt szöveteiben expresszióra képesek anélkül, hogy minden generációban újra kellene fertőzni. Például, ha TGMV A-genomja teljes hosszúságú kópiájánál nagyobbat viszünk be növényi sejtbe, akkor tizedannyi transzgénikus növényt nyerünk, mintha B-genomot alkalmazunk, vagy kontroll transzformációkat végzünk [Rodgers és mtsai., Tomato golden mosaic virus A component DNA replicates autonomously in transgenic plants, Cell (Cambridge, MA) 45, 593-600 (1986)]. A szerzők szerint ez TGMV A-DNS-ében lévő egyik gén expressziójának tulajdonítható. Mind TGMV A-, mind TGMV B-genomok tandem kópiáit expresszáló növények nyers kivonata nem képes Nicotians benthsmiana növényeket fertőzni. Ez egybevág az alacsony vírustiterekkel. A regenerálódó transzgénikus növényeket tehát a toxikus, víruseredetű géntermék alacsony expressziós szintje és a vírusreplikáció alacsony szintje alapján ki lehetett válogatni, vagy a gazda elfojtja (elnémítja) a gének expresszióját. Ez megegyezik a szerzők azon felismerésével, hogy viszonylag kevés sejt szabadít fel vírust, amely következtetés azon a megfigyelésen ala13 pul, hogy a szövetek többsége életképes és tünetmentes marad. Hasonló módon, más közleményekben leírt gyenge replikáció a 35S:replikációs fehérjét tartalmazó transzgénikus növényekben felveti, hogy a növények akár a replikációs fehérje gyenge expressziójára szelektálhatok (feltehetőleg a toxicitásuk miatt), akár azon az alapon, hogy a replikációs gén szövetspecifikus expressziós profilja különbözik a vírusreplikáció expressziós profiljától.
Jelenleg nem ismert olyan növényi, vírusalapú, rekombináns vektor, amely örökíthető és episzómális replikációra és a transzgénikus gazdanövény célszövetében/szöveteiben idegen fehérjék expressziójára képes anélkül, hogy minden generációban újra kellene fertőzni.
Vírusvektorok génelfojtásra történő alkalmazását már közölték [Covey, S. N. és mtsai., Nature (London) 385, 781782 (1997); Kumagai és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 92, 1679-1683 (1995); Kjemtrup, S. és mtsai., Plant J. 14, 91-100 (1998); Ratcliff, F. és mtsai., Science (Washington, DC) 27 6, 1558-1560 (1997); Ruiz, Μ. T. és mtsai., Plant Cell 10, 937-946 (1998); Baulcombe, D. C. és Angell, S. M. Virus amplicons for gene silencing in transgenic plants, WO 9836083 számú, nemzetközi közzétételi irat]. Az egyik közleményben azt a következtetést vonták le, hogy a replikálódó vírus-RNS a génelfojtás egy lehetséges kiváltója [Baulcombe, D. C. és Angell, S. M. Consistent gene silencing in transgenic plants expressing a replicating potato virus X RNA, EMBO .16(12) 3675-3684 (1997)]. Felve tették, hogy az amplikonközvetítette génelfojtás fontos, új stratégia lehet transzgénikus növényekben a génelfojtás állandó aktiválására.
Egy további vizsgálatban Pruss és munkatársai [Plant Cell 9, 959-868 (1997)] kitanítást közölnek arról, hogy dohány karcolatos vírus (TEV, tobacco etch virus) Pl/HC-Pro szekvenciája általános patogenitási erősítőként hat három különböző csoport, a potexvírus (PVX), a tobamovírus (TMV) és a cucumovírus (CMV) együttes fertőzése esetén. A kölcsönhatás mechanizmusa még nem teljesen tisztázott, az a tény azonban, hogy a Pl/HC-Pro-szekvencia expressziója megváltoztatja a betegségnek ezen nem rokon, heterológ vírusok által történő indukcióját, jelzi, hogy a vírusfertőzés egy közös lépésére hat. Az is ismert továbbá, hogy a HC-Pro központi doménje részt vesz potyvírusok RNS-replikációjában is.
Ezen közlemények ellenére, amelyekben vírusvektorokat alkalmaznak génelfojtásra, ezek transzgénikus növényekben történő alkalmazásáról feltételes vagy szabályozott, helyspecifikus rekombináció ellenőrzése alatt nem számoltak be idáig. Ilyen szabályozás hiányában az aktuális, víruseredetű génelfojtás állandóan működik. Ez káros lehet a növény számára, és a transzgénikus víruseredetű elfojtást a nem létfontosságú génekre korlátozza. Elfojtó szuppresszorgének alkalmazásáról transzgénikus gének elfojtásának legyőzésére már beszámoltak, de víruseredetű episzómákban lévő transzgének elfojtásának megakadályozására történő alkalmazásukról még nem számoltak be.
- 15 Idegen fehérje termelésére és/vagy génelfojtásra szolgáló transzgénikus vírusvektorok a fertőző virusvektoroktól abban különböznek, hogy nem igényelnek szisztémás mozgást. Konstitutívan expresszált, víruseredetű transzgének vírusrezisztenciára történő alkalmazásáról már beszámoltak. Ilyen transzgének feltételes expressziója, előnyösen replikon feltételes aktiválása - azaz a vírusfertőzés során - valószínűleg hatékonyabb ellenőrzést biztosít.
Feltételes vagy szabályozott expresszióról növényekben beszámoltak [lásd, De Veylder, L. és mtsai., Plant Cell Physiol. .38, 568-577 (1997); Gatz, C., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 89-108 (1997); Hansen, G. és mtsai., Mol. Gen. Genet. 254, 337-343 (1997); Jepson, I. és mtsai., WO 9706269 Al számú nemzetközi közzétételi irat (1997); Jepson, I., WO 9711189 A2 számú nemzetközi közzétételi irat (1997), és más hivatkozások ebben a bejelentésben] . Azonban ha sztringensen vizsgáljuk az alap, nem specifikus expressziót, nagyon kevés volt szigorúan specifikus. [Odell, J. T. és mtsai., Plant Physiol. 106, 447-458 (1994]; van dér Geest és mtsai., Plant Physiol. 109 (4), 1151-58 (1995); Ma és mtsai., Aust. J. Plant Physiol. 25(1), 53-59 (1998); Czako és mtsai., Mol. Gen. Genet. 235(1) , 33-40 (1992)]. Ilyen promóterek bizonyos alkalmazásokra nem megfelelőek, például új, fitotoxikus fehérjék expresszálására szolgáló transzgének alkalmazásánál, olyan enzimek expresszálására, amelyek fitotoxikus termékek bioszintéziséhez vezetnek és/vagy génelfojtásra szolgáló transzgének alkalmazásánál.
Dirks és munkatársai (WO 9828431 számú nemzetközi közzétételi irat) kitanitást közölnek egy Arabidopsis promóterre (AtDMCl), amely transzgénikus növényekben heterológ génszekvencia meiózisspecifikus expressziójára alkalmazható. A találmányuk további megvalósítási módjai lehetővé teszik bármilyen, nem kívánatos DNS-szekvencia eltávolítását transzgénikus növényben az első szexuális szaporodási ciklusban (Cre/lox-rendszer alkalmazásával) és egy citotoxikus gén meiózisspecifikus transzkripcióját és meiotikus sejthalált (apomiktikus magvak előállítására vagy apomiktikus mutánsok kimutatására). Ezek a kitanítások azonban annyiban korlátozottak, hogy a feltételes vagy szabályozott expresszió szükségszerűen meiózishoz kapcsolódik.
Növényekben helyspecifikus rekombinációról [Odell és mtsai., Plant Physiol. 106, 447-458 (1994); Odell és mtsai., WO 9109957 (1991); Surin és mtsai., WO 9737012 (1997); Dirks és mtsai., WO 9828431 (1998)] és Creközvetítette rekombináció eredményességének mutáns lox-Phelyekkel történő csökkentéséről és alkalmazásukról Cre-lox alapú integráció gyakoriságának növelésében már beszámoltak [Albert és mtsai., Plant J. 7, 649-59 (1995); Araki és mtsai., Nucleic Acids Res. 25, 868-872 (1997)]. A mutáns helyek alkalmazását a Cre-közvetítette rekombináció specifitásának növelésére kiméra Cre-génekkel kapcsolatban hozzáférhető, szabályozott promóterek ellenőrzése alatt még nem mutatták be. Ezek szerint tehát szükség van egy megfelelően sztringens, helyspecifikus rekombinációs rendszerre kereskedelmileg vonzó, feltételes, helyspecifikus rekombináció számára.
A következőkben röviden összefoglaljuk a találmányt.
A találmány tárgyát képezi bináris, transzgénikus, víruseredetű expressziós rendszer, amely a következőkből áll:
i) kromoszómálisan integrált, inaktív replikonból, amely a következőket tartalmazza:
a) a vírusreplikációhoz szükséges, közeire ható, víruseredetű elemeket,
b) legalább egy, megfelelő, szabályozó szekvenciát tartalmazó célgént, és
c) helyspecifikus rekombinázra érzékeny helyspecifikus szekvenciákat, és ii) kromoszómálisan integrált, kiméra, távolra ható módon aktiváló génből, amely szabályozott, növényi promoter! tartalmaz helyspecifikus rekombinázt kódoló szekvenciához működőképesen kapcsolva, ahol a kiméra, távolra ható módon aktiváló gén expressziója az inaktív replikont tartalmazó sejtekben helyspecifikus rekombinációt, a replikonreplikáció aktiválódását és a célgén fokozott expresszióját eredményezi.
A találmány tárgyát képezi továbbá geminivírusból vagy egyszálú RNS-vírusból származó, inaktív replikon.
A találmány szerinti megoldás részét képezi továbbá, hogy a szabályozott, növényi promoter lehet szövet specifikus, konstitutív vagy indukálható, és a vad típusú vagy mutáns, helyspecifikus szekvenciák helyspecifikus rekombinázra érzékenyek, a helyspecifikus szekvenciák lehetnek Cre-rekombináz fehérjére érzékeny lox-szekvenciák.
A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás növényben egy célgén által kódolt fehérje szintjének megváltoztatására, amely során (i) egy növényt a találmány szerinti, víruseredetű expressziós rendszerrel transzformálunk, és (ii) a transzformált növényi magot olyan körülmények között neveljük, amelynél a fehérje expresszálódik.
A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás növényben egy célgén által kódolt fehérje szintjének megváltoztatására, amely során:
(i) egy első növényt egy inaktív replikonnal transzformálunk, hogy egy első, elsődleges transzformánst kapjunk, az inaktív replikon a következőket tartalmazza:
a) vírusreplikációhoz szükséges, közeire ható, víruseredetű elemeket,
b) legalább egy, megfelelő, szabályozó szekvenciát tartalmazó célgént, és
c) helyspecifikus rekombinázra érzékeny helyspecifikus szekvenciákat, (ii) egy második növényt transzformálunk egy kiméra, távolra ható módon aktiváló génnel, hogy egy második, elsődleges transzformánst kapjunk, amely egy szabályozott, növényi promotert tartalmaz egy távolra ható módon aktiváló, helyspecifikus rekombinázt kódoló szekvenciához működőképesen kapcsolva, (ill) az első és második elsődleges transzformánsokat felneveljük, hogy mindkét magból utódokat nyerjünk, és (iv) keresztezzük az első és a második transzformánsok utódait, és így a célgén expresszálódik.
A találmány egy másik megvalósítási módja szerint eljárás növényben egy célgén által kódolt fehérje szintjének megváltoztatására, amely során:
(i) egy növényt egy inaktív replikonnal transzformálunk, az inaktív replikon a következőket tartalmazza:
a) vírusreplikációhoz szükséges, közeire ható, víruseredetű elemeket,
b) legalább egy, megfelelő, szabályozó szekvenciát tartalmazó célgént, és
c) helyspecifikus rekombinázra érzékeny helyspecifikus szekvenciákat, (ii) a transzformánst egy vírussal fertőzzük, amely egy szabályozott, növényi promoterhez működőképesen kapcsolt, távolra ható módon aktiváló, helyspecifikus rekombinázt kódoló szekvenciából álló, kiméra, távolra ható módon aktiváló gént tartalmaz, ahol a kiméra, távolra ható módon aktiváló gén expressziója az inaktív replikont tartalmazó sejtekben helyspecifikus rekombinációt, a replikonreplikáció aktiválódását és a célgén fokozott expresszióját eredményezi.
A találmány egy másik megvalósítási módja szerint bináris, transzgénikus, expressziós rendszer, amely egy inaktív transzgénből és kiméra, távolra ható módon aktiváló génből áll, az inaktív transzgén a következőket tartalmazza :
(i) közeire ható, transzkripciós szabályozó elemeket egy kódoló szekvenciához vagy funkcionális RNS-hez nem működőképesen kapcsolva, és (ii) helyspecifikus rekombinázra érzékeny helyspecifikus szekvenciákat, a kiméra, távolra ható módon aktiváló gén egy szabályozott, növényi promóterhez működőképesen kapcsolt távolra ható módon aktiváló, helyspecifikus rekombinázt kódoló szekvenciát tartalmaz, ahol a kiméra, távolra ható módon aktiváló gén expressziója helyspecifikus rekombináció révén az inaktív transzgént tartalmazó sejtekben a közeire ható, transzkripciós szabályozó elemeknek működőképesen a kódoló szekvenciához vagy funkcionális RNS-hez történő kapcsolódását, valamint a célgén fokozott expresszióját eredményezi.
A találmány egy másik megvalósítási módja szerint bináris, transzgénikus, expressziós rendszer, amely a következőket tartalmazza:
(i) helyspecifikus rekombinázra érzékeny helyspecifikus szekvenciákhoz kötött, kromoszómálisan integrált, gátló fragmenst, és (ii) kromoszómálisan integrált, inaktív, elfojtó, szuppresszor transzgént, ahol a helyspecifikus rekombináz expressziója hely specifikus rekombinációt eredményez, amely aktiválja az elfojtó, szuppresszor gént.
A találmány tárgyát képezi továbbá transzgénikus, víruseredetű, expressziós rendszer, amely a következőket tartalmazza :
(i) kromoszómálisan integrált, geminivírus-proreplikont, amely a következőkből áll:
a) vírusreplikációhoz szükséges, közeire ható, víruseredetű elemekből,
b) legalább egy, megfelelő, szabályozó szekvenciát tartalmazó célgénből, és
c) szegélyező szekvenciákból, amelyek lehetővé teszik az a) és b) pontok szerinti elemek kivágását, ahol a proreplikonban hiányzik egy funkcionális replikációs gén az episzómális replikációhoz, (ii) kromoszómálisan integrált, kiméra, távolra ható replikációs gént, amely egy szabályozott, növényi promótert tartalmaz működőképesen egy geminivíruseredetű, replikációs fehérjét kódoló szekvenciához kapcsolva, és (iii) a geminivirus B-genom dimerjét, ahol a távolra ható, replikációs gén expressziója a proreplikont tartalmazó sejtekben a proreplikon és a Bgenom replikációját és a célgén fokozott expresszióját eredményezi.
A találmány egy további tárgyát képezi transzgénikus, geminivíruseredetű expressziós rendszer, amely a következőket tartalmazza:
(i) kromoszómálisan integrált, inaktív replikon, amely a következőket tartalmazza:
a) vírusreplikációhoz szükséges, közeire ható, víruseredetű elemeket,
b) legalább egy, megfelelő, szabályozó szekvenciát tartalmazó célgént, és
c) helyspecifikus rekombinázra érzékeny helyspecifikus szekvenciákat, (ii) kromoszómálisan integrált, kiméra, távolra ható módon aktiváló gént, amely szabályozott, növényi promótert tartalmaz helyspecifikus rekombinázt kódoló szekvenciához működőképesen kapcsolva, (iii) geminivírus B-genomjának dimerjét, ahol a kiméra, távolra ható módon aktiváló gén expressziója az inaktív replikont tartalmazó sejtekben helyspecifikus rekombinációt, a replikon és a B-genom replikációjának aktiválódását és a célgén fokozott expresszióját eredményezi.
A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás vírusrezisztencia fokozására növényben, amely során (i) egy első növényt egy inaktív replikonnal transzformálunk, hogy egy első, elsődleges transzformánst kapjunk, az inaktív replikon a következőket tartalmazza:
a) vírusreplikációhoz szükséges, közeire ható, víruseredetű elemeket,
b) a fertőző vírussal homológ, homológiafüggő rezisztencia biztosítására képes vírusszekvenciákat,
c) helyspecifikus rekombinázra érzékeny hely specifikus szekvenciákat (ii) egy második növényt egy kimére, távolra ható módon aktiváló génnel transzformálunk, hogy második, elsődleges transzformánsokat kapjunk, amelyek szabályozott, növényi promótert tartalmaznak távolra ható módon aktiváló, helyspecifikus rekombinázt kódoló szekvenciához működőképesen kapcsolva, (iii) az első és második, elsődleges transzformánsokat felneveljük, hogy mindkét magból utódokat nyerjünk, és (iv) keresztezzük az első és második transzformánsokat, ahol a fertőző vírussal homológ vírusszekvenciák expresszálódnak, amely vírusrezisztenciát biztosít a növénynek .
Ά találmány transzgénikus növényekben ellenőrzött replikonreplikációra és transzgének expressziójára alkalmas replikonreplikációval vagy anélkül. A rendszer mindkét komponense kromoszómálisan integrált és függetlenül öröklődik. Az egyik komponens egy inaktív replikon, amely episzómálisan nem képes replikálódni, hacsak nem távolra ható módon biztosítunk egy távolra ható módon aktiváló fehérjét. A második komponens egy kiméra, távolra ható módon aktiváló gén, amelyben egy távolra ható módon aktiváló fehérje kódoló szekvenciáját szövet- vagy fejlődésspecifikus és/vagy indukálható promoter ellenőrzése alá helyezzük. A távolra ható módon aktiváló fehérje akár víruseredetű replikációs fehérje, akár helyspecifikus rekombinációs fehérje lehet. Ha ez víruseredetű replikációs fehér je/fehérjék, az inaktív replikon proreplikon típusú, amely t
ben funkcionális replikációs fehérje/fehérjék hiányoznak és episzómálisan nem képes replikálódni, hacsak nem a replikációs fehérjét/fehérjéket távolra ható módon biztosítjuk. Ha ez helyspecifikus rekombináz, az inaktív replikonban lévő rokon, helyspecifikus szekvenciákat érintő helyspecifikus rekombinációt eredményezhet, hogy az inaktív replikon aktívvá alakuljon, amely autonóm vagy közeire ható (cisz) replikációra képes. A replikont alkalmazó két rendszer egymástól függetlenül vagy kombinációban alkalmazható.
A helyspecifikus rekombinációs rendszer egy inaktív transzgén távolra ható módon történő aktiválására is alkalmazható episzómális replikációval vagy anélkül.
A találmány szerinti, különböző komponensek függetlenül örökíthetők és együtt vihetők be egy transzgénikus növénybe, vagy a különálló komponenseket hordozó, transzgénikus növények keresztezésével hozhatók össze, például azzal az eljárással, amellyel TopCross® magas olajtartalmú kukoricamag állítható elő (US 5.704.160). A találmány tárgyát képezik expressziós kazetták készítésére szolgáló eljárások és eljárások ezek alkalmazására, hogy megváltozott genotípusú és/vagy fenotípusú, transzgénikus, növényi sejteket állítsunk elő.
A következőkben az ábrákat és a szekvencialeírásokat ismertetjük.
Az 1. ábrán egy replikon kivágódását és expressziójának szabályozását mutatjuk be, valamint aktív transzgén előállítását helyspecifikus rekombinázra érzékeny helyspecifikus szekvenciákat tartalmazó, inaktív replikonból.
A 2. ábrán egy replikon kivágódását és expressziójának szabályozását mutatjuk be, valamint aktív transzgén előállítását helyspecifikus rekombinázra érzékeny helyspecifikus szekvenciákat tartalmazó, inaktív replikonból, ahol az egyik helyspecifikus szekvencia az 5' nem kódoló, átíródó szekvenciában van és a másik fordított orientációban van jelen a promóterben.
A 3. ábrán egy replikon kivágódását és expressziójának szabályozását mutatjuk be, amely replikon egy transzkripciós stopfragmenst tartalmaz helyspecifikus szekvenciák közé épülve, és így a replikációt helyspecifikus rekombináz közvetíti.
A 4. ábrán egy proreplikon kivágódását és aktiválását mutatjuk be egy kiméra, távolra ható, replikációs gén expressziója révén.
A következő szekvencialeírások és a mellékelt szekvencialisták a szabadalmi bejelentések kitanításainak nukleotid- és/vagy aminosavszekvenciáira vonatkozó szabályokkal, amelyek a 37 C.F.R. §1.821-1.825-ban találhatók (Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures - the Sequence Rules), a World Intellectual Property Organization (WIPO) Standard ST2.5 (1998) szabályaival, valamint az EPO és PCT szekvencialistákkal kapcsolatos követelményeivel összhangban vannak [5.2. és 49.5(a-bis) szabályok és a Kezelési Útmutató (Administration Instructions) 208. része és C-függeléke]. A szekvencialeírások a nukleotidszekvenciák egy betűs kódját és az aminosavak há rom betűs kódját alkalmazzák az IUPAC-IYUB standardokkal összhangban, amelyek ismertetése a Nucleic Acids Res. 13, 3021-3030 (1985) és a Biochemical Journal 219, 345-373 (1984) folyóiratokban található.
A bejelentésben megadott, 1-42 szekvenciák a génamplifikációknál alkalmazott láncinditóknak felelnek meg.
A következőkben részletesen ismertetjük a találmányt.
A találmány tárgyát képezi bináris, expressziós rendszer, amelynél növényi DNS- vagy RNS-virusok, szabályozott promoterek és/vagy helyspecifikus rekombinációs rendszerek különböző, genetikai elemeit alkalmazzuk. Az expressziós rendszer feltételes, episzómális replikációra, transzgénexpresszióra episzómális replikációval vagy anélkül, a gazda vírus által kiváltott génelfojtására és vírusrezisztenciára alkalmazható. Ilyen replikonok képesek lehetnek vagy nem lehetnek képesek sejtről sejtre történő mozgásra vagy szisztémás mozgásra.
Az ismertetett problémákat olyan eljárásokkal oldottuk meg, amelyekben két komponensű expressziós rendszert alkalmazunk, amelyeknek legalább egyike kromoszómáiisan integrált .
Egy másik eljárás szerint az expressziós rendszer egy inaktív replikont és egy szabályozott, kiméra, távolra ható módon aktiváló, helyspecifikus rekombinázgént tartalmaz. Az inaktív replikon vad típusú vagy mutáns, helyspecifikus rekombinációs szekvenciákból áll és nem képes replikálódni akár azért, mert nem tud kivágódni a kromoszómából (DNS replikon esetén) és/vagy azért, mert egy vagy több vírusgén nem írható át megfelelően (mind DNS-, mind RNSvírusamplikon esetében). A távolra ható módon aktiváló, helyspecifikus rekombináz helyspecifikus rekombinációt közvetít az inaktív replikonban vagy körülötte lévő, vad típusú és/vagy mutáns, helyspecifikus szekvenciák között, amely az inaktív replikont aktiválja és replikálódásra képessé teszi. Ilyen replikonok képesek lehetnek vagy nem lehetnek képesek sejtről sejtre történő mozgásra vagy szisztémás mozgásra. A helyspecifikus rekombináció tehát DNSátrendeződést okoz (kivágást vagy inverziót) a kromoszómában, amely akár DNS- vagy RNS-amplikon kivágódását és/vagy egy vagy több gén megfelelő transzkripcióját eredményezi, amely a replikon felszabadulásához és autonóm (azaz közeire ható, cisz} replikációjához vezet (1., 2. ábrák) . Az 1. ábrán mutatjuk be egy inaktív replikon vagy transzgén szabályozott, távolra ható módon történő aktiválásának vázlatát helyspecifikus rekombináció, például Crelox közvetítette DNS-kivágódással. Az üres háromszög a vad típusú vagy mutáns lox-P-helyet mutatja. Az A-DNS egy transzgén promótere és a C-DNS ORF/3’ nem transzlatálódó szakasza lehet vagy bármilyen más DNS. A B-DNS lehet egy replikon és/vagy egy transzkripciós stopfragmens. Ha a konstrukció a replikációs gén promótere (teli négyszög) és az ORF-je (üres négyszög) közé épült geminivírus-replikon, akkor a replikációs gén inaktív. Ha a replikon transzkripciós stopfragmensként is szolgál, a beépülése inaktiválja a transzgént, és helyspecifikus rekombináció esetén mind a replikációs, mind a kromoszómális transzgén génje aktiválódik, és ez utóbbi a replikon kivágódásának jelzője (riportere) lehet.
Hasonló módon, a 2. ábrán egy inaktív replikon (amplikon) távolra ható módon történő aktiválódásának vázlatát mutatjuk be helyspecifikus rekombináció, például Crelox közvetítette DNS-inverzió révén. A lox-szekvenciákat nyilakkal jelöljük az amplikon felett. Az üres nyíl jelöli a replikont. A replikonban lévő nyitott leolvasási kereteket az amplikon alatti nyilakkal jelöljük. A TATA és TSS jelölések a TATA-boxot, illetve a transzkripciós starthelyét (transcription start site) jelölik a növényi promoter számára. Az ATAT és SST a TATA-illetve TSS-helyek fordított sorrendben. Az Ml, M2 és M3 a három mozgási fehérje, az RdRP az RNS-függő RNS-polimeráz, a CP a köpenyfehérje (coat protein) és a háromszögek a megkettőzött CPpromóterek. A Pro' és a 3' poli-A a promótert és a 3' poliadenilációs szignált tartalmazó szakaszok.
Egy másik lehetőségként kifejlesztettünk egy eljárást inaktív transzgének távolra ható módon történő aktiválására az előzőekben ismertetett, helyspecifikus rekombinációs rendszerrel replikonok alkalmazása nélkül (3. ábra). A 3. ábrán egy inaktív replikon (amplikon) távolra ható módon történő aktiválását mutatjuk be transzkripciós stopfragmens helyspecifikus rekombináció, például Cre-lox közvetítette DNS-kivágódása révén. A transzkripciós stopfragmenst teli négyszöggel jelöljük. Az üres nyíl a replikont jelöli. A replikonban lévő nyitott leolvasási kereteket az amplikon alatt nyíllal jelöljük. A lox-szekvenciákat az amplikon felett nyíllal tüntetjük fel. A TATA és TSS jelölések a TATAbox és a transzkripciós start (iniciációs) hely a növényi promoter számára. Az Ml, az M2, az M3, az RdRP, a CP a köpenyfehérje, a Pro' és a 3' poli-A ugyanazok, mint a 2. ábrán .
Egy másik megvalósítási mód szerint az expressziós rendszer egy proreplikont és egy szabályozott, kiméra, távolra ható módon aktiváló, replikációs gént tartalmaz. A proreplikon tartalmazza a replikációhoz szükséges, közeire ható vírusszekvenciákat, de növényi sejtekben nem képes episzómális replikációra, mivel hiányzik belőle a replikációhoz alapvetően fontos, funkcionális replikációs gén(gének). A távolra ható módon aktiváló gén expresszálja a proreplikonból hiányzó, víruseredetű, replikációs fehérjét és távolra ható módon lehetővé teszi a proreplikon replikációját (4. ábra). A 4. ábrán mutatjuk be egy inaktív replikon (proreplikon) távolra ható módon történő aktiválásának vázlatos rajzát. Egy kromoszómáiisan integrált, kiméra, replikációs gén szabályozott expressziója a replikon replikatív felszabadulását és replikációját eredményezi a proreplikon kromoszómálisan integrált mesterkópiájából.
Az inaktív replikont tartalmazó növényi sejtek a replikont episzómálisan csak egy helyspecifikus rekombináz jelenlétében replikálják. Egy kiméra, helyspecifikus rekom binázgén szabályozott expressziója tehát ilyen sejtekben szabályozott replikonreplikációt és a célgén amplifikációját eredményezi. A találmány szerinti, egyedi elemek örökíthetek, a génexpressziós rendszer lehet örökölhető vagy olyan keresztezések utódaira korlátozódhat, amelyek genetikailag egyesítik ezt a két elemet. Néhány felhasználásnál a transzgén vagy a célgének expressziója a keresztezések utódaira korlátozódik, például a TopCross magas olaj tartalmú kukoricamag előállítására szolgáló eljárásnál.
A találmány szerinti rendszer alkalmazásával bemutatjuk, hogy (i) szójababmag és kukoricamag szövete támogatja geminivírus replikációját, (ii) az expressziós rendszer hat idegen gének expressziójára dohánynövényben, (iii) PVX-amplikonok replikálódhatnak fejlődő szójababmagban, és (iv) mind geminivírus, mind PVX-vírusok a cre-lox rekombinációs rendszerrel replikációra aktiválhatok. A találmány előrelépést jelent a technika állásához képest olyan növényi vírusvektorok kialakításával, (a) amelyek stabilan fennmaradnak transzgénikus növények kromoszómájában, (b) amelyeknek replikációját egy helyspecifikus rekombináz szabályozott expressziója ellenőrzi, és (c) amelyek olyan idegen fehérjéket kódoló nukleinsavszekvenciákat tartalmazhatnak, amelyek transzgénikus növényekben idegen fehérje termelése vagy a gazdanövény génjeinek elfojtása céljából expresszálhatók. A találmány előrelépést jelent a technika álládához képest transzgének feltételes, magas szintű expressziójára szolgáló eljárás kialakításával szabályozott, helyspecifikus rekombinációs rendszer alkalmazásával mutáns, helyspecifikus szekvenciák és helyspecifikus rekombináz szabályozott expressziójának alkalmazásával.
A leírás és a szabadalmi igénypontok teljesebb megértése kedvéért a következő kifejezéseket és meghatározásokat alkalmazzuk.
A gén kifejezésen mRNS-t, funkcionális RNS-t vagy specifikus fehérjét expresszáló nukleinsavfragmenst értünk, beleértve a szabályozó szekvenciákat. A natív gén kifejezésen egy gént értünk, ahogy a természetben található. A kiméra gén kifejezésen bármilyen olyan gént értünk, amely 1) a természetben együtt elő nem forduló DNS-szekvenciákat, például szabályozó és kódoló szekvenciákat tartalmaz vagy 2) fehérjék természetes módon kapcsolatban nem álló részeit kódoló szekvenciákat tartalmaz vagy 3) promóterek természetes módon kapcsolatban nem álló részeit tartalmazza. Ezek szerint egy kiméra gén tartalmazhat különböző forrásokból származó, szabályozó és kódoló szekvenciákat, vagy ugyanabból a forrásból származó, szabályozó és kódoló szekvenciákat, de a természetben megtalálható módtól eltérően elrendezve. A transzgén kifejezésen olyan gént értünk, amelyet transzformáció útján juttatunk be a genomba és stabilan fennmarad. Transzgének például a konkrét, transzformálandó növénnyel akár heterológ, akár homológ gének. A transzgének tartalmazhatnak továbbá natív géneket egy nem natív szervezetbe épülve vagy kiméra géneket. Az endogén gén kifeje zésen egy natív gént értünk természetes elhelyezkedésében egy szervezet genomjában.
A kódoló szekvencia kifejezésen olyan DNS- vagy RNS-szekvenciát értünk, amely egy konkrét aminosavszekvenciát kódol a nem kódoló szekvenciákat kizárva. A nyitott leolvasási keret (open reading frame) és ORF kifejezéseken egy kódoló szekvencia transzlációs iniciációs és terminációs kodonjai között kódolt aminosavszekvenciát értjük. Az iniciációs kodon és a terminációs kodon kifejezéseken a kódoló szekvenciában három szomszédos nukleotid (kodon) egységét értjük, amely a fehérjeszintézis (mRNS transzláció) kezdetét, illetve a láncbefejezést határozza meg.
A funkcionális RNS kifejezésen antiszensz RNS-t, ribozimot vagy más, nem transzlatálódó RNS-t értünk.
A szabályozó szekvenciák és megfelelő szabályozó szekvenciák kifejezések a kódoló szekvenciától 5'-irányban (5' nem kódoló szekvenciák), azon belül vagy 3'-irányban (3' nem kódoló szekvenciák) elhelyezkedő szekvenciákra vonatkoznak, amelyek befolyásolják a transzkripciót, az RNS érését vagy stabilitását vagy a kapcsolt, kódoló szekvencia transzlációját. Szabályozó szekvenciák például a serkentők, a promóterek, a transzlációs vezetőszekvenciák, az intronok és a poliadenilációs szignálszekvenciák. Ezek lehetnek természetes és szintetikus szekvenciák, valamint szintetikus és természetes szekvenciák kombinációja. Mint fent ismertettük, a megfelelő szabályozó szekvenciák nem korláto zódnak a promóterekre, azonban néhány, találmány szerinti megfelelő szabályozó szekvencia például, de nem kizárólag a konstitutív növényi promóterek, a növényi szövetspecifikus promóterek, a növényi fejlődésspecifikus promóterek, az indukálható növényi promóterek és a víruseredetű promóterek.
Az 5' nem kódoló szekvencia kifejezésen a kódoló szekvenciához képest 5’-irányban elhelyezkedő nukleotidszekvenciát értjük. A teljesen érett RNS-ben az iniciációs kodontól 5’-irányban helyezkedik el és az elsődleges transzkriptum mRNS-sé érésére, az mRNS stabilitására vagy a transzlációs hatékonyságra hat [Turner és mtsai., Molecular Biotechnology 225 (1995)].
A ”3' nem kódoló szekvencia kifejezésen a kódoló szekvenciához képest 3’-irányban elhelyezkedő nukleotidszekvenciákat értjük, és ide tartoznak a poliadenilációs szignálszekvenciák és más szekvenciák, amelyek az mRNS érésére vagy a génexpresszióra hatni képes szabályozó szignálokat kódolnak. A poliadenilációs szignálra általában az jellemző, hogy az mRNS-prekurzor 3'-végéhez poliadenilsavvéget kapcsol. Különböző 3' nem kódoló szekvenciák alkalmazására Ingelbrecht és munkatársai [Plant Cell 1., 671-680 (1989)] hoznak példákat.
A promoter kifejezésen a kódoló szekvenciájához képest általában 5'-irányban elhelyezkedő nukleotidszekvenciát értünk, amely a kódoló szekvencia expresszióját ellenőrzi az RNS-polimeráz és más, a megfelelő transzkripcióhoz szükséges tényezők felismerésével. Promoter például egy minimális promoter, amely TATA-boxból és más, a transzkripció iniciációs helyének meghatározására szolgáló szekvenciákból álló rövid DNS-szekvencia, amelyhez szabályozó elemek kapcsolódnak az expresszió ellenőrzése céljából. A promoter kifejezésen értjük továbbá azt a nukleotidszekvenciát, amely egy minimális promoter! tartalmaz olyan szabályozó elemekkel, amelyek a kódoló szekvencia vagy funkcionális RNS expressziójának ellenőrzésére képesek. Az ilyen típusú promóterszekvencia proximális és több disztális, 5’-irányban elhelyezkedő elemből áll, ez utóbbi elemeket gyakran serkentőknek nevezik. A serkentő („enhancer) ezek szerint olyan DNS-szekvencia, amely fokozhatja a promoter aktivitását, és lehet a promoter természetesen vele járó eleme vagy heterológ elem, amelyet a promoter szintjének vagy szövetspecifitásának fokozása érdekében építettek be. Mindkét orientációban képes működni [normál vagy kibillentett („flipped)], és akkor is képes működni, ha a promótertől akár 5'-irányba, akár 3'-irányba áthelyezzük. Mind a serkentők, mind más, 5'-irányban elhelyezkedő promóterelemek szekvenciaspecifikus DNS-kötő fehérjéket kötnek, amelyek a hatásukat közvetítik. A promóterek teljes egészükben származhatnak egy natív génből, vagy a természetben található, különböző promóterekből származó, különböző elemekből állhatnak, vagy szintetikus DNS-szegmenseket is tartalmazhatnak. A promoter tartalmazhat olyan DNS-szekvenciákat is, amelyek fiziológiai vagy fejlődési körülményekre reagálva a transzkripciós iniciáció hatékonyságát ellenőrző fehérjetényezők kötésében vesznek részt.
A konstitutív expresszió kifejezést konstitutív vagy szabályozott promótert alkalmazó expresszióra értjük. A feltételes és szabályozott expresszió kifejezéseket szabályozott promóterrel ellenőrzött expresszióra értjük.
A konstitutív promoter kifejezést olyan promóterekre értjük, amelyek minden szövetben minden időben irányítják a génexpressziót.
A szabályozott promoter kifejezést olyan promóterekre értjük, amelyek a génexpressziót nem konstitutívan, hanem időbeli és/vagy térbeli módon szabályozzák, ilyenek például mind a szövetspecifikus, mind az indukálható promóterek. Tartalmazhatnak természetes és szintetikus szekvenciákat, valamint szintetikus és természetes szekvenciák kombinációját. Különböző promóterek irányíthatják a génexpressziót különböző szövet- vagy sejttípusokban vagy különböző fejlődési állapotokban vagy különböző környezeti feltételekre válaszul. Növényi sejtekben alkalmazható, különböző típusú, új promótereket folyamatosan felismernek, számos példa található Okamuro és munkatársai összefoglalójában [Okamuro és mtsai., Biochemistry of Plants 15, 1-82 (1989)]. Mivel a legtöbb esetben a szabályozó szekvenciák pontos határai nincsenek tökéletesen meghatározva, különböző hosszúságú DNS-fragmenseknek azonos promóteraktivitása lehet. Növényekben alkalmazható, jellemző, szabályozott promóterek például, de nem kizárólag a védőszerrel indukálható promóterek, a tetraciklinnel indukálható rendszerekből származó promóterek, a szaliciláttal indukálható rendszerekből származó promóterek [Gatz, C., Curr. Opin.
Biotechnoi. 7(2), 168-72 (1996)], az alkohollal indukálható rendszerekből származó promóterek, a glükokortikoiddal indukálható rendszerekből származó promóterek, a patogén által indukálható rendszerekből származó promóterek és az ecdysommal indukálható rendszerekből származó promóterek [Martinez és mtsai., Inducible Gene Expression Plants, 2341 szerk. : Reynolds, Paul H. S., kiad.: CABI Publishing, Wallington, UK (1999); Thompson és mtsai., Mol. Cell. Biol. 12(3), 1043-53 (1992)].
A szövetspecifikus promoter kifejezést olyan szabályozott promóterekre értjük, amelyek nem expresszálódnak minden növényi sejtben, csak bizonyos szervek (például levelek vagy magok) egy vagy több sejttípusában, specifikus szövetekben (például embrió vagy sziklevél) vagy specifikus sejttípusokban (például levélparenchima vagy magi raktározó sejtek). Ide tartoznak az időbeli módon szabályozott promóterek, például amelyek a korai vagy a késői embriogenezis idején, a termésérés idején a fejlődő magokban vagy termésben, a teljesen differenciált levélben vagy az öregedés megindulása idején szabályoznak.
A nem specifikus expresszió kifejezésen konstitutív expressziót vagy egy szabályozott promóterből származó, nem kívánatos sejtekben vagy szövetekben történő, alacsony szintű, alap (ún. ’szivárgó’) expressziót értjük.
Az indukálható promoter kifejezést azokra a szabályozott promóterekre értjük, amelyek egy vagy több sejttípusban egy külső inger, például kémiai, fény, hormon, stressz vagy patogén hatására kapcsolhatók be.
A működőképesen kapcsolt kifejezést nukleinsavszekvenciáknak egyetlen nukleinsavfragmensen történő olyan kapcsolódását értjük, amelynél az egyik működése befolyásolja a másikét. Például egy promoter működőképesen kapcsolódik egy kódoló szekvenciához vagy funkcionális RNS-hez, ha hatni képes a kódoló szekvencia vagy funkcionális RNS expressziójára (azaz a kódoló szekvencia vagy a funkcionális RNS a promoter transzkripciós ellenőrzése alatt áll). A kódoló szekvenciák a szabályozó szekvenciákhoz szensz vagy antiszensz orientációban lehetnek kapcsolva.
Az expresszió kifejezésen a szensz (mRNS) vagy funkcionális RNS transzkripcióját és stabil felhalmozódását értjük. Az expresszió kifejezésen fehérje termelődését is értjük.
A megváltozott szint kifejezésen transzgénikus szervezetekben az expresszió azon szintjét értjük, amely különbözik a normál vagy nem transzformált szervezetekétől.
A fokozott mértékű expresszió (,overexpresszió') kifejezésen transzgénikus szervezetben az expresszió azon szintjét értjük, amely meghaladja a normál vagy nem transzformált szervezetekben történő expresszió szintjét.
Az antiszensz gátlás kifejezést egy endogén vagy transzgénből származó fehérje expressziójának gátlására képes, antiszensz RNS-transzkriptum termelődésére értjük.
A koszuppresszió vagy távolra ható kapcsolás („transwitch) kifejezéseken azonos vagy lényegében azonos transzgén vagy endogén gének expressziójának gátlására képes, szensz RNS-transzkriptumok termelődését értjük. (US ···: .··. .·· ···: .·· * · ··♦ · ··♦ - 38 5.231.020 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat).
A génelfojtás kifejezésen vírusgének, transzgének vagy endogén magi gének homológiafüggő szuppresszióját értjük. A génelfojtás lehet transzkripciós, ha a szuppresszió az érintett gén csökkent mértékű transzkripciójának köszönhető, vagy poszttranszkripciós, ha a szuppresszió az érintett génekkel homológ RNS-fajták fokozott mértékű anyagcseréjének (lebomlásának) köszönhető [lásd, English és mtsai., Plant Cell 8, 179-188 (1996)]. Génelfojtás például a vírus által kiváltott génelfojtás [lásd, Teresa Ruiz és mtsai., Plant Cell 10, 937-946 (1998)].
Az elfojtó szuppresszorgén kifejezést olyan génre értjük, amelynek expressziója hatástalanítja a génelfojtást és fokozza az elfojtott gének expresszióját. Elfojtó szuppresszorgének lehetnek növényi, nem növényi vagy víruseredetűek. Ilyenek például, de nem kizárólag a HC-Pro-, a Pl-HC-Pro- és a 2b-fehérjék. Hasonlóak a TGMV B-genomjában lévő egy vagy több gén.
A homológ valamivel kifejezésen két nukleinsavmolekula nukleotidszekvenciája vagy két fehérjemolekula aminosavszekvenciája közötti hasonlóságot értjük. A homológia mérése akár DNS-DNS, akár DNS-RNS hibridizációval végezhető sztringens körülmények között, amely a szakember számára jól ismert (lásd, Nucleic Acid Hybridisation, szerk.: Hames és Higgins, kiad.: IRL Press, Oxford, UK) vagy a két nukleinsav vagy fehérje közötti szekvenciahasonlóság összehasonlításával.
Az amplikon kifejezésen olyan kiméra gént értünk, amelyben egy RNS-virus cDNS-e működőképesen kapcsolódik növényi, szabályozó szekvenciákhoz oly módon, hogy az elsődleges transzkriptum az RNS-virus plusz szála.
A bináris, víruseredetű expressziós rendszer kifejezésen olyan két elemből álló expressziós rendszert értünk, amelynek legalább egyik eleme kromoszómáiisan integrált. Az első elem egy inaktív replikon, amely a célgént tartalmazhatja, amelynek expressziója kívánatos a növényben vagy a növényi sejtben. A második elem egy távolra ható módon aktiváló génhez működőképesen kapcsolt, szabályozott promóterből áll. Az első elem egy proreplikon vagy egy inaktív replikon lehet. Az együttműködő, inaktív replikon vagy proreplikon és a kiméra, távolra ható módon aktiváló gén szabályozott módon hat a replikonreplikációra és a célgén expressziójára a növényben. A rendszer mindkét eleme kromoszómáiisan integrált lehet és függetlenül öröklődhet. A távolra ható módon aktiváló gént irányító, szabályozott promoter stimulálása felszabadítja a replikont a kromoszómából és ezzel lehetővé teszi az episzómális replikációját. A felszabadulás történhet a replikonnak a kromoszómából történő fizikai kivágódásával (excízió) helyspecifikus rekombinációval, a proreplikon kromoszómális mesterkópiájából történő replikatív felszabadulással a replikációs fehérje jelenlétében, vagy transzkripciós felszabadulással egy amplikon kromoszómális mesterkópiájából.
···· ·· ·· ·* tt ·· * · · · 1 ·
- 40 - ’..’.l. %>%>%.*
A bináris, transzgénikus, víruseredetű, replikációs rendszer kifejezésen két kromoszómáiisan integrált elemből álló replikációs rendszert értünk. Az első elem egy proreplikon vagy egy inaktív replikon lehet, amelyben hiányzik egy idegen fehérjét kódoló célgén. A második elem egy helyspecifikus rekombinázgénhez működőképesen kapcsolt, szabályozott promóterből áll. Az együttműködő, inaktív replikon és a kiméra, helyspecifikus rekombinázgén szabályozott módon hat a replikonreplikációra a növényben. Ilyen rendszer akkor alkalmazható, ha a vírus replikációja szabályozott módon kívánatos, de idegen gén expresszióját nem akarjuk. A vírus szabályozott expressziója alkalmas lehet például növénynek vírusrezisztencia biztosítására.
A transzgénaktivációs rendszer kifejezésen egy inaktív transzgénből és egy kiméra, helyspecifikus rekombinázgénből álló expressziós rendszert értünk, amelyek együttműködve, szabályozott módon hatnak a transzgénexpresszióra. A rekombináció specifitása a szabályozott promóterek specifitásával határozható meg, valamint vad típusú vagy mutáns, helyspecifikus szekvenciák alkalmazásával. A rendszer mindkét eleme kromoszómálisan integrált lehet és függetlenül öröklődhet. Ilyen helyspecifikus szekvenciák a technika állása szerint jól ismertek, lásd például a Cre-lox-rendszert [Sauer, B., US 4.959.317), valamint az FLP/FRT helyspecifikus rekombinációs rendszert [Lyznik és mtsai., Nucleic Acids Res. 21(4), 969-75 (1993)].
· 4 4 tf f ♦ - 41 A célgén kifejezésen a replikonon lévő gént értjük, amely a kívánt, célzott, kódoló szekvenciát, funkcionális RNS-t vagy fehérjét expresszálja. A célgén nem alapvető fontosságú a replikonreplikációhoz. A célgének tartalmazhatnak továbbá natív, nem víruseredetű géneket nem natív szervezetbe építve vagy kiméra géneket, és megfelelő szabályozó szekvenciák ellenőrzése alatt állhatnak. A célgénben lévő szabályozó szekvenciák bármilyen forrásból származhatnak, például vírusból. A célgének a transzformálandó, konkrét növény génjeivel akár heterológ, akár homológ, kódoló szekvenciákat tartalmazhatnak. A célgének azonban nem tartalmaznak natív, víruseredetű géneket. Jellemző célgének például, de nem kizárólag olyan gének, amelyek egy szerkezeti fehérjét, magi raktározó fehérjét, gyomirtószerrezisztenciát biztosító fehérjét és rovarra rezisztenciát biztosító fehérjét kódolnak. A célgének által kódolt fehérjéket idegen fehérjéknek nevezzük. A növényben egy célgén expressziója általában megváltozott növényi jellemzőt hoz létre.
A megváltozott növényi jellemző kifejezés egy transzgénikus növényben bármilyen fenotípusos vagy genotípusos változást jelent a vad típusú vagy nem transzgénikus gazdanövényhez képest.
A transzkripciós stopfragmens kifejezésen olyan nukleotidszekvenciát értünk, amely egy vagy több olyan szabályozó szignált tartalmaz, például poliadenilációs szignálszekvenciákat, amelyek a transzkripciót befejezik. Ilyenek például a nopalin-szintázt kódoló gének 3' nem szabá’··:.··..·· ·<·!.♦·· • · ·♦· « ··» _ 42 - ··’♦ *”’ ’ ’* lyozó szakaszai és a ribulóz-bifoszfát-karboxiláz kis alegysége.
A transzlációs stopfragmens kifejezésen olyan nukleotidszekvenciákat értünk, amelyek egy vagy több olyan szabályozó szignált tartalmaznak, például egy vagy több terminációs kodont mind a három keretben, amelyek a transzlációt befejezik. Transzlációs stopfragmens beépítése a kódoló szekvencia 5’-végénél lévő iniciációs kodonnal szomszédosán vagy annak közelébe megakadályozza a transzlációt, vagy nem megfelelő transzlációt eredményez. A transzlációs stopfragmens helyspecifikus rekombinációval történő kivágása egy helyspecifikus szekvenciát hagy a kódoló szekvenciában, amely nem zavarja a megfelelő transzlációt az iniciációs kodon alkalmazásával.
A gátló fragmens kifejezésen helyspecifikus szekvenciákkal szegélyezett DNS-fragmenst értünk, amely gátolhatja a kódoló szekvencia transzkripcióját és/vagy megfelelő transzlációját, és így inaktív transzgént eredményez. Ha a gátló fragmens poliadenilációs szignálszekvenciákat és más, a transzkripció befejezésére képes, szabályozó szignálokat kódoló szekvenciákat tartalmaz, gátolhatja a kódoló szekvencia transzkripcióját, ha az 5' nem transzlatálódó szakaszba helyezzük, azaz a transzkripciós starthely és az ORF közé. A kódoló szekvenciába építve a gátló fragmens megakadályozhatja a megfelelő transzlációt a nyitott leolvasási keret elrontásával. Helyspecifikus rekombináció útján történő DNS-átrendeződés helyreállíthatja a transzkripciót és/vagy a megfelelő transzlatálhatóságot. A gátló ♦ « · *♦ ♦ ·«· — 4 3 — *· *♦♦♦ »·* *· * V fragmens helyspecifikus rekombinációval történő kivágása például egy helyspecifikus szekvenciát hagy hátra, amely lehetővé teszi a transzkripciót és/vagy a transzlatálhatóságot. A transzkripciós vagy transzlációs stopfragmens gátló fragmensnek tekinthető.
A közeire ható módon (cisz) és a távolra ható módon (transz) kifejezések DNS-elemeknek ugyanazon a DNSmolekulán, illetve különböző DNS-molekulákon történő jelenlétére vonatkoznak, például víruseredetű replikációs origóra és replikációs fehérjegénre.
A közeire ható szekvencia és a közeire ható elem kifejezéseken olyan DNS- vagy RNS-szekvenciát értünk, amelynek működéséhez szükséges, hogy ugyanazon a molekulán legyenek. A replikonon lévő, közeire ható szekvencia egyik példája a víruseredetű replikációs origó.
A távolra ható szekvencia és a távolra ható elem kifejezéseken olyan DNS- vagy RNS-szekvenciákat értünk, amelyeknek működéséhez nem szükséges, hogy ugyanazon a molekulán legyenek. Távolra ható szekvencia például a replikációs gén (az AC1 az ACMV-geminivírusban vagy az ALI a TGMV-geminivírusban), amely a replikációban közreműködhet anélkül, hogy a replikonon lenne.
A közeire ható, víruseredetű szekvenciák kifejezésen olyan vírusszekvenciákat értünk, amelyek szükségesek a vírusreplikációhoz (például a replikációs origó) és cisz helyzetben vannak.
.·· ·»·ι «*’ — 44 — **·* ·:*· *’·* **-* *«'
A távolra ható módon aktiváló gén kifejezésen egy távolra ható módon aktiváló fehérjét kódoló gént értünk. Víruseredetű replikációs fehérjét/fehérjéket vagy helyspecifikus replikázt kódolhat. Lehet természetes gén, például víruseredetű replikációs gén, vagy kiméra gén, például, ha a növényi szabályozó szekvenciák egy helyspecifikus rekombináz vagy egy víruseredetű replikációs fehérje nyitott leolvasási keretéhez kapcsolódnak működőképesen.
A távolra ható módon aktiváló gének lehetnek kromoszómálisan integráltak vagy átmenetileg expresszáltak.
Az episzóma és a replikon kifejezésen olyan DNSvagy RNS-vírust vagy vektort értünk, amely növényi sejtekben episzómálisan replikálódik. Tartalmazza a replikációhoz szükséges, közeire ható vírusszekvenciákat, például a replikációs origót. Tartalmazhat, de nem feltétlenül tartalmaz vírusreplikációhoz szükséges, távolra ható vírusszekvenciákat, például víruseredetű replikációs géneket (például az ACl-gént az ACMV-ben és az ALl-gént a TGMVben). Tartalmazhat, de nem feltétlenül tartalmaz célgént a gazdanövényben történő expresszióhoz.
Az inaktív replikon kifejezésen egy replikációban károsodott replikont értünk, amely replikációhoz szükséges, közeire ható vírusszekvenciákat tartalmaz, például replikációs origót, de a replikációban sérült, mert hiányzik egy, a replikációhoz szükséges, funkcionális vírusgén és/vagy az a képesség, hogy felszabaduljon a kromoszómából helyspecifikus rekombinációs szekvenciák részvételével történő DNS-átrendeződésnek köszönhetően. Következésképpen az *·. ···. *r»* ’-·* V inaktív replikon csak akkor replikálódhat episzómálisan, ha az alapvetően fontos replikációs fehérjét távolra ható módon biztosítjuk, mint a geminivírus-proreplikon esetében, vagy ha a nem működőképes replikációs gént helyspecifikus rekombinációval működőképessé tesszük az aktív replikonDNS-nek a kromoszómából történő felszabadulásával vagy anélkül. A replikonreplikáció aktiválása kifejezésen azt a folyamatot értjük, amikor az inaktív replikon episzómális replikációra aktívvá válik.
A floxed replikon kifejezésen olyan replikont értünk, amelyet tandem módon (azaz közvetlenül, ismételten) helyspecifikus szekvenciák szegélyeznek. A replikon egy DNS- vagy RNS-vírusamplikon teljes hosszúságú kópiája lehet. A replikon DNS-ként kerül kivágásra helyspecifikus rekombinációt követően.
Az episzómális replikáció és replikonreplikáció kifejezéseken kromoszómálisan nem integrált DNS- vagy RNSvírusok vagy víruseredetű replikonok replikációját értjük. A replikációhoz alapvető fontosságú, víruseredetű, replikációs fehérje/fehérjék jelenlétét igényli, független a kromoszómális replikációtól, és a gazdagenom kópiájához képest a vírus vagy proreplikonok többszörös kópiáinak termelődését eredményezi.
Az autonóm vagy közeire ható (cisz) replikáció kifejezéseken egy olyan replikon replikációját értjük, amely a replikációhoz szükséges minden közeire és távolra ható szekvenciát tartalmaz (például a replikációs gént).
— 46 — ···· **** J *“*
A replikációs origó kifejezésen a virus replikációjához vagy episzómális replikációhoz alapvetően fontos, közeire ható, replikációs szekvenciát értjük.
A proreplikon kifejezésen egy inaktív replikont értünk, amely a replikációhoz szükséges, közeire ható, víruseredetű szekvenciákból és a replikon felszabadulását lehetővé tevő szegélyező szekvenciákból áll. Bakteriális plazmidba vagy gazdanövény kromoszómájába integrált, és egy célgént tartalmazhat. A proreplikonban hiányzik a replikációhoz alapvetően fontos, replikációs fehérjét kódoló gén, ezért a replikációs fehérje hiányában nem képes episzómális replikációra. A replikációjához mind a beépülésből való felszabadulása, mind az alapvetően fontos replikációs gén távolra ható módon történő jelenléte szükséges. A beépülésből történő felszabadulás különböző módokon váltható ki. A proreplikon például részleges vagy teljes tandem duplikációban lehet jelen, például oly módon, hogy a teljes hosszúságú replikonszekvenciát vírusszekvenciák szegélyezik, és oly módon, hogy a megkettőzött vírusszekvencia tartalmazza a víruseredetű replikációs origót. Ebben az esetben a proreplikon mesterkópiaként szolgál, amelyből a replikonok replikációs felszabadulással kivágódhatnak replikációs fehérje/fehérjék jelenlétében [Bisaro, David, Recombination in geminiviruses: Mechanisms for maintaining genome size and generating genomic diversity, Homologous Recomb. Gene Silencing Plants, 219-70 szerk.: Paszkowski,
Jerzy, kiad.: Kluwer, Dordrecht, Germany (1994)]. Egy másik lehetőségként a proreplikon a szegélyező szekvenciái között — 47 — '-· ···· *♦'* történő helyspecifikus rekombinációval vágódhat ki megfelelő helyspecifikus rekombináz jelenlétében [ahogy a helyspecifikus rekombinációs rendszereknél, például a Crelox és az FLP/FRT rendszereknél ismertetik, Odell és mtsai., Use of site-specific recombination systems in plants, Homologous Recomb. Gene Silencing Plants, 219-70 szerk.: Paszkowski, Jerzy, kiad.: Kluwer, Dordrecht, Germany (1994)]. RNS-Virus proreplikonok esetében az inaktív replikont szegélyező szekvenciák, amelyek például szabályozó szekvenciák, lehetővé teszik a replikon RNStranszkriptumként történő előállítását, amely távolra ható módon képes replikálódni replikációs fehérje jelenlétében. Ezek a szabályozó szekvenciák konstitutív vagy szabályozott expresszióhoz valók lehetnek.
A víruseredetű replikációs fehérje és replikáz kifejezéseken vírusreplikációhoz alapvetően fontos vírusfehérjét értünk. Távolra ható módon biztosítható a replikonnak, hogy elősegítse a replikációját. Ilyenek például az ACMV-geminivírus ACl-génje és a TGMV-geminivírus ALl-génje által kódolt, víruseredetű replikációs fehérjék. Néhány vírusnak csak egy replikációs fehérjéje van, másoknak egynél több lehet.
A replikációs gén kifejezésen egy víruseredetű replikációs fehérjét kódoló gént értünk. A replikációs fehérje ORF-jén kívül a replikációs gén tartalmazhat más, átfedő vagy át nem fedő ORF-(ek)et, ahogy a természetben a vírusszekvenciákban találhatók. Ezek a további ORF-ek nem szükségesek a replikációhoz, azonban fokozhatják a repliká ciót és/vagy a vírus-DNS felhalmozódását. Ilyen további ORF-ek például az ACMV-geminivírusban lévő AC3 és a TGMVgeminivirusban lévő AL3.
A kiméra, távolra ható replikációs gén kifejezésen akár egy replikációs gént értünk, amelyben a replikációs fehérje kódoló szekvenciája egy szabályozott, növényi promoter ellenőrzése alatt áll, amely nem azonos a natív, víruseredetű replikációs génben lévővel, akár egy módosított, natív, víruseredetű replikációs gént értünk, például amelyben helyspecifikus szekvenciá(ka)t építünk az 5’ átíródó, de nem transzlatálódó szakaszba. Ilyen kiméra gének ismert replikációs fehérjekötő helyek inszercióit tartalmazhatják a promoter és a transzkripciós starthely között, amely gyengíti a víruseredetű replikációs fehérjegén transzkripciój át.
A kromoszómálisan integrált kifejezésen egy idegen génnek vagy DNS-konstrukciónak a gazda DNS-ébe kovalens kötésekkel történő beépülését értjük. Ha a gének nem kromoszómálisan integráltak átmenetileg expresszáltak lehetnek. A gén átmeneti expresszióján egy olyan gén expresszióját értjük, amely nem integrálódott a gazda kromoszómájába, de függetlenül működik akár egy autonóm módon replikálódó plazmid vagy expressziós kazetta részeként, akár egy másik biológiai rendszer, például vírus részeként.
A produkciós szövet kifejezésen nem osztódó, véglegesen differenciált sejtekből álló, érett, betakarítható szövetet értünk. Nem tartoznak ide a csíravonalsejtekből, merisztémasejtekből és nem teljesen differenciált sejtekből álló, fiatal, növekedő szövetek.
A csiravonalsejt kifejezésen azokat a sejteket értjük, amelyekből ivarsejtek lesznek, és amelyeknek genetikai anyaga örökölhető.
A távolra ható aktiválás kifejezésen a génexpresszió vagy a replikonreplikáció beindulását értjük egy másik (szabályozó) gén távolra ható expressziójának hatására .
A transzformáció kifejezésen egy idegen génnek a gazdaszervezet genomjába történő átvitelét értjük. Növényi transzformációs eljárások például az Agrobacterium közvetítette transzformáció [De Blaere és mtsai., Meth. Enzymol. 143, 277 (1987)] és a részecskegyorsítási vagy génágyú transzformációs technológia [Klein és mtsai., Nature (London) 327, 70-73 (1987); US 4.945.050)]. A transzformált, transzformáns és transzgénikus kifejezéseken a transzformációs folyamaton keresztülment növényeket vagy kalluszokat értjük, amelyek egy idegen gént tartalmaznak a kromoszómájukba beépülve. A nem transzformált kifejezésen normál növényeket értünk, amelyek nem mentek keresztül transzformációs folyamaton.
Az átmenetileg transzformált kifejezésen olyan sejteket értünk, amelyekbe transzgéneket és idegen DNS-t vittünk be (például Agrobacterium közvetítette transzformációval vagy biolisztikus bombázással), de stabil fennmaradásra nincsenek szelektálva.
A stabilan transzformált kifejezésen olyan sejteket értünk, amelyeket a transzformációt követően szelekciós tápközegen szelektáltunk és regeneráltunk.
Az átmeneti expresszió kifejezésen olyan sejtekben történő expressziót értünk, amelyekbe vírust vagy transzgént vírusfertőzéssel vagy más eljárásokkal, például Agrobacterium közvetítette transzformációval, elektroporációval vagy biolisztikus bombázással vittünk be, de a stabil fennmaradásukra nem szelektáltunk.
A genetikailag stabil és örökölhető kifejezéseken kromoszómáiisan integrált, genetikai elemeket értünk, amelyek stabilan fennmaradnak a növényben és az utódokban stabilan öröklődnek az egymást követő generációkban.
Az elsődleges transzformáns és TO-generáció kifejezéseken olyan transzgénikus növényeket értünk, amelyek ugyanabba a genetikai generációba tartoznak, mint a szövet, amelyet eredetileg transzformáltunk (azaz nem ment keresztül meiózison és megtermékenyítésen a transzformációt követően) .
A másodlagos transzformánsok és ΤΙ-, T2-, T3generációk, stb. kifejezéseken az elsődleges transzformánsokból egy vagy több meiotikus vagy megtermékenyítési cikluson keresztül származó, transzgénikus növényeket értjük. Származhatnak az elsődleges vagy másodlagos transzformánsok önmegtermékenyítéséből, vagy az elsődleges vagy másodlagos transzformánsoknak más, transzformált vagy nem transzformált növényekkel történő keresztezéséből.
A vad típus kifejezésen a normál, a természetben található gént, vírust vagy szervezetet értjük bármilyen ismert mutáció nélkül.
A genom kifejezésen egy szervezet teljes genetikai anyagát értjük.
A dimer kifejezésen, ha a geminivírus B-genomjára alkalmazzuk, a B-genom legalább egy részleges vagy teljes, tandem kópiáját értjük. A leírás szerinti értelemben a dimer kifejezésen tehát a geminivírus genomjának részleges vagy teljes, tandem dimerjét értjük, oly módon, hogy az egyetlen replikont közeire ható, a vírusreplikációhoz szükséges vírusszekvenciák, például a replikációs origó szegélyezik. Ezek a geminivírus dimerek mesterkópiaként szolgálhatnak, amelyekből a replikonok replikatív felszabadulással kivágódhatnak a replikációs fehérje távolra ható jelenlétében [Bisaro, David, Recombination in geminiviruses: Mechanisms for maintaining genome size and generating genomic diversity. Homologous Recomb. Gene Silencing Plants, 219-70 szerk.: Paszkowski, Jerzy, kiad.: Kluwer, Dordrecht, Germany (1994)].
A TopCross® magas olaj tartalmú kukoricamag eljárás kifejezésen egy széles körben alkalmazott eljárást értünk hibrid kukoricamagok előállítására szántóföldön, amelynek leírása például az US 5.704.160 számú amerikai egyesült ál lamokbeli szabadalmi iratban található.
A találmány tárgyát képezi kétkomponensű expressziós rendszer transzgénikus növényekben. Mindkét komponens kromoszómálisan integrált, és így önmagában stabilan fennmarad.
A találmány egyik megvalósítási módja szerint az egyik komponens helyspecifikus szekvenciá(ka) t tartalmazó, inaktív replikon, amely önmagában képtelen replikálódni. A második komponens egy kiméra, helyspecifikus rekombinázgén, amelyben a helyspecifikus rekombináz kódoló szekvenciája egy szabályozott promóterhez kapcsolódik működőképesen. A rekombináz expressziója megfelelő inger hatására rekombinációt eredményez az inaktív replikonban lévő vagy körülötte elhelyezkedő, rokon, vad típusú vagy mutáns, helyspecifikus szekvenciák között, amely aktiválja a replikon felszabadulását és/vagy a replikonreplikációt.
A találmány egy másik megvalósítási módja szerint az egyik komponens helyspecifikus szekvenciá(ka)t hordozó, inaktív transzgén és a második komponens egy kiméra, távolra ható módon aktiváló gén, amelyben egy helyspecifikus rekombináz kódoló szekvenciája egy szabályozott promóterhez kapcsolódik működőképesen. A rekombináz megfelelő inger hatására történő expressziója rekombinációt eredményez az inaktív transzgénben vagy körülötte lévő, rokon, vad típusú vagy mutáns, helyspecifikus szekvenciák között, amely aktiválja a transzgénexpressziót vírusreplikáció nélkül.
A replikonreplikációval és/vagy a transzgénexpresszióval tehát konkrét, növényi sejtek célozhatok meg replikációs fehérje/fehérjék vagy rekombináz expressziójának ezekre a sejtekre történő szabályozásával. A növények a sejtes toxicitásra és/vagy a replikonreplikáció káros hatására és/vagy a transzgén vagy a replikációs gén expressziójára a növény növekedésének és differenciálódásának korai szakaszaiban a legérzékenyebbek, amelyek sejtosztódást és differenciálódást érintenek. Ilyen expressziónak teljesen vagy nagymértékben nem osztódó, véglegesen differenciált sejtekre történő szabályozása csökkenti a replikonreplikáció káros hatását a növény növekedésére és fejlődésére. Ilyen véglegesen differenciált sejtek például a produkciós szövetben találhatók, például de nem kizárólag a mag és a gyökérszövetek raktározó sejtjei és az érett levélsejtek.
A találmány tárgyát képezi szabályozott, transzgénikus, expressziós rendszer. Mivel ennek a rendszernek a komponensei stabilan transzformáltak, a találmánnyal megoldjuk az episzómális instabilitás problémáját a sejtosztódások során, mivel az episzómák szelekció hiányában nem stabilak. Ha az inaktív replikonban vagy az inaktív transzgénben lévő helyspecifikus szekvenciák közötti rekombináció aktiválja a replikációját, illetve a transzgén expresszióját, a rendszer örökölhetővé válik, hacsak nem a helyspecifikus rekombináció csíravonalsejtekben lévő DNSkivágódást érint.
A replikon sejtautonómmá válik, ha a szükséges, víruseredetű mozgási fehérje/fehérjék nem expresszálódnak a sejtben. Ez történik geminivírus csak az A-DNS-ének alkalmazása esetén, vagy olyan PVX alkalmazásakor, amelyben mu táció történt egy mozgási fehérjében. A replikon szisztémásán sejtről sejtre terjed, ha a szükséges, víruseredetű mozgási fehérje/fehérjék is expresszálódnak a sejtben.
Különböző konstrukciókat tartalmazó, transzgénikus növények szövettenyészetben szelektálhatok és növénnyé regenerálhatok a szakember számára ismert, és az előzőekben említett eljárásokkal. A távolra ható módon aktiváló, kiméra, helyspecifikus rekombinázgénnek az a képessége, hogy aktiváljon egy, a növényi kromoszómában lévő, inaktív replikont helyspecifikus rekombináció útján a következő eljárások egyikével vizsgálható:
1. az inaktív replikont hordozó, transzgénikus növényt a Cre-gént hordozó vírusokkal fertőzzük,
2. keresztezzük a növényeket, amelyek közül az egyik a helyesen szabályozott, kiméra Cre-gént tartalmazza, a másik az inaktív replikont,
3. két Agrobacterium törzset készítünk, amelyek különböző, növényi szelekciós markerekkel ellátott, bináris vektorokat tartalmaznak, és az egyik egy kiméra Cre-gént tartalmaz egy megfelelően szabályozott promoter ellenőrzése alatt, és a másik az inaktív replikont tartalmazza. A két komponenst együtt juttatjuk a növényekbe kotranszformációval vagy egymást követő transzformációkkal.
A transzgénikus növényi szövetben a replikáció riportergén-expresszióval vagy a víruseredetű nukleinsavak Southern-blottal történő vizsgálatával követhető nyomon DNS-vírusok esetében és Northern-blottal RNS-vírusok eseté ben .
Helyspecifikus rekombináció transzgének feltételes expressziója érdekében
Fejlődés által szabályozott vagy kémiailag indukált promoterek feltételes transzgénexpresszió érdekében történő alkalmazását általában akár a teljesen bekapcsolt állapot nem megfelelő erőssége, akár a nem specifikus, alap (azaz szivárgó) expresszió korlátozza, az alkalmazástól függően.
A feltételes expressziónak mind a szintje, mind a specifitása növelhető az érdeklődés tárgyát képező gén kódoló szekvenciájának egy erős, konstitutív vagy szabályozott promoter ellenőrzése alá történő helyezésével produkciós szövetekben történő expresszió érdekében oly módon, hogy a gén transzkripciósán inaktív, hacsak nem történik helyspecifikus rekombináció a rokon, helyspecifikus rekombináz feltételes expressziója révén. Az érdeklődés tárgyát képező gén feltételes expressziója így most már a rekombináz feltételes expressziójától függ. Ilyen módon a magas szintű expresszióért és a specifitásért felelős tényezők elválaszthatók, és ezután a rekombináz nem specifikus, alap (azaz szivárgó) expressziójára lehet koncentrálni .
Mivel a rekombináz enzim szükséges szintje várhatóan nem magas, számos specifikus promoter alkalmazható, amelyek máskülönben túl gyengék lennének az érdeklődés tárgyát képező gén expressziójához. Továbbá, mivel a helyspecifikus rekombináció a rekombináz küszöbszintjétől függ, a szivárgó transzkripció, amely a rekombináz küszöb alatti szintjét eredményezi, elviselhető.
A rendelkezésre álló, szabályozott promóterek fokozott szövetszelektivitása valósítható meg a vad típusú, Cre-közvetítette rekombináció hatékonyságának csökkentésével, a rekombináz szükséges szintjének emelésével akár a helyspecifikus rekombináció számára egy mutáns hely alkalmazásával és/vagy mutáns rekombináz alkalmazásával, amely nem elég hatékony a rekombinációhoz. Ilyen mutánsok jól ismertek, legalább is a Cre-lox-rendszer esetében. Bemutatjuk, hogy védőszer által indukált Cre-expresszió alkalmazásával egy transzgén (35S:luciferáz) expressziójának aktiválására a transzgén Cre-közvetítette aktiválásában egy mutáns lox-hely (lox72) és egy vad típusú lox-P-hely alkalmazása csökkenti a promoter alapaktivitását, összehasonlítva azzal, amikor mindkét helyen vad típusú lox-P-helyet alkalmazunk .
A nem specifikus rekombinázexpresszió tovább csökkenthető (azaz expressziójának specifitása tovább növelhető) egyéb, poszttranszkripciós megközelítési módokkal, például :
1. kis mértékben transzlatált, kiméra rekombinázgén alkalmazásával (például, amelynek nem ideális a szekvenciakörnyezete az iniciációs kodon körül a Kozak-féle szabályt követve, vagy amelynek további, rövid ORF-ek találhatók az 5’ nem transzlatálódó szakaszban, például élesztőben GCN4 mRNS, vagy amelynek 3' nem transzlatálódó szekvenciái vannak, amelyek az mRNS-t instabillá teszik, mint ezt Pamela Green ismerteti (Department of
Biochemistry, Michigan State University, East Lansing, MI 48824-1312, USA)
2. mutáns rekombináz alkalmazásával, amelynek kisebb a sejtes stabilitása (azaz rövidebb a féléletideje). Ilyen mutánsok PEST-szekvenciák hozzáadásával készíthetők [Sekhar és mtsai., Jrl. Receptor Signal Transduction Res. 18 (2-3), 113-132 (1998)].
Ha egy rendszert egy adott terménynövényben kifejlesztünk, könnyen adaptálható a jellemző célgének sorának feltételes expressziójára replikon részvételével vagy anélkül.
Továbbá, a replikonreplikáció várhatóan a célgén magas szintű expresszióját éri el génamplifikáció révén, amely örökölhető. Ezekből a vektorokból származó, magas szintű transzkripció továbbá génelfojtásra alkalmazható antiszensz gátlással vagy koszuppresszióval.
A találmány tárgyát képezik továbbá új, rekombináns víruskonstrukciók, például transzfervektorok és eljárások ezek készítésére, valamint alkalmazásuk. Növényi sejtnek a vektorokkal történő transzformálása esetén génamplifikáció révén szabályozott, magas szintű expresszióra képes transzgénikus növény állítható elő. Ez a szabályozott expresszió válasz lehet különböző ingerekre, például fejlődési állapotra, a növény sérülésére (például rovar támadására vagy patogénre), környezeti stresszre (például hő vagy magas sótartalom) vagy vegyszerekre, amelyek specifikus promótereket indukálnak. A találmány szerinti eljárással olyan növények állíthatók elő, amelyekben bizonyos szőve teknek és/vagy növényi részeknek új vagy megváltozott a fenotipusa.
A konstrukciók például vektorok, expressziós kazetták és bináris plazmidok, a konkrét konstrukció szándékozott alkalmazásától függően. Két alap-DNS-konstrukció szükséges, amelyek sokféle módon egyesithetők növényi sejt transzformálása és transzgénikus növény kinyerése érdekében. Agrobacterium közvetítette transzformáció esetén az inaktív replikon és kiméra, replikációs gén egy bináris plazmidban egyesíthető, vagy a kettő különálló bináris plazmidokon vihető be a sejtbe akár kotranszformációval, akár egymást követő traszformációkkal. Egy másik lehetőségként a két konstrukció az egyik vagy a másik konstrukciót tartalmazó két transzgénikus vonal keresztezésével egyesíthető.
Az inaktív replikonban, valamint a kiméra, replikációs fehérjegénben lévő célgénben alkalmazott terminációs szakaszt elsősorban a kényelem kedvéért választjuk, mivel a terminációs szakaszok viszonylag felcserélhetőnek tűnnek. Az alkalmazott terminációs szakasz natív lehet a transzkripciós iniciációs szakasszal, az érdeklődés tárgyát képező DNS-szekvenciával, vagy más forrásból származhat. A terminációs szakasz lehet természetesen előforduló vagy teljesen vagy részlegesen szintetikus. Megfelelő terminációs szakaszok A. tumefaciens Ti-plazmidjából nyerhetők, például az oktopin-szintáz és nopalin-szintáz terminációs szakaszok, vagy β-phaseolin-génekből, a kémiailag indukálható lant-génből, pIN-ből [Hersey és mtsai., Isolation and characterization of cDNA clones for RNA species induced by substituted benzenesulfonamides in corn, Plant Mol. Biol. 17(4), 679-90 (1991), US 5.364.780].
A konstrukciók
A találmány egyik szempontja szerint növényi vírusok távolra ható aktivációs replikációjának új rendszerét fejlesztjük ki helyspecifikus rekombinációs rendszer alkalmazásával. A rendszer előnye, hogy jobban elviseli a szabályozott promóterek nem specifikus, alapexpresszióját (azaz a szivárgást), és a távolra ható aktiváció szorosabb ellenőrzésére ad lehetőséget. Továbbá, ha egy megfelelően szabályozott, helyspecifikus rekombinációt fejlesztünk ki, általánosan alkalmazható különböző vírusok inaktív replikonjainak aktiválására, valamint transzgének távolra ható aktivációs expressziójára replikon nélkül. Néhány, helyspecifikus rekombinázt (például Cre-rekombinázt) expresszáló, hozzáférhető, szabályozott promoter nem specifikus expresszióját (azaz szivárgást) a növények jobban viselik, mivel a rekombináznak el kell érnie egy küszöbszintet, mielőtt hatása lenne a rekombinációra [Araki és mtsai., Targeted integration of DNA using mutant lox sites in emryonic stem cells, Nucleic Acids Res. 25, 868-872 (1997)]. A promóterek specifitása tovább fokozható a rekombináz szükséges küszöbszintjének növelésével akár ismert, mutáns, rekombináns fehérjék alkalmazásával, mint ezt a Cre-re ismertették [Abremski, K. és mtsai., Properties of a mutant Cre protein that alters the topological linkage of recombination products, J. Mol. Biol. 202, 59-66 (1988); Wierzbicki és mtsai., A mutational analysis of the bacteriophage Pl recombinase Cre'j J. Mol. Biol. 195, 7 8594 ¢1987)] és/vagy mutáns, helyspecifikus szekvenciákkal, például Iox-P-helyekkel [Albert és mtsai., Site-specific integration of DNA into wild-type and mutant lox sites placed in the plant genome, Plant J. 7, 659-59 (1995)], amelyek a rekombinációt kevésbé hatékonnyá teszik, mint a vad típusú, helyspecifikus rekombinációs rendszer, és így a rekombináz magasabb szintjét igénylik.
Ebben a rendszerben az inaktív replikonkonstrukció vad típusú vagy mutáns helyspecifikus szekvenciákat tartalmaz a replikonon belül vagy a replikont szegélyezve. A helyspecifikus, felismerő szekvenciák közötti rekombináció a replikont aktiválja és kiváltja a replikonreplikációt. Ha a helyspecifikus szekvenciák közvetlenül orientáltak (azaz tandem elhelyezkedésűek), a helyspecifikus rekombináció a DNS kivágódását eredményezi a helyspecifikus szekvenciák közül (1. ábra és 3. ábra). Ha fordított orientációban vannak (azaz fej-fej vagy vég-vég orientációban), a helyspecifikus rekombináció a DNS inverzióját eredményezi a helyspecifikus szekvenciák között (2. ábra).
Egy másik megvalósítási mód szerint (1. ábra) az inaktív replikonkonstrukció a replikon (akár egy geminivirus-replikon, akár RNS-vírusamplikon) egyetlen kópiáját tartalmazza, amelyet tandem helyspecifikus szekvenciák szegélyeznek, és a kromoszómába van integrálva. Ebben az integrált állapotban a replikon inaktív és nem képes replikálódni. A helyspecifikus rekombináció egyetlen helyspecifikus szekvenciát tartalmazó replikon egyetlen kópiá ját vágja ki, amely replikációra képes. Ha a replikont helyspecifikus szekvenciák közé építjük be olyan helyen, amely a transzkripciós starthely és a nyitott leolvasási keret között van (azaz a replikációs gén 5' átíródó, de nem transzlatálódó szakaszában) , a replikációs gén nem működőképes, és a helyspecifikus rekombináció helyreállítja a funkcionális replikációs gént (2. ábra). Ha az RNS-amplikon a promoter és a transzkripciós starthelye közé épül be, az RNS-replikon nem íródik át, és a helyspecifikus rekombináció kivágja az amplikont a kromoszómából és helyreállítja a funkcionális amplikont. Bármelyik esetben, a helyspecifikus rekombináció eltávolítja a replikont a kromoszómából, amely előnyös a vírus által kiváltott génelfojtás elkerülése érdekében. Ha a replikont két, tandem lox-hely szegélyezi, akkor ezt floxed replikonnak nevezzük. A floxed replikon egy riportergénbe integrálható oly módon, hogy transzkripciós stopfragmensként szolgál, és gátolja a riportergén megfelelő transzkripcióját. Helyspecifikus rekombináció kivágja a replikont és helyreállítja a funkcionális riportergént. Ilyen riportergén növényeknek megfelelően szabályozott, Cre-lox aktivációs rendszerre történő szűrővizsgálatának kifejlesztésére alkalmazható. Előnyösen a transzkripciós stopfragmenst a floxed amplikon mellé építjük be, hogy megakadályozza a replikációs gén véletlen transzkripcióját a floxed amplikonokkal szomszédos szekvenciákból, például a transzgénikus növényekben lévő növényi DNS környezetéből. Nem szükséges azonban, hogy a floxed replikon inszerciója egy génbe vagy egy transzk ripciós stopfragmensbe történjen, amennyiben a replikációs gén nem expresszálódik az integrált helyzetében. Az inaktív replikonban lévő replikációs gén inaktiválása fontos, ha az expressziója káros a növény fejlődésére.
Megjegyezzük, hogy a génelfojtás jelentős akadálya a növényi transzgénexpressziónak, és a találmány szerinti expressziós és replikációs rendszerek oly módon alakíthatók át, hogy ezeket a problémákat megcélozzák. Jelenleg dohánykarcoló vírusnak (tobacco etch vírus) Pl-HC-Pro- és HCPro-polipeptidjeinek és uborkamozaik-vírusának (cucumber mosaic virus) 2B-fehérj éje patogenitási tényezőiről mutatták ki, hogy növényekben gátolják a transzgének és/vagy RNS-vírusgének génelfojtását [Anandalakshmi, R. Pruss, G. J., Ge, X., Marathe, R., Mallory, A. C., Smith, T. H., Vance, V. B., A viral suppressor of gene silencing in plants, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 13079-13084 (1998); Brigneti, G., Voinnet, 0., Li, W.-X., Ji, L.-H., Ding, S.W., Baulcombe, D. C., Viral pathogenicity determinants are suppressers of transgene silencing in Nicotiana benthamiana, EMBO J. 17, 6739-6746 (1998); Carrington, J. C., Whitham, S. A., Viral invasion and host defense: strategies and counterstrategies”, Curr. Opin. Plant Biol. 1, 336-341 (1998); Vance, V. B., Pruss, G. J., Carrington, J., Martin, L., Dawson, W. 0., Potyvirus booster sequence and helper component proteinase for enhancing expression of a foreign or endogenous gene product in plants, WO 9844097 számú nemzetközi közzétételi irat (1998)]. Transzgénikus növényekben ilyen elfojtó szuppresszorok konstitutív expressziója káros lehet a növény számára, mivel konstitutivan szuppresszálja a génelfojtást, egy alapvető növényi folyamatot. Ez a káros hatás különösen erős a vírusvektoroknál, mivel az előzőekben ismertetett, elfojtó szuppresszorok a vírus patogenitását is növelik. Gyakorlatilag a HC-Pro-t tartalmazó PVX-vírussal (burgonya X-vírus) fertőzött növények súlyos tüneteket mutatnak, elhalást és satnyulást, míg a 2B-fehérjével fertőzöttek erős elhalás! tüneteket mutatnak, és három héten belül elpusztulnak [Brignetti, G., Voinnet, 0., Li, W.-X., Ji, L.-H., Ding, S.-W., Baulcombe, D. C., Viral pathogenicity determinants are suppressers of transgene silencing in Nicotiana benthamiana, EMBO J. 17, 6739-6746 (1998)]. Ezeknek az elfojtó szuppresszoroknak a transzgénikus terménynövények produkciós szöveteire történő korlátozott és/vagy szabályozott expressziója alapvetően fontos a víruseredetű vektorreplikáció fokozása és/vagy a magasabb szintű génexpresszió gyakorlati alkalmazása tekintetében, különösen idegen fehérje előállítása esetében.
Megfigyeltük, hogy TGMV B-genomja szintén gátolhatja a vírus által kiváltott génelfojtást. Például, ha olyan floxed TGMV A-genomot, amelyben a köpenyfehérje ORF-et GUS-ORF-fel helyettesítettünk, tartalmazó T-DNS-sel transzformált, transzgénikus dohánynövények leveleit 35S:Cregénnel és TGMV B-genom dimerjével együtt bombáztunk, a GUS expressziója szignifikánsan magasabb volt, mint a csak 35S:Cre-génnel egyedül transzformáltaknál. Vad típusú
Nicotiana benthamiana együtt bombázása PVX-GFP-vel és TGMV ·'·! «;· ·**» — g4 — ···» '’** '
B-vel a GFP-aktivitás hosszabb ideig történő fennmaradását eredményezte, mint a csak PVX-GFP-vel egyedül történő bombázás. Felismertük, hogy a vad típusú Nicotiana benthamiana növény GFP-t hordozó TGMV-vel történő fertőzése a GFP olyan expresszióját eredményezte, amely legalább két hónapon keresztül nem csökken vagy múlik el. Ilyen fertőzés két plazmid együttes biolisztikus bombázásával érhető el, a leírás szerint együtt TGMV-GFP-dimereknek nevezzük, az egyik a TGMV-A-GFP részleges dimerét tartalmazza, amelyben a köpenyfehérje ORF-et GFP egy világosabb (mutáns) formájával helyettesítettük, és a másik a vad típusú TGMV-B részleges dimerjét tartalmazza. Felismertük továbbá, hogy a TGMV-GFP-expresszió hasonló módon megmarad az olyan növényekben, amelyekben a PVX-GFP-expressziót elfojtottuk. Ehhez 714B-LL1 jelű, transzgénikus N. benthamiana növényt alkalmaztunk, amely egy inaktív RNS-vírus PVX-GFP-amplikont tartalmaz. Ezek a transzgénikus növények nem expresszálnak semmilyen GFP-t, mivel a PVX-GFP inaktív formája nem teszi lehetővé a replikációt, hacsak nem történik Cre-lox közvetítette, helyspecifikus rekombináció. Ha a 714B-LL1 jelű vonalat 35S:Cre-génnel bombázzuk, a PVX-GFP-replikáció és a GFP-expresszió aktiválását eredményezi, amely körülbelül 2 héten belül elfojtódik. Ha egy ilyen elfojtott 714B-LL1növényt TGMV-GFP-dimerrel fertőztünk, a TGMV-GFP-ből származó GFP-expresszió, amely megkülönböztethető a PVXGFP-ből származótól világosabb fluoreszcenciájával, ugyanannyi ideig megmaradt, mint a nem transzformált kontrolinál. Ha a 714B-LL1 jelű vonalat 35S:Cre és TGMV-GFP dimerekkel együtt bombáztunk, a TGMV-GFP-ből származó GFPexpresszió ugyanannyi ideig megmaradt, mint a nem transzformált kontroliban, amely idő alatt a PVX-GFP-ből származó GFP elfőjtódott. Mivel TGMV-ben lévő idegen gén expressziója TGMV-B jelenlétében megmarad és az idővel nem fojtódik el, a TGMV-B magas szintű expresszió fokozására alkalmazható a vírusvektorokban jelen lévő transzgének elfojtásának szuppresszálásával. Nyilvánvaló, hogy minden geminivírusnak van ilyen elfojtó szuppresszor aktivitása, akár egyrészes akár kétrészes genomja van. Valószínű, hogy geminivírusban lévő idegen génnek ez a fennmaradó expressziója a geminivírus mozgásából származik. A geminivírus B-genomjának elfojtó szuppresszor aktivitása különböző módokon alkalmazható. Szakember TGMV B-genomját gazdanövény kromoszómájába transzformálhatja és a rokon proreplikonnal vagy floxed A-genommal egyesítheti. Például, a TGMV B-genom teljes egészében részleges dimerként lehet jelen a kromoszómában, vagy a replikációja és az expressziója helyspecifikus rekombinációval történő aktiválás ellenőrzése alatt állhat. Ha dimerként van jelen, a replikációjával vagy anélkül gátolhatja az elfojtást. Ez előbbi esetben a replikáció távolra ható módon aktiválható közvetlenül egy szabályozott promoter ellenőrzése alatt álló replikációs fehérje/fehérjék expressziójával, vagy közvetve egy inaktív A-genom helyspecifikus rekombináció útján történő aktiválásával. A teljes B-genom alkalmazására egy másik lehetőség a B-genomban lévő, elfojtó szuppresszorgén azonosítása és idegen génexpresszió fokozására történő al kalmazása. Mivel a TGMV-B-nek csak két nagy ORF-je van, a BL1 és a BR1, amelyek víruseredetű mozgási fehérjéket kódolnak, szakember által könnyen azonosítható, melyik ORF az elfojtó szuppresszor. Levelek például 35S:Cre és mutáns BRl-et tartalmazó TGMV-B dimerrel (vagy PVX:BL1 kiméra génnel), vagy 35S:Cre és mutáns BLl-et tartalmazó TGMV-B dimerrel (vagy PVX:BR1 kiméra génnel) együtt bombázhatok, és a GUS-expresszió relatív expressziója mérhető. Az azonosított, elfojtó szuppresszorgén azután transzgénexpresszió fokozására alkalmazható.
Az elfojtó szuppresszorgének szabályozott expressziója a géneknek megfelelő, szabályozott promóterek ellenőrzése alá helyezésével végezhető, vagy előnyösen helyspecifikus rekombinációval történő szabályozott aktiválással. A találmány egyik megvalósítási módja szerint a kiméra, elfojtó szuppresszorgéneket Cre aktiválja. Az lenne azonban a legkedvezőbb, ha mind a víruseredetű expressziós rendszer, mind az elfojtó szuppresszorgén egy közös ellenőrzés alatt állna, amely egyidejűleg biztosítja a vírusreplikációt és a génelfojtás gátlását magas szintű expresszió és idegen fehérjék magas szintű termelése érdekében. A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a feltételes, víruseredetű replikációs rendszer egy elfojtó szuppresszorgén feltételes expressziójára épül. Az 1. ábra szerint például az A-elem egy növényi promoter lehet, például a 35S-promóter, a B-elem egy inaktív RNS-vírusból származó amplikon lehet, amely a C-elem transzkripciós és/vagy transzlációs stopfragmenseként is szolgál, és a C elem az elfojtó szuppresszorgén ORF-je, például Pl-HC-Pro, HC-Pro vagy 2t>-fehérje (mint az előzőekben ismertetettük) és 3’ nem transzlatálódó szakasz. A szabályozott, helyspecifikus rekombináció egyidejűleg aktiválja az RNSvirusreplikon kivágódását és replikációját és az elfojtó szuppresszorgén expresszióját az A-elemben lévő promoter ellenőrzése alatt. Hasonló módon, az 1. ábra szerint, az Aelem egy növényi promoter lehet, például a 35S-promóter, a B-elem egy geminivirusból származó, inaktív replikon lehet, amely a C-elem transzkripciós és/vagy transzlációs stopfragmenseként is szolgál, és a C-elem a TGMV B-genomból származó elfojtó szuppresszorgén ORF-je és 3' nem transzlatálódó szakasz. Szabályozott, helyspecifikus rekombináció egyidejűleg aktiválja a geminivíruseredetű vírusreplikon replikációját és geminivíruseredetű, elfojtó szuppresszorgén expresszióját az A-elemben lévő promoter ellenőrzése alatt.
Egy másik lehetőségként az elfojtó szuppresszorgén egy inaktív replikonon lévő célgénként expresszálható. Például, lox-helyekkel bíró, inaktív PVX-amplikonok, mint az előzőekben ismertettük (2. és 3. ábrák) a kérdéses célgénen kívül egy elfojtó szuppresszorgént tartalmaznak víruseredetű promoter ellenőrzése alatt. A vírusreplikonban lévő kérdéses célgén és elfojtó szuppresszorgén akár tandem génekként lehetnek jelen megkettőzött, víruseredetű CPpromóter ellenőrzése alatt, akár a célfehérjével N- vagy Cterminális fúziós fehérjeként, mint ezt Anandalakshmi és munkatársai ismertették [Anandalakshmi, R., Pruss, G. J.,
Ge, X., Marathe, R., Mallory, A. C., Smith, T. H., Vance, V. B., A viral suppressor of gene silencing in plants, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 13079-13084 (1998)]. Transzgénikus növényekben ilyen vírusalapú vektorok szisztémásán képesek lehetnek vagy nem lehetnek képesek terjedni. Például, geminivíruson alapuló replikonokban a köpenyfehérje-ORF egy elfojtó szuppresszorgén ORF-jével helyettesíthető. A replikonokba beépíthető méret révén fennálló korlátozás két replikon alkalmazásával kerülhető ki, az egyik hordozza az elfojtó szuppresszorgént és a másik a kérdéses célgént.
Egy másik megvalósítási mód szerint a replikon alapvető fontosságú replikációs génjének/génjeinek transzkripcióját tandem helyspecifikus helyekkel szegélyezett, transzkripciós stopfragmenssel gátoljuk, és a helyspecifikus rekombináció kivágja a transzkripciós stopfragmenst, egyetlen helyspecifikus szekvenciát hagyva maga után, amely lehetővé teszi az eddig gátolt gén transzkripcióját, majd ezt követően a replikon felszabadulását és replikációját. A TGMV- és ACMV-vírusokban például a tandem helyspecifikus helyekkel szegélyezett, transzkripciós stopfragmens a replikációs gén, a víruseredetű dimerben lévő AC1 5' átíródó, de nem transzlatálódó szakaszába építhető (például az Mfel-helyen). RNS-vírusamplikonok esetében a lox-hely a promoter TATA-box szekvenciája és a transzkripciós starthely közé építhető (3. ábra).
Egy másik megvalósítási mód szerint a replikonban vagy körülötte egy szakaszt helyspecifikus szekvenciákkal megfordítunk, hogy a replikon genomját vagy az RNSvírusamplikont elrontsuk. A megfordított szakasz teljes egészében a replikon genomján belül lehet, amely a vírusgénem elrontását eredményezi. Helyspecifikus rekombináció helyreállítja a replikon, beleértve az amplikon szerveződését (kivéve a megmaradt helyspecifikus szekvenciába) t) , és így lehetővé teszi a replikációt. Egy másik lehetőségként az inverzió a replikon és/vagy egy amplikon növényi szabályozó szekvenciájának egy részében lehet, amely megzavarja az alapvető fontosságú replikációs gén(ek) megfelelő transzkripcióját. Helyspecifikus rekombináció helyreállítja a helyes transzkripciót és lehetővé teszi a replikon felszabadulását és replikációját.
A helyspecifikus szekvenciák és a velük rokon rekombináz enzimek bármilyen, természetes, helyspecifikus rekombinációs rendszerből származhatnak. Jól ismertek például a Cre-ΐοχ-, az FLP/FRT-, az R/RS-, a Gin/gixrendszerek. Ezekről ismertetés található Odell és munkatársai könyvében [Odell és mtsai., Use of site-specific recombination systems in plants, Homologous Recomb. Gene Silencing Plants, 219-70 szerk.: Paszkowski, Jerzy, kiad.: Kluwer, Dordrecht, Germany (1994)].
A találmány egyik megvalósítási módja szerint (4. ábra) az alap, inaktív replikonkonstrukció proreplikon, amely geminivírus-replikon esetében előnyösen részleges vagy teljes tandem dimerként van jelen a T-DNS-ben oly módon, hogy
ΊΟ egy egyetlen replikont a vírusreplikációhoz szükséges, közeire ható, víruseredetű szekvenciák, például a replikációs origó szegélyeznek. Ezek a geminivírus-dimerek mesterkópiaként szolgálhatnak, amelyből a replikonok replikatív felszabadulással kivágódhatnak [Bisaro, David, Recombination in geminiviruses: Mechanisms for maintaining genome size and generating genomic diversity, Homologous Recomb. Gene Silencing Plants, 219-70 szerk.: Paszkowski, Jerzy, kiad.: Kluwer, Dordrecht, Germany (1994) ] replikációs fehérje távolra ható módon történő jelenléte esetén. A proreplikon-szekvenciák előnyös forrása geminivírusból származhat (például ACMV vagy TGMV), amelyben az alapvető fontosságú replikációs gén (például az AC1) mutáció (addíció, átrendeződés vagy a nukleotidszekvenciák részleges vagy teljes deléciója) révén működésképtelenné vált. A mutáció történhet a nem kódoló szekvenciában, például a promóterben és/vagy a replikációs fehérje kódoló szekvenciájában oly módon, hogy a replikációs fehérjében akár egy vagy több megváltozott aminosavat, akár kereteltolódást eredményez. Előnyösen a mutáció kereteltolódási mutációt eredményez a replikációs fehérje iniciációs kodonjában vagy ahhoz közel, és így még csak csonka replikációs fehérje sem készül. Előnyösebben az egész replikációs gént kivágjuk a proreplikonból oly módon, hogy ne legyen homológia a távolra ható módon aktiváló replikációs gén és a replikon között, hogy megakadályozzuk a távolra ható módon aktiváló replikációs gén vírus által kiváltott, homológián alapuló elfojtását a replikon replikáció során. Továbbá a proreplikonból előnyösen a köpenyfehérjegén túlnyomó részét vagy teljes egészét kivágjuk és a célgén számára klónozó, restrikciós helyekkel helyettesítjük.
Ezen megvalósítási mód szerint a másik alapkonstrukció egy kiméra, távolra ható replikációs gén, amely egy replikációs fehérje kódoló szekvenciájához működőképesen kapcsolt, szabályozott, növényi promóterből áll. Az ACMVgeminivírusoknál a replikációs fehérjét az AC1 kódolja, a TGMV-geminivírusoknál az ALl-ORF-ek. Előnyösen az ACMV-ben lévő AC2- és AC3-ORF-eket is tartalmazza az ACl-gyel együtt, és a TGMV-ben lévő AL2- és AL3-0RF-eket is tartalmazza az ALl-ORF-en kívül.
RNS-vírusból származó proreplikonok esetében az inaktív replikont szegélyező amplikonszekvenciák, amelyek például szabályozó szekvenciák, lehetővé teszik a replikon RNS-transzkriptumként történő előállítását, amely távolra ható módon replikálódni tud replikációs fehérje jelenlétében. Ezek a szabályozó szekvenciák lehetnek konstitutív vagy szabályozott expresszióhoz való szekvenciák. Előnyösen az ezekben az amplikonokban alkalmazott promoterek gyenge promoterek, hogy csökkentsük a vírus által kiváltott génelfojtást [Ruiz és mtsai., Plant Cell 19, 937-946 (1998)]. Tartalmazzák továbbá egyszálú RNS-vírusok replikációs fehérjéit (például RNS-függő RNS-polimerázokat), ha azok távolra ható módon támogatják a vírusreplikációt [például, rozsnokmozaik-vírus, brome mosaic virus (BMV)].
Helyspecifikus rekombináció helyreállíthatja a funkcionális, víruseredetű replikázgént és távolra ható módon aktiválhatja a replikon közeire ható replikációját, amely viszont távolra ható módon biztosítja a replikációs fehérjét a proreplikon replikációjához.
Szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti expressziós rendszerek (beleértve az inaktív replikont) szabályozott replikációra alkalmazhatók célgén hiányában. Ebben az esetben idegen gén expressziója nem fontos, helyette szabályozó vírusreplikációra törekszünk. Ilyen rendszer akkor alkalmazható, amikor a szabályozott vírusreplikáció a transzgénikus növénynek vírusrezisztenciát biztosít.
Előnyösebben az RNS-vírus replikációja távolra ható módon aktiválható akár az amplikonból transzkripciós stopfragmens helyspecifikus kivágásával, amely a vírusreplikációhoz szükséges normális transzkripciót teszi lehetővé (3. ábra). A transzkripciós stopfragmens például a promoter és a víruseredetű cDNS közé, a víruseredetű cDNSen belül vagy a víruseredetű cDNS és a 3' poliadenilációs szignál közé helyezhető. Mivel a TATA-box és a transzkripciós starthely között csak korlátozott méretű hely van, a lox-szekvenciának a TATA-boxszal való átfedése előnyös, csakúgy, mint deletált helyspecifikus szekvencia, például lox D117 alkalmazása [Abremski és mtsai., J. Mól. Bioi. 202, 59-66 (1988)]. Egy másik lehetőségként a replikon két fordított helyspecifikus hely közötti helyspecifikus inverzióval aktiválható, amely funkcionális amplikont eredményez (2. ábra). Ez a két helyspecifikus hely bárhol lehet az amplikonban, amennyiben az inverziót követően nem gátolják a replikációt. Az egyik helyspecifikus szekvencia például a GÉP- vagy a GUS-gén 5’ nem kódoló, átíródó szekvenciájában lehet, a másik fordított orientációban a 35S-promóter serkentője és TATA-box-szekvenciája között helyezkedhet el (2. ábra).
Ha a replikálódó replikon kromoszómális génekkel homológ szekvenciákat tartalmaz, a homológ génről leírták, hogy elfojtódik [Ruiz és mtsai., Plant Cell 1% 937-946 (1998)]. Ha az amplikonban lévő promoter konstitutívan és erősen expresszálódik (mint például a 35S-promóter), a replikáció végül is elfojtódik. Ilyen elfojtásról leírták, hogy vírusfertőzésre rezisztenciát biztosít. Homológiafüggő vírusrezisztenciáról kimutatták, hogy homológiafüggő, poszttranszkripciós génelfojtásnak köszönhető [lásd, Mueller és mtsai., The Plant Journal 7, 1001-1013 (1995)]. Egy inaktív amplikon feltételes, távolra ható módon történő aktiválása várhatóan rezisztenciát biztosít homológ vírusokkal történő fertőzésre. Mivel ilyen génelfojtásról leírták, hogy az mRNS küszöbszintjétől függ, ha a génelfojtás nem kívánatos, az amplikonban lévő promótereknek (2. és 3. ábra) előnyösen gyenge promótereknek kell lenniük, mint például a minimális 35S-promóter, hogy csökkentsék annak a veszélyét, hogy a replikonreplikáció folyamán elfojtódja nak.
Az inaktív replikonok tartalmazhatnak célgén(eke)t is, amelyek replikálódnak és magasabb szinten expresszálódnak, ha a replikon távolra ható módon replikációra aktiválódik. Az ezekben a célgénekben lévő kódoló szekvencia víruseredetű és/vagy növényi eredetű, szabályozó szekvenciákhoz kapcsolódik működőképesen. A kazettában egy vagy több intron is lehet. Más szekvenciák (például tranzitpeptidek, szekréciós vezetőszekvenciák vagy intronok) kívánt esetben szintén lehetnek a proreplikonban és a replikonban. Ezeknek a szekvenciáknak a kinyerése és alkalmazása a szakember számára jól ismert. A célgén a kérdéses polipeptidet (például egy enzimet) vagy funkcionális RNS-t kódolhat, amelynek szekvenciája antiszensz gátlást vagy koszuppressziót eredményez. A találmány szerinti nukleotidszekvenciák szintetikusak, természetes eredetűek lehetnek vagy ezek kombinációja. A kérdéses nukleotidszekvencia természetétől függően kívánatos lehet a szekvenciát a növény által előnyben részesített kodonokkal szintetizálni.
A célgének funkcionális RNS-eket vagy idegen fehérjéket kódolhatnak. Az idegen fehérjék jellemzően nem víruseredetű fehérjéket kódolnak, és olyan fehérjék, amelyek a növényi gazda számára lehetnek idegenek. Ilyen idegen fehérjék például a növény elsődleges vagy másodlagos anyagcseréjének enzimei, betegségre vagy gyomirtó szerre rezisztenciát biztosító fehérjék, kereskedelmileg alkalmas, nem növényi enzimek és állati takarmányozás vagy humán élelmiszer számára kedvező tulajdonságú fehérjék. A célgének által kódolt, idegen fehérjék például jobb táplálkozási tu lajdonságú, magi raktározó fehérjék, például a magas kéntartalmú 10 kD kukoricamag-fehérje vagy a magas kéntartalmú zein-fehérjék.
A víruseredetű replikációs fehérje/fehérjék szabályozott expressziója a replikációs fehérje kódoló szekvenciájának szövetspecifikus, fejlődésre specifikus vagy indukálható promoter ellenőrzése alá helyezésével érhető el.
Növényekben számos, szövetspecifikus módon szabályozott génről és/vagy promóterről jelentek meg közlemények. Ilyen gének például a magi raktározó fehérjéket (például napin, cruciferin, béta-konglicinin és phaseolin) kódoló gének, zeint vagy olaj testfehérjéket (például oleozint) kódoló gének vagy a zsírsav-bioszintézisben részt vevő gének [acil-karrier-fehérjék, sztearil-ACP-deszaturáz és zsírsavdeszaturázok (fad2-l)] és más, az embriófejlődés idején expresszálódó gének [például Bce4, lásd EP255378 és Kridl és mtsai., Seed Science Research 1_, 209-219 (1991)]. Magspecifikus expresszióra különösen alkalmas a borsó vicilin-promóter [Czako és mtsai., Mol. Gen Genet. 235 (1), 33-40 (1992)]. Más alkalmas promóterek érett levelekben történő expresszióhoz azok, amelyek az öregedés idején kapcsolódnak be, például a SAG-promóter Arabidopsisból [Gan és mtsai., Inhibition of leaf senescence by autoregulated production of cytokinin, Science (Washington, D.C.) 270(5244), 1986-8 (1995)].
A megporzáskor vagy a megporzás alatt a termésérésig, legalább az érés megkezdődéséig expresszált, termés specifikus promóterek egy osztályát az US 4.943.674 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban tárgyalják. Előnyösen gyapotszálban expresszálódó cDNS-klónokat már izoláltak [John és mtsai., Gene expression in cotton (Gossypiuin hirsutum L.) fiber: cloning of the mRNAs, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89(13), 5769-73 (1992)]. Izoláltak és jellemeztek paradicsomból származó cDNS-klónokat, amelyek a termésfejlődés során eltérő expressziót mutatnak [Mansson és mtsai., Mol. Gen. Genet. 200, 356-361 (1985); Slater és mtsai., Plant Mol. Biol. 5, 137-147 (1985)]. A poligalakturonáz-gén promótere a termésérés idején aktív. A poligalakturonáz-gént az US 4.535.060 (benyújtva 1985. augusztus 13.), az US 4.769.061 (benyújtva 1988. szeptember 6.), az US 4.801.590 (benyújtva 1989. január 31.) és az US 5.107.065 (benyújtva 1992. április 21.) számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokban ismertetik.
A psbA (a II-fotorendszer egyik komponense) érett, plasztisz mRNS-e legmagasabb szintjét a termésfejlődés idején éri el, ellentétben az I- és a II-fotorendszer más komponenseinek plasztisz mRNS-ével, amelyek az érés megindulása után ki nem mutatható szintre csökkennek a kromoplasztiszokban [Piechulla és mtsai., Plant Mol. Biol. Ί_, 367-376 (1986)]. Mostanában paradicsom pollen [McCormick és mtsai., Tomato Biotechnology, kiad.: Alan R. Liss, Inc., New York (1987)] és bibe [Gasser és mtsai., Plant Cell 1^, 15-24 (1989)] kölcsönhatásokban nyilvánvalóan szerepet játszó géneket képviselő cDNS-klónokat izoláltak és jellemez tek.
A szövetspecifikus promóterek egyéb példái közé tartoznak azok, amelyek levélsejtekben a levelet ért sérülés után (például rovarrágás után) irányítják az expressziót, vagy a gumóban (például patatin-gén promótere) és rostsejtekben {a fejlődés által szabályozott rostsejtfehérje egyik példája az E6 [John és mtsai., Gene expression in cotton (Gossypium hirsutum L.) fiber: cloning of the mRNAs, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(13), 5769-73 (1992)]} irányítják az expressziót. Az E6-gén leginkább a rostban aktív, azonban transzkriptumok alacsony szinten a levélben, a magkezdeményben és a virágban is találhatók.
Néhány úgynevezett szövetspecifikus promoter szövetspecifitása nem kizárólagos, és a szakember diphtheriatoxin-szekvencia alkalmazásával vizsgálhatja. Szövetspecifikus expresszió szivárgó expresszióval is elérhető különböző, szövetspecifikus promóterek kombinálásával [Beals és mtsai., Plant Cell 9, 1527-1545 (1997)]. A szakember más szövetspecifikus promótereket is izolálhat (lásd, US 5.589.379 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat). Számos indukálható promóterről (génkapcsolókról) jelent meg közlemény. Gatz összefoglalójában sokat ismertetnek [Gatz, Current Opinion in Biotechnology 7, 168-172 (1996); Gatz, C., Chemical control of gene expression,
Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 89-108 (1997)]. Ilyen például a tetraciklin-represszor rendszer, a Lac-represszor rendszer, a réz indukálta rendszerek, a szalicilét indukálta rendszerek (például a PRla-rendszer), a glükokortikoid [Aoyama, T., és mtsai., N-H Plant Journal
11, 605-612 (1997)] és az ecdysom által indukált rendszerek. Szintén ide tartoznak a benzén-szulfonamid (US 5.364.780) és az alkohol által indukált rendszerek (WO 97/06269 és WO 97/06268) és a glutation-S-transzferáz promóterek. Más vizsgálatokban környezeti stresszre vagy ingerekre, például magasabb sótartalomra, szárazságra, patogénre és sérülésre indukálhatóan szabályozott génekre koncentrálnak [Graham és mtsai., J. Biol. Chem. 260, 65556560 (1985); Graham és mtsai., J. Bioi. Chem. 260, 65616554 (1985)] [Smith és mtsai., Planta 168, 94-100 (1986)]. Sérült burgonyanövények leveleiben metallokarboxipeptidázinhibitor fehérje felhalmozódásáról számoltak be [Graham és mtsai., Biochem. Biophys. Res. Comm. 101, 1164-1170 (1981)]. Más növényi génekről leírták, hogy metil-jazmonát, „válaszkiváltók („elicitors), hősokk, anaerob stressz vagy gyomirtó védőszerek indukálják.
Kiméra, távolra ható, víruseredetű replikációs fehérje szabályozott expressziója más genetikai stratégiákkal tovább szabályozható. A Cre-közvetítette génaktivációt például Odell és munkatársai ismertették [Odell és mtsai., Mol. Gen. Genet. 113, 369-278 (1990)]. Cre-Közvetítette kivágással eltávolítható egy DNS-fragmens, amely a promoter és a replikációs fehérje kódoló szekvenciája közötti loxhelyekkel kapcsolt 3' szabályozó szekvenciát tartalmaz, és amely gátolja egy kiméra replikációs gén expresszióját a promóterből, és ez a távolra ható replikációs gén expresszióját eredményezi. Ebben az esetben a kiméra Öregén, a kiméra, távolra ható replikációs gén vagy mindkettő »«· V
- 79 - - ·*·* * szövetspecifikus, fejlődésre specifikus vagy indukálható promóterek ellenőrzése alatt állhat. Egy másik genetikai stratégia tRNS-szuppresszorgén alkalmazása. Egy tRNSszuppresszorgén szabályozott expressziója feltételesen ellenőrizheti egy távolra ható, replikációs fehérje kódoló szekvenciájának expresszióját, amely egy megfelelő terminációs kodont tartalmaz, mint ezt Ulmasov és munkatársai ismertetik [Ulmasov és mtsai., Plant Molecular Biology 35, 417-424 (1997)]. Akár a kiméra tRNS-szuppresszorgén, akár a kiméra, távolra ható, replikációs gén vagy mindkettő szövetspecifikus és fejlődésre specifikus vagy indukálható promóterek ellenőrzése alatt állhat.
Szakember számára nyilvánvaló, hogy növényben egy transzgén expressziós szintje és szabályozása szignifikáns módon különbözhet a vonalak között. Ily módon sok vonalat le kell vizsgálni ahhoz, hogy a kívánt expressziós szintű és szabályozású vonalat megtaláljuk. Amint a kiméra Cretranszgén kívánt, szabályozási specifitásával bíró vonalat azonosítottuk, különböző, inaktív replikonokat vagy inaktív transzgént hordozó vonalakkal keresztezhetők az aktiváció érdekében. A szakember számára sokféle technológia ismert növényi gazdasejtbe konstrukciók bevitelére. Ilyen technológiák például DNS-sel történő transzformáció A. tumefaciens vagy A. rhizogenes transzformáló eszközként történő alkalmazásával, elektroporációval, részecskegyorsítással, stb. (lásd, pl. EP 295959 és EP 138341).
Agrobacterium spp. Ti- és Ri-plazmidjai bináris típusú vektorainak alkalmazása különösen előnyös. A Ti-eredetű vekto- 80 rok magasabbrendű növények széles körét transzformálják, például egyszikű és kétszikű növényeket, például szójababot, gyapotot, repcét, dohánynövényt és rizst [Pacciotti és mtsai., Bio/Technology 3, 241 (1985); Byrne és mtsai., Plant Cell Tissue and Organ Culture 8, 3 (1987); Sukhapinda és mtsai., Plant Mol. Biol. 8, 209-216 (1987); Lorz és mtsai., Mol. Gen Genet. 199, 178 (1985); Potrykus, Mol. Gen. Genet. 199, 183 (1985); Park és mtsai., J. Plant Biol. 38(4), 365-71 (1995); Hiei és mtsai., Plant J. 6, 271-282 (1994)]. A T-DNS alkalmazását növényi sejtek transzformálására alaposan vizsgálták, és részletesen ismertették [EP 120516; Hoekema, The Binary Plant Vector System, V. fejezet, kiad.: Offsetdrukkerij Kanters, B. V., Albasserdam (1985); Knauf és mtsai., Genetic Analysis of host Range Expression by Agrobacterium, Molecular Genetics of the Bacteria-Plant Interaction, 245 szerk.: Puhler, A., kiad.: Springer-Verlag, New York (1983) és An és mtsai., EMBO J. 4, 277-284 (1983)]. Növényekbe történő bevitelhez a találmány szerinti kiméra gének bináris vektorokba építhetők a példákban ismertetettek szerint.
Szakember számára egyéb transzformációs eljárások is hozzáférhetők, például idegen DNS-konstrukciók közvetlen felvétele (EP 295959), elektroporációs technológiák [lásd, Fromm és mtsai., Nature (London) 319, 791 (1986)] vagy nagy sebességű ballisztikus bombázás nukleinsavkonstrukciókkal borított fémrészecskékkel [lásd, Kline és mtsai., Nature (London) 327, 70 (1987); US 4.945.050 számú amerikai egye sült államokbeli szabadalmi irat]. Transzformálás után a ο ·
- 81 sejteket a szakember regenerálhatja. Különleges jelentőségűek az utóbbi időben ismertetett eljárások idegen gének transzformálására kereskedelmileg fontos terménynövényekbe, például repcemagba [lásd, DeBlock és mtsai., Plant Physiol. 91, 694-701 (1989)], napraforgóba [Everett és mtsai., Bio/Technology 5, 1201 (1987)], szójababba [McCabe és mtsai., Bio/Technology 6, 923 (1988); Hinchee és mtsai., Bio/Technology 6, 915 (1988); Chee és mtsai., Plant Physiol. 91, 1212-1218 (1989); Christou és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 7500-7504 (1989); EP 301749], rizsbe [Hiei és mtsai., Plant J. 6, 271-282 (1994)] és kukoricába [Gordon-Kamm és mtsai., Plant Cell 2, 603-618 (1990); Fromm és mtsai., Biotechnology 8, 833-839 (1990)].
A transzgénikus növényi sejtek ezután megfelelő szelekciós tápközegre helyezhetők a transzgénikus sejtek kiválogatása érdekében, amelyek azután kallusszá nevelhetők. A kalluszból hajtások fejlődnek, és a hajtásokból csíranövényeket állítunk elő gyökereztető tápközegen történő neveléssel. A különböző konstrukciókhoz általában marker kapcsolódik a növényi sejtek kiválogatása céljából. A kényelem kedvéért a marker lehet egy biocidra való rezisztencia (előnyösen egy antibiotikumra, például kanamicin, G418, bleomicin, higromicin, kloramfenikol, gyomirtó szer vagy hasonlók). Az alkalmazott, konkrét marker a transzformált sejtek kiválogatását teszi lehetővé összehasonlítva azokkal a sejtekkel, amelyekben nincsen a bevitt DNS. A találmány szerinti transzkripciós kazettákat tartalmazó DNSkonstrukciók komponensei olyan szekvenciákból készíthetők,
amelyek natívak (endogének) vagy idegenek (exogének) a gazdához képest. Az idegen kifejezésen azt értjük, hogy a szekvencia nem található meg abban a vad típusú gazdában, amelybe a konstrukciót bejuttatjuk. Heterológ konstrukciók legalább egy szakaszt tartalmaznak, amely nem natív a génhez képest, amelyből a transzkripciós iniciációs szakasz származik.
A transzgénikus sejtekben és növényekben a transzgének jelenlétének bizonyítására Southern-blot vizsgálat végezhető a szakember számára ismert eljárások alkalmazásával. A replikonok Southern-blottal mutathatók ki és mennyiségileg mérhetők, mivel ezek könnyen megkülönböztethetők a proreplikon-szekvenciáktól megfelelő restrikciós enzimek alkalmazásával. A transzgének expressziós termékei a sokféle eljárás közül bármelyikkel kimutathatók a termék természetétől függően, például Western-blottal és enzimes vizsgálattal. Fehérjeexpresszió mennyiségi mérésére és különböző, növényi szövetekben a replikáció kimutatására különösen alkalmas módszer riportergén, például GUS alkalmazása. Amint kinyertük a transzgénikus növényeket, azok felnevelhetek, hogy a kívánt fenotípusú növényi szöveteket vagy részeket állítsák elő. A növényi szövet vagy növényi részek begyűjthetők és/vagy a mag gyűjthető be. A mag további, kívánt jellemzőjű szövetekkel vagy részekkel bíró növények neveléséhez szolgálhat forrásként.
A találmány szerinti, víruseredetű expressziós rend szer annak bizonyítására alkalmazható, hogy (i) szójababés kukoricamag-szövet segíti a geminivírus-replikációt, (ii) a Cre helyspecifikus rekombinációt közvetíthet transzgénikus, inaktív replikonokban és inaktív transzgénekben, és ez a rekombináció idegen fehérje magas szintű expresszióját és/vagy a gazda génelfojtását okozza, és (iii) az expressziós rendszer hat idegen gének expressziójára dohánynövényben.
A találmányt a következő példákkal határozzuk meg részletesebben. Ezek a példák a találmány előnyös megvalósítási módjait mutatják be, és csak a szemléltetés célját szolgálják. Az előző leírásból és a példákból a szakember számára nyilvánvalóvá válnak a találmány alapvető jellemzői, és a találmány alapgondolatától és oltalmi körétől való eltérés nélkül elvégezheti a találmány különböző változtatásait és módosításait, hogy különböző alkalmazásokhoz és feltételekhez igazítsa.
Általános eljárások
A példákban alkalmazott, hagyományos, rekombináns DNS és molekuláris klónozási technológiák a szakember számára jól ismertek és ismertetésük a következők munkákban található: Sambrook, J., Fritsch, E. F. és Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, kiad.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989)(Maniatis) és Silhavy, T. J., Bennan, M. L. és Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, kiad.: Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1984) és Ausubel, F. M. és mtsai., Current Protocols in Molecular Biology, kiad.: Greene Publishing Assoc. and WileyInterscience (1987).
A restrikciós enzimes emésztéseket, foszforilálásokat, ligálásokat és transzformációkat Sambrook és munkatársai leírása alapján (lásd fent) végeztük. A restrikciós enzimeket New England Biolabstól (Boston, MA) , GIBCO/BRL-től (Gaithersburg, MD) vagy Promegatól (Madison, WI) szereztük be. A Taq-polimerázt Perkin Elmertől szereztük be (Branchburg, NJ) . A táptalajok GIBCO/BRL-től származtak (Gaithersburg, MD).
Az Agrobacterium tumefaciens LBA4404 törzset Dr R. Schilperoottól, Leiden, kaptuk [Hoekema és mtsai., Nature 303, 179-180 (1983)].
Transzformációs eljárások
A biolisztikus transzformációkat alapvetően az US 4.945.050 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat alapján végeztük, amely a kitanítás részét képezi. Röviden, aranyrészecskéket (1 mm átmérőjű) DNS-sel borítunk a következő technológia szerint. A plazmid DNS 10 pg-ját 50 μΐ aranyrészecske-szuszpenzióhoz adjuk (60 mg/ml). A részecskékhez kalcium-kloridot (50 μΐ 2,5 M oldatból) és spermidin szabad bázist (20 μΐ 1,0 M oldatból) adunk. A szuszpenziót kevertetjük ezen oldatok hozzáadása alatt. Tíz perc elteltével a csöveket rövid ideig centrifugáljuk (5 sec 15000 rpm), és a felülúszót eltávolítjuk. A részecskéket 200 μΐ abszolút etanolban szuszpendáljuk, újra centrifugáljuk, és a felülúszót eltávolítjuk. Az etanolos öblítést újra elvégezzük és a részecskéket 30 μΐ végtérfogatban etanolban szuszpendáljuk. A DNS-sel borított aranyrészecs kék egy részét (5 μΐ) repülő lemez közepére helyezzük (Bio85
Rad Labs, 861 Ridgeview Dr. Medina, OH). A részecskéket kukoricaszövetbe gyorsítjuk PDS-1600/He (Bio-Rad Labs, 861 Ridgeview Dr. Medina, OH) készülékkel 1000 psi héliumnyomással, 0,5 cm réstávolsággal és 1,0 cm repülési távolsággal .
Az Agrobacterium-transzformációkat alapvetően Park és munkatársai leírása alapján végeztük [Park és mtsai., J. Plant Bioi. 38(4), 365-7 (1995)].
1. példa
Floxed” ACMV- és TGMV-monomerek készítése
A pMHP35-öt a 35SCabb:Ata-ból (Arab ALS) származó Xbal-fragmensnek pTZ18R Xbal-helyébe történő klónozásával készítettük.
Vad típusú lox-P-hely bevitele a 35S-promóter Xholés Sacl-helyei közé
Két tandem (azaz közvetlenül ismételt), vad típusú lox-P-helyet vittünk be az Xhol- és a Sacl-helyek közé a 35S-promóter:GUS:3'-nos kiméra riportergén {genebank) 5' átíródó, de nem transzlatálódó szakaszában oly módon, hogy a két lox-P-helyet egy EcoRI-hellyel választottuk el. Ehhez egy XhoI-EcoRI-adaptor-A-t [amelyet a GV48- (1. azonosítószámú szekvencia) és a GV49-láncindítópárok (2. azonosítószámú szekvencia) kapcsolásával készítettünk] és egy EcoRISacI-adaptor-B-t [amelyet GV50- (3. azonosítószámú szekvencia) és GV51-láncindítópárok (4. azonosítószámú szekvencia) hibridizálásával készítettünk] együtt ligáltunk Xhol-gyel és Sacl-gyel emésztett, 35S-promóter:GUS:3'-nos kiméra ri portergént hordozó plazmidba.
- 86 (1. azonosítószámú szekvencia) 5'-TCG AGA TAA CTT CGT ATA ATG TAT GCT ATA CGA AGT TAT G-3' (GV48) (2. azonosítószámú szekvencia) 5'-AAT TCA TAA CTT CGT ATA GCA TAC ATT ATA CGA AGT TAT C-3' (GV49) (3. azonosítószámú szekvencia) 5'-AAT TCT ATA ACT TCG TAT AAT GTA TGC TAT ACG AAG TTA TGA GCT-3’ (GV50) (4. azonosítószámú szekvencia) 5’-CAT AAC TTC GTA TAG CAT ACA TTA TAC GAA GTT ATA G-3' (GV51)
A képződő plazmidot pGV686-nak jelöltük, és a bevitt lox-P-helyekről szekvenciavizsgálattal győződtünk meg. Ezt követően a nopalin-szintázból származó poliA szignálszakaszt (3'-nos) [GenBank nyilvántartási szám: J01541 V00087] az oktopin-szintázból származóval (3'-öcs) [GenBank nyilvántartási szám: V00088 és J01820] helyettesítettük, amely a pGV690-plazmidot eredményezte.
A TGMV- és az ACMV-monomer inszerciója a pGV690-ben lévő lox-helyek közé
A módosított ACMV egyetlen kópiáját (amelyben a köpenyfehérjegén túlnyomó részét kivágtuk) a pGV596plazmidból (WO 99/22003) Mfel-fragmensként izoláltuk, és a pGV690 EcoRI-helyébe klónoztuk, amely a pGV691-et eredményezte oly módon, hogy a víruseredetű kezdőpont a 35Spromóterrel szomszédos.
A Cre azon képességét, hogy távolra ható módon aktiválja mind a GUS-expressziót, mind a vírusreplikációt először floxed vírusgenomoknak, pGV691-nek, 35S:Cre kiméra gént tartalmazó pNY102-plazmiddal Nicotiana tabacum var.
Xanthi és N. benthamiana levelekbe történő együtt bombázá sával vizsgáltuk, valamint 35S: Cre-génnel stabilan transzformált Xanthi növények leveleinek bombázásával. GUSAktivitás és replikonreplikáció csak Cre jelenlétében volt kimutatható, amely bizonyítja, hogy a GUS jó riportere a kivágódásnak, hogy a geminivírus-replikáció legalább egy lox-helyet elvisel, és hogy a Cre expressziója a kromoszómálisan integrált, kiméra Cre-génből távolra ható módon aktiválhatja a vírusreplikációt. Ha pGV691-et, pGV596d-t (egy ACMV-proreplikon egy mutáns replikációs fehérjével, amelynek ismertetése a WO 99/22003 számú nemzetközi közzétételi iratban található) és pNY102-t együtt bombázzuk, a pGV596d-ből származó proreplikon távolra ható replikációját, valamint a pGV691-ből származó replikon közeire ható replikációját figyeltük meg.
A pGV691-ben lévő PvuII-helyet Xmal-hellyé alakítottuk NEB1048 Smal-linker alkalmazásával, majd az Xmal-H3fragmenst pSK-ba klónoztuk Xmal-HindlII-helyre (Stratagene, 11011 North Torrey Pines Road La Jolla, CA 92037), amely a pGV696-ot eredményezte. A pGV699-et a ribulóz-1,5bifoszfát-karboxiláz és a nopalin-szintáz gének kis alegységének tandem, 3’ nem transzlatálódó szakaszaiból álló transzkripciós stopfragmenst tartalmazó, pGV697-ből származó Pstl-fragmensnek pGV696 Pstl-helyére történő klónozásával készítettük, a kívánt orientációban, hogy a víruseredetű replikázgén véletlen transzkripcióját a T-DNSben vagy az inszerciós helyével szomszédosán lévő növényi promóterről megakadályozzuk. A pGV699-ből származó XmalHindlII-fragmenst pBE673-ba klónoztuk, amely egy bináris vektor bar-szelekcióra (ismertetése a WO 99/22003 számú nemzetközi közzétételi iratban), és amely a pBE704-et eredményezte. Mind a floxed ACMV-vektort, mind egy replikációban sérült ACMV-mutáns dimerjét tartalmazó bináris vektor készítése érdekében a mutáns ACMV-dimert tartalmazó pGV596d SacI-Xmal-fragmensét a pBE673 bináris vektor SacI-Xmal-helyére klónoztuk, amellyel elkészítettük a pBE695-öt. Ezután a pGV699 XmaI-H3-fragmensét klónoztuk a pBE695-be, amely a pBE705-öt eredményezte. A pBE704- és pBE705-konstrukciókat N. benthamiana és N. tabacum növényekbe vittük akár egyedül, akár ACMV-proreplikon, a pGV596d jelenlétében Agrobacterium közvetítette transzformációval, amelyet az előzőekben ismertettünk. A transzgénikus növények Cre-vel történő bombázása a GUSexpresszió aktiválását mutatta, és az ACMV replikon replikációja megfigyelhető volt mind a 704-, mind a 705transzformánsokban. Továbbá, a mutáns ACMV-replikon replikációját a 705-transzformánsokban is megfigyeltük, amely az átmeneti vizsgálatból származó adatokat megerősíti. Az eredmények mutatják, hogy a kivágott replikon replikációja szignifikánsan magasabb a proreplikon hiányában, mint a jelenlétében.
A pGV690-ben lévő GUS-ORF-et a pSP-luc+-vektorból (Promega, 2800 Woods Hollow Road Madison, WI53711) származó Luc-ORF-et hordozóval helyettesítettük Ncol-Xbal alkalmazásával, és így elkészítettük a pGV716-ot. A TGMV teljes hosszúságú genomjának egyetlen kópiáját egy 2,6 kb Mfelír agmensként izoláltuk a pTAl.3-plazmidból (N. Robertson,
North Carolina State University) , és az EcoRI-helyre klónoztuk a pGV716 loxP-helyei közé, amely floxed TGMVreplikonokat eredményez a pGV731-plazmidban oly módon, hogy a víruseredetű kezdőpont a 35S-promóterrel szomszédos. A pGV731-ben lévő köpenyfehérjegént a pGV671-ből származó GUS-ORF-fel helyettesítettük (WC 99/22003 számú nemzetközi közzétételi irat) Nde/Sall alkalmazásával, amely a pGV733at eredményezi. A pGV733 SglII-től ífindlll-ig terjedő fragmensét BamHI/HíndlII-mal hasított pBE673-be klónoztuk, amely a pBE733-at, egy bar bináris vektort eredményez.
A pBE736 bináris vektort úgy készítettük, hogy azonos legyen a pBE733-mal azzal a kivétellel, hogy az egyik loxhelyet vad típusú P-ből mutáns lox72-re [Albert és mtsai., Plant J. 2' 649-59 (1995)] cseréltük. A mutáns loxhelyekkel bíró, floxed replikonokat egy bináris vektorba vittük, és a módosított bináris vektorokat Agrobacteriwn tumefaciensbe vittük és növényekbe transzformáltuk Agrobacterium közvetítette transzformációval. A növények utódait összegyűjtöttük és helyesen szabályozott Cre-gént tartalmazó vonalakkal kereszteztük.
A pBE733 és pBE736 bináris vektorokat Agrobacteriumba transzformáltuk és dohánynövény (Nicotiana tabacum var. Xanthi) és Nicotiana benthamiana levéllemezekbe vittük Agrobacterium közvetítette transzformációval (25 ml Agrobacterium tenyészettel 1,0 OD A600 értéknél). Három nap MS-tápközegen történő inkubálás után a lemezeket 6 héten keresztül inkubáltuk hajtató tápközegen (1 mg/ml claforannal, 1 μg/ml BAP-pal, 0,1 μg/ml NAA-val kiegészí tett MS-tápközeg) , amely dohánynövény esetében 10 μg/ml PPT-t és Nicotiana benthamiana esetében 6 μg/ml PPT-t tartalmaz (Sigma Chemical Co., 6050 Spruce St., St. Louis, MO 63103). A BE733-transzformánsokban Southern-vizsgálattal bizonyítottuk a transzgén jelenlétét, és Southern-blottal vizsgáltuk a replikációt és a GUS-expressziót 35S:Cre-gént tartalmazó pNY102-plazmiddal történő bombázás során.
A pBE733-ból származó floxed TGMV-t tartalmazó transzgénikus dohánynövényt és Nicotiana benthamiana-t kaptunk. Transzgénikus levél vagy növény bombázása PVX:Cre-vel és 35S:Cre-vel eltérő GUS-festődést adott, amely replikáció esetén várható. A Nicotiana benthamiana 733#23-vonal Tlutódnövényeit PVX-Cre-vel fertőztük. Ez a fertőzött levelekben egészen 25 napig tartó GUS-expressziót eredményezett megfigyelhető elfőjtódás nélkül. Ezek az eredmények bizonyítják, hogy az inaktív replikon örökölhető és Creközvetítette kivágással aktiválható.
2. példa
Inaktív PVX-GFP- és PVX-GUS-amplikonok lox-helyekkel
A pVX201-, a pTXS-GFP- és a TXGC3S.vec-plazmidokat Dr. D. Baulcombe-tól kaptuk (The Sainsbury Laboratory, John Innes Centre, Norwich Research Park, Norwich Research Park, NR4 7UH, UK). A pVX201 a 35S:PVXcDNS:3’nos kiónját ('PVXamplikon’) tartalmazza, a pTXS-GFP a T7-promóter:PVX-GFPGFP-konstrukciót tartalmazza, a TXGC3S.vec a T7 promóter:PVX-GFP-konstrukciót tartalmazza. A GFP- és a GUSORF-eket a PVX-köpenyfehérje-promóter mögé klónoztuk.
A PVX-GFP-t ('PVX-GFP-amplikon’) tartalmazó pGV680-at a pVX201-amplikon SacI-AvrII-tragmensének a GFP-ORF-et tartalmazó pTXS-GFP-ből származó SacI-Avrll-fragmenssel történő helyettesítésével készítettük. A PVX-GUS-t (’PVX-GFPamplikont’) tartalmazó pGV681-et a pVX201-amplikon SaclAvrlI-fragmensének a GUS-ORF-et tartalmazó TXGC3S.vec SaclAvrll-fragmensével történő helyettesítésével készítettük. A pGV680, illetve a pGV681 víruseredetű RNS-függő RNSpolimerázának nyitott leolvasási keretében egy kereteltolódási mutáció a pGV682-, illetve a pGV683-plazmidokat eredményezte. Ezt a mutációt a pGV680- és a pGV681-DNS-eknek Agel-gyel történő hasításával, a végek kitöltésével és újraligálással készítettük.
Nicotiana benthamiana leválasztott leveleit a fenti plazmidokkal bombáztuk biolisztikus ágyú alkalmazásával. A bombázás után 10-14 nappal a levelek vizsgálata azt mutatta, hogy GFP-fluoreszcencia a pGV680-nal bombázott levelekben kimutatható volt, a pGV682-vel bombázottakban viszont nem, és a pGV681-gyel bombázott levelekben GUS-festődés kimutatható volt, míg a pGV683-ban nem. Ez bizonyítja, hogy a riportergén-expresszió működőképes, víruseredetű RNSirányította RNS-polimeráztól (RdRP) függ, és hogy a riportergének replikáció kimutatására alkalmazhatók.
Ha pGV681-et bombáztunk sziklevelekbe, körülbelül 50100 mg szójababeredetű zigotikus embriókkal, a GUS-festődés a PVX-vektor replikációját mutatta ki 10-14 nappal a bombázást követően. Ez azt mutatja, hogy a PVX magszövetben és olyan eltérő növényfajokban, mint Glycine max és Nicotiana benthamiana replikálódni tud.
Fordított, mutáns lox-helyek bevitele PVX-amplikonokba
Egy mutáns lox-helyet (lox43) vittünk be PCR-rel PVXGFP-amplikonba. Ehhez egy PCR-termék-I-et, illetve egy PCRtermék-II-t készítettünk el pGV681 templátként történő alkalmazásával és I. PCR-láncindítópárok [5. azonosítószámú szekvencia, (GV70, felső láncindító) és 6. azonosítószámú szekvencia (GV71, alsó láncindító)], illetve II. PCRláncindítópárok [7. azonosítószámú szekvencia (GV73, felső láncindító) és 8. azonosítószámú szekvencia (GV72, alsó láncindító)] alkalmazásával.
[5. azonosítószámú szekvencia] 5'-GCG GCA TGC GTC GAC ACA TGG TGG AGC ACG ACA-3' (GV70)
[6. azonosítószámú szekvencia] 5'-GCC GGG TAC CGA GAC GCG TCA TCC CTT ACG-3' (GV71)
[7. azonosítószámú szekvencia] 5'-GTC TCG GTA CCT ATA ATG TAT GCT ATA CGA AGT TAT ATA AGG AAG TTC ATT TCA-3' ÍGV73)
[8. azonosítószámú szekvencia] 5'-TGA TCC GCG GGT TTC TTC TCA TGT-3' (GV72)
A PCR-termék-I-et SphI-gyel és Asp718-cal emésztettük, a PCR-termék-II-t Asp718-cal és SacII-vel emésztettük, amely 369 bp, illetve 464 bp nagyságú fragmenseket eredményezett. A pGV680-plazmidot SphI-gyel és GacII-vel emésztettük, és a 9792 bp vektort három utas ligálással a két PCR-fragmenssel ligáltuk, amely az amplikon 35S-promó terében lévő As-l-elem és a TATA-box között mutáns lox43 helyet tartalmazó pGV701-plazmidot eredményezi.
Egy mutáns lox-helyet (lox44) adaptor-ligálással építettünk be a nem transzlatálódó szakaszba 5'-irányba a pGV681-ben lévő GUS-ORF-hez. Ehhez a pGV681-et Xmal-gyel emésztettük és egy adapterhoz ligáltuk, amelyet a következő két, 51-mer láncindítók párosításával készítettünk:
[9. azonosítószámú szekvencia] 5'-CCG GGA ATG CAT GCT ATA GCA TAC ATT ATA CGA AGT TAT TCG AAT TTA AAT-3'
[10. azonosítószámú szekvenmcia] 5'-CCG GAT TTA AAT TCG AAT AAC TTC GTA TAA TGT ATG CTA TAG CAT GCA TTC-3'
A ligáit DNS Swal-gyel történő emésztését követően a lineáris DNS-t izoláltuk, újra ligáltuk és E. coliba transzformáltuk, amely a pGV700 jelű plazmidot eredményezte. A lox44 PVX-GUS-amplikonba történő beépítése a GUS-ORF N-terminális végének 31 aminosavval történő kitérjesztését eredményezi. A pGV700-ban, illetve a pGV701-ben lévő mutáns 1οχ43-, illetve lox44-helyeket DNS-szekvenciavizsgálattal bizonyítottuk.
A két, fordított lox-helyet tartalmazó PVX-GFP és PVX-GUS-amplikonokat a fenti mutáns lox-helyek egyesítésével készítettük. A PVX-GUS esetében a pGV701 GFP-ORF-et tartalmazó AvrII-SacI-fragmensét a pGV700-éval helyettesítettük, amely a lox44-et és a GUS-ORF-et hordozza, és így kaptuk a pGV702-t. A PVX-GFP esetében a pGV701-ben lévő 4432 bp nagyságú Agel-Cial-fragmenst helyettesítettük a pGV700 lox44-et hordozó, 4476 bp nagyságú Agrel-BstBI.· · :a .* :..
- 94 fragmensével, amely a pGV708-at eredményezte a GFP Nterminális végén 23 aminosavval történő kiterjesztésével.
Nicotiana benthamiana leválasztott leveleit pGV700-, pGV701-, pGV702- és pGV708-plazmidokkal bombáztuk biolisztikus ágyú alkalmazásával. A bombázás után 10-14 nappal a levelekben a riportergének expressziója alapján replikációt mind a négy esetben megfigyeltünk, bár a replikáció szintje alacsonyabb volt a pGV708-ban. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy lox-helyek beépítése növényi promóterbe és/vagy a riportergénhez 5’-irányba, intergénikus szekvenciába nem befolyásolja a replikációt. A gyengébb GFPfluoreszcencia a pGV708-ban a GFP-fehérje N-terminális kiterjesztésének következménye lehet.
Egy nem működőképes amplikon előállítása céljából a pGV702-t és a pGV708-at Cre-t expresszáló baktériumon keresztül passzáltuk, vagy tisztított Cre-enzimmel (Novagen, Madison WI) inkubáltuk, hogy megfordítsuk a szekvenciát a fordított lox-helyek között. Egyik plazmidban sem sikerült azonban inverziót kimutatni. Ez feltehetőleg az ezekkel a mutáns lox-helyekkel - amelyek a Cre-lox-rekombinációban a legkevésbé hatékonyak voltak - elérhető gyenge hatékonyságú inverziónak köszönhető.
Fordított, vad típusú lox-P-helyek bevitele PVXamplikonokba
Vad típusú lox-P-helyet klónoztunk adapterként a pGV701-plazmidban lévő GFP-ORF-hez 5’-irányban lévő intergénikus szakaszban lévő Cdal-helybe, amelyet Xmal-gyel történő emésztés követett, majd a lineáris vektor izolálása és önmagával történő ligálása, amely a pGV712-plazmidot eredményezi. Az adaptert a GV78-láncinditó (11. azonosítószámú szekvencia) és a GV77-láncindító (12. azonosítószámú szekvencia) párosításával készítettük.
[11. azonosítószámú szekvencia] 5'-CGA TAA CTT CGT ATA ATG TAT GCT ATA CGA AGT TAT CCC GGG-3' (GV78)
[12. azonosítószámú szekvencia] 5’-CGC CCG GGA TAA CTT CGT ATA GCA TAC ATT ATA CGA AGT TAT-3' (GV77)
A pGV712-t>en lévő 35S-promóterben lévő mutáns lox43helyet vad típusú lox-P-hellyel helyettesítettük a következők szerint. PCR-Terméket készítettünk pGV712 templát-DNSen felső láncindítóként GV74 (13. azonosítószámú szekvencia) és alsó láncindítóként GV72 (8. azonosítószámú szekvencia) alkalmazásával.
[13. azonosítószámú szekvencia] 5'-GAT GAC GCG TAT AAC TTC GTA TAA TGT-3’ (GV74)
A PCR-terméket Mlul-gyel és SacII-vel emésztettük, és a képződő terméket alkalmaztuk a lox44-et tartalmazó MlulSacII-fragmens helyettesítésére pGV712-ben, amely a pGV713plazmidot eredményezte. A pGV713 két, fordított, vad típusú lox-P-helyet tartalmaz. A pGV713 inkubációja Crerekombinázzal a gyártó útmutatása szerint (Novagen, Madison, WI) megfordítja az RNS-függő RNS-polimerázt tartalmazó, lox-P-helyek közötti DNS-szekvenciát, amely egy nem funkcionális amplikont eredményez a pGV714-plazmidban. A pGV714-plazmidot E. coli XLl-sejtek transzformációját kö vetően tisztítottuk.
Vad típusú lox-P-helyet klónoztunk adaptorként a pGV702-plazmidban lévő GUS-ORF-hez 5'-irányban lévő, intergénikus szakaszban lévő Clal-helybe. Ehhez a pGV702plazmidot Xmal-gyel linearizáltuk és a GV80-láncindítóból (14. azonosítószámú szekvencia) és a GV81-láncindítóból (15. azonosítószámú szekvencia) párosított adapterhoz ligáltuk.
[14. azonosítószámú szekvencia] 5'-CCG GGG ATA ACT TCG TAT AGC ATA CAT TAT ACG AAG TTA TTC GAA CAT TTA AAT-3' GV8 0
[15. azonosítószámú szekvencia] 5'-CCG GAT TTA AAT GTT CGA ATA ACT TCG TAT AAT GTA TGC TAT ACG AAG TTA TCC-3' GV81
A képződő, pGV702W-nek jelölt plazmidot alkalmaztuk fordított, vad típusú lox-P-helyeket tartalmazó PVX-GUS elkészítéséhez. Ennek érdekében a pGV713 GFP-ORF-et tartalmazó AvrII-SacI-fragmensét a pGV702W lox-P-t és GUS-ORF-et hordozó AvrII-SacI-fragmensével helyettesítettük, és így kaptuk a pGV708W-t.
Azt, hogy a fordított, nem funkcionális amplikonok nem képesek replikálódni, ha Cre-közvetítette inverzióval nem alakulnak funkcionális amplikonná Nicotiana benthamiana levelek bombázásával bizonyítottuk. A pGV712- és a pGV713plazmidok replikálódtak és elterjedtek a bombázott levelekben. Ez abból látható, hogy 10-14 nappal a bombázás után GFP-fluoreszcencia kimutatható volt. A pGV714-plazmid azonban nem replikálódik, hacsak nem pNY102-plazmiddal együtt bombáztuk, amely plazmid 35S-promóter ellenőrzése alatt
Cre-t expresszál. A pGV714-ből származó, fordított, nem funkcionális amplikont tartalmazó, 3,01 kB BspEl-SacIfragmenst Xmal-gyel (BspEl-gyel kompatibilis) és Sacl-gyel hasított pBE674-be, egy bináris, növényekben bar-szelekciót lehetővé tevő vektorba klónoztuk a fentiekben ismertetettek szerint, amely a pBE714-et eredményezi. A pBE714-et Agrobacterium LBA4404 közvetítésével vad típusú Nicotiana benthamiana növényekbe vittük a fentiekben ismertetettek szerint. A növényeket PPT-vel szelektáltuk 30 gg/ml foszfinotricin hajtató, majd 10 μ?/ιη1 gyökereztető tápközegen. Tíz transzformánst (714B # E-5, E-6, G-l, M-4, M-6, M7, Q-l, S-4, LL-1, UU-1) nyertünk. Southern-vizsgálattal kimutattuk, hogy az M-7 és a Q-l kivételével mindegyik pozitív a transzgénre nézve. Fenotípusosan mindegyik normális, és víruseredetű tüneteket egyik sem mutatott.
A transzformánsoknak azt a képességét, hogy Creexpresszióval távolra ható módon aktiválhatok Cre-t expresszáló PVX-szel történő fertőzéssel vizsgáltuk. Öt pozitív 714B transzgénikus növényből (LL-1, UU-1, E-5, M-4 és S4) származó levelet részecskeágyúval bombáztunk kiméra 35S:Cre-gént hordozó plazmid-DNS 1 μg-jával az amplikonaktiváció vizsgálatára, kontrollként csak aranyrészecskével bombáztunk. Körülbelül 5 nap múlva GFP-expressziót figyeltünk meg a 35S:Cre-vel bombázott, öt transzgénikus növény közül három (LL-1, M-4 és S4) leveleiben, viszont a kontrollként csak aranyrészecskékkel bombázott levelekben nem. Körülbelül 12 nap elteltével a 35S:Cre-vel bombázott transzgénikus levelekben a GFP-expresszió megszűnt, amely
- 98 - ·:·· ··’’ azt mutatja, hogy elfojtás történhetett, amely gyakran tapasztalható vad típusú leveleknek PVX-GFP-vel történő fertőzése során. A Cre-aktivált levelekben a GFP expressziós szintje, terjedése és időtartama összehasonlítható volt a közvetlenül vad típusú N. benthamiana levelekbe bombázott PVX:GFP-ével.
A 714B LL-1 jelű transzgénikus növény nyolc Tlutódnövénye közül öt mutatott GFP-expressziót 35S:Cre-vel történő bombázás során. Tizenkét másik utódnövényből származó, leválasztott levél hasonló bombázása során azt tapasztaltuk, hogy az aktiválásra nézve 11 volt pozitív. Az inaktív vírus tehát örökíthető és az utódok Cre-vel aktiválhatok. A Cre-vel aktivált utódnövényekben a GFP expressziós szintje, elterjedése és időtartama kissé eltért a Tl-utódok egyedei között, de általában véve összehasonlítható volt a közvetlenül vad típusú N. benthamiana magoncokba bombázott PVX:GFP-ével.
A 714B transzgénikus vonalakat genetikailag egyesítettük helyesen szabályozott Cre-kiméra génekkel, például ilyen Cre-géneket hordozó transzgénikus vonalakkal történő keresztezéssel.
3. példa
Kivágódással (excízióval) inaktivált PVX-amp11konok
Tandem lox-helyekkel szegélyezett, PVX-RNSvírusreplikon elkészítése érdekében két PCR-terméket készítettünk a pGV680-on: egy 438 bp PCR-terméket, amely a TATAboxot (minimális promoter) és a lox-P-helyet tartalmazza, a GV85-láncindító (16. azonosítószámú szekvencia) (Sphl hellyel) és a GV86-láncinditó (17. azonosítószámú szekvencia) (Notl-helyekkel) alkalmazásával készítettük, és egy 441 bp PCR-terméket, amely egy mutáns lox-helyet (loxD117) [Abrenski, K. és Hoess, R., J. Mól. Bioi. 184, 211-220 (1985)] és a PVX cDNS 5'-végét tartalmazza, GV87-láncindító (18. azonosítószámú szekvencia) (Nótl-hellyel) és GV88láncindító (19. azonosítószámú szekvencia) (SacII-hellyel) alkalmazásával készítettük. A két PCR-terméket ezután Notlgyel emésztettük, ligáltuk és templátként alkalmaztuk PCRhez a következő láncindítópárok alkalmazásával: GV105- (20. azonosítószámú szekvencia) és GV88-láncindítók (19. azonosítószámú szekvencia), amely 509 bp nagyságú PCR-terméket eredményezett. A képződő PCR-terméket SphI-gyel és SacIIvel emésztettük, és az 509 bp fragmenst, amely a TATA-boxot (minimális promoter) és azt követően tandem, vad típusú és mutáns (D117) lox-P-helyeket tartalmaz az amplikon cDNS elején, izoláltuk és SphI-gyel és SacII-vel emésztett pGV680-ba klónoztuk, amely a pGV720-at eredményezte. A pGV720 tehát egy PVX-GFP-amplikon minimális 35S-promóterrel és tandem loxP- és loxD117-helyekkel a TATA-box és a transzkripciós starthely között. A pGV720 N. benthamianaba bombázva nem replikálódott hatékonyan, ezért a teljes hosszúságú promóterrel helyettesítettük, amelyet egy 438 bp PCR-termékként izoláltunk GV85 PCR-láncindító (16. azonosítószámú szekvencia) (SphI-hellyel) és GV86-láncindító (17. azonosítószámú szekvencia) (Notl-hellyel) alkalmazásával pGV680-on, és az SphI-Notl-gyel emésztett pGV720-ba klónoztuk, amely a pGV740-et eredményezte. A pGV740 tehát
- 100 egy PVX-GFP-amplikon 35S-promóterrel és tandem loxP- és loxD117-helyekkel a TATA-box és a transzkripciós starthely között. A pGV740 N. benthamianaba bombázva replikálódni képes Cre-t expresszáló gén nélkül is, amely azt mutatja, hogy az amplikonnak legalább 66 bp lehet a TATA-box és a PVX-cDNS 5'-vége között.
Bár a pGV740 könnyen inaktiválható egy transzkripciós stopfragmensnek a Notl-helybe történő beépítésével, mint ez a 3. ábrán látható, úgy döntöttünk, hogy excíziós replikont készítünk, amely fizikailag kivágja az RNS-vírusamplikont a kromoszómából helyspecifikus rekombináció esetén. Ennek érdekében a PVX-cDNS végén lévő promótert elmozdítottuk először a promoter deletálásával oly módon, hogy egy Xmal/Notl/Xmal-adaptert [GV157-láncindító (21. azonosítószámú szekvencia) és GV158-láncindító (22. azonosítószámú szekvencia)] ligálunk a pGV740 Xmal-helyéhez, majd Notlgyel emésztjük és újra ligáljuk. Ily módon a pGV760-at készítettük el, amely egy promoter nélküli PVX-GFP-amplikon egy mutáns loxD117-hellyel a transzkripciós starthelytől 5'-irányban. A következőkben élesztő 2u-trp-fragmenst izoláltunk PCR-rel GV165-láncindító (23. azonosítószámú szekvencia) és GV166-láncindító (24. azonosítószámú szekvencia) alkalmazásával és SphI-gyel hasított pGV760 SphI-helye körüli rekombinációval klónoztuk a vektor transzformálásával és élesztőbe történő irányításával. A trp-re prototróf élesztőkolóniákból DNS-t izoláltunk és E. coliba transzformáltuk. Az ampicillinrezisztens E. coliról bebizonyosodott, hogy a kívánt, élesztő-E. coli vándorló (shuttle) * · ϋ«· · ···
-ιοίplazmid, a pGV774. A 391 bp nagyságú 35S-promóter+loxPhelyet PCR-rel izoláltuk GV170-láncinditó (25. azonosítószámú szekvencia) és GV171-láncindító (26. azonosítószámú szekvencia) alkalmazásával pGV740-en a loxP-hely 3'-végénél lévő Xmal-hellyel, és élesztő rekombinációval klónoztuk a pGV774-ben lévő Mari-helyet szegélyező szakaszokon 20 bp átfedés alkalmazásával. A képződő plazmid, a pGV783 egy élesztő-E. coli átviteli vektor, amely tandem vad típusú és loxD117-helyekkel szegélyezett, floxed, excíziós PVX-GFPamplikont tartalmaz. Az 1. ábrán mint excíziós amplikont a B-elem képviseli az A- és/vagy a C-elemekkel vagy nélkülük.
Inaktív, mozgásban sérült, excíziós PVX-amplikon A pGV783-ban lévő excíziós PVX-GFP-amplikonban lévő köpenyfehérjegént a pGV783 Xhol-gyel és Sall-gyel történő emésztésével kivágtuk, majd újra ligáltuk, amely a mozgásban sérült amplikont, a pGV819-et eredményezte. Ezt a mutáns amplikont Xmal-fragmensként izoláltuk és pBIN19 bináris vektor Xmal-helyére klónoztuk, amely a pBE819-et eredményezte. Ezt dohánynövényekbe vittük be Agrobacterium közvetítette transzformációval.
Inaktív, excíziós PVX-amplikon kettős riporterrel idegen fehérje expressziéja számára
Annak bizonyítására, hogy az amplikonok mind idegen fehérje expresszálására, mind endogén gén elfojtására alkalmazhatók, a pGV784-et készítettük el. Ez a konstrukció vad típusú és loxD117-helyekkel bíró, floxed, excíziós PVX-CP-GFP-PDS-amplikont tartalmazó élesztő-E. coli átviteli vektor. A pGV770-ből származó 3,6 kb AvrII/SacI-sávot
Avril/Sacl-gyei hasított pGV783-ba klónoztuk. A pGV770 PVXGFP-PDS-CP-amplikon. Ez egy kiméra, amely GFP-ORF-ből (740 bp) áll, amelyet N. benthamiana fitén-deszaturáz cDNS-ének részleges, körülbelül 200 bp fragmense követ. Két lépéses PCR-rel készítettük el. Először a teljes GFP-ORF-et izoláltuk PCR-rel a pGV680-on GV162-láncindító (27. azonosítószámú szekvencia) és GV163—láncinditó (28. azonosítoszamú szekvencia) alkalmazásával, és egy 200 bp N. benthamiana fitén-deszaturáz szekvenciát izoláltunk PCR-rel GV133láncindító (29. azonosítószámú szekvencia) és GV109-láncindító (30. azonosítószámú szekvencia) alkalmazásával pGV723-plazmidon, amely egy részleges N. benthamiana fiténdeszaturáz cDNS-kiónt tartalmaz [Ruiz és mtsai., Plant Cell 10, 937-946 (1998)]. Mivel ezeknek a láncindítóknak a 3’végén 18 bp szekvencia a fitén—deszaturaz szekvenciára specifikus, ezek a 18 bp szekvenciák a szekvencia közvetlen izolálására is alkalmazhatók N. benthamiana levélből izolált mRNS-ből végzett RT-PCR-rel a szakember számára jól ismert technológiákkal. Ezt követően ezt a két fragmenst a láncindítókkal bevitt Agel/Xmal-helyekkel ligáltuk és PCRrel újra ampl i f i kai tűk GV162 —lancindito (27. azonosítoszamú szekvencia) és GV109—láncinditó (30. azonosítoszamú szekvencia) alkalmazásával. Az egész, kiméra GFP-PDS-fragmenst Clal-gyel és Xhol-gyel emésztettük és pVX201 Clal-Sallhelyeibe klónoztuk, amely a pGV770-et eredményezte. A pGV770-ből származó 3,6 kb AvrII/SacI-et AvrII/Sacl-gyel hasított pGV783-ba (lásd alábbiakban) klónoztuk, amely a pGV784-plazmidot eredményezte. Ebben az esetben a pGV784- 103 -
ben lévő, exciziós amplikon az 1. ábrán lévő B-elemet képviseli A- és C-elemek nélkül. Ezt 8,387 kB Xmalfragmensként izoláltuk és pBIN19 bináris vektor Xmalhelyébe klónoztuk, amely a pBE784-et eredményezte, amelyet dohánynövénybe vittünk Agrobacterium közvetítette transzformációval .
•
Az előző tárgyalásban említett láncindítókat az alábbiakban adjuk közre:
GV85 ’-GAG GCA TGC CCG GGC AAC ATG GTG GAG CAC GAC A-3' (16. azonosítószámú szekvencia)
GV8 6
5'-TAT GCG GCC GCA TAA CTT CGT ATA GCA TAC ATT ATA CGA AGT TAT ATA GAG GAA GGG T-3' (17. azonosítószámú szekvencia)
GV87
TCC TTG ATC CGC GGG TTT CTT CTC ATG T (18. azonosítószámú szekvencia)
GV88
5'-TCC TTG ATC CGC GGG TTT CTT CTC ATG T-3' (19. azonosítószámú szekvencia)
GV105
5'-CAC GCA TGC ACT ATC CTT CGC AAG ACC C-3' (20. azonosítószámú szekvencia)
GV157
5'-CCG GGG CGG CCG CAT AC-3' (21. azonosítószámú szekvencia)
- 104 GV158
5'-CCG GGT ATG CGG CCG CC- 3' (22. azonosítószámú szekvencia)
GV165
5'-ACC ATG ATT ACG CCA AGC TTA AGA AAA GGA GAG GGC CAA GA-3' (23. azonosítószámú szekvencia)
GV166
5'-AGT TAT GCG GCC GCC CCG GGC ATA TGA TCC AAT ATC AAA GGA-3' (24. azonosítószámú szekvencia)
GV17 0
5'-GCG CAG CCT GAA TGG CGA ATG GCG CCC CAA AAA TAT CAA AGA TAC A-3' (25. azonosítószámú szekvencia)
GV171
5'-AAG GAG AAA ATA CCG CAT CAC CCG GGA TAA CTT CGT ATA GCA TAC A-3' (26. azonosítószámú szekvencia)
GV162 (25-mer)
5'-GCC AAT CGA TCA TGA GTA AAG GAG A-3' (27. azonosítószámú szekvencia)
GV163 (35-mer)
5'-GCT AAC CGG TAG ACA TTT ATT TGT ATA GTT CAT CC-3' (28. azonosítószámú szekvencia)
GV133 (34-mer)
5'-GAA GTC GAC CGC GGG CAG ACT AAA CTC ACG AAT A-3'
GV109 (30-mer)
5'-GAA TTC TCG AGC CAT ATA TGG ACA TTT ATC-3' (30.
azonosítószámú szekvencia)
- 105 4. példa
Inaktív PVX-replikonnak és elfojtó szuppresszorgénnek együttes aktiválása helyspecifikus rekombinációval
Kétféle eljárással elfojtó szuppresszorgént építünk be a lox-ot tartalmazó PVX-amplikonokba. Az egyik eljárás szerint az elfojtó szuppresszorgén ORF-jét az 1-3. ábrákon bemutatott amplikonokban lévő célgénnel vagy köpenyfehérjeORF-fel helyettesítjük oly módon, hogy az elfojtó szuppresszor a replikonon legyen. A másik eljárás szerint az elfojtó szuppresszor ORF-jét az excíziós riporterrel helyettesítjük oly módon, ahogy azt a C-elem szemlélteti, és a transzkripciós/transzlációs stopfragmensként működő, floxed amplikont az 1. ábrán a B-elem szemlélteti. Bármelyik esetben az amplikon aktivációja az elfojtó szuppresszorgén expresszióját is aktiválja, amely legyőzi a gazda homológiafüggő elfojtást érintő, vírusellenes védekező rendszerét, és nagyobb mértékű replikációt és idegen fehérje magasabb szintű termelődését eredményezi.
Inaktív(fordított)PVX-replikon és elfojtó szuppresszorgén együttes aktiválása helyspecifikus rekombinációval
A pGV714 nem funkcionális PVX-GFP-amplikon fordított loxP-helyekkel, amelynek elkészítését a fentiekben ismertettük. Ezt alkalmaztuk köpenyfehérjét helyettesítő vektorok, a pGV806 és a pGV808 készítéséhez. A pGV806 esetében a pGV714-ben lévő köpenyfehérje ORF-jét HC-Pro elfojtó szuppresszor ORF-jével (dohány karcolatos vírus, tobacco etch vírus genomjának 1057-2433 bázisai, GenBank nyilván- 106 *·*:.**. .·· ··«.
♦ » ··· . ·♦♦ *»·* ···· *«·* V» tr· tartási szám: M15239) vagy Pl-HC-Pro ORF-jével helyettesítettük (dohány karcolatos vírus genomjának 145-2433 bázisai, GenBank nyilvántartási szám: M15239) , amelyet a Ptl0059-plazmidból (American Type Culture Collection, ATCC 45035) izoláltunk. Ezt a klónozást homológ rekombinációval hajtottuk végre élesztőben [Hua, S. B. és mtsai., Plasmid 38(2), 91-6 (1997); Oldenburg, K. R. és mtsai., Nucleic Acids Res. 25(2) , 451-2 (1997) és Prado, F. és mtsai., Curr. Genet. 25(2)Febr., 180-3 (1994)]. Ennek érdekében először is az élesztő szelekciós markert (trp) és a 2 mikron élesztő replikációs origót tartalmazó PCR-fragmenst készítettük el P216 PCR-láncindító (31. azonosítószámú szekvencia) és P217-láncindító (32. azonosítószámú szekvencia) alkalmazásával. Ezeknek a láncindítóknak az 5'-végi 25 bázisa homológiát mutat a pGV714 E. coli vektorában lévő KasI bármelyik végével, így a PCR-termék együttes transzformációja a Kasl-gyel linearizált pGV714-gyel élesztősejtekbe az élesztőeredetű fragmens klónozását eredményezi résjavítás (gap repair) útján (homológ rekombináció a vektorban lévő Kasl-en keresztül), amely egy E. coli-élesztő átviteli vektort, a pGV800-at eredményezi. Ezt követően a HC-Pro-t vagy a Pl-HC-Pro-t tartalmazó PCR-termékekét készítettük el P233-P235 PCR-láncindítópárok (33., illetve 35. azonosítószámú szekvenciák) és P234-P235 PCR-láncindítópárok (34., illetve 35. azonosítószámú szekvenciák) alkalmazásával pTL0059-en. A P233-ban lévő 33, 5'-végi bázis és a P234-ben lévő 30, 5'-végi bázis homológ a köpenyfehérje-promóterrel, • ♦ ··« * ·*«♦ .Φ
- 107 míg a P235-ben lévő 31, 5'-végi bázis a köpenyfehérje-ORF 3'-végi nem transzlatálódó szakaszával (UTR) homológ.
A HC-Pro- vagy a Pl-HC-Pro-PCR-termékek együttes transzformációja a Stul-gyel linearizált pGV800-zal résjavítást (homológ rekombinációt a köpenyfehérje-ORF-ben lévő Stul-helyen keresztül) és a köpenyfehérjét kódoló szekvenciának a HC-Pro-val vagy a Pl-HC-Pro-val történő helyettesítését eredményezi, amellyel a pGV806, illetve a pGV808 jön létre. Ezek az elfojtó szuppresszorok helyettesítik a 2. ábrán bemutatott amplikonokban lévő köpenyfehérje-ORFet.
A fentiekben ismertetett láncindítókat az alábbiakban mutatjuk be:
P216 (46-mer)
5'-TGC GTA AGG AGA AAA TAC CGC ATC AAA GAA AAG GAG AGG GCC AAG A-3' (31. azonosítószámú szekvencia)
Az 5'-végi 25 bázis (aláhúzással jelölve) a pGV714vektorral, a 3'-végi 21 bázis az élesztőeredetű fragmenssel homológ.
P217 (47-mer)
5'-GCG CAG CCT GAA TGG CGA ATG GCG CCA TAT GAT CCA ATA TCA AAG GA-3' (32. azonosítószámú szekvencia)
Az 5'-végi 25 bázis (aláhúzással jelölve) a pGV714vektorral homológ, és a 3'-végi 22 bázis az élesztőeredetű fragmenssel homológ.
P233 (52 bp felső láncindító a HCP-hez)
5'-AAC GGT TAA GTT TCC ATT GAT ACT CGA AAG ATG AGC
GAC AAA TCA ATC TCT GA-3' (33. azonosítószámú szekvencia)
- 108 Αζ 5'-végi 33 bázis (aláhúzással jelölve) a pGV800ban lévő PVX köpenyfehérje-promóterrel, és a 3'-végi 20 bázis a HC-Pro kódoló szekvencia 5'-végével homológ.
P234 (50 bp felső láncindító a Pl-HC-Pro-hoz)
5'-AAC GGT ΤΑΆ GTT TCC ATT GAT ACT CGA AAG ATG GCA CTG ATC TTT GGC AC-3' (34. azonosítószámú szekvencia)
Az 5'-végi 30 bázis (aláhúzással jelölve) a pGV800ban lévő PVX köpenyfehérje-promóterrel homológ, és a 3'végi 20 bázis a Pl-HC-Pro kódoló szekvencia 5'-végével homológ .
P235 (53 bp alsó láncindító a HCP-hez) 5' -GGG GTA GGC GTC GGT TAT GTA GAC GTA GTT ATC CAA CAT TGT AAG TTT TCA TT-3' (35. azonosítószámú szekvencia)
Az 5'-végi 31 bázis (aláhúzással jelölve) a pGV800ban lévő PVX köpenyfehérje-szekvencia 3' nem transzlatálódó szakaszával (UTR) homológ és a 3'-végi 22 bázis a HC-Pro kódoló szekvencia 3'-végével homológ.
Ezeket a módosított, GFP-t és elfojtó szuppresszorokat köpenyfehérje nélkül hordozó PVX-cDNS-eket alkalmazzuk dohánynövények szakember számára ismert, Agrobacterium közvetítette transzformációjához. A pGV806ban lévő amplikont például 8,3 kB Bspel- és Xmalfragmensként izoláltuk és Xmal-gyel linearizált pBI101-be klónoztuk. Szabályozott, Cre-közvetítette rekombináció esetén szisztémás terjedés nélküli vírusreplikáció és az elfojtó szuppresszor együttes aktiválása fokozza az idegen fehérje, ebben az esetben a GFP termelődését.
- 109 Inaktív,excí ziós PVX-replikon és elfőj tó szuppresszorgén együttes aktiválása helyspecifikus rekombinációval
A PVX-cDNS-t és a pGV783-plazmidból származó 35Spromótert tartalmazó lox-helyek közötti teljes szakasz izolálható és lox-helyek közé klónozható az 1. ábra szerint Belemként az A- és/vagy a C-elemekkel. Ehhez a lox-helyek szekvenciája vagy a lox-helyek körüli szekvencia az excízió (kivágás) előtt a következő:
atgATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT (36. azonosítószámú szekvencia) - inaktív PVX-amplikon
-TAANTAAATAACT TCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT (37. azonositószámú szekvencia)Q, és az excízió után:
atgATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT (38 . azonosítószámú szekvencia)Q, amelyben a kis betűs kodon az iniciációs kodon, az aláhúzott szekvenciák az inaktív replikont szegélyező, vad típusú loxP-hely, N bármilyen bázis és Q az elfojtó szuppresszor kódoló szekvenciája oly módon, hogy keretben legyen az iniciációs kodonnal a kivágódás (excízió) után. Ily módon az elfojtó szuppresszor addig nem transzlatálódik, amíg a gátló fragmens ki nem vágódik, hogy helyreállítsa a megfelelő olvasási keretet. A vad típusú loxszekvencia mutánssal is helyettesíthető a szakember számára ismert eljárásokkal a jobb, feltételes specifitás kedvéért, míg ez a transzlációs aktiválás megmarad.
- 110 -
5. példa
Inaktív (floxed) geminivírus-replikon és elfojtó szuppresszorgén együttes aktiválása helyspecifikus rekombinációval: a szuppresszorgén a replikonon van
Kétféle eljárással elfojtó szuppresszorgént építünk a floxed geminivírus-vektorba. Az elfojtó szuppresszor ORFjét akár GUS-ORF-fel, akár a pGV733-ban lévő luciferáz ORFfel helyettesítjük. Az előbbi esetben az elfojtó szuppresszor a replikonon van (az 1. ábra szerint mint Belem A- és/vagy C-elemekkel vagy azok nélkül). Az utóbbi esetben viszont a replikonon kívül van az 1. ábra szerinti C-elemként az A- és B-elemekkel együtt oly módon, hogy a Belem transzkripciós/transzlációs stopfragmensként szolgál. Transzlációs stopfragmens egy példáját a fentiekben, a PVXnél ismertetettük. Bármelyik esetben a replikon aktiválása aktiválja az elfojtó szuppresszorgén expresszióját is a gazda vírusellenes, homológiafüggő elfojtást érintő, védekező rendszerének legyőzésére és fokozottabb replikációt és idegen fehérje magasabb szintű termelődését eredményezi.
6. példa
Floxed, bináris TGMV a köpenyfehérjét helyettesítő GFP-vel
A TGMV köpenyt helyettesítő vektorát GFP-vel készítettük. Ennek érdekében élesztőeredetű szelekciós markert (trp) és 2 mikron élesztőeredetű replikációs origót tartalmazó PCR-fragmenst készítettünk P216 és P217 PCRláncinditók (31. és 32. azonosítószámú szekvenciák) alkalmazásával és pCSTA-ban lévő [Von Arnim, Albrechit, Stanley,
- Ill John, Virology 186(1), 286-93 (1992); Dr John Stanleytől kaptuk (John Innes Center, Norwich, United Kingdom)] E. coli vektorban lévő Kasl-be klónoztuk résjavitással (homológ rekombináció a vektorban lévő Kasl-helyen keresztül, mint ezt a fentiekben ismertetettük), amely E. coli-élesztő átviteli vektort, a pGV793-at eredményezi. A következőkben 796 bp GFP-ORF-et tartalmazó PCR-terméket készítettünk a psmGFP-plazmidból [Davis, S. J. és Viersta, R. D., Plant Molecular Biology 36, 521-528 (1998) ] a P218-láncindítóval (39. azonosítószámú szekvencia) és a P219-láncindítóval (40. azonosítószámú szekvencia), és Hpal-gyel és BstBI-gyel hasított pGV793-ba klónoztuk élesztő klónozással, amely a pGV798-at eredményezte. A P218 egy 49 bp nagyságú láncindító, amelynek 5'-végi 29 bázisa a köpenyfehérje-promóterrel homológ, és a 3'-végi 18 bp a GFP-ORF 5'-végével homológ (2 bp-os helytelen párosodási kivéve), a P219 48-mer, amelynek 5'-végi 31 bázisa a köpenyfehérje 3' nem transzlatálódó szakaszával homológ, és a 3'-végi 18 bázis a GFP-ORF 3'végével homológ. Végül a pGV651-ben lévő, köpenyfehérje SacI-Nhel-fragmenst, egy’ TGMV-A-dimert (WO 99/22003 nemzetközi közzétételi irat) a pGV798-ból származóval.helyettesítettünk, amivel a pGV802-t, egy TGMV-A-dimert készítettük el, amelyben GFP helyettesíti a köpenyfehérjét.
Ha N. benthamianát pGV802-vel és TGMV-B-dimerrel (Dr D. Robertsontól kaptuk, North Carolina State University) együtt bombáztunk, a fertőzött szövet GFP-t expresszált tartósan, és legalább két hónapon keresztül nem fojtódott el. Egy floxed TGMV-GFP-replikon elkészítése érdekében a
- 112 replikon egyetlen kópiáját izoláljuk részleges Mfel-ként, és pGV690 EcoRI-helyébe klónozzuk a fentiekben ismertetettek szerint. A képződő plazmid GFP-ORF-et tartalmazó BamHIXhol-fragmensét alkalmazzuk a GUS-ORF helyettesítésére a SamHI-XhoI-gyel hasított pBE733-ban. Ezt a bináris vektort transzformáljuk növényekbe Agrobacterium közvetítette transzformációval egyedül vagy pBE795-plazmiddal együtt transzformálva. A pBE795 TGMV-B-dimert tartalmazó bináris vektor. Ezt a pBIB [Becker, D., Nucleic Acids Research 18, 203 (1990)] Smal-SalI-szekvenciájának a TGMV-B-dimer BsrBISall-fragmens szekvenciájával történő helyettesítésével készítettük.
P218 (felső láncindító GFP-ORF-hez) (49-mer) ’-AAA GTT ATA TAA AAC GAC ATG CGT TTC GTA GAT CTA AGG AGA TAT AAC A-3' (39. azonosítószámú szekvencia)
P219 (alsó láncindító GFP-ORF-hez) (48-mer) ’-AAT TTT ATT AAT TTG TTA TCG AAT CAT AAA TTA TTT GTA TAG TTC ATC-3’ (40. azonosítószámú szekvencia)
7. példa
Szabályozott, kiméra Cre-géneket expresszáló transzgénikus vonalak
A kiméra replikázgénekhez a Cre-ORF-et 1,3 kB NcolXbal-fragmensként izoláljuk 35S:Cre-plazmidból és a pGV656ban lévő 10 kD ORF-et tartalmazó NcoI-Xbal-fragmens helyettesítésére alkalmazzuk, amely a pGV692-t eredményezi, il letve a pGV659-ben lévő ACMV replikációs fehérjét tartalmazó NcoI-Xbal-fragmens helyettesítésére alkalmazzuk, amely a pGV693-at eredményezi. A pGV692-ből származó, a Vc:Cre-gént
- 113 tartalmazó Hindi 11-fragmenst a pBinl9 (GenBank nyilvántartási szám: U09365) és pBE673 (ismertetése a WO 99/22003 számú nemzetközi közzétételi iratban) Hindi II-helyébe klónoztuk, amely a pBE692 bináris plazmidot (növényi kanamicin-rezisztenciagénnel) és a pBE692b bináris plazmidot (növényi foszfotricon-rezisztenciagénnel) eredményezi. A pGV693-ból származó, IN:Cre-gént tartalmazó, BamHI-BamHI-Asp718I részleges fragmenst BamHI-Asp718I-gyel hasított pBinl9-be és pBE673-ba klónoztuk, amely a pBE693 és pBE693b bináris plazmidokat eredményezi. Nicotiana benthamiana és N. tabacum var Xanthi növényeket transzformáltunk Agrobacterium BA692-, illetve BA693-törzsével, amelyek a pBE692, illetve a pBE693 bináris plazmidokat tartalmazzák. Ezeket a transzgénikus növényeket a floxed vírusokat tartalmazó növényekkel keresztezzük.
A kiméra IN:Cre-gént módosítottuk, hogy csökkentsük a transzlációs képességét annak érdekében, hogy elviselje a szivárgó Cre-transzkripciót. Mivel leírták, hogy kis, 5'irányú ORF-ek általában csökkentik vagy szélsőséges esetben megakadályozzák a 3’-irányú transzlációt [Kozak, M., Mammalian Genome 7, 563-74 (1996)], a pGV693-at Cre-ORF iniciációs kodonjában lévő, egyedüli Ncol-hellyel linearizáltuk és egy adaptert ligáltunk, amelyet a P224láncindítóból (41. azonosítószámú szekvencia) és a P225láncindítóból (42. azonosítószámú szekvencia) építettünk fel. Ez a transzlációs iniciációs kodontól 5'-irányban 39 bp-nyi szekvencia hozzáadását eredményezi, amely 21 bp ORFet tartalmaz a transzlációs iniciációs kodontól 5'-irányban
- 114 18 bázispár távolságra. A képződő plazmidban, a pGV787-ben a módosítást DNS-szekvenálással bizonyítottuk. A pGV787-ből származó BamHI-fragmenst alkalmaztuk a pBE673-ban lévő megfelelő szakasz helyettesítésére, amely a pBE787 bináris vektort eredményezte. Ezt a vektort vizsgáltuk transzgénikus növényekben.
A fenti tárgyalásban alkalmazott láncindítókat az alábbiakban adjuk közre:
P224
5'-CAT GCG TGT CGC ATA CTA TTA CTA ATA GGC AGC GAG GAT-3' (41. azonosítószámú szekvencia)
P225
5'-CAT GAT CCT CGC TGC CTA TTA GTA ATA GTA TGC GAC ACG-3' (42. azonosítószámú szekvencia)
Helyesen szabályozott Cre-expresszióra történő szűrővizsgálat, és mutáns lox-helyek alkalmazása
Kifejlesztettünk egy rendszert, amely lehetővé teszi a helyesen szabályozott Cre-expressziójú transzgénikus vonalak kiválasztását. A luciferáz-gént választottuk a Creközvetítette excízióhoz, mint egy érzékeny, nem káros riportert. Floxed vektorok egy készletét, pGV751-754 választottuk ki, amelyek a 35S-promóter-lox-NPTII-gén-rbcS 3'-terminátor-Nos 3'-terminátor-lox-Luc alapkazettát tartalmazzák. A Cre-expresszió kivágja az NPTII-gént tartalmazó STOP-fragmenst és a lox-helyek közötti transzkripciós terminációs szekvenciákat, így bekapcsolja a luciferázexpressziót. Az NPTII-gén excíziója a szelekció során a növényeket érzékennyé teszi kanamicinre. Az IN2:Cre-t
- 115 (pBE692) vagy a Vc:Cre-t (pBE693) - amelyeket a fentiekben ismertettünk - hordozó bar-rezisztens, bináris vektoroknak együttes transzformációja kanamicin + bar szelekciós lemezeken lehetővé teszi azoknak a transzgénikus vonalaknak a kiválasztását, amelyekben a Cre-expressziója elég alacsony ahhoz, hogy ne közvetítsen rekombinációt.
A fenti szelekciós eljárás alkalmazásával a mutáns lox-helyek hatékonyságát vizsgáltuk, hogy fokozzák-e a Cret expresszáló, szabályozott promóterek specifitását. Számos mutáns lox-helyet publikáltak, amelyekről leírták, hogy több Cre-fehérjét igényelnek ahhoz, hogy helyspecifikus rekombinációt aktiváljanak [Albert és mtsai., Plant J. 7, 649-59 (1995)]. A mutáns 1οχ72-, lox78- és lox65-helyek in vitro hatékonyságát 12,5%-nak, 5%-nak és 2,5%-nak írták le a vad típusú loxP-hez képest. A pGV751-, a pGV752-, a pGV753- és a pGV754-plazmidok egy vad típusú lox-helyet és egy második lox-helyet tartalmaznak, amely vad típusú loxP (pGV751), lox65 (pGV752), lox72 (pGV753) és lox78 (pGV754) a fenti kazettában. A pGV751-et és a pGV752-t választottuk a transzgénikus növényekben történő kezdeti vizsgálatokhoz. A floxed konstrukciókat bináris vektorokba vittük (amelyeket az alábbiakban pBE-előtaggal jelölünk), és dohánynövényekbe (N. tabacum, cv. Xanthi) transzformáltuk Agrobacterium közvetítette levéllemez-transzformációval pBE751(kan) + pBE693b(bar), pBE751(kan) + pBE692b(bar) , pBE753(kan) + pBE693b(bar) és pBE753(kan) + pBE692b(bar) konstrukciókkal.
- 116 A védőszer-indukcióhoz az elsődleges transzformánsok levéllemezeit 30 percen keresztül 30 ppm frissen készített 2-CBSU-ba áztattuk [Hersey, Η. P. és Stoner, T. D., Plant Molecular Biology 17, 679-690 (1991)], majd szilárd, sík MS-tápközegre helyeztük a vizsgálat előtt 1-2 napra. A vizsgálandó, teljes magoncokat vagy levéllemezeket 5 mM rovareredetű luciferinnel bepermeteztük, majd 5 percen keresztül sötétben tartottuk, mielőtt a luciferázexpresszióról hideg CCD-kamera alatt képet készítettünk.
A 751/693bar és a 753/693bar együttes transzformációk eredményei
A luciferáz expresszióját hideg CCD-kamerával mutattuk ki nem kezelt és védőszerrel kezelt, független, transzgénikus vonalakból, amelyeket IN:Cre-vel transzformáltunk pBE751 (vad típusú lox-P-hellyel) vagy pBE753 (mutáns lox72-vel) floxed konstrukció jelenlétében. Az 1. táblázatban mutatjuk be, hogy a vad típusú lox-P-hez képest a mutáns lox72 csökkenti azoknak a vonalaknak a számát, amelyek a levéllemezben nulla időpontban luciferázt mutatnak. Azokat a vonalakat, amelyek védőszerrel indukálhatok voltak háttér nélkül további vizsgálatra kiválasztottuk. Ezekből a növényekből származó levéllemezeket 2 napon keresztül inkubáltuk védőszeres kezeléssel vagy anélkül. A 2. táblázatban mutatjuk be, hogy a luciferáz-expresszió, az excízió riportere magasabb azokban a vonalakban, amelyeket pBE751-gyel együtt transzformáltunk, mint amelyeket a pBE753-mal.
- 117 1. táblázat
Luciferáz-expresszió védőszerrel történő kezeléssel vagy anélkül
Független transzgénikus növények Kezelés nélkül 2-CBSU és sé- rülési kezelés
751 és 693bar Id - +
8b + + lox?
10a +
11a - -
16a + +lox?
20 - -
21 - +
2 6c - +
29a + + lox?
30 - +
31 + + lox?
32 + + lox?
33 + + lox?
34 + + lox?
35 + + lox?
36 — -
37 - +
753 és 693bar 1b - -
4b - +/-
6a - +/-
12a -
- 118 -
14d — +
17a -
18c - +
21a - -
22 - +
23a - +
24b - -
26a - -
29b - -
30 +/-
31 - -
32 - +/-
2. táblázat
Relatív luciferáz-expresszió a lévé11emezekben védőszerrel történő kezeléssel vagy anélkül, 2 nap után
Sérülés 2-CBSU és sérülés
Kontroll 1 (vad típus 187 218
*Kontroll 2 126 283
751 1 5663 4895
751 10 1156 5522
751 21 1286 16500
751 26 1898 6990
751 30 2595 58015
751 37 8450 72091
753 4 829 921
- 119 -
753 6 247 671
753 14 495 4408
753 18 905 8598
753 22 241 1274
753 23 405 3843
753 30 542 1117
753 32 129 645
Kontroll 2: transzgénikus növény 751/693bar-ral.
Ebben a transzgénikus növényben azonban a luciferázt nem indukáljuk sem sérüléssel, sem védőszeres kezeléssel.
- 120 -
SZEKVENCIALISTA (210)1 (211)40 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: láncindító (400)1 tcgagataac ttcgtataat gtatgctata cgaagttatg40 (210)2 (211)40 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: láncindító (400)2 aattcataac ttcgtatagc atacattata cgaagttatc
- 121 - (210)3 (211)45 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: láncindító (400)3 aattctataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat gagct 45 (210)4 (211)37 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: láncindító (400)4 cataacttcg tatagcatac attatacgaa gttatag37 (210)5 (211)33 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia
- 122 -
(220) ¢223) A mesterséges szekvencia leírása: láncindító (400)5 gcggcatgcg tcgacacatg gtggagcacg aca33 (210)6 (211)30 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: láncindító (400)6 gccgggtacc gagacgcgtc atcccttacg30 (210)7 (211)54 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: láncindító (400)7 gtctcggtac ctataatgta tgctatacga agttatataa ggaagttcat ttca 54
- 123 - (210)8 (211)24 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: láncindító (400)8 tgatccgcgg gtttcttctc atgt24 (210)9 (211)51 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: láncindító (400)9 ccgggaatgc atgctatagc atacattata cgaagttatt cgaatttaaa t 51
(210) 10
(211) 51
(212) DNS
(213) mesterséges szekvencia
- 124 ·♦· *
(220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: láncindító (400)10 ccggatttaa attcgaataa cttcgtataa tgtatgctat agcatgcatt c 51 (210)11 (211)42 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: láncindító (400)11 cgataacttc gtataatgta tgctatacga agttatcccg gg42 (210)12 (211)42 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: láncindító (400)12 cgcccgggat aacttcgtat agcatacatt atacgaagtt at42 — ]_25 - *· ’··· *r* *«-<* *·»* (210)13 (211)27 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: láncindító (400)13 gatgacgcgt ataacttcgt ataatgt27 (210)14 (211)54 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: láncindító (400)14 ccggggataa cttcgtatag catacattat acgaagttat tcgaacattt aaat 54 (210)15 (211)54 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia
- 126 (220) ¢223) A mesterséges szekvencia leírása: láncindító (400)15 ccggatttaa atgttcgaat aacttcgtat aatgtatgct atacgaagtt atcc 54 (210)16 (211)34 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: láncindító (400)16 gaggcatgcc cgggcaacat ggtggagcac gaca34 (210)17 (211)58 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: láncindító (400)17 tatgcggccg cataacttcg tatagcatac attatacgga gttatataga 50 ggaagggt58
- 127 - (210)18 (211)28 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: láncindító (400)18 tccttgatcc gcgggtttct tctcatgt (210)19 (211)28 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: láncindító (400)19 tccttgatcc gcgggtttct tctcatgt (210)20 (211)28 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia
- 128 (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása:
(400)20 cacgcatgca ctatccttcg caagaccc (210)21 (211)17 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása:
(400)21 ccggggcggc cgcatac (210)22 (211)17 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása:
(400)22 láncindító láncindító láncindító ccgggtatgc ggccgcc
- 129 -
(210) ¢211) ¢212) (213) 23 41 DNS mesterséges szekvencia
(220)
(223) (400) A mesterséges szekvencia leírása: láncindító 23
accatgatta cgccaagctt aagaaaagga gagggccaag a 41 (210) 24 (211) 42 (212) DNS (213) mesterséges szekvencia
(220)
(223) (400) A mesterséges szekvencia leírása: láncindító 24
agttatgcgg ccgccccggg catatgatcc aatatcaaag ga 42
(210) 25
(211) 46
(212) DNS
(213) mesterséges szekvencia
- 130 (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: láncindító (400)25 gcgcagcctg aatggcgaat ggcgccccaa aaatatcaaa gataca 46 (210)26 (211)46 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: láncindító (400)26 aaggagaaaa taccgcatca cccgggataa cttcgtatag cataca 46 (210)27 (211)25 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: láncindító (400)27 gccaatcgat catgagtaaa ggaga
- 131 - (210)28 (211)35 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: láncindító (400)28 gctaaccggt agacatttat ttgtatagtt catcc35 (210)29 (211)34 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: láncindító (400)29 gaagtcgacc gcgggcagac taaactcacg aata34
(210) 30
(211) 30
(212) DNS
(213) mesterséges szekvencia
- 132 (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: láncindító (400)30 gaattctcga gccatatatg gacatttatc30 (210)31 (211)46 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: láncindító (400)31 tgcgtaagga gaaaataccg catcaaagaa aaggagaggg ccaaga 46 (210)32 (211)47 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: láncindító (400)32 gcgcagcctg aatggcgaat ggcgccatat gatccaatat caaagga 47
- 133 (210) (211) (212) ¢213) mesterséges szekvencia ¢220) (223)
A mesterséges szekvencia leírása: láncindító (400)33 aacggttaag tttccattga tactcgaaag atgagcgaca aatcaatctc tga 53 (210)34 (211)50 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223)
A mesterséges szekvencia leírása: láncindító (400) aacggttaag tttccattga tactcgaaag atggcactga tctttggcac (210) (211) (212) (213) mesterséges szekvencia
- 134 (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: láncindító (400)35 ggggtaggcg tcggttatgt agacgtagtt atccaacatt gtaagttttc att 53 (210)36 (211)37 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: láncindító (400)36 atgataactt cgtatagcat acattatacg aagttat37 (210)37 (211)41 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: láncindító (400)37 taantaaata acttcgtata gcatacatta tacgaagtta t41
- 135 (210)38 ¢211)37 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: láncindító (400)38 atgataactt cgtatagcat acattatacg aagttat37 (210)39 (211)49 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223) A mesterséges szekvencia leírása: láncindító (400)39 aaagttatat aaaacgacat gcgtttcgta gatctaagga gatataaca 49 (210)40 (211)48 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia
- 136 (220) (223)
A mesterséges szekvencia leírása: láncindító (400)40 aattttatta atttgttatc gaatcataaa ttatttgtat agttcatc 48 (210)41 (211)39 (212)DNS (213) mesterséges szekvencia (220) (223)
A mesterséges szekvencia leírása: láncindító (400) catgcgtgtc gcatactatt actaataggc agcgaggat

Claims (41)

  1. - 137 SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Bináris, transzgénikus, expressziós rendszer, amely a következőket tartalmazza:
    (i) kromoszómálisan integrált, inaktív replikont, amely tartalmaz:
    a) vírusreplikációhoz szükséges, közeire ható, víruseredetű elemeket,
    b) legalább egy, megfelelő, szabályozó szekvenciát tartalmazó célgént, és
    c) helyspecifikus rekombinázra érzékeny helyspecifikus szekvenciákat, és (ii) kromoszómálisan integrált, kiméra, távolra ható módon aktiváló gént, amely egy szabályozott, növényi promóterhez működőképesen kapcsolt, helyspecifikus rekombinázt kódoló szekvenciát tartalmaz, és a kiméra, távolra ható módon aktiváló gén expressziója az inaktív replikont tartalmazó sejtekben helyspecifikus rekombinációt, a replikonreplikáció aktiválódását és a célgén fokozott expresszióját képes eredményezni .
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti, víruseredetű expressziós rendszer, amelyben a rekombinázra érzékeny helyspecifikus szekvenciák lox-szekvenciák, és a helyspecifikus rekombinázt kódoló szekvencia a Cre-fehérjét kódolja.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti, transzgénikus, víruseredetű expressziós rendszer, amelyben az inaktív replikon geminivírusokból vagy egyszálú RNS-vírusokból származik.
    - 138 -
  4. 4. A3, igénypont szerinti, transzgénikus, víruseredetű expressziós rendszer, amelyben a geminivírus az alábbiak bármelyike: paradicsom aranymozaik-vírusa (TGMV, tomato golden mosaic virus) és afrikai cassavamozaikvírus (ACMV, african cassava mosaic virus).
  5. 5. A3, igénypont szerinti, transzgénikus, víruseredetű expressziós rendszer, amelyben az egyszálú RNS-virus burgonya X-vírus.
  6. 6. Az 1. igénypont szerinti, víruseredetű expressziós rendszer, amelyben a szabályozott, növényi promoter az alábbiak bármelyike: szövetspecifikus promoterek, indukálható promoterek és fejlődési állapotra specifikus promoterek.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti, víruseredetű expressziós rendszer, amelyben a szabályozott promoter az alábbi gének bármelyikéből származik: védőszerrel indukálható rendszerből származó génekből, tetraciklinnel indukálható rendszerből származó génekből, szaliciláttal indukálható rendszerekből származó génekből, alkohollal indukálható rendszerekből származó génekből, glükokortikoiddal indukálható rendszerből származó génekbők, patogén által indukálható rendszerekből származó génből és ecdysommal indukálható rendszerekből származó génből.
  8. 8. Az 1. igénypont szerinti, víruseredetű expressziós rendszer, amelyben a célgén az alábbi fehérjék bármelyikét kódolja: enzimet, szerkezeti fehérjét, magi raktározó fe hérjét, gyomirtó szerre rezisztenciát biztosító fehérjét és rovarra rezisztenciát biztosító fehérjét.
    - 139 -
  9. 9. Az 1. igénypont szerinti, víruseredetű expressziós rendszer, amelyben a célgén RNS-t kódol, amelynek expressziója egy transzgén vagy endogén gén homológiafüggő génelfojtását eredményezi.
  10. 10. Az 1. igénypont szerinti, víruseredetű expressziós rendszer, amelyben a célgénhez kapcsolt legalább egy, megfelelő, szabályozó szekvencia az alábbiak bármelyike: konstitutív növényi promoter, növényi szövetspecifikus promóterek, növényi fejlődésspecifikus promóterek, indukálható növényi promóterek és víruseredetű promóterek.
  11. 11. A 10. igénypont szerinti, víruseredetű expressziós rendszer, amelyben a legalább egy, megfelelő, szabályozó szekvencia az alábbiak bármelyike: víruseredetű köpenyfehérj e-promóter, nopalin-szintáz-promóter, phaseolinpromóter és karfiolmozaik-vírus promótere.
  12. 12. Az 1. igénypont szerinti, víruseredetű expressziós rendszer, amelyben az inaktív replikon adott esetben egy tranzitpeptidet kódoló DNS-fragmenst tartalmaz.
  13. 13. Eljárás növényben egy célgén által kódolt fehérje szintjének megváltoztatására, azzal jellemezve, hogy (i) az 1. igénypont szerinti, víruseredetű, expressziós rendszerrel növényt transzformálunk, és (ii) a transzformált növényi magot a fehérje expresszáltatására alkalmas körülmények között neveljük.
    - 140 -
  14. 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy célgénként szensz orientációban beépített célgén által kódolt fehérje szintjét változtatjuk meg úgy, hogy az expresszált fehérje szintjét emeljük.
  15. 15. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a rekombinázra érzékeny helyspecifikus szekvenciákként mutáns lox-szekvenciákat alkalmazunk, amelyek nem hatékonyak a Cre-lox-rekombinációhoz, és a helyspecifikus rekombinázt kódoló szekvenciaként a Cre-fehérj ét kódoló szekvenciát alkalmazunk.
  16. 16. Eljárás növényben egy célgén által kódolt fehérje szintjének megváltoztatására, azzal jellemezve, hogy (i) egy első növényt egy inaktív replikonnal transzformálunk, miáltal egy első, elsődleges transzformánst állítunk elő, amely inaktív replikon a következőket tartalmazza :
    a) vírusreplikációhoz szükséges, közeire ható, víruseredetű elemeket,
    b) legalább egy, megfelelő, szabályozó szekvenciát tartalmazó célgént, és
    c) helyspecifikus rekombinázra érzékeny helyspecifikus szekvenciákat, és (ii) egy második növényt transzformálunk egy kiméra, távolra ható módon aktiváló génnel, miáltal hogy második, elsődleges transzformánst állítunk elő, amely egy szabályozott, növényi promótert tartalmaz egy távolra ható módon aktiváló, helyspecifikus rekombinázt kódoló szekvenciához működőképesen kapcsolva,
    - 141 - (iii) az első és a második, elsődleges transzformánsokat felneveljük, és így mindkét magból utódokat nyerünk, és (iv) keresztezzük az első és a második transzformánsok utódait, amelyekben a célgén expresszálódott.
  17. 17. Az 1. igénypont szerinti, bináris, transzgénikus, expressziós rendszer, amelyben a kromoszómálisan integrált, inaktív replikon egy riportergén-szekvenciába van integrálva oly módon, hogy ha a replikon kivágódik, a riportergén aktiválódik.
  18. 18. Az 1. igénypont szerinti, bináris, transzgénikus, expressziós rendszer, amelyben az inaktív replikonba egy transzkripciós stopfragmens van integrálva.
  19. 19. Bináris, transzgénikus, víruseredetű expressziós rendszer, amely a következőket tartalmazza:
    (i) kromoszómálisan integrált, inaktív replikont, amely tartalmaz:
    a) vírusreplikációhoz szükséges, közeire ható, víruseredetű elemeket,
    b) legalább egy, megfelelő, szabályozó szekvenciát tartalmazó célgént, és
    c) helyspecifikus rekombinázra érzékeny helyspecifikus szekvenciákat, és (ii) átmenetileg expresszált, kiméra, távolra ható módon aktiváló gént, amely egy növényi vagy víruseredetű promótert tartalmaz egy helyspecifikus rekombinázt kódoló szekvenciához működőképesen kapcsolva,
    - 142 és így a kiméra, távolra ható módon aktiváló gén expressziója az inaktív replikont tartalmazó sejtekben helyspecifikus rekombinációt, a replikonreplikáció aktiválódását és a célgén fokozott expresszióját képes eredményezni .
  20. 20. Eljárás növényben egy célgén által kódolt fehérje szintjének megváltoztatására, azzal jellemezve, hogy (i) egy növényt egy inaktív replikonnal transzformálunk, amely inaktív replikon tartalmaz:
    a) vírusreplikációhoz szükséges, közeire ható, víruseredetű elemeket,
    b) legalább egy, megfelelő, szabályozó szekvenciát tartalmazó célgént, és
    c) helyspecifikus rekombinázra érzékeny helyspecifikus szekvenciákat, (ii) a transzformánst fertőzzük egy vírussal, amely egy szabályozott, növényi promóterhez működőképesen kapcsolt, távolra ható módon aktiváló, helyspecifikus rekombinázt kódoló szekvenciából álló, kiméra, távolra ható módon aktiváló gént tartalmaz, és így a kiméra, távolra ható módon aktiváló gén expressziója útján az inaktív replikont tartalmazó sejtekben helyspecifikus rekombinációt, a replikonreplikáció aktiválódását éa a célgén fokozott expresszióját érjük el.
  21. 21. Bináris, transzgénikus, expressziós rendszer, amely egy inaktív transzgént és egy kiméra, távolra ható módon aktiváló gént tartalmaz, és az inaktív transzgén a következőket tartalmazza:
    - 143 - (i) közeire ható, transzkripciós, szabályozó elemeket a kódoló szekvenciához vagy funkcionális RNS-hez működésképtelenül kapcsolva, és (ii) helyspecifikus rekombinázra érzékeny helyspecifikus szekvenciákat, a kiméra, távolra ható módon aktiváló gén pedig egy szabályozott, növényi promótert tartalmaz egy távolra ható módon aktiváló, helyspecifikus rekombinázt kódoló szekvenciához működőképesen kapcsolva, és így a kiméra, távolra ható módon aktiváló gén expressziója az inaktív transzgént tartalmazó sejtekben a közeire ható, transzkripciós, szabályozó elemeknek a kódoló szekvenciához vagy a funkcionális RNS-hez történő működőképes kapcsolatát képes eredményezni helyspecifikus rekombináció útján, és ezáltal célgén fokozott expresszióját képes eredményezni.
  22. 22. A 21. igénypont szerinti, bináris, transzgénikus expressziós rendszer, amelyben a rekombinázra érzékeny, helyspecifikus szekvenciák lox-szekvenciák.
  23. 23. A 21. igénypont szerinti, víruseredetű expressziós rendszer, amelyben a lox-szekvenciák mutáns lox-szekvenciák, amelyek nem hatékonyak a Cre-loxrekombinációhoz.
  24. 24. Bináris, transzgénikus, víruseredetű replikációs rendszer, amely a következőeket tartalmazza:
    (i) kromoszómáiisan integrált, inaktív replikont, amely vírusreplikációhoz szükséges, közeire ható, víruseredetű elemeket és helyspecifikus rekombinázra érzékeny helyspecifikus szekvenciákat tartalmaz, és
    -144- ·..· μ· ·.*· (ii) kiméra, távolra ható módon aktiváló gént, amely egy szabályozott, növényi promótert tartalmaz helyspecifikus rekombinázt kódoló szekvenciához működőképesen kapcsolva, és így a kiméra, távolra ható módon aktiváló gén expressziója az inaktív replikont tartalmazó sejtekben helyspecifikus rekombinációt és replikonreplikáció aktiválódását képes eredményezni.
  25. 25. A 24. igénypont szerinti, transzgénikus, víruseredetű, replikációs rendszer, amelyben a rekombinázra érzékeny, helyspecifikus szekvenciák lox-szekvenciák.
  26. 26. A 24. igénypont szerinti, transzgénikus, víruseredetű, replikációs rendszer, amelyben az inaktív replikon geminivírusokból vagy egyszálú RNS-vírusokból származik.
  27. 27. A 26. igénypont szerinti, transzgénikus, víruseredetű, replikációs rendszer, amelyben a geminivírus paradicsom arany mozaikvírus (TGMV) vagy afrikai cassava mozaikvírus (ACMV) .
  28. 28. A 26. igénypont szerinti, transzgénikus, víruseredetű, replikációs rendszer, amelyben az egyszálú RNSvírus burgonya X-vírusa.
  29. 29. A 24. igénypont szerinti, víruseredetű, replikációs rendszer, amelyben a szabályozott, növényi promoter az alábbiak bármelyike: szövetspecifikus promóterek, indukálható promóterek és fejlődési állapotra specifikus promóterek.
    j
  30. 30. A 29. igénypont szerinti, víruseredetű, replikációs rendszer, amelyben a szabályozott promoter az alábbi gének bármelyikéből származik: védőszerrel indukálható rendszerből származó gének, tetraciklinnel indukálható rendszerből származó génekből, szaliciláttal indukálható rendszerekből származó génekből, alkohollal indukálható rendszerekből származó génekből, glükokortikoiddal indukálható rendszerből származó génekbők, patogén által indukálható rendszerekből származó génből és ecdysommal indukálható rendszerekből származó génből.
  31. 31. A 21. igénypont szerinti, bináris, transzgénikus, expressziós rendszer, amelyben az inaktív transzgén elfojtó szuppresszorgén.
  32. 32. Bináris, transzgénikus, expressziós rendszer, amely a következőket tartalmazza:
    (i) kromoszómáiisan integrált, gátló fragmenst helyspecifikus rekombinázra érzékeny helyspecifikus szekvenciákhoz kapcsolva, és (ii) kromoszómáiisan integrált, inaktív, elfojtó, szuppresszor transzgént, és így a helyspecifikus rekombináz expressziója helyspecifikus rekombinációt képes eredményezni, amely képes aktiválni az elfojtó szuppresszorgént.
  33. 33. A 32. igénypont szerinti, bináris, transzgénikus, víruseredetű, expressziós rendszer, amelyben a gátló fragmens inaktív replikon, amely a következőket tartalmaz za :
    (i) legalább egyetlen, megfelelő, szabályozó szekvenciát tartalmazó célgént, és (ii) helyspecifikus rekombinázra érzékeny helyspecifikus szekvenciákat, és így a helyspecifikus rekombináz expressziója helyspecifikus rekombinációt képes eredményezni és mind a replikon, mind az elfojtó szuppresszorgén aktiválódásának és a célgén fokozott expressziójának elérésére alkalmas.
  34. 34. A 32. igénypont szerinti, bináris, transzgénikus, víruseredetű, expressziós rendszer, amelyben a gátló fragmens inaktív replikon, amely helyspecifikus rekombinázra érzékeny helyspecifikus szekvenciákat tartalmaz, és így a helyspecifikus rekombináz expressziója helyspecifikus rekombinációt eredményez, és mind a replikon, mind az elfojtó szuppresszorgén aktiválódását eredményezi.
  35. 35. A 32. igénypont szerinti, bináris, transzgénikus, víruseredetű, expressziós rendszer, amelyben az elfojtó szuppresszorgén az alábbi gének bármelyike: Pl helper (segítő) komponens proteinázt (Pl-HC-Pro) kódoló gén, helper komponens proteinázt (HC-Pro) kódoló gén és cucumovírus-eredetű 2b-fehérjét kódoló gén.
  36. 36. A 32. igénypont szerinti, bináris, transzgénikus, víruseredetű, expressziós rendszer, amelyben az elfojtó szuppresszorgén az alábbi gének bármelyike: BL1- vagy BR1geminiviruseredetű mozgási (movement) fehérjéket kódoló gének.
    *··* *♦· t*·
    - 147 - ,:λ V' V? !-‘·
  37. 37. Transzgénikus, víruseredetű, expressziós rendszer, amely a következőket tartalmazza:
    (i) kromoszómálisan integrált, geminivírus-proreplikont, amely tartalmaz:
    a) vírusreplikációhoz szükséges, közeire ható, víruseredetű elemeket,
    b) legalább egy, megfelelő, szabályozó szekvenciát tartalmazó célgént, és
    c) szegélyező szekvenciákat, amelyek az a) és b) elemek kivágását teszik lehetővé, amely proreplikonban hiányzik az episzómális replikációhoz szükséges, funkcionális, replikációs gén, és (ii) kromoszómálisan integrált, kiméra, távolra ható, replikációs gént, amely szabályozott, növényi promótert tartalmaz geminivírus-eredetű replikációs fehérjét kódoló szekvenciához működőképesen kapcsolva, és (iii) geminivírus B-genomjának dimerjét, és így a távolra ható, replikációs gén expressziója a proreplikont tartalmazó sejtekben a proreplikon és a Bgenom replikációját és a célgén fokozott expresszióját eredményezi.
  38. 38. Eljárás növényben egy célgén által kódolt fehérje szintjének megváltoztatására, azzal jellemezve, hogy (i) a 37. igénypont szerinti, víruseredetű, expressziós rendszerrel növényt transzformálunk, és (ii) a transzformált növényi magot fehérje expresszálódására alkalmas körülmények között neveljük.
  39. 39. Transzgénikus, geminivírus-eredetű expressziós rendszer, amely a következőket tartalmazza:
    (i) kromoszómáiisan integrált, inaktív replikont, amely a tartalmaz:
    a) vírusreplikációhoz szükséges, közeire ható, víruseredetű elemeket,
    b) legalább egy, megfelelő, szabályozó szekvenciát tartalmazó célgént, és
    c) helyspecifikus rekombinázra érzékeny helyspecifikus szekvenciákat, (ii) kromoszómáiisan integrált, kiméra, távolra ható módon aktiváló gént, amely szabályozott, növényi promótert tartalmaz helyspecifikus rekombinázt kódoló szekvenciához működőképesen kapcsolva, (iii) geminivírus B-genomjának dimerjét, és így a kiméra, távolra ható módon aktiváló gén expressziója az inaktív replikont tartalmazó sejtekben helyspecifikus rekombinációt, a replikon és a B-genom replikációjának aktiválódását, és a célgén fokozott expresszióját eredményezi.
  40. 40. Eljárás növényben egy célgén által kódolt fehérje szintjének megváltoztatására, azzal jellemezve, hogy (i) a 39. igénypont szerinti, víruseredetű expressziós rendszerrel transzformálunk egy növényt, és (ii) a transzformált, növényi magot fehérje expresszálódására alkalmas körülmények között neveljük.
    - 149 -
  41. 41. Eljárás vírusrezisztencia fokozására növényben, azzal jellemezve, hogy (i) egy első növényt egy inaktív replikonnal transzformálunk, és ezáltal egy első, elsődleges transzformánst kapunk, amely inaktív replikon a következőket tartalmazza:
    a) vírusreplikációhoz szükséges, közeire ható, víruseredetű elemeket,
    b) a fertőző vírussal homológ vírusszekvenciákat, amelyek homológiafüggő rezisztenciát képesek biztosítani,
    c) helyspecifikus rekombinázra érzékeny helyspecifikus szekvenciákat, és (ii) transzformálunk egy második növényt egy kiméra, távolra ható módon aktiváló génnel, miáltal egy második, elsődleges transzformánst kapunk, amely szabályozott, növényi promótert tartalmaz egy távolra ható módon aktiváló, helyspecifikus rekombinázt kódoló szekvenciához működőképesen kapcsolva, (iii) az első és második, elsődleges transzformánsokat felneveljük, és így mindkét magból utódokat nyerünk, és (iv) keresztezzük az első és második transzformánsok utódait, amelyekben a fertőző vírussal homológ vírusszekvenciák expresszálódnak, vírusrezisztenciát biztosítva a
    A meghatalmazott: DANUBIA
    Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft.
    Svingor Ádám szabadalmi ügyvivőjelölt
HU0104697A 1998-09-23 1999-09-22 Binary viral expression system in plants HUP0104697A3 (en)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10155898P 1998-09-23 1998-09-23
US13008699P 1999-04-20 1999-04-20
US15025599P 1999-08-23 1999-08-23
PCT/US1999/021989 WO2000017365A2 (en) 1998-09-23 1999-09-22 Binary viral expression system in plants

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUP0104697A2 true HUP0104697A2 (hu) 2002-03-28
HUP0104697A3 HUP0104697A3 (en) 2003-12-29

Family

ID=27379204

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0104697A HUP0104697A3 (en) 1998-09-23 1999-09-22 Binary viral expression system in plants

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP1115870A2 (hu)
CA (1) CA2339595A1 (hu)
HU (1) HUP0104697A3 (hu)
NZ (1) NZ510594A (hu)
WO (1) WO2000017365A2 (hu)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6632980B1 (en) * 1997-10-24 2003-10-14 E. I. Du Pont De Nemours And Company Binary viral expression system in plants
KR20030047880A (ko) * 2000-03-28 2003-06-18 테크놀로지 퀸스랜드 유니버시티 선택된 유전자 서열의 부위 특이적 발현 및/또는 발달조절된 발현을 허용하는 대형 뉴클레오티드 서열로부터폐환형으로 방출될 수 있는 구조물
AU2001243939B2 (en) * 2000-03-28 2006-06-15 Queensland University Of Technology A construct capable of release in closed circular form from a larger nucleotide sequence permitting site specific expression and/or developmentally regulated expression of selected genetic sequences
US7468475B2 (en) 2000-06-16 2008-12-23 Schmuelling Thomas Method for modifying plant morphology, biochemistry and physiology
DE10049587A1 (de) 2000-10-06 2002-05-02 Icon Genetics Ag Vektorsystem für Pflanzen
US7560622B2 (en) 2000-10-06 2009-07-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions relating to the generation of partially transgenic organisms
DE10061150A1 (de) 2000-12-08 2002-06-13 Icon Genetics Ag Verfahren und Vektoren zur Erzeugung von transgenen Pflanzen
DE10102389A1 (de) 2001-01-19 2002-08-01 Icon Genetics Ag Verfahren und Vektoren zur Plastidentransformation höherer Pflanzen
DE10109354A1 (de) * 2001-02-27 2002-09-05 Icon Genetics Ag Rekombinante virale Schaltersysteme
DE10114209A1 (de) 2001-03-23 2002-12-05 Icon Genetics Ag Ortsgerichtete Transformation durch Verwendung von Amplifikationsvektoren
DE10115507A1 (de) 2001-03-29 2002-10-10 Icon Genetics Ag Verfahren zur Kodierung von Information in Nukleinsäuren eines genetisch veränderten Organismus
DE10121283B4 (de) * 2001-04-30 2011-08-11 Icon Genetics GmbH, 80333 Verfahren und Vektoren zur Amplifikation oder Expression von gewünschten Nucleinsäuresequenzen in Pflanzen
DE10132780A1 (de) 2001-07-06 2003-01-16 Icon Genetics Ag Plastidäre Genexpression über autonom replizierende Vektoren
DE10143237A1 (de) 2001-09-04 2003-03-20 Icon Genetics Ag Herstellung künstlicher interner ribosomaler Eingangsstellenelemente (Ires-Elemente)
DE10143238A1 (de) 2001-09-04 2003-03-20 Icon Genetics Ag Identifizierung eukaryotischer interner Ribosomen-Eingangsstellen (IRES)-Elemente
US7238854B2 (en) 2002-04-11 2007-07-03 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method of controlling site-specific recombination
US7267979B2 (en) 2002-07-01 2007-09-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method of controlling gene silencing using site specific recombination
WO2008037431A1 (en) 2006-09-25 2008-04-03 Freie Universität Berlin Transcriptional repressors of cytokinin signaling and their use
ES2385451T3 (es) 2009-07-10 2012-07-25 Freie Universität Berlin Rock2 y Rock3, dos nuevas variantes de ganancia de función de los receptores de citoquinina AHK2 y AHK3
EP2418283A1 (en) 2010-08-07 2012-02-15 Nomad Bioscience GmbH Process of transfecting plants
EP2584042A1 (en) 2011-10-17 2013-04-24 Nomad Bioscience GmbH Production, storage and use of cell wall-degrading enzymes
EP2647715A1 (en) 2012-04-03 2013-10-09 Nomad Bioscience GmbH Agrobacterium for transient transfection of whole plants
EP3097783B1 (en) 2015-05-26 2019-11-13 Nomad Bioscience GmbH Colicin m for the control of ehec
EP3372091A1 (en) 2017-03-07 2018-09-12 Nomad Bioscience GmbH Method of reducing contamination of an object with clostridium
EP3378485A1 (en) 2017-03-24 2018-09-26 Nomad Bioscience GmbH Bacteriocins for control of salmonella enterica
JP2021514391A (ja) 2018-02-15 2021-06-10 アイコン ジェネティクス ゲーエムベーハー ノロウイルスに対する免疫応答を生成するための免疫原性組成物及びワクチン
CA3133030A1 (en) 2019-03-12 2020-09-17 Icon Genetics Gmbh Norovirus-like particles with improved stability
MX2021014984A (es) 2019-06-06 2022-01-24 Nomad Bioscience Gmbh Klebicinas para el control de klebsiella.
US20230270145A1 (en) 2020-07-16 2023-08-31 Nomad Bioscience Gmbh Products for oral consumption with reduced sugar content
EP4248987A1 (en) 2022-03-21 2023-09-27 Nomad Bioscience GmbH Chimeric bacteriocins and method for the control of pseudomonas

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3686633T2 (de) * 1985-10-25 1993-04-15 David Matthew Bisaro Pflanzenvektoren.
NL9001711A (nl) * 1989-10-03 1991-05-01 Clovis Matton N V Genetische manipulaties met recombinant dna, dat van rna virus afgeleide sequenties omvat.
EP0686197B1 (en) * 1993-02-26 2000-06-07 Calgene LLC Geminivirus-based gene expression system
GB9405768D0 (en) * 1994-03-23 1994-05-11 Univ Leicester Viral replicon
GB9626858D0 (en) * 1996-12-24 1997-02-12 Gatsby Plant Science Innovatio Transcriptional regulation in plants
GB9703146D0 (en) * 1997-02-14 1997-04-02 Innes John Centre Innov Ltd Methods and means for gene silencing in transgenic plants
ES2338284T3 (es) * 1997-11-18 2010-05-05 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Movilizacion de genomas viricos a partir de t-adn utilizando sistemas de recombinacion especificos de sitio.

Also Published As

Publication number Publication date
CA2339595A1 (en) 2000-03-30
WO2000017365A3 (en) 2000-08-24
HUP0104697A3 (en) 2003-12-29
NZ510594A (en) 2002-09-27
WO2000017365A2 (en) 2000-03-30
EP1115870A2 (en) 2001-07-18
WO2000017365A8 (en) 2000-10-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6632980B1 (en) Binary viral expression system in plants
HUP0104697A2 (hu) Bináris, víruseredetű expressziós rendszer növényekben
US6077992A (en) Binary viral expression system in plants
JP4560266B2 (ja) 植物における遺伝子発現を調節するための組換えウイルススイッチ
CA2390152C (en) Enhanced transgene expression by co-expression with a suppressor of post-transcriptional gene silencing (ptgs)
AU731330B2 (en) Binary viral expression system in plants
US20020147168A1 (en) Single-step excision means
JP2004531260A (ja) 植物における対象とする核酸配列の増幅及び発現に用いる方法及びベクター
WO1997037012A9 (en) Single-step excision means
WO2000056895A1 (en) COTTON LEAF CURL VIRUS (CLCuV) PROMOTER AND ITS USE
JP2004529654A (ja) トランスジェニック植物を作製するための方法及びベクター
US7238854B2 (en) Method of controlling site-specific recombination
US7267979B2 (en) Method of controlling gene silencing using site specific recombination
JP4797141B2 (ja) 選択された遺伝子配列の部位特異的発現および／または発生上調節される発現を可能にする、より大きいヌクレオチド配列から閉環状で放出することができる構築物
US20040078844A1 (en) Methods and means for gene silencing
AU1441000A (en) Binary viral expression system in plants
MXPA01002374A (en) Binary viral expression system in plants
AU717267B2 (en) Single-step excision means
Kumar et al. Strategies For Production of Marker-Free Transgenic Crops
Hegedus 10 pORE Modular Vectors for Plant Transformation
Bilgin Utilization of Transgenic Maize Plants for Functional Analysis of a Histone Promoter and Host-Geminivirus Interactions
MXPA00003537A (en) Binary viral expression system in plants