HUP0102614A2 - Az angiogenezis módosítására alkalmas, SRC tirozin kinázt hasznosító eljárások és kompozíciók - Google Patents

Abstract

A találmány eljárásokat ír le angiogenezis módosítására szövetekbenSrc fehérjéket, módosított Src fehérjéket vagy ezeket kódolónukleinsavakat alkalmazva. A találmány elsősorban olyan eljárásokat írle, amelyek gátolják az angiogenezist inaktív Src fehérjéket vagyezeket kódoló nukleinsavakat alkalmazva, vagy amelyek gerjesztik azangiogenezist aktív Src fehérjéket vagy ezeket kódoló nukleinsavakatalkalmazva. A találmány továbbá leírja génszolgáltató rendszerekalkalmazását Src fehérjéket vagy módosított formáikat kódolónukleinsavak bejuttatására. Ó

Description

pQ ö 2

AZ ANGIOGENEZIS MÓDOSÍTÁSÁRA ALKALMAS, SRC TIROZIN KINÁZT HASZNOSÍTÓ ELJÁRÁSOK ÉS KOMPOZÍCIÓK

A találmány általában az orvostudomány területére esik és elsősorban a szövetek angiogenezisének módosítására szolgáló eljárásokra és kompozíciókra vonatkozik, felhasználva az Src fehérje tirozin kinázt, az Src variánsait, továbbra az ezeket kódoló nukleinsavakat.

Az angiogenezis a szövet erekkel való ellátásának, vagyis a vaszkularizációnak a folyamata, amely magában foglalja újonnan kifejlődő véredények beszövését valamely szövetbe, ezt nevezhetjük neovaszkularizációnak is. Ezt a folyamatot hámsejtek és sima izomsejtek beszűrödése közvetíti. Az az általános vélemény, hogy ez a folyamat három út valamelyikével megy végbe: a véredények már létező véredényekböl sarjadnak ki; véredények de novo kifejlődése történik prekurzor sejtekből (vaszkulogenezis); vagy létező kis véredények nőnek meg átmérőjükben [Blood és munkatársai: Biochim. Biopys. Acta 1032, 89-118 (1990)].

Az angiogenezis fontos folyamat az újszülött növekedésben, de fontos a sebgyógyulásban és sokféle klinikai betegség ki14^32 fejlődésében, ezek közé értve a szöveti gyulladásokat, artritiszt, tumor növekedést, diabeteszes retinopátiát, a retina neovaszkularizációjának tulajdonítható pigment degenerációt, és hasonló állapotokat. Az ilyen, angiogenezissel társuló klinikai manifesztálódásokra összefoglalva úgy utalnak, mint angiogén betegségekre [Folkman és munkatársai: Science 235, 442-447 (1987)]. Angiogenezis általában nem fordul elő felnőtt vagy érett szövetekben, bár ez azért előfordul a sebgyógyulásban és a sárgatest növekedési ciklusban [lásd például Moses és munkatársai: Science 248, 1408-1410 (1990)].

Általában azt valószínűsítik, hogy az angiogenezis gátlása hasznos terápia lehet a tumor növekedésének visszaszorítására. Az angiogenezis gátlására javasolják (1) az angiogén molekulák , például a bFGF (bázisos fibroblaszt növekedési faktor) kibocsátásának gátlását; (2) az angiogén molekulák semlegesítését például anti-pbFGF antitestek alkalmazásával; (3) α_νβ₃ vitronektin receptor inhibitorainak alkalmazását; és (4) az angiogén stimulusokra adott hámsejt válaszok gátlását. Ez utóbbi stratégia az utóbbi időkben fokozott figyelmet kap, így például Folkman és munkatársai [Cancer Biology 3, 89-96 (1992)] számos hámsejt válasz inhibitort írnak le, ide értve a kollagenáz inhibitort, alapmembrán forgalom inhibitorokat, angiosztatikus szteroidokat, gomba eredetű angiogenezis inhibitorokat, 4. vérlemezke faktort, trombospondint, az artritisz gyógyszereit, így a D-penicillamint és az arany-tiomalátot, D₃ vitamin analógokat, α-interferont és hasonlókat, amelyek alkalmazhatók lehetnek az angiogenezis gátlására. Az angiogenezis további javasolt inhibitoraival kapcsolatban lásd az alábbi irodalmi helyeket: Blood és munkatársai: Biochem. Biophys. Acta 1032, 89-118 (1990); Moses és munkatársai: Science 248, 1408-1410 (1990); Ingber és munkatársai: Lab. Invest. 59, 44-51 (1988); továbbá az 5,092,885; 5,112,946; 5,192,744; 5,202,352; 5,753,230 és 5,766,591 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmakat. Az említett referenciákban leírt angiogenezis inhibitorok egyike sem érinti az Src fehérjéket.

Ahhoz, hogy az angiogenezis bekövetkezzék, a hámsejteknek először el kell bontaniuk és keresztezniük kell a véredény alapmembránt hasonló módon, mint amelyet a tumor sejtek alkalmaznak a behatolás és áttétel képződés során.

Korábban beszámoltak arról, hogy az angiogenezis függ a kölcsönhatástól a vaszkuláris integrinek és az extracelluláris mátrix fehérjék között [Brooks és munkatársai: Science 264, 569-571 (1994)]. Ezen kívül arról is beszámoltak, hogy az angiogén vaszkuláris sejtek programozott sejtpusztulását (apoptózis) olyan kölcsönhatás indítja be, amelyet az α_νβ3 vaszkuláris integrinek bizonyos antagonistái gátolnak [Brooks és munkatársai: Cell 79, 1157-1164(1994)]. Újabban arról számoltak be, hogy a mátrix 2metalloproteináz (MMP-2) kötése a vitronektin receptorhoz (a_vPs) gátolható α_νβ₅ antagonisták alkalmazásával, és ezáltal gátlódik a proteináz enzimes működése [Brooks és munkatársai: Cell 85, 683693 (1996)].

Az alábbiakban röviden összefoglaljuk a találmányt.

A találmány angiogenezis módosításával foglalkozik szövetekben

Src tirozin kinéz segítségével, amelyre a továbbiakban általában Src-ként hivatkozunk.

Kompozíciókat és eljárásokat kívánunk kialakítani az angiogenezis módosítására olyan szövetekben, amelyek valamely betegségi állapottal vannak kapcsolatban. Src fehérje angiogenezist módosító mennyiségét tartalmazó kompozíciót vezetünk be egy betegségi állapottal kapcsolatban kezelendő szövetbe, amely azután választ ad az angiogenezis módosulására. Az Src fehérjét szolgáltató kompozíció tartalmazhat tisztított fehérjét, biológiailag aktív fehérje fragmentumokat, rekombináns úton termelt Src fehérjét vagy fehérje fragmentumokat vagy ezek fúziós fehérjéit, vagy gén/nukleinsav expressziós vektorokat valamely Src fehérje expresszálására.

Amikor az Src fehérje inaktiválva vagy gátolva van, a módosítás az angiogenezis gátlása. Amikor az Src fehérje aktív vagy aktiválva van, a módosítás az angiogenezis lehetővé tétele vagy gerjesztése.

A kezelendő szövet lehet bármilyen szövet, amelyben az angiogenezis módosítása kívánatos. Az angiogenezis gátlásához olyan megbetegedett szövetek kezelése hasznos, ahol káros neovaszkularizáció lép fel. Az ilyen szövetekre példák lehetnek a gyulladt szövetek, szilárd tumorok, áttételek, resztenózison keresztülment szövetek és további hasonló szövetek.

Az angiogenezis gerjesztésével olyan betegek kezelése hasznos, akiknek iszkémiás végtagjaik vannak, ahol gyenge a vérkeringés ezekben a végtagokban cukorbetegségi vagy más állapotok következtében. Hasonlóképpen kezelhetők krónikus sebekkel bíró betegek, akiknél a sebek nem gyógyulnak, és ezért előnyös lehet a vaszkuláris sejtburjánzás és neovaszkularizáció növelése.

Különösen előnyös olyan Src fehérjék alkalmazása, amelyek valamely itt leírt módosított aminosav szekvenciát tartalmaznak. Számos különösen előnyös módosított Src fehérjét írunk le, leírjuk továbbá ezek expresszióját.

A találmány magában foglal továbbá olyan gyógyászati kompozíciókat angiogenezis stimulálására valamely emlős célszövetben, amelyek valamely vírus- vagy nem-vírus gén transzfer vektort tartalmaznak; ezek a kompozíciók valamely nukleinsavból és gyógyászatilag elfogadható hordozóból vagy kötőanyagból állnak; az említett nukleinsav egy Src fehérjét kódoló nukleinsav szegmenssel bír, ahol az említett Src fehérjének bármilyen aminosava lehet az 527. kodonnál tirozin, szerin vagy treonin kivételével.

Szintén ide tartoznak az olyan gyógyászati kompozíciók angiogenezis gátlására emlős célszövetekben, amelyek valamely vírus- vagy nem vírus gén transzfer vektort tartalmaznak; ezek a kompozíciók valamely nukleinsavból és gyógyászatilag elfogadható hordozóból vagy kötőanyagból állnak; az említett nukleinsav olyan nukleinsav szegmenssel bír, amely kináz aktivitással nem rendelkező Src fehérjét kódol.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a bejelentés ábráit. Az ábrák a leírás részét képezik.

Az 1. ábra a csirke c-Src cDNS szekvenciája, amely a komplett kódoló szekvencia azokkal az intronokkal együtt, amelyek Takeya és munkatársai első leírásából [Cell 32, 881-890 (1983)] hiányoznak. Ez a szekvencia hozzáférhető J00844 GenBank hozzáférési számon. A szekvencia 1759 nukleotidot tartalmaz, ahol a fehérjét kódoló rész a 112. nukleotid helynél kezdődik és az 1713. nukleotid helynél végződik.

A 2. ábra a csirke c-Src kódolt aminosavgyök szekvenciája, amelyet az 1. ábrában bemutatott kódoló szekvencia kódol.

A 3. ábra humán c-Src cDNS szekvenciája, amelyet először Braeuninger és munkatársai írtak le [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 10411-10415 (1991)]. A szekvencia hozzáférhető a GenBank-tól az X59932 X71157 hozzáférési számon. A szekvencia 2187 nukleotidot tartalmaz, ahol a fehérje kódoló rész a 134. nukleotid helynél kezdődik és az 1486. nukleotid helynél végződik.

A 4. ábra a humán c-Src kódolt aminosavgyök szekvenciája, amelyet a 3. ábrában bemutatott kódoló szekvencia kódol.

Az 5. ábra bemutatja endogén Src aktiválásását bFGF-fel vagy VEGF-fel, amint ezt a 4. példában leírjuk. Az ábra felső része egy in vitro kináz vizsgálat eredményeit mutatja be endogén c-Src megfelelő szorzószámú aktiválásával bFGF-fel vagy VEGF-fel. Az ábra alsó része a kináz vizsgálati folt próbázása anti-Src antitesttel, mint terhelő kontrollal ekvivalens Src és IgG tartalomhoz.

A 6. ábra a c-Src A retrovírus-közvetített gén expressziójának hatását illusztrálja az angiogenezisre a csirke magzatburok tömlői (korioallantoin) membránjában (CAM), ahogyan ezt a 4. példában leírjuk. 9 napos csirke CAM-ot teszünk ki RCAS-Src A (aktív mutált c-Src) vagy kontroll RCAS-GFP (Green Fluorcescent Protein; egy fluorescens indikátor fehérje) retrovírusoknak vagy puffernek 72 órán át. Az angiogenezis szintjét mennyiségileg úgy határozzuk meg, ahogyan a 6A. ábrában bemutatjuk, míg a reprezentatív mikrofényképek (4x) a 6B. ábrában az egyes kezeléseknek felelnek meg sztereomikroszkóppal felvéve.

A 7. ábra a c-Src A retrovirális expresszióját mutatja be aktiváló vaszkuláris MAP kináz foszforilezésben. A 7A. ábra 10 napos csirke CAM-ok szöveti extraktumait mutatja, amelyek ki voltak téve VEGFnek vagy PMA-nak 30 percig, vagy fertőzve voltak c-Src A retrovírussal 48 órán át. Az NT azt jelenti, hogy nem történt kezelés. Az Src-t immun-kicsapásnak vetjük alá ekvivalens mennyiségű teljes fehérje extraktumból és alávetjük egy in vitro immun komplex kináz vizsgálatnak FAK-GST fúziós fehérjét alkalmazva szubsztrátumként, majd elektroforézist végzünk és átvisszük nitrocellulózra. A fenti teljes szöveti lizátumok alikvotjait azután mérjük endogén ERK foszforilezésre immunfoltképzéssel (blotting) anti-foszfo-ERK antitesttel. A 7B. ábra 10 napos CAM-okat mutat be, amelyek fertőzve vannak vagy vak RCAS-sel vagy Src A-t tartalmazó RCAS-sel. Két nap múlva a CAM-okat felboncoljuk, OCT-ben fagyasztva tároljuk és 4 μm-es metszeteket készítünk. A metszeteket immun-festésnek vetjük alá anti-foszforilezett ERK antitestekkel (New England Biolabs), mossuk és kimutatjuk kecskeanti-nyúl FITC-konjugált szekunder antitesttel. Fluoreszcens képeket fogunk be hütött CCD kamerával (Princeton Inst.).

A 8. ábra a szelektív követelményt mutatja be Src aktivitáshoz a VEGF-fel indukált angiogenezis során, de nem a bFGF-fel indukált angiogenezis során. 9 napos csirke CAM-okat teszünk ki RCAS-Src 251-nek vagy kontroll RCAS-GFP retrovírusoknak vagy puffernek 20 órán át, majd inkubáljuk további 72 órán át bFGF vagy VEGF jelenlétében vagy távollétében. Az angiogenezis szintjeit a 8A. ábrában értékeljük mennyiségileg, ahogyan az előzőekben leírtuk, és reprezentatív mikrofényképeket (6x) veszünk fel sztereomikroszkóppal és ezeket a 8B. ábrában mutatjuk be. A 8C. ábra foltképzést mutat be anti-Src antitesttel próbázva, hogy igazoljuk az Src 251 expresszióját átfertőzött sejtekben, összehasonlítva a vak kezelésekkel.

A 9. ábra RCAS-Src 251 retrovirális szolgáltatásának eredményeit ábrázolja humán tumorokhoz. A 9A. ábra mikrofénykép, amely RCAS-GFP-vel (RCAS-Green Fluorescent Protein) fertőzött humán medulloblasztóma tumor fragmentumot mutat be, amely GFP-t kizárólag a tumor véredényekben expresszál (lásd a nyílhegyet), amint ezt BioRad lézer konfokális tapogató mikroszkóppal (vonal=500 μm) végzett optikai metszetkészítéssel kimutatjuk. A 9B. ábra adatokat mutat be retrovirus helyi alkalmazásával kezelt tumorokból, amelyeket nőni hagyunk 3 vagy 6 napig azután, hogy ezeket kimetszettük és nedves tömegüket meghatároztuk. Az adatokat úgy fejezzük ki, mint átlagos változást a tumor tömegben (50 mg tumor kiindulási tömegből) +/- 2 párhuzamos standard eltérése (SEM). A 9C. ábra reprezentatív mikrofényképekben embriókból sebészileg eltávolított medulloblasztóma tumorokat mutat be (vonal = 350μm). Az alsó panelek az egyes tumorok nagy .:. ...· ·., · r nagyítású képei, amelyek részletesen mutatják be az egyes tumorok érrendszerét (vonal = 350pm). A nyílhegy véredény szétesést jelez RCAS-Src 251-gyel kezelt tumorokban.

A 10. ábra olyan diagram, amely az RCASBP(RCAS) vektor konstrukció restrikciós térképét szemlélteti.

Az alábbiakban részletesen leírjuk a találmányt.

A. Definíciók

Aminosav gyök. Ez olyan aminosavra utal, amely valamely polipeptid peptid kötéseinél végbemenő kémiai emésztésekor (hidrolízis) keletkezik. Az itt leírt aminosav gyökök előnyösen L izomer formában vannak. D izomer formák is helyettesíthetnek bármely L-aminosav gyököt, amíg a kívánt működési tulajdonságot a polipeptid megőrzi. Az NH₂ a polipeptid amino terminálisán jelen levő szabad aminocsoportra utal. A COOH a polipeptid karboxi terminálisán jelen levő szabad karboxicsoportra utal, betartva a standard polipeptid nomenklatúrát [J. Biol. Chem. 243, 3552-59 (1969); és ennek adaptálása a 37 CFR §1. 822 (b) (2)-ben],

Meg kell jegyeznünk, hogy minden aminosavgyök szekvenciát itt olyan képlettel mutatunk be, amely balról jobbra halad, a hagyományos irányban az amino terminálistól a karboxi terminálisig. Ezen kívül egy vonalka az aminosavgyök szekvencia elején vagy végén egy peptid kötést jelez egy vagy több aminosav gyök egy további szekvenciájához.

Polipeptid. Ez a kifejezés aminosavgyökök egymással peptidkötésekkel összekapcsolt lineáris sorára utal, ahol a peptid kötés az α-aminocsoport és a mellette levő aminosav gyök karboxilcsoportja közt létesült.

Peptid. Ez a kifejezés, ahogyan itt használjuk, nem több, mint 50 aminosavgyök lineáris sorára utal, amelyek egymással úgy vannak összekapcsolva, ahogyan a polipeptidekben.

Ciklusos peotid. Ez a kifejezés olyan vegyületre utal, amelynek gyűrűs szerkezete van, és a számos olyan amid kötést foglal magában, mint amelyek a tipikus peptidekben találhatók. A ciklusos peptid lehet fejtől farokig homodetikus ciklusos peptid, vagy tartalmazhat egy heterodetikus gyűrűszerkezetet, amelyben a gyűrű diszulfid hidakkal, laktám hidakkal, tioészerekkel, tioamidokkal, guanidinocsoporttal vagy hasonló kapcsolásokkal van bezárva.

Fehérje. Ez a kifejezés több, mint 50 aminosavgyök lineáris sorára utal, amelyek úgy vannak összekapcsolva, ahogyan a polipeptidekben.

Fúziós fehérje. Ez a kifejezés olyan polipeptidre utal, amely legalább két különböző polipeptid tartományt (domént) tartalmaz működőképesen összekapcsolva egy tipikus peptidkötéssel (fuzionált), ahol a két tartomány olyan peptideknek felel meg, amelyeket a természetben nem találtak fuzionálva.

Szintetikus peptid. Ez a kifejezés aminosavgyökök kémiailag kialakított láncára utal, ahol az aminosavgyökök egymással peptidkötéssel vannak összekapcsolva. A szintetikus peptid mentes a természetben előforduló fehérjéktől és fragmentumaitól.

B. Általános megfontolások

A találmány általában azon a felismerésen alapul, hogy az angiogenezist az Src tirozin kinéz fehérje közvetíti, és azon, hogy az angiogenezist módosítani lehet aktív vagy inaktív Src fehérjék szolgáltatásával az angiogenezis gerjesztésére illetve gátlására.

Ez a felismerés nagyon fontos, mivel az angiogenezis, vagyis az új véredények képzése jelentős szerepet játszik sokféle betegségi folyamatban. Ahol egy betegségi állapottal társult szövet angiogenezist igényel a szöveti növekedéshez, kívánatos az angiogenezist gátolni és ezáltal a megbetegedett szövet növekedését gátolni. Amikor egy sérült szövet angiogenezist igényel a szöveti növekedéshez és gyógyuláshoz, kívánatos lehet gerjeszteni vagy elősegíteni az angiogenezist és ezáltal elősegíteni a szövet gyógyulását és növekedését.

Amikor új véredények növekedése a megbetegedett szövettel társult patológiás állapot oka vagy hozzájárul ehhez a patológiás állapothoz, az angiogenezis gátlása csökkenti a betegség káros hatásait. Az angiogenezis gátlásával útját lehet állni a betegségeknek, enyhíteni lehet a tüneteket és bizonyos esetekben gyógyítani lehet a betegséget.

Az olyan betegségek, amelyek érinthetik a szöveteket és a neovaszkularizációt (vagyis új érképzést), és amelyekkel kapcsolatban előny származhat az angiogenezis gátló jellegű módosításával, fogalma magában foglalja az izületi csúzt (reumatoid artritisz), diabetikus retinopátiát, gyulladásos betegségeket, resztenózist és hasonló betegségeket. Ahol az új véredények növekedése szükséges egy ártalmas szövet növekedésének támogatására, az angiogenezis gátlása csökkenti a .:. ...· ·„· ·τ vérszolgáltatást ebben a szövetben és ezáltal hozzájárul a szövettömeg, amely a vérszolgáltatási követelményeken alapul, csökkenéséhez. A példák magukban foglalják a tumorok növekedését, ahol a neovaszkularizáció folyamatos követelmény ahhoz, hogy a tumor néhány milliméteres vastagsági növekedésen túl is növekedjék, magukban foglalják továbbá szilárd tumor áttételek létesülését.

Amikor az új véredények növekedése hozzájárul a szövet gyógyulásához, az angiogenezis gerjesztése segít a gyógyulásban. Példák találhatók iszkémiás végtagokkal bíró betegek, akiknél gyenge a keringés a végtagokban cukorbaj vagy más okok miatt, kezelésére. Szintén kezelés kezdeményezhető olyan betegeknél, akiknek nem gyógyuló sebeik vannak és ezért előnyük származhat a vaszkuláris sejt burjánzás, a neovaszkularizáció növekedéséből.

A találmány szerinti eljárások részben azért hatékonyak, mivel a terápia nagy mértékben szelektív az angiogenezisre, míg más biológiai folyamatokra nem.

Amint korábban leírtuk, az angiogenezis sokféle folyamatot foglal magában, amelyek érintettek a szövet neovaszkularizációjában, ezek közé értve a csirázás-t, érkialakulást (vaszkulogenezist) vagy véredény megnagyobbodást, ahol a Src fehérje hatással van az angiogenezises folyamatok mindegyikére. A traumás sebgyógyulások, sárgatest kialakulás és embriogenezis kivételével véleményünk szerint az angiogenezises folyamatok többsége betegségi folyamatokkal társul. Következésképpen a jelen terápiás eljárások szelektívek a betegségre és ezeknek az eljárásoknak nincsenek káros mellékhatásai.

C. Src fehérjék

Egy Src tirozin kináz fehérje a találmány szerinti felhasználáshoz változó lehet a szándékolt felhasználástól függően. Az Src fehérje vagy Src kifejezések az Src tirozin kináz fehérjék itt leírt különböző formáira utalnak aktív vagy inaktív formában.

Az aktív Src fehérje kifejezés az Src fehérje bármely olyan formájára utal, amely gerjeszti az angiogenezist. Az angiogenezis gerjesztésére vonatkozó előnyös méréseket itt leírjuk, ezek azonban nem korlátozó jellegűek. A fehérjét akkor tekintjük aktívnak, ha az angiogenezis szintje legalább 10 %-kal, előnyösen 25 %-kal, és még előnyösebben 50 %-kal nagyobb, mint a kontroll szint, amelynél Src-t nem adunk a vizsgáló rendszerhez. A gerjesztés méréséhez előnyös vizsgálati rendszer a CAM vizsgálat, amelyben RCAS vírus vektort alkalmazunk, amint ezt a kiviteli példákban leírjuk; ebben a vizsgálatban az angiogén indexet úgy számítjuk ki, hogy megszámláljuk az elágazási pontokat. Egy előnyös aktív Src fehérje tirozin kináz aktivitást is mutat. Az aktív Src fehérjékre példákat írunk le a kiviteli példákban, ezek között szerepel az Src A.

Az inaktív Src fehérje kifejezés az Src fehérje bármely olyan formájára utal, amely gátolja az angiogenezist. Az angiogenezis gátlására vonatkozó méréseket itt leírjuk, ezek azonban nem korlátozó jellegűek. A fehérjét akkor tekintjük inaktívnak, ha az angiogenezis szintje legalább 10 %-kal, előnyösen 25 %-kal, és még előnyösebben 50 %-kal kisebb, mint a kontroll szint, amelynél • · · ····« ····** · exogén Src-t nem adunk a vizsgáló rendszerhez. A gátlás méréséhez előnyös vizsgálati rendszer a CAM vizsgálat, amelyben RCAS vírus vektort alkalmazunk, ebben a vizsgálatban az angiogén indexet úgy számítjuk ki, hogy megszámláljuk az elágazási pontokat. Egy előnyös inaktív Src fehérje csökkentett tirozin kináz aktivitást mutat. Az inaktív Src fehérjékre példákat írunk le a kiviteli példákban, ezek között szerepel az Src 251.

Valamely, a találmányban alkalmazható Src fehérjét elő lehet állítani sokféle különböző eljárás valamelyikével, ezek közé értve az izolálást természetes forrásokból, például szövetekből, az előállítást rekombináns DNS expresszióval és ezt követő tisztítással, és további hasonló eljárásokat. Src fehérjét lehet szolgáltatni in situ is valamely génterápiás rendszert bevezetve a szóban forgó szövetbe, amely azután expresszálja a fehérjét a szövetben.

Egy Src fehérjét kódoló gént előállíthatunk a szakterületen ismert sokféle eljárás bármelyikével, és ebből a szempontból a találmányt semmiféleképpen nem szándékozunk korlátozni. így például az Src természeti fejlődéstörténete jól ismert, így ide tartozik az Src homológok sokasága emlős, madár (avian), vírus és hasonló forrásokból. A gént könnyen lehet klónozni cDNS klónozó eljárásokat alkalmazva bármely, a fehérjét expresszáló szövetből. A találmány céljaira előnyös Src egy celluláris fehérje, például az emlős- vagy madár homológok, amelyeket c-Src-nek neveznek. Különösen előnyös a humán c-Src.

• · · » · · * · ·· · ··* ( strukturgén dezoxiribonukleinsav (DNS) szekvenciájával. így egy strukturgént vagy DNS szegmenst meghatározhatunk azon fehérje vagy polipeptid aminosavgyök szekvenciája alapján, amelyet a gén vagy szegmense kódol.

A genetikai kódnak fontos és jól ismert vonása a redundancia. Ez azt jelenti, hogy a fehérjék előállításához alkalmazott aminosavak többségét egynél több kódoló nukleotid triplett (kodon) kódolhatja vagy egy vagy több nukleotid triplett (kodon) jelölhető meg egy adott aminosav gyökhöz. Ennél fogva egy sor különböző nukleotid szekvencia kódolhat egy adott aminosavgyök szekvenciát. Az ilyen nukleotid szekvenciákat funkcionálisan egyenértékűnek tekintjük, mivel ezek minden organizmusban ugyanazon aminosavgyök kialakulását eredményezhetik. Alkalmanként a purinnak vagy pirimidinnek metilezett változata épülhet be egy adott nukleotid szekvenciába. Az ilyen metilezés azonban semmiképpen nem hat a kódolási viszonyokra.

Egy nukleinsav lehet bármilyen polinukleotid vagy nukleinsav fragmentum, legyen bár poliribonukleotid vagy polidezoxiribonukleotid, vagyis RNS vagy DNS vagy analógjaik. Az előnyös kiviteli formákban egy nukleinsav molekula DNS, előnyösen kettős szálú DNS szegmens formájában van, bár bizonyos molekulárbiológiai módszerekben az egyszálas DNS vagy RNS az előnyös.

DNS szegmenseket sokféle eljárással állíthatunk elő, ide értve a szintetikus vegyi utakat és a rekombináns megközelítéseket, előnyösen a klónozást vagy a polimeráz láncreakciót (PCR). Azokat a DNS szegmenseket, amelyek egy Src fehérje részeit kódolják, könnyen szintetizálhatjuk kémiai technikákkal, például a foszfotriészter eljárással [Matteucci és munkatársai: J. Am. Chem. Soc. 103, 3185-3191 (1981)], vagy automatizált szintézises eljárást alkalmazva. Ezen kívül nagyobb DNS szegmenseket könnyen előállíthatunk jól ismert eljárásokkal, például a DNS szegmenst meghatározó oligonukleotidok egy csoportjának szintézisével, amelyet hibridizálás követ, majd az oligonukleotidok ligálása, hogy felépítsük a komplett szegmenst. Más eljárások magukban foglalják egy előnyös DNS szegmens izolálását PCR-rel oligonukleotid primerek egy párjával, amelyet egy olyan cDNS könyvtárhoz alkalmazunk, amelyről úgy véljük, hogy tartalmaz Src fehérjét kódoló tagokat.

Kémiai szintézissel természetesen elvégezhetünk bármely módosítást egyszerűen helyettesítve a megfelelő bázisokat olyan bázisokkal, amelyek a natív aminosavgyök szekvenciát kódolják. Az eljárás jól ismert és könnyen alkalmazható sokféle itt leírt, különböző módosított Src fehérje előállításához.

Ezen kívül a DNS szegmensek, amelyek lényegében egy Src fehérjét kódoló strukturgénből állnak, ezt követően is módosíthatók helyre irányuló vagy véletlenszerű mutagenezissel, hogy bevezessünk bármely kívánt helyettesítést.

1, Src gén klónozása

Egy Src gént klónozhatunk genomikus DNS vagy hírvivő (messenger) RNS (mRNS) alkalmas forrásából sokféle biokémiai eljárás valamelyikével. Ezeknek a géneknek a klónozását általános eljárások szerint hajthatjuk végre, amelyek le vannak írva a kiviteli példákban és a szakterületen ismertek.

A találmány szerinti eljárásban való felhasználáshoz alkalmas Src gén klónozásához nukleinsavak forrásai lehetnek genomikus DNSek vagy hírvivő RNS-ek (mRNS-ek) cDNS könyvtár formájában olyan szövetekből, amelyekről vélhető, hogy expresszálják ezeket a fehérjéket. Előnyös szövet a humán tüdöszövet, bár bármely más megfelelő szövet is alkalmazható.

Az előnyös klónozási eljárások magukban foglalják egy cDNS könyvtár megalkotását standard eljárások szerint, továbbá Srckódoló nukleotid szekvencia izolálását PCR amplifikálással az itt leírt nukleotid szekvenciákon alapuló, párban álló oligonukleotid primerek alkalmazásával. Egy másik eljárás szerint a kívánt cDNS kiónokat egy cDNS-ből vagy genomikus könyvtárakból azonosíthatjuk és izolálhatjuk hagyományos nukleinsav hibridizáló eljárással olyan hibridizáló próbát alkalmazva, amely az itt leírt nukleinsav szekvenciákon alapul. Más eljárások Src kódoló nukleinsavak izolálására és klónozására gyakorlatilag nyilvánvalók azok számára, akik a szakterületen járatosak.

2. Exoressziós vektorok

Egy Src fehérjét kódoló DNS szegmenst tartalmazó rekombináns DNS molekulát (rDNS) úgy állíthatunk elő, ahogyan itt leírjuk. Pontosabban egy expresszálható rDNS-t alakíthatunk ki egy vektort operatívan (keretben, expresszálhatóan) egy Src kódoló DNS szegmenshez kapcsolva. így egy rekombináns DNS molekula egy olyan hibrid DNS molekula, amely legalább két nukleinsavból álló nukleotid szekvenciát tartalmaz, amelyek normálisan nem találhatók együtt a természetben.

Annak a vektornak a kiválasztása, amelyhez a DNS szegmens működőképesen kapcsolódik, közvetlenül függ - amint ez a szakterületen jól ismert - a kívánt működési tulajdonságoktól, például a fehérje expressziótól, valamint a transzformálandó gazdasejttől. Egy olyan vektornak, amely alkalmas a jelen találmány gyakorlati kivitelezésében, legalább képesnek kell lennie egy strukturgén replikációjának és előnyösen expressziójának irányítására, amely strukturgén benne foglaltatik azokban a vektor DNS szegmensekben, amelyekhez működőképesen van kapcsolva. Mind prokarióta, mind eukarióta expressziós vektorok ismertesek azok számára, akik jártasak a vektor megalkotás szakterületén, és le vannak írva Ausubel és munkatársai szakközleményében [a Current Protocols in Molecular Biology című szakkönyvben; kiadó: Wiley and Sons, New York (1993)], továbbá Sambrook és munkatársai szakkönyvében [Molecular Cloning: A Laboratory Manual; kiadó: Cold Spring Harbor Laboratory (1989)]. Ezek a referenda helyek leírnak számos általános rekombináns DNS eljárást, amelyekre itt utalunk.

Az egyik kiviteli módban egy megfelelő vektor magában foglal egy prokarióta replikont, vagyis egy olyan DNS szekvenciát, amely képes irányítani a rekombináns DNS molekula közvetlen autonóm replikálódását és fenntartását extrakromoszomálisan valamely prokarióta gazdasejtben, például bakteriális gazdasejtben, amely ezzel van transzformálva. Az ilyen replikonok a szakterületen jól ismertek. Ezen kívül azok a kiviteli formák, amelyek magukban foglalnak valamely prokarióta replikont, magukban foglalnak egy olyan gént is, amelynek expressziója gyógyszer rezisztenciát visz át egy bakteriális gazdasejtbe, amely ezzel transzformálva van.

Tipikus bakteriális gyógyszer rezisztencia gének azok, amelyek ampicillinre vagy tetraciklinre visznek át rezisztenciát.

Azok a vektorok, amelyek valamely prokarióta replikont foglalnak magukban, magukban foglalhatnak egy olyan prokarióta promótert is, amely irányítani képes egy strukturgén expresszióját (transzkripció és transzláció) valamely bakteriális gazdasejtben, például E.coli-ban, amely ezzel van transzformálva. A promoter egy DNS szekvencia által kialakított expressziós szabályozó elem, amely lehetővé teszi, hogy az RNS polimeráz kötése és a transzkripció végbemenjen. A bakteriális gazdaszervezetekkel összeférhető promoter szekvenciákat tipikusan olyan plazmid vektorokban szolgáltatják, amelyek kényelmes restrikciós helyeket nyújtanak valamely találmány szerinti DNS szegmens beiktatásához. Tipikusan ilyen jellegű plazmid vektorok a pUC8, pUC9, pBR322 és pBR329, amelyek a BioRad Laboratories-töl (Richmond, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok) szerezhetők be, a pRSET, amely az Invitrogen-töl (San Diego, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok) szerezhető be, továbbá a pPL és pKK223, amelyek a Pharmacia-tól (Piscataway, New Jersey, Amerikai Egyesült Államok) szerezhetők be.

Az eukarióta sejtekkel összeférhető expressziós vektorokat, előnyösen gerinces sejtekkel összeférhető expressziós vektorokat is lehet alkalmazni a találmány szerinti rekombináns DNS molekulák kialakítására. Eukarióta sejt expressziós vektorok jól ismertek a szakterületen és ezek rendelkezésre állnak sokféle kereskedelmi forrásból. Általában olyan vektorok vannak forgalomban, amelyek kényelmes restrikciós helyeket tartalmaznak a kívánt DNS szegmens beiktatásához. Tipikus ilyen vektorok a pSVL és a pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-1/pML2d (International Biotechnologies, Inc.), pTDT1 (ATCC 31255), pRc/CMV (Invitrogen, Inc.); az előnyös vektorok azok, amelyeket a kiviteli példákban leírunk, és az ezekhez hasonló eukarióta expressziós vektorok.

A gén expresszióhoz ezzel a találmánnyal összefüggésben különösen előnyös rendszer magában foglal egy gén szolgáltató alkotórészt, vagyis megteremti a lehetőséget a gén szolgáltatására a szóban forgó szövetbe. A megfelelő vektorok fertőző vektorok, mint a rekombináns DNS vírusok, adenovirus vagy retrovirus vektorok, amelyek úgy vannak tervezve, hogy expresszálják a kívánt fehérjét, és olyan vonásokkal bírnak, hogy lehetővé tegyék egy előre kiválasztott célszövet fertőzését. Különösen előnyös a replikáció-kompetens madár szarkóma vírus [replication competent avian sarcoma (RCAS) vírus], amelyet itt leírunk.

Tervezhetők olyan emlős sejt rendszerek, amelyek rekombináns vírusokat vagy vírus elemeket hasznosítanak, hogy irányítsák az expressziót. így például amikor adenovirus expresszós vektorokat alkalmazunk, egy polipeptidet kódoló szekvenciát ligálhatunk egy f

adenovirus transzkripciós/transzlációs szabályozó komplexbe, például a késői promoter és háromrészes vezető (tripartite leader) szekvenciába. Ezt a kiméra gént azután beiktathatjuk az adenovirus genomba in vitro vagy in vivo rekombinációval. A beiktatás a vírus genom egy nem-esszenciális területébe (például az E1 vagy E3 területbe) olyan rekombináns vírust eredményez, amely életképes és képes expresszálni a polipeptidet a megfertőzött gazdaszervezetben [lásd például Logan és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 3655-3659 (1984)]. Egy másik eljárás szerint a Vaccinia vírus 7.5 K promótert alkalmazhatjuk [lásd például Mackett és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 7415-7418 (1982); Mackett és munkatársai: J. Virol. 49, 857-869 (1984); Panicali és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 4927-4931 (1982)]. Különösen érdekesek azok a vektorok, amelyek szarvasmarha papillóma víruson alapulnak, ezek ugyanis azzal a képességgel bírnak, hogy extrakromoszómális elemekként replikáidnak [Sarver és munkatársai: Mol. Cell. Biol. 1, 486 (1981)]. Röviddel azután, hogy ez a DNS belép a célsejtbe, a plazmid replikálódik mintegy 100-200 másolattal sejtenként. A beiktatott cDNS transzkripciója nem igényli a plazmid integrációját a gazdasejt kromoszómájába, ezáltal az expresszió magas szintje alakul ki. Ezek a vektorok alkalmazhatók stabil expresszióhoz, belefoglalva egy szelektálható markert a plazmidba, például a neo gént. Egy másik megoldás szerint a retrovirális genom módosítható olyan vektorként való felhasználáshoz, amely képes a polipeptidet kódoló nukleotid szekvenciát bevezetni a gazdasejtbe és képes ennek expresszióját irányítani a gazdasejtben [Cone és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6349-6355 (1984)]. Magas szintű expresszié érhető el indukálható promóterek alkalmazásával is, közéjük értve - a korlátozás szándéka nélkül - a metallotionin HA promoted és a hősokk promótereket.

Nemrégiben hasonlították össze a hosszú távú túlélést a citomegalovírus (CMV) promoter által hajtott és a Rous szarkóma vírus (RSV) promoter által hajtott timidin kináz (TK) génterápia között humán petefészekrákot hordozó meztelen egerekben. Az adenovírus-közvetített CMV promoter által hajtott Herpes simplex vírus TK génterápiának sejtpusztító hatékonysága 2-10-szer nagyobb, mint az RSV által hajtott terápia hatékonysága [Tong és munkatársai: Hybridoma 18 (1), 93-97 (1999)]. Leírták kiméra promóterek tervezését is génterápiás alkalmazásokhoz, amely megköveteli és alacsony szintű expressziót, amelyet indukálható magas szintű expresszió követ [Suzuki és munkatársai: Human Gene Therapy 7, 1883-1893 (1996)].

Rekombináns fehérjék hosszú távú, nagy kitermelésű termelésében a stabil expresszió az előnyös. A helyett, hogy olyan expressziós vektorokat alkalmaznánk, amelyek vírus eredetű replikációs origót tartalmaznak, a gazdasejteket megfelelő szabályozó elemekkel (például promoter és fokozó szekvenciákkal, transzkripciós terminátor szekvenciákkal, poliadenilező helyekkel, stb.) és valamely szelektálható markerrel szabályozott cDNS-sel transzformálhatjuk. Amint az előzőekben említettük, a rekombináns plazmidban levő szelektálható marker rezisztenciát ad át a szelekcióhoz és lehetővé teszi, hogy a sejtek stabilan integrálják a plazmidot kromoszómáikba és növekedjenek gócokat képezve, amelyek pedig klónozhatok és sejtvonalakba terjeszthetők ki.

így például idegen DNS bevezetését követően a manipulált sejteknek lehetővé tehetjük, hogy 1-2 napig nőjenek dúsított tápközegen, majd átkapcsolunk valamely szelektív tápközegre. Sokféle szelekciós rendszer alkalmazható, beleértve (de nemcsak ezekre korlátozva) a Herpes simplex vírus timidin kináz [Wigler és munkatársai: Cell 11. 223 (1977)], hipoxantin-guanin foszforibozil transzferáz [Szybalska és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48, 2026 (1962)], és az adenin foszforibozil transzferáz [Lowy és munkatársai: Cell 22, 817 (1980)] géneket, amelyeket alkalmazni lehet a tk^-, hgprt~ illetve aprt^- sejtekben. Alkalmazhatók antimetabolit rezisztencia átadó gének is a szelekció alapjaként; ilyenek például a dhfr génjei, amelyek rezisztenciát adnak át metotrexátra [Wigler és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 3567 (1980); O'Hare és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 1527 (1981)]; a gpt, amely rezisztenciát ad át mikofenolsavra [Mulligan és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 2072 (1981)]; a neo, amely rezisztenciát ad át a G-418 aminoglükozidra [Colberre-Garapin és munkatársai: J. Mól. Bioi. 150, 1 (1981); és a hygro, amely rezisztenciát ad át higromicinre (Santerre és munkatársai; Gene 30, 147 (1984)]. Nemrégiben további szelektálható géneket is írtak le, nevezetesen a trpB-t, amely lehetővé teszi, hogy a sejtek indolt hasznosítsanak triptofán helyett; a hisD-t, amely lehetővé teszi, hogy a sejtek hisztinolt hasznosítsanak hisztidin helyett [Hartman és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 804 (1988)], és az ODC-t (ornitin dekarboxiláz), amely rezisztenciát ad át a 2-(difluor-metil)-DL-ornitin (DMFO) ornitin dekarboxiláz inhibitorra [McConlogue L, a Current Communications in Molecular Biology (Új közlemények a molekuláris biológiában) című szakkönyvben, szerkesztő- kiadó: Cold Spring Harbor Laboratory (1987)].

A főbb vektorok, amelyeket figyelembe kell venni a humán génterápiában, retrovirus eredetűek [Wilson: Clin. Exp. Immunol. 107 (1. szupplementum), 31-32 (1997); Bank és munkatársai: Bioessays 18 (12) 999-1007 (1996); Robbins és munkatársai: Pharmacol. Ther. 80(1), 35-47 (1998)]. A génátvitel és az antiszensz terápia gyógyászati potenciálja serkenti több vektorrendszer kifejlesztését sokféle szövet kezelésére [érrendszer: Stephan és munkatársai: Fundam. Clin. Pharmacol. 11 (2), 97-110 (1997); Feldman és munkatársai: Cardiovasc. Rés. 35 (3), 391-404 (1997); Vassalli és munkatársai: Cardiovasc. Rés. 35 (3), 459-69 (1997); Baek és munkatársai: Circ. Rés. 82 (3), 295-305 (1998); vese: Lien és munkatársai: Kidney Int. Suppl. 61, S85-8 (1997); máj: Ferry és munkatársai: Human Gene Ther. 9 (14), 1975-81 (1998); izom: Marshall és munkatársai: Curr. Opn. Genet. Dev. 8 (3), 360-5 (1998)]. Ezeken a szöveteken kívül a humán génterápia kritikus célpontja a rák, vagy a tumor maga, vagy a társult szövetek [Runnebaum: Anticancer Rés. 17 (4B), 2887-90 (1997); Spear és munkatársai: J. Neurovirol. 4 (2), 133-47 (1998)].

Azokra a vírus génterápiás vektor rendszerekre, amelyek könnyen adaptálhatók a találmány szerinti eljárásokban való felhasználásra, speciális példákat írunk le a továbbiakban. Retrovirus gén szolgáltatásról közöltek nemrég összefoglalást Federspiel és

......· · ··;·

Hughes [Methods in Cell Biol. 52, 179-214 (1998)], amelyben főleg a madár (avian) leukózis vírus (ALV) családot írják le [Federspiel és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4931 (1996); Federspiel és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 11241 (1994)]. Retrovirus vektorokról, ide értve az ALV-t és a rágcsáló leukémia vírust (MLV), ír továbbá Svoboda [Gene 206, 153-163 (1998)].

Módosított retrovirus / adenovirus expressziós rendszerek könnyen adaptálhatók a jelen találmány szerinti eljárások gyakorlatához. így például Karavanas és munkatársai adtak áttekintést a rágcsáló leukémia vírus (MLV) rendszerekről [Crit. Rev. in Oncology/ Hematology 28, 7-30 (1998)]. Az adenovirus expressziós rendszerekről adnak áttekintést Van Seggem és Nemerow a Gene Expression Systems című szakkönyvben [szerkesztők: Fernandez és Hoeffler, kiadó: Academic Press, San Diego, Kalifornia; 5. fejezet, 112-157. oldal (1999)].

A fehérje expressziós rendszerekről kimutatták, hogy hatékonyan alkalmazhatók mint in vivo, mind in vitro. így például leírtak hatékony génátvitelt humán pikkelyes sejt karcinómákba Herpes simplex vírus (HSV) 1. típusú amplikonjával [Carew és munkatársai: Am. J. Surg 176, 404-408 (1998)]. Herpes simplex vírust használnak génátvitelhez az idegrendszerbe [Goins és munkatársai: J. Neurovirol. 3 (1. szupplementum), S80-8 (1997)]. HSV-TK-t alkalmazva célzott öngyilkos vektorokat vizsgáltak szilárd tumorokon [Smiley és munkatársai: Hum. Gene Ther. 8 (8), 965-77 (1997)]. Herpes simplex 1. típusú vektort alkalmaztak rák génterápiához végbél karcinóma sejteken [Yoon és munkatársai:

Ann. Surg. 228 (3), 366-74 (1998)]. Hibrid vektorokat fejlesztettek ki, hogy kiterjesszék a transzfekció időtartamát, ezek között megemlítjük a HSV/AAV (adeno-asszociált vírus) hibrideket hepatociták kezelésére [Fraefel és munkatársai: Mól. Med. 3 (12), 813-825 (1997)].

Vaccinia vírusokat fejlesztettek ki humán gén terápiához nagy genomjuk miatt [Peplinski és munkatársai: Surg. Oncol. Clin. N. Am. 7 (3), 575-88 (1998)]. Timidin kináz-kiiktatott Vaccinia vírust, amely purin nukleozid pirofoszforilázt expresszál, írtak le tumorra irányuló génterápiás vektorként való felhasználásra [Puhlman és munkatársai: Human Gene Therapy 10, 649-657 (1999)].

Adeno-asszociált 2. vírust (AAV) írtak le humán gén terápiában való felhasználáshoz, az AAV azonban igényel egy segítő (helper) vírust (például adenovírust vagy herpeszvírust) az optimális replikációhoz és becsomagoláshoz emlős sejtekben [Snoeck és munkatársai: Exp. Nephrol. 5 (6), 514-20 (1997)]; Rabinowitz és munkatársai: Curr. Opn. Biotechnoi. 9 (5), 470-5 (1998)]. Leírták azonban fertőző rekombináns AAV in vitro becsomagolását, és ez ezt a rendszert sokkal ígéretesebbé teszi [Ding és munkatársai: Gene Therapy 4, 1167-1172 (1997)]. Kimutatták, hogy az ekotropikus retrovirus receptor cDNS AAV-vel közvetített átvitele lehetővé teszi megalapozott és primer humán sejtek ekotropikus retrovirális transzdukcióját [Qing és munkatársai: J. Virology 71 (7), 56635667)]. Bemutatták humán vad típusú p53-at expresszáló AAV vektor alkalmazását rák génterápiához [Qazilbash és munkatársai: Gene Therapy 4, 675-682 (1997)]. Bemutattak génátvitelt érsejtekbe is AAV vektorokat alkalmazva [Maeda és munkatársai: Cardiovascular Res. 35, 514-521 (1997)]. Az AAV-röl kimutatták, hogy megfelelő vektor májra irányuló gépterápiához [Xiao és munkatársai: J. Virol. 72 (12), 10222-6 (1998)]. Az AAV vektorokról kimutatták, hogy alkalmazhatók az agyszövetekben és a központi idegrendszerben végbemenő génterápiában [Chamberlin és munkatársai: Brain Res. 793 (1-2), 169-75 (1998); During és munkatársai: Gene Therapy 5 (6), 820-7 (1998)]. Az AAV vektorokat össze is hasonlították az adenovirus vektorokkal (AdV) a tüdő génterápiájánál és az átvitelnél humán cisztás fibrózisos hámsejtekbe [Teramoto és munkatársai: J. Virol 72 (11), 8904-12 (1998)].

Kiméra AdV/retrovírus génterápiás vektor rendszerek beépítik az egyes vírusok hasznos minőségi tulajdonságait, hogy egy nem integratív AdV-t alkossanak meg, amely azután funkcionálisan integratívvá válik egy retrovirus termelő sejt köztes generációja révén [Feng és munkatársai: Nat. Biotechnology 15 (9), 866-70 (1997); Bilbao és munkatársai: FASEB J. 11 (8), 624-634 (1997)]. A génterápiás vektoroknak ezt az erőteljes új generációját adaptálták célzott rák gén terápiához [Bilbao és munkatársai: Adv. Exp. Med. Bioi. 451, 365-74 (1998)]. p53-at expresszáló AdV egyetlen injekciója gátolja humán prosztata ráksejtek szubkután tumor gócait [Asgari és munkatársai; Int. J. Cancer 71 (3), 377-82 (1997). Vad típusú p53 Adv-vel közvetített génátvitelét írták le kifejlett, nemkissejtes tüdőrákban szenvedő betegekben [Schuler és munkatársai: Human Gene Therapy 9, 2075-2082 (1998)]. Ugyanez a rák a tárgya az AdV vektorok által közvetített p53 génhelyettesítéses terápiának [Roth és munkatársai: Semin.

Oncol. 25 (3), 8. szupplementum, 33-7 (1998)]. A p53-nak AdV-vel közvetített génátvitele gátolja a hámsejt differenciálódást és az angiogenezist in vivo [Riccioni és munkatársai: Gene Ther. 5 (6), 747-54 (1998)]. Leírták a gp75 melanoma antigén adenovírusközvetített expresszióját, mint immunterápiát áttételes melanómához [Hirschowitz és munkatársai: Gene Therapy 5, 975983 (1998)]. Az AdV megkönnyíti a humán sejtek fertőzését ekotropikus retrovírussal és növeli a retrovirus fertőzés hatékonyságát [Scott-Taylor és munkatársai: Gene Ther. 5 (5), 6219 (1998)]. AdV vektorokat alkalmaztak génátvitelhez vaszkuláris simaizom sejtekbe [Li és munkatársai: Chin. Med. J. (Engl.) 110 (12), 950-4 (1997); pikkelyes sejt karcinóma sejtekbe [Goebel és munkatársai: Otolaryngol. Head Neck Surg. 119 (4), 331-6 (1998)]; nyelőcsörák sejtekbe [Senmaru és munkatársai: Int. J. Cancer 78 (3), 366-71 (1998)]; meszangiális sejtekbe [Nahman és munkatársai: J. Investig. Med. 46 (5), 204-9 (1998)]; gliasejtekbe (Chen és munkatársai: Cancer Res. 58 (16), 3504-7 (1998); és az állatok ízületeibe [Ikeda és munkatársai: J. Rheumatol. 25 (9), 1666-73 (1998)]. Nemrégiben mutattak be egy AcV vektorok által közvetített katéter-alapú szívburki génátvitelt [March és munkatársai: Clin. Cardiol. 22 (1), 1. szupplementum, 123-9(1999)]. Az AdV rendszer manipulálása a megfelelő szabályozó genetikai elemekkel lehetővé teszi az AdV-közvetített szabályozható célgén expressziót in vivo [Burcin és munkatársai: PNAS (USA) 96 (2), 355-60(1999)].

Alfavírus vektorokat fejlesztettek ki humán génterápiás alkalmazáshoz expressziós kazettákkal való transzformációhoz alkalmas csomagoló sejtvonalakkal, amelyek megfelelőek Sindbis vírus és Semliki Forest vírus eredetű vektorokkal való felhasználásra (Polo és munkatársai: Proc. Nat). Acad. Sci. USA 96. 4598-4603 (1999)]. Kifejlesztettek nem citopátiás flavivírus replikon RNS alapú rendszereket is [Varnavski és munkatársai: Virology 255 (2), 366-75 (1999)]. Öngyilkos HSV-TK gént tartalmazó Sindbis vírus vektorokat alkalmaztak sejtfajlagos becélzásra tumorsejtekbe [Iijima és munkatársai: Int. J. Cancer 80 (1), 110-8 (1998)].

Humán habos víruson [human foamy virus (HFV)] alapuló retrovirus vektorok ígéretesnek mutatkoztak, mint génterápiás vektorok [Trobridge és munkatársai: Human Gene Therapy 9, 2517-2525 (1998)]. Habos vírus vektorokat terveztek öngyilkos génterápiákhoz [Nestler és munkatársai: Gene Ther. 4 (11), 1270-7 (1997)]. Rekombináns rágcsáló citomegalovírust és promoter rendszereket szintén alkalmaztak vektorokként magas szintű expresszióhoz [Manning és munkatársai: J. Virol. Meth. 73 (1), 31-9 (1998); Tong és munkatársai: Hybridoma 18 (1). 93-7 (1998)].

Gén szolgáltatást nem osztódó sejtekbe könnyebbé lehet tenni a Sendai vírus alapú vektorok kialakításával [Nakanishi és munkatársai: J. Controlled Release 54 (1) 61-8 (1998)].

A további erőfeszítések során, hogy lehetővé tegyék nem osztódó szomatikus sejtek transzformálását, feltárták a lentivírus vektorokat. Leírták cisztás fibrózis génterápiáját egy replikáció hiányos humán immunhiány vírus [human immunodeficiency virus (HIV)] alapú vektor alkalmazásával [Goldman és munkatársai: Human Gene Therapy 8, 2261- 2268 (1997)]. Leírták májba és izomba átadott gének hosszan tartó expresszióját is [Kafri és munkatársai: Nat. Genet. 17 (3), 314-7 (1997)]. A biztonsági aggodalmak azonban jelentősek, ezért javított vektorok kifejlesztése gyors ütemben folytatódik [Kim és munkatársai: J. Virol. 72 (2), 994-1004 (1998)]. A HIV LTR és Tat vizsgálatai fontos információkat nyújtanak a kifejlődő vektorok genomjainak szerveződéséről [Sadaie és munkatársai: J. Med. Virol. 54 (2), 118-28 (1998)]. így a genetikai követelmények egy hatékony HÍV alapú vektorhoz már jobban megérthetek [Gasmi és munkatársai: J. Virol. 73 (3), 1828-34 (1998)]. Leírtak ön-inaktiváló vektorokat, vagy feltételes csomagoló sejtvonalakat írtak le [lásd például Zuffery és munkatársai: J. Virol. 72 (12), 9873-80 (1998); Miyoshi és munkatársai: J. Virol. 72 (10), 8150-7 (1998); Dull és munkatársai: J. Virol. 72 (11), 8463-71; és Kául és munkatársai: Virology 249 (1), 167-74 (1998)]. Bemutatták humán limfociták és CD34+ sejtek HÍV vektorok általi hatékony transzdukcióját [Douglas és munkatársai: Hum. Gene Ther. 10 (6). 935-45 (1999); Miyoshi és munkatársai: Science 283 (5402), 682-6 (199)]. Leírták nem osztódó humánsejtek hatékony transzdukcióját macska immunhiány vírus [feline immunodeficiency virus (FIV)] lentivírus vektor réven, amely a lehető legkisebbre csökkenti a biztonsági aggodalmakat, amelyek a HÍV alapú vektorok alkalmazásánál fennállnak [Poeschla és munkatársai: Nature Medicine 4 (3), 354-357 (1998)]. Kimutatták humán vér mononukleáris sejtek eredményes fertőzését FIV vektorok révén [Johnston és munkatársai: J. Virol. 73 (3), 2491-8 (1999)].

Mivel sok vírus vektort nehéz kezelni és kapacitásuk beiktatott DNS-ekhez korlátozott, ezeknek, a korlátozásoknak és hátrányoknak a kiküszöbölésére törekednek. így például egyszerűsített vírus csomagoló vonalakon túl kifejlesztették a human Herpes simplex vírusból, 1. típusú Herpes simplex vírusból (HSV-1), és az Epstein-Barr vírusból (EBV) származó Mini-vírus vektorokat, hogy egyszerűsítsék a genetikai anyagok manipulálását és vírus vektorok kialakítását [Wang és munkatársai: J. Virology 70 (12), 8422-8430 (1996)]. Adaptor plazmidokról korábban kimutatták, hogy egyszerűsítik az idegen DNS beiktatását segítő-független (helper-independent) retrovirus vektorokba [ J. Virology 61 (10), 3004-3012 (1987)].

A vírus vektorok nem az egyedüli eszközök a génterápia kivitelezésére, mivel számos nem-vírus vektort is írtak le. Egy célzott nem-vírus gén átadó vektorról, amely a hám növekedési faktor/DNS poliplex [Epidermal Growth Factor/DNA polyplex (EGF/DNA)] alkalmazásán alapul, kimutatták, hogy hatékony és fajlagos gén átadást eredményez [Cristiano: Anticancer Res. 18, 3241-3246 (1998)]. Az érrendszer és a központi idegrendszer génterápiáját is bemutatták kationos liposzómákat alkalmazva [Yang és munkatársai: J. Neurotrauma 14 (5), 281-97 (1997)]. A hasnyálmirigy gyulladás átmeneti génterápiáját is elvégezték kationos liposzómák alkalmazásával [Denham és munkatársai: Ann. Surg. 227 (6), 812-20 (1999)]. Egy kitozán-alapú vektor / DNS komplexről kimutatták, hogy hatékony a gén átadáshoz [Erbacher és munkatársai: Pharm. Rés. 15 (9), 1332-9 (1998)]. Leírtak egy terplex rendszeren alapuló nem-vírus DNS átadó vektort [Kim és munkatársai: 55 (1-3), 175-82 (1998)].

Vírusrészecskékkel bevont liposzóma komplexeket is alkalmaztak génátvitelhez [Hirai és munkatársai: Biochem. Biophys. Rés. Commun. 241 (1), 112-8 (1997)].

Bemutattak rák génterápiát timidin kinázt kódoló nem vírus T7 vektor közvetlen tumor injekcióival [Chen és munkatársai: Human Gene Therapy 9, 729-736 (1998)]. A plazmid DNS előállítás fontos a közvetlen injektálási génátvitelhez [Horn és munkatársai: Hum. Gene Ther. 6 (5), 656-73 (1995)]. Módosított plazmid vektorokat adaptáltak speciálisan közvetlen injekcióhoz [Hartikka és munkatársai: Hum. Gene Ther. 7_(10), 1205-17 (1996)].

így tehát a szakterületen génátviteli/génterápiás vektorok és konstrukciók széles választéka ismert. Ezek a vektorok könnyen adaptálhatók a találmány eljárásában való alkalmazáshoz. A megfelelő manipulációkkal, rekombináns DNS / molekulárbiológiai technikákat alkalmazva egy működőképesen kapcsolt Src (akár aktív, akár inaktív) beiktatásához a kiválasztott expressziós /átadó vektorba sok ekvivalens vektor alakítható ki a találmány gyakorlati kivitelezéséhez.

E, Eljárások angiogenezis módosítására

A találmány eljárást nyújt angiogenezis módosítására valamely betegségi folyamattal vagy állapottal társuló szövetben, ahol ez a módosítás hatással van a szövetben történő olyan eseményekre, amelyek az angiogenezistől függnek. Az eljárás általában magában foglalja egy kompozíció hozzáadását a betegségi folyamattal vagy állapottal társuló szövethez, amely kompozíció tartalmazza egy Src fehérje, vagy egy aktív vagy inaktív Src-t expresszáló nukleinsav vektor angiogenezist módosító mennyiségét.

Amint itt leírjuk, bármely szövetfajta vagy szerv, amely organizált szövetekből áll, támogathatja az angiogenezist betegségi állapotokban, ahol a szövet vagy szerv lehet bőr, izom, bél, kötőszövet, ízület, csont és hasonló szövetek, amelyekbe véredények tudnak beözönleni angiogén ösztönzésre.

A találmány szerint kezelt betegek a legtöbb kiviteli módban előnyösen emberi betegek, bár meg kell érteni, hogy a találmány elvi megoldása azt jelzi: ez a találmány hatékony minden emlősnél, így szándékunk szerint ezek is benne foglaltatnak a beteg fogalmába. Ezzel összefüggésben emlősön bármely emlős fajt értünk, amelyben angiogenezist érintő betegségekkel társult szövetek kezelése kívánatos lehet, különösen mezőgazdasági vagy házi emlősök lehetnek érintettek.

így az eljárás abból áll a találmány kivitelezése szempontjából, hogy egy betegnek beadjuk egy Src fehérjét vagy egy Src fehérjét expresszáló DNS vektort tartalmazó, fiziológiailag elviselhető kompozíció gyógyászatilag hatásos mennyiségét.

Az Src fehérje beadásánál a dózistartomány függ a fehérje formájától és hatékonyságától, amint ezt a továbbiakban leírjuk. Az adag mennyiségének elég nagynak kell lenni ahhoz, hogy kialakítsa azt a hatást, amelyben az angiogenezis és az angiogenezis által közvetített betegségi tünetek enyhülnek. Az adagnak azonban nem szabad olyan nagynak lenni, hogy káros mellékhatásokat okozzon, például hiperviszkozitási szindrómákat, tüdőödémát, szívszélhűdést és hasonlókat. A dózis általában változhat a beteg korával, állapotával, nemével és a betegség mértékével a betegben, és ezt az, aki a szakterületen jártas, könnyen meg tudja határozni. Az adagolást az egyes orvosok képesek beállítani bármely komplikáció esetén is.

Egy gyógyászati lag hatékony mennyiség az Src fehérje vagy az (aktív vagy inaktív) Src fehérjét kódoló nukleinsav olyan mennyisége, amely elegendő az angiogenezis kimutatható módosítására a kezelendő szövetben, vagyis ez egy angiogenezismódosító mennyiség. Az angiogenezis módosulását CAM vizsgálattal mérhetjük, mint ezt a későbbiekben leírjuk, de szóba jöhet bármely más, a szakterületen jártas személyek számára ismert eljárás is.

Az Src fehérjét vagy az Src fehérjét expresszáló nukleinsav vektort bevezethetjük parenterálisan injekcióval vagy fokozatos infúzióval megfelelő időn át. Bár a kezelendő szövet a testben általában szisztémás beadással elérhető, és ezért leggyakrabban a gyógyászati kompozíciók intravénás beadásával kezelünk, más szöveti és átadási eszközök is szóba jönnek. így a találmány szerinti kompozíciók bevezethetők intravénásán, intraperitonálisan, intramuszkulárisan, szubkután, testüregekbe, transzdermálisan, és szolgáltatható perisztaltikus eszközökkel is.

Egy Src fehérjét vagy Src fehérjét expresszáló nukleinsav vektort kényelmesen bevezethetünk intravénásán, például egy egységdózis injekciójával. Az egységdózis kifejezés, ahogyan azt használjuk találmány szerinti terápiás kompozíciókra utalva, fizikailag elkülönült egységeket jelent, amelyek alkalmasak egyedi dózisként valamely beteghez; minden dózis aktív anyag előre meghatározott mennyiségét tartalmazza, amely mennyiséget úgy kalkuláljuk, hogy a dózis a szükséges hígítókkal, vagyis hordozókkal vagy töltőanyagokkal együtt a kívánt gyógyászati hatást fejtse ki.

Az egyik előnyös kiviteli módban a reagenst egyszeri adagolással adjuk be intravénásán. A lokalizált beadást végre lehet hajtani közvetlen injekcióval vagy igénybe véve az anatómiailag izolált szakaszok előnyeit, izolálva a célszerv rendszerének mikrocirkulációját, reperfúziót végezve egy keringő rendszerben, vagy a megbetegedett szövetekkel társult érrendszer célterületeinek katéter-alapú ideiglenes eldugulását idézve elő.

A kompozíciókat olyan módon adjuk be, hogy illeszkedjék a dózis kiszereléshez, és gyógyászatilag hatékony mennyiségben. A beadandó mennyiség és időtartam függ a kezelendő egyedtöl, az egyed rendszerének kapacitásától az aktív alkotórész hasznosítására, és a kívánt terápiás hatás mértékétől. A beadandó, igényelt aktív alkotórész pontos mennyisége függ a gyakorló orvos megítélésétől és jellemző minden egyedre. A megfelelő adagolási tartományokat azonban a szisztémás alkalmazáshoz itt leírjuk, ez azonban függ a beadás útjától. A beadáshoz az alkalmas adagolási rend szintén változó, de tipikusan egy kiindulási beadást ismételt dózisok követnek egy vagy több órás időközökkel egymást követő injekciókkal vagy a beadás más útjaival. Egy másik eljárás szerint folyamatos intravénás infúzió is bevezethető, amely alkalmas a vérben olyan koncentrációkat fenntartani, amely az in vivo terápiás tartományba esik.

1. Az angiogenezis gátlása

Az angiogenezis gátlása fontos sokféle betegségben, ezeket angiogén betegségeknek nevezik. Az ilyen betegségek között találjuk - a korlátozás szándéka nélkül - a gyulladásos betegségeket, mint az immun- és nem-immun gyulladásokat, krónikus izületi reumát és pszoriázist, a véredények alkalmatlan vagy oda nem illő behatolásával társult rendellenességeket, mint a diabeteszes retinopátiát, neovaszkuláris glaukómát, resztenózist, kapilláris burjánzást ateroszklerotikus foltokon és csontritkulást, továbbá rákkal társult rendellenességeket, például szilárd tumorokat, szilárd tumor áttételeket, angiofibrómákat, hemangiomát, retrolentális fibropláziát, Kaposi szarkómát és hasonló rákokat, amelyek neovaszkularizációt (vagyis új érrendszer képzést) igényelnek a tumor növekedésének támogatására.

így azok az eljárások, amelyek gátolják az angiogenezist egy ilyen betegséggel társult szövetben, könnyítik a betegség tüneteit és a betegségtől függően hozzájárulhatnak a betegség gyógyításához. Az egyik kiviteli módban a találmány az angiogenezis gátlásával kíván foglalkozni önmagában egy betegségi állapottal társuló szövetben. Az angiogenezis mértékét egy szövetben, és ennek megfelelően a jelen eljárással elért gátlás mértékét sokféle eljárással értékelhetjük.

így vonatkozó kiviteli módban a kezelendő szövet egy gyulladt szövet, és a gátlandó angiogenezis gyulladt szövet angiogenezis, ahol gyulladt szövet neovaszkularizációjáról van szó. Ebben az osztályban az eljárás angiogenezis gátását célozza izületi gyulladásos szövetekben, például krónikus reumában szenvedő betegekben, immun- és nem-immun gyulladt szövetekben, pszoriázisos szövetekben és hasonlókban.

Egy másik vonatkozó kiviteli módban a kezelendő szövet egy retina betegségben, például retinopátiában, pigment degenerációban vagy neovaszkuláris glaukómában szenvedő beteg retina szövete, és a gátlandó angiogenezis retina szövet angiogenezis, ahol retina szövet neovaszkularizációjáról van szó.

Egy további vonatkozó kiviteli módban a kezelendő szövet szilárd tumorban, áttételben, bőrrákban, mellrákban, hemangiómában vagy angiofibrómában és hasonló rákban szenvedő beteg tumorszövete, és a gátlandó angiogenezis tumor szöveti angiogenezis, ahol tumor szövet neovaszkularizációjáról van szó. A jelen eljárások szerint kezelhető tipikus szilárd tumor szövetek közt találjuk a tüdő, hasnyálmirigy, mell, végbél, nyelőcső, petefészek és hasonló szövetek tumorjait. A tumor szöveti angiogenezis gátlása különösen előnyös kiviteli mód a miatt a fontos szerep miatt, amelyet a neovaszkularizáció játszik a tumor növekedésben. A tumorszövet neovaszkularizációjának hiányában a tumorszövet nem kapja meg a szükséges tápanyagokat, növekedése lelassul, megszakad a további növekedés, visszafejlődik, végül elhal, a tumor pusztulását eredményezve.

Más szavakkal megfogalmazva a jelen találmány eljárást nyújt tumor neovaszkularizáció gátlására gátolva a tumor angiogenezist a jelen eljárás szerint. A találmány hasonlóképpen eljárást nyújt tumor növekedés gátlására az angiogenezis-gátló eljárások gyakorlati alkalmazásával.

Az eljárások különösen hatékonyak áttételek kialakulása ellen, mert (1) kialakulásuk egy primer tumor vaszkularizációját igényli, hogy az áttételes (metasztatikus) ráksejtek elhagyhassák a primer tumort; és (2) ezek létrejötte egy másodlagos helyen neovaszkularizációt igényel az áttételek növekedésének támogatására.

Egy vonatkozó kiviteli módban a találmány gyakorlatát más terápiákkal együtt visszük végbe, ilyen más terápiák például a szilárd tumorok elleni hagyományos kemoterápiák és az áttételek létrejöttét visszaszorító kemoterápiák. Az angiogenezis inhibitor beadását tipikusan a kemoterápia során vagy után hajtjuk végre, bár előnyösebb az angiogenezist gátolni a kemoterápiás menetrend után akkor, ha a tumor szövet válaszol a toxikus támadásra angiogenezist indukálva, hogy visszanyerje vér és tápanyagok szolgáltatását a tumor szövetbe. Ezen kívül előnyös alkalmazni az angiogenezist gátló eljárásokat sebészeti beavatkozás után, amikor szilárd tumokokat távolítanak el; ez megelőző kezelést jelenthet áttételek ellen.

Olyan mértékben, ahogyan a jelen eljárásokat alkalmazzák tumor neovaszkularizáció gátlására, az eljárások alkalmazhatók tumor szövet növekedés gátlására, tumor áttétel képződés gátlására és kialakult tumorok visszafejlesztésére.

A resztenózis a sima izomsejt [smooth muscle cell (SMC)] vándorlás és burjánzás folyamata a szövetbe perkután transzluminális szív koszorúér angioplasztika helyén, amely akadályozza az angioplasztika sikerét. Az SMC vándorlása és burjánzása a resztenózis során angiogenezises folyamatnak tekinthető, amelyet a jelen eljárások gátolnak. Ennél fogva a találmány megcélozza a resztenózis gátlását is gátolva az angiogenezist a jelen eljárások szerint olyan betegekben, akik angioplasztikai beavatkozáson mentek keresztül. A resztenózis gátlására tipikusan inaktivált tirozin kinázt vezetünk be az angioplasztikai beavatkozás után, mivel a koszorú edény falak ki vannak téve a resztenózis kockázatának tipikusan a mintegy 2. és a mintegy 28. nap között, és még tipikusabb a beavatkozást követő első mintegy 14 napig.

A jelen eljárás angiogenezis gátlására valamely betegségi állapottal társult szövetben, és ennél fogva az angiogenezissel kapcsolatos betegségek kezelésére szolgáló eljárások gyakorlati kivitelezésére magában foglalja egy szövet, amelyben angiogenezis megy végbe vagy ki van téve annak, hogy végbemegy, érintkezésbe hozását olyan kompozícióval, amely egy inaktivált Src fehérje vagy ezt a fehérjét expresszáló vektor gyógyászatilag hatékony mennyiségét tartalmazza.

Az angiogenezis gátlása és a tumor visszafejlődése legkorábban a 7. napon jelentkezik a kiindulási érintkezésbe hozás után a gyógyászati kompozícióval. További vagy meghosszabbított kitevés inaktív Src fehérjének előnyös lehet a 7. nap és a 6. hét között, előnyösen a mintegy 14.-28. nap között.

2. Az angiogenezis gerjesztése (potenciálása)

Azokban az esetekben, amikor kívánatos elősegíteni vagy gerjeszteni angiogenezist, hasznos egy aktív Src fehérje beadása a szövethez. A beadás útja és időbeosztása hasonló azokhoz az eljárásokhoz, amelyeket az előzőekben a gátláshoz leírtunk.

F. Terápiás kompozíciók

A találmány terápiás kompozíciókra is irányul, amelyek az itt leírt gyógyászati eljárások gyakorlati megvalósításához alkalmasak. A találmány szerinti gyógyászati kompozíciók tartalmaznak valamely gyógyászatilag elfogadható hordozót egy Src fehérjével vagy egy Src fehérjét expresszálni képes vektorral együtt, ahogyan itt leírjuk, amelyek aktív hatóanyagként vannak feloldva vagy diszpergálva. Egy előnyös kiviteli formában a terápiás kompozíció nem immunogén, amikor beadjuk valamely emlősbe vagy emberi betegbe gyógyászati célból.

Ahogyan itt használjuk, a gyógyászatilag elfogadható és fiziológiailag elviselhető kifejezések és ezek grammatikai változatai, ahogyan kompozíciókra, hordozókra, hígítókra és reagensekre utalunk, egymást felcserélve alkalmazhatók, és olyan anyagokat képviselnek, amelyeket be lehet adni emlősökbe vagy emlősökre nem kívánt fiziológiai hatások kialakulása nélkül, amilyenek például a hányinger, szédülés, rendezetlen gyomorműködés és hasonlók.

Az olyan gyógyászati kompozíciók, amelyek aktív alkotórészeket tartalmaznak bennük oldva vagy diszpergálva, elkészítése jól ismert a szakterületen és nem szükséges ezt valamilyen konkrét kiszerelésre korlátozni. Az ilyen kompozíciókat tipikusan injektálható vagy folyékony oldatként vagy szuszpenzióként készítjük el, de a kérdés megoldható szilárd kiszereléssel is, amely alkalmas oldathoz vagy szuszpenzióhoz, a folyadékot csak közvetlenül felhasználás előtt hozzáadva. A készítményt lehet emulgeálni is vagy liposzóma kompozícióként forgalomba hozni.

Az aktív alkotórészt összekeverhetjük töltő- és kötőanyagokkal, amelyek gyógyászatilag elfogadhatók és összeférhetök az aktív alkotórésszel, olyan mennyiségben, amely alkalmas az itt leírt gyógyászati eljárásokban való felhasználáshoz. A megfelelő töltöés kötőanyagok például a víz, fiziológiás konyhasóoldat, glükóz, glicerin, etanol és hasonlók, továbbá mindezek kombinációi. Ezen kívül ha szükséges, a kompozíció tartalmazhat kis mennyiségben kiegészítő anyagokat is, például nedvesítő vagy emulgeáló szereket, pH pufferoló szereket és hasonlókat, amelyek fokozzák az aktív alkotórész hatékonyságát.

A találmány szerinti kompozíció magába foglalhatja bármely sóképző alkotórész gyógyászatilag elfogadható sóit. A gyógyászatilag elfogadható sók között találhatók savaddiciós sók (amelyek a polipeptid szabad aminosavaival képződnek); ezek kialakulhatnak szervetlen savakkal, amilyenek például sósav vagy foszforsav, vagy szerves savakkal, amilyenek például az ecetsav, borkősav, mandulasav és hasonlók. A szabad karboxicsoportokkal képződő sók szintén származhatnak mind szervetlen bázisokból, például nátrium-, kálium-, ammonium-, kalcium- vagy vashidroxidokból, mind szerves bázisokból, például izopropil-aminból, trimetil-aminból, 2-etil-amino-etanolból, hisztidinböl, prokainból és hasonlókból.

Fiziológiailag elviselhető hordozók az aktív alkotórészekhez jól ismertek a szakterületen. A folyékony hordozókra példák lehetnek a steril vizes oldatok, amelyek az aktív alkotórészeken és vizen kívül más anyagot nem tartalmaznak, de olyanok is, amelyek tartalmaznak valamely puffért, mint nátrium-foszfátot fiziológiás pH értéken, vagy fiziológiás konyhasóoldatot, vagy mindkettőt, ilyen például a foszfáttal pufferolt fiziológiás konyhasóoldat. A vizes hordozók tartalmazhatnak továbbá egynél több pufferoló sót, valamint további sókat, mint nátrium- és kálium-kloridot, továbbá glükózt, polietilén-glikolt és más oldott anyagokat.

A folyékony kompozíciók tartalmazhatnak a vízen kívül más folyékony fázisokat is, vagy ki is zárható belőlük a víz. Az ilyen további vizes fázisokra példák lehetnek a glicerin, étkezési olajok, mint a gyapotmagolaj, de szerepelhetnek itt víz-olaj emulziók is.

Egy sor gyógyászati kompozíció tartalmazza a találmány szerinti Src fehérje angiogenezist módosító mennyiségét, vagy megfelelő rekombináns DNS expresszáló vektor olyan mennyiségét, amely Src fehérje hatékony mennyiségét expresszálja; ez általában úgy van kiszerelve, hogy az Src fehérje mennyisége legalább 0,1 tömeg %-a legyen a teljes gyógyászati kompozíció tömegének. A tömeg % az Src fehérje tömegének aránya a teljes kompozíció tömegéhez, így például 0,1 tömeg % 0,1 gramm Src fehérjét jelent 100 gramm teljes kompozícióban. A DNS expressziós vektoroknál a bevezetett mennyiség függ az expressziós vektor tulajdonságaitól, a kezelendő szövettől, és hasonló megfontolásoktól.

G. Kiszerelés

A találmány vonatkozik olyan kiszerelésre, amely egy jelöléssel ellátott tároló eszköz valamely találmány szerinti Src fehérje szolgáltatására. Egy kiszerelés áll valamely csomagolóanyagból, megfelelő jelöléssel ellátva a kezelendő betegségi állapothoz, továbbá valamely gyógyászati szerből a csomagolóanyagon belül.

A gyógyászati szer egy kiszerelésben bármely találmány szerinti kompozíció, amely alkalmas Src fehérje szolgáltatására és gyógyászatilag elfogadható formában van kialakítva, ahogyan ez az adott indikációhoz alkalmas. így a kompozíció tartalmazhat Src fehérjét vagy olyan DNS molekulát, amely képes Src fehérjét expresszálni. A kiszerelés olyan mennyiségű gyógyászati szert tartalmaz, amely alkalmas valamely itt megadott állapot kezelésében való felhasználáshoz, akár egyszeres, akár többszörös dózisban.

A csomagolóanyag tartalmaz valamely jelölést, amely jelzi a csomagolóanyagon belül található gyógyászati szer alkalmazási lehetőségeit például olyan állapotok kezelésére, amelyek befolyásolhatók angiogenezis és hasonló, itt leírt állapotok gátlásával vagy gerjesztésével. A jelölés továbbá útmutatásokat foglal magában a használatról, és további információkat, amelyek szükségesek lehetnek a piaci forgalomban. A csomagolóanyagok közé tartoznak a tartályok is a gyógyhatású szerek tárolására.

Ahogyan itt használjuk, a csomagolóanyag kifejezés olyan anyagokra utal, mint az üveg, műanyag, papír, fóliák és hasonlók, amelyek képesek rögzített módon magukban foglalni valamely gyógyászati szert. így például a csomagolóanyag lehet műanyag vagy üveg ampulla, laminált göngyöleg és hasonló tároló eszköz, amely a gyógyászati szert magában foglaló gyógyászati kompozíció tárolására használható.

Egy előnyös kiviteli formában a csomagolóanyag olyan jelölést tartalmaz, amely kitapintható nyomtatású; ez leírja a gyártott készítmény tartalmát és a benne található gyógyászati szer alkalmazását.

Kiviteli példák

Az alábbi, a találmányra vonatkozó kiviteli példák csak a bemutatás célját szolgálják és természetesen nem arra vannak szánva, hogy bármilyen módon korlátozzák a találmány oltalmi körét. A találmány különböző változatai, amelyek most ismertek vagy később lesznek kifejlesztve, és amelyek azoknak, akik a szakterületen jártasak, a látókörén belül vannak, úgy tekinthetők, hogy a találmány későbbiekben leírt igénypontjainak oltalmi körén belül vannak.

1, c-Src exoressziós konstrukciók előállítása

Az olyan expressziós konstrukciók elkészítéséhez, amelyek alkalmasak angiogenezis módosítására a találmány szerinti eljárásokkal, c-Src cDNS-t manipulálunk és beiktatjuk valamely expressziós konstrukcióba / vektorba.

A vad típusú (vagyis endogén) csirke c-Src-t kódoló cDNS szekvenciát az 1. ábrában mutatjuk be (SEQ ID NO: 2), a kódolt aminosavgyök szekvenciát pedig a 2. ábrában mutatjuk be (SEQ ID NO: 3). A kódolt fehérje szekvencia a cDNS 112.-1713. helyek közti nukleotidjaiból transzlatálódik. A humán c-Src cDNS nukleinsav szekvenciájának megfelelő nukleinsav szekvenciát (SEQ ID NO: 4) és a kódolt aminosavgyök szekvenciát (SEQ ID NO: 5) a

3. ábrában illetve a 4. ábrában mutatjuk be. A humán fehérje szekvenciánál a kódoló szekvencia a cDNS 134. nukleotid helyénél kezdődik és az 1486. nukleotid helyénél fejeződik be.

Vad típusú, valamint sokféle mutált c-Src cDNS-t készítünk el. Mutált c-Src konstrukciókat készítünk helyre irányuló mutagenezissel, ahogyan ezt Kaplan és munkatársi leírják [EMBO J. 13, 4745-4756 (1994)]. Mutált c-Src fehérjéket kódoló mutált cSrc konstrukciókat írnak le a találmány szerinti eljárásokban való felhasználáshoz Kaplan és munkatársai az előzőekben jelzett közleményükben. Kaplan és munkatársai leírnak különböző mutált c-Src konstrukciókat és kódolt fehérjéket, amelyek hasznosak a jelen találmány gyakorlati megvalósításában. így például Kaplan és munkatársai csirke c-Src allélek számos terméket ábrázolják az 1. ábrában, ide értve az Src A-t és az Src 251-et.

A c-Src működésének két kategóriáját írjuk le angiogenezis módosítására. Amint az előzőekben tárgyaltuk, az egyik kategória olyan Src molekulákat tartalmaz, amelyek fokozzák az angiogenezist és így aktív fehérjéknek tekinthetők. A vad típusú Src-ről és különböző mutációiról bemutatjuk a találmányban, hogy angiogenezist indukálnak. A vad típusú c-Src egyik előnyös mutációja (ahol az előnyös kifejezés ebben az összefüggésben azt jelenti, hogy képes véredény növekedést indukálni és ezáltal a tumor tömegét in vivo növelni) a Src A mutáns, amelynek pontmutációja van az 527. helyen levő aminosavgyöknél (aa), az 527. tirozint fenil-alaninra változtatva. Ez a hely normális esetben a c-Src kináz, amelyre CSK-ként is utalunk, negatív szabályozásának helye. Amikor a CSK foszforilezi az 527. aminosavat a vad típusú • · ·· · · ·

......... ~ * ··:·

Src-ben, a fehérje inaktiválódik. A mutált Src A-ban azonban a szabályozó tirozin át van alakítva fenil-alaninná, így alakítva át a fehérjét konstitutíven (vagyis állandóan) aktív fehérjére, amely már nem tárgya a foszforilezéssel történő inaktiválásnak.

Bizonyos mutációkról az Src-ben azt is kimutatták, hogy ellenkező irányú módosító hatásuk van az angiogenezisre, gátolva az angiogenezist és nem stimulálva azt. Az ilyen mutációkra úgy utalunk, mint inaktív Src mutációkra. Az olyan mutációval bíró fehérjékre, amelyek átadják ezt a gátló aktivitást, úgy is utalunk, mint domináns-negatív Src fehérjékre, amennyiben ezek gátolják a neovaszkularizációt, ebbe a fogalomba értve mind az Src endogén aktivitásából eredő, mind a növekedési faktor stimulálása révén fokozott Src aktivitásból eredő neovaszkularizációt. így a vad típusú c-Src bizonyos találmány szerinti mutációi működhetnek dominánsnegatívként azon képességükre tekintettel, hogy blokkolják a véredény növekedést és ezáltal például csökkentik a tumor tömegét in vivo.

Az ilyen előnyös inhibitor (gátló) c-Src fehérjék közt található az Src 251, amelyben az Src-nek csak az első 251 aminosava expresszálódik. Ebből a konstrukcióból hiányzik a teljes kináz dómén s ezért erre úgy utalunk, mint kináz-pusztult Src fehérjére. Egy második konstrukció az Src (K295M) mutáció, amelyben a 295. helyen levő lizin aminosavgyök metioninra van mutálva. Ez a pontmutáció a kináz doménben megakadályozza az ATP kötést és így blokkolja a kináz-függö Src funkciókat, amelyek a vaszkuláris sejt és tumorsejt jeladásával és burjánzásával kapcsolatosak.

így például egy mutáció esetében az 527. helyen, amennyiben a létrejövő mutált aminosavgyök nem tirozin, szerin vagy treonin, a találmány szerint a megváltozott aminosav jelenléte a nevezett helyen olyan Src fehérjét eredményez, amely egy kívánt aktív, angiogenezist elősegítő módosító aktivitással bír.

A pontmutációkat tekintve bármely mutáció, amely a kívánt gátló vagy stimuláló aktivitást eredményezi, szóba jön a találmányban való alkalmazásra. Szóba jönnek fúziós fehérje konstrukciók is, kombinálva a kívánt Src fehérjét (mutánsát vagy fragmentumát) expresszált aminosav toldatokkal (tag), antigén epitópokkal, fluoreszcens fehérjékkel vagy más fehérjékkel vagy peptidekkel; a kombináció akkor lehetséges, ha az Src fehérje kívánt módosító hatása épen marad.

szekvencialistában, és a konstrukció restrikciós térképe a 10. ábrában van bemutatva, ott RCAS hivatkozással.

Az eredeti Src 251 konstrukciót Dr.Schwartzberg Pam alklónozta a NIH-nél (National Institute of Health), Dr.Varmus Harold laboratóriumában. Röviden ismertetve egy Src cDNS szekvencia klónozását expressziójához úgy hajtjuk végre, hogy beiktatunk egy Notl-BstBI-Notl restrikciós helyeket tartalmazó kapcsolót (linkért) egy egyedi Notl helybe az Src 251 5' végénél. Az Src-nek van egy egyedi Clal helye 3' végénél. Az Src 251 emésztése BstBI-gyel és Clal-gyel egy BstBI-Clal fragmentumot alakít ki, amelyet azután az RCASBP(A)-n levő Clal helybe ligálunk. Egy BstBI túlnyúlás lehetővé teszi a ligálást egy Clal túlnyúlással, amely nem hasad újból Clal-gyel. A találmány gyakorlati kivitelezésében való felhasználásra alkalmas Src konstrukciót könnyen megkapjuk a fenti vektorban, először emésztve az Src 251-et tartalmazó RCAS vektort Notl-gyel és Clal-gyel (DAM+ háttérben), hogy lehetővé váljék egy hasonlóképpen emésztett Src cDNS beiktatása. Ennél fogva ezt az Src 251-et tartalmazó kiindulási RCASBP(A) konstrukciót tovább használjuk minden más Src konstrukció, amelyet az előzőekben leírtunk és amelyet Kaplan és munkatársai leírtak [The EMBO J.: 13 (20), 4745-4751 (1994)], alklónozására RCASBP(A)-ba az Src 251 konstrukció által kialakított Notl-Clal fragmentum révén. Abból a célból, hogy a kívánt c-Src mutációkat alakítsuk ki a cDNS-ben, standard helyre irányul mutagenezises munkameneteket hasznosítunk, amelyek ismeretesek azok számára, akik a szakterületen járatosak. A kívánt mutációk befogadására tervezett PCR primereket is alkotunk meg olyan restrikciós helyekkel, amelyek megkönnyítik az ez után következő klónozási lépéseket. Src-kódoló nukleinsav szekvenciák teljes szegmenseit iktatjuk ki a nukleinsav konstrukciókból PCR amplifikációs technikák révén, amelyek csirke, humán és hasonló Src homológok ismert cDNS szekvenciáin alapulnak, így alakítva ki ezt követően új konstrukciókat.

A találmány egyik kiviteli módjában az Src nukleinsavak amplifikálásához alkalmazott 3' PCR primer egy keretben levő szekvenciát is kódol. Az ilyen primer alkalmazása egy 9E10-myc epitóp toldatot ad az ezt követő Src konstrukció karboxi terminálisához.

A következő aminosavakat adjuk az Src 251. aminosava után, hogy 9E10-myc epitóp toldatot [VDMEQKLIAEEDLN (SEQ ID NO: 6)] tartalmazó vektor konstrukciókat alakítsunk ki. Két külön PCR-t hajtunk végre minden egyes konstrukcióhoz és hasonló eredményeket kapunk. Minden, PCR-rel megalkotott mutáns konstrukciót szekvencia elemzésnek is alávetünk PCR-rel, hogy igazoljuk a kiónok megjósolt DNS szekvenciáját. Vad típusú és mutált Src cDNS-ek állnak rendelkezésre az Upstate Biotech Laboratoriesnél is (Lake Placid, New York, Amerikai Egyesült Államok) a jelen találmány szerinti expressziós rendszerekben való felhasználásra; ez a cég forgalomba hoz avian, valamint humán Src-t, és számos kináz-pusztult és aktivált-mutált formát.

Alternatív expressziós vektorok a találmány szerinti Src fehérjék expresszálásában való felhasználáshoz magukban foglalnak adenovirus vektorokat is, amelyek le vannak írva a 4,797,368;

5,173,414; 5,436,146; 5,589,377 és 5,670,478 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmakban. Alternatív eljárások az Src módosító fehérjék szolgáltatásához magukban foglalják az Src cDNS szolgáltatását valamely nem-vírus vektor rendszerrel, ahogyan ez le van írva az 5,675,954 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalomban, valamint magának a cDNSnek, mint puszta DNS-nek szolgáltatását, amint ez le van írva az 5,559,466 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalomban. Az ilyen találmány szerinti konstrukciók szolgáltatása nem csak egy vírus vektor helyi alkalmazására vonatkozik, ahogyan ez le van írva a későbbiekben a CAM vizsgáló rendszerben. így például vírus vektor készítmények intravénásán is injektálhatok szisztémás szolgáltatáshoz az érpályákba. Ezek a vektorok becélozhatok a megnövekedett neovaszkularizáció helyeibe is például egy tumor lokalizált injektálásával.

In vitro expresszált fehérjék szolgáltatása szintén szóba jöhet a kiválasztott Src fehérje expresszióját és tisztítását követően fehérjék vagy polipeptidek szállításához alkalmas eljárásokkal. Az egyik ilyen eljárás magában foglal liposzóma szolgáltató rendszereket, ahogyan ez le van írva a 4,356,167; 5,580,575; 5,542,935 és 5,643,599 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmakban. További vektor és fehérje szolgáltató rendszerek és jól ismertek azok számára, akik a szakterületen jártasak, a találmány szerinti Src fehérjék expressziójában és/vagy szolgáltatásában való alkalmazáshoz.

2. Kezeletlen csirke embrió korioallantoin membránok [Chorioallantoic Membrane (CAMtl jellemzése

A. A CAM készítése

Angiogenezist indukálhatunk csirke embrió korioallantoin membránban (CAM), miután a normális embrionális angiogenezis érett véredények kialakulását eredményezte. Az angiogenezisröl kimutatták, hogy indukálható speciális citokinekre vagy tumor fragmentumokra adott válaszként, amint ezt Leibovich és munkatársai [Nature 329, 630 (1987)] és Ansprunk és munkatársai [Am. J. Pathol. 79, 597 (1975)] leírták. CAM-okat állítunk elő csirke embriókból az angiogenezis ezt követő indukciójához és gátlásához. Tíz napos csirke embriókat szerzünk be a McIntyre Poultry cégtől [Lakeside, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok] és ezeket 37°C hőmérsékleten inkubáljuk 60 % nedvesség mellett. Kis lyukat készítünk a héjon keresztül a tojás végénél közvetlenül a légzsák felett egy kis kézi fúró (Dremel, az Emerson Electric Co. részlege, Racine, Wisconsin, Amerikai Egyesült Államok) alkalmazásával. Egy második lyukat is fúrunk a tojás szélesebb oldalán olyan területben, amely mentes az embrionális véredényektöl, ahogyan ezt előzőleg a tojás lámpázásával megállapítjuk. Negatív nyomást alkalmazunk az eredeti lyukhoz, ami azt eredményezi, hogy a CAM (korioallantoin membrán) elválik a héj membrántól és egy hamis légzsákot alkot a CAM fölött. Egy 1,0 centiméter (cm) x 1,0 cm méretű négyszögletes ablakot hasítunk ki a héjon keresztül a leereszkedett CAM fölé egy kis modell csiszoló kerék (Dremel) alkalmazásával. A kis ablak lehetővé teszi a közvetlen hozzáférést az alatta fekvő CAM-hoz.

A létrejövő CAM készítményt azután vagy az embriogenezis 6. napján alkalmazzuk, egy olyan stádiumnál, amelyet aktív neovaszkularizáció jellemez, további kezelés nélkül a CAM-hoz; ez tükrözi azt a modellt, amelyet az embrionális neovaszkularizációra való hatás értékelésére alkalmazunk;

vagy az embriogenezis 10. napján alkalmazzuk, amikor az angiogenezis alábbhagy. Ez utóbbi készítményt így ebben a találmányban felújított angiogenezis indukálására alkalmazzuk válaszként citokin kezelésre vagy tumorral való érintkezésre, ahogyan a későbbiekben leírjuk.

3. CAM angiogenezis vizsgálatok

A. Növekedési faktorokkal indukált angiogenezis

Az angiogenezisről kimutatták, hogy indukálható citokinekkel vagy növekedési faktorokkal.

Angiogenezist indukálunk ráhelyezve egy 5 milliméter (mm) x 5 mm-es Whatman szűrőpapír darabot (Whatman No.1. szűrőpapír), amely telítve van Hank féle kiegyensúlyozott sóoldattal [Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), GIBCO, Grand Island, New York. Amerikai Egyesült Államok], vagy 2 mikrogramm/milliliter (pg/ml) rekombináns bázisos fibroblaszt növekedési faktort [basic fibroblast growth factor (bFGF)] vagy vaszkuláris hámsejt növekedési faktort [vascular endothelial cell growth factor (VEGF) (Genzyme, Cambridge, Massachussets, Amerikai Egyesült Államok) tartalmazó HBSS-sel, egy 9 vagy 10 napos csirke embrió CAM-jára olyan területen, amely mentes a véredényektől, és az ablakokat ezután leragasztjuk ragasztóanyaggal. Növekedési faktorok más koncentrációi is hatékonyak a véredények növekedésének indukálására. Azoknál a vizsgálatoknál, ahol az angiogenezis gátlását antagonisták intravénás injekcióival értékeljük, az angiogenezist először 1-2 pg/ml bFGF-tel vagy VEGF-tel indukáljuk fibroblaszt növesztő közegben. Az angiogenezist mikroszkópos fényképezéssel követjük 72 óra múlva.

B. Embrionális angiogenezis

A CAM készítmény az angiogenezis inhibitorok hatásának értékeléséhez az embrionális új érrendszer természetes kialakulására a 6 napos embrionális csirke embrió, ahogyan az előzőekben leírtuk. A fejlődésnek ebben a stádiumában a véredények de novo növekedésen mennek keresztül és így alkalmas rendszert nyújtanak a találmány szerinti Src fehérjék által előidézett angiogenezis módosítás értékeléséhez. A CAM rendszert úgy készítjük el, ahogyan az előzőekben leírtuk, azzal a kivétellel, hogy a vizsgálatot a 6. embrionális napon végezzük el a 9. vagy 10. nap helyett.

4, Az angiogenezis módosulása, ahogyan a CAM vizsgálattal mérjük

Abból a célból, hogy felbecsüljük az Src fehérjék hatását az angiogenezisre, az alábbi vizsgálatokat hajtjuk végre 10 napos csirkeembrió CAM készítményeken. 5 pg, az 1. példa szerint előállított RCAS konstrukciót átfertőzünk immortalizált (halhatatlanná tett) csirke DF-1 fibroblaszt vonalba (Foster Doug ajándéka, University of Minnesota). Ez a sejtvonal, valamint a primer csirkeembrió fibroblasztok képesek vírust produkálni, a DF-1 sejtvonal azonban magasabb titereket produkál. Vírus felülúszókat gyűjtünk összefolyást még el nem ért DF-1 termelő sejtvonalakból szérummentes CLM tápközegben (összetétel: F-10 tápközeg alap, kiegészítve DMSO-val, fólsavval, glutaminsavval és MÉM vitaminoldattal). 35 ml vírus felülúszót koncentrálunk ultracehtrifugálással 4°C hőmérsékleten 2 órán át 22000 fordulat/perccel. Ezeket a koncentrált vírus üledékeket újra szuszpendáljuk az eredeti térfogat századrészével szérummentes CLM tápközegben, ebből alikvotokat készítünk és - 80°C hőmérsékleten tároljuk. A titert egy olyan kontroll vírus vektor sorozathígításával becsüljük meg, amely zöld fluoreszcens fehérjét [green fluorescent protein (GFP)] kódoló nukleotid szekvenciával bír (erre a későbbiekben RCAS-GFR-ként utalunk), megfertőzve a primer csirke embrió fibroblasztokat, amelyeket 48 - 72 órán át inkubálunk. A vírus törzsoldat, amelyet koncentrálás után kapunk, titerei általában meghaladják a 10⁸IU/ml értéket. A vírus törzsoldatokat alkalmazó CAM vizsgálatokhoz kortizon-acetáttal átitatott, 6 mm átmérőjű Whatman szűrőpapír korongokat készítünk 3 mg/ml kortizon-acetátban 30 percen át 95 %-os etanolban. A korongokat lamináris áramlású fülkében megszárítjuk, majd áztatjuk korongonként 20 μΙ vírus törzsoldattal 10 percen át. Ezeket a korongokat alkalmazzuk 9 vagy 10 napos csirke embriók CAM-jára, majd leragasztjuk cellofán tapasszal és 37°C hőmérsékleten

inkubáljuk 18-24 órán át. Ezután vagy vak PBS-t (foszfáttal pufferolt fiziológiás konyhasóoldat), vagy növekedési faktorokat adunk 5 pg/ml koncentrációban a CAM-hoz a megfelelő vírus törzsoldat 20 μΙ-es térfogatában, mint a vírus egy további emlékeztetőjét a CAM szövethez. 72 óra múlva a CAM-okat kinyerjük és megvizsgáljuk az angiogén index változásaira, ahogyan ezt a korong alatt fekvő CAM-ban levő elágazási pontok mennyiségének kettős vakkal végzett megszámlálásával meghatározzuk. A kináz vizsgálatokhoz a korong alatt fekvő szövetet RIPA-ban kinyerjük, motorizált őrlő berendezéssel homogenizáljuk és Src-vel immun-kicsapásnak vetjük alá ekvivalens mennyiségű teljes fehérjéből, majd in vitro kináz vizsgálatot végzünk szubsztrátumként FAK-GST fúziós fehérjét alkalmazva. Az immunfluoreszcenciás tanulmányokhoz a korong alatt fekvő CAM szöveteket OCT krioprezervatív készítményben lefagyasztjuk, 4 μηη-es metszeteket vágunk, ezeket acetonban 1 percig rögzítjük, 3 %-os normál kecske szérumban 1 órán át inkubáljuk, ezt követi egy inkubálás primer nyúl antifoszforilezett ERK antitesttel, amint ezt korábban leírták [Eliceiri és munkatársai: J. Cell. Bioi. 140, 1255-1263 (1998)], majd a mosás PBS-ben, és a kimutatás fluoreszcens szekunder antitesttel.

A. Endogén Src aktiválása bFGF-fel vagy VEGF-fel

Abból a célból, hogy megbecsüljük a növekedési faktorok hatásait az Src angiogenezist módosító aktivitására, a következő vizsgálatot végezzük el. 10 napos csirke embrió CAM-ok, amelyeket előzőleg bFGF-nek vagy VEGF-nek (2 pg/ml) tettünk ki 2 órán át, szövetkivonatait lizáljuk. Endogén Src-t immunkicsapásnak vetünk alá teljes fehérje ekvivalens mennyiségéből és in vitro immun komplex kináz vizsgálatot végzünk szubsztrátumként FAK-GST fúziós fehérjét alkalmazva, majd elektroforézist végzünk és átvisszük nitrocellulózra.

A vizsgálatok eredményeit az 5. ábrában mutatjuk be, ahol a növekedés az Src aktivitásban nyilvánvaló a gél megnövekedett sűrűségéből akár bFGF, akár VEGF kezeléssel, összehasonlítva a nem kezelt (vak) mintákkal, amelyek az Src aktivitás alapvonalát jelzik a CAM vizsgálatban. Mind a bFGF, mind a VEGF a CAM-ben jelen levő endogén Src aktivitás mintegy kétszeres növekedését eredményezi. A fenti kináz vizsgálati foltot próbázzuk anti-Src antitesttel is, mint ráterhelő kontrollal ekvivalens Src és IgG tartalomhoz.

B. Src A retrovírussal közvetített gén exoressziójának hatása az angiogenezisre csirke embrió CAM-ban

Az alábbi vizsgálatot hajtjuk végre a mutált Src fehérjék angiogenezisre való hatásának becslésére a CAM készítményben. A vizsgálathoz 9 napos csirke embrió CAM-okat teszünk ki RCASSrc A-t vagy RCAS-GFP-t expresszáló retrovírusoknak vagy puffernek 72 órán át követve az előzőekben leírt munkamenetet.

Ennek a vizsgálatnak az eredményeit a 6A. ábrában mutatjuk be, ahol az angiogenezis szintjeit mennyiségileg úgy határozzuk meg, ahogyan az előzőekben leírtuk. Reprezentatív mikrofényképeket (4x) készítünk sztereomikroszkóppal, ezeket a 6B. ábrában mutatjuk be. Az alapvonal endogén Src aktivitás angiogén indexe mintegy 50. Ezzel ellentétben retrovirus vektorral expresszált olyan

RCAS-Src A-val kezelt CAM-ok, amelyek az 527. aminosavgyök helyen pontmutáció következtében tirozin helyett fenil-alanint hordoznak, az angiogenezis fokozását (indukcióját) eredményezik, mintegy 90 angiogén indexszel. Az Src A-val közvetített angiogenezis fokozása nyilvánvaló a 6B. ábrában bemutatott fényképekből is.

C.Az Src A retrovirális expressziója aktiválja a vaszkuláris MAP kínáz foszforilezést

Az Src A hatását a vaszkuláris MAP kináz foszforilezésre a VGEF és PMA növekedési faktorok hatásával összehasonlítva vizsgáljuk az előzőekben leírt és itt leírt munkameneteket követve. VEGF-nek vagy PMA-nak (egy másik mitogén hasonló koncentrációval) 30 percig kitett 10 napos csirke embrió CAM-ok szövetkivonatait összehasonlítjuk azoknak a CAM-oknak, amelyeket Src Aexpresszáló retrovírussal fertőztünk 48 órán át, szövetkivonataival. Az Src-t immun-kicsapásnak vetjük alá ekvivalens mennyiségű teljes fehérje extraktumokból és in vitro immun komplex kináz vizsgálatot végzünk szubsztrátumként FAK-GST fúziós fehérjét alkalmazva, majd elektroforézisnek vetjük alá és átvisszük nitrocellulózra.

Ennek a vizsgálatnak az eredményeit a 7A. ábrában adjuk meg, ahol a kezeletlen CAM-ok (NT) mutatják az alapvonal endogén Src-közvetített vaszkuláris MAP kináz foszforilezést. Mind a VEGF, mind a PMA mintegy kétszeres növekedést eredményez az alapvonalhoz viszonyítva. Ezekkel ellentétben az Src A mintegy 510-szeresére növeli az aktivitást ahhoz viszonyítva, amelyet a kezeletlen minták mutatnak.

A fenti teljes szöveti lizátumok alikvotjait mérjük endogén ERK foszforilezésre is immunfolt képzéssel valamely anti-foszfo-ERK antitesttel, amint ezt a 7B. ábrában bemutatjuk. Ehhez a becsléshez 10 napos CAM-okat fertőzünk vagy vak RCAS-sel, vagy olyan RCAS-sel, amely Src A-t expresszál. Két nap múlva a CAMokat kimetsszük, OCT-ben krioprezerváljuk és 4 pm-es metszeteket készítünk. A metszeteket immunfestésnek vetjük alá antifoszforilezett ERK antitesttel (New England Biolabs), mossuk, majd kimutatjuk kecske-anti-nyúl FITC-vel konjugált másodlagos antitesttel. Fluoreszcens képeket fogunk be hűtött CCD kamerával (Princeton Institute). A mikrofényképek fokozott immunfluoreszcenciát jeleznek az Ser A-val kezelt készítményeknél a vak kontrollal összehasonlítva.

D. Szelektív követelmény az Src aktivitáshoz a VEGF-fel indukált angiogenezis során, amely nem érvényes a bFGF-fel indukált angiogenezisre

Abból a célból, hogy felbecsüljük az Src módosító aktivitásának hatását a növekedési faktorral indukált angiogenezisre, az alábbi vizsgálatokat hajtjuk végre. Kilenc napos csirke embrió CAM-okat teszünk ki olyan retrovirus vektor készítményeknek, amelyek a domináns-negatív Src mutációkat expresszálják; ezekre mint Src 251-re vagy Src K295M-re utalunk, ahogyan az előzőekben leírtuk. CAM-okat kezelünk RCAS-Src 251 vagy kontroll RCAS-GFP retrovírusokkal vagy pufferral 20 órán át, majd további 72 órán át inkubáljuk bFGF vagy VEGF jelenlétében vagy távollétében.

Az angiogenezis szintjét, ahogyan az előzőekben leírtak szerint

mennyiségileg értékeljük, a 8A. ábrában mutatjuk be. A 8B. ábrában bemutatott reprezentatív mikrofényképeket (6x) sztereomikroszkóppal vesszük fel. A 8C. ábra egy foltot mutat be anti-Src antitesttel próbázva, hogy igazoljuk az Src 251 expresszióját transzfektált sejtekben összehasonlítva a vak kezelésekkel.

Az így leírt vizsgálatok eredményei azt jelzik, hogy mind a bFGF-fel, mind a VEGF-fel kezelt CAM-ok RCAS-GFP kontrollok jelenlétében angiogenezist indukálnak az Src-közvetített alapvonal angiogenezis fölött, amely a vak vagy kezeletlen CAM készítményeknél látható. Az expresszált Src 251 domináns-negatív mutáns hatékony a VEGF által indukált angiogenezis gátlására egészen vissza az alapvonal szintig, míg nem hatékony a bFGF által közvetített angiogenezis gátlására. A 8B. ábrában bemutatott mikrofényképek képszerűen igazolják a 8A. ábrában bemutatott adatokat. így a retrovírálisan expresszált Src 251 hatékony angiogenezis inhibitor, amikor az angiogenezist VEGF indukálja.

A találmány szerinti Src fehérjék alkalmazásai más angiogenezis modellekhez, amint ezt az ez után következő példákban leírjuk, szintén a találmány tárgyát képezik.

5. Tumor szövet növekedés visszaesése Src módosítókkal in vivo nyúlszem modell vizsgálattal mérve

Az Src módosítók hatását növekedési faktorral indukált angiogenezisre természetük szerint áttetsző struktúrákban figyelhetjük meg, amelyre jó példa a szem szaruhártyája. Új véredények nőnek ki a szaruhártya pereméből, amelyeknek gazdag vérellátása van, a szaruhártya közepe felé, amelynek normális körülmények között nincs vérellátása. Az angiogenezis stimulátorai, mint a bFGF, amikor a szaruhártyára alkalmazzuk, indukálja új véredények növekedését a szaruhártya pereméből. Az angiogenezis antagonistái, amikor a szaruhártyába alkalmazzuk, gátolják az új véredények növekedését a szaruhártya pereméből, így a szaruhártya angiogenezisen megy keresztül hámsejtek benyomulásával a szaruhártya peremétől a szívós kollagénnel burkolt szaruhártya szövetbe, amely könnyen látható. A nyúlszem modell vizsgálat ennél fogva egy in vivo modellt szolgáltat az angiogenezis stimulálásának és gátlásának közvetlen megfigyeléséhez a vegyületek beültetését követően közvetlenül a szem szaruhártyájába.

A. In vivo nyúlszem modell vizsgálat

1. Növekedési faktorokkal indukált angiogenezis

Angiogenezist indukálunk az in vivo nyúlszem modell vizsgálatban bFGF vagy VEGF növekedési faktorokkal, ezt ismertetjük a következő fejezetekben.

a. Növekedési faktort és monoklonális antitesteket tartalmazó hidron szemcsék előállítása

Növekedési faktort tartalmazó hidron polimer szemcséket készítünk, ahogyan ezt D’Amato és munkatársai leírják [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4082-4085 (1994)]. Az egyes szemcsék 650 ng növekedési faktort tartalmaznak elkülönítetten kötve szukralfáthoz (Carafet, Marion Merrell Dow Corporation), hogy a növekedési faktor stabilizálva legyen és biztosítva legyen ennek lassú kibocsátása a körülvevő szövetbe. Ezen kívül olyan hidron szemcséket készítünk, amelyek tartalmazzák a kívánt Srcexpresszáló retrovírust, ahogyan az előzőekben leírtuk. A szemcséket speciálisan preparált teflon rudakba öntjük, amelyeknek egy 2,5 mm-es belső ürege van felületébe befúrva. Mintegy 12 μΙ öntő anyagot helyezünk minden rúdba, és polimerizáljuk egy éjszakán át steril fülkében. A szemcséket azután ultraibolya besugárzással sterilezzük. Az Src fehérjék hatásait azután úgy becsüljük meg, ahogyan az előzőekben leírtuk.

6. Tumor szövet növekedés in vivo visszafejlődése Src módosítókkal, ahogyan ezt kiméra egér.'humán vizsgálattal mérjük

Egy in vivo kiméra egér:humán modellt alakítunk ki egy SCID egérből való bőrdarabot helyettesítve humán újszülött fitymával. Az in vivo kiméra egér:humán modellt lényegében úgy készítjük el, ahogyan ezt Yan és munkatársai leírják [J. Clin. Invest. 91, 986-996 (1993)]. Röviden ismertetve a bőrnek egy 2 cm -nyi területét sebészileg eltávolítjuk egy 6-8 hetes SCID egérből és helyettesítjük humán fitymával. Az egeret érzéstelenítjük és szőrzetét borotválással eltávolítjuk egy-egy 5 cm²-es területről a hasi terület mindkét oldalán. Két 2 cm²-es , kör alakú beültetési ágyat alakítunk ki eltávolítva a bőr teljes vastagságát az izomhüvelytöl lefelé. Azonos méretű, humán újszülött fitymából származó, teljes vastagságú humán bőr átültetendő szövetet helyezünk a sebágyakba és helyben odavarrjuk. Az átültetendő bőrt befedjük Band-Aid kötöző anyaggal, amelyet a bőrhöz varrunk. Alkalmazunk mikropórusos szövet tapaszt is a seb lefedéséhez.

Az M21-L humán melanoma sejtvonalat vagy az MDA 23.1 mell karcinóma sejtvonalat (ATCC HTB 26; α_νβ3 negatív szöveti metszetek LM609 mAb-bel végzett immunreaktivitása alapján) alkalmazzuk szilárd humán tumorok kialakítására az SCID egéren levő humán átültetett bőrön. 5.10⁶ M21-L vagy MDA 23.1 sejtek egyedi sejtszuszpenzióját injektáljuk intradermálisan a humán átültetett bőrbe. Az egereket azután 2-4 hétig figyeljük, lehetővé téve mérhető humán tumorok növekedését.

Miután egy mérhető tumor kialakult, a jelen találmány szerinti retrovirus készítményeket vagy PBS-t injektálunk az egerek farki vénájába. 2-3 hetes időtartam után a tumort kimetsszük és elemezzük tömegükre és szövettani képükre. Ezután megbecsüljük a találmány szerinti expresszált Src fehérjék hatását a tumorokra.

7. Humán tumorszövet növekedésének in vitro visszaszorulása Src módosítókkal CAM vizsgálattal mérve

A tumor növekedése függ az angiogenezistöl [Folkman (1992); Weidner és munkatársai (1991); Brooks és munkatársai (1994b)]. A jelen beszámoló valójában azt sugallja, hogy a tumor növekedés fogékony a VEGF receptor antagonisták anti-angiogén hatásaira [Kim és munkatársai (1993)]. Ennél fogva megvizsgáljuk, vajon az angiogenezis visszaszorítása kináz-hiányos Src 251 bevezetésével befolyásolja-e egy humán csontvelő blasztóma (DAOY) növekedését, amely nagy mértékben angiogén tumor, és amelyről ismert, hogy VEGF-et termel, de bFGF-et csak nagyon keveset (adatokat nem mutatunk be).

A 3. és 6 napos DAOY csontvelő blasztóma tumor növekedési vizsgálatokat csirke embrió CAM-ban lényegében úgy hajtjuk végre, ahogyan ezt korábban leírták [Brooks és munkatársai (1994)]. 5.10⁶ DAOY sejtet, amelyek 10 %-os borjúembrió szérumot is tartalmazó RPMI tápüregben tenyésztek, mosunk és egy 10 napos embrió CAM-jára ültetjük, hogy termeljen DAOY tumor fragmentumokat. 7 nap múlva 50 mg tumor fragmentumot kimetszünk és átültetjük egy másik 10 napos embrióra, majd inkubáljuk további 3 vagy 6 napig a kontroll RCAS-GFP retrovirus vagy RCAS-Src 251 helyi alkalmazásával (25 μΙ) vagy vak kezeléssel. A fertőzött tumorok teljes szövete azonos fókusztávolságú leképzését, mint iránymutatót alkalmazva képesek vagyunk meghatározni, van-e szignifikáns expressziója az RCAS konstrukcióknak a tumor fragmentum körül és a tumor fragmentumon belül ezzel a helyi megközelítéssel. A tumor kimetszést és tömegmérést kettős vak módszerrel hajtjuk végre csak a könnyen meghatározható szilárd tumor tömeget távolítva el [Brooks és munkatársai (1994)]. A nedves tumor tömegeket 3 és 6 nap után összehasonlítjuk a kiindulási tömeggel és a tumor tömeg százalékos változását csoportonként meghatározzuk.

Ezek a tumorok könnyen nőnek a CAM-on és aktív angiogenezist alakítanak ki (9. ábra), lehetővé téve számunkra, hogy szelektíven célozzuk meg az avian-eredetü tumor érrendszert avian-fajlagos RCAS retrovírust alkalmazva.

A 9. ábra ábrázolja az eredményeket, amelyek RCAS-Src 251 retrovirális szolgáltatását mutatják a csirke embrió CAM-on növekvő humán tumorokhoz, megfordítva a tumor növekedést. A

9A. ábra humán csontvelő blasztómákat mutat be, amelyek csirke embriók CAM-ján növekedtek, ahogyan az előzőekben ismertettük. Az RCAS GFP-t vagy RCAS-Src 251-et tartalmazó retrovirusokat helyileg alkalmazzuk az 50 mg-nál nagyobb, előzetesen létesült tumorokhoz. A GFP-t expresszáló RCAS-GFP-vel fertőzött csontvelő blasztóma tumor fragmentumok reprezentatív mikrofényképe határozott expressziót tár fel a tumor véredényeiben (nyílhegy), amint ezt egy BioRad azonos fókusztávolságú lézer letapogató mikroszkóppal végzett optikai szakaszolással kimutatjuk (csík = 500 pm). A 9B. ábra mutatja be az eredményeket azokból a tumorokból, amelyeket az előzőekben leírtak szerint kezelünk, és amelyeket 3 vagy 6 napig hagyunk növekedni az után, hogy ki voltak vágva és nedves tömegük meg volt határozva. Az adatokat úgy adjuk meg, mint az átlagos változást a tumor tömegben (50 mg tumor kiindulási tömegből) +/- standard eltérés (SEM) 2 párhuzamos alapján. Az RCAS-Src 251-nek jelentős befolyása van a tumor növekedésre 3 nap után (*, P < 0,002) és 6 nap után (**, P < 0,05). A 9C. ábra az embriókból sebészileg eltávolított csontvelő blasztóma tumorok reprezentatív sztereomikroszkópos fényképét mutatja Olympus sztereomikroszkóppal felvéve (csík: 350 pm). Az alsó panelek az egyes tumorok nagy nagyítású fényképei, ezek az egyes tumorok érrendszerét mutatják be részletesen (csík: 350 pm). A nyílhegy véredény megszakadást jelez RCAS-Src 251-gyei kezelt tumorban.

Az eredmények azt mutatják, hogy az Src 251-et tartalmazó RCAS szolgáltatása előzetesen kialakult csontvelő blasztómákhoz szelektív vírus expressziót eredményez a tumorral társult véredényekben (9A. ábra), és ez végül ezeknek a tumoroknak a visszafejlődéséhez vezet a hat napos időtartam során (9B. ábra). Fontos, hogy az Src 251-et tartalmazó vírussal kezelt állatokban a tumorral társult véredények súlyosan sérültek és számuk is kevesebb, összehasonlítva a kontroll állatokban levő tumor véredényekkel (9C. ábra). Az a tény, hogy az RCAS-GFP-vel kezelt tumorok GFP lokalizációt csak a tumor érrendszerben mutatnak, azt sugallja, hogy a retrovirálisan szolgáltatott Src 251-gyei megfigyelt tumorellenes hatás anti-angiogén tulajdonságainak következménye.

A kiviteli példák és a hozzájuk tartozó leírások csak a jobb bemutatás célját szolgálják és nem céljuk a korlátozás. A találmány nem korlátozódik deponált sejtvonalakra sem, mivel a deponált sejtvonalakat alkalmazó kiviteli formák és módok csak egy-egy illusztrálását jelentik a találmány különböző szempontjainak. Bármely sejtvonal, amely működésében ekvivalens, a találmány oltalmi körén belül van. Az anyagok deponálása nem jelenti annak beismerését, hogy az itt található írásos ismertetés ne lenne elegendő ahhoz, hogy lehetséges legyen a találmány bármely szempontjának gyakorlatba vétele, beleértve a legjobb módozatokat is, és nem az volt a szándék, hogy az igénypontok oltalmi köre a megoldásokat képviselő speciális illusztrációkra korlátozódjék. A találmánynak az itt bemutatottakon és leírtakon kívüli különböző módosításai nyilvánvalóak az itt található leírás alapján azoknak, akik a szakterületen jártasak, és ezek az ezután következő igénypontok oltalmi körébe tartoznak.

1/26

SZEKVENCIALISTA <110>

<120>

The Scripps Research Institute és munkatársai angiogenezis módosítására alkalmas src tirozin kinazt HASZNOSÍTÓ ELJÁRÁSOK ÉS KOMPOZÍCIÓK < 130> TSRI 651.1 < 140> Még nem ismert < 141> Meghatározandó < 150> 60/007,220 < 151> 1990-05-29 < 160> 6 < 170> Patentln Ver. 2.0 < 210> 1 < 211> 11627 < 212> DNS < 213> Mesterséges szekvencia < 223> A mesterséges szekvencia leírása: RCASBP(A) a madár szarkóma vírusra alapozva <220:

< 221: kevert vonás < 222> (7649)..(11258) < 223> pBR 322 szekvenciák <220>

< 221> LTR < 222> (7166)..(7494) < 223> felfelé (upstream) <220>

< 221> LTR < 222> (1).·(101) < 223 > f_e|feié (a számozás a felfelé levő R-nél kezdődik)

2/26 <220>

<22i> kevert vonás <222> (11394)..(11623) <223> U3 <220>

< 221> kevert vonás < 222> (1)··(21) < 223> R * kevert vonás <221>

<222> (22)..(101) <223> U5 <220>

<22i> kevert vonás <222> (102)..(119) <220>

<221< LTR <222> (7166)..(7494) <223> lefelé (downstream) <220>

<221> kevert vonás <222> (7166)..(7393) <223? U3

3/26

<220> <221> <222> <223>	kevert vonás (7394)..(7414) R
<220> <221> <222> <223^	kevert vonás (7415)..(7494) U5
<220> <221> <222> <223>	kevert vonás (7154).;(7165) PPT
<220> <221> <222> <223>	kevert vonás (388) . . (391) illesztési donor (AGGT) >
<220> <221> <222> <223>	kevert vonás (5074)..(5077) env illesztési akceptor (AGGC)
<220> <221> <222> <223>	kevert vonás (6982)..(6985) Clal illesztési akceptor (AGGA)

220

<221> <222> <223>

gén (372)..(902) gag pl9

4/26 <220>

<22i> 9θ^η < 222> (909)..(1094) < 223> gag plO <220>

< 221> gen < 222> (1095)..(1814) < 223> gag p27 <220>

<22i> θθη < 222> (1043)..(210Θ) < 223> gag pl2 <220>

< 221> gén <222> (2109)..(2480) <223> gag pl5 <220>

<22i> kevert jel <222> (2481) . . (2483) <223> gag stop

5/26

• · · ····· «···*· ** · gén (2501) . . (4216) pol RT gén (4217) - . (5185) pol IN kevert jel _t (5186) . . (5188) pol stop gén (5244) . . (6263) env gp85 gén (6264) . . (6878) env gp37

6/26 <220>

<22i> kevert jel < 222> (6879) . . (6881) < 223> env stop < 220> , < 221 > kevert vonás < 223 > Clal hely / a Clal hely a gag-ban metilezve van a Dam+ törzsekben és nem hasad < 400> 1 gccatttgac cattcaccac attggtgtgc acctgggttg atggccggac cgttgattcc60 ctgacgacta cgagcacctg catgaagcag aaggcttcat ttggtgaccc cgacgtgata120 gttagggaat agtggtcggc cacagacggc gtggcgatcc tgtctccatc cgtctcgtct180 atcgggaggc gagttcgatg accctggtgg agggggctgc ggcttaggga ggcagaagct240 gagtaccgtc ggagggagct ccagggcccg gagcgactga cccctgccga gaactcagag300 ggtcgtcgga agacggagag tgagcccgac gaccacccca ggcacgtctt tggtcggcct360 gcggatcaag catggaagcc gtcattaagg tgatttcgtc cgcgtgtaaa acctattgcg420 ggaaaatctc tccttctaag aaggaaatcg gggccatgtt gtccctgtta caaaaggaag480

7/26 ggttgctvat gcctccctca gatttatatt ctccggggtc ccgggatccc atcactgcgg540 cgctctccca gcgggcaatg gtacttggaa aatcgggaga gttaaaaacc tggggattgg600 ttttgggggc attgaaggcg gctcgagagg aacaggttac atctgagcaa gcaaagtttt660 ggtügggatt agggggaggg agggtctcnc ccccaggtcc ggagtgcatc gagaaaccag720 ctacggagcg gcgaatcgac aaaggggagg aggtgggaga aacaaccgtg cagcgagatg 780 cgaagatggc gccagaggaa gcggccacac ctaaaaccgt tggcacatcc tgctatcatt 840 gcggaacagc tgttggctgc aattgcgcca ccgccacagc ctcggcccct cctccccctt 900 atgtggggag tggtttgtat ccttccctgg cgggggtggg agagcagcag ggccagggag 960 ataacacgtc tcggggggcg gagcagccaa gggaggagcc agggcacgcg ggtcaggccc 1020 ctgggccggc cctgactgac tgggcaaggg taagggagga gcttgcgagt actggtccgc 1080 ccgtggtggc catgcctgta gtgattaaga cagagggacc cgcctggacc cctctggagc1140 caaaattgat cacaagactg gctgatacgg tcaggaccaa gggcttacga tccccgatca1200 ctatggcaga agtggaagcg ctcatsgccct ccccgttgct gccgcatgac gtcacgaatc1260 taatgagagt gattttagga cctgccccat atgccttatg gatggacgct: tggggagtcc1320 aactccagac ggttatagcg gcagccactc gcgacccccg acacccagcg aacggtcaag1380 ggcgggggga acggaccaac tstggatcgat taaagggctt agctgatggg atggtgggca1440 acccacaggg tcaggccgca tstattaagac cgggggaatt ggctgctatt acggcgtcgg1500 ctctccaggc gtttagagaa gttgcccggc tggcggaacc tgcaggtcca tgggcggaca1560 tcacgcaggg accatctgag tcctttgttg attttgccaa tcggcttata aaggcggttg1620 aggggtcaga tctcccgcct tccgcgcggg ctccggtgat cattgactgc tttaggcaga1680 agtcacagcc agatattcag cagcttatac gggcagcacc ctccacgctg accaccccag1740 gagagataat caaatatgtg ctagacaggc agaagattgc ccctcttacg gatcaaggca1800 tagccgcggc catgtcgtsct gctatccagc ccttagttat ggcagtagtc aatagagaga1860 gggatggaca aactgggtcg ggtggtcgtg cccgagggct ctgctacact tgtggatccc1920 cgggacatta tcaggcacag tgcccgaaaa aacgaaagtc aggaaacagc cgtgagcgat1980 gtcagctgtg tgacgggatg ggacacaacg ctaaacagtg taggaagcgg gatggcaaca2040 agggccaacg cccaggaaga ggtctctctt cggggccgtg gcccggccct gagcagcctg2100 ccgtctcgtt agcgatgaca atggaacatsa aagatcgccc cttggttagg gtcattctga2160 ctaacactgg gagtcatcca gtcaaacaac gttcggtgta tatcaccgcg ctgttggact2220

8/26

ccggagcgga catcactatt atttcggagg aggattggcc	tactgattgg	ccggtggtgg	2280
acaccgcgaa cccacag;>tc catggcatag gagggggaat	tcccatgcga	aaatcccggg	2340
atatgaCaga ggtgggggtt attaaccgag acgggtcgtt	ggagcgaccc	ctgctcctct	2400
tccccgcagt cgctatggtt agagggagta tcctaggaag	agattgtctg	cagggcctag	2460
ggctccgctt gacaaattta tagggagggc cactgttctc	actgttgcgc	tacatctggc	2520
tattccgctc aaatggaagc cagaccgcac gcctgtgtgg	attgaccagt	ggcccctccc	2580
tgaaggtaaa cttgtaggcc taacgcaatt agtggaaaaa	gaattacagt	taggacatat	2640
agagccctca	cttagttgtt	ggaacacacc	tgtttttcgt	gatccggaag	gcttccgggt	2700
cttatcgctt	attgcatgat	ttgcgcgctg	ttaacgccaa	gcttgtccct	tttggggccg	2760
tccaacaggg	ggcgccagtt	ctctccgcgc	tcccgcgtgg	ctggcccctg	atggtcctag	282 0
acctcaagga	ttgcttcttt	tctatccctc	ttgcggaaca	agatcgcgaa	gcttttgcat	2880
ttacgctccc	ctctgtgaat	aaccaggccc	ccgctcgaag	attccaatgg	aaggtcttgc	2940
cccaagggat	gacctgttct	cccactatct	gtcagttggt	agtgggtcag	gtgctcgagc	3000
ccttgcgact	caagcaccca	gctctgcgca	tgttgcatta	tatggacgat	cttttgctag	3060
ccgcctcaag	tcatgatggg	ttggaagcgg	cagggaagga	ggttatcggt	acattggaaa	3120
gagccgggtt	cactatttcg	ccggataaga	tccagaggga	gcccggagta	caatatcttg	3180
ggtacaagtt	aggcagtacg	tatgtagcac	ccgtaggctt	ggtagcagaa	cccaggatag	3240
ccaccttgtg	ggatgttcaa	aagctggtgg	ggtcacttca	gtggcttcgc	ccagcgttag	3300
ggatcccgcc	acgactgatg	ggtccctttt	atgagcagtt	acgagggtca	gatcctaacg	3360
aggcgaggga	atggaatcta	gacatgaaaa	tggcctggag	agagatcgta	cagcttagca	3420
ctactgctgc	cttggaacga	tgggaccctg	cccagcctct	ggaaggagcg	gtcgctagat	3480
gtgaacaggg	ggcaataggg	gtcctgggac	agggactgtc	cacacaccca	aggccatgtt	3540
tgtggttatt	ctccacccaa	cccaccaagg	cgtttactgc	ttggttagaa	gtgctcaccc	3600
ttttgattac	taagctacgc	gcttcggcag	tgcgaacctt	tggcaaggag	gttgatatac	3660
tcctgttgcc	tgcatgcttc	cgggaggacc	ttccgctccc	ggaggggatc	ctgttagcac	3720
ttagggggtt	tgcaggaaaa	atcaggagta	gtgacacgcc	atctattttt	gacattgcgc	3780
gtccactgca	tgtttctctg	aaagtgaggg	ttaccgacca	ccctgtgccg	ggacccactg	3840
tctttaccga	cgcctcctca	agcacccata	aaggggtggt	agtctggagg	gagggcccaa	3900
ggtgggagat	aaaagaaata	gttgatttgg	gggcaagtgt	acaacaactg	gaggcacgcg	3960

9/26 ggcaccEccg cEgEggccga caacgeccoc —««gEg ««g.ctcEg 4020 cgtttgttgc gaa.aEgEEa cEcaagatgg g.caggaggg agceccgtet acagcggcgg 4000 _ctctEatEEE agaggaegcg EEa.gcca.a ggEc.gcc.E ggccgeegte «ecacgEgc 4140 ggagEcaEEC EgaagEgcca gggeEEEEca cagaaggaaa cgacgtggca gatagecaag 4200 «„attc. agcgtatccc EEgag.gagg «aaagacct EcaEaccgcE otec.tatcg 4200 g.ccccgcgc gct.tccaaa gcgEgtaae. EaEct.tgca gc.ggctagg gaggEEgetc 4320 agacctgccc gcacEgcaac EcagccccEg cgEEggaggc cggggtaaac ccEaggggEE 4300 tgggaccccE .„gat.tgg c.g.eag.cE EEacgcEEga 9ccE.ga.Eg 9«ccccgEE 4440 ccEggcEcgc EgEEacEgEg g.c.ccgccE c.Ec.gcg.E .9EcgEa.cE c.gc.Eggcc 4000 gegttacacc ggEEgcEgca c.ac.Ec.EE gggecaeggc «ccgccgEE «ggg.agae 4000 caaaggccaE aa.aac.gac aacgggtccE gécEcáégtc „g.Ecc.cg cg.g.gEggc 4020 ecgcgagatg ggggae.gea cac.cc.ccg gg.EEccggg aaaECeec.g ggec.agcc4600 tggcagageg ggeeaacegg cecocgaaag aa.agaoecg Egagcaogcg gaggggg.eg4740 gctacaagaa aagaatecce accagcaaac aggggga.ca attagoeaag geaaagtatg4800 ccctcaatca ctttgagcgt ggcgaaaaca caaaaacacc ganacaaaaa caceggagae4000 cEaccgEEcE Eacagaagga cccecggEEa aa.EacgaaE agagaeaggg g.gEggg.a.4920 aaggaEggaa cgtg«ggt= tggggacg.g gEEalgcegc EgEgaa.aac aggg.e.cEg4900 ataaggEtat EEgggtaocc EcEcgga.ag EEa.accgg. EgEeaccea. a.gg.Eg.ggS040

E3.cEa.ga. ag.Eg^g agccoEcEtE EEgc.ggc.E EEcEgacEgg .EacccEggg3100 aag.cg.gca agaagoacte caaggag.a. ccgcEagca. cgcga. agacccggag3160 aagacaccct Egctgccaac gagagEtaaE E.E.EEcEca EE.EEggEgE ccEggECEEg0220

EgcgaggEE. cgggggcaag .gctg.EgEc cacEEacecg agc.gccagg ga.ccEEEgg 3280 aEEacaEggg cca.ccgE.c aggcc.a.cg g.EEEEEgcc EctcEacaca gEc.gcc.cc 3340 EccccEECtc aaacacgEEE gaEaggE.Ec ccgEccccEa EEtccgaggg EgaEEEEaag S400 gg.EaEgEEE cEgaEaca.a EEgeacc.cc EEggg.actg .EcggEE.gt cLcgEo.gcc 0460 gacEEE.cEg gcggaccEg. ea.cagEacc acccEc.cEE .Ecgg.aggE cEe.EgcEtg 5=20 EEgEEaaagc Eg.acgectc E.Egtggg.t g.gcc.cctg a.cEac.gct gEt.ggEEcc 3S00 cagEcEcEcc cEaac.EEac EaaEaEEgcE cag.Ettccg ge.Eaaccgg ggg.EgcgE. 0640 ggcEEcagac cacaaggggt EccEEggtat cE.ggEEggt cE.gacagga ggccacgcgg 0700

10/26 tttctcctta gacacccctc tttctctaaa tccacggaac gataggcaca atctttttat ggggagtgag tactgcggtg aacatgtata actgctcaca ggtggggcgg cagtaccgct cgcacgggtc ttcctgaaat ccagtgtaca aggagaggag caggaaatta atgagtcgga gccgttcagc tttacggtga ggtaatgcca gtgggtgttg cggaaaagca ggcacgattc agcacacaag gtagtttcac caaaccaaaa ggggatcgcg catggcaagg aattcccagt aagcttacca tgttagcacc taagcataca cggacaggta taagacgtaa acgaagcacc gtgcagcttt ggggtcctac agcaagaatc gctgcgcaag ccttaagaga aatcgagaga ttgacaacat cactcc’cgg ggacctattg ctgcagaacc gagcggctat tgacttcttg gttgccggaa tgtgctgttt caatttgagt cagctaatga aggaacatgt caataagatc ctgcgaggac tattcggggg aataggagaa ttggggcttg tagttatttt gttgctagta tgcggtaata ggagaaagat gattaataac ctgcaaaagg cctgtgggca gcctgaaagc gtatagcgct:

tgcgagtcca tcgagcaagg tacgcttttg tctgtgtgct gcaggagctg ctgtggcatc gatgcgatgt acgggccaga tttaggcgaa aagcggggct tcggttgtac tttcgctttt gcatagggag ggggaaatgt acatggtaac gatgagttag caacatgcct gattggtgga agtaaggtgg tacgatcgtg catggattgg acgaaccact gaattccgca tcgatacaat aaacgccatt tgaccattca ggaccgttga ttccctgacg actacgagca gcgctaccac cgtccggtag gatattctca tcacacctgg tttgcatcta ctagcctgtt gatgatgtca ctcctagctc gaccagagtg ggcgtggata tgggccgttc gtgtgcctgc tccatcagct agaatagtat caggaaagac agctgactct tatacgcgta gcggttagga agtcttatgc tacaaggaga ccttattagg ttgcagagat ccacattggt cctgcatgaa

cgtttacagt	ggtgacagcg	5760
catatggcta	cagattttgg	5820
gtggtaatgc	gcgcacgccc	5880
gcaaatgggt	taatcaatca	5940
actgtacagc	tagtagtttg	6000
tcccgggaaa	gtgggtcgac	6060
ccgcaatttt	cctcatttgt	6120
ggggcccctg	ctatttaggc	6180
aggtgcttgt	caattcatcg	6240
atgatacatg	ctcagatgaa	6300
tcctagcccc	gggggtagca	6360
ggtccgttaa	acaggctaac	6420
cgagtattcg	acacgcggtc	6480
acggccatgg	ctgtgaggac	6540
agtctataca	gaagaagttc	6600
gcgacctaat	tggaagttgg	6660
atttgctgaa	aggactgctt	6720
cttgcctttt	gcaaatgtta	6780
accacacgga	atataagaag	6840
aaggcagtac	atgggtggtg	6900
agctattggt	aattgtgaaa	6960
gctggtggcc	tcgcgtacca	7020
tctgagggga	ctagggCgtg	7080
gtccccttag	gatatagtag	7140
: aatactcttg	tagtcttgca	7200
. gaaaaagcac	cgtgcatgcc	7260
I aaggcaacag	acgggtctga	7320
; attgtattta	agtgcctagc	7380
. gtgcacctgg	gttgatggcc	7440
l gcagaaggct	tcatttggtg	7500

·. .^ · V ·τ

-.......

11/26

accccgacgt	gatagttagg	gaatagtggt cggccacaga	cggcgtggcg	atcctgtctc	7560
catccgtctc	gtctatcggg	aggcgacttc	gatgaccctg	gtggaggggg	ctgcggctta	7620
gggaggcaga	agctgagtac	cgtcggaggg	gatccacagg	acgggtgtgg	tcgccatgat	7680
cgcgtagtcg	atagtggctc	caagtagcga	agcgagcagg	actgggcggc	ggccaaagcg	7740
gtcggacagt	gctccgagaa	cgggtgcgca	tagaaattgc	atcaacgcat	atagcgctag	7800
cagcacgcca	tagtgactgg	cgatgctgtc	ggaatggacg	atatcccgca	agaggcccgg	7860
cagtaccggc	ataaccaagc	ctatgcctac	agcatccagg	gtgacggtgc	cgaggatgac	7920
gatgagcgca	ttgttagatt	tcatacacgg	tgcctgactg	cgttagcaat	ttaactgtga	7980
taaactaccg	cattaaagct	ccaaacttgg	ctgtttcccg	tgtgaaattg	ttatccgctc	8040
acaattccac	acattatacg	agccggaagc	ataaagtgta	aaacctgggg	tgcctaatga	8100
gtgagaattc	ttgaagacga	aagggcctcg	tgatacgcct	atttttatag	gttaacgtca	8160
tgataataat	ggtttcttag	acgtcaggtg	gcacttttcg	gggaaatgtg	cgcggaaccc	8220
ctatttgttt	atttttctaa	atacatccaa	atatgtatcc	gctcatgaga	caataaccct	8280
gataaatgct	tcaataatat	tgaaaaagga	agagtatgag	tattcaacat	ttccgtgtcg	8340
cccttattcc	cttttttgcg	gcattttgcc	ttcctgttct	tgctcaccca	gaaacgctgg	8400
tgaaagtaaa	agatgctgaa	gatcagttgg	gtgcacgagt	gggttacatc	gaactggatc	8460
tcaacagcgg	taagatcctt	gagagttttc	gccccgaaga	acgttttcca	atgatgagca	8520
cttttaaagt	tctgccatgt	ggcgcggtat	taecccgtgt	tgacgccggg	caagagcaac	8580
tcggtcgccg	catacactat	tctcagaatg	acttggttga	gtactcacca	gtcacagaaa	8640
agcatcttac	ggatggcatg	acagtaagag	aattatgcag	tgctgccata	accatgagtg	8700
ataacactgc	ggccaactta	cttctgacaa	cgatcggagg	accgaaggag	ctaaccgctt	8760
ttttgcacaa	catgggggat	catgtaactc	gccttgatcg	ttgggaaccg	gagctgaatg	8820
aagccatacc	aaacgacgag	cgtgacacca	cgatgcctgc	agcaatggca	acaacgttgc	8880
gcaaactatt	aactggcgaa	ctacttactc	tagcttcccg	gcaacaatta	atagactgga	8940
tggaggcgga	taaagttgca	ggaccacttc	tgcgctcggc	ccttccggct	ggctggttta	9000
ttgctgataa	atctggagcc	ggtgagcgtg	ggtctcgcgg	taccattgca	gcactggggc	9060
cagatggtaa	gccctcccgt	atcgtagtta	tctacacgac	ggggagtcag	gcaactatgg	9120
atgaacgaaa	tagacagatc	gctgagatag	gtgcctcact	gattaagcat	tggtaactgt	9180
cagaccaagt	ttactcatat	atactttaga	ttgatttaaa	acttcatttt	taatttaaaa	9240

12/26

ggatctaggt	gaagatcctt	tttgataatc	tcatgaccaa	aatcccttaa	cgtgagtttt	9300
cgttccactg	agcgtcagac	cccgtagaaa	agatcaaagg	atcttcttga	gatccttttt	9360
ttctgcgcgt	aatctgctgc	ttgcaaacaa	aaaaaccacc	gctaccagcg	gtggtttgtt	9420
tgccggatca	agagctacca	actctttttc	cgaaggtaac	tggcttcagc	agagcgcaga	9480
taccaaatac	tgtccttcta	gtgtagccgt	agttaggcca	ccacttcaag	aactctgtag	9540
caccgcctac	atacctcgct	ctgctaatcc	tgttaccagt	ggctgctgcc	agtggcgata	9600
agtcgtgtct	taccgggttg	gactcaagac	gatagttacc	ggataaggcg	cagcggtcgg	9660
gctgaacggg	gggCtcgtgc	acacagccca	gcttggagcg	aacgacctac	accgaactga	9720
gatacctaca	gcgtgagcta	tgagaaagcg	ccacgcttcc	cgaagggaga	aaggcggaca	9780
ggtatccggt	aagcggcagg	gtcggaacag	gagagcgcac	gagggagctt	ccagggggaa	9840
acgcctggta	tctttatagt	cctgtcgggt	ttcgccacct	ctgacttgag	cgtcgatttt	9900
tgtgatgctc	gtcagggggg	cggagcctat	ggaaaaacgc	cagcaacgcg	gcctttttac	9960
ggttcctggc	cttttgctgg	ccttttgcta	acatgttctt	tcctgcgtta	tcccctgatt	10020
ctgtggataa	ccgtattacc	gcctttgagt	gagctgatac	cgctcgccgc	agccgaacga	10080
ccgagcgcag	cgagtcagtg	agcgaggaag	cggaagagcg	cctgatgcgg	tattttctcc	10140
ttacgcatct	gtgcggtatt	tcacaccgca	tatggtgcac	tctcagtaca	atctgctctg	10200
atgccgcata	gttaagccag	tatacactcc	gctatcgcta	cgtgactggg	tcatggctgc	10260
gccccgacac	ccgccaacac	ccgctgacgc	gccccgacgg	gcttgtctgc	tcccggcatc	10320
cgcttacaga	caagctgtga	ccgtctccgg	gagctgcatg	tgCcagaggt	tttcaccgtc	10380
atcaccgaaa	cgcgcgaggc	agctgcggta	aagctcatca	gcgtggtcgt	gaagcgattc	10440
acagatgtct	gcctgttcat	ccgcgtccag	ctcgttgagt	ttctccagaa	gcgttaatgt	10500
ctggcttctg	ataaagcggg	ccatgttaag	ggcggttttt	tcctgtttgg	tcacttgatg	10560
cctccgtgta	agggggaatt	tctgttcatg	ggggtaatga	taccgacgaa	acgagagagg	10620
atgctcacga	tacgggttac	tgatgatgaa	catgcccggt	tactggaacg	ttgtgagggt	10680
aaacaactgg	cggtatggat	gcggcgggac	cagagaaaaa	tcactcaggg	tcaatgccag	10740
cgcttcgtta	atacagatgt	aggtgttcca	cagggtagcc	agcagcatcc	tgcgatgcag	10800
atccggaaca	taatggtgca	gggcgctgac	ttccgcgttt	ccagacttta	cgaaacacgg	10860
aaaccgaaga	ccattcatgt	tgttgctcag	gtcgcagacg	ttttgcagca	gcagtcgctt	10920
cacgttcgct	cgcgtatcgg	tgattcattc	tgctaaccag	taaggcaacc	ccgccagcct	10980

13/26 agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgagcaccc gtggccagga cccaacgctg 11040 cccgagatgc gccgcgtgcg gctgctggag atggcggacg cgatggatat gttctgccaa 11100 gggttggttt gcgcattcac agttctccgc aagaattgat tggctccaat tcttggagtg 11160 gtgaatccgC tagcgaggtg ccgccggctt ccattcaggt cgaggtggcc cggctccatg 11220 caccgcgacg caacgcgggg aggcagacaa ggtatagggc ggcgatgcga tgtacgggcc 11280 agatatacgc gtatctgagg ggactagggt gtgtttaggc gaaaagcggg gcttaggttg 11340 tacgcggtta ggagtcccct taggatatag tagtttcgct tttgcatagg gagggggaaa 11400 tgtagtctta tgcaatactc ttgtagtctt gcaacatggt aacgatgagt tagcaacatg 11460 ccttacaagg agagaaaaag caccgtgcat gccgattggt ggaagtaagg tggtacgatc 11520 gtgccttatt aggaaggcaa cagacgggtc tgacatggat tggacgaacc actgaattcc 11580 gcattgcaga gatattgtat ttaagtgcct agctcgatac aataaac 11627 <210> 2 <211> 1759 < 212> DNS < 213? csirke <220>

< 221> 9^én^ < 222> (1)..(1759) < 223 > csirke c-SRC eDNS <220>.

<221> CDS <222> (112)..(1710) tccgacaccc atctgtctgt ctgtctgtgt gctgcaggag ctgagctgac tctgctgtgg 60 cctcgcgtac cactgtggcc aggcggtagc tgggacgtgc agcccaccac c atg ggg 117 • · · · · · · ······ ο · ·

14/26

Met Gly 1

age Ser

age Ser

aag Lys 5

age Ser

aag Lys

ccc Pro

aag Lys

gac Asp 10

ccc Pro

age Ser

cag Gin

ege Arg

egg Arg 15

ege Arg

age Ser

ctg Leu

165

gag Glu

cca Pro

ccc Pro

gac Asp

age Ser

acc Thr

cac His

cac His

ggg Gly

gga Gly

ttc Phe

cca Pro

gcc Ala

teg Ser

cag Gin

acc Thr

213

20

25

30

ccc

aac

aag

aca

gca

gcc

ccc

gac

acg

cac

ege

acc

ccc

age

ege

tec

261

Pro 35

Asn

Lys

Thr

Ala

Ala 40

Pro

Asp

Thr

His

Arg 45

Thr

Pro

Ser

Arg

Ser 50

ttt Phe

999 Gly

acc Thr

gtg Val

gcc Ala 55

acc Thr

gag Glu

ccc Pro

aag Lys

etc Leu 60

ttc Phe

ggg Gly

ggc Gly

ttc Phe

aac Asn 65

act Thr

309

tet

aac

acc

gtt

acg

teg

ccg

cag

cgt

gcc

ggg

gca

ctg

get

ggc

ggc

357

Ser

Asp

Thr

Val 70

Thr

Ser

Pro

Gin

Arg 75

Ala

Gly

Ala

Leu

Ala 80

Gly

Gly

gtc Vai

acc Thr

act Thr Θ5

ttc Phe

gtg Val

get Ala

etc Leu

tac Tyr 90

gac Asp

tac Tyr

gag Glu

tec Ser

egg Arg 95

act Thr

gaa Glu

acg Thr

405

gac Asp

ttg Leu 100

tcc Ser

ttc Phe

aag Lys

aaa Lys

gga Gly 105

gaa Glu

ege Arg

ctg Leu

cag Gin

att lie 110

gtc Val

aac Asn

aac Asn

acg Thr

453

gaa Glu 115

ggt Gly

gac Asp

tgg Trp

tgg Trp

ctg Leu 120

get Ala

cat His

tec Ser

etc Leu

act Thr 125

aca Thr

gga Gly

cag Gin

acg Thr

ggc Gly 13 0

501

tac

ate

ccc

agt

aac

tat

gtc

geg

ccc

tea

gac

tec

ate

cag

get

gaa

549

Tyr

He

Pro

Ser

Asn 135

Tyr

Val

Ala

Pro

Ser 140

Asp

Ser

lie

Gin

Ala 145

Glu

gag Glu

tgg Trp

tac Tyr

ttt Phe 150

ggg Gly

aag Lys

ate He

act Thr

cgt Arg 155

egg Arg

gag Glu

tec Ser

gag Glu

egg Arg 160

ctg Leu

ctg Leu

597

15/26

etc Leu

aac Asn

ccc Pro 165

gaa Glu

aac Asn

ccc Pro

egg Arg

gga Gly 170

acc Thr

ttc Phe

ttg Leu

gtc Val

egg Arg 175

gag Glu

age Ser

gag Glu

645

acg Thr

aca Thr 180

aaa Lys

ggt Gly

gcc Ala

tat Tyr

tgc Cys 185

etc Leu

tcc Ser

gtt Val

tet Ser

gac Asp 190

ttt Phe

gac Asp

aac Asn

gcc Ala

693

aag Lys 195

ggg Gly

etc Leu

aat Asn

gtg Val

aag Lys 200

cac His

tac Tyr

aag Lys

ate He

ege Arg 205

aag Lys

ctg Leu

gac Asp

age Ser

ggc Gly 210

741

ggc Gly

ttc Phe

tac Tyr

ate He

acc Thr 215

tea Ser

ege Arg

aca Thr

cag Gin

ttc Phe 220

age Ser

age Ser

ctg Leu

cag Gin

cag Gin 225

ctg Leu

789

gtg Val

gcc Ala

tac Tyr

tac Tyr 230

tcc Ser

aaa Lys

cat His

get Ala

gat Asp 235

ggc Gly

ttg Leu

tgc Cys

cac His

ege Arg 240

ctg Leu

acc Thr

837

aac Asn

gtc Val

tgc Cys 245

ccc Pro

acg Thr

tcc Ser

aag Lys

ccc Pro 250

cag Gin

acc Thr

cag Gin

gga Gly

etc Leu 255

gcc Ala

aag Lys

gac Asp

885

geg

Ala tgg Trp 260 gaa

Glu ate

He ccc

Pro egg

Arg gag Glu 265 teg Ser ctg Leu egg

Arg ctg Leu gag Glu 270 gtg Val aag

Lys

Ctg Leu ggg

Gly

933 cag Gin 275 gg^c Gly tgc

Cys ttt

Phe gga Gly gag Glu 280 gtc Vai tgg

Trp atg Met ggg Gly acc Thr 285 tgg

Trp aac Asn ggc Gly acc Thr acc Thr 290

981 aga Arg gtg

Val gcc

Ala ata He aag Lys 295 act

Thr ctg

Leu aag

Lys ccc

Pro ggc Gly 300 acc

Thr atg

Met tcc

Ser ccg Pro gag Glu 305 gcc Ala

1029 ttc

Phe ctg

Leu cag

Gin gaa Glu

310 gcc

Ala caa

Gin gtg Vai atg Met aag

Lys 315 aag

Lys etc Leu egg

Arg cat

His gag Glu 320 aag

Lys ctg Leu

1077 • · · · · · f ······ · · ·

16/26

gtt Vai

cag Gin

ctg Leu 325

tac Tyr

gca Ala

gtg Val

gtg Val

teg Ser 330

gaa Glu

gag Glu

ccc Pro

ate He

tac Tyr 335

ate lie

gtc Val

act Thr

1125

gag Glu

tac Tyr 340

atg Met

age Ser

aag Lys

ggg Gly

age Ser 345

etc Leu

ctg Leu

gat Asp

ttc Phe

ctg Leu 350

aag Lys

gga Gly

gag Glu

atg Met

1173

ggc Gly 355

aag Lys

tac Tyr

ctg Leu

egg Arg

ctg Leu 360

cca Pro

cag Gin

etc Leu

gtc Val

gat Asp 365

atg Met

get Ala

get Ala

cag Gin

att lie 370

1221

gca Ala

tee Ser

ggc Gly

atg Met

gee Ala 375

tat Tyr

gtg Val

gag Glu

agg Arg

atg Met 380

aac Asn

tac Tyr

gtg Val

cac His

ega Arg 385

gac Asp

1269

ctg Leu

egg Arg

geg Ala

gee Ala 390

aac Asn

ate lie

ctg Leu

gtg Val

ggg Gly 395

gag Glu

aac Asn

ctg Leu

gtg Val

tgc Cys 400

aag Lys

gtg Val

1317

get Ala

gac Asp

ttt phe 405

ggg Gly

ctg Leu

gca Ala

ege Arg

etc Leu 410

ate lie

gag Glu

gac Asp

aac Asn

gag Glu 415

tac Tyr

aca Thr

gca Ala

1365

egg Arg

caa Gin 420

ggt Gly

gee Ala

aag Lys

ttc Phe

ccc Pro 425

ate lie

aag Lys

tgg Trp

aca Thr

gee Ala 430

ccc Pro

gag Glu

gca Ala

gee Ala

1413

etc Leu 435

tat Tyr

ggc Gly

egg Arg

ttc Phe

acc Thr 440

ate Xie

aag Lys

teg Ser

gat Asp

gtc Val 445

tgg Trp

tee Ser

ttc Phe

ggc Gly

ate He 450

1461

ctg Leu

ctg Leu

act Thr

gag Glu

ctg Leu 455

acc Thr

acc Thr

aag Lys

ggc Gly

egg Arg 460

gtg Val

cca Pro

tac Tyr

cca Pro

ggg Gly 465

atg Met

1509

gtc Vai

aac Asn

agg . Arg

gag Glu 470

gtg Val

ctg Leu

gac Asp

cag Gin

gtg Val 475

gag Glu

agg Arg

ggc Gly

tac Tyr

ege Arg 480

atg Met

ccc Pro

1557

• · · · · · f • · · · ·* ·· *

17/26

tgc Cys

cog Pro

ccc Pro 485

gag Glu

tgc Cys

ccc Pro

gag Glu

teg Ser 490

ctg Leu

cat His

gac Asp

etc Leu

atg Met 495

tgc Cys

cag Gin

tgc Cys

1605

tgg

.egg

agg

gac

cct

gag

gag

egg

ccc

act

ttt

gag

tac

ctg

cag

gee

1653

Trp

Arg

Arg

Asp

Pro

Glu

Glu

Arg

Pro

Thr

Phe

Glu

Tyr

Leu

Gin

Ala

500

505

510

ttc

ctg

gag

gac

tac

ttc

acc

teg

aca

gag

ccc

cag

tac

cag

cct

gga

1701

Phe

Leu

Glu

Asp

Tyr

Phe

Thr

Ser

Thr

Glu

Pro

Gin

Tyr

Gin

Pro

Gly

515

520

525

530

gag aac eta taggeetgga gctcctcctg gaccagaggc ctcgctgtgg ggtacaggg 1759 Glu Asn Leu <210> 3 <211> 533 <212> PRT <213 > csirke <400> 3

Met Gly Ser Ser Lys Ser Lys Pro Lys Asp Pro Ser Gin Arg Arg Arg 15 1015

Ser Leu Glu Pro Pro Asp Ser Thr His His Gly Gly Phe Pro Ala Ser 20 2530

Gin Thr Pro Asn Lys Thr Ala Ala Pro Asp Thr His Arg Thr Pro Ser 35 4045

Arg Ser Phe Gly Thr Vai Ala Thr Glu Pro Lys Leu Phe Gly Gly Phe 50 5560

Asn Thr Ser Asp Thr Vai Thr Ser Pro Gin Arg Ala Gly Ala LeuAla

70 7580

Gly Gly Vai Thr Thr Phe Vai Ala Leu Tyr Asp Tyr Glu Ser ArgThr

9095

Glu Thr Asp Leu Ser Phe Lys Lys Gly Glu Arg Leu Gin Tie Vai Asn

100 105110

18/26

Asn Thr Glu Gly Asp Trp Trp Leu Ala His Ser Leu Thr Thr Gly Gin 115 120125

Thr Gly Tyr lie Pro Ser Asn Tyr Vai Ala Pro Ser Asp Ser lie Gin 130 135 '140

Ala Glu Glu Trp Tyr Phe Gly Lys lie Thr Arg Arg Glu Ser GluArg

145 150 155160

Leu Leu Leu Asn Pro Glu Asn Pro Arg Gly Thr Phe Leu Vai ArgGlu

165 170175

Ser Glu Thr Thr Lys Gly Ala Tyr Cys Leu Ser Vai Ser Asp Phe Asp 180 185190

Asn Ala Lys Gly Leu Asn Vai Lys His Tyr Lys He Arg Lys Leu Asp 195 200'205

Ser Gly Gly Phe Tyr He Thr Ser Arg Thr Gin Phe Ser Ser Leu Gin 210 215220

Gin Leu Vai Ala Tyr Tyr Ser Lys His Ala Asp Gly Leu Cvs HisArg

225 230 235 ’240

Leu Thr Asn Vai Cys Pro Thr Ser Lys Pro Gin Thr Gin Gly LeuAla

245 250255

Lys Asp Ala Trp Glu He Pro Arg Glu Ser Leu Arg Leu Glu Vai Lys 260 265270

Leu Gly Gin Gly Cys Phe Gly Glu Vai Trp Met Gly Thr Trp Asn Gly 275 280285

Thr Thr Arg Vai Ala He Lys Thr Leu Lys Pro Gly Thr Met Ser Pro 290 295300

Glu Ala Phe Leu Gin Glu Ala Gin Vai Met Lys Lys Leu Arg HisGlu

305 310 315320

Lys Leu Vai Gin Leu Tyr Ala Vai Vai Ser Glu Glu Pro He TyrHe

325 330335

Vai Thr Glu Tyr Met Ser Lys Gly Ser Leu Leu Asp Phe Leu Lys Gly

340 345350 • · · · ··· • · ··♦ »· ·

19/26

Glu

Met

Gly 355

Lys

Tyr

Leu

Arg

Leu 360

Pro

Gin

Leu

Vai

Asp 365

Met

Ala

Ala

Gin

He 370

Ala

Ser

Gly

Met

Ala 375

Tyr

Vai

Glu

Arg

Met 380

Asn

Tyr

Vai

His

Arg 385

Asp

Leu

Arg

Ala

Ala 390

Asn

He

Leu

Vai

Gly 395

Glu

Asn

Leu

Vai

Cys 400

Lys

Vai

Ala

Asp

Phe 405

Gly

Leu

Ala

Arg

Leu 410

lie

Glu

Asp

Asn

Glu 415

Tyr

Thr

Ala

Arg

Gin 420

Gly

Ala

Lys

Phe

Pro 425

lie

Lys

Trp

Thr

Ala 430

Pro

Glu

Ala

Ala

Leu 435

Tyr

Gly

Arg

Phe

Thr 440

lie

Lys

Ser

Asp

Vai 445

Trp

Ser

Phe

Gly

He 450

Leu

Leu

Thr

Glu

Leu 455

Thr

Thr

Lys

Gly

Arg 460

Vai

Pro

Tyr

Pro

Gly 465

Met

Vai

Asn

Arg

Glu 470

Vai

Leu

Asp

Gin

Vai 475

Glu

Arg

Gly

Tyr

Arg 480

Met

Pro

Cys

Pro

Pro 485

Glu

Cys

Pro

Glu

Ser 490

Leu

His

Asp

Leu

Met 495

Cys

Gin

Cys

Trp

Arg 500

Arg

Asp

Pro

Glu

Glu 505

Arg

Pro

Thr

Phe

Glu 510

Tyr

Leu

Gin

Ala

Phe 515

Leu

Glu

Asp

Tyr

Phe 520

Thr

Ser

Thr

Glu

Pro 525

Gin

Tyr

Gin

Pro Gly Glu Asn Leu

530

20/26 <210>. 4 <211? 2187 <212> DNS <213 > Homo sapiens <220>

<221>

<222i <223>

<220>

<221>

<222>

<400>

gcgccgcgtc ccgcaggccg tgatgccgcc cgcgcggagg tggcccggac cgcagtgccc 60 (1) ... (2187) humán c-SRC cDNS^

CDS (134)..(1483) caagagagct ctaatggtac caagtgacag gttggcttta ctgtgactcg gggacgccag 120

agctcctgag aag atg tea gca ata cag gee gee tgg cca tee ggt aca	169
	Met : 1	Ser Ala	He Gin Ala Ala Trp Pro Ser Gly Thr
5	10
gaa tgt	att gee aag	tac aac	ttc cac ggc act	gee gag cag gac ctg	217
Glu Cys	lie Ala Lys 15	Tyr Asn	Phe His Gly Thr 20	Ala Glu Gin Asp Leu 25
ccc ttc	tgc aaa gga	gac gtg	etc ace att gtg	gee gtc acc aag gac	265
Pro Phe 30	Cys Lys Gly	Asp Vai 35	Leu Thr He Vai	Ala Vai Thr Lys Asp 40
ccc aac	tgg tac aaa	gee aaa	aac aag gtg ggc	cgt gag ggc ate ate	313
Pro Asn 45	Trp Tyr Lys	Ala Lys 50	Asn Lys Vai Gly 55	Arg Glu Gly He He 60
cca gee	aac tac gtc	cag aag	egg gag ggc gtg	aag geg ggt acc aaa	361
Pro Ala	Asn Tyr Vai 65	Gin Lys	Arg Glu Gly Vai 70	Lys Ala Gly Thr Lys 75
etc age	etc atg cct	tgg ttc	cac ggc aag ate	aca egg gag cag get	409
Leu Ser	Leu Met Pro 80	Trp Phe	His Gly Lys He 85	Thr Arg Glu Gin Ala 90

gag G1U	egg Arg	ett Leu 95	ctg Leu	tac Tyr	ccg Pro	ccg Pro	gag Glu 100	aca Thr
age	acc	aac	tac	ccc	gga	gac	tac	acg
Ser	Thr 110	Asn	Tyr	Pro	Gly	Asp 115	Tyr	Th?
aag	gtg	gag	cac	tac	cgc	ate	atg	tac
Lys 125	Val	Glu	His	Tyr	Arg 130	lie	Met	Tyr
gac	gag	gag	gtg	tac	ttt	gag	aac	etc
Asp	Glu	Glu	Val	Tyr 145	Phe	G1U	Asn	Leu
acc	tea	gac	gca	gat	gga	etc	tgt	acg
Thr	Ser	Asp	Ala 160	Asp	Gly	Leu	Cys	Thr 165
atg	gag	ggc	aca	gtg	geg	gcc	cag	gat
Met	Glu	Gly 175	Thr	Val	Ala	Ala	Gin 100	Asp
gcc	ctg	aac	atg	aag	gag	ctg	aag	ctg
Ala	Leu 190	Asn	Met	Lys	Glu	Leu 195	Lys	Leu
gag	“ttc	gga	gac	gtg	atg	ctg	ggc	gat
Glu 205	Phe	Gly	Asp	Val	Met 210	Leu	Gly	Asp
gtc	aag	tgc	att	aag	aac	gac	gcc	act
Vai	Lys	Cys	lie	Lys 225	Asn	Asp	Ala	Thr
gcc	tea	gtc	atg	acg	caa	ctg	egg	cat
Ala	Ser	Val	Met 240	Thr	Gin	Leu	Arg	His 245

--	. ,Ρ·Ρ _- ·' < ''i	• · · · · · · · ··· *·· ··· * 21/26
ctg	ttc ctg gtg egg	gag 457
Leu	Phe Leu Val Arg 105	Glu
tgc	gtg age tgc gac	ggc 505
Cys	Val Ser Cys Asp 120	Gly
gcc	age aag etc age	ate 553
Ala 135	Ser Lys Leu Ser	He 140
cag	ctg gtg gag cac	tac 601
Gin	Leu Val Glu His 155	Tyr
etc	att aaa cca aag	gtc 649
Leu	He Lys Pro Lys 170	Val
ttc	tac cgc age ggc	tgg 697
Phe	Tyr Arg Ser Gly 185	Trp
cag	acc ate ggg aag	ggg 745
Gin	Thr He Gly Lys 200	Gly
ega	ggg aac aaa gtc	gcc 793
Arg 215	Gly Asn Lys Val	Ala 220
cag	gcc ttc ctg get	gaa 841
Gin	Ala Phe Leu Ala 235	Glu
aac	ctg gtg cag etc	ctg 889
Asn	Leu Val Gin Leu 250	Leu

· · · ··· ······ ·· <

22/26

ggc Gly

gtg Val

ate He 255

gt/ Val

gag Glu

gag Glu

aag Lys

ggc Gly 260

ggg Gly

etc Leu

tac Tyr

ate He

gtc val 265

act Thr

gag Glu

tac Tyr

937

atg Met

gcc Ala 270

aag Lys

ggg Gly

age Ser

ett Leu

gtg Val 275

gac Asp

tac Tyr

ctg Leu

egg Arg

tet Ser 280

agg Arg

ggt Gly

egg Arg

tea Ser

985

gtg Vai 285

ctg Leu

ggc Gly

gga Gly

gac Asp

tgt Cys 290

etc Leu

etc Leu

aag Lys

ttc Phe

teg Ser 295

eta Leu

gat Asp

gtc Val

tgc Cys

gag Glu 300

1033

gcc Ala

atg Met

gaa Glu

tac Tyr

ctg Leu 305

gag Glu

ggc Gly

aac Asn

aat Asn

ttc Phe 310

gtg Val

cat His

ega Arg

gac Asp

ctg Leu 315

get Ala

1081

gcc Ala

cgc Arg

aat Asn

gtg Val 320

ctg Leu

gtg Val

tet Ser

gag Glu

gac Asp 325

aac Asn

gtg Val

gcc Ala

aag Lys

gtc Val 330

age Ser

gac Asp

1129

ttt Phe

ggt Gly

etc Leu 335

acc Thr

aag Lys

gag Glu

geg Ala

tec Ser 340

age Ser

acc Thr

cag Gin

gac Asp

acg Thr 345

ggc Gly

aag Lys

ctg Leu

1177

cca Pro

gtc Val 350

aag Lys

tgg Trp

aca Thr

gcc Til a

cct Pro 355

gag Glu

gcc Ala

ctg Leu

aga Arg

gag Glu 360

aag Lys

aaa Lys

ttc Phe

tec Ser

1225

act Thr 365

aag Lys

tet Ser

gac Asp

gtg Val

tgg Trp 370

agt Ser

ttc Phe

gga Gly

ate lie

ett Leu 375

etc Leu

tgg Trp

gaa Glu

ate He

tac Tyr 380

1273

tcc Ser

ttt Phe

ggg Gly

ega Arg

gtg Val 385

cct Pro

tat Tyr

cca Pro

aga Arg

att lie 390

ccc Pro

ctg Leu

aag Lys

gac Asp

gtc Val 395

gtc Val

1321

cct Pro

egg Arg

gtg Val

gag Glu 400

aag Lys

ggc Gly

tac Tyr

aag Lys

atg Met 405

gat Asp

gcc Ala

ccc Pro

gac Asp

ggc Gly 410

tgc Cys

ccg Pro

1369

23/26

ccc Pro

gca Ala

gtc Vai 415

tat Tyr

gaa Glu

gtc Vai

atg Met

aag Lys 420

aac Asn

tgc Cys

tgg Trp

cac His

ctg Leu 425

gac Asp

gcc Ala

gcc Ala

1417

atg Met

egg Arg 430

ccc Pro

tcc Ser

ttc Phe

eta Leu

cag Gin 435

etc Leu

ega Arg

gag Glu

cag Gin

ett Leu 440

gag Glu

cac His

ate He

aaa Lys

1465

acc cac gag ctg cac ctg tgacggctgg cctccgcctg ggtcatgggc

Thr His Glu Leu His Leu

445 _; ⁴⁵⁰

ctgtggggac	tgaacctgga	agatcatgga	cctggtgccc	ctgctcactg	ggcccgagcc	1573
tgaaetgage	cccagcgggc	tggcgggcct	ttttcctgcg	tcccagcctg	cacccctccg	1633
gccccgtctc	tcttggaccc	acctgtgggg	cctggggagc	ccactgaggg	gccagggagg	1693
aaggaggcca	eggageggga	ggcagcgccc	caccacgtcg	ggcttccctg	gcctcccgcc	1753
actcgccttc	ttagagtttt	attcctttcc	ttttttgaga	ttttttttcc	gtgtgtttat	1813
tttttattat	ttttcaagat	aaggagaaag	aaagtaccca	gcaaatgggc	attttacaag	1873
aagtaegaat	cttatttttc	ctgtcctgcc	cgtgagggtg	ggggggaccg	ggcccctctc	1933
tagggacccc	tcgccccagc	ctcattcccc	attctgtgtc	ccatgtcccg	tgtctcctcg	1993
gtcgccccgt	gtttgcgctt	gaccatgttg	cactgtttgc	atgcgcccga	ggcagacgtc	2053
tgtcaggggc	ttggatttcg	tgtgccgctg	ccacccgccc	acccgccttg	tgagatggaa	2113
ttgtaataaa	ccacgccatg	aggacaccgc	cgcccgcctc	ggcgcttcct	ccaccgaaaa	2173
						2187
aaaaaaaaaa	aaaa

<210> 5 <211> 450 < 212> PRT < 213> Homo sapiens < 400> 5 . _ _{Prn Ser} qi_v Thr Glu Cys He Ala

Met Ser Ala He Gin Ala Ala Trp Pro Ser Giy ¹⁰ _Lys Tyr Asn Phe Bls Gly Thr Al. Olu Gin Asp Len Pro Phe Cys Lys 20 ²⁵ • · · · *·· *«···· «Λ ·

24/26

Gly Asp Vai Leu Thr He Vai Ala 35

Lys Ala Lys Asn Lys Vai Gly Arg 50

Vai Gin Lys Arg Glu Gly Vai Lys 65

Pro Trp Phe His Gly Lys He Thr 85

Tyr Pro Pro Glu Thr Gly Leu Phe 100

Pro Gly Asp Tyr Thr Leu Cys Vai 115

Tvr Arg He Met Tyr His Ala Ser 130I

Tyr Phe Glu Asn Leu Met Gin Leu

145150

Asp Gly Leu Cys Thr Arg Leu lie 165

Vai Ala Ala Gin Asp Glu Phe Tyr 180

Lys Glu Leu Lys Leu Leu Gin Thr 195200

Vai Met Leu Gly Asp Tyr Arg Gly 210215

Lys Asn Asp Ala Thr Ala Gin Ala

225230

Thr Gin Leu Arg His Ser Asn Leu 245

Glu Glu Lys Gly Gly Leu Tyr He 260 val Thr Lys Asp Pro Asn Trp Tyr 45

Glu Gly He He Pro Ala Asn Tyr 60

Ala Gly Thr Lys Leu Ser Leu Met 7580

Arg Glu Gin Ala Glu Arg Leu Leu 9095

Leu Val Arg Glu Ser Thr Asn Tyr 105

Sgi* Cys Asp Gly Lys Val Glu His 125

Lys Leu Ser He Asp Glu Glu Val 140

Val Glu His Tyr Thr Ser Asp Ala 155150

Lys Pro Lys Val Met Glu Gly Thr 170I

Arg Ser Gly Trp Ala Leu Asn Met

185190

He Gly Lys Gly Glu Phe Gly Asp 205

Asn Lys Val Ala Val Lys Cys lie 220

Phe Leu Ala Glu Ala Ser Val Met 235240

Val Gin Leu Leu Gly Val lie Val 250255

Val Thr Glu Tyr Met Ala Lys Gly 265270

Λ W · » · · * *

25/26

Ser Leu Val Asp Tyr Leu Arg Ser 275280

Asp Cys Leu Leu Lys Phe Ser Leu 290295

Leu Glu Gly Asn Asn Phe Val His 305310

Leu Val Ser Glu Asp Asn Val Ala 325

Lys Glu Ala Ser Ser Thr Gin Asp 340

Thr Ala Pro Glu Ala Leu Arg Glu 355360

Val Trp Ser Phe Gly He Leu Leu 370375

Val Pro Tyr Pro Arg He Pro Leu

385390

Lys Gly Tyr Lys Met Asp Ala Pro 405

Glu Val Met Lys Asn Cys Trp His 420

Phe Leu Gin Leu Arg Glu Gin Leu 435 440

His Leu

450

Arg Gly Arg Ser Val Leu Gly Gly 285

Asp Val Cys Glu Ala Met Glu Tyr 300

Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val 315320

Lys Val Ser Asp Phe Gly Leu Thr 330335

Thr Gly Lys Leu Pro Val Lys Trp 345350

Lys Lys Phe Ser Thr Lys Ser Asp 365

Trp Glu He Tyr Ser Phe Gly Arg 380

Lys Asp Val Val Pro Arg Val Glu 395400

Asp Gly Cys Pro Pro Ala Val Tyr 410415

Leu Asp Ala Ala Met Arg Pro Ser 425430

Glu His He Lys Thr His Glu Leu 445

26/26 < 210> 6 < 211> 14 < 212>.PRT < 213 > Mesterséges szekvencia <220>

<223> a mesterséges szekvencia leírása: 9E10-myc epitóp toldat <400> 6

Val Asp Met Glu Gin Lys Leu He Ala Glu Glu Asp Leu Asn 15 10

Claims (38)

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Kiszerelés, amely csomagolóanyagból és valamely gyógyászati kompozícióból áll az említett csomagolóanyagon belül, ahol az említett gyógyászati kompozíció képes módosítani az angiogenezist valamely betegségi állapottal társult szövetben, és ahol az említett csomagolóanyag jelölést tartalmaz, amely azt jelzi, hogy az említett gyógyászati konstrukció alkalmazható betegségi állapotok kezelésére az angiogenezis módosításával, és ahol az említett gyógyászati kompozíció valamely Src fehérjét tartalmaz vagy egy, az említett fehérje expresszálására képes nukleotiddal bíró oligonukleotidot.

2. Az 1. igénypont szerinti kiszerelés, ahol az említett Src fehérje aktív Src fehérje és az említett módosítás angiogenezis gerjesztése.

3. A 2. igénypont szerinti kiszerelés, ahol az említett aktív Src fehérje Src A.

4. A 2. igénypont szerinti kiszerelés, ahol az említett szövetnek gyenge vérkeringése van.

5. Az 1. igénypont szerinti kiszerelés, ahol az említett Src tirozin kináz fehérje inaktív Src fehérje és az említett módosítás angiogenezis gátlása.

6. Az 5. igénypont szerinti kiszerelés, ahol az említett inaktív Src fehérje Src 251 vagy Src K295M.

7. Az 5. igénypont szerinti kiszerelés, ahol az említett szövet gyulladásban van és az említett állapot artritisz vagy reumatoid artritisz.

8. Az 5. igénypont szerinti kiszerelés, ahol az említett szövet szilárd tumor vagy szilárd tumor áttétel.

9. A 8. igénypont szerinti kiszerelés, ahol az említett beadás kemoterápiával együtt történik.

10. Az 5. igénypont szerinti kiszerelés, ahol az említett szövet retina szövet és az említett állapot retinopátia, diabeteszes retinopátia vagy pigment degeneráció.

11. Az 5. igénypont szerinti kiszerelés, ahol az említett szövet koszorúér angoplasztika helyén található és az említett állapot resztenózis.

12. Az 1. igénypont szerinti kiszerelés, ahol az említett beadás magában foglal intravénás, intraszinoviális, intramuszkuláris vagy orális beadást.

13. Az 1. igénypont szerinti kiszerelés, ahol az említett beadás egyetlen dózis intravénás beadását jelenti.

14. Az 1. igénypont szerinti kiszerelés, ahol az említett gyógyászati kompozíció tartalmaz még liposzómákat is.

15. Az 1. igénypont szerinti kiszerelés, ahol az említett gyógyászati kompozíció valamely, az említett nukleotid szekvencia expresszálására képes vírus expressziós vektort tartalmaz.

68 ¢7

16. Az 1. igénypont szerinti kiszerelés, ahol az említett gyógyászati kompozíció valamely, az említett nukleotid szekvencia expresszálására képes nem-vírus expressziós vektort tartalmaz.

17. Eljárás angiogenezis módosítására betegségi állapottal társult szövetben azzal jellemezve, hogy az említett szövetbe bevezetünk egy Src fehérjét vagy az említett fehérjét expresszálni képes nukleotid szekvenciát tartalmazó kompozíciót.

18. A 17. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett Src fehérje aktív Src fehérje és az említett módosítás angiogenezis gerjesztése.

19. A 18. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett aktív Src fehérje Src A.

20. A 18. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett szövetnek gyenge vérkeringése van.

21. A 17. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett Src fehérje inaktív Src fehérje és az említett módosítás angiogenezis gátlása.

22. A 21. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett inaktív Src fehérje Src 251 vagy Src K295M.

23. A 21. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett szövet gyulladásban van és az említett állapot artritisz vagy reumatoid artritisz.

24. A 21. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett szövet szilárd tumor vagy szilárd tumor áttétel.

25. A 24. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett beadást kemoterápiával együtt hajtjuk végre.

26. A 21. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett szövet retina szövet és az említett állapot retinopátia, diabeteszes retinopátia vagy pigment degeneráció.

27. A 21. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett szövet koszorúér angioplasztika helyén található és az említett állapot resztenózis.

28. A 17. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy intravénás, intraszinoviális, intramuszkuláris vagy orális beadást végzünk.

29. A 17. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy egyetlen dózisban, intravénásán végezzük a nevezett beadást.

30. A 17. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett gyógyászati kompozíció tartalmaz még liposzómákat is.

31. A 17. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett gyógyászati kompozíció valamely, az említett nukleotid szekvencia expresszálására képes vírus expressziós vektort tartalmaz.

32. A 17. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az említett gyógyászati kompozíció valamely, az említeit nukleotid szekvencia expresszálására képes nem-vírus expressziós vektort tartalmaz.

33. Gyógyászati kompozíció angiogenezis stimulálására emlős célszövetekben, amely egy nukleinsavat tartalmazó vírus gén átvivő vektort és egy gyógyászatilag elfogadható hordozóvagy töltőanyagot tartalmaz; az említett nukleinsavnak van egy olyan szegmense, amely egy Src fehérjét kódol, ahol az említett Src fehérje az 527. kodonnál bármely aminosav gyökkel bírhat tirozin, szerin vagy treonin kivételével.

34. Gyógyászati kompozíció angiogenezis stimulálására emlős célszövetekben, amely egy nukleinsavat tartalmazó nem-vírus gén átvivő vektort és egy gyógyászatilag elfogadható hordozóvagy töltőanyagot tartalmaz; az említett nukleinsavnak van egy olyan szegmense, amely egy Src fehérjét kódol, ahol az említett Src fehérje az 527. kodonnál bármely aminosav gyökkel bírhat tirozin, szerin vagy treonin kivételével.

35. Gyógyászati kompozíció angiogenezis gátlására emlős célszövetekben, amely egy nukleinsavat tartalmazó vírus gén átvivő vektort és egy gyógyászatilag elfogadható hordozóvagy töltőanyagot tartalmaz; az említett nukleinsavnak van egy olyan nukleinsav szegmense, amely Src fehérjét kódol, ahol az említett Src fehérje kináz aktivitással nem rendelkezik.

36 Gyógyászati kompozíció angiogenezis gátlására emlős célszövetekben, amely egy nukleinsavat tartalmazó nem-vírus

gén átvivő vektort és egy gyógyászatilag elfogadható hordozóvagy töltőanyagot tartalmaz; az említett nukleinsavnak van egy olyan nukleinsav szegmense, amely Src fehérjét kódol, ahol az említett Src fehérje kináz aktivitással nem rendelkezik.

37. Gyógyászati kompozíció angiogenezis stimulálására valamely emlős célszövetben, amely kompozíció terápiás mennyiségű Src fehérjét tartalmaz valamely gyógyászatilag elfogadható hordozóban vagy töltőanyagban; az említett Src fehérje bármely aminosavat tartalmazhat az 527. kodonnál tirozin, szerin vagy treonin kivételével.

38. Gyógyászati kompozíció angiogenezis gátlására emlős célszövetben, amely kompozíció valamely Src fehérjét tartalmaz valamely gyógyászatilag elfogadható hordozóban vagy töltőanyagban; az említett Src fehérje nem rendelkezik kináz aktivitással.

„„ _Λ „ advofatent szabadaími és védjegy iroda KŐVÁRI GYÖRGY szabíidíünii ügyvivő

ÍOH Buífepest, Fő 19