HUP0400005A2 - Oszteopontin alkalmazása neurológiai megbetegedések gyógykezelésére és/vagy megelőzésére - Google Patents

Description

ΊΚ

Oszteopontin alkalmazása neurológiai megbetegedések gyógykezelésére és/vagy megelőzésére

KÖZZÉTÉTELI PÉLDÁNY

A találmány tárgya általánosságban neurológiai megbetegedésekkel és rendellenességekkel kapcsolatos. A találmány tárgyát közelebbről idegsejt-védelem (neuroprotekció), ideg mielinizáció és mielintermelő sejtek előállítása vagy regenerációja képezi. A találmány tárgyát még közelebbről demielinizációval járó és neurodegeneratív megbetegedések, neuropátiák, traumás idegsérülések, stroke (szélütés) és veleszületett metabolikus zavarok által okozott neurológiai betegségek képezik. Még közelebbről, a találmány tárgyát oszteopontin vagy oszteopontin-agonista vegyület neurológiai megbetegedés gyógykezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló gyógyszer előállítására történő alkalmazása képezi.

Az idegi mielinizáció alapvető szerepet játszik a központi idegrendszer („central nervous system”, CNS) és a perifériás idegrendszer („peripher^ nervous system”, PNS) kialakulásában és működésében. Az axonok körüli mielinhüvely nélkülözhetetlen az idegi ingerületvezetéshez. A mielinhüvely-sérülés számos megbetegedés kísérőjelensége, ilyenek pl. a központi idegrendszert érintő szklerózis multiplex (SM), a Guillain-Barré-szmdróma és a CIDP stb. [Abramsky és Ovadia (1997); Trojaborg (1998); Hartung és mtsai. (1998)]. A különböző okok, pl. fertőző ágensek vagy autoimmun kórképek következtében kialakuló demielinizációs kórképek idegi funkciócsökkenéssel járnak, ami bénuláshoz és halálhoz vezethet. A jelenleg elérhető gyógyászati hatóanyagok szklerózis multiplex esetében csökkentik a gyulladásos epizódok súlyosságát és lassítják a kórkép rosszabbodását, de szükség lenne olyan terápiás eljárásokra is, amelyek remielinizációhoz és az idegi funkció visszaállításához vezetnek [Abramsky és Ovadia (1997); Pohlau és mtsai. (1998)].

A heveny behatások, pl. trauma, hipoxia és isémia miatti központi idegrendszeri károsodás az idegsejteket és a fehérállományt egyaránt érintheti. Bár a legtöbb figyelem az idegsejt-elhaláshoz vezető folyamatokra koncentrálódik, egyre több tény utal arra, hogy az axonok mielinizációját végző oligodendrociták károsodása szintén fontos összetevője a központi idegrendszeri sérüléseknek. Patkányokban pl. a stroke-ot követően nagyon korán (3 órával) ki lehetett mutatni az oligodendrociták károsodását, így az említett sejtek az idegsejteknél is érzékenyebbek az excitotoxikus eredetű károsodásra [Pantoni és mtsai. (1996)]. A sejtelhalás egyik potenciális előidézője a glutamát-koncentráció jelentős emelkedése, ami számos heveny központi idegrendszeri sérülés velejárója [Lipton és mtsai. (1994)]. Az idegsejtek mellett az oligodendrocitákról is bebizonyosodott, hogy az AMPA/kainát altípusba tartozó funkcionális

-2glutamátreceptorokat expresszálnak. Az oligodendrociták emellett a glutamát-adagolással szemben is sérülékenynek bizonyultak [McDonald és mtsai. (1998)].

Trauma alatt az ideg károsodását vagy sérülését értjük. A trauma lehet gerincvelőt érintő, amely esetben a sérülés helyének megfelelően és attól lefelé eső területeken szabályozott idegi funkciók, többek között az izommozgatas es az erzekeles károsodása alakul ki, vagy lehet pl. zárt fejsérülést követő agykárosodás.

Agyi hipoxia alatt szűkebb értelemben az agyféltekék oxigénhiányos állapotai értjük, de ezt a kifejezést jellemzően a teljes agy oxigénhiányos állapotának megnevezésére alkalmazzák. A hipoxia súlyosságától függően a klinikai tünetek a zavarodottságtól a visszafordíthatatlan agykárosodásig, kómáig és halálig terjedhetnek.

A stroke oka általában agyi isémia. Ezt a kórképet agyér-megbetegedésnek vagy -balesetnek („cerebrovascular disease or accident”) is nevezik. Olyan, funkciókieséssel járó agyelváltozások csoportját jelöli, amely bármely agyterület vérellátásának megszakadása következtében alakul ki. Az agy a vérkeringésben található vér mintegy 20%-át igényli. Az agy elsődleges vérellátását a nyakban futó két verőér (artéria carotis) biztosítja, amelyekből az agy állományában leágazódó artériák egy-egy meghatározott agyterület vérellátásáért felelnek. Már a vérellátás rövid ideig tartó megszűnése is agyi funkciócsökkenést (idegi deficitet) okozhat. Ennek tünetei az érintett agyterülettől függően változhatnak és gyakran látászavarban, beszédzavarban, egyes testrészek esetében csökkent mozgás- és érzékelési képességben vagy különböző fokú eszméletvesztésben nyilvánulnak meg. Ha a vérellátás hiánya néhány másodpercnél hosszabb ideig tart, az érintett agyterületen lévő sejtek elpusztulnak (infarktus), ami a terület visszafordíthatatlan károsodását okozza es akar halálhoz is vezethet.

A stroke minden 1000 személy közül 4-et érint. A fejlett országok többségében, ideértve az Amerikai Egyesült Államokat, ez a harmadik leggyakoribb halálok. A stroke előfordulási gyakorisága az életkor előrehaladtával drámai mértékben fokozódik, 35 éves kor felett a veszélye tízévenként megduplázódik. A 65 éves kor feletti személyek mintegy 5%-a legalább egy stroke-on már átesett. A megbetegedés férfiakban gyakrabban fordul elő.

Amint említettük, stroke esetén egyes agyterületek vérellátásának zavara miatt kialakult agyi funkciócsökkenés (idegi deficit) tapasztalható. Az agyi funkciócsökkenes függ az érintett területtől, a károsodás mértékétől és a rendellenesség okától. A stroke oka lehet pl. csökkent vérátáramlás (isémia), ami az érintett területen a szövetek hiányos vérellátását és elhalását idézi elő (infarktus). Az isémiás stroke oka lehet pl. az agybeli vérerekben képződött véralvadék (trombus), vagy az egyéb helyről az agyba kerülő véralvadék, ateroszklerozisos φ · ·· ·· · *»

-3plakkrészlet vagy egyéb anyag (embolus). Az agybeli vérzés a stroke-hoz hasonló tüneteket idézhet elő.

A stroke leggyakrabban ateroszklerózis következtében, másodlagosan alakul ki (agyi trombózis). Ateroszklerózis („az artériák falának megkeményedése”) során az artériákat bélelő sejtrétegben zsírlerakódás jön létre, aminek következtében ateroszklerotikus plakk (zsírt és vérlemezkéket tartalmazó anyag) keletkezik. Az artéria elzáródása lassan alakul ki. Az ateroszklerotikus plakkok nem szükségszerűen vezetnek stroke-hoz. A különböző agyi artériák között nagyszámú kis vérér alkotta összeköttetés van jelen. A vérátáramlás fokozatos csökkenése esetén ezek a kis erek megnőnek és segítségükkel a vér „kikerüli” az elzáródott területet (kollaterális vérkeringés). Amennyiben a kollaterális vérkeringés kielégítő verátáramlast képes biztosítani, még egy artéria teljes elzáródása sem okoz idegi funkciózavart. További védekezési lehetőséget biztosít az agynak, hogy a vérerei átmérőjűknek köszönhetően még 75%-os elzáródásuk esetén is elegendő mennyiségű vért juttatnak az általuk ellátott agyterületre.

A trombózisos stroke idős emberekben a leggyakoribb, a probléma hátterében legtöbbször ateroszklerózisos szívbetegség vagy cukorbetegség áll. Ez a stroke típus bármikor, meg nyugalomban is előfordulhat. Az érintett személy elveszítheti az öntudatát, de eszméleténél is maradhat.

Az embólia (pl. az érpályában utazó vérrög) által kiváltott stroke a leggyakrabban szíveredetű embólia következménye, ebben az esetben a szívrendellenesség miatt keletkező vérrögök (embólusok) az agyba jutnak. Az embólusok más területekről is származhatnak, különösen gyakran erednek pl. ateroszklerotikus plakkokból. Az embólus a vérárammal az agyba jut, ahol megakad egy kis artériában. Az ilyen típusú stroke hirtelen jelentkezik és azonnal maximális mértékű neurológiai deficitet okoz. Az ilyen típusú stroke nem függ a személy aktivitásának mértékétől és bármikor előfordulhat. Ennél a kórképnél gyakran figyelhetők meg szívritmuszavarok, amelyek sok esetben az embólus okozóinak tekinthetők. Az agykárosodás sok esetben súlyosabb, mint az agyi trombózis okozta stroke esetében. A páciens elveszítheti az öntudatát, de eszméleténél is maradhat. Az elváltozás súlyosabb kimenetelű, ha a stroke által károsított vérerek megrepednek és vérzés indul ki belőlük (vérzéses stroke).

A perifériás neuropátia az érzékelés hiányával, izomgyengeséggel és -sorvadással, a mély ínreflexek gyengülésével, valamint vazomotorikus tünetekkel jellemezhető szindróma. Az említett tünetek külön-külön vagy bármely kombinációban egyaránt előfordulhatnak.

Az utóbbi betegség érinthet egy ideget (mononeuropátia), különálló helyeken lévő két vagy több ideget (többszörös mononeuropátia) vagy egyidejűleg sok ideget (pohneuropatia). Elsődleges károsodást szenvedhet az axon (pl. cukorbetegségben, Lyme-kórban, urémiában

-4vagy toxikózisban), vagy a mielinhüvely vagy a Schwann-sejtek (pl. heveny vagy idült gyulladásos polineuropátiában, leukodisztrófiákban vagy Guillain-Barré-szindrómában). A kisméretű, velőhüvely nélküli vagy velőhüvelyes idegrostok károsodása elsősorban hőmérséklet és fájdalomérzet kiesésben nyilvánul meg, a nagyméretű velőhüvelyes idegrostok sérülése a mozgató vagy proprioceptív működést károsítja. Egyes (pl. ólommérgezés, dapson mérgezés, kullancscsípés, porfíria vagy Guillain-Barré-szindróma következtében kialakuló) neuropátiák elsősorban a mozgatórostokat károsítják, míg a más okból (pl. rákos eredetű dorsalis gyökér ganglionitis, lepra, AIDS, cukorbetegség vagy idült piridoxin-toxikózis) létrejövő elváltozások elsődlegesen a dorsalis gyökérbeli ganglionokra vagy érzörostokra teijednek ki, érzékelésbeli problémákat okozva. Esetenként a cranialis idegek érintettsége is megfigyelhető (pl. Guillain-Barré-szindrómában, Lyme-kórban, cukorbetegségben, diftériában). Az érintett területek azonosítása elősegíti a kórok meghatározását.

Egy különálló ideg leggyakrabban traumás hatás következtében sérülhet. A rendkívül erős izommunka vagy egy ízület erőszakos túlnyújtása helyi neuropátiát idézhet elő, de hasonló eredménnyel járhatnak ismétlődő, kisfokú traumás hatások is (pl. kisméretű szerszámok megszorítása, légkalapács használatához kapcsolódó erőteljes vibráció stb.). A nyomási vagy becsípődéses eredetű bénulás elsősorban a csontos kiemelkedések felett (pl. sovány vagy senyves és főként alkoholista személyeknél mély alvás vagy altatás során), vagy szűk csatornákban (pl. carpalis alagút szindrómában) futó felületes (ulnaris, radiális, peronealis) idegeket érinti. Nyomási bénulást eredményezhetnek továbbá a daganatok, a hyperostosis, a gipszek, a mankók vagy az elhúzódó görcsös testtartás (pl. kertészkedés közben). Az idegbeli vérzés és a hideg környezet vagy a besugárzás szintén neuropátiát eredményezhet. Mononeuropátiát eredményezhet pl. egy daganat közvetlen ráteijedese is.

A multiplex mononeuropátia rendszerint kollagén eredetű érbetegségek (pl. polyarteritis nodosa, SLE, Sjörgen-szindróma, RA), sarcoidosis, metabolikus megbetegedések (cukorbetegség, amyloidosis) vagy fertőző betegségek (Lyme-kór, HÍV fertőzés) következteben alakul ki. Multiplex mononeuropátiát okozhatnak például mikroorganizmusok is az idegbe történő közvetlen beszaporodásukkal is (pl. lepra eseteben).

A heveny lázas megbetegedések miatt kialakuló polineuropátia toxinhatás (pl. diftéria esetében) vagy autoimmun reakció (pl. Guillain-Barré-szindrómában) eredménye egyaránt lehet, az esetenként immunizálást követően megfigyelhető polineuropátia valószínűleg szinten autoimmun reakció eredménye.

A toxikus ágensek általában polineuropátiát idéznek elő, de esetenként mononeuropátiát is okozhatnak. Ilyen anyagok pl. az emetin, a hexobarbitál, a barbitál, a klórbutanol, a

-5szulfonamidok, a fenitoin, a nitofurantoin, a vinka alkaloidok, a nehézfémek, a szénmonoxid, a triortokrezil-foszfát, az ortodinitrofenol, számos oldószer, egyéb ipari eredetű mérgek és bizonyos AIDS elleni hatóanyagok (pl. a zalcitabin és a didanozin).

A hiánybetegségek és a metabolikus zavarok is polineuropátia előidézői lehetnek. A B-vitamin-hiány gyakori oka a polineuropátiának (pl. alkoholizmus, beriberi, vészes vérszegénység, izoniazid okozta piridoxin-hiány, maiabszorpciós szindrómák és terhesség alatti vészes hányás esetében). Polineuropátiával járhat még a hypothyreosis, a porfíria, a szarkoidózis, az amiloidózis és az urémia is. A cukorbetegség a leggyakrabban az érző- mozgató idegekre kiterjedő distalis polineuropátiát okoz, emellett multiplex mononeuropátiát és helyi mononeuropátiát is előidézhet (pl. a szemmozgató és a cranialis abducens idegek esetében).

A rosszindulatú daganatok okozta polineuropátia származhat monoklonális gammopátiából (myeloma multiplex, limfóma), amyloid lerakódásból, táplálkozási eredetű hiánybetegségből vagy ún. paraneoplasztikus szindróma része lehet.

Specifikus mononeuropátiák. Az egy vagy több idegre kiterjedő mononeuropátiákra az érintett ideg lefutásának megfelelően jelentkező fájdalom, gyengeség és fonákérzés jellemző. A multiplex mononeuropátia aszimmetrikus megjelenésű, az idegek károsodása egy időben vagy progresszíven egyaránt jelentkezhet. Nagyszámú ideg érintettsége polineuropátiához hasonló kórképet idéz elő.

Az ulnaris ideg bénulása az ismételt könyöklés miatt vagy gyermekkori törést követő aszimmetrikus csontnövekedés következtében a könyék ulnaris barázdájában futó ideget ért trauma (késői ulnaris bénulás) eredménye lehet. A nervus ulnaris a könyökcsatomában is összenyomódhat. A sérülés következtében az 5. ujjban és a 4. ujj mediális felében fonákérzés és hiányos érzékelés alakul ki, a hüvelykujj közelítő izma, az 5. ujj tavolító izma es a mm. interossei gyengék és sorvadtak. A súlyos fokú idült ulnaris bénulás ún. „karomállás” kialakulását vonja maga után. A sérülés helye ideg ingerületvezetési vizsgálatokkal határozható meg. A műtéti helyreállítás előtt konzervatív kezelést kell megkísérelni.

A carpalis alagút szindróma a nervus medianusnak a haránt irányú felületes kéztőszalag és az alkar kézhajlító izmainak hosszirányú inai közötti, a csukló tenyér felőli részén bekövetkező összenyomatásának következménye. Az elváltozás egy- és kétoldali egyaránt lehet. Az ideg összenyomatása a kéz radiális-palmáris részén fonákérzést, a csuklóban és a tenyérben pedig fájdalmat idéz elő. Esetenként a fájdalom az összenyomatás helyétől proximálisan, az alkarban és a vállbán is jelentkezik. A fájdalomérzés éjjel felerősödhet. A szindróma következtében az első három ujj palmáris részén érzékelésvesztés jelentkezhet, a hüvelykujj távoli-6tását és szembefordítását végző izmok gyengék és sorvadtak lehetnek. Az említett szindrómát el kell különíteni a nyaki ideggyökér-bántalom miatt kialakuló C6-gyökér összenyomatástól.

A nervus peroneus bénulásának oka rendszerint az idegnek a fibula nyakának laterális részéhez nyomódása. Leggyakrabban senyves, ágyhoz kötött betegekben és megszokásból labukat keresztbe tevő sovány személyekben fordul elő. A bántalom következtében a lábfej felemelés gyengülése és lábfejlelógás alakul ki. Esetenként érzékelésvesztés is kialakulhat az alsó lábszár anterolaterális részén és a lábfejen, vagy az 1. és 2. metatarsalis csont közötti részen. A terápia az összenyomatásos eredetű neuropátia esetében általában konzervatív (a láb keresztbetéteiének kerülése). Az inkomplett neuropátiák általában spontán gyógyulnak. A gyógyulás elmaradása esetén műtéti feltárasra lehet szükség.

A nervus radiális bénulása („szombat esti bénulás”) az idegnek a karcsonthoz nyomódásából származik, pl. ha a kar mérgezés vagy mély alvás során egy szék támlájára fekszik. Tünetei közé tartozik a csukló és az ujjnyújtó izmok gyengülése (csuklólógás), es esetenként a musculus interosseus dorsalis I. dorsalis felszíne feletti érzékelésvesztés. Kezelése hasonló az összenyomatásos peroneális neuropátia esetében leírtakhoz.

A polineuropátiák viszonylag szimmetrikusan jelentkeznek, gyakran egy időben érintenek érzékelő, mozgató és érmozgató idegrostokat. Kiterjedhetnek az axonhengerre vagy a velőshüvelyre, bármely esetben lehetnek hevenyek (pl. Guillain-Barré-szindróma), vagy idültek (pl. veseelégtelenség).

A metabolikus zavarok (pl. cukorbetegség) vagy veseelégtelenség miatt kialakuló polineuropátia lassan, gyakran hónapok vagy évek alatt alakul ki. Gyakran az alsó végtagot érintő, a végtag disztális részén súlyosabb érzékelési zavarokkal kezdődik. Gyakran kifejezett perifériás bizsergés, zsibbadás, égető fájdalom, ízületi helyzetérzékelés- vagy rezgeserzekelescsökkenés jelentkeznek. A fájdalom éjszaka felerősödik és fokozódik az érintett terület megérintésekor vagy hőmérsékleti változások hatására. Súlyos esetben az érzékelés elvesztesenek jól látható jelei vannak, akiesés jellemzően „harisnya-kesztyű” eloszlású. Az Achilles- és más mély ínreflexek csökkennek vagy eltűnnek. Az érzékelés súlyos fokú csökkenésekor az ujjakon fájdalommentes fekélyek jelennek meg vagy Charcot-ízület alakul ki. Az érzékelési és helyzetérzési zavarok járásbeli rendellenességekhez vezethetnek. A mozgatóidegek érintettsége a disztális izmok gyengeségéhez és sorvadásához vezet. Az autonóm idegrendszer is érintett lehet, ami éjszakai hasmenéshez, vizelet- és bélsár-visszatartási képtelenséghez, impotenciához vagy testtartásfiiggő alacsony vérnyomáshoz vezethet. Az érmozgató idegek károsodásának tünetei változatosak. A bőr a megszokottnál halványabb és szárazabb lehet, esetenként sötéten elszíneződik, jelentősen fokozott izzadás is jelentkezhet. Súlyos fokú, elhúzódó ese^:·:·^:·γ·.? J.

-7 tekben gyakran megfigyelhetők a bor taplalasaval kapcsolatos elváltozások is (sima, fénylő bőr, egyenetlen, barázdált körmök, osteoporosis).

Hiányosan táplált és alkoholista személyekben gyakori a táplálkozási eredetű polineuropátia. A leghosszabb és legnagyobb idege esetében az elsődleges axonkárosodás másodlagos demielinizációhoz és axonpusztulashoz vezethet. Még nem tisztázott, hogy a bántalom tiamin vagy más vitamin (pl. piridoxin, pantoténsav, folsav) hiányára vezethető vissza. A pindoxinhiányos neuropátia rendszerint gümőkór elleni izoniazid kezelésben részesülő személyekben fordul elő; a piridoxinhiányos vagy piridoxinfüggő csecsemők görcsöket produkálhatnak. A disztális végtagok szimmetrikus gyengesége és sorvadása rendszerint nehezen észrevehető, de gyorsan rosszabbodhat, esetenként ezt érzékelés-kiesés, fonákérzés és fájdalom is kísérheti. A lábikrában és a lábfejben tapasztalható fájdalom, görcs, hidegség, égető érzés és zsibbadás érintésre fokozódhat. A tisztázatlan eredetű bántalom esetén többféle vitamin adagolható, ennek hatékonyságát ez idáig azonban még nem igazolták.

Ritka esetben a kizárólag érzőidegekre kiteljedő polineuropátia perifériás fájdalommal és fonákérzéssel kezdődik, majd centrálisán haladva mindenféle érzékelés elvesztésével jár. Ez a jelenség carcinoma (elsősorban bronchuscarcinoma) távoli hatásaként, fokozott piridoxin-felvétel (> 0,5 g/nap) esetében, amiloidózis, hypothyreosis, myeloma és urémia kísérőjelenségeként alakul ki. A piridoxin hatására kialakult neuropátia a piridoxin-adagolás abbahagyása után megszűnik.

Az öröklött neuropátiákat érző-mozgató neuropátiák és érzőidegeket érintő neuropátiák csoportjára osztjuk. A leggyakoribb öröklött érző-mozgató neuropátia a Charcot-ManeTooth betegség. A kevésbé gyakori érző-mozgató neuropátiák a születéskor kezdődnek és nagyobb fokú rokkantságot okoznak. A ritkán megfigyelhető, érzőidegeket érintő neuropátiák esetében a disztális fájdalom- és hőérzékelés eltűnése kifejezettebb, mint a rezges- és helyzetérzés csökkenése. A fő problémát itt a fájdalomérzés hiánya miatt kialakuló lábvég-csonkulás okozza, amit gyakran kísér fertőzés és osteomyelitis.

Az I. és II. típusú öröklött érző-mozgató neuropátia (Charcot-Marie-Tooth betegség, peroneális izomatrófia) viszonylag gyakori, rendszerint autoszomális domináns módon öröklődő rendellenesség, ami elsődlegesen a peroneális- és a lábvégizmok gyengeségevei es sorvadásával jár. Az érintett páciensekben vagy rokonaikban előfordulhat egyéb degeneratív betegség is (pl. Friedreich-féle ataxia). Az I. típusban szenvedő páciensekben a gyermekkor közepén lábfejlelógás és lassan romló disztális izomsorvadás („gólyaláb”) figyelhető meg. A karok izomsorvadása később kezdődik. A rezgés-, fájdalom- és hőmérsékletérzékeles „harisnyakesztyű” mintát követve csökken. A mély ínreflexek hiányoznak. A betegséget hordozó, de

·.’· J. «

-8kevésbé érintett családtagokban a magas boltíves talp vagy a kalapácsujj lehet a betegség egyetlen megfigyelhető jele. Az idegek ingerületvezetési sebessége lassú, a disztális látenciák elhúzódnak. Szegmentális demielinizáció és remielinizáció egyaránt megfigyelhető. A perifériás idegek megnagyobbodása tapintással is kimutatható lehet. A betegség lassan rosszabbodik, a páciens élettartamát nem befolyásolja. A II. típusú kórkép lassabban fejlődik ki, az izomgyengeség rendszerint későbbi életkorban jelentkezik. A páciensek idegeiben viszonylag megfelelő ingerületvezetési sebesség tapasztalható, de akiváltott potenciálok amplitúdója alacsony. A biopsziás mintákban Waller-féle degeneráció figyelhető meg.

A III. típusú öröklött érző-mozgató neuropátia (hipertrófiás intersticiális neuropátia, Déjerine-Sottas-szindróma) ritka, autoszomális recesszív módon öröklődő kórkép. A betegség gyermekkorban kezdődik, progresszív izomgyengeség, érzékelés-kiesés és a mély ínreflexek hiánya jellemzi. Kezdetben hasonlít a Charcot-Marie-Tooth betegségre, de esetében a mozgatóidegek károsodása gyorsabb ütemben zajlik. A folyamat demielinizációval és remielinizációval jár, ami a perifériás idegek megnagyobbodásához és a biopsziás mintákban látható hagymalevél-szeru idegelváltozásokhoz vezet.

Az izomgyengeség jellegzetes eloszlása, a lábdeformitások, a családbeli előfordulás és az elektrofiziológiai rendellenességek megerősítik a betegség diagnózisát. Az érintett családokban genetikai elemzés végezhető, specifikus kezelés azonban nem áll rendelkezésre. A betegség rosszabbodására való tekintettel hasznos, ha a fiatal páciensek pályaválasztási tanácsadásban részesülnek. A lábfejlelógás merevítéssel korrigálható, a lábfej stabilizálása ortopédiai műtéttel is elősegíthető.

Neurodegeneratív betegségek többek között az Alzheimer-kór, a Parkinson-kór, a Huntington-kór és a miatrófiás laterális szklerózis („Amyotropic Lateral Szklerózis , ALS).

Az Alzheimer-kór agyszövetbeli elváltozások következményeként kialakuló, a mentális funkciók károsodásával járó rendellenesség. Ide tartozik a nem a vérerek elváltozásai miatt kialakuló agyszövet-zsugorodás, az elsődleges degeneratív elbutulás és a diffúz agyszövetsorvadás. Az Alzheimer-kórt más néven Alzheimer-típusú időskori elbutulásnak (SDAT) is nevezik. Ez az öregedéssel kapcsolatos szellemi leépülés leggyakoribb alakja. A betegseg előfordulási gyakorisága megközelítőleg 9/10000 személy. A kórkép a nőket kissé gyakrabban érinti mint a férfiakat és elsősorban idősebb emberekben fordul elő.

A betegség oka ismeretlen. A kialakulásában esetleg résztvevő neurokémiai tényezők közül kiemelendő az idegsejtek által ingerületátadásra alkalmazott anyagok (neurotranszmitterek, pl. acetilkolin, szomatosztatin, P-anyag és noradrenalin) hiánya. Hajlamosító környezeti tényezők pl. az alumíniummal, a mangánnal és egyéb anyagokkal való érintkezés. Fertőző

:.:.. j. J, ”

-9eredetű okai közé tartoznak a prionok (vírusszerű szervezetek) okozta központi idegrendszeri (agy- és gerincvelőbeli) fertőzések. Bizonyos családokban (az esetek 5-10A-ában) a betegség kialakulására való öröklött hajlani figyelhető meg, ez azonban nem követi szigorúan a mendeli öröklődési szabályokat. A betegség diagnózisa általában az elbutulás egyéb okainak kizárásán alapul.

Kimutatták, hogy a több Alzheimer-kóros beteget tartalmazó családokban a megbetegedett személyek mindegyikében egy meghatározott génváltozat fordul elő. Ez, az apolipoprotein E4-et termelő gén nem a betegség kiváltó oka, jelenléte csupán növeli a kórkép későbbi kifejlődésének esélyét. Sok ember hordozza az E4 gént és soha nem betegszik meg Alzheimer-kórban.

A betegség kezdetét memóriazavarok jelzik, majd a szellemi képességek progresszív romlása figyelhető meg. A betegség súlyosbodásával előfordulhatnak hangulat- vagy beszédkészségbeli változások, járásbeli változások stb. Az agy szöveteinek mennyisége csökken (sorvadás), a kamrák ürege nő és az agyszövetben különböző anyagok lerakódása figyelhető meg.

A Parkinson-kór reszketéssel, járásbeli-, mozgásbeli és koordinációs zavarokkal járó agyi rendellenesség. A megbetegedést az agy izommozgásokat szabályozó részének károsodása okozza. A Parkinson-kórt reszkető bénulásnak vagy paralysis agitansnak is nevezik.

Az 1000 személy közül megközelítőleg kettőt érintő megbetegedés leggyakrabban 50 éves kor felett jelentkezik. A férfiakat és nőket egyforma eséllyel érintő kórkép a leggyakoribb időskori idegrendszeri rendellenesség. A parkinsonizmus kifejezés a Parkinson-kórra jellemző mozgásbeli változások kombinációjával járó bármely kórképre utal. A parkinsonizmust más kórképek vagy külső tényezők is kiválthatják (másodlagos parkinsonizmus).

A Parkinson-kórt az agy izommozgásokat szabályozó központja (a bazális ganglionok és az extrapiramidális terület) idegsejtjeinek progresszív pusztulása idézi elő. A sejtek közötti ingerületátvivő anyagok (transzmitterek) közé tartozó dopamin természetes körülmények között ezen az agyterületen termelődik. Az említett agyterület károsodása csökkenti a szervezet rendelkezésére álló dopamin mennyiségét. A dopaminhiány felborítja a dopamin és egyéb ingerületátvivő anyagok, pl. az acetilkolin között fennálló egyensúlyi állapotot. A dopamin hiányában károsodik az idegsejtek ingerületátvivő funkciója, ami a izmok funkciózavarához vezet. Az idegsejt-károsodás pontos oka egyelőre ismeretlen. A kórkép egyik- vagy mindkét testfelet érintheti és különböző mértékű funkciózavarral jár.

Az izomműködés szabályozásának elvesztésén túl egyes páciensekben súlyos fokú depresszió alakul ki. Bár a szellemi teljesítőképesség korai elvesztése ritkán fordul elő, a su **$***<**»· ·

-10lyos fokban Parkinson-kóros személyekben általános szellemi hanyatlás figyelhető meg (elbutulás, hallucinációk stb.). Az elbutulás a kórkép gyógykezelésére igénybe vett készítmények mellékhatása is lehet.

A Huntington-kór autoszomális domináns módon öröklődő ritka idegrendszeri megbetegedés, amely 10000 személy közül megközelítőleg egyet érint [Breighton és Hayden (1981)]. A megbetegedés klinikai tünetei általában az élet ötödik évtizedéig nem ismerhetők fel. A kórkép pszichiátriai zavarokkal, önkéntelen mozgásokkal, a felfogóképesség romlásával jár és általában 17 évvel a tünetek jelentkezése után elkerülhetetlenül a beteg halálához vezet.

A Huntington-kór kialakulásáért felelős gént huntingtinnek nevezik. A 4p kromoszómán helyeződő gén kimutatása lehetővé teszi a kórkép hatékony preklinikai és születés előtti diagnosztizálását. A genetikai rendellenességet fölös számú párosán ismétlődő CAG nukleotidszekvencia j elenléte j ellemzi.

Huntington-kóros páciensekben a CAG ismétlődés mérete szoros összefüggést mutat az életkorral, amikor a klinikai tünetek először jelentkeztek. Ez a kapcsolat különösen szembetűnő a gyermekkori Huntington-kórban megbetegedett személyek eseteben, akiknél rendkívül lényeges mértékű, rendszerint 50 ismétlődés feletti megnagyobbodás tapasztalható. A Huntington-kóros családokban a CAG ismétlődés hossza bizonyos mértékű instabilitást mutat, ami különösen kifejezett az érintett apától huntingtin gént öröklő gyermekeknél.

A Huntington-kór esetében nem ismert, hogy ez a széles körben expresszált gén miként idéz elő szelektív idegsejt-pusztulást. Emellett szekvencia-elemzéssel sem lehetett szembetűnő homológiát kimutatni más ismert génekkel, továbbá nem azonosítottak olyan szerkezeti motívumokat vagy funkcionális doméneket sem, amelyek egyértelmű betekintést engednének a gén működésébe. Továbbra is megválaszolásra vár a kérdés, hogyan okozhatnak ezek a széles körben expresszált gének szelektív idegsejt-elhalást.

A miatrófiás laterális szklerózis (ALS) az agyvelőben és a gerincvelőben lévő idegsejtek pusztulása miatt a harántcsíkolt izmok idegi ellenőrzésének fokozatos elvesztésével járó rendellenesség. A Lou Gehrig-kómak is nevezett megbetegedést az izmok használatának és szabályozásának megszűnése jellemzi. Az említett izmokat ellátó idegek elsorvadnak és eltűnnek, ami az idegi stimuláció kiesése miatt az izomszövet megfogyását eredményezi. A harántcsíkolt (tudatos ellenőrzés alatt álló) izmokkal kezdődően csökken az izomerő és az izomkoordináció. A folyamat előrehaladása következtében egyre több és több izomcsoport válik énntetté. Csökkenhet az idegi stimulációja a félig-kontrollált, pl. a légző- vagy a nyelésben részt

Η· <· J.

- π - vevő izmoknak is. Az ismeretlen oktanú betegség nem befolyásolja a gondolkodási képességet.

Az ALS előfordulási gyakorisága 1/100000 személy. Egyes esetekben családi halmozódása gyanítható. A kórkép nagyobb eséllyel érinti a férfiakat mint a nőket. A tünetek általában felnőtt korban, gyakran 50 éves kor felett jelentkeznek.

Traumás eredetű idegsérülés a központi és a körzeti idegrendszerben egyaránt előfordulhat. A traumás agysérülés (TBI), vagy egyszerűbben fejsérülés vagy zárt fejsérülés (CHI) olyan sérülésre utal, amikor a fejet ért külső ütés hatására agyszövet-károsodás lép fel. Leggyakrabban gépkocsi- vagy kerékpárbaleset következtében fordul elő, de kialakulhat vízbefulás közeli állapot, szívroham, stroke és fertőzés következtében is. Ezek az agybeli oxigénvagy vérellátás-hiány következtében kialakuló traumás agysérülések anoxiás sérülésnek is nevezhetők.

Agysérülés vagy zárt fejsérülés alakul ki, ha pl. gépjárműbaleset vagy zuhanás következtében ütés éri a fejet. Ebben az esetben a koponya egy stabil tárggyal ütközik, a koponyán belül található agy pedig a tengelye (az agytörzs) körül megcsavarodik és elfordul, aminek következtében helyi vagy kiteljedt sérülés alakul ki. A folyadékkal körülvett, abban „úszó lágy szövetből felépülő agy „visszapattanhat” a koponya faláról, aminek további károsodás a következménye.

A trauma után közvetlenül eszméletvesztés léphet fel, ami percekig, hetekig vagy hónapokig tarthat. A megcsavarodás és visszapattanás miatt a traumás agysérüléses beteg agya rendszerint egyszerre több helyen károsodik. Ezt diffúz vagy „nem-lövedék eredetű agykárosodásnak nevezik. A nem-lövedék eredetű sérülésekben kialakuló agykárosodást elsődleges vagy másodlagos sérülésként osztályozhatjuk.

Az elsődleges agykárosodás a sérülés időpontjában, főként a behatás helyen alakul ki, különösen koponyatörés esetén. A nagyméretű zúzódások ágybéli vérzéshez vagy a kereg serüléséhez vezethetnek. Az agyvelő rotációs mozgása következtében fellépő, az idegi nyúlványokra ható nyíró- és húzóerők hatására diffúz axonkárosodás jön létre. Előfordulhatnak csak kórszövettani vizsgálattal kimutatható kisméretű vérzések vagy diffúz axonkárosodás is.

A másodlagos agykárosodás a sérülés pillanata után kialakuló komplikációk következtében jön létre. Ilyenek pl. a koponyaűri vérzés, az extracerebralis artériák traumás sérülése, a koponyaűri sérvképződés, a hipoxiás agykárosodás és az agyburok-gyulladás.

A nyitott fejsérülés látható elváltozásokkal jár, lövedék, baleset vagy a koponyán keresztül az agyba hatoló tárgy hatására alakul ki („lövedék-eredetű agysérülés”). Ez a fejsérülés-típus nagyobb valószínűséggel károsítja az agyvelő egy meghatározott területet.

-12Η·Η··>

Az enyhe agysérülés előfordul, hogy nem okoz eszméletvesztést csupán rövid ideig tartó kábulatot vagy zavarodottságot. Bár ebben az esetben az alkalmazott orvosi ellátás minimális mértékű, a kóma nélküli agysérülést szenvedett személyek a kómás állapotot túlélt páciensekhez hasonló tüneteket es funkciókiesést mutathatnak.

A trauma következtében kialakuló agybeli elváltozások a további sérülés megakadályozását szolgáló monitorozást tesznek szükségessé. Súlyos fejsérülés következtében az agy mérete megnő. Ez az agyduzzadásnak nevezett jelenség az agybajutó vérmennyiség növekedésének eredménye. Később az agy állományában vízfelhalmozódás is kialakulhat, ezt az állapotot agyödémának nevezzük. Mind az agyduzzadás, mind az agyödéma az ágybéli nyomás jelentős fokozódásához vezet.

A paraplégia és tetraplégia miatti kórházi felvételek túlnyomó része gerincvelő-sérülés eredménye, ami az esetek több, mint 80%-ában közlekedési baleset következménye. E sérülések esetében két fő csoportot különíthetünk el: a gerincsérülés nyitott és zárt lehet.

A nyílt sérülések a gerincvelő és az ideggyökerek közvetlen sérülését okozzák. A perforáló sérülések súlyos fokú szakadást és vérzést idézhetnek elő. A genncsérulesek túlnyomó többsége zárt, rendszerint a gerincoszlop röntgenvizsgálattal kimutatható törésével, elmozdulásával járnak. A gerincvelő sérülés a csontelváltozások mértékétől függ, elsődleges és másodlagos típusú lehet. Az elsődleges sérülések közé soroljuk a zúzódást, az idegszál-szakadast és a vérzéses elhalást, a másodlagos sérülések közé tartoznak pl. az extradurális hematóma, az infarktus, a fertőzés és az ödéma.

A gerincvelő-sérülés késői hatásai között megemlítendő a sérült idegrostok felszálló és leszálló anterográd degenerációja, a traumát követő syringomyelia, valamint a paraplégia szisztémás hatásai, így pl. a húgyúti és a mellkasi fertőzések, a felfekvések és az izomsorvadás.

Az előzőekben felsoroltakon kívül veleszületett metabolikus zavarok is idegrendszeri kórképekhez vezethetnek. A nagyszámú idegrostot befedő velőshüvelyek az élet korai szakaszában kialakított lipoprotein rétegekből állnak. A központi idegrendszerbeli oligodendroglia sejtek által képzett mielin ugyan kémiai szerkezetét és immunológiai tulajdonságait tekintve egyaránt eltér a perifériásán a Schwann-sejtek által kialakítóitól, mégis mindkettő funkciója azonos: az idegi impulzusok azon mentén történő továbbjutásának elősegítése.

Számos veleszületett metabolikus zavar (pl. a fenilketonuria, az egyéb aminosavuriák; a Tay-Sachs, a Niemann-Pick és a Gaucher-kór; a Hurler-szindróma, a Krabbe-kór és egyéb leukodisztrófiák) károsíthatja a fejlődésben lévő mielinhüvelyt, elsősotban a központi ideg:’.t.:.:.. ·’. ί

-13rendszerben. Hacsak nem sikerül a biokémiai hatást kijavítani vagy kompenzálni, a probléma állandósult, gyakran kitelj edt idegrendszeri müködészavart eredményez.

A Krabbe-kór vagy globoid sejtes leukodisztrófia a környéki és a központi idegrendszer fehérállományát érintő rendellenesség. A galaktocerebrozidáz (GALC) nevű lizoszomális enzim mutációjának alacsony szintű enzimaktivitás és a szinte kizárólag a mielinben lévő galaktolipidek elbontásának csökkent képessége az eredménye. A páciensekben a folyamatos mielinizáció és/vagy remielinizáció miatti megfelelő szintű GALC-expresszió fenntartása érdekében működőképes saját oligodendrocitákra, vagy oligodendrociták vagy azokká differenciálódni képes őssejtek átültetésére van szükség [Wenger és mtsai. (2000)].

Az 1. típusú neuro fibromatózis (NF1) idegrendszeri elváltozások szeles köret előidézni képes, autoszomálisan öröklődő gyakori rendellenesség.

A több szervrendszerre kitelj edő atrófia („Multiple System Atrophy”, MSA) ismeretlen oktanú, sporadikusan jelentkező felnőttkori neurodegeneratív betegség. A neurodegeneratív betegségek közül egyedinek számít abból a szempontból, hogy az oligodendroglia sejtek lényeges, ha nem alapvető szerepet játszanak a korfejlodeseben. A Parkinson-kortol való kü lönbözősége leginkább abban nyilvánul meg, hogy az MSA-ban beteg páciensek nem reagálnak az L-dopa kezelésre.

Az idősebb korban bekövetkező demielinizáció számos neurológiai rendellenesség kísérőjelensége lehet, az idegeket vagy a mielint ért helyi sérülés, isémia, toxikus hatás vagy metabolikus zavar okozta károsodásból származhat. Vannak arra utaló adatok is, hogy a demielinizáció hozzájárulhat a skizofrénia kialakulásához. A súlyos fokú mielinvesztést rendszerint axondegeneráció és gyakran sejttest-degeneráció követi, ezek mindegyike visszafordíthatatlan folyamat is lehet. Mindezek ellenére sok esetben figyelhető meg remielinizáció, az idegi funkció teljes visszanyerését eredményező gyors regeneráció és reparáció. Az ismeretlen oktanú, elsődleges demielinizációs megbetegedésekben a központi (a gerincvelőbeh, agyvelőbeli vagy szemidegbeli) demielinizáció a legjellemzőbb elváltozás. Ezen megbetegedések közül a legismertebb a szklerózis multiplex („Multiplex szklerózis”, MS).

A heveny disszeminált encephalomyelitis vagy fertőzést követő encephalomyelitis során perivaszkuláris központi idegrendszeri demielinizáció figyelhető meg. A betegség spontán is jelentkezhet, de rendszerint vírusfertőzés, vírusvakcinázás (vagy nagyon ritkán baktériumos vakcinázás) következményeként alakul ki, ami immunológiai okra utal. A vírusvakcmázást követően jelentkező heveny gyulladásos perifériás neuropátiák és a Guillain-Barré-szmdróma hasonló, feltehetően immunpatológiai alapon kialakuló demielinizációs kórképek, amelyek azonban csak perifériás idegeket érintenek.

- 14A metakromáziás leukodisztrófía szintén demielinizációs megbetegedés. Az adrenoleukodisztrófia és az adrenomyeloneuropátia ritka, X-kromoszómához kötötten recesszív módon öröklődő metabolikus kórképek, amelyekre a mellékvese működészavara és az idegrendszerbeli kiterjedt demielinizáció a jellemző. Az adrenoleukodisztrófia fiatal, míg az adrenomyeloneuropátia serdülőkorú fiúkban fordul elő. A betegségek következtében értelemzavar, görcsös hajlam és vakság jelentkezhet. Az adrenoleukodisztrófia kivétel nélkül halálra vezet. A betegség diétás és immunmodulációs kezelésével kapcsolatos kísérletek folyamatban vannak.

A Leber-féle öröklődő szemideg-atrófiára és a vele rokon mitokondriális rendellenességekre elsősorban a központi látás kétoldali elvesztése jellemző, a betegség rendszerint a tízes éveik végén - húszas éveik elején járó fiatal férfiakban figyelhető meg. A Leber-féle öröklődő szemideg-atrófia a szklerózis multiplex során kialakuló szemideggyulladáshoz hasonlít. A betegséggel kapcsolatban az anyától örökölt mitokondriális DNS mutációit mutatták ki.

Az emberi T-sejtes limfotróp vírussal történt fertőzés egyik következményeként kialakuló HTLV-vel kapcsolatos myelopátia lassan progrediáló gerincvelő-megbetegedés, amelyet mindkét láb merevséggel kísért gyengesége jellemez.

A következőkben további, rendellenes mielinizációval kísért neuropátiákat sorolunk fel.

Immuneredetű: heveny, Guillain-Barré, idült, idült immuneredetű demielinizációs polineuropátia (CIDP), multifokális CDIP, multifokális motor neuropátia (MMN), anti-MAGszindróma, GALOP-szindróma, anti-szulfatid ellenanyag-szindróma (szérum M-proteinnel), anti-GM2 ellenanyag szindróma, POEMS-szindróma, polineuropátia, szervmegnagyobbodás, endokrinopátia vagy ödéma, M-protein, bőrelváltozások, perineuritis, IgM anti-GDlb ellenanyag szindróma (ritka).

Toxinok: diftéria, varjútövis („buckthorn”), hexaklorofén, nátrium-cianát, tellúr.

Drogok: elsősorban demielinizációt okozók: klorokvin, FK506 (Tacrolimus), perhexilin, prokainamid, zimeldin; demielinizációt és axonkárosodást okozók: amiodaron, eozinofília-mialgia szindróma, arany, szuramin, Taxol.

Öröklött: szénhidrát-hiányos glikoprotein, katarakta és arctorzulás, Cockayne-szindróma, veleszületett hipomielinizáció; veleszületett izomdisztrófia: Merosin hiányos ~, Farberkór (lipogranulomatózis), HMSN és CMT, domináns: IA, IB, ΠΙ, HNPP, EGR2, hőérzékeny; recesszív: III (Dejerine-Sottas), 4A, 4B, 4B2, 4C, 4D (LOM), 4E, 4F, HMSN-R, CNS; X-kromoszómához kötött: IX, Krabbe, Marinesco-Sjörgen, metakromáziás leukodisztrofia, Niemann-Pick, Pelizaeus-Merzbacher (PLP), Refsum, prionprotein (PrP27-30): Glu200Lys mutá-

- 15 ció, Creutzfeld-Jakob-kór; egérmodell: prion fokozott expresszió, Salla-kór, SOX10, Tenascin-XA, a perifériás mielinhüvelyek egyenetlen elrendezése, Ehlers-Danlos fenotípus.

Metabolikus (ritka): cukorbetegség (egyidejű CIDP-nek köszönhetően), hypothyreosis, májbetegségek.

Mitokondriális: MNGIE-szindróma, miopátia és külső szembénulás, neuropátia, gasztrointesztinális encefalopátia, NARP-szindróma, neuropátia, ataxia, retinitis pigmentosa.

Fertőzések: Creutzfeld-Jakob-kór, diftéria, HÍV: kapcsolódó CIDP, lepra: lepromatosus ~, kevert axonális — demielinizácios, kolonizált Schwann-sejtek, Creutzfeld-Jakob-kor változat.

A következő internetes címen további resztetek találhatok. http://www.neuro.wustl.edu/neuromuscular/nother/mielin.html

A szklerózis multiplex (SM) a központi idegrendszert érintő gyulladásos eredetű, demielinizációval járó megbetegedés. A kórkép lefolyásában átmeneti javulás és visszaesés váltakozhat, vagy progresszív rosszabbodást mutat. A szklerózis multiplex nem az egyetlen demielinizációval járó megbetegedés. A perifériás idegrendszerben a kórkép megfelelője az idült gyulladásos demielinizácios poliradikuloneuropátia (CIDP). Emellett léteznek heveny, monofázisos kórképek, mint pl. a perifériás idegrendszerben Guillain-Barré-szindrómának (GBS-nek) nevezett gyulladásos demielinizácios poliradikuloneuropátia, valamint a központi idegrendszerben a heveny disszeminált encephalomyelitis (ADEM). Mind a szklerózis multiplex, mind a Guillain-Barré-szindróma heterogén kórkép. A szklerózis multiplex esetében különféle káros külső hatások genetikai tényezőkkel együtt olyan betegséget okozhatnak, amely megfelel az SM diagnosztikai kritériumainak. Mindkét megbetegedés esetében az elsődleges demielinizácios elváltozásokat maradandó idegkárosodást okozó axonsérülés kísérheti.

A fenti demielinizácios kórképek közül a szklerózis multiplex a leggyakoribb. Autoimmun kórképnek tekinthető, amelyben az immunrendszer fehérvérsejtjei támadást intéznek a a központi idegrendszer fehérállománya ellen. A szürkeállomány is érintett lehet. Bár a szklerózis multiplex pontos oka nem ismert, kialakulását genetikai tényezők és bakteriális valamint vírusos fertőzések is elősegíthetik. Klasszikus megjelenési formájában (az esetek 85%-ában) egymást váltó rosszabbodási/j avulási fázisok figyelhetők meg, amelyek klinikailag több hétig tartó idegi működészavamak és a tünetek azt követő lényeges mértékű vagy teljes megszűnésének felelnek meg (Noseworthy, 1999). Az átmeneti javulásos időszakok hossza az idő előrehaladtával csökken. Sok páciensben ezután a betegség végső fázisa alakul ki, amelyet az idegi funkciók lényegi javulás nélküli fokozatos megszűnése jellemez. Ezt másodlagos prog- * Λ *»♦· * • > ' J ·.

Μ-Η-Λ J

-16resszív szklerózis multiplexnek nevezzük. A szklerózis multiplexes betegek egy kis hányadánál (mintegy 15%-ánál) a betegség megjelenésétől kezdve az idegi funkciók fokozatos és folyamatos romlása figyelhető meg (elsődleges progresszív szklerózis multiplex). A SM súlyosabb formái ellen jelenleg nem rendelkezünk megfelelő gyógykezelési móddal, ezek általában a páciens halálához vezetnek.

A szklerózis multiplex jellemző alapelváltozása az agyvelő és a gerincvelő fehérállományában megfigyelhető, reaktív gliás heg képződésével kísért demielinizált plakk. A demielinizáció az idegi impulzusok tovavezetésének funkcionális gyengülésével vagy gátlásával jár együtt. A szklerózis multiplexes betegekben axonszakadás és -elhalás is megfigyelhető [Bjartmar és mtsai. (1999)]. A kórszövettani vizsgálatok alapján a leggyakrabban érintett területek a látóidegek, a kamrák körüli fehérállomány, az agytörzs és a gerincvelő [Storch és mtsai. (1998)]. Az említett központi idegrendszeri károsodások klinikailag kettőslátásban, zsibbadtságban, bizonytalan járásban, valamint idült esetben többek között spasztikus paraparézisben és inkontinenciában nyilvánulnak meg.

A szklerózis multiplex patogeneziséért felelős molekuláris mechanizmusok genetikai és környezeti tényezőkből, pl. bakteriális- és vírusfertőzésekből erednek. Az említett mechanizmusok elősegítik a T-limfocitáknak és a makrofágoknak a vér-agy gáton keresztül a központi idegrendszerbe fokozott számban történő bejutását.

A demielinizáció a mielin aktivált makrofágok és mikroglia sejtek általi károsításának, valamint a mielintermelő sejtek ellen irányuló, Fas-ligandum szignáltranszdukción alapuló, komplement- vagy ellenanyag-közvetített citotoxicitás eredménye. A demielinizáció tehát a mielinhüvely közvetlen károsításának és a mielint termelő sejtek elpusztításának eredmenye.

Genetikai és környezeti tényezők következtében fokozott számban lépik át gyulladásos sejtek a vér-agy gátat. Ennek következtében nagyszámú autoreaktív T-limfocita és makrofág lép be a központi idegrendszer szöveteibe. A T-sejtek citokin-szekréciója aktiválja az antigénbemutató sejteket. Ha az antigénbemutató sejtek felszínén található MHC-Π molekulákkal kapcsolatban álló autoreaktív T-sejtek aktiválódhatnak, ha feltételezett „SM-antigénekkel”, pl. a mielinhüvely protein-összetevőivel találkoznak. Az oligodendrociták és a miehnhuvely károsodása számos ezt követően beinduló mechanizmus következménye lehet. Egyes paciensekben a károsodás zöméért a komplement- vagy ellenanyag-közvetített citotoxicitás felelős, masokban a fehérállomány a Fas-ligandum szignáltranszdukció és a CD4+ T-sejtek áltál kibocsátott gyulladáskeltő citokinek, pl. a TNF-ot hatására sérül. A folyamatban a fokozott fagocitózison és faktorkiválasztáson keresztül az aktivált makrofágok is szerepet játszhatnak. Mindezek kiterjedt demielinizációt okoznak, ami a központi idegrendszerbeli axonok ingerületve- 17zetési hatékonyságának következményes csökkenését idézi elő. A gyulladásos folyamat megszűntével azonban javítómechanizmusok léphetnek működésbe, amelyek hatására a velőshüvely újraképződése indul meg. A szklerózis multiplexes betegek remielinizált axonjaira kórszövettanilag a vékony velőshüvely jelenléte hívja fel a figyelmet. A demielinizált axonmembránba inszertálva gyakran járulékos nátriumcsatomák figyelhetők meg, amelyek az ingerületvezetési hatékonyság csökkenését hivatottak kompenzálni. Az oligodendroglia-előalakok fokozhatják a remielinizációt a szklerózis multiplexes elváltozásokban.

Az oligodendrociták a mielinhüvely termeléséhez és fenntartásához kapcsolódóan számos feladatot látnak el. A velőshüvely több idegsejt axonjának biztosít szigetelést, támasztékot és ingerületvezetés fokozást. Egy oligodendrocita akár 50 különböző axon velőshüvelyét is előállíthatja. A mielinizáció csak meghatározott, nagy átmérőjű axonokra korlátozódik, a dendritek és pl. az asztrociták sejtnyúlványai velőshüvely nélküliek. Az axonok ellenőrzést gyakorolnak a mielinhüvelyt kialakító oligodendrociták felett, mivel pl. a patkány látóideg modellben az axon átvágása meggátolja a mielin újraképződését és az oligodendrocita előalakok képzését [Barres és Ralf, (1999)]. Az oligodendrociták proliferációját és migrációját a fejlődés során az axonból kijutó faktorok stimulálhatják. Ez a folyamat gondoskodik a központi idegrendszerben az axonok és oligodendrociták számának egyezéséről.

A központi idegrendszer perineurális támasztósejtjei, az oligodendrociták mielinhüvellyel látják el az axonokat és elősegítik az idegi impulzusok tovavezetését. Szerepet játszanak az axonok működésében és túlélésében. Megjegyzendő, hogy egy oligodendrocita csupán egy nyúlványt bocsát minden egyes, általa mielinizált axonhoz.

A többlemezes mielinhüvely a gliasejt plazmamembránjának lipidekben gazdag és proteinekben szegény specializált doménja. Támaszt nyújt az axonoknak és javítja a központi idegrendszerben az elektromos jelátvitelt, mivel megakadályozza, hogy a töltés a környező szövetekbe „elfolyjon”. A mielinhüvely Ranvier-féle befŰződéseinél megy végbe az axonbeli ugrásszerű ingerületátvezetés.

Felnőtt szervezetben az oligodendrociták az agyvelő és a gerincvelő szubventrikuláris zónájában található, egyelőre kevéssé definiált prekurzor sejtekből fejlődnek ki [Nait-Oumesmar és mtsai. (1999)]. Az említett proliferatív, mielin-transzkriptumokat és proteineket expresszáló prekurzorok először hetekkel a mielinizációt megelőzően az embrionális gerincvelő ventrális részén jelennek meg [Hajihosseini és mtsai. (1996)]. A mielinizáció a születés után megy végbe az agyban. A születés utáni fejlődés során az említett előalakok a miehmzalando idegpályákhoz vándorolnak.

-18Az oligodendrociták prekurzor sejtekből történő kialakulása előre meghatározott módon megy végbe [Id. pl. Rogister és mtsai. (1999)]. Az oligodendrociták kifejlődésének egyes szakaszai jól elkülöníthetők bizonyos sejtspecifikus markerek jelenléte alapján. Ilyenek az endoteliális idegsejt-adhéziós molekula (E-NCAM), a vimentin, az A2B5, a POU transzkripciós faktor Tst-l/Oct6/SCIP, a pre-oligodendroblaszt antigén (POA), a galaktocerebrozidáz (GalC), Ol, 04, és a PLP, MBP és MOG elnevezésű mielinspecifikus proteinek. Az idegi őssejtekből bipoláris pre-GD3+ sejtek keletkeznek, amelyekből O2A előalakok jönnek létre. Ezekből a sejtekből azután vagy oligodendrociták vagy 2. típusú asztrociták alakulnak ki. Az oligodendrocitává történő differenciálódást megelőzően a sejtek pre-oligodendrocita és preGalC+ stádiumokon jutnak keresztül. Az érett oligodendrociták nem képesek további prolifcrációra. Az érett oligodendrociták a mielins-pecifikus proteinek előállítása mellett GalC és szulfatid (SÜL) sejtspecifikus markereket is expresszálnak.

Mindezek alapján az oligodendrociták mitotikusan aktív, mozgásképes előalakokból jönnek létre. Amint e sejtek posztmitotikussá válnak, mielin-specifikus proteineket kódoló gének transzkripciója és transzlációja indul meg bennük. Az axont körbevevő mielinhüvely kialakulását az érett oligodendrocita nyúlványai és az axon közvetlen érintkezése idézi elő. A központi idegrendszerben az axonok mielinhüvellyel történő beburkolásának végső lépése a myelimhüvely tömörítése, amely ebben a végső alakjában komplex formában makromolekulákat tartalmazó folyékony kristályra hasonlít [Scherer (1997)]. A mielinizáció elősegítése során figyelembe kell venni a mielinhüvely egyedi szerkezeti proteinjeinek precíz sztöchiometrikus kapcsolatát, mivel egy adott komponens mennyiségének növelése vagy csökkentése a teljes mielinhüvely szerkezetének megzavarásához vezethet.

Az oligodendrociták nem képesek a demielinizált axonok folyamatos javítására, ami hozzájárul a szklerózis multiplexben megfigyelhető kumulatív idegrendszeri működészavarhoz. Szklerózis multiplexes betegekben a remielinizáció elősegítése meggátolhatja az axonkárosodást, ami korlátozhatja a központi idegrendszerbeli axonok pusztulásával kapcsolatos működészavar súlyosbodását.

A szklerózis multiplex demielinizációs jellegéből kiindulva kiteijedt vizsgálatokat végeztek az aktív SM elváltozásokkal kapcsolatban. A csupasz axonok és a miehnhüvelyt képző oligodendrociták hiánya az ép mielinhüvely károsodására és a remielinizáció szklerózis multiplexszel összefüggő rendellenességére utaltak. A szklerózis multiplexes elváltozások mintegy 40%-ában lehetett félbemaradt remielinizációt megfigyelni, elsősorban a betegség korai szakaszában [Prineas és mtsai. (1993)]. Ez alapján reálisnak tűnik az elgondolás, hogy a mielinhüvely javításának elősegítésére kidolgozandó stratégiák meggátolhatják a maradandó

-19idegrendszeri károsodás kialakulását. Az említett beavatkozás sikerének esélye különösen magas friss központi idegrendszeri elváltozások eseteben, amelyeknél kimutathatóan végbemegy a remielinizáció. A mielinizációt vagy remyelenizációt végző oligodendrocita ugyanakkor rendkívül kifejezett metabolikus stresszhelyzetben van, még enyhe fokú további behatások is visszafordíthatatlan károsodását okozhatják [Scolding és Lassmann (1996)]. Ez aktív szklerózis multiplexes elváltozás esetén, ahol a gyulladás és egyéb tényezők gátolják a remielimzációt, csökkenti a spontán helyreállítás esélyét. A mielinhüvely-helyreállítást elősegítő stratégiák aktív szklerózis multiplexes elváltozások esetén fokozhatják a remielinizáció és az axonvédelem esélyeit.

A felnőtt emberi központi idegrendszer proliferációra képes oligodendroglia prekurzor sejteket tartalmaz, amelyek mielinhüvelyt képző oligodendrocitákká differenciálódhatnak. Mindemellett úgy tűnik, hogy a szklerózis multiplexes elváltozások környezetében a betegség idült fázisában proliferációs és differenciálódási képessegük gátlása miatt csökken az endogén oligodendrocita prekurzor sejtek száma [Wolswijk (1998)]. Ezek a sejtek az idült SM elváltozások környezetében általában nyugalmi állapotban vannak, ami meggátolja, hogy aktívan részt vegyenek a remielinizációban. Az idült szklerózis multiplexes elváltozásokban ennélfogva olyan faktorok lehetnek jelen, amelyek meggátolják az oligodendroglia sejtek regenerációját, vagy hiányozhatnak belőlük olyan faktorok, amelyek nélkülözhetetlenek az oligodendrocita prekurzor sejtpopuláció stimulációjához [(Wolswijk (1998)]. E koncepcióból adódott az a hipotézis, hogy a szklerózis multiplex hatékony terápiájának nemcsak a gyulladásos tünetek elnyomására, hanem a remielinizáció elősegítésére is ki kell terjednie. A remielinizációt végző sejtek számos forrásból származhatnak, ilyenek pl. az elváltozás helyén túlélő oligodendrociták, az ezekből a túlélő sejtekből származó sejtek, valamint a közelben lévő prekurzor sejtek. Kimutatták, hogy egyes anyagok, pl. bázikus fibroblaszt növekedési faktor (bFGF) hatására az érett oligodendrociták „dedifferenciálódásra” és proliferálódásra képesek, ami a demielinizációval járó betegségben az oligodendroglia sejtvonal regenerációjának lehetséges mechanizmusára utal [Grinspan és mtsai. (1996); Grinspan és mtsai. (1993)].

A demielinizációval járó megbetegedésekben, pl. szklerózis multiplexben a remielinizáció jótékony hatása melletti további bizonyítékot szolgáltattak a megbetegedés állati modelljeiben gyógykezelés céljából alkalmazott gliaeredetű növekedési faktorok. Az oligodendrociták proliferációját és túlélését ismerten elősegítő központi idegrendszeri növekedési faktor, a 2. gliaeredetű növekedési faktor (neuregulin/GGF-2) a szklerózis multiplex EAE egérmodelljében késleltette a betegség kialakulását, csökkentette a klinikai tünetek súlyosságát és mérsékelte a visszaesések gyakoriságát [Marchionni és mtsai. (1999)]. Az axonok által tér

-20melt neuregulin jótékony hatással van az érett oligodendrociták túlélésére [Femández és mtsai. 2000)].

Az EAE modellben más növekedési faktorok is elősegítették a remielinizációt és terápiás hatást mutattak, ilyenek például a vérlemezke-eredetű növekedési faktor (PDGF) és az IGF-1 [Id. pl. Dubois-Dalcq és Murray (2000)]. Az oligodendrocita sejtvonal sejtjeinek proliferációra és/vagy differenciálódásra késztetésén keresztül a remielinizáció stimulálásával elért siker a szklerózis multiplex terápiájának céljával alkalmazott remielinizáció előnyére utal. Fontos lenne továbbá a mielinszintézist gátló molekulák azonosítása, mivel ezek csökkenthetik a szklerózis multiplex esetében a mielin helyreállításra alkalmazott módszerek, pl. az oligodendroglia sejt transzplantáció hatékonyságát.

A sérült mielinhüvely helyreállítása és az axonok pusztulásának megakadályozása érdekében a remielinizáció a gyulladáscsökkentő eljárásokkal együttesen alkalmazható.

A kórkép súlyosságának csökkentése érdekében a központi idegrendszerben az oligodendrociták stimulálásával megkísérelhető az axonpályák remielimzációja. A remielinizáció elősegítése visszafordíthatja az immunrendszer sejtjeinek a központi idegrendszerbe jutása következtében a mielinhüvely áltál elszenvedett károsodást.

Több vizsgálatban a differenciálódó oligodendroglia sejtek és a szklerózis multiplexes elváltozások esetében megfigyelhető differenciált génexpressziót (DGE) mikromátnx eljárással tették láthatóvá [Scralato és mtsai. (2000); Whitney és mtsai. (1999)]. Ezekben a különféle génsorozatok vizsgálatára lényeges mértékben eltérő technológiákat alkalmaztak. A differenciálódó oligodendrocitákban és a szklerózis multiplexes elváltozásokban megfigyelhető génexpresszió elemzésével a mielin-specifikus gének expressziójának lényeges mértékű változását detektálták. Emellett más, differenciáltan szabályozottnak bizonyult géneket is azonosítottak, amelyek nagy részéről idáig azt lehetett tudni, hogy a sejtciklus szabályozásában, a citoszkeleton átrendezésében és a membránon keresztül történő anyagforgalomban vesznek részt [Scarlato és mtsai. (2000)].

A nagymértékben foszforilált szialoprotein oszteopontin (OPN) a csontok es a fog mineralizált extracelluláris mátrix anyagának fontos összetevője. Az oszteopontin jellemző oszszetevői közé tartozik egy poliaszpartámsav-szekvencia, a hidroxiapatit kötődést elősegítő Ser/Thr foszforilációs helyek, valamint a sejtkötődést/szignáltranszdukciót elősegítő, nagymértékben konzervált RGD motívum. Az oszteopontin eltérő szövetekben megfigyelhető expressziója az említett konzervált motívumok közül egyet vagy többet érintő, különféle funkcióinak meglétére utal. Bár az oszteopontin szempontjából „knockout” egér jellegtelen fenotipusa alapján korábban egyetlen szövetben sem lehetett egyértelműen meghatározni az oszteo:.:. j.:. . ·. : ·· * · ·· ·*· · ·

-21 pontin szerepét, az újabb vizsgálatok nagyon érdekes új információt nyújtottak a protein különféle biológiai eseményekben, így pl. a fejlődési folyamatokban, a sebgyógyulásban, az immunológiai válaszreakciókban, a daganatképződésben, a csontreszorpcióban és a kalcifikációban betöltött szerepével kapcsolatban. Az oszteopontin funkcionális sokfélesége jórészt annak a tudható be, hogy különböző szignáltranszdukciós reakcióutakhoz kapcsolódó receptorokon keresztül képes a sejtaktivitás stimulálására (Sodek és mtsai.).

Az oszteopontin a patkány spinális és trigeminális idegrendszerében lévő elsődleges érző neuronoknak mind a sejttestében, mind az axonjában expresszálódik [Ichikawa és mtsai. (2000)].

Az oszteopontin mRNS-e in situ hibridizációs vizsgálatok alapján a felnőtt emberi agyban is expresszálódik. Az expresszió a szaglóhagymában és az agytörzsben volt megfigyelhető, az utóbbiban funkcionálisan eltérő helyeken, így pl. mozgató-, érző- és retikuláns területeken [Shin és mtsai. (1999)].

Egy másik kísérletben patkányokban az előagyat érintő átmeneti isémiát követően az oszteopontin mRNS expressziójának idő- és térbeli megjelenését vizsgálták. A globális isémiát követő átmeneti OPN mRNS indukció a csíkolt testben hamarabb jelentkezett, mint a hippocampusban. A jelenség kifejezett volt a csíkolt test oldalsó agykamrához közeli dorsomediális területén, a CA1 almezőben és a hippocampus subiculumában a mikroglia sejtek reaktivitásának fokozódása előtt. Kimutatható volt még a hilus dentatusban és igen kis mértékben a CA3-an is [Lee, Μ. Y„ Shin, S. L„ Choi, Y. S„ Kim, E. L, Cha, J. H„ Chun, Μ. H„ Lee, S. B., Kim, S. Y.: Neurosci. Lett. 271, 81 (1999)].

Az oszteopontint más néven Eta-l-nek is nevezik. A WO 00/63241 számú nemzetközi közzétételi irat immunválasz-módosítással, elsősorban az I. típusú immunválasz Eta-1 („early T lymphocyte activation-1”, korai T-limfocita aktivátor l)/oszteopontin modulátorokkal végzett módosításával foglalkozik. Az oszteopontin modulátorokat alkalmasnak tekintik különféle fertőzések, immunológiai rendellenességek és kórképek, autoimmun megbetegedések (pl. SM), különféle immunhiányos problémák és rákos megbetegedések gyógykezelésére. Az autoimmun megbetegedések, köztük a szklerózis multiplex gyógykezelésére alkalmasnak tekintett, a WO 00/63241 számú nemzetközi közzétételi iratban közzétett oszteopontin modulátorok az oszteopontin/Eta-1 gátló anyagai, amint az a WO 00/63241 számú nemzetközi közzétételi irat V. fejezetének („Clinical Applications of the Modulatory Methods of the Invention , D „Autoimmune Diseases”) 51-53. oldalán szerepel.

Az interferonok gyulladáscsökkentő, vírusellenes és proliferáció-ellenes hatással rendelkező citokin-alosztály tagjai. Biokémiai és immunológiai tulajdonságaik alapjan a terme-22szetes körülmények között előforduló emberi interferonokat három osztályba soroljuk: alfa interferon (leukocita), béta interferon (fibroblaszt) és gamma interferon (immun). Az alfa interferon az Egyesült Államokban és más országokban hivatalosan igénybe vehető tüskés sejtes leukémia („hairy cell leukemia”), nemi szervi szemölcsök, Kaposi-szarkóma (AIDS betegekben gyakran előforduló daganat) és idült nem-A nem-B máj gyulladás kezelésére.

Az interferonok a szervezetben vírusfertőzések hatására termelődő glikoproteinek. A védett sejtekben meggátolják a vírusok elszaporodását. Az alacsony molekulatömegű proteint tartalmazó interferonok jellemzően nem specifikus hatásúak, vagyis az egyfajta vírus által indukált IFN számos egyéb vírus ellen is hatékonyak. Faj specifikusak, tehát az egy adott faj által termelt interferon csupán ugyanazon vagy vele közeli rokonságban álló faj sejtjeiben képes vírusellenes hatást kifejteni. Az interferonok voltak az első citokinek, amelyek potenciális daganatellenes és vírusellenes aktivitását megkísérelték gyógyászati célra igénybe venni.

A három fő interferon osztály jelölésére az IFN-a, IFN-β és IFN-γ jelzést alkalmazzuk. A fő interferon osztályokat kezdetben a forrásukul szolgáló sejttípus (leukocita, fibroblaszt, T-sejt) alapján nevezték el. Azóta azonban világossá vált, hogy egyazon sejt különféle interferon-típusokat termelhet. Ettől kezdve a leukocita eredetű IFN-t IFN-oc-nak, a fibroblaszt eredetű IFN-t IFN-p-nak, a T-sejt eredetű IFN-t IFN-y-nak nevezzük. Létezik egy negyedik típusú interferon is, a Burkitt-limfómából származó „Namalwa” sejtvonal által termelt limfoblasztoid IFN, ez a sejtvonal feltehetően leukocita és fibroblaszt IFN keveréket állít elő.

Az interferonegység (a némiképp önkényesen megállapított definíció szerint) a sejtek 50%-ának víruskárosítással szembeni megvédéséhez szükséges IFN aktivitás mértéke.

Mindegyik interferon osztály jól elkülönülő típusokat tartalmaz. Az IFN-β és az IFN-γ egyazon gén terméke. Az egyes típusok közötti különbségek feltehetően az eltérő mértékű glikozilációból adódnak.

A több mint 15 típusból álló IFN-oc-k a legváltozatosabb csoportot jelentik. A 9. kromoszómán legalább 23 tagból álló IFN-α génklaszter található, amelyek közül 15 aktív és transzkripcióra kerül. Az érett IFN-α. nem glikozilált.

Az IFN-α és IFN-β azonos nagyságúak (165 vagy 166 aminosavból állnak) és hasonló biológiai hatással rendelkeznek. A 146 aminosavból álló IFN-y-k kevésbé hasonlítanak az IFN-α és IFN-β osztályok tagjaira. Csupán az IFN-y-k képesek a makrofágok aktiválására vagy a T „killer” sejtek érésének előidézésére. Ezeket az új típusú gyógyászati ágenseket biológiai válaszreakciót módosító anyagoknak („biologic response modifiers”, BRM) nevezhet-

-23 jük, mivel a szervezet daganatra adott válaszreakciójára gyakorolnak hatást, immunmódosításon keresztül befolyásolva a daganat felismerését.

Közelebbről, az emberi fibroblaszt eredetű interferon (IFN-β) vírusellenes aktivitással rendelkezik és stimulálhatja a „natural killer” sejtek daganatsejtek elleni aktivitását. Ez a mintegy 20000 Da molekulatömegű polipeptid vírusok és dupla szálú RNS-ek hatására keletkezik. A rekombináns DNS-technológiával klónozott fibroblaszt interferon gén nukleotidszekvenciájából Derynk és mtsai. levezették a 166 aminosav nagyságú protein teljes aminosav-szekvenciáját [Derynk, R. és mtsai. (1980)].

Shephard és mtsai. a molekula vírusellenes hatását megszüntető, a 842. bázisnál kialakult mutációról (Cys -» Tyr a 141. pozíciónál) számoltak be és bemutattak egy, a 1119-1121 nukleotidok deléciójával létrejött variáns kiónt is [Shephard, Η. M. és mtsai. (1981)].

Mark és mtsai. mesterséges mutációt alakítottak ki a 469. bázis (T) (A)-val történő helyettesítésével, ami a 17. pozícióban Cys -> Ser cserét eredményezett [Mark, D. F. és mtsai. (1984)]. Az így nyert IFN-β legalább annyira aktív volt, mint az „eredeti” és hosszú távú tárolás (-70°C) során is stabilnak bizonyult.

A Rebif® (rekombináns emberi interferon-β), a szklerózis multiplex elleni interferon terápia legújabb eszköze lényeges előrelépést jelent a kezelés hatékonyságában. A gyakorlatilag a természetes körülmények között előforduló emberi molekulával azonos Rebif®-et [interferon(IFN)-b la-t] emlőseredetű sejtek termelik.

Az interferonok hatásmechanizmusa még nem teljesen tisztázott. A legtöbb esetben meghatározott gének indukciójának vagy transzkripciójának befolyásolásán keresztül gyakorolnak hatást az immunrendszerre. In vitro kísérletekben kimutatták, hogy az interferonok mintegy 20 géntermék termelésének előidézésére vagy elnyomására képesek.

A szklerózis multiplex esetében az IFN-β hatása három fő úton érvényesülhet:

- a T-sejtek egyes funkcióinak, pl. aktiválásának, proliferációjának és „szuppresszor” hatásának szabályozása;

- a citokinek termelésének módosítása, a gyulladást elősegítő citokinek expressziójának csökkentése, a gátló, gyulladásellenes citokinek expressziójának fokozása;

- a T-sejtek vér-agy gáton keresztül a központi idegrendszerbe jutásának szabályozása.

A PRISMS vizsgálatban megállapították a hetente háromszor szubkután adagolt IFN-β la fellángoló-alábbhagyó („relapsing-remitting”) szklerózis multiplex (RR-MS) kezelésében mutatott hatékonyságát. A vizsgálat eredményei alapján az IFN-β la pozitív hatást képes gyakorolni a szklerózis multiplex hosszú távú kórlefolyására azáltal, hogy csökkenti a fellángolá-24sok számát és súlyosságát és mérsékli a betegség MRI vizsgálattal megállapított aktivitását [„Randomised, Double-Blind, Placebo-Controlled Study of Interferon beta-la in Relapsingremitting Multiple Sclerosis”, The Lancet 352, 1498 (1998)].

A jelen leírásban egyetlen dokumentumra való hivatkozás sem jelenti annak elismerését, hogy az adott közlemény a találmány szerinti megoldásra vonatkozó korábbi ismeretet tartalmaz, vagy a jelen szabadalmi bejelentés igénypontjai alátámasztását szolgálná. Bármely közlemény tartalmára vagy dátumára vonatkozó bármely megállapítás a benyújtás pillanatában rendelkezésünkre álló információn alapul és nem jelenti az említett megállapítások helyességének elismerését.

A találmány tárgyát neurológiai megbetegedés kezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló új módszer képezi.

A találmány szerinti megoldás alapját az a felismerés képezi, hogy az oszteopontin nevű protein elősegíti a gliasejtek proliferációját és differenciálódását, ezáltal az idegek mielinizációját és regenerációját. A találmány szerinti megoldással összefüggésben kimutattuk továbbá, hogy az oszteopontin kedvező hatást fejt ki a szklerózis multiplex és a perifériás neuropátiák állati modelljeiben.

Mindezeknek megfelelően a találmány tárgyát oszteopontin, vagy oszteopontin aktivitást elősegítő anyag neurológiai kórképekben, pl. traumás idegsérülésben, stroke-ban, a központi vagy a környéki idegrendszer demielinizációval járó megbetegedéseiben, neuropátiákban és neurodegeneratív megbetegedésekben történő alkalmazása képezi.

A találmány tárgyát képezi továbbá az oszteopontin interferonnal kombinációban neurológiai megbetegedések kezelésére és/vagy megelőzésére történő alkalmazása is. A találmány tárgyát képezi továbbá a nukleinsav-molekulák és az oszteopontint tartalmazó expreszsziós vektorok, valamint az oszteopontint expresszáló sejtek neurológiai megbetegedés kezelésére és/vagy megelőzésére történő alkalmazása. A találmány tárgyát képezik továbbá az oszteopontint és egy interferont, valamint adott esetben egy vagy több gyógyászati szempontból elfogadható kötőanyagot tartalmazó gyógyászati készítmények is.

Az alábbiakban az ábrák rövid leírását közöljük.

Az 1A ábrán az oszteopontin expresszió eltérő idejű kuprizon kezelés után TaqMan® elemzéssel megállapított mértékét bemutató oszlopdiagram látható. 3/5 w. cup = 3 vagy 5 hetes kuprizon kezelés; 5 w. cup + 1/3/6 w. = 5 hetes uprizon kezelés, majd a kezelés megszüntetése után egy/három vagy hat hetes gyógyulás.

Az 1B ábrán a kisagyi fejlődés különböző fázisaiban az oszteopontin, az MBP és a PLP mRNS kontroll C 1-hez viszonyított, TaqMan® elemzéssel megállapított szabályozásé-25 • · · · · · ·· ··:···:··..· a. ..

nak mértékét mutatjuk be. C1-C20 = születés utáni kisagy 1-20 napos korig; CA = felnőtt kisagy·

A 2. ábra az oszteopontin és ismert izoalakjai, valamint C- és N-terminális szerkezetek sematikus képét tartalmazza.

A 3. ábra az oszteopontin kódoló szekvenciáját tartalmazó Pác plazmid sematikus képe.

A 4. ábra a 6 órán át (1), két napon át (2), hat napon át (3) vagy 10 napon át (4) cAMP-vel kezelt „oli-neu” oligodendrocita sejtvonalban megfigyelhető, kontrolihoz viszonyított oszteopontin mRNS-expresszió fokozódást bemutató oszlopdiagram. Az 5. és a 6. oszlop kuprizon kísérletben tapasztalt oszteopontin mRNS mennyiséget mutat be. (5) = három hetes kuprizon kezelés, (6) = öt hetes kuprizon kezelés.

Az 5. ábrán az oszteopontin kódoló szekvenciát tartalmazó pDEST 12.2 plazmid sematikus rajza látható.

A 6. ábrán az oszteopontin kódoló szekvenciát és EGFP jelű fluoreszcens markert tartalmazó pDEST 12.2 plazmid sematikus rajza látható.

A 7. ábrán a HIS-toldalékkal ellátott oszteopontin kódoló szekvenciát tartalmazó pDEST 12.2 plazmid sematikus rajza látható.

A 8. ábra oli-neu sejtek inzulinmegvonás és bakulovírusban (Baculo-OPN) vagy HEK-sejtben (HEK-OPN) expresszált oszteopontinnal végzett 24 órás kezelés után megfigyelhető proliferációját mutatja be. Az eredményeket élő sejteket megfestő „Alamar Blue” festék megfigyelhető fluoreszcenciájának mértékében adtuk meg.

A 9. ábra inzulinmegvonás mellett tenyésztett oli-neu sejtek bakulovírusban (BACOPN) vagy HEK-sejtben (HEK-OPN) expresszált oszteopontinnal végzett 24 órás kezelés után megfigyelhető proliferációjának dózis-hatás görbéjét tartalmazza.

A 10. ábra inzulinmegvonás mellett tenyésztett oli-neu sejtek vagy teljes hosszúságú, bakulovírusban expresszált oszteopontinnal (BacOPN), vagy oszteopontin N-terminális fragmensével (N-terminal BacOPN) végzett kezelés után megfigyelhető proliferációját mutatja be.

All. ábra 100 nM bakulovírusban expresszált rekombináns oszteopontinnal kezelt vegyes kérgi tenyészetek MBP immunhisztokémiai vizsgálatának eredményét tartalmazza. A = kontroll; B = OPN-kezelés; C = a B kinagyítva, D = OPN-kezelt kevert kortikális tenyészetből származó másik látómező, amelyben nem láthatók axonok.

-•l· ’·:· ·.< ϊ ’

-26A 12 ábrán LIF-fel és bakulovírusban expresszált oszteopontinnal kezelt mielinizálódó, kevert kortikális tenyészetek ELISA-val meghatározott MBP protein termelésének fokozódása látható.

A 13. ábrán in vitro foszforilált E. coli-ban expresszált oszteopontinnal (OPN-E-coli) vagy bakulovírusban expresszált oszteopontinnal (OPN Bac) különböző adagjaival (10 pM, 10 nM, 100 nM) kezelt CG4 sejtek proliferációja látható.

A 14. ábrán a vivőanyaggal (PBS-sel), vivőanyaggal + 0,1% BSA-val, 1,10 vagy 100 μg/kg AS900011-gyel (oszteopontinnal), vagy 100 pg/kg AS900011 és 20000 E egéreredetű interferon béta (mIFNP) kombinációjával, vagy csupán 20000 E mIFNp-val szubkután kezelt EAE egerek gerincvelőjében megfigyelhető perivaszkuláris gyulladásos sejtes infiltráció kitelj edtsége látható.

A 15. ábrán a vivőanyaggal (PBS-sel), vivőanyaggal + 0,1% BSA-val, 1,10 vagy 100 pg/kg AS900011-gyel (oszteopontinnal), vagy 100 pg/kg AS900011 és 20000 E egéreredetű interferon béta (mIFNp) kombinációjával, vagy csupán 20000 E mIFNp-val szubkután kezelt EAE egerek gerincvelőjében megfigyelhető, demielinizációt mutató terület százalékos aránya látható.

A 16. ábrán a vivőanyaggal (PBS-sel), vivőanyaggal + 0,1% BSA-val, 1, 10 vagy 100 pg/kg AS900011-gyel (oszteopontinnal), vagy 100 pg/kg AS900011 és 20000 E egéreredetű interferon béta (mIFNP) kombinációjával, vagy csupán 20000 E mIFNp-val szubkután kezelt EAE egerek esetében a kezelés végén megállapított klinikai pontszám, a gyulladásos sejtes infiltráció, valamint a demielinizáció kiterjedtsége látható.

A 17. ábra a vivőanyaggal, 1, 10 vagy 100 pg/kg oszteopontinnal (Őst), pozitív kontroll vegyület (4-MC) 10 pg/kg-os adagjával, vagy 100 pg/kg denaturált oszteopontinnal (OstD) kezelt, ülőideg-roncsolással neuropátiássá tett egerek testtömegét mutatja be.

A 18. ábra a vivőanyaggal, 1, 10 vagy 100 pg/kg oszteopontinnal (Őst), pozitív kontroll vegyület (4-MC) 10 pg/kg-os adagjával, vagy 100 pg/kg denaturált oszteopontinnal (OstD) kezelt neuropátiás egerek összetett izom akciós potenciáljának amplitúdóját mutatja be.

A 19. ábra a vivőanyaggal, 1, 10 vagy 100 pg/kg oszteopontinnal (Őst), pozitív kontroll vegyület (4-MC) 10 pg/kg-os adagjával, vagy 100 pg/kg denaturált oszteopontinnal (OstD) kezelt neuropátiás egerek összetett izom akciós potenciáljának látenciáját mutatja be.

A 20. ábra a vivőanyaggal, 1, 10 vagy 100 pg/kg oszteopontinnal (Őst), pozitív kontroll vegyület (4-MC) 10 pg/kg-os adagjával, vagy 100 pg/kg denaturált oszteopontinnal (OstD) kezelt neuropátiás egerek összetett izom akciós potenciáljának időtartamát mutatja be.

Η· Η· / 1 Ί

-27 A 21. ábra a vivőanyaggal, 1, 10 vagy 100 pg/kg oszteopontinnal (Őst), pozitív kontroll vegyület (4-MC) 10 pg/kg-os adagjával, vagy 100 pg/kg denaturált oszteopontinnal (OstD) kezelt neuropátiás egerek degenerált rostjainak arányát mutatja be.

A 22. ábra a vivőanyaggal, 1, 10 vagy 100 pg/kg oszteopontinnal (Őst), pozitív kontroll vegyület (4-MC) 10 pg/kg-os adagjával, vagy 100 pg/kg denaturált oszteopontinnal (OstD) kezelt neuropátiás egerekben a látóterenként! mielinizált idegrostok számát tartalmazza.

Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmány szerinti megoldást.

A találmány szerinti megoldás alapját az a felismerés szolgáltatta, hogy az oligodendrociták differenciálódása és a kisagy kifejlődése során az oszteopontin differenciált módon expresszálódik. Kimutattuk továbbá azt is, hogy az oszteopontin cDNS oligodendrocitákban való expresszálódása in vitro az említett sejtek differenciált fenotípusának kialakulását eredményezi. Az oszteopontin expresszió következtében az oligodendrociták differenciálódó, mielinképző sejtre jellemző fenotípust mutatnak. Az említett in vitro jelenségek mellett kimutattuk továbbá, hogy az oszteopontin, és különösen az oszteopontin és az interferon kombinációja előnyös hatást fejt ki szklerózis multiplex egy bevezetett modelljében. A perifériás neuropátia kísérletes modelljében az oszteopontin kifejezetten jó hatással volt az idegi aktivitásra, lényeges mértékben csökkentette a degenerált idegrostok százalékos arányát és fokozta a mielinizációt.

A jelen leírásban bemutatott kísérletes eredmények ennek megfelelően új lehetőséget nyit a neurológiai megbetegedések, különösen az idegsejtek és a gliasejtek működésével öszszefuggő kórképek gyógykezelésében. Az említett megállapítások annak fényében különösen meglepőek, hogy a WO 00/63241 számú nemzetközi közzétételi iratban leírtak szerint a szklerózis multiplex kezelése érdekében az oszteopontin gátlására van szükség.

Mindezeknek megfelelően a találmány tárgyát oszteopontin vagy oszteopontin aktivitás agonista vegyülete idegrendszeri betegség gyógykezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló gyógyszer előállítására történő alkalmazasa kepezi.

Az „oszteopontin” megnevezés alatt a nyolcvanas évek vége óta ismert aminosavszekvenciával rendelkező, teljes hosszúságú emberi oszteopontint értünk [Oldberg és mtsai. (1986); Kiefer és mtsai. (1989)]. Az emberi oszteopontin szekvenciáját a csatolt szekvencialistában az 1. azonosítószámon tesszük közzé. Az oszteopontin kifejezés magában foglalja továbbá az állatokból, pl. egérből, szarvasmarhából, patkányból származó oszteopontint is, amennyiben az adott molekula oszteopontin aktivitást biztosító mértékben megegyezik az eredeti oszteopontinnal, és amennyiben emberben nem immunogén.

-28A találmány szerinti megoldásban az oszteopontin megnevezés magában foglalja továbbá az oszteopontin mutációit és fragmenseit, pl. természetes körülmények között előforduló izoalakjait is. Az oszteopontin transzkripciós szinten (alternatív szplájszing) és poszttranszlációs módosulások (foszforiláció, glikoziláció) miatt funkcionálisan eltérő alakokban expresszálódik. Ez idáig az OPN három szplájsz-variánsa ismert, ezek az OPN-a (más néven „teljes hosszúságú” oszteopontin), az OPN-b és az OPN-c (1. 2. és 3. azonosítószámú szekvencia; 2. ábra). Az említett izoalakokat pl. Kon és mtsai. (2000) írták le és pl. Saitoh és mtsai. (1985) és Kon és mtsai. (2002) jellemezték.

A trombinnal végzett hasítás a protein N- és C-terminális részeit tartalmazó két in vivo proteolitikus hasítási fragmens keletkezését eredményezi. Az oszteopontin, különösen pedig a protein C-terminális részének foszforilálása lényeges hatással bírhat a molekula funkciója szempontjából. Az oszteopontin megnevezés ennélfogva magában foglalja az említett proteolitikus fragmenseket és az eltérően foszforilált oszteopontin alakokat is.

Az oszteopontin megnevezés magában foglalja a molekula izoalakjait, mutációit, fúziós proteinjeit, funkcionális származékait, aktív részeit vagy fragmenseit, cirkulárisán permutált származékait vagy mindezek sóit is. Ezek az izoalakok, mutációk, fúziós proteinek, funkcionális származékok, aktív részek vagy fragmensek, cirkulárisán permutált származékok vagy mindezek sói megtartják az oszteopontin biológiai hatasat. Ezek a molekulák az eredeti oszteopontinhoz képest előnyösen fokozott biológiai aktivitással rendelkeznek.

Az „oszteopontin aktivitás agonista vegyületei” kifejezés alatt az oszteopontin aktivitását stimuláló vagy utánzó molekulát értünk, ilyenek pl. az oszteopontin receptor agonista ellenanyagai, vagy az oszteopontin receptoron keresztül szignáltranszdukciót aktiváló kis molekulatömegű agonista vegyületek. Az oszteopontin legalább kétféle receptor-csoporton keresztül fejti ki hatását. Egyrészt RGD (Arg-Gly-Asp) sejtkötődési motívumon keresztül mangán jelenlétében av-integrinekkel (ανβ3 és av5 integrin receptorokkal) [Kunicki és mtsai. (1997)], másrészt CD44 v6-vl0 variáns izoalakokkal lép kölcsönhatásba. Feltételezhetően az oszteopontin C-terminális vége a CD44-gyel létrejövő kapcsolatban, míg N-terminális vége az integrin receptorokkal kialakított kölcsönhatásban, a makrofágok proliferációjában, túlélésében és differenciálódásában vesz részt.Az oszteopontin N-terminális része IL-12 és IL-10 kibocsátást is indukál. A leírás szerinti „OPN aktivitás agonistája” kifejezés felöleli az említett receptorok bármelyikének agonista-, stimuláló vagy enhenszer vegyületét.

Az „oszteopontin aktivitás agonistája” kifejezés a leírás szerinti értelemben kiterjed továbbá az oszteopontin közvetített aktivitás hatékonyságát fokozó ágensekre is. Ilyen aktivitások pl. a sejtek extracelluláris mátrix összetevőkhöz történő kapcsolódásának elősegítése, az • · · · · · * « · · ·· » ^: r Η· ·.> Λ

-29oligodendrocita sejtvonal sejtjeinek mielintermelő sejtekké történő átalakulásának elősegítése, az oligodendrocita sejtvonalba tartozó sejtek (progenitor vagy prekurzor sejtek) toborzásának, proliferációjának, differenciálódásának vagy érésének elősegítése, valamint az oligodendrocita sejtvonalba tartozó sejtek apoptózissal és sejtkárosodással szembeni védelmének elősegítése.

A „gyógykezelés” és „megelőzés” kifejezések alatt idegrendszeri megbetegedés valamint idegrendszeri megbetegedéssel kapcsolatos tünetek, betegségek vagy komplikációk egy vagy több tünetének vagy okának megelőzését, meggátlását, csillapítását, javítását vagy viszszafordítását értjük. A neurológiai megbetegedés „gyógykezelése” során a találmány szerinti anyagokat a betegség kialakulását követően alkalmazzuk, míg a „megelőzés” során az említett anyagok igénybe vételére a betegség páciensen látható tüneteinek megjelenése előtt kerül sor.

A „neurológai megbetegedés” kifejezés magában foglalja a központi és a környéki idegrendszer összes ismert neurológiai megbetegedését, kórképét vagy sérülését, ideértve a korábban részletesen ismertetett kórképeket is.

A neurológiai megbetegedések közé tartoznak a központi vagy a környéki idegrendszer rendellenes működésével, pl. az idegi ingerület-átvitellel, a fejfájással, a fejsérüléssel, a központi idegrendszeri fertőzésekkel, a neuro-ophthalmológiai és fejideg elváltozásokkal, az agyféltekék működésével és rendellenes működésével, a mozgással, az eszméletvesztéssel és kómával, a demielinizácios kórképekkel, a deliriummal es elbutulassal, a craniocervicalis kapcsolódással, a görcsrohamokkal, a gerincvelői rendellenességekkel, az alvással, a perifériás idegrendszerrel, a cerebrovascularis kórképekkel vagy az izom-rendellenességekkel kapcsolatos betegségek. Az említett rendellenességek definíciója megtalálható pl. a következő Internet oldalon: http://www.merck.com/pubs/mmanual/sectionl4/secl4.htm.

A találmány szerinti neurológiai megbetegedés előnyösen a következők bármelyike: traumás idegsérülés, stroke, a központi és a körzeti idegrendszer demielinizácios kórképei, neurodegeneratív betegségek.

A traumás idegsérülés helye a központi vagy a körzeti idegrendszerben lehet, ide értjük az agy- vagy gerincvelői traumát és pl. a paraplégiát is (Id. fentebb).

A stroke oka agyi hipoxia vagy isémia lehet, ezt a kórképet agyér-megbetegedésnek vagy -balesetnek is nevezik. A stroke bizonyos agyterületek vérellátásának megszakadása következtében kialakuló agyi funkcióvesztést (neurológiai deficitet) okozhat. A vérellátás megszakadása származhat pl. az agybeli vérerekben képződött véralvadék (trombus), vagy az egyéb helyről az agyba kerülő véralvadék, ateroszklerózisos plakkrészlet vagy egyéb anyag (embólus). Az agybeli vérzés a stroke-hoz hasonló tüneteket idézhet elő. A stroke leggyakrabΜ· χ

-30ban ateroszklerózis következtében, másodlagosan alakul ki (agyi trombózis). Ennek megfelelően a találmány tárgyát képezi az ateroszklerózis gyógykezelése is.

A perifériás neuropátia az érzékelés hiányával, izomgyengeséggel és -sorvadással, a mély ínreflexek gyengülésével, valamint vazomotorikus tünetekkel jellemezhető szindróma. Az említett tünetek külön-külön vagy bármely kombinációban egyaránt előfordulhatnak. A betegség érinthet egy ideget (mononeuropátia), különálló helyeken lévő két vagy több ideget (multiplex mononeuropátia) vagy egyidejűleg sok ideget (polineuropátia). Elsődleges károsodást szenvedhet az axon (pl. cukorbetegségben, Lyme-kórban, urémiában vagy toxikózisban), vagy a mielinhüvely vagy a Schwann-sejtek (pl. heveny vagy idült gyulladásos polineuropátiában, leukodisztrófiákban vagy Guillain-Barré-szindrómában). A találmány szerint gyógykezelhető egyes (pl. ólommérgezés, dapson mérgezés, kullancscsípés, porfiria vagy GuillainBarré-szindróma következtében kialakuló) neuropatiák elsősorban a mozgatórostokat károsítják, míg a más okból (pl. rákos eredetű dorsalis gyökér ganglionitis, lepra, AIDS, cukorbetegség vagy idült piridoxin-toxikózis) létrejövő elváltozások elsődlegesen a dorsalis gyökérbeli ganglionokra vagy érzőrostokra terjednek ki, érzékelésbeli problémákat okozva. Esetenként a cranialis idegek érintettsége is megfigyelhető (pl. Guillain-Barré-szindrómában, Lyme-kórban, cukorbetegségben, diftériában).

Az Alzheimer-kór agyszövetbeli elváltozások következményeként kialakuló, a mentális funkciók károsodásával járó rendellenesség. Ide tartozik az agyszövet-zsugorodás, az elsődleges degeneratív elbutulás és a diffúz agyszövet-sorvadás. Az Alzheimer-kórt más néven Alzheimer-típusú időskori elbutulásnak (SDAT) is nevezik.

A Parkinson-kór reszketéssel, járásbeli-, mozgásbeli és koordinációs zavarokkal járó agyi rendellenesség. A megbetegedést az agy izommozgásokat szabályozó részének károsodása okozza. A Parkinson-kórt reszkető bénulásnak vagy paralysis agitansnak is nevezik.

A Huntington-kór autoszomális domináns módon öröklődő idegrendszeri megbetegedés.

A miatrófiás laterális szklerózis (ALS) az agyvelőben és a gerincvelőben lévő idegsejtek pusztulása miatt a harántcsíkolt izmok idegi ellenőrzésének fokozatos elvesztésével járó rendellenesség. A Lou Gehrig-kómak is nevezett megbetegedést az izmok használatának és szabályozásának megszűnése jellemzi.

A szklerózis multiplex (SM) a központi idegrendszert érintő gyulladásos eredetű, demielinizációval járó megbetegedés. A kórkép lefolyásában átmeneti javulás és visszaesés váltakozhat, vagy progresszív rosszabbodás tapasztalható. A szklerózis multiplex nem az egyetlen demielinizációval járó megbetegedés. A perifériás idegrendszerben a kórkép megfelelője •*·< · »w • · X

-31 az idült gyulladásos demielinizációs poliradikuloneuropátia (CIDP). Emellett léteznek heveny, monofázisos kórképek, mint pl. a perifériás idegrendszerben Guillain-Barré-szindrómának (GBS-nek) nevezett gyulladásos demielinizációs poliradikuloneuropátia, valamint a központi idegrendszerben a heveny disszeminált encephalomyelitis (ADEM).

További neurológiai rendellenességek pl. a rendellenes mielinizációval járó kórképek (Id. fentebb), valamint a carpalis alagút szindróma. A traumás idegsérülés együtt járhat a gerincoszlop ortopédiai elváltozásaival, amelyek szintén a találmány tárgykörébe tartoznak.

A neurológiai megbetegedések veleszületett metabolikus zavarok következtében is kialakulhatnak. A találmány egy előnyös megvalósítási módjában a neurológiai megbetegedés veleszületett metabolikus deficit következménye.

Találmány szerinti metabolikus megbetegedések lehetnek többek között a fenilketonuria és egyéb aminosavuriák, a Tay-Sachs-, a Niemann-Pick- és a Gaucher-kór, a Hurler-szindróma, a Krabbe-kór és más leukodisztrófiák. Ezek a kórképek elsősorban a központi idegrendszerben a fejlődő mielinhüvelyt érintik.

A veleszületett metabolikus zavarok által okozott neurológiai megbetegedéseket a fentiekben már részletesen ismertettük.

A találmány tárgykörébe tartoznak továbbá kevésbé jól ismert neurológiai megbetegedések, mint pl. a neurofibromatózis vagy a több szervrendszerre kitelj edő atrófia („Multiple System Atrophy”, MSA). A találmány szerint gyógykezelhető további kórképeket a fentiekben már részletesebben ismertettük.

A találmány egy további előnyös megvalósítási módjában a neurológiai megbetegedés perifériás neuropátia, legelőnyösebben cukorbetegséghez kapcsolódó neuropátia (diabetikus neuropátia). A találmány szerinti terápiával előnyösen kezelhető betegségek közé tartoznak továbbá a kemoterápiával kapcsolatos neuropátiák is.

A „diabetikus neuropátia” kifejezés magában foglalja a cukorbetegséghez kapcsolódó bármely neuropátiát, a diabetikus neuropátia által okozott vagy ahhoz kapcsolódó egy vagy több tünetet vagy rendellenességet, valamint a cukorbetegség idegeket érintő, a fentiekben részletesen ismertetett komplikációit. A diabetikus neuropátia polineuropátia is lehet. A diabetikus polineuropátiában nagyszámú ideg egyidejű érintettsége figyelhető meg. A cukorbetegséghez kapcsolódó neuropátia lehet azonban mononeuropátia is. Fokális mononeuropátiában a kórkép egyetlen ideget érint, ez lehet pl. a szemmozgató ideg vagy a n. abducens cramalis. Amennyiben különálló helyeken két vagy több ideg érintett multiplex mononeuropátiáról beszélünk.

-32A találmány egy további előnyös megvalósítási módjában a neurológiai kórkép demielinizációval járó megbetegedés. A demielinizációval járó megbetegedések köze tartoznak előnyösen a központi idegrendszer demielinizációs kórképei, mint pl. a heveny disszeminalt encephalomyelitis (ADEM) és a szklerózis multiplex (SM), valamint a körzeti idegrendszer demielinizációs megbetegedései. Utóbbiak közé tartoznak többek között az idült gyulladásos eredetű demielinizációs poliradikuloneuropátia (CIDP), valamint bizonyos monofázisos kórképek, mint a Guillain-Barré-szindrómának (GBS) nevezett gyulladásos eredetű demielinizációs poliradikuloneuropátia.

A találmány egy további előnyös megvalósítási módjában a találmány tárgyát neurodegeneratív megbetegedés gyógykezelése és/vagy megelőzése képezi. A neurodegeneratív megbetegedés Alzheimer-kór, Parkinson-kór, Huntington-kór vagy ALS lehet.

Az oszteopontin előnyösen a következők egyikenek megfelelő peptid, polipeptid vagy protein lehet;

(a) Az 1. azonosítószámú szekvenciát tartalmazó polipeptid;

(b) Az 1. azonosítószámú szekvencia 1-168. vagy 1-170. aminosavait tartalmazó polipeptid;

(c) Az 1. azonosítószámú szekvencia 1-16. és 170-314. aminosavait tartalmazó polipeptid.

(d) Az 1. azonosítószámú szekvencia 170-314. aminosavait tartalmazó polipeptid.

(e) A 2. azonosítószámú szekvenciát tartalmazó polipeptid (f) A 3. azonosítószámú szekvenciát tartalmazó polipeptid (g) Az (a) - (f) pontokban felsorolt polipeptidek bármelyikének muteinje, amelynek aminosav-szekvenciája az (a) - (f) pontbeli szekvenciák legalább egyikével legalább 40%-os, vagy 50%-os, vagy 60%-os, vagy 70%-os, vagy 80%-os, vagy 90%-os azonosságot mutat;

(h) Az (a) - (f) pontokban felsorolt polipeptidek bármelyikének muteinje, amelyet az (a) - (f) pontokban felsorolt polipeptidek bármelyikét kódoló natív DNS-szekvencia komplementerével mérsékelten sztringens vagy nagymértékben sztringens körülmények között hibndizálni képes DNS-szekvencia kódol;

(i) Az (a) - (f) pontokban felsorolt polipeptidek bármelyikének muteinje, amelynek aminosav-szekvenciájában az (a) - (f) pontbeli szekvenciákhoz képest bekövetkezett változások konzervatív aminosav szubsztitúciók;

(j) Az (a) - (f) pontbeli polipeptidek bármelyikének sója, izoalakja, fúziós proteinje, funkcionális származéka, aktív frakciója vagy cirkulárisán permutált származéka.

-33 Az aktív frakciók vagy fragmensek bármely oszteopontin izoalak bármely részét vagy doménját így pl. N-terminális végét vagy C-terminális végét, vagy az OPN-a, -b vagy -c közül (Id. 2. ábra) bármelyiket tartalmazhatják. A GRGDS motívum jelen lehet, hiányozhat, vagy mutáns alakban lehet jelen. A heparinkötő hely olyan mértékben mutálódhat, hogy heparin megkötésére alkalmatlanná is teheti az oszteopontint. A teljes nagyságú oszteopontin vagy annak bármely aktív fragmense a következő pozíciójú szerinmaradékok közül egynél vagy többnél foszforilált is lehet: 8, 10, 11, 33, 46, 47, 60, 62, 65, 83, 86, 89, 92, 101, 104, 107, 110, 113, 153, 155, 175, 179, 199, 203,208,212,218, 223,227, 238,242, 247, 251,254, 259, 264, 275, 287, 292, 294, 295.

A foszforiláció utánzása érdekében mindemellett a szerin foszforilációs helyeken szerin -> glutaminsav mutáció is történhet.

Szakember számára egyértelmű, hogy az oszteopontin kisebb szakaszai is elegendők lehetnek hatásának kifejtéséhez, ilyen például az oszteopontin működéséhez nélkülözhetetlen aminosavakat tartalmazó aktív peptid.

Szakember számára az is nyilvánvaló, hogy az oszteopontin muteinjei, sói, izoalakjai, fúziós proteinjei, funkcionális származékai, aktív frakciói vagy cirkulárisán permutalt származékai az oszteopontinéhoz hasonló, vagy akár annál kifejezettebb biológiai aktivitással rendelkezhetnek. Az oszteopontin és muteinjei, izoalakjai, fúziós proteinjei, funkcionális származékai, aktív frakciói vagy fragmensei vagy cirkulárisán permutált származékai vagy mindezek sói biológiai aktivitása együtt tenyésztéses („co-culturing”) vizsgálati eljárásban állapítható meg (Id. 8. példa). A kevert kortikális tenyészetek oligodendrocitákat valamint egyéb, központi idegrendszeri eredetű sejteket (pl. idegsejteket, asztrocitákat, mikroglia sejteket) tartalmaznak és oszteopontinnal, vagy annak muteinjével, izoalakjával, fragmensével, aktív frakciójával, funkcionális származékával vagy sójával történő inkubalas hatásara a mielinizációban jellemzően szerepet játszó gének (pl. P0, MBP vagy MAG) indukálása vagy expressziójának fokozása figyelhető meg bennük. Az említett gének expressziója kvantitatív „real-time” RTPCR (TaqMan® RT-PCR) elemzéssel mérhető (részletesebben lásd a példákat). Az oszteopontin aktivitás meghatározására alkalmas egyszerű vizsgálati eljárás az oligodendrocita proliferációs vizsgálat, amelynek során megfelelő oligodendrocita sejtvonal (pl. oli-neu vagy CG4 sejtek) oszteopontinnal, vagy annak muteinjével, izoalakjával, fragmensével, aktív frakciójával, funkcionális származékával vagy sójával történő inkubálásra kerül sor (Id. a 7. példát).

A találmány szerinti megoldás szempontjából előnyösnek tekintett aktív frakciók aktivitása megegyezik a teljes nagyságú oszteopontinéval vagy meg is haladja azt, vagy egyéb

-34előnyös tulajdonsággal rendelkeznek, pl. jobb a stabilitásuk, alacsonyabb a toxicitásuk vagy immunogenitásuk, vagy könnyebben előállíthatok nagy tételben vagy könnyebben kitisztíthatok. Szakember számára nyilvánvaló, hogy a muteinek, aktív fragmensek és funkcionális származékok előállíthatok a megfelelő cDNS alkalmas plazmidba klónozásával, majd a fentiekben említett együtt tenyésztéses vizsgálatokban történő tesztelésével.

A találmány szerinti proteinek glikolizáltak és nem-glikolizáltak lehetnek, származhatnak természetes forrásból, pl. testfolyadékokból, vagy előnyösen rekombináns úton előállítottak is lehetnek. A rekombináns expresszióhoz prokarióta expressziós rendszer (pl. E. coli), eukarióta expressziós rendszer (pl. rovarsejtek), vagy előnyösen emlőssejt (pl. CHO-sejt vagy HEK-sejt) alapú expressziós rendszer alkalmazható.

A találmány szerinti leírásban „mutein” megnevezés alatt olyan oszteopontin-analógokat értünk, amelyekben a természetes oszteopontin egy vagy több aminosava más aminosavval lett helyettesítve, vagy delécióra került, vagy amelyekben az oszteopontin természetes szekvenciája egy vagy több aminosavval ki lett egészítve anélkül, hogy a kapott termék aktivitása a vad típusú oszteopontinéhoz képest lényeges mértékben megváltozott volna. A muteinek előállítására ismert szintetizálási és/vagy helyirányított mutagenezis eljárások, vagy bármely más e célra megfelelő technika vehető igénybe.

A találmány szerinti megoldásban alkalmazható oszteopontin muteinek vagy az azokat kódoló nukleinsavak az itt ismertetett kitanítás és leírás alapján átlagos képzettségű szakember által túlzott kísérletezés nélkül előállítható szubsztitúciós peptideknek vagy polinukleotidoknak megfelelő alapvetően megegyező szekvenciák véges sorozatából állnak.

A találmány szerinti muteinek a találmány szerinti oszteopontint kódoló DNS-hez vagy RNS-hez mérsékelten vagy nagyfokban sztringens körülmények között hibridizálni képes DNS vagy RNS által kódolt proteinnek felelnek meg. A „sztringens körülmények” kifejezés alatt az átlagosan képzett szakember által sztringensnek tartott hibridizációs és azt követő mosási feltételeket értünk [Id. Ausubel és mtsai.: Current Protocols in Molecular Biology, fentebb, 6.3 és 6.4, kiad.: Intersience, N.Y. (1987, 1992); Sambrook és mtsai.: Molecular Cloning: A laboratory manual, kiad.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)].

Minden megkötés nélkül sztringens körülményeknek nevezzük a 12-20°C-kal a vizsgált hibrid számított Tm értéke alatti hőmérsékleten végzett mosást, pl. 2 x SSC es 0,5% SDS 5 percig, 2 x SSC és 0,1% SDS 15 percig; 0,1 x SSC és 0,5% SDS 37°C-on 30-60 percig, majd 0,1 x SSC és 0,5% SDS 68°C-on 30-60 percig. Átlagos képzettségű szakemberek számára is nyilvánvaló, hogy a sztringensségi viszonyok függnek a DNS-szekvenciák, oligonuk

-35 leotid próbák (pl. 10-40 bázis hosszúságúak) vagy kevert oligonukleotid próbák hosszától is. Kevert próbák alkalmazása esetén SSC helyett előnyös tetrametil-ammónium-kloridot (TMAC) alkalmazni [ld. Ausubel, fentebb].

A találmány egy előnyös megvalósítási módjában bármely említett mutein a csatolt szekvencialista 1., 2. vagy 3. azonosítószámú szekvenciájával legalább 40%-os azonosságot vagy hasonlóságot mutat. Előnyösebben, az azonosság vagy hasonlóság foka legalább 50%os, legalább 60%-os, legalább 70%-os, legalább 80%-os, vagy legelőnyösebben legalább 90%-os.

Az azonosság két vagy több polipeptid-szekvenciának vagy két vagy több polinukleotid-szekvenciának a szekvenciák összehasonlításával megállapított kapcsolatát tükrözi. Általánosságban az azonosság az összehasonlított szekvencia-részletben a két pohnukleotid- vagy polipeptid-szekvencia nukleotidról nukleotidra vagy aminosavról aminosavra történő egyezésére utal.

A nem tökéletesen egyező szekvenciák esetében %-os azonosság megállapítására kerülhet sor. Általánosságban, a két összehasonlítandó szekvenciát úgy rendezik egymás alá, hogy az egyezésük mértéke maximális legyen. Ennek során az egyezés mértékének növelése érdekében a szekvenciák közül egyikbe vagy másikba „hézagok” is illeszthetők. Azonos, vagy nagymértékben hasonló hosszúságú szekvenciák esetében a százalékos azonosság megállapítására előnyösen a szekvenciák mindegyikének teljes hosszára vonatkozóan kerülhet sor („global alignment”, globális egymás alá rendezés); míg az egyenlőtlen hosszúságú szekvenciák esetében megfelelőbb, ha az összehasonlításra meghatározott rövidebb szakaszokon kerül sor („local alignment”, helyi egymás alá rendezés).

A két vagy több szekvencia azonosságának vagy hasonlóságának megállapítására szolgáló eljárások szakember számára jól ismertek. Például két pohnukleotid százalékos azonosságának vagy két polipeptid százalékos azonosságának és százalékos hasonlóságának megállapítására igénybe vehetők a Wisconsin Sequence Analysis Package 9.1 számú verziójában [Devereux, J. és mtsai. (1984)] található BESTFIT és GAP programok. A BESTFIT Smith és Waterman (1981) „helyi homológia” algoritmusát alkalmazva a két szekvencia közötti legnagyobb hasonlóságú egyedi régiót azonosítja. Szekvenciák azonosságának es/vagy hasonlóságának megállapítására egyéb programok is igénybe vehetők, ilyen pl. a BLAST programcsalád [Altschul, S. F. és mtsai. (1990); Altschul, S. F. és mtsai. (1997); elérhető az NCBI honlapjáról a www.ncbi.nlm.nih.gov címen], valamint a FASTA [Pearson, W. R. (1990); Pearson (1988)].

-36......... . _χ .

A találmány szerinti muteinekben előnyösnek tekintett változások az úgynevezett „konzervatív” szubsztitúciók közé tartoznak. Az oszteopontin polipeptidek konzervatív aminosav-szubsztitúciói létrejöhetnek például egyazon csoportba tartozó, a molekula biológiai funkciójának megmaradásának elősegítéséhez megfelelő mértékben hasonló fizikokémiai tu5 lajdonságokkal rendelkező „szinonim” aminosavak [Grantham (1974)] kicserélésével. Egyértelmű, hogy a fentiekben definiált szekvenciákban funkciójuk megváltoztatása nélkül aminosavak inszerciója és deléciója végezhető el, különösen abban az esetben, ha az inszerciók es deléciók csupán néhány, pl. harmincnál kevesebb, vagy előnyösen tíznél kevesebb ammosavra teijednek ki és nem járnak a funkcionális konformáció szempontjából kritikus aminosavak 10 pl. cisztinek eltávolításával vagy áthelyezésével. Az ilyen deléciók és/vagy inszerciók eredményeként létrejött proteinek és muteinek szintén a találmány hatókörébe tartoznak. Az előnyösnek tekintett szinonim aminosav-csoportokat az I. táblázat tartalmazza. A még előnyösebbnek tekintett szinonim aminosav-csoportokat a II. táblázat tartalmazza. A legelőnyösebbnek tekintett szinonim aminosav-csoportokat a III. táblázatban tüntettük fel.

-37·.> .i.

I. táblázat Előnyösnek tekintett szinonim aminosav-csoportok
Aminosav	Szinonim csoport
Ser	Ser, Thr, Gly, Asn
Arg	Arg, Gin, Lys, Glu, His
Leu	He, Phe, Tyr, Met, Val, Leu
Pro	Gly, Alá, Thr, Pro
Thr	Pro, Ser, Alá, Gly, His, Gin, Thr
Alá	Gly, Thr, Pro, Alá
Val	Met, Tyr, Phe, He, Leu, Val
Gly	Alá, Thr, Pro, Ser, Gly
He	Met, Tyr, Phe, Val, Leu, He
Phe	Trp, Met, Tyr, He, Val, Leu, Phe
Tyr	Trp, Met, Phe, He, Val, Leu, Tyr
Cys	Ser, Thr, Cys
His	Glu, LYs, Gin, Thr, Arg, His
Gin	Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gin
Asn	Gin, Asp, Ser, Asn
Lys	Glu, Gin, His, Arg, Lys
Asp	Glu, Asn, Asp
Glu	Asp, Lys, Asn, Gin, His, Arg, Glu
Met	Phe, He, Val, Leu, Met
Trp	Trp

-38II. táblázat

Még előnyösebbnek tekintett szinonim aminosav-csoportok

Aminosav	Szinonim csoport
Ser	Ser
Arg	His, Lys, Arg
Leu	Leu, He, Phe, Met
Pro	Ala, Pro
Thr	Thr
Alá	Pro,Ala
Val	Val, Met, He
Gly	Gly
He	He, Met, Phe, Val, Leu
Phe	Met, Tyr, He, Leu, Phe
Tyr	Phe, Tyr
Cys	Cys, Ser,
His	His, Gin, Arg
Gin	Glu, Gin, His
Asn	Asp, Asn
Lys	Lys, Arg
Asp	Asp, Asn
Glu	Glu, Gin
Met	Met, Phe, He, Val, Leu
Trp	Trp

III. táblázat

Legelőnyösebbnek tekintett szinonim aminosav-csoportok

Aminosav	Szinonim csoport
Ser	Ser
Arg	Arg
Len	Leu, He, Met
Pro	Pro
Thr	Thr
Alá	Alá
Val	Val
Gly	Gly
He	He, Met, Leu
Phe	Phe
Tyr	Tyr ____
Cys	Cys, Ser,
His	His
Gin	Gin
Asn	Asn
Lys	Lys
Asp	Asp
Glu	Glu
Met	Met, He, Leu
Trp	Met

A találmány szerinti megoldásban alkalmazható oszteopontin polipepna es prorem muteinek előállítására alkalmas aminosav-szubsztitúciók kialakítása ismert eljárási lépésekkel történhet, amilyenek pl. a 4959314, 4588585 és 4737462 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokban (Mark és mtsai.), az 5116943 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban (Koths és mtsai.), a 4965195 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban (Narnen és mtsai.), a 4879111 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban (Chong és mtsai.) és az 5017691 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban (Lee és mtsai.) foglaltak; a lizin-szubsztituált proteinekre a 4904584 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat (Shaw és mtsai.) szolgáltat példát.

-40A „fúziós protein” meghatározás alatt oszteopontint vagy annak muteinjét vagy fragmensét egy másik, pl. testfolyadékokban hosszabb ideig jelen lévő proteinhez fuzionálva tartalmazó polipeptidet értünk. Az oszteopontin ennek megfelelően egy másik proteinnel, polipeptiddel, pl. immunglobulinnal vagy annak fragmensével stb. fuzionálható.

A „funkcionális származék” kifejezés alatt oszteopontin származékokat és azok muteinjeit valamint fúziós proteinjeit értjük, amelyek az aminosavakon vagy az N- vagy C-terrmnális csoportokon oldalláncként előforduló funkciós csoportokból szakember számára ismert eljárásokkal állíthatók elő és amelyek a találmány tárgyát képezik, amennyiben nem károsítják az oszteopontinéhoz alapvetően hasonló aktivitással rendelkező protein aktivitását, vala mint nem kölcsönöznek toxicitást az őket tartalmazó készítményeknek.

Ilyen származékok tartalmazhatnak pl. polietilén-glikol oldalláncokat, amelyek elfedhetnek antigénhelyeket és meghosszabbíthatják az oszteopontin testfolyadékokban való tartózkodásának idejét. Egyéb származékok a karboxilcsoportok alifás észtereit, a karboxilcsoportok ammóniával vagy elsődleges vagy másodlagos aminokkal kialakított amidjait, az aminosavak szabad amino-csoportjainak acilgyökökkel (pl. alkanoil vagy karbociklikus aroilcsoportokkal) kialakított származékait, vagy pl. a szerin vagy a treonin szabad hidroxilcsoportjai acilgyökökkel kialakított O-acil származékait tartalmazhatják.

Az oszteopontin, a muteinek vagy a fúziós proteinek ’’aktív frakciója” alatt a proteinmolekula polipeptidláncának bármely fragmensét vagy prekurzorát értjük önmagában vagy a hozzá kötődött molekulákkal vagy reziduumokkal, pl. cukor- vagy foszfátmaradekokkal együtt, vagy a proteinmolekula vagy a cukormaradékok önmagukkal alkotott aggregátumait értjük, amennyiben az említett frakció az oszteopontin aktivitásához alapvetően hasonló aktivitással rendelkezik.

A jelen leírásban „só” alatt az oszteopontin molekula vagy annak analógjai karboxilcsoportjai által képzett sókat és aminocsoportjai által képzett savaddíciós sókat értjük. A karboxilcsoport sói szakember számára ismert eljárásokkal állíthatók elő, ezek szervetlen sók, pl. nátrium-, kalcium-, ammonium-, vas- vagy cinksók stb., valamint szerves bázisokkal, pl. aminokkal, többek között trietanolaminnal, argininnel vagy lizinnel, piperidinnel, prokainnal stb. képzett sók lehetnek. Savaddíciós sók pl. az ásványi savakkal, pl. sósavval vagy kénsavval alkotott sók, valamint a szerves savakkal, pl. az ecetsavval vagy oxálsawal kialakított sók. Természetesen bármely sónak meg kell őriznie az oszteopontin találmány szerinti biológiai aktivitását, vagyis proliferatív hatást kell gyakorolniuk az oligodendrocitákra.

A találmány egy előnyös megvalósítási módjában az oszteopontin molekula hordozómolekulához, a vér-agy gáton történő átjutást elősegítő pepiidhez vagy proteinhez fúzionálva

-41 van jelen. Ez a központi idegrendszer bántalmazottságával járó kórképek esetében elősegíti a molekulának a hatás helyére juttatását. A vér-agy gáton történő drog célbajuttatás megvalósítható a vér-agy gát pl. ozmotikus úton, vagy biokemiailag, vazoaktív anyagok, pl. bradikinin segítségével végzett áttörésével. A vér-agy gáton történő átjutást célzó stratégiák alkalmazhatnak endogén transzport rendszereket, ideértve a hordozó-közvetített transzportereket, mint pl. a glükóz és aminosav hordozókat; az inzulin és a transzferrin esetében működő receptor-közvetített transzcitózist, valamint aktív kiáramlási transzportereket, pl. a p-glikoproteint. A véragy gáton történő átjutásra alkalmazott stratégia továbbá az intracerebrális implantáció is.

Az oszteopontin funkcionális származékai a protein egyes tulajdonságainak, pl. stabilitásának, felezési idejének, biohozzáférhetőségének, az emberi szervezet általi tolerálhatóságának, valamint immunogén hatásának javítása érdekében polimerekkel is konjugálhatók. E cél elérése érdekében az oszteopontin pl. polietilén-glikollal (PEG) kapcsolható össze. A „PEGizálás” ismert eljárásokkal, pl. a WO 92/13095 számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetett módon hajtható végre.

Mindezek alapján a találmány egy előnyös megvalósítási módjában az oszteopontin

PEG-izált.

A találmány egy további előnyös megvalósítási módjában a fúziós protein immunglobulint (lg) tartalmaz. A fúzió lehet közvetlen, vagy megvalósulhat rövid kapcsolópeptiden keresztül, ami lehet csupán 1-3 aminosav nagyságú, vagy hosszabb, pl. 13 aminosav méretű is. Az említett kapcsolószekvencia lehet pl. E-F-M (Glu-Phe-Met) szekvenciájú tripeptid, vagy az oszteopontin szekvencia és az immunglobulin szekvencia közé beillesztett, 13 aminosavbol (Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met) álló szekvencia. Az előbbiek alapján nyert fúziós protein előnyösebb tulajdonságokkal bír, pl. hosszabb ideig van jelen a testfolyadékokban (hosszabb felezési idejű), vagy fokozott specifikus aktivitással, fokozott mértékű expresszióval rendelkezik. Az lg fúzió a fúziós protein kitisztítását is elősegítheti.

A találmány egy további előnyös megvalósítási módjában az oszteopontin egy lg mo lekula konstans részéhez fuzionálva fordul elő. A fúzióra előnyösen nehézlánc-régiókkal, pl. az emberi IgGl CH2 és CH3 nehézlánc régióival kerül sor. A találmány szerinti fúziós proteinek előállítására az lg molekulák más izoalakjai, pl. az IgG2 vagy IgG4 izoalakok, vagy más lg osztályok tagjai, pl. az IgM molekulák is felhasználhatók. A fúziós proteinek lehetnek monomerek, multimerek, ezen belül hetero- vagy homomultimerek. A fúziós protein immunglobulin részének módosításával elkerülhető, hogy aktiválja a komplementkötést vagy a komplement-kaszkádot, vagy elérhető, hogy Fc-receptorokhoz kötődjön.

··:···:··«· .:.

-42A találmány tárgyát képezi továbbá oszteopontin és egy immunszuppresszív ágens kombinációjának egyidejű, egymást követő vagy elkülönült alkalmazása neurológiai rendellenességek gyógykezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló gyógyszer előállítására. Az említett immunszuppresszív ágens lehet szteroid, metotrexát, ciklofoszfamid, anti-leukocita ellenanyag (pl. CAMPATH-1) stb.

A találmány tárgyát képezi továbbá oszteopontin és egy interferon kombinációjának egyidejű, egymást követő vagy elkülönült alkalmazása neurológiai rendellenességek gyógykezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló gyógyszer előállítására.

Jelen leírásban „interferon” alatt bármely, a szakirodalomban ekként definiált molekulát értünk, ideértve a korábban interferonként meghatározott molekulákat is. Az interferon előnyösen lehet emberi eredetű, de származhat más fajból is, amennyiben biológiai aktivitása hasonlít az emberi interferonokéhoz és emberben nem immunogén hatású.

A fenti definíciónak bármely IFN-a, IFN-β és IFN-γ molekula megfelel. A találmány szerinti megoldás szempontjából előnyösnek tekintjük az IFN-β alkalmazását.

A jelen leírásban „béta-interferon (IFN-β)” alatt biológiai folyadékokból izolált vagy prokarióta vagy eukarióta gazdasejtekből rekombináns DNS-eljárásokkal kinyert emberi fibroblaszt eredetű interferont, valamint annak sóit, funkcionális származékait, variánsait, analógjait és ftagmenseit értjük.

A „funkcionális származék” kifejezés alatt olyan származékokat értünk, amelyek az aminosavakon vagy az N- vagy C-terminális csoportokon oldalláncként előforduló funkciós csoportokból szakember számára ismert eljárásokkal állíthatók elő és amelyek a találmány tárgyát képezik, amennyiben gyógyászati szempontból elfogadhatóak maradnak, vagyis nem károsítják a fentiekben ismertetett proteinek biológiai aktivitását, pl. a receptorhoz való kötődésre és a receptor szignáltranszdukció megindítására irányuló képességét, valamint nem kölcsönöznek toxicitást az őket tartalmazó készítményeknek. A származékok tartalmazhatnak kémiai gyököket, pl. szénhidrát- vagy foszfátgyököket, amennyiben megtartják a protein biológiai aktivitását és gyógyászati szempontból elfogadhatók maradnak.

A származékok tartalmazhatják pl. karboxilcsoportok alifás észtereit, a karboxilcsoportok ammóniával vagy elsődleges vagy másodlagos aminokkal kialakított amidjait, az aminosavak szabad amino-csoportjainak acilgyökökkel (pl. alkanoil vagy karbociklikus aroilcsoportokkal) kialakított származékait, vagy pl. a szerin vagy a treonin szabad hidroxilcsoportjai acilgyökökkel kialakított O-acil származékait. Az ilyen származékok tartalmazhatnak pl. poli-43etilén-glikol oldalláncokat, amelyek elfedhetnek antigénhelyeket és meghosszabbíthatják a molekula testfolyadékokban való tartózkodásának idejét.

A találmány szerinti megoldás szempontjából különösen nagy jelentőségűek a derivatizált, vagy a hosszabb hatástartam elérése érdekében komplexkötő ágenssel kombinált proteinek. így a találmány tárgyát képezik a fentiekben említett PEG-izált változatok, vagy a hoszszan tartó in vivo aktivitás érdekében géntechnológiai úton módosított proteinek.

A „származék” megnevezés alatt csupán azokat a származékokat értjük, amelyekben egy aminosav sem lett a többi húsz gyakrabban előforduló aminosav egyikére cserélve.

A jelen leírásban „só” alatt a fentiekben ismertetett proteinek vagy azok analógjainak karboxilcsoportjai által képzett sókat és aminocsoportjai által képzett savaddíciós sókat értjük. A karboxilcsoport sói szakember számára ismert eljárásokkal állíthatók elő, ezek szervetlen sók, pl. nátrium-, kalcium-, ammonium-, vas- vagy cinksók stb., valamint szerves bázisokkal, pl. aminokkal, többek között trietanolaminnal, argininnel vagy lizinnel, piperidinnel, prokainnal stb. képzett sók lehetnek. Savaddíciós sók pl. az ásványi savakkal, pl. sósavval vagy kénsavval alkotott sók, valamint a szerves savakkal, pl. az ecetsavval vagy oxálsavval kialakított sók. Természetesen bármely sónak meg kell őriznie a találmány szerinti proteinek (oszteopontin és béta-IFN) biológiai aktivitását, vagyis a megfelelő receptorhoz való kötődésre és a receptor szignáltranszdukció megindítására irányuló képességét.

A proteinek stabilitásának fokozása érdekében az interferonok polimerekhez is konjugálhatók. A béta-interferon és a polietilénglikol (PEG) elnevezésű poliol által kialakított konjugátum leírása megtalálható pl. a WO 99/55377 számú nemzetközi közzétételi iratban.

A találmány egy további előnyös megvalósítási módjában az interferon β-interferon, még előnyösebben ΙΡΝ-βΜ.

Az oszteopontin és az interferon alkalmazására előnyösen egy időben, egymást követően vagy elkülönülten kerül sor.

A találmány egy előnyös megvalósítási módjában az oszteopontin alkalmazott adagja mintegy 0,0001 - 100 mg/testtömeg kg (ttkg) közötti, vagy mintegy 0,01-10 mg/ttkg közötti, vagy mintegy 1-5 mg/ttkg közötti, vagy mintegy 2 m/ttkg.

A találmány tárgyát képezi továbbá nukleinsav-molekula alkalmazása neurológiai betegség gyógykezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló gyógyszer előállítására, amely nukleinsav-molekula a következők egyikének megfelelő aminosav-szekvenciát tartalmazó polipeptidet kódoló nukleinsav-szekvenciát foglal magában:

(a) Az 1. azonosítószámú szekvenciát tartalmazó polipeptid;

(b) Az 1. azonosítószámú szekvencia 1-168. vagy 1-170. aminosavait tartalmazó polipeptid;

(c) Az 1. azonosítószámú szekvencia 1-16. és 170-314. aminosavait tartalmazó polipeptid.

(d) Az 1. azonosítószámú szekvencia 170-314. aminosavait tartalmazó polipeptid.

(e) A 2. azonosítószámú szekvenciát tartalmazó polipeptid (f) A 3. azonosítószámú szekvenciát tartalmazó polipeptid (g) Az (a) - (f) pontokban felsorolt polipeptidek bármelyikének muteinje, amelynek aminosav-szekvenciája az (a) - (f) pontbeli szekvenciák legalább egyikével legalább 40%-os, vagy 50%-os, vagy 60%-os, vagy 70%-os, vagy 80%-os, vagy 90%-os azonosságot mutat;

(h) Az (a) — (í) pontokban felsorolt polipeptidek bármelyikének muteinje, amelyet az (a) - (í) pontokban felsorolt polipeptidek bármelyikét kódoló natív DNS-szekvencia komplementerével mérsékelten sztringens vagy nagymértékben sztringens körülmények között hibridizálni képes DNS-szekvencia kódol;

(i) Az (a) - (f) pontokban felsorolt polipeptidek bármelyikének muteinje, amelynek aminosav-szekvenciájában az (a) - (f) pontbeli szekvenciákhoz képest bekövetkezett változások konzervatív aminosav szubsztitúciók;

(j) Az (a) - (f) pontbeli polipeptidek bármelyikének sója, izoalakja, fúziós proteinje, funkcionális származéka, aktív frakciója vagy cirkulárisán permutált származéka.

A nukleinsav pl. csupasz nukleinsav molekulaként, pl. intramuszkuláris injektálással adható be.

A nukleinsav tartalmazhat továbbá a kódolt gén emberi testbeli, előnyösen megfelelő sejtekben vagy szövetekben végbemenő expressziójához szükséges vektorszekvenciákat, pl. vírusvektor-szekvenciákat is.

Mindezek alapján a találmány egy előnyös megvalósítási módjában a nukleinsav-molekula expressziósvektor-szekvenciát is tartalmaz. A szakember számára jól ismert expressziósvektor-szekvenciák a kérdéses gén expressziójához szükséges további elemeket is tartalmaznak. Tartalmazhatnak szabályozó szekvenciákat, pl. promoter- és enhenszer-szekvenciakat, a kiválasztást lehetővé tevő jelzöszekvenciákat, replikációs kezdőhelyet stb. A megbetegedés gyógykezelésére és/vagy megelőzésére ennek megfelelően génterápiás eljárást veszünk igénybe. Az oszteopontin expressziójára előnyösen in situ kerül sor.

A találmány egy előnyös megvalósítási módjában az expressziósvektor lentivírus-eredetű vektor. A lentivírus-eredetü vektorok rendkívül hatékonynak bizonyulnak a génátvitel•τ ♦·:· ·-· .j. ..·

-45 ben, különösen a központi idegrendszerben. A találmány szerinti megoldásban egyéb jól ismert vírusvektorok, pl. adenovírus-eredetű vektorok is igénybe vehetők.

Az oszteopontin vér-agy gáton történő átjutásának elősegítésére célzott vektor is alkalmazható. Ezek a vektorok például a transzferrin-receptorra, vagy egyéb endoteliális transzportmechanizmusra irányulhatnak.

A találmány egy előnyös megvalósítási módjában az expressziósvektor beadására intramuszkuláris injektálással kerülhet sor.

A találmány tárgyát képezi továbbá az oszteopontin endogén termelésének az oszteopontint természetes körülmények között nem, vagy csak kis mennyiségben expresszáló sejtekben történő indukálására és/vagy fokozására szolgáló vektor alkalmazása. A vektor tartalmazhat az oszteopontin expressziójára kiválasztott sejtekben működőképes szabályozószekvenciákat is. Ezek a szabályozószekvenciák lehetnek pl. promoterek vagy enhenszerek. A szabályozószekvenciának a genom megfelelő lokuszába homológ rekombinációval történő beillesztésével a szabályozószekvencia működőképesen kapcsolódik a génnel, amelynek expressziojat indukálni vagy fokozni kívánjuk. Ezt a technológiát rendszerint „endogén génaktivációnak”; EGA-nak) nevezik (Id. WO 91/09955 számú nemzetközi közzétételi irat).

A találmány tárgyát képezi továbbá oszteopontin termelése érdekében genetikailag módosított sejt alkalmazása neurológiai rendellenességek gyógykezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló gyógyszer előállítására.

A találmány tárgyát képezi továbbá neurológiai rendellenességek gyógykezelését és/vagy megelőzését célzó gyógyszer előállítására szolgáló, oszteopontin termelése érdekeben genetikailag módosított sejt. Ennek megfelelően a drognak az emberi test megfelelő részeihez történő eljuttatására sejtterápiás módszer is igénybe vehető.

A találmány tárgyát képezik továbbá neurológiai megbetegedések megelőzésere és/vagy gyógykezelésére különösen alkalmas gyógyászati készítmények, amelyek oszteopontin és interferon terápiás szempontból hatékony adagját tartalmazzák, adott esetben immunszuppresszív anyag terápiás szempontból hatékony adagjával együtt.

A „gyógyászati szempontból elfogadható” kifejezés alatt bármely, a hatóanyag biológiai aktivitásának hatékonyságát nem befolyásoló és a kezelt gazdaszervezet számara nem toxikus vivőanyagot értünk. A parenterális beadásra szánt aktív proteinek pl. fiziológiás sooldat, dextrózoldat, szérumalbumin vagy Ringer-oldat alkalmazásával egységnyi injekciós adagok formájában szerelhetők ki.

A találmány szerinti gyógyászati készítmény hatóanyagai különféle módokon juttathatók be a páciens szervezetébe. A beadás történhet intradermálisan, transzdermálisan (pl. lassú l· < X

-46kibocsátású kiszerelésekben), intramuszkulárisan, intraperitoneálisan, intravénásán, szubkután, orálisan, epidurálisan, helyileg, intratekálisan, rektálisan vagy intranazálisan. A fenti célra bármely egyéb, gyógyászati szempontból hatékony beadási mód is igénybe vehető, ilyenek pl. a hámon vagy nyálkahártyán keresztüli abszorpció, vagy a génterápia. Utóbbi esetében a hatóanyagot kódoló DNS-molekulát adjuk be a páciensnek (pl. vektor segítségével), ami az aktív hatóanyag in vivo expresszióját és szekrécióját idézi elő. Mindemellett a találmány szerinti proteinek biológiailag aktív ágensekkel, pl. gyógyászati szempontból elfogadható szörfaktánsokkal, kötőanyagokkal, vivőanyagokkal, oldószerekkel és hordozóanyagokkal kombináltan is beadhatók.

Parenterális (pl. intravénás, szubkután, intramuszkuláris) beadás céljából az aktív protein(ek) gyógyászati szempontból elfogadható, parenterális beadásra szánt hordozóanyaggal (pl. vízzel, fiziológiás sóoldattal, dextrózoldattal), izotóniás állapotot fenntartó adalékanyagokkal (pl. mannitollal), kémiai stabilitást biztosító anyagokkal (pl. tartósítószerekkel és pufferekkel) együtt oldatként, szuszpenzióként, emulzióként vagy liofilizált porként is kiszerelhetö(k). Az említett kiszerelések sterilizálása az általában alkalmazott eljárásokkal történhet.

A találmány szerinti aktív protein(ek) biológiai hozzáférhetősége a molekula emben testen belüli felezési idejét megnövelő konjugálás! eljárásokkal, pl. a molekula pohetilen-glikolhoz történő kötésével (Id. WO 92/13095 számú nemzetközi közzétételi irat) is fokozható.

Az aktív protein(ek) terápiás szempontból hatékony mennyisége számos tényező függvénye, ide tartozik a protein típusa, affinitása, az antagonisták által kifejtett maradék citotoxicitás, a beadás módja, a páciens klinikai állapota (ideértve a nem-toxikus mértékű endogén oszteopontin-aktivitás fenntartásának igényét).

„Terápiás szempontból hatékony mennyiség” alatt azt a mennyiséget értjük, amelynél az oszteopontin előnyös hatást fejt ki a neurológiai megbetegedésre. Azt, hogy egy páciens kezelésére egy vagy több dózissal kerül-e sor, számos tényező befolyásolhatja, ilyenek pl. az oszteopontin farmakokinetikai jellemzői, a beadás módja, a páciens állapota és tulajdonságai (neme, életkora, testtömege, egészségi állapota, magassága), a klinikai tünetek súlyossága, az egyidejű egyéb kezelések, a gyógykezelés gyakorisága és a kívánt hatás.

Amint azt korábban említettük, az oszteopontin előnyösen alkalmazott adagja mintegy 0,0001 - 10 mg/testtömeg kg (ttkg) közötti, vagy mintegy 0,1-3 mg/ttkg közötti, vagy mintegy 1-2 mg/ttkg közötti. Az oszteopontin további előnyös adagjai a mintegy 0,1-1000 pg/ttkg, vagy a mintegy 1-100 pg/ttkg, vagy a mintegy 10-50 pg/ttkg.

• ♦ · · · · ··♦

-47A találmány szerinti megoldás szempontjából előnyösnek tekintett beadási mód a szubkután beadás. A találmány szerinti megoldás szempontjából előnyösnek tekintjük továbbá az intramuszkuláris beadást is.

A találmány egy további előnyös megvalósítási módjában az oszteopontin beadására naponta vagy kétnaponta kerül sor.

A hatóanyag napi mennyisége általában több adagra osztva, vagy a kívánt cél elérésére alkalmas tartós kibocsátású formában adható be. A második alkalommal és a későbbiekben beadott hatóanyag adagja az első vagy a megelőző adagéval megegyezhet, de annál kevesebb vagy több is lehet. A második és a további gyógyszerbeadásra a megbetegedés jelentkezese során vagy az előtt egyaránt sor kerülhet.

A találmány szerinti megoldásnak megfelelően egy páciens megelőző vagy terápiás céllal történő kezelése során az oszteopontin más terápiás elrendezések (pl. több drogot alkalmazó elrendezések) vagy ágensek, elsősorban interferon terápiás szempontból hatékony mennyiségének beadásával egy időben, annál korábban, vagy azt követően alkalmazható. A más terápiás ágensekkel egyidejűleg alkalmazott hatóanyagok ugyanazon vagy eltérő készítményben egyaránt beadhatók.

A találmány tárgyát képezi továbbá neurológiai megbetegedés gyógykezelésére szolgáló eljárás, amelynek során rászoruló páciensnek adott esetben gyógyászati szempontból elfogadható vivőanyaggal együtt oszteopontin, vagy oszteopontin-aktivitás agomsta vegyület hatékony mennyiségét adjuk be.

A találmány tárgyát képezi továbbá neurológiai megbetegedés gyógykezelésére szolgáló eljárás, amelynek során rászoruló páciensnek adott esetben gyógyászati szempontból elfogadható vivőanyaggal együtt oszteopontin, vagy oszteopontin-aktivitás agomsta vegyület es interferon hatékony mennyiségét adjuk be.

A jelen leírásban idézett minden szakirodalmi közlemény, a szakfolyóiratokban közölt cikkek, kivonatok, a közzétett vagy közzé nem tett amerikai egyesült államokbeli vagy külföldi szabadalmi iratok, a kiadott amerikai egyesült államokbeli vagy külföldi szabadalmak, vagy bármely egyéb idézett szakirodalom teljes egészében a kitanítás részét képezi, beleértve a bennük közzétett adatokat, táblázatokat, ábrákat és szöveget. A kitanítás részét kepezik továbbá az idézett szakirodalmi forrásokban idézett közlemények is.

Az ismert eljárási lépésekre, hagyományos eljárási lépésekre, ismert eljárásokra vagy hagyományos eljárásokra történő hivatkozás semmilyen formában nem jelenti, hogy a találmány szerinti megoldás bánnely szempontja, leírása vagy megvalósítási módja a tudományágban közzétételre került volna vagy a meglévő ismeretekből következne.

:.:.. j. t

-48 A találmány szerinti megoldás előzőekben ismertetett leírásában a találmány lényege teljes részletességgel bemutatásra került, így szaktudással rendelkező személyek (a szakirodalmi hivatkozások anyagára is támaszkodva) a találmány szerinti specifikus megoldásokat jelentős mértékű kísérletezés nélkül is könnyen módosíthatják és/vagy adaptálhatják különböző alkalmazások céljából anélkül, hogy eltérnének a találmány általános elvétől. Ennek megfelelően a jelen leírásban foglalt kitanítás és iránymutatások alapján az említett adaptációk és módosítások a közzétett megvalósítási módokkal egyenértékűnek és azonos értelműnek tekinthetők. A jelen leírásban alkalmazott kifejezésmód és fogalom-meghatározások csupán illusztrációs célt szolgálnak és nem korlátozó érvényűek, így ezeket a szakembernek a jelen leírásban foglalt kitanítás és iránymutatások alapján, átlagos szaktudás birtokában kell értelmeznie.

A találmány részletes bemutatása után a találmány szerinti megoldás könnyebb értelmezése érdekében a következő példákat tesszük közzé. A példák csupán illusztrációs célt szolgálnak, nem jelentik a találmány hatókörének korlátozását.

1. példa

Az oszteopontin demielinizációval járó betegségek in vitro és in vivo modelljei esetében differenciált expressziót mutat

Eljárások

In vitro modellrendszerek

Az Oli-neu sejtvonalat oligodendrocita prekurzor sejtek a t-neu onkogént, egy konstitutíven aktív tirozinkinázt kódoló replikációra képtelen retrovírussal végzett halhatatlanná tételével alakították ki, az említett sejtvonal a tenyésztőközegben 1 mM dibutiril-cAMP jelenlétében indukálódik és differenciálódást mutat [Jung és mtsai (1995)]. Ez a tulajdonság lehetővé teszi az oligodendrociták izolált sejttípusként történő tanulmányozását.

Az A2B5 jelű, egéreredetű oligodendrocita prekurzorból származó, Oli-neu jelű eger oligodendrocita sejtvonal morfológiája és antigenitási jellemzői kezeletlen állapotban és hat napos, 1-5 mM dibutiril-cAMP-vel végzett differenciálódást elősegítő kezelést követően jelentős különbséget mutatnak. Míg a kezeletlen Oli-neu sejtek kerek alakúak és az ohgodendrocita prekurzorokhoz hasonlóan főként bipolárisak, a cAMP-vel kezelt sejteken több nyúlvány jelenik meg, a sejtek laposabbak és lapos, megnyúlt „hüvelyszeru” szerkezeteket is formálnak.

A működőképes mielin in vitro láthatóvá tételéhez kevert kérgi tenyészetekkel végzett in vitro mielinizációs vizsgálati eljárás alkalmazható. Az említett rendszer lehetővé teszi anI···:··-· j.

.49.

nak megfigyelését, hogy az oligodendrociták hogyan érintkeznek az axonokkal és hogy állítják elő számukra a mielinhüvelyt más központi idegrendszeri sejttípusok jelenlétében [Lubetzki és mtsai. (1993)]. A rendszer alkalmas az oligodendrocita prekurzorok proliferációját vagy az oligodendrociták differenciálódását és túlélését, pl. a valódi mielinszegmensek kialakulását befolyásoló biológiai tényezők vizsgálatára. A mielinizáció in vitro tanulmányozásának szükségessége nagyszámú vizsgálati eljárás kifejlesztéséhez vezetett, ilyenek pl. az aggregálódó agysejt-tenyészetek [Matthieu és mtsai. (1992)], kisagydarab-tenyészetek [Notterpek és mtsai. (1993)] és együtt-tenyésztési rendszerek [Shaw és mtsai. (1996); Barres és mtsai. (1993)]. Az említett módszerek előnye, hogy lehetővé teszik az oligodendrociták más sejttípusokkal kapcsolatos viselkedésének, valamint a mielintermeléshez szükséges stimulációjuknak a tanulmányozását. Specifikus károsító hatások segítségévéi az említett rendszerekben demielinizáció váltható ki, valamint tanulmányozható a remielinizációs válaszreakció is.

In vivo modellrendszerek

A szklerózis multiplexnek nagyszámú kísérletes in vivo és in vitro modellje ismeretes. Az in vivo modellek nagy része a szklerózis multiplex klasszikus állati modelljével, a kísérletes allergiás encephalomyelitis-szel (EAE-vel) kapcsolatos. Az említett modellnek különféle emlős szervezetekre adaptált változatai léteznek, ilyenek pl. az egér-, a patkány- és a főemlősrendszerek [Petry és mtsai. (2000)]. Emellett állati modellekben a szklerózis multiplex feltételezett víruskomponensét „utánzó” módszereket is kidolgoztak, ilyen pl. a szklerózis multiplex encephalitogén Theiler-féle egérvírus modellje [Dal Canto es mtsai. (1995)].

A kizárólag a központi idegrendszerben vagy a körzeti idegrendszerben végbemenő mielinizáció tanulmányozására szolgáló állati modelleket kevésbé gyakran veszik igénybe. A fejlődés során végbemenő mielinizáció folyamatának vizsgálata hasznosnak bizonyult az „összegződés!” hipotézisnek („recapitulation hypothesis”) megfelelően az oligodendrogliavagy Schwann-sejtek differenciálódása, migrációja és proliferációja mögött álló mechanizmusok tanulmányozása során [Franklin és Hinks (1999)]. A fejlődés során, vagyis a központi és a körzeti idegrendszer kialakulásakor bekövetkező mielinizáció és az idősebb korban megfigyelhető remielinizáció összehasonlításakor azonban specifikusan a remielinizációs folyamatra vonatkozó modellek kidolgozására volt szükség.

A Cuprizone modell

A remielinizációs modellek közül a legismertebb és legszélesebb körben alkalmazott az egérbeli remielinizáció Cuprizone modellje. A modellben a szerves rézkelát-képző vegyület Cuprizone szájon át történő beadására kerül sor, amelyről kimutatták, hogy oligodendrocitákra szelektív toxikus hatást fejt ki [Morell és mtsai. (1998)].

• * · · * · ··« ··»· *·:···* 3. ..·

-50A Cuprizone-val kezelt egerek corpus callosumában demielinizáció és remielinizáció figyelhető meg. Az említett kóros elváltozások anti-CNPáz ellenanyaggal vagy MBP ellenanyaggal végzett jelzéssel tehetők láthatóvá. A mielin festésére Luxol Fast Blue - Schiff perjódsavas festés (LFB-PAS) alkalmazható. A remielinizációt végző oligodendrocita prekurzorok PDGFa receptor vagy NG2 elleni ellenanyagok alkalmazásával mutathatók ki.

Az egerek Cuprizone-val történő 3-5 hetes kezelése a corpus callosum kiterjedt demielinizációjához vezet. A demielinizációval egy időben, a Cuprizone kezelés 3. hete után a mielin-specifikus géntranszkriptumok fokozott szintézise figyelhető meg [Morell és mtsai. (1998)].

A Cuprizone adagolás megszakítása kedvező feltételeket teremt a gyógyulásra, így a Cuprizone etetés abbahagyása után az egerek corpus callosumában kiterjed remielinizáció figyelhető meg. A Cuprizone modell ezek alapján a demielinizáció és a remielinizáció tanulmányozására egyaránt alkalmas in vivo rendszernek tekinthető. Előnyei közé tartozik, hogy nem jár T-sejtek központi idegrendszerbe történő beáramlásával, aminek köszönhetően könnyebben tanulmányozható a mielinizációs folyamat és a kísérletes eredmények reprodukálhatósága is jobb [Hiremath és mtsai. (1998)].

A Cuprizone kezeléshez C57BL/6 jelzésű (8 hetes, 20 ± 3 g testtömegű) nőivarú egereket használtunk 6 csoportban, csoportonként 6-6 állattal. A csoportbeosztás a következő volt.

1. csoport: szabványos porított tápot fogyasztó kontroll csoport.

2. csoport: három hétig 0,2% Cuprizone-t tartalmazó porított tápot fogyasztó csoport (Cup3w).

3. csoport: öt hétig 0,2% Cuprizone-t tartalmazó porított tápot fogyasztó csoport (Cup5w).

4. csoport: öt hétig 0,2% Cuprizone-t tartalmazó porított tápot, majd egy hétig szabványos porított tápot fogyasztó csoport (IwR).

5. csoport: öt hétig 0,2% Cuprizone-t tartalmazó porított tápot, majd három hétig szabványos porított tápot fogyasztó csoport (3wR).

6. csoport: öt hétig 0,2% Cuprizone-t tartalmazó porított tápot, majd hat hétig szabványos porított tápot fogyasztó csoport (6wR).

Az egyes csoportokbeli állatok agyát a kísérlet végén meghatározott időben eltávolítottuk. Az egereket ehhez először elaltattuk és a bal kamrán keresztül perfundáltuk. A kinyert agyakból a corpus callosum - caudate putamen (corpus striatum) és a hippocampus síkjában

-t· *····.· j,

-51 koronális sorozatmetszeteket készítettünk. Az immunhisztokémiai és in situ vizsgalatok céljából az agyvelőrészleteket paraffinba ágyaztuk.

Kórszövettani metszetek készítése

K formalint 1 térfogatrész formaldehid (Fluka, 36%, p.a.) és egy térfogatrész steril PBS, valamint 8 térfogatrész steril víz összeöntésével állítottuk elő. Perisztaltikus pumpához csatlakoztatott, 20G 1-1/5-ös méretű tűvel felszerelt szilikoncsövet 10 ml PBS-sel töltöttünk meg. A csőbe ezután folyamatosan 40 mL formaiint töltöttünk vigyázva, hogy ne okozzunk légbuborék-képződést.

Az állatokat a szervek és szövetek kórszövettani vizsgálata érdekében alkalmazott fixálóanyag intrakardiális perfúziója előtt steril PBS-sel 1:1 arányban 3 mg/100 mL koncentrációjúra hígított pentobarbitál-nátriummal (Sanofi®) altattuk. Az altatószer intraperitoneális adagja egerenként 0,05 mL (0,75 mg/kg) volt. Miután az egerek elkábultak, lábaikat a bőrön keresztül tűvel (25G, 5/8) „Styrofoam” lapra rögzítettük. Az állatok hasfalát etanollal letisztítottuk, majd steril ollóval a szegycsont („extemo”) magasságában bemetszést ejtettünk a bőrön. A hasfalsebet ezután mind jobb, mind bal irányban meghosszabbítottuk. A szegycsontot csipesszel megemeltük, a rekeszt átlós metszéssel megnyitottuk, majd a bordákkal párhuzamosan futó kétoldali metszésekkel megnyitottuk a mellkast. A mellkas közepén helyeződő szívet csipesszel rögzítettük, a jobb oldali pitvar azonnali átmetszésével vénás vérzést idéztünk elő. Az egerek vérkeringésébe ezután 10 mL PBS-t, majd 40 mL formaiint juttattunk. Az állatok agyát és gerincvelejét óvatosan eltávolítottuk, majd 10 mL formaiinban 2 órára 50 mL-es Falcon® csövekbe helyeztük. A formaiint ezután 10 mL steril PBS-re cseréltük, majd a szerveket egy éjszakán át 4°C-on tároltuk. A PBS oldatot ezután ismét lecseréltük, majd a mintákat további néhány órán át 4°C-on tároltuk. Az agyféltekéket és a gerincvelőt megközelítőleg 0,5 cm-es szeletekre vágtuk, majd a beágyazógépnek megfelelő műanyag kosarakba helyeztük. Az agy- és genncvelőminták paraffinos beágyazására „Tissue Tek Vacuum Infiltration Processor E150/E300” típusú automata berendezést alkalmaztunk (Miles Inc. Diagnostics). A beágyazás a következő program szerint történt:

perc 50%-os etanolban, perc 70%-os etanolban, perc 70%-os etanolban, perc 80%-os etanolban, perc 80%-os etanolban, perc 96%-os etanolban, perc 96%-os etanolban, • * * ·» * * ^:*r ·*··· ·»· J. 1/

-52120 perc 96%-os etanolban, perc 100%-os xilolban, perc 100%-os xilolban, x 60 perc inkubálás paraffinban (Histosec, Merck 11609); az utolsó stádium a beágyazás.

Az oldatok hőmérséklete 40°C, a paraffiné 65 °C volt. Az anyagok beágyazása után az agy- és gerincvelő-részleteket a kiöntéshez megfelelő irányban műanyag blokkokra helyeztük. A mintákra folyékony paraffint öntöttünk, majd a blokkokat hűtőlapon 0°C-on gyorsan lehűtöttük. A paraffinos blokkokból mikrotómmal 5-10 pm vastagságú metszeteket készítettünk. A metszeteket szilanizált üveg tárgylemezekre (SuperFrost-Plus ™, Menzel katalógusszám: 041300) húztuk. A felhúzás után a metszeteket pormentes környezetben tároltuk.

Sejttenyésztés

Oli-neu: egéreredetű oligodendrocita sejtvonal (Oli-neu) sejtjeit centrifugálással koncentráltuk, majd Sato-féle tápközegben reszuszpendáltuk [Trotter és mtsai. (1989)]. A sejteket 75 mL-es palackokban 37°C-on, 5% CO2 jelenléte mellett, szabályozott körülmények között tenyésztettük. A differenciálást a közvetlenül a sejttenyésztő tápközeghez adott 1 mM dbcAMP-vel végeztük. Az RNS-t trizol-eljárással vontuk ki (Id. később).

RNS izolálás

Oli-neu sejtekből, Cuprizone kezelésben részesült egerek agyából készült metszetekből és különböző fejlődési fázisban lévő teljes posztnatális egéragyvelőkből a Tri-Zol® kivonási protokoll alkalmazásával (Life Technologies AG, Basel, Svájc) összes RNS-t vontunk ki. Az összes RNS-t tartalmazó mintákból Qiagen OLIGOTEXTM oszlopok (QIAGEN Inc., 28159 Stanford Avenue, Valencia, CA 91355, USA) alkalmazásával Poli(A)+ RNS-t állítottunk elő.

cDNS mikroarray alkalmazásával végzett DGE-elemzés

A mikroarray kísérleteket az hicyte Genomics-nál (Incyte Genomics Inc., 3160 Porter Drive, Palo Alto, California 94304, USA) végeztük. A DGE-elemzést „Incyte’s Mouse GEM™ 1” génexpresziós mikroarray alkalmazásával végeztük (http ://www. incyte. com/reagents/gem/products. shtml).

A vizsgálatokban használt „Incyte csipeket 8734 ismert es ismeretlen gennek (EST szekvenciának) megfelelő cDNS molekulával töltöttük fel. Az Incyte technológiájának köszönhetően az említett gének mindegyikének mikromennyiségét egyazon array-ra lehetett helyezni. Az ismert géneknek vagy EST-nek megfelelő cDNS molekulák hossza 500-5000 bp volt. Az Incyte specifikációinak megfelelően egy adott mintabeli mRNS dinamikus detektál« * • * , ·> · * ·’·:· <* J, 1?

-53hatósági határértéke 2-2000 pg volt. Az egyes array kísérletekhez 600 ng poli(A)+ RNS-re volt szükség. Az 1,75-nél magasabb arány esetén A differenciált expresszió megállapításának határértéke 1,75-nél nagyobb arány volt.

Szignálnormalizálás és az expresszió mértékének megállapítása

A két fluoreszcenciás intenzitásból számított arányszámok lehetővé teszik a két vizsgált mintabeli relatív génexpresszió mennyiségi meghatározását. Az egyes génekre vonatkozó arányszámokat az expresszió normalizált mértéke alapján határozzuk meg. A normalizációs faktort a második mintabeli összes expresszió (P2) és az első mintabeli összes expresszió (Pl) hányadosaként kaphatjuk meg. Ezzel a faktorral korrigáljuk ezután a P2-beli összes gén expressziójának mértékét. Az említett normalizálási lépést követően a génarányokat a következők szerint állapítjuk meg: az El egy adott gén 1. mintabeli expressziójának mértéke, az E2 pedig ugyanazon gén második mintabeli normalizált expressziójának mértéke; ha E2 > El, akkor az arány = E2/E1, ellenkező esetben az arány = -E1/E2.

Mivel a minta hibridizálása kompetíciós körülmények között egyidejűleg történik, az Incyte technológia precízebben alkalmazható relatív expressziós változások megállapítására és kevésbé megbízható abszolút expressziós szintek megállapítása során. Ennek ellenére az említett expressziós mennyiségek értékei felhasználhatók a nem egyazon csipen vizsgált RNS mintapár populációk összehasonlítására. Az ilyen „in silico” összehasonlítások ugyan kevésbé megbízhatóak, viszont további információt szolgáltathatnak a vizsgált rendszerben működő mechanizmusokból.

Eredmények

A differenciált oszteopontin-expresszió elemzésére alkalmazott modellek

A IV. táblázatban a fentiekben ismertetett mRNS-kivonásra és csip hibridizálásra (DGE-elemzésre) alkalmazott modelleket foglaltuk össze.

· *►·»» · *4 > - , >1 · «-54-

IV. táblázat

A DGE-elemzés során alkalmazott modellek

Modellek	Kezelések	Kontrollok
1. In vitro oligodendrocita differenciálódási modell	Oli-neu sejtek + dibutirilcAMP (6 óra)	kezeletlen Oli-neu sejtek
Oli-neu sejtek + dibutirilcAMP (6 nap)	kezeletlen Oli-neu sejtek
2. In vivo Cuprizone demielinizációs / remielinizációs modell	Felnőtt frontális agyterület + Cuprizone (3 hét)	Kezeletlen felnőtt frontális agyterület
Felnőtt frontális agyterület + Cuprizone (5 hét)	Kezeletlen felnőtt frontális agyterület
Felnőtt frontális agyterület + Cuprizone (3 hét)	Felnőtt frontális agyteriilet + Cuprizone (5 hét)
3. Fejlődés során tapasztalható mielinizáció	Egér cerebellum, 10. posztnatális nap (P10)	Egér cerebellum, 2. posztnatális nap (P2)
DGE pozitív kontrol	: mielinspecifikus gének szabályozása

Pozitív kontrollként először azt vizsgáltuk, hogy DGE alkalmazásával kimutatható-e a 5 mielinspecifikus gének differenciált szabályozása.

Az V. táblázat az Incyte mikroarray-eken jelen lévő mielinspecifikus gének esetében megfigyelt szabályozást mutatja be. A gének esetében a Cuprizone-kezelés 3 hetes és 5 hetes időpontjára vonatkozó differenciált expressziós értékeket egyaránt feltüntettük. Ezek az adatok a csip megbízhatóságát igazoló pozitív kontrollként értelmezhetők. Mivel az általunk al10 kalmazott kísérleti körülmények között jól ismert a mielin szerkezeti gének szabályozása, a gének csipeken mért expressziója egyrészt felhasználható (a) a technológia pontosságának, másrészt (b) modelljeink reprodukálhatóságának igazolására.

V. táblázat: mielinspecifikus gének in vivo szabályozása in vivo mielinizációs modellekben végzett mikroarray vizsgálatok alapján

Gén	Deponálási szám	Cup3w	Cup5w	P 2/10*
bázikus mielin protein	AA059540	113,6	11,3	+7,9
vezikuláris mielin protein / mielin és limfocita protein (MVP/MAL)	AA519027	33,5	11,7	0
Ciklikus nukleotid foszfodiészteráz 1 (CNPáz)	W63987	22,9	n,i	+2,9

* 10 napos posztnatális cerebellum

A fenti táblázatban látható, hogy a demielinizáció, a remielinizáció és a fejlődés során bekövetkező mielinizáció tanulmányozására igénybe vett különböző in vivo modellekből származó RNS-en végzett mikroarray vizsgálatok alapján hogyan történik egyes mielinspecifíkus gének szabályozása. Az említett mielinspecifíkus gének expressziójában bekövetkezett változások a transzkripciós szabályozás mikroarray-k segítségével végzett tanulmányozásának lehetőségére hívják fel a figyelmet.

Három hetes Cuprizone adagolást követően az egéragy meghatározott területein láthatóvá tehető a kezelés demielinizációt kiváltó hatása. A három hetes kezelést követően ez alapján a mielinszintézisben és/vagy a mielin fenntartásában szerepet játszó különféle gének expressziójának csökkenését vártuk. A mielinspecifíkus gének expressziójának mikroarray vizsgálattal kimutatott csökkenése az alkalmazott kísérletes rendszer pontosságát és megbízhatóságát igazolja. Az V. táblázatban bemutatott adatokból kitűnik, hogy az MBP mRNS-ének mennyisége a kontrolihoz képest 13,6-szeres, a ciklikus nukleotid foszfodiészteráz 1 (CNPáz) mRNS-ének mennyisége pedig 2,9-szeres csökkenést mutatott a három hetes Cuprizone adagolás következtében. Az 5 hetes Cuprizone kezelés után azonban mindkét gén RNS-ének mennyisége a normálértékhez képest már csak 1,3-szoros, valamint 1,1-szeres csökkenést mutatott, ami arra utalt, hogy a biológiai rendszer a strukturális mielinproteinek szintézisének fokozásával kísérletet tett a remielinizációra.

Az oszteopontin-expresszió differenciált szabályozása

A csipen az oszteopontin-expresszió 3 hét Cuprizone kezelés után +2,2-szeres, 5 hetes Cuprizone kezelés után +2,8-szoros fokozódást mutatott.

2. példa

Az oszteopontin differenciált génexpressziójának igazolása „real-time” kvantitatív reverz transzkripciós (RT)-PCR vizsgálati eliárással (TaqMan®)

Eljárások cDNS templát előállítás

A TaqMan® elemzés céljára a cDNS templátokat összes RNS mintákból reverztranszkripcióval (RT), TaqMan® reverz transzkripciós reagensek alkalmazásával állítottuk elő (P/N N808-0234). Az RT reakciókat 100 pL reakciótérfogatban végeztük, a reakcióelegy a következőket tartalmazta: 10 pL TaqMan RT puffer, 22 pL 25 mM MgC12 oldat (5,5 mM), 20 pL dezoxiNTP keverék (mindegyik dNTP-ből 500 pM), 5 pL random hexamer (2,5 pM), 2 pL Rnáz gátló (0,4 E/pL), 2,5 pL MultiScribe™ reverz transzkriptáz (1,25 E/pL) és 38,5

pL RNS minta (összesen 1 Vg) RNáz-mentes vízben. A reakciókat Eppendor MasterCycler berendezésben 25°C-on 10 percig (inkubálási lépés), 48°C-on 30 percig (reverz transzkripció), és 95°C-on 5 percig (inaktiválási lépés) végeztük. A szintetizált cDNS-eket 20 pL-es adagokban -20°C-on tároltuk.

Láncindító előállítás és verifikálás

Az igazolt génekhez és a GAPDH-hoz („housekeeping kontroll”) a „SYBR Green Real Time PCR” 5’ és 3’ láncindítókat a publikált szekvenciáknak megfelelően a PE Biosystems „Primer Express™” programja segítségével terveztük. A láncindítókat 0,02 μΜ koncentrációban az Interactiva-tól rendeltük meg (Interactiva: The Virtual Laboratory, Sedanstrasse 10, D-89077 Ulm). Minden egyes láncindító szett esetében ellenőriztük a specifítást és az optimális láncindító-koncentrációt. A potenciális genomi DNS kontaminációt RT enzim hozzáadása nélkül végzett reverz transzkripciós reakciónak alávetett negatív kontroll cDNS mintákon végzett PCR vizsgálatokkal monitoroztuk. A nem-specifikus amplifikáció hiányát a PCR-termékek 3,5%-os MetaPhor géleken vagy előöntött 4%-os NuSieve® géleken végzett elemzésével igazoltuk.

Az alábbi táblázatban a mikroarray vizsgálatok alapján differenciáltan szabályozottként meghatározott gének differenciált expressziójának igazolása érdekében végzett TaqMan® elemzéshez előállított génspecifikus láncindítók szekvenciáit tüntettük fel. A táblázat tartalmazza továbbá az egyes láncindító pároknak megfelelő gének nevét, a láncindítók PrimerExpress™ szoftverrel történt tervezéséhez felhasznált szekvenciák GenBank deponálási számát is.

VI. táblázat: Az RT-PCR elemzéshez alkalmazott láncindítók

Gén megnevezése	Deponálási szám	TaqMan® oligo	TaqMan® oligo szekvencia
Szekretált foszfoprotein 1 (oszteopontin)	AA 108928	Osteopontin166F	AGCCTGCACCCAGATCCTA TAG
Osteopontin- 235R	GCGCAAGGAGATTCTGCTT CT

TaqMan reakciók

A „SYBR GREEN Real-Time PCR”-t 5 pL/üreg RT-termék (0,5 ng összes RNS), 25 pL/üreg SYBR Green PCR „master mix” (Applied Biosystems, CA, USA), AmpErase Uracil N-glikoziláz (UNG) (0,5 egység/üreg) és 20 pL láncindító (300 mM) hozzáadásával végeztük. A PCR-t 50°C-on két percig (az esetleges „carryover” elkerülése érdekében a korábbi : , · . ·;

TaqMan futtatások során létrejött PCR-termékekbe épült uracil eltávolítására alkalmazott AmpErase UNG inkubálásához) és 95°C-on 15 másodpercig (az AmpliTaq Gold aktiváláshoz) végeztük. A mintákat ezután 40 ciklusban 95°C-on 15 másodpercig és 60°C-on egy percig ABI PRISM® 7700 „Sequence Detection System”-ben futtattuk. Ezáltal amplifikáltuk a reverz transzkripciónak alávetett cDNS-mintákat és megállapítottuk Ct (küszöbciklus, „treshold cycle”) értéküket. A Ct értékeket a GAPDH „housekeeping” génre normalizáltuk. Amennyiben lehetséges volt, a mintákat az eredmények reprodukálhatóságának fokozása érdekében két vagy három példányban futtattuk. Az elektroforézises vizsgálattal a megállapított gének és a GAPDH esetében különálló specifikus DNS-csíkot mutattunk ki.

A génszabályozás meghatározása a ciklusküszöb (CT) alapján

A „SYBR Green PCR master mix” alkalmazásával végzett „real-time” kimutatás alapelve a PCR-termék közvetlen detektálása a „SYBR Green” festék dupla szálú DNS-hez történő kötődése következtében kialakuló fluoreszcencia mértékének növekedése alapján. Ez PCR növekedési görbék alapján lehetővé teszi egy génspecifíkus amplifikaciós termek mennyisége relatív növekedésének meghatározását.

Egy meghatározott cDNS kontroll mintához viszonyított mennyiségi meghatározása az adott génnek megfelelő mRNS-ből konvertált cDNS mennyiségének élettani referenciaként szolgáló kalibráló mintához történő viszonyításával végezhető el. A kalibráló minta kontroll vagy kezeletlen állapotú lehet. A cDNS relatív mennyiségi meghatározása endogén kontrollra (ez esetben GAPDH-ra) történő normalizálással válik teljessé, amellyel kiszűrhető a kezdeti koncentrációbeli eltérések, a templát cDNS-ek előállítására használt összes RNS minősége, valamint a reverz transzkripciós reakciók konverziós hatékonysága miatti variabilitás. A relatív mennyiségi értékek kiszámításához megállapítottuk az egyes minták ismételt futtatása esetében kapott CT értékek átlagát, kiszámítottuk a célpont minták és az endogén kontrollok átlagos CT értéke közötti különbséget (ACT), kivontuk a célpont gén kalibrátorának átlagos CT értékét a célpont ACT értékéből (AACT), majd végül a célpont gén relatív mennyiségi értékét a génexpresszió fokozása vagy csökkentése mértékének növelése érdekében 2-AACT alakban fejeztük ki.

A fluoreszcenciás szignálok normalizálása TaqMan® reakciókban

A „SYBR Green” - dupla szálú DNS komplex által kibocsátott fluoreszcenciás szignált a tamplát DNS-t nem tartalmazó passzív referencia vagy negatív kontroll reakciókra normalizáltuk. A normalizálás érdekében a „SYBR Green” - dupla szálú DNS komplex emisszió- • ζ ** * · · · ♦ · • ·· · ···· ·_φ··

-58jának intenzitását elosztottuk a passzív referencia emissziójának intenzitásával. Ennek eredményeként a reakcióra vonatkozó Rn (normalizalt riporter) aranyt kaptuk.

Rn+ = Rn érték a minden összetevőt, így templát DNS-t is tartalmazó reakció esetében Rn- = nem reagáltatott minta Rn értéke (templát DNS nélküli minta)

ARn = (Rn+)-(Rn-), ahol

Rn+ = („SYBR Green” - dupla szálú DNS komplex emissziójának intenzitása)/PCR templáttal (passzív referencia emissziós intenzitása)

Rn- = („SYBR Green” - dupla szálú DNS komplex emissziójának intenzitása)/templát nélkül (passzív referencia emissziós intenzitása)

A szabályozás mértékének megállapítása a ciklusküszöb (CT) értékek alapján

A ARn adott PCR körülmények mellett, egy meghatározott reakcióban kialakult szignál nagyságáról tájékoztat. A ciklusküszöb paraméter a génspecifíkus termék amplifikációja relatív fokozódásának mérésére szolgál, ami egy specifikus transzkriptum kísérleti cDNS populáción belüli relatív előfordulási gyakoriságát reprezentálja. Azt a cikluspontot jelöli, amelynél elsőként lehet statisztikailag lényeges mértékű ARn fokozódást megfigyelni. A küszöbértéket a korai ciklusok Rn értékei átlagos standard eltérése és egy változtatható faktor szorzataként definiálhatjuk. A ciklusküszöb parameter a differenciált genexpresszio mennyiségi meghatározására szolgál. A fluoreszcencia intenzitásának háttér feletti növekedéséhez tartozó adott pont vagy ciklus alapján az egyes génspecifikus növekedési görbékre meghatározott értékek számíthatók ki.

Az összes számítás és relatív mennyiségi meghatározás során meghatároztuk az egyes minták ismételt futtatásával kapott CT értékek átlagát, kiszámítottuk a célpont minták és az endogén kontrollok átlagos CT értéke közötti különbséget (ACT), kivontuk a célpont gén kalibrátorának átlagos CT értékét a célpont ACT értékéből (AACT). Végezetül a célpont gén relatív mennyiségi értékét a génexpresszió fokozása vagy csökkentése mértekének növelése érdekében 2-AACT alakban fejeztük ki.

Eredmények

A „real-time” kvantitatív reverz transzkriptáz (RT)-PCR (TaqMan) érzékeny és megbízható módszer a génexpresszióbeli változások igazolására és pontosabb meghatározására. A TaqMan szekvencia detektor (ABI PRISM® 770 Sequence Detection System, Applied Biosystems, Foster City, CA) PCR-alapú vizsgálati eljárást foglal magában, amelyhez kap“< ’J • »v< *··· *·· *· · ··

- 59csolódó hardverek és szoftverek nagyszámú nukleinsav-szekvencia mennyiségi meghatározására alkalmas rendszert biztosítanak. A berendezés hőmérséklet alapú sokszorozás („thermocycling”), fluoreszcenciás detektálás és egy adott PCR-termék ciklusról-ciklusra történő mennyiségi növekedésének kimutatását lehetővé tevő alkalmazás-specifikus szoftverek kombinációját foglalja magában.

A mikroarray elemzéssel azonosított több, nagymértékben szabályozott gén expresszióját a TaqMan alapú vizsgálat is igazolta. Mindegyik esetben lehetőség szerint az egyes modell rendszerek időbeli jellemzőit is figyelembe vettük. Ez lehetővé tette, hogy több adatot gyűjtsünk arról, hogyan viselkednek egyes gének a teljes folyamat során.

A gének expressziójának mennyiségi változását a vizsgált génre specifikus amplifikációs terméknek megfelelő dupla szálú DNS és „SYBR Green” festék kötődése következtében kialakuló fluoreszcencia mértékének növekedése alapján a PCR-termék közvetlen detektálását magában foglaló TaqMan® eljárással határoztuk meg. Az egy adott cDNS kontroll mintához viszonyított mennyiségi meghatározását az adott génnek megfelelő mRNS-ből konvertált cDNS mennyiségének élettani referenciaként szolgáló kalibráló mintához történő viszonyításával végeztük el. A kalibráló minta kontroll vagy kezeletlen állapotú volt. A cDNS relatív mennyiségi meghatározása a kezdeti koncentrációbeli eltérések, a templát cDNS-ek előállítására használt összes RNS minősége, valamint a reverz transzkripciós reakciók konverziós hatékonysága miatti variabilitás kiszűrése érdekében GAPDH-ra történt normalizálással vált teljessé.

A szekretált foszfoprotein 1. (oszteopontin) gén expresszióját a Cuprizone modellben ismert demielinizációs/remielinizációs jelenségek időtartamát felölelő vizsgálattal elemeztük.

A Cuprizone remielinizációs modellben az oszteopontin expresszióval kapcsolatos TaqMan vizsgálatok eredményeit az 1A ábra tartalmazza. Egerek frontális agyvelőterületein az oszteopontin mRNS-ének mennyisége 3 hetes Cuprizone kezelés (3 w. Cup.) után 18-szoros, 5 hetes Cuprizone kezelés (5 w. Cup.) után pedig 25-szörös emelkedést mutatott.

Öt hetes Cuprizon kezelés, majd a kezelés megszüntetése után egy, három vagy hat hetes gyógyulás után (5 w. cup + 1 w„ 3 w„ 6 w.) az oszteopontin expresszió csökkenését lehetett megfigyelni. Ezek az eredmények az oszteopontinnak a modell demielinizációs és remielinizációs fázisában betöltött lényeges szerepére utalnak, hiszen a remielinizáció már a demielinizáció során megkezdődik.

Az 1B ábrán az oszteopontin expressziójának mennyisége látható a kisagyi fejlődés különböző fázisaiban. Az oszteopontin mRNS-ének mennyisége a korai posztnatáhs fejlődés

-60során (C4-C8 nap) fokozódik, ez az időszak a cerebellum mielinizációja kezdetének felel meg.

A mikroarray vizsgálatok a Cuprizone kezelés alatt egerek frontális agyvelőterületein az oszteopontin expresszió fokozódására utaltak. E vizsgálat eredménye alapján az oszteopon5 tin expresszió a Cuprizone kezelés következtében kialakuló demielinizációs és remielinizációs fázisban egyaránt megfigyelhető, az expresszió csúcsa a kezelés demielinizációs szakaszára esik, a gyógyulás során pedig megközelítőleg az alapszintre tér vissza.

A vizsgálatok eredményeit a VII. táblázat tartalmazza.

TaqMan® elemzéssel igazoltuk a 3 és 5 hétig Cuprizone kezelésben részesült egerek 10 agyában megfigyelhető fokozott oszteopontin expressziót.

VII. táblázat: A Cuprizone modellbeli oszteopontin szabályozás TaqMan® elemzésének eredményei

Szövettípus	Kísérlet	Expresszió mértéke	Szabályozás
Frontális agyterület	Cup. kontroll	1,00	Kontroll szintű
Frontális agyterület	Cup. kontroll	-1,32	csökkent
Frontális agyterület	3 w. Cup.	17,51	fokozott
Frontális agyterület	3 w. Cup.	23,43	fokozott
Frontális agyterület	5 w. Cup.	20,25	fokozott
Frontális agyterület	5 w. Cup.	23,43	fokozott
Frontális agyterület	5 w. Cup. + 1 w. R.	1,79	fokozott
Frontális agyterület	5 w. Cup. + 1 w. R.	3,32	fokozott
Frontális agyterület	5 w. Cup. + 3 w. R.	2,95	fokozott
Frontális agyterület	5 w. Cup. + 3 w. R.	4,56	fokozott
Frontális agyterület	5 w. Cup. + 5 w. R.	-1,16	csökkent
Frontális agyterület	5 w. Cup. + 5 w. R.	1,04	Kontroll szintű
Frontális agyterület	5 w. Cup. + 5 w. R.	1,07	Kontroll szintű

3. példa

A differenciált oszteopontin expresszié igazolása northern-blot vizsgálattal

Eljárás

Biot készítés

Egyes gének esetében az expresszió szövetspecifitását egér „Multi-Tissue Norther Blot”-ok (Clontech Labs, 1020 East Meadow Circle, Palo Alto, CA) segítségével vizsgáltuk. Ezek felnőtt egér különböző szöveteiből származó 2 g poli(A)+ RNS-t tartalmaztak sávonként. Az in vitro és in vivo modellek esetében a differenciált génexpresszió elemzesre különálló biotokat készítettünk. Az egyik biot sorozaton a három és öt hétig Cuprizone-val kezelt egerek, valamint a gyógyulási periódus 1., 3. és 6. hetében elaltatott egerek agyából izolált RNS-t vizsgáltuk. Egy második sorozatot különböző posztnatális fejlődési fázisokban lévő teljes agyakból kivont RNS vizsgálatára használtunk fel. Végezetül egy harmadik biot sorozaton különböző ideig dibutiril-cAMP-vel kezelt, tenyésztett Oli-neu sejtekből kivont RNS-eket vizsgáltunk. A detektálási hatékonyság maximalizalasa es a hibridizalast követő egyenetlen leválasztás okozta eltérések minimalizálása érdekében minden egyes génspecifikus próba esetében új blotot használtunk. A biotokat kétszer hibridizáltuk, először az adott génnel szembeni, a leválasztást követően pedig az RNS feltöltés okozta eltérések kizárása érdekeben egér glicerinaldehid-3-foszfát (mGAPDH) elleni próbával.

Az RNS mintákat (10 pL/mélyedés) formaldehidet és 5 X MOPS-t (209,27 g 3-(Nmorfolino)-propánszulfonsavat, 20,5 g nátrium-acetátot, 50 mL 0,5 M EDTA-t, pH = 8,0 5 L steril vízben, pH = 7,0 12 M NaOH) tartalmazó 1,2%-os denaturáló agarózgélre vittük. Az RNS-minták mindegyikét 2 pL etidium-bromiddal (0,01 mg/ml), 2 pL 5X 3-(N-morfolino)propánszulfonsavval (MOPS), 3,5 pL 37%-os formaldehiddel és 10 pL formamiddal kevertük össze. A mintákat ezután 65°C-on 10 percig melegítettük, majd jégre helyezve hirtelen lehütöttük. Közvetlenül a gélre való feltöltés előtt a mintákhoz 2 pL RNS feltöltőpuffert adtunk (50% glicerin, 1 mM EDTA, 0,4% brómfenolkék és 0,4% xilolcianol festék).

A géleket 1 X MOPS futtatópufferben ~3 óráig futtattuk (1L = 330 ml 37% formaldehid, 400 mL 5X MOPS, 270 mL DEPC-kezelt víz) 5 V cm-1 (gélhossz) mellett. Ezt pozitívan töltött nylonmembránra (HybondTM-N, Amersham Life Sciences, Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, Anglia HP7 9NA) történő, egy éjszakán át tartó átvitel követte SSC oldat alkalmazásával [Id. Terry Brown: Current Protocols, 4.9., szerk.: Ausubel és mtsai. (1993)]. Az RNS-átvitel hatékonyságát a membrán és a kiterített gél UV fény alatti vizsgálatával ellenőriztük. Az RNS-ek membránhoz történő keresztkötesere „Stratalinker -t alkalmaz : ···: .1 .·’·

J.

-62tunk (Stratagene, USA). A biotokat a hibridizáció előtt szobahőmérsékleten Whatman 3MM szűrőpapírok között tároltuk.

Próbakészítés

A kérdéses gének géltisztított cDNS kiónjai restrikciós-fragmenseinek (-500 > 800 bp) felhasználásával radioaktív 32P-jelölt próbákat készítettünk. A DNS-fragmenseket „HighPrimeTM” jelölőrendszer (Roche Diagnostics AG, IndustriestraBe 7, 6343 Rotkreuz, Svájc) segítségével 32P-dCTP-vel >109 cpm ml-1 specifikus aktivitásig véletlenszerűen jelöltük. A be nem épült 32P-dCTP-t a próbakeverék (DNS finomságú, 0,15% Kathon® CG/ICP Biocide®-t tartalmazó desztillált vízben lévő) „Sephadex® G-25” médiumot tartalmazó Pharmacia „NAPTM-5 oszlopon történő gravitációs eluálásával távolítottuk el.

Hibridizáció és szignáldetekció

A próbák hibridizációját ExpressHybTM (Clontech Labs, 1020 East Meadow Circle, Palo Alto, CA) készülék gyártó utasításainak megfelelő működtetésével végeztük. A hibridizációt követően a biotokkal -80°C-on autoradiográfiás kazettákban „HyperfilmTM MP”-t (Amersham Pharmacia Biotech, Anglia) exponáltunk. Az exponálás után a próba leválasztását a biot 90-100°C-on 10 percig 0,5% SDS-t tartalmazó steril vízben végzett inkubálásával, majd 10 percig tartó lehűtésével értük el. A leválasztott membránokat műanyagtasakba zártuk, majd az ismételt próbázásig -20°C-on tároltuk.

Eredmények

A northem-blot elemzést korábban már alkalmazták nagy mintaszámú differenciált génexpressziós vizsgálatokban másodlagos megerősítő eljárásként [Chang és mtsai. (2000)]. Szenzitivitása és pontossága nem csupán egy adott gén expressziója szöveti specifitásának vizsgálatát teszi lehetővé, hanem alkalmas a kísérleti és a kontroll feltételek között megfigyelhető differenciált szabályozás nagyságrendjének megállapítására is. Ezen tulajdonsága alapján a mikroarray elemzéssel kapott DGE-eredmények igazolásának megbízható módszere. Emellett a northem-blotok információt nyújtanak a kérdéses gén transzkriptumainak méretéről és lehetséges alternatív szplájsz izoalakjairól is.

A Cuprizone-kezelésben részesült és a kontroll egerek agyából izolált RNS felhasználásával northern biotokat állítottunk elő. Ezeket az Incyte Genomics által rendelkezésünkre bocsátott klónokból készült radioaktívan jelzett DNS-fragmensekkel próbáztuk. A génexpresszió TaqMan® elemzésével kapott adatok northem-blot vizsgálattal való reprodukálhatóságát Cuprizone-val kezelt egerek agyából izolált RNS blothoz hibridizált, egér oszteopontin elleni radioaktívan jelölt próba alkalmazásával igazoltuk. Ennek segítségével az oszteopontin

...... .: . ·

J. '/

-63Cuprizone modellbeli expressziója TaqMan® elemzésével kapott eredményt össze tudtuk hasonlítani a northem-blot elemzés eredményével.

A 3. ábrán az Incyte Genomics-től rendelt, pT7T3D-Pac vektorba inszertált egér oszteopontin nyitott leolvasási keretet mutatja be. A szürke terület a kódoló szekvencia, a nyíl az oszteopontin teljes cDNS-ét jelöli. A klón inszertet EcoRI és NotI restrikciós helyek szegélyezték. E gén szöveti expresszi ójának elemzésére szolgáló, northem-blot vizsgálatban alkalmazható próba előállítása érdekében Hindi és StyI restrikciós enzimek segítségével egy 893 bp nagyságú fragmenst vágtunk ki a kiónból. Az említett fragmenst géltisztítottuk és a próbaként történő használat érdekében jelöltük.

Az egér oszteopontin expresszióját a Cuprizone modell egyes fázisaiban, köztük a gyógyulási szakaszban lévő, valamint kezeletlen kontroll egerek agyából származó RNS-ekkel készített biot alkalmazásával végzett northem-blot elemzéssel igazoltuk. A blotot először az egér oszteopontin cDNS egy radioaktívan jelzett fragmensével próbáztuk, az exponálást követően szétválasztottuk, majd az egér GAPDH radioaktívan jelölt fragmensével próbáztuk. Ez utóbbi pozitív kontrollt a biot egyes sávjaiban lévő teljes RNS mennyiségek különbözősége miatt kialakuló expresszióbeli eltérések kiegyenlítése érdekében alkalmaztuk.

A Cuprizone kezelésben részesült egerek agyában az oszteopontin expressziója a Cuprizone etetés 3. és 5. hetében csúcsosodik ki, az 5. héten kissé magasabb szintet érve el. A gyógyulási szakaszban az oszteopontin mRNS mennyiség viszonylag gyorsan csökken, ami már a kezelés abbahagyását követő első héten is érzékelhető. Hat hetes gyógyulás után az oszteopontin mRNS mennyisége megközelítőleg az alapállapotnak megfelelő értékre csökken. Mindez minőségileg megfelel a Cuprizone modellbeli oszteopontin expresszió TaqMan® elemzésével kapott eredményeknek (Id. 1A ábra).

4. példa

Az oszteopontin expresszió szabályozása Oli-neu sejtekben

A cAMP-vel kezelt oligodendrocitákban (Oli-neu) megfigyelhető oszteopontin expressziét TaqMan® elemzéssel vizsgáltuk. A kísérlet eredményeit a 4. ábra tartalmazza. Az ábra 1-4. oszlopai az oligodendrocitákkal kapcsolatos eredményeket reprezentálják. A kontrolihoz viszonyítva (értéke = 1) a cAMP-vel végzett 6 órás kezelés (1. oszlop) az oszteopontin mRNS mennyiség fokozódásához vezetett. Két napos cAMP kezelést követően (2. oszlop) 12-szeres fokozódást tapasztaltunk. A 6-10 napig tartó hosszabb kezelés (3., 4. oszlop) alacsonyabb oszteopontin mRNS mennyiséget eredményezett. Az oszteopontin mRNS Cuprizone modellbeli szabályozásával (5., 6. oszlop) összevetve megállapítható, hogy a 3 és 5 hetes . ·. : 71 * · - ·» ·*· ·♦

-64Cuprizone kezelés hatására a frontális agyterületeken tapasztalható oszteopontin expresszió fokozódás megfelel az oligodendrocitákhan 2 napos cAMP kezelést követően kialakulónak.

5. példa

Az oszteopontin oligodendrocitákhan történő expressziója

Eljárás

Oli-neu sejteket kalcium-foszfát precipitációs eljárással átmenetileg transzfektáltunk. Röviden összefoglalva, exponenciális növekedési fázisban lévő Oli-neu sejteket a transzfekciót megelőző napon 105/mL mennyiségben 6 üregű tálca üregeibe juttattunk. Száz pL 250 mM CaC12 oldatot 5 pg plazmid DNS-sel kevertünk össze. A Ca/DNS oldathoz egyenlő mennyiségű (100 pl) 2 X HEPES oldatot adtunk (140 mM NaCl, 50 mM HEPES pH = 7,05), amelyet Na2HPO4 és NaH2PO4 300 mM törzsoldatból (pH = 7,05) foszfáttal egészítettünk ki. Pontosan egy perccel később a keveréket óvatosan a tenyésztőtálcához adtuk, majd azt CO2 inkubátorban 37°C-on 4 órán át inkubáltuk. Ezt követően a tenyésztőközeget frissre cseréltük, majd a sejteket a kinyerésük és westem-blottal végzett elemzésük előtt 24-72 óráig inkubáltuk.

Eredmények

Oli-neu sejteket pDEST12.2 vektorbeli különféle egér oszteopontin szerkezetekkel transzfektáltunk (pDEST12.2-oszteopontin-EGFP, pDEST12.2-oszteopontin-His6, pDEST12.2-oszteopontin, Id. 4-7. ábra, pCIE-EGFP kontroll plazmid). A proteint a sejtek előállították és szekretálták, amint azt kereskedelmi forgalomban beszerezhető specifikus ellenanyagokkal ki tudtuk mutatni (R&D Systems, AF808). Az EGFP-jelzett szerkezet megkönnyítette a transzfekció monitorozását, a transzfekciót követően 24 órával a pCIEGFP kontrolihoz (nem közölt adat) képest specifikus sejtmorfológiai változást (az oligodendrocita nyúlványok számának megszaporodását) lehetett kimutatni. Ez arra utalt, hogy az oszteopontin az egéreredetű Oli-neu oligodendrocita sejtvonal egy érettebb fenotípus felé történő differenciálódását idézi elő. Az oszteopontinnal transzfektált Oli-neu sejtek morfológiailag nagymértékben hasonlítottak egy mielinizáló oligodendrocitára.

A fenti eredmények alapján az oszteopontin oligodendrocitákbeli expressziója elősegíti azok mielinképzés irányába történő differenciálódását, emiatt az oszteopontin alkalmazása jótékony hatást fejt ki oligodendrocita rendellenességekkel kapcsolatos megbetegedésekben.

. - ···· ' ··* • Σ · ·· · ·

6. példa

Az oszteopontin protein specifikus agyrégiókban történő expressziói a a Cuprizone modellben

A Cuprizone modellbeli de- és remielinizáció során különböző időpontokban oszteopontin kimutatására irányuló immunhisztokémiai vizsgálatokat végeztünk. A Cuprizone kezelés 5. hetén a demielinizálódott corpus callosumban és a csíkolt test kötegeiben erős festődést detektáltunk, a demielinizációs helyeken ebben az időszakban kifejezett mikroglia-toborzás zajlik. Az aktivált mikroglia sejtek láthatóvá tétele érdekében egymást követő metszeteket CD68-cal jelöltünk; a hasonló expressziós mintázat az oszteopontin mikroglia sejtekbeli expressziójára utal.

Érdekes módon az oldalsó agykamrákat bélelő sejtekben is ki tudtunk mutatni oszteopontint. Ezt a régiót felnőtt szubventrikuláris zónának nevezik, ahol idegsejtek, asztrociták és oligodendrociták képzésére szolgáló multipotens őssejtek találhatók. Az oszteopontint expresszáló oligodendroglia prekurzor sejtek elkülönítésére NG2, PSA-NCAM, PDGFa receptorokkal végzett kettős festéseket fogunk alkalmazni.

7. példa

Az oszteopontin protein oligodendrocita proliferáciora kifeitett hatása

Ebben a kísérletben t-neu onkogénnel halhatatlanná tett egéreredetű elsődleges oligodendrocita (oligodendroglia) sejtvonalat (Oli-neu-t) alkalmaztunk. Az Oli-neu sejtvonal kialakítása és jellemzői, valamint tenyésztésének körülményei megtalálhatók Jung és mtsai. közleményében (1995).

A vizsgálat célja az OPN oligodendrocita proliferaciora kifejtett hatasanak Oli-neu proliferációs vizsgálati eljárásban történő meghatározása volt. A vizsgált sejteket szubkonfluens állapotban oltottuk ki. A sejteket a kontroll vagy rekombináns proteinekkel történő kezelést megelőzően 24 órán át inzulinmentes tápközegben tenyésztettük. A sejtek számát fluoreszcens „Almar blue” festéssel állapítottuk meg. A potencírozás mértékét az IGF1 (kontroll) standard görbével történő összehasonlítással állapítottuk meg. A proliferáció gátlására vonatkozó számításokat a dbcAMP standard görbével történt összehasonlításra alapoztuk.

Anyagok

Felszerelés és szoftver

Wallac Victor 2 többjelzős számlálóberendezés (geijesztés 530-560 nm-en, kibocsátás 590 nm-en)

Graph Pad Prism szoftver

	Reagensek Oli-neu sejtvonal [Eur. J. Neuro. 7, 125 (1995)] Alamar blue (BioSource Inti. Inc. Camarillo, CA 93012) A Sato tápközeg a következő összetevőkből állt:
	Termék	Gyártó	Mennyiség	pL/500 ml
DMEM	Seromed F0435	500 mL
Transzferrin	Sigma T-2252	100 mg/mL (1 mg 10 mL PBS-ben)	50
Nátrium-szelenit	Sigma S-9133	1 mg/2,56 ml PBS	50
Inzulin	Sigma 1-1882	10 mg/ml (100 mg/10 ml PBS)	500
Putreszcin	Sigma P-7505	80,5 mg/mL (PBS)	500
Progeszteron	Sigma P-0130	0,62 mg/ml (EtOH)	50 _________
TIT (trijódtironin)	Sigma T-5516	1,7 mg /ml (1/3 HC1 + 2/3 EtOH)	100
L-tiroxin	Sigma T-0397	2,88 mg/ml + 1 csepp NaOH IN	100
L-glutamin	Gibco 25030-024	200 mM	5000
Gentamicin	Gibco 15750-037	50 mg/ml	250
Nátrium-bikarbonát	Gibco 25080-052	7,50%___________	13000
Lószérum			5000
5	Poli D-lizinnel (356461) bevont BioCoat lapos aljú lemez (Becton-Dickinson) IGF1 (11146 Sigma); DbcAMP (D-0627, Sigma).	R3-

E1 járás

Sejttenyésztés in vitro biológiai vizsgálóeljárás céljára

Az Oli-neu sejtek poli-L-lizin szubsztráton növő adherens sejtek. A sejteket poli-lizin10 nel előzetesen bevont BioCoat™ típusú 96 üregű tálcákra vittük, ahol heti 2-3 alkalommal megfeleztük őket. Ehhez a sejteket először PBS-sel mostuk, majd PBS és 1 mM EDTA keverékével leválasztottuk. A tenyésztést 10% C02-t tartalmazó párásított inkubátorban végeztük.

A fagyasztásra 20% FCS-t és 10% DMSO-t tartalmazó Sato tápközeget alkalmaztunk. Ebben a kísérletben legfeljebb 16 passzázson átesett Oli-neu sejteket használtunk. A sejteket 15 24 órás inzulint nem tartalmazó Sato tápközegben történt 24 órás tartást követően 96 üregű tálcákon 4000 sejt/üreg végső koncentrációban alkalmaztuk.

„Alamar Blue” festés

A CO2 inkubátorban történt 48 órás tárolást követően az üregekhez 10 pL „Alamar Blue” törzsoldatot adtunk, majd a tálcát további 2,5 órán át inkubáltuk. A fluoreszcenciát 530- u U · ;* 1

-67 560 nm-es gerjesztési és 590 nm-es kibocsátási hullámhosszon vizsgáltuk. A tálcákat legfeljebb 4 órán át és legfeljebb 1 millió relatív fluoreszcenciás egység eléréséig lehetett leolvasni.

Kísérleti elrendezés

Kontrollként 100 ng/ml R3-IGF-l-et (pozitív kontroll), vagy 1 mM dbcAMP-t (negatív kontroll), vagy inzulinmentes tápközeget, vagy 100 nM felfőzött OPN-t alkalmaztunk. A kísérleti minták 1 nM, 10 pM, 0,1 pM vagy 100 nM rekombináns oszteopontint tartalmaztak. A kontrollokat és a mintákat a kívánt koncentrációban inzulinmentes Sato tápközeggel 50 pL végtérfogatra hígítottuk, majd az üregekhez adtuk. Oli-neu sejteket 24 órán át inzulinmentes tápközegben tartottunk, majd 48 órán át a kísérleti vagy kontroll mintákkal kezeltünk. Az inzulinmentes tápközegben frissen 24 órán át tenyésztett levált Oli-neu sejteket 1 mM EDTA-t tartalmazó PBS-sel nyertük ki a tenyésztöpalackból. A sejtekből 300000 sejt/mL koncentrációjú szuszpenziót hoztunk létre, majd ennek 50 pL-ét az üregekhez adtuk. Ezután a sejteket 48 órán keresztül 37°C-os párásított CO2 inkubátorban tároltuk. Ezután az üregekhez 10 pL „Alamar Blue”-t adtunk, majd a sejteket további 2,5 órán át inkubáltuk. Ezután minden egyes üregből 70 pL-t fekete 96 üregű lemezre vittünk át és azonnal lemértük a fluoreszcenciát.

A nem differenciált Oli-neu sejtek proliferációját rovarsejt- (BacOPN) vagy emlőssejtalapú expressziós rendszer (HEK-OPN) segítségével előállított oszteopontin különféle menynyiségeivel történt kezelést követően 24 órával állapítottuk meg. A növekedési ráta mennyiségi meghatározására a sejtes metabolikus aktivitást fluorimetrikus/kolorimetrikus növekedésindikátorral („Alamar Blue”) vizsgáltuk. Ez az ágens oxidációs-redukciós indikátort tartalmaz, ami a tápközeg sejtnövekedés következtében kialakuló kémiai redukciója hatására fluoreszcenciát és színváltozást mutat. Az alkalmazott ágens és az alkalmazott vizsgálati eljárás leírása megtalálható pl. Ahmed és mtsai. (1994) közleményében és az 5501959 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban.

Eredmények

E kísérlet eredményeit a 8-10. ábrák mutatják be.

Mind a bakulovírusban, mind a HEK-sejtekben expresszált rekombináns oszteopontin esetében dózisfuggő válaszreakciót lehetett megfigyelni. Amint az várható volt, a felfőzés megszüntette a protein biológiai aktivitását. A bakulovírusban expresszált (BacOPN) és a HEK-sejtben expresszált (HEK OPN) oszteopontin hozzáadása a sejtproliferáció dózisfuggő fokozódását idézte elő (8. ábra9, a BacOPN esetében az IC50 3,7 nM, a HekOPN (9. ábra) esetében az IC50 0,05 nM volt. Mindemellett az OPN a-izoalak 1-186. aminosavainak megfelelő N-terminális OPN-szerkezetet (2. ábra, N-term. OPN-a) is expresszáltuk rovarsejtekben.

. · ···:

η· Λ :?

-68Α tisztított proteint a teljes hosszúságú proteinnel összehasonlítva proliferációs vizsgálati eljárásban vizsgáltuk. A csonka protein a vizsgálat alapján aktívnak bizonyult (10 nM, lOOnM), Id. a 10. ábrát.

8. példa

Oszteopontin mielinizáciős markerek expressziójára gyakorolt hatása vegyes kérgi tenyészetekben

Fedőlemezeken tenyésztett vegyes kérgi sejttenyészeteket az 5-17. in vitro naptól (DIV) kezdődően 12 napig (100 nM) BacOPN-nel kezeltünk. A 17. in vitro napon a tenyészeteket rögzítettük és anti-MBP ellenanyaggal festettük. Az eredmények alapján a BacOPN-nel kezelt sejteket tartalmazó fedőlemezek több nagyfokban elágazódó MBP-pozitív oligodendrocitát tartalmaztak, mint a kontrollok (11. ábra). Mindemellett míg a kontroll tenyészetekben (11A ábra) nem lehetett mielinizáló oligodendrocitákat megfigyelni, addig az ONP-vel kezelt tenyészetek (B, C és D ábra) axonokat körülvevő és mielinszegmenseket és intemodális befuződéseket tartalmazó oligodendrocitákban gazdagok (11B-D ábra). A szegmens klaszterek megszámolásával kiderült, hogy amíg a kontroliban nem fordult elő szegmens, három különböző oszteopontinnal kezelt mintában 16, 22 és 18 szegmens klasztert lehetett megfigyelni. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a vegyes kérgi sejttenyészetek oszteopontinnal történő kezelése a mielinképző oligodendrocitákra jellemző differenciált oligodendrocita fenotípus kialakulásához vezet.

9. példa

Oszteopontin MBP expresszióra gyakorolt, MBP ELISA-val megállapított hatása vegyes kérgi tenyészetekben

Az MBP protein mennyiségi növekedésének és ennélfogva a mielinizációnak az OPNés LIF kezelésben részesült vegyes kérgi tenyészetekben történő monitorozására MBP ELISA-t alkalmaztunk.

Elsődleges tenyészetek

A tenyészetek anyaga vemhes NMR1 típusú nőivarú egerekből a párzás után 16 nappal eltávolított embriók agyszövetéből származott. Az embriókat Lubetzki és mtsai. protokollja szerint felboncoltuk, az agykérgeket tripszines emésztéssel disszociáltuk, majd az elkülönült sejteket (neuronokat, asztrocitákat, oligodendroglia sejteket, mikroglia sejteket és idegsejt előalakokat) 1 x 105 sejt/üreg mennyiségben (50 pL kezdeti térfogatban) poli-L-lizinnel bevont 96 üregű tenyésztőtálcákra vittük.

-69Rekombináns proteinnel végzett kezelés

A kezeléseket rekombináns proteinekkel végeztük (pozitív kontroll, rekombináns egér leukémia inhibitor faktor (LIF), AMRAD Laboratories, 1 pg/ml, 100 ng/ml és 10 ng/ml koncentrációban; bakulovírusban előállított teljes hosszúságú egéreredetü oszteopontin 100 nM, 10 nM és 10 pM koncentrációban). A sejtekhez történt in vitro hozzáadásuk előtt a proteineket a törzsanyagból tenyésztőközeggel a kívánt koncentrációjúra hígítottuk. A tenyészeteket 5 napos tenyésztést követően 17 napon keresztül kezeltük. A tápközeget három naponta cseréltük.

Mikrotitertálcás mintakinyerési protokoll

A sejteket lizáltuk és a mintákat 17 nap in vitro tenyésztés (DIV17) után kinyertük. A sejtlízist hármas detergenspuffer alkalmazásával végeztük.

Hármas detergenspuffer

V égkoncentráció ml Trisz, pH = 8,0 1M 50 mM

8,77gNaCl 150 mM mL NaN3 (10%) °>^02% mL SDS 20% °>^1%

10mLNP40 ^1% g nátrium-dezoxikolát 0,5%

Az alkalmazás előtt 10 mL hármas detergenspufferhez egy proteázgátló tablettát (Roche no.: 1836170) adtunk.

A 96 üregű tálcán tenyésztett vegyes kortikális tenyészetekből eltávolítottuk a tápközeget. A sejteket 50 pL 1 X PBS-sel két alkalommal óvatosan mostuk, majd az üregekhez 50 pL hármas detergenspuffert adtunk. A lizalt mintákat tartalmazó mikrotiter-talcakat az elemzésig -20°C-on tároltuk.

BCA proteinvizsgálati eh árás

A Pierce BCA proteinvizsgálat detergens kompatíbilis eljárás, amely az összes protein bicinkoninsawal (BCA) végzett kolorimetrias detektálásán es mennyiségi meghatározásán alapul. Az eljárás a Cu+2 alkalikus közegben protein hatására végbemenő, Cu+1 képződését eredményező jól ismert redukcióját és egy bicinkoninsavat tartalmazó különleges reagenssel végzett kolorimetriás rézkation (Cu+1) detektálás kombinációját tartalmazza.

A vizsgálati eljárás lila színű reakcióterméke két molekula BCA egy molekula rézionnal történt kelátképzésének eredményeként jön létre. Ez a vízoldékony komplex 562 nm-en » * · ·· * · ··?· Η· <· Λ -70erős abszorbanciát mutat, ami széles határok (20 pg/mL - 2000 pg/mL) között a növekvő proteinkoncentrációval lineárisan változik. A BCA eljárás nem valódi „végpont-eljárás”, mivel a kapott szín intenzitása folyamatosan nő, azonban az inkubáció végeztével a színkialakulás üteme elegendő mértékben lelassul ahhoz, hogy nagyszámú mintát lehessen egyszerre vizsgálni. A BCA reakcióban a szín kialakulásáért a protein makromolekuláris szerkezete, a peptidkötések száma és négy aminosav (cisztein, cisztein, triptofán és tirozin) jelenléte felelősek.

Mikrotitertálcás összprotein-meghatározási protokoll

A mikrotitertálca megfelelő üregeibe a standardok (2000 pg/mL, 1500 pg/mL, 1000 pg/mL, 750 pg/mL, 500 pg/mL, 250 pg/mL, 125 pg/mL, 25 pg/mL BSA) és minták 25 pL-ét mértük. Az üregek kitöltéséhez („to blank the wells”) a hígítószer (hármas reagenspuffer) 25 pL-ét használtuk (20-2000 pg/mL munkatartomány).

Az üregek mindegyikéhez 200 pL munkareagenst (50 rész BCA „A reagens es 1 rész BCA „B” reagens keverékét) adtunk. A tálcát 30 másodpercig ráztuk, majd 37°-on 10 percig inkubáltuk. Az inkubálást követően az abszorbancia ertekeket 570 nm-en mertük.

MBP „szendvics” ELISA

Az 1:5000 arányban 1 X PBS-ben hígított anti-MBP ellenanyaggal (Chemicon, MAB5274) +4°C-on egy éjszakán át 96 üregű, lapos aljú steril mikrotiter-tálcákat (Costar) inkubáltunk. Mindegyik üreghez 50 pL hígított ellenanyagoldatot adtunk.

A következő napon mindegyik üregből eltávolítottuk az ellenanyagoldatot és 1 X PBS-ben lévő 50 pL 1%-os BSA oldat alkalmazásával blokkolási lépést hajtottunk végre. A blokkolást szobahőmérsékleten egy órán keresztül folytattuk. A blokkolást követően a tálcákat automatizált berendezés segítségével PBS/Tween alkalmazásával három alkalommal mostuk.

Az 1% BSA/PBS-ben lévő MBP peptidstandard sorozathígításoknak vagy mintáknak a mikrotiter-tálca üregeihez adása után inkubálást végeztünk. Az MBP peptid 100 ng/ml-es törzsoldatát 2:2 arányban hígítottuk. Az alkalmazott hígításokat a BCA proteinmeghatározási vizsgálati eljárás eredménye alapján kiszámított összprotein mennyiség alapján határoztuk meg. A következő hígításokat használtuk:

100 pg, 50 pg, 25 pg, 12,5 pg, 6,2 pg, 3,1 pg.

Az MBP standarddal és proteinmintákkal történt inkubálást követően a tálcákat ismételten három alkalommal 1% BSA/PBS-sel mostuk.

«.j- , > J. .-

Ezután 1% BSA/PBS-ben hígított poliklonális anti-MBP ellenanyag (Zymed 10-0038, 1:300) alkalmazásával szobahőmérsékleten két órán át második inkubálást végeztünk. Az inkubálást követően a tálcákat ismét három alkalommal mostuk (Id. fentebb).

A következő lépésként minden egyes üreghez 50 pL 1% BSA/PBS-ben hígított kecske anti-nyúl biotint (Vector BA-1000, 1:10000) adtunk, majd a tálcákat szobahőmérsékleten egy órán át inkubáltuk. Az inkubálást követően a tálcákat ismét három alkalommal mostuk (Id. fentebb).

Az utolsó inkubálás előtt 1 X PBS-ben hígított 50 pL sztreptavidin-konjugált tormaperoxidázt (strep-HRP; Amersham RPN 1051, 1:8000) adtunk mindegyik üreghez. A tálcákat szobahőmérsékleten egy órán át inkubáltuk.

A tálcák mosását követően a reakciót ortofenilén-diamin-dihidroklorid alkalmazásával tettük láthatóvá (OPD, Sigma, az oldatot 1 tabletta 20 mL vízhez adásával állítottuk elő). A reakciót 3 M HC1 vagy 30% H2SO4 hozzáadásával blokkoltuk. Az optikai denzitás értékét többcsatornás leolvasóval (Labsystems Multiskan EX) 492 nm-en határoztuk meg.

Eredmények

Amint a 12. ábrán látható, az MBP proteinmennyiség a (10 nM) bacOPN-nel kezelt tenyészetekben a DIV 17 időpontban háromszorosa volt a kontroll tenyészetek esetében megállapítottnak. Ez a megfigyelés alátámasztja a bakulovírusban expresszált oszteopontin oligodendrocita prekurzor proliferációra és mielinizációra kifejtett pozitív hatására vonatkozó korábbi eredményeinket.

10. példa

Az oszteopontin CG4 proliferációra kifejtett hatása

A CG4 sejtvonal elsődleges A2B5 oligodendrocita prekurzorokból spontán kinyert halhatatlan patkány oligodendrocita sejtvonal. A CG4 sejteket gyakran veszik igénybe az oligodendrocita differenciálódás vagy túlélés vizsgálata során. Az említett sejtvonal a következő előnyökkel rendelkezik.

Az oligodendrocita progenitorokhoz hasonlóan nagyfokú proliferációs ráta (O2A-szerű) (GD3, A2B5-pozití sejtek);

Alacsony fenntartási költség B104 patkány neuroblasztóma sejtvonalból [Louis, J. C. és mtsai. (1992); ATCC] kinyert kondicionált tápközegben (hatékony növekedési faktor koncentrációk mellett);

Rövid ideig tartó proliferációhoz a B104 kondicionált tápközeg helyett (FBS nélküli, FGF2+PDGF tartalmú) meghatározott („defined”) tápközeg is alkalmazható.

-72Meghatározott tápközeggel a sejtek oligodendrocitákká (04,GalC-pozitív) történő differenciálódása indítható el.

FBS jelenlétében a sejtek (GFAP-pozitív) asztrocitákká történő differenciálódása is el érhető.

A kétféle (E. coli-ban vagy rovarsejtben expresszált) oszteopontin protein proliferációra gyakorolt hatását a CG4 sejtek 35. passzázsának alkalmazásával vizsgáltuk. A vizsgálathoz az R&D System E. coli-ban előállított oszteopontint (Cat.441-OP-t) alkalmaztunk, amelyet (GST fuzionált) protein kináz 2-vel 60 pL reakciótérfogatban a következők szerint in vitro foszforiláltunk.

Kinázpuffer, 6X

Hepes 50 mM

MgC12 lOmM

DTT 1 mM

Nátrium-vanadát 0,2 mM

Béta-glicerofoszfát 25 mM

ATP keverék (60 pM)

Mintapuffer, 2X, pH - 6

Trisz-Cl 0,125

Glicerin 20%

DTT 0,2 M

Brómfenolkék 0,02% pL ATP 600 pM pL 32pATP

265 pL H2O2

A reakciót ATP keverék hozáadásával kezdtük meg, az első inkubálást 30°C-on 1 órán át végeztük. A proteinkináz eltávolítása érdekében előzőleg PBS-ben mosott reakciókeverekhez 30°C-on 90 percig (rázás mellett) végzett inkubálást követően 100 pL „Glutathione Sepharose” gyöngyöt (Pharmacia) adtunk. Ezután a keveréket szobahőmérsékleten, óvatos mozgatás mellett egy órán át inkubáltuk. A szuszpenziót a gyöngyök kiülepítése érdekeben 5 percig 500 g-n centrifugáltuk. Ezt követően a felülúszót PBS ellenében 4°C-on egy éjszakán át dializáltuk. A protein mennyiségét BCA-val határoztuk meg (Pierce).

Kináz reakció:

pL kazein-kináz, 0,05 pg/pL pL E. coli OPN, 0,5 pg/pL pL 50 mM trisz-HCl, pH = 8 pL kinázpuffer, 6X pL ATP keverék

-73 Proliferációvizsgálati eljárás

A Bac OPN és az in vitro foszforilált OPN proteinek CG4 sejtek proliferációját kiváltó hatását 10 pM, 10 nM és 100 nM koncentrációban vizsgáltuk. A leolvasáshoz BrdU-t (Amersham) használtunk [Avellana és mtsai. (1996)]. A sejteket 70% kondicionált NI tápközegben (5 pg/ml transzferrinnel, 100 mM putreszcinnel, 30 nM nátrium-szelenittel és 10 ng/ml biotinnal kiegészített, 4,5 g glükózt, 2 mM glutamint, 100 E/ml penicillint, 100 pg/ml sztreptomicint és 1 mM nátrium-piruvátot tartalmazó DMEM] és 30% B104 kondicionált tápközegben (biotin nélküli NI) tenyésztettük [Louis, J. C. és mtsai. (1992)]. A vizsgálatot (100 pg/ml) poli-omitinnel kezelt 24 üregű tálcákon végeztük, a tálcák üregei 3x104 sejtet tartalmaztak. Az üregekhez egy időben 10 nM BrdU-t adtunk, majd a sejteket 18 órán át inkubáltuk. A fixálást követően a sejtosztódások kimutatása erdekeben anti-BrdU ellenanyaggal im muncitokémiai vizsgálatot végeztünk. Az összes sejtszám megállapítása érdekében a sejteket Hoechst 44432 festékkel (Sigma) is megfestettük. A sejttenyészetek képét „Leica Qwin Image Analysis System” alkalmazásával elemeztük.

Eredmények

A vizsgálat eredményeit a 13. ábra tartalmazza.

A bakulovírusban expresszált oszteopontin a CG4 sejtek fokozott proliferációját idézi elő. A legkifejezettebb ilyen irányú hatás az OPN 10 nM-os koncentrációja mellett volt megfigyelhető, bár a 100 nM-os OPN koncentráció is proliferációhz vezetett. Az in vitro foszfonlált, E. coli-ban expresszált OPN a CG4 sejtek kismértékű proliferációját idézte elő.

Az OPN-nel kezelt és OPN-nel nem kezelt CG4 sejtek morfológiai összehasonlítása során kiderült, hogy míg a kontroll sejtek esetében nem lehetett differenciálódás nyomait megfigyelni, addig az OPN-nel kezelt CG4 sejtek többsége nyúlványokat „növesztett”. Bár a differenciálódás kifejezettebb volt a bakulovírusban expresszált OPN esetében, az in vitro foszforilált, E. coli-ban expresszált OPN is előidézte a CG4 sejtek proliferációját (nem közölt adatok).

11. példa

Az oszteopontin hatása a MOG-indukált kísérletes autoimmun encephalomyelitisre (EAE-re) egérben

A vizsgálat célja

Az oszteopontin (OPN, AS900011) különféle funkciókkal rendelkező citokin, amely szerepet játszik különféle sejttípusok adhéziójában, migrációjában, differenciálódásában, túlé

:.:. :.:. . ·* *· ’··:

* · · · ·· · * ·

-74lésében és citokin-szekréciójában. A remielinizációt és az oligodendrociták működését szabályozó gének kimutatására irányuló differenciált génexpressziós vizsgálatban (DGE-ben) az oszteopontin ilyen tulajdonságára derült fény (Id. 1. példa). Oligodendrocita prekurzorok bakulovírusban expresszált rekombináns OPN-nel (AS900011-gyel) végzett kezelése dózisfüggő módon fokozta a proliferációjukat (IC50: 3,7 pM; Id. 7. példa). Emellett az AS900011 hatást gyakorolt a CG4 sejtvonal és primer neuroszférák („neurospheres”) differenciálódására is (Id. 8. példa). A Cuprizone-val kezelt egerek demielinizált corpus callosum területein OPN expresszié figyelhető meg, amely a mikroglia sejtekben a legerősebb (Id. 1. példa). Mindemellett OPN expressziót lehetett kimutatni a szubventrikuláris zónában (SVZ-ben) is, amelyről feltételezik, hogy a remielinizációban részt vevő oligodendrocita prekurzorokat tartalmaz (Id. 4. példa). Feltételezhető, hogy a sokrétű immunológiai szabályzófunkcióval rendelkező OPN az ideg- és gliasejtek működését is befolyásolhatja.

E kísérlet célja az OPN MOG-indukált EAE egérmodell esetében kifejtett terápiás hatásának vizsgálata volt.

Vizsgálati eljárás

A jelen vizsgálathoz alkalmazott EAE indukciós eljárás a Sahrbacher és mtsai. (1998) által közzétett protokoll adaptált változata volt. A kísérletben alkalmazott állatok védelme az 1992. január 27-i 116. számú olasz D. L. által hatályba léptetett 86/609/EEC direktívának megfelelően történt. Az állatok elhelyezesere es ellatasara szolgáló felszerelések es eszközök a 86/609/EEC direktívával összhangban voltak. Az Intézet az illetékes állategészségügyi hatóságok minden szükséges engedelyenek birtokában van. A kísérleti protokoll állatokkal való bánásmódra vonatkozó részeit a hivatalos állatorvos jóváhagyta. A protokollt az Olasz Egészségügyi Minisztérium engedélyezte (51/99-B számú végzés).

Vizsgálati rendszer

Fajta, törzs, altörzs és nem:

az IFF A CREDO (Saint Germain sur l’Arbresle, Franciaország) tenyészetből származó C57 BL/6JICO nőivarú egereket a Charles River Italia (Calco, Lecco, Olaszország) szerezte be.

A vizsgálati rendszer kiválasztásának indoklása:

kísérletes modellként a C57 BL/6JICO egereket választottuk, ez a törzs igazoltan érzékeny az EAE-vel szemben

Beszállító:

Charles River Italia S.p.A.

Via Independenza, 11

-75:.:. :.:. . < *· Ή * · · · ·· · ··

23885 - Calco (Lecco)

Akklimatizálás:

A kísérlet megkezdése előtt legalább 5 nappal. Ebben a periódusban az állatok megfigyelésével győződünk meg a kísérletbeli részvételre való alkalmasságukról.

Életkor és testtömeg a véletlenszerű csoportbeosztás idején:

Mintegy 8 hetes életkor, 18-22 g

Elhelyezés:

állat/ketrec légkondicionált szobákban.

Hőmérséklet: 22°C ± 2

Relatív páratartalom: 55% ± 10

Légcsere: 15-20 alkalommal óránként, HEPA 99,99% szűrön átszűrve

Világítás: 12 órás ciklusokban (reggel 7 és este 7 között)

Ketrec: 42,5 x 26,6 x 15 méretű Makrolon® ketrecek, rozsdamentes fedővel ellátott etetővel felszerelve. A ketrec alja rácsot tartalmaz. A rácson keresztül a ketrec aljára potyogó ürülék időnként el lesz távolítva.

Az állatok azonosítása:

az azonosítás fülbe helyezett krotáliával történik. A ketrecre helyezett azonosítólap tartalmazni fogja a kísérlet számát, az adagolási csoportot és a hatóanyag adagolásának időpontját.

Takarmány:

GLP 4RF25 „top certificate” granulált táp, előállítója a Charles River Itala engedélyével a Mucedola S.r.l., Settimo Milanese. A beteg állatok táplálása érdekében a 7. naptól a ketrec aljára megnedvesített granulátumot is juttattunk. A táp előállítója a takarmány tápanyagokra és szennyező anyagokra vonatkozó vizsgálatának eredményéről igazolást nyújt, mindezek mennyisége az EPA-TESCA (44FR.-44053-44093, 1979. július 26.) által javasolt értékeken belül van. A RBM legalább évente kétszer megvizsgáltatja az állati takarmány bakteriális szennyezettségét. A táplálék ad libitum az állatok rendelkezésére áll.

Itatóvíz:

a városi vezetékes vízből származik. A szűrt itatóvizet automatikus szeleprendszer segítségével ad libitum biztosítjuk az állatoknak. Az automatikus itatórendszer mellett műanyag itatóedényeket is alkalmazunk. Az itatóvizet mikrobiológiai szennyezettsége, nehézfém vagy egyéb szennyező anyag (pl. oldószer, peszticid) tartalma, valamint egyéb kémiai és fizikai tulajdonságai szempontjából időszakonként megvizsgáltatjuk. Az itatóvíz minőségi határértékeit a 80/778 számú EEC direktíva tartalmazza.

- 76Az itatóvízben a kísérlet eredményét befolyásoló szennyező anyagok jelenléte nem valószínűsíthető.

Vizsgált anyagok:

his-jelzett egéreredetű oszteopontin (AS900011) és mIFNB.

Immunizálási eljárás:

Az egereket a kísérlet 0. napján 0,5 mg Mycobacterium tuberculosis-t tartalmazó Freund-féle komplett adjuvánst (FCA, Difco, Detroit, USA) és 200 pg MOG35-35 peptidet (Neosystem, Strasbourg, Franciaország) magában foglaló emulzió 0,2 mL-ével bal oldali horpaszukon szubkután beadással immunizáltuk. Közvetlenül ez után 400 pL pufferben (0,5 M NaCl, 0,017% Triton X-100, 0,015 M Trisz, pH = 7,5) oldott 500 ng pertussis toxint (List Biological Lab., Campbell, CA, USA) adtunk be nekik intraperitoneálisan. A 2. napon az állatok ismételten 500 ng pertussis toxint kaptak ip. A 7. napon az egerek jobb oldali horpaszának bőr alati kötőszövetébe egy második dózis CFA-ban lévő 200 pg MOG35-35 peptidet juttattunk. A kísérlet mintegy 8-10. napjától kezdődően az említett immunizálás a faroknál kezdődő és az elülső végtagokig terjedő, fokozatosan súlyosbodó bénuláshoz vezet.

Kísérleti elrendezés:

A kísérletben 7 csoportban 15-15 állatot vizsgáltunk. A csoportok mindegyikét az immunizálási protokollnak megfelelően CFA-ban lévő MOG35-35 peptiddel és pertussis toxinnal immunizáltuk, majd a következő elrendezés szerint kezeltük.

1. csoport:	csak OPN vivőanyaggal (PBS + 0,1% BSA) se. kezelt pozitív kontroll csoport
2. csoport:	csak mIFNB vivőanyaggal (PBS) se. kezelt pozitív kontroll csoport
3. csoport:	1 pg/kg oszteopontinnal (AS900011) se. kezelt csoport
4. csoport:	10 pg/kg oszteopontinnal (AS900011) se. kezelt csoport
5. csoport:	100 pg/kg oszteopontinnal (AS900011) se. kezelt csoport
6. csoport:	100 pg/kg oszteopontinnal (AS900011) és 20000 E/egér mIFNB-val se. kezelt csoport
7. csoport:	20000 E/egér mIFNB-val se. kezelt csoport

Az állatok csoportonkénti száma a megfigyelt gyógyászati hatás megfelelő értékeléséhez minimálisan szükséges létszámnak felel meg.

Vivőanyag:

az oszteopontin megfelelő koncentrációra hígításához PBS-t + 0,1% BSA-t alkalmazunk, a mIFNB megfelelő koncentrációjúra hígításához PBS-t veszünk igénybe.

-77 Adagolási mód:

Az oszteopontin (AS900011) 1, 10 és 100 pg/kg-os mennyiségét 10 ml/kg-os adagban se. adtuk be. Az mIFNB 20000 E/egér mennyiségét 200 pL/egér adagban se. adjuk be. Az első csoportot PBS + 0,1% BSA 10 ml/kg-os adagjával se. kezeljük, míg a 2. csoportot egerenként 200 pL PBS adaggal se. kezeljük.

A kezelés időtartama:

A jelen vizsgálatban alkalmazott csoportok kezelése a >1 súlyosságú klinikai tünetek megjelenésekor kezdődött és 35 egymást követő napig fog tartani.

Beadási formula:

a vegyületet és az mIFNB-t megfelelő kötőanyaggal kialakított oldatként adagoltuk. A megfelelő kiszereléseket a kísérlet szponzorának utasítási szerint állítjuk elő.

Klinikai megfigyelések:

Az immunizálást követő 7. naptól kezdve az állatokat bénulás tüneteinek jelentkezése szempontjából egyedileg megfigyeltük és állapotukat a következő klinikai pontszámok egyikével írtuk le:

= nincs betegségtünet, egyéb elváltozás

0,5 = részleges farokbénulás = farokbénulás

1,5 = farokbénulás + részleges egyoldali hátulsó végtag bénulás, = farokbénulás + hátulsó végtag gyengeség vagy részleges hátulsó végtag bénulás,

2,5 = farokbénulás + részleges hátulsó végtag bénulás(medence „lógás”), = farokbénulás + teljes hátulsó végtag bénulás,

3,5 = farokbénulás + teljes hátulsó végtag bénulás + inkontinencia = farokbénulás + hátulsó végtag bénulás + az elülső végtagok bénulása vagy részleges gyengesége = moribund állapot vagy elhullás

Az állatok megfigyelésére csendes szobában került sor. A klinikai tünetek napi elbírálását a csoportok által kapott kezelést nem ismerő asszisztens végezte.

Az állatok testtömegét naponta megmértük.

A súlyos fokú fájdalmat mutató vagy moribund állapotban lévő állatokat az alkalmazott állatorvos vagy az erre feljogosított személy meg fogja vizsgálni és szükség esetén a felesleges szenvedés elkerülése érdekében el fogja őket altatni.

-78Vérminta- vétel:

az utolsó kezelést követően 24 órával (pentobarbitál anesztézia alatt) mindegyik állattól vérmintát veszünk. A vérmintából a szokásos eljárással kinyerjük a szérumot, majd azt 20°C-on fagyasztva tároljuk. A fagyasztott szérummintákat a vegyületek relatív szérumbeli koncentrációjának megállapítása érdekében az SPRI-be szállítjuk.

Kórszövettani vizsgálatok:

a kezelés végeztével a pentobarbitál anesztézia alatt lévő állatokat a bal kamrán keresztül 4%-os formaldehiddel perfundáljuk (fixáljuk). Ezután óvatosan eltávolítjuk, majd formaiinban rögzítjük a gerincvelőjüket. A gerincvelőből készített szeleteket parafinnba ágyazzuk. A beágyazott mintákból metszeteket készítünk, amelyeket a gyulladásos jelenségek kimutatása érdekében hematoxilin-eozinnal, a demielinizáció kimutatása érdekében pedig Kluver-PAS szerint („Luxol Fast Blue” + perjódsavas Schiff festés) festjük.

Adatelemzés:

A klinikai vizsgálatok eredményét minden egyes csoport esetében átlagpontszámként (± SEM) adjuk meg. A vizsgált anyagok hatását a vivőanyaggal kezelt pozitív kontroll csoport eredményeivel vetjük össze. Az egyes csoportok klinikai pontszámai közti különbségeket Kruskal-Wallis teszttel vizsgáljuk, majd szignifikáns különbség esetén az egyes mérési időpontokban a páros Wilcoxon teszttel elemezzük. A testtömeg-adatokat egyszempontos ANOVA-val értékeljük, majd szignifikáns különbség esetén Tukey-tesztet alkalmazunk. A statisztikai elemzésekhez S-Plus® szoftvert alkalmazunk.

Eredmények

A jelen vizsgálat eredményeit a 14-16. ábrák mutatják be.

A perivaszkuláris gyulladásos sejtes infiltráció kórszövettani elemzésével kimutattuk, hogy az OPN kezelésben részesült állatokban, elsősorban a legalacsonyabb, 1 pg/kg-os adag alkalmazása esetében, enyhébb perivaszkuláris gyulladásos sejtes beszürődést lehetett megállapítani. Az OPN és a szklerózis multiplex gyógykezelésére már korábban igénybe vett IFNB együttes alkalmazása hatékonyabb volt, mint az említett hatóanyagok külön-külön történt adagolása (14. ábra).

Az elemzés során ezt követően a demielinizálódott területek százalékos arányát állapítottuk meg (15. ábra). Az OPN-nel kezelt állatok esetében itt is kisebb kiteijedésű demielinizálódott területeket találtunk. Az OPN és az IFN kombinált alkalmazása nagymértékben szignifikáns demielinizáció-csökkenést okozott, ami messze elmaradt még az IFN önálló alkalmazásánál megfigyelt demielinizáció mértékétől is (15. ábra).

···· · · «·· ··:* ··:· ·..· a. ..· .79.

A 16. ábra a kezelés végén megállapított klinikai pontszámot, a gyulladásos sejtes infiltráció, valamint a demielinizáció kiteljedtségét mutatja be. Bár az oszteopontinnal kezelt egerek klinikai pontszámai nem voltak lényegesen alacsonyabbak mint a kontrolioké, az OPN és az IFN kombinált alkalmazása a pozitív kontroll IFNB kezelésnek megfelelő alacsony klinikai pontszámokat eredményezett. Ez a megfigyelés összhangban volt a gyulladásos sejtes beszűrődés és a demielinizáció mértékével, az OPN és IFNB kezelés hatására ugyanis mindkét paraméter lényeges mértékű csökkenést mutatott (16. ábra).

Összefoglalva, a kísérletben a következő eredményeket kaptuk.

Az 1 mg/kg, 10 mg/kg vagy 100 mg/kg se. adagban önmagában alkalmazott oszteopontin (AS900011) nem csökkentette statisztikailag lényeges mértékben a perivaszkuláris gyulladásos sejtes beszűrődés és a demielinizáció mértékét. Az mIFNB-val végzett kezelés (20000 E/egér, se.) 55%-kal csökkentette a perivaszkuláris gyulladásos sejtes beszűrődés és 53%-kal a demielinizáció mértékét. Ha ugyanilyen adagú mIFNB-t 100 mg/kg oszteopontinnal kombináltan alkalmaztunk, úgy mind a gyulladásos sejtes reakció, mind a demielinizáció kiterjedtsége lényeges mértékben csökkent (71%-kal valamint 81%-kal).

A kórszövettani vizsgálattal kapott eredmények összhangban voltak a 35. napon (a kezelés végén), az állatok kiirtását és gerincvelőjük begyűjtését megelőzően megállapított klinikai pontszámokkal. Az 1 mg/kg, 10 mg/kg vagy 100 mg/kg se. adagban önmagában alkalmazott oszteopontin (AS900011) nem csökkentette statisztikailag lényeges mértékben a megbetegedés súlyosságát. Az mIFNB-val végzett kezelés (20000 E/egér, se.) statisztikailag lényeges mértékben csökkentette a megbetegedés súlyosságát. Ha ugyanilyen adagú mIFNB-t 100 mg/kg oszteopontinnal kombináltan alkalmaztunk, a klinikai tünetek statisztikailag lényeges mértékű csökkenését lehetett megfigyelni.

Mindezek az eredmények arra utalnak, hogy az oszteopontin és a mIFNB alkalmazásával végzett kombinált kezelés egér EAE modellben hatékonyan csökkenti mind a klinikai tüneteket, mind a kóros elváltozások mértékét, ennek következtében szklerózis multiplex eredményes kezelésére is alkalmas lehet.

12. példa

Az oszteopontin ülőideg-zúzódással kialakított neuropátia esetében kimutatható védőhatása egérben

Rövidítések

CMAP: összetett izom akciós potenciál

EMG: elektromiográfia *·· · · «·· ”:· *·:· 4. ·.'

-80IGF-1: inzulinszerű növekedési faktor

SC: szubkután

SEM: az átlag standard hibája vs: „versus” valamivel szemben Bevezetés

A neuropátiák általában szelektívek, ami az érintett PNS neuronok típusára (érző vagy szimpatikus), valamint a neuronok altípusára (kicsi vagy nagy) egyaránt vonatkozik. A neurotróp faktorok neuroprotektív hatásának értékelésére leggyakrabban használt állati modell a perifériás idegek axonjának átvágása. A különféle balesetek súlyos következményei lehetnek a traumás idegsérülések, az idegfonat-sérülések és a gerincvelői gyökerek sérülései. Egyes kórképeket, pl. a carpalis alagút-szindrómát vagy a gerincoszlop ortopédiai komplikációt gyakran kíséri mielinsérüléshez vezető perifériásideg-összenyomatás Az axotomia az érintett neuronokbán sejtelhalást, csökkent axonális ingerületvezetési sebességet és megváltozott neurotranszmitter-mennyiséget idéz elő. A zúzódásos sérülések lehetővé teszik a regenerációt, ami az idegek kóros elváltozásai szempontjában szintén érdeklődésre számot tartó folyamat [McMahon, S. és Priestley, J. V. (1995)].

A sejtes neurobiológia alapvető kérdése a sérülést vagy betegséget követő idegi regeneráció szabályozása. A funkcionális idegi regeneráció nem csupán az axonok saijadzását és meghosszabbodását, hanem új mielin szintézisét is igényli. Az idegi ingerületvezetés élettani szintjének visszaállítása és az axonok újabb neurodegeneratív támadásoktól való védelme érdekében remielinizációra van szükség. A neurodegeneratív kórképekkel kpacsolatos kutatások elsődleges célja az idegsejt-elhalást megakadályozó, a neuron fenotípusát fenntartó, valamint az idegsejtek és a mielinhüvely által elszenvedett károsodásokat kijavító beavatkozások kifejlesztése. Az axotomizált gerincvelői motoros neuronok teljes regenerációjáért felelős molekuláris és sejtes mechanizmusok megismerése érdekében már nagyszámú kutatást végeztek [Fawcett és mtsai. (1990); Funakoshi és mtsai. (1993)]. A neurotróp faktorok és a nekik megfelelő receptorok sérülés-előidézte expressziója fontos szerepet játszhat az idegek regenerációs képességében. Korábbi vizsgálatokban az idegi regeneráció jelentős mértékű javulását figyelték meg különféle peptidek és nem-peptid vegyületek esetében, ilyenek voltak pl. az inzulinszerű növekedési faktor (IGF-1), az ACTH [Lewis és mtsai. (1993); Strand és mtsai. (1980)], a tesztoszteron [Jones (1993)], az SR57746A [Foumier és mtsai. (1993)] és a 4-metilkatekol [Kaechi, K. és mtsai. (1993); Hanaoka, Y. és mtsai. (1992)].

Jelen kísérletet a különböző oszteopontin adagokkal kezelt egerekben mutatott idegi regeneráció értékelése érdekében végeztük. Ebben a modellben az OPN neuronok és axonok • * * · ·♦ ·* \ η· ^:;· <· J. :?

-81 (érző és mozgató neuronok) túlélésére és regenerációjára, a mielinizációra vagy a makrofáginfiltrációra gyakorolt pozitív hatása a mozgató funkció helyreállását eredményezheti. A regeneráció az érző-mozgató funkciók helyreállása vagy morfológiai vizsgálatok alapján állapítható meg. Kísérletünkben ennek megfelelően párhuzamos elektrofiziológiás méréseket és kórszövettani morfometriai elemzéseket végeztünk.

Anyag és módszer

Állatok

A vizsgálatokban nyolcvannégy 8 hetes korú nőivarú C57bl/6 egeret (Elevag Janvier, Le Genest-St-Isle, France) alkalmaztunk. Az állatokat 7 egyenlő csoportra osztottuk (n = 12): (a) a vivőanyaggal kezelt, nem műtött csoport; (b) vivőanyaggal kezelt, idegzúzáson átesett csoport; (c) idegzúzás/oszteopontin kezelés (1 pg/kg); (d) idegzúzás/oszteopontin kezelés (10 pg/kg); (e) idegzúzás/oszteopontin kezelés (100 pg/kg); (f) idegzúzás/4-metilkatekol kezelés (10 pg/kg); (g) idegzúzás/denaturált oszteopontin kezelés (100 pg/kg).

Az állatokat szabályozott hőmérsékletű (21-22°C-os) inkubátorban, megfordított fény/sötétség ciklus mellett (12h/12h), ad libitum takarmány- és itatóvíz-ellátással csoportosan tartottuk (5 egér/ketrec). A kísérleteket az intézeti előírások szem előtt tartásával végeztük.

Az ülőideg-sérülés kialakítása

Az állatokat 60 mg/kg ketamin-klórhidrát (Imaigene 500®, Rhone Mérieux, Lyon, Franciaország) ip. injektálásával elaltattuk. A jobboldali ülőideget a jobb comb magasságában sebészileg feltártuk és trifurkéciójától 5 mm-re proximálisan roncsoltuk. Az ideget kétszer 30 másodpercig érfogó (1,5 mm szélességű, Koenig, Strasbourg, Franciaország) felhelyezésével roncsoltuk, az egyes roncsolások között az érfogót 90°-kal elforgattuk.

A kísérletes és gyógyszerezési elrendezés

A műtét napja előtt egyszer (alapérték), majd azt követően három héten keresztül heti egy alkalommal elektromiográfiás (EMG) vizsgálatokat végeztünk.

Az idegroncsolásos műtét napját 0. napnak tekintettük. A műtétet követő 4 napon nem végeztünk vizsgálatokat.

A testtömegre és a túlélési arányra vonatkozó adatokat naponta rögzítettük.

A kísérletesen előidézett idegsérülés napjától a kísérlet végéig az oszteopontint és a denaturált oszteopontint naponta egy alkalommal se. adagoltuk, míg a 4-metilkatekol napi injektálását ip. végeztük.

:.:.:.:. j ’··:

-82A kísérlet 4. hetében csoportonként 4 állatot kiirtottunk és eltávolított ülőidegeiket morfológiai vizsgálatnak vetettük alá.

Elektrofoziológiás mérések

Az elektrofiziológiás méréseket „Neuromatic 2000M” típusú elektromiográf (EMG) (Dantec, Les Ulis, Franciaország) alkalmazásával végeztük. Az egereket 60 mg/kg ketaminklórhidrát (Imaigene 500®, Rhone Mérieux, Lyon, Franciaország) ip. injektálásával elaltattuk. Az elaltatott állatok hőmérsékletét melegítőlámpa segítségével 30°C-on tartottuk, ezt a farokra helyezett érintőhőmérő (Quick, Bioblock Scientific, Illkirch, Franciaország) alkalmazásával ellenőriztük.

Az összetett izom akciós potenciált (CMAP)a gastrocnemius izomban mértük az ülőideg 0,2 ms ideig tartó, szupramaximális intenzitású (12,8 mA) stimulálásával. Az akciós potenciál amplitúdóját (mV), látenciáját (ms) és időtartamát (egy depolarizációs/repolarizációs eseményhez szükséges időt) állapítottuk meg. Az amplitúdó az aktív mozgató egységek számára utal, a disztális látencia pedig közvetetten a mozgatóideg ingerületvezetési és neuromuszkuláris ingerületátadási sebességének függvénye.

Morfometriai elemzés

A morfometriai vizsgálatot az idegroncsolást követően három héttel végeztük el. Erre a célra csoportonként négy állatot választottunk ki véletlenszerűen. Az állatokat 100 mg/kg Imaigene 500® ip. injektálásával altattuk el. Az ülőideg egy 5 mm-es szakaszát kórszövettani vizsgálat céljából eltávolítottuk. A szövetmintát egy éjszakán keresztül foszfátpuffer oldatban lévő (pH = 7,4) glutáraldehid (Sigma, L’Isle d’Abeau-Chesnes, Franciaország) 4%-os vizes oldatában rögzítettük, majd a feldolgozásáig 4°C-on 30%-os szacharózban tároltuk. Az idegrészletet két órán át foszfátpufferben lévő 2%-os ozmium-tetroxidban (Sigma, L’Isle d’Abeau-Chesnes, Franciaország) rögzítettük, majd alkoholsorban dehidráltuk és Epon gyantába ágyaztuk. A beágyazott szöveteket a polimerizáció érdekében 3 napig +70°C-on tartottuk. Mikrotómmal 1,5 pm-es harántirányú metszeteket készítettünk, azokat két percig 1%-os toluidinkék oldattal festettük (Sigma, L’Isle d’Abeau-Chesnes, Franciaország), majd dehidráltuk és „Eukitt”-re húztuk. Fénymikroszkóppal (Nikon, Tokyo, Japán) mintánként 20 metszetet vizsgáltunk, idegszövet-mintánként hat véletlenszerűen kiválasztott metszeten pedig félautomata digitális képfeldolgozó szoftver (Biocom, Franciaország) alkalmazásával morfometriai elemzést végeztünk. Metszetenként két látóteret vizsgáltunk. A vizsgálat során meghatároztuk az összes rost számát és a degenerált rostok (látóterenként!) százalékos aranyát.

- 83 Adatelemzés

Az adatok általános elemzését egytényezős vagy ismételt méréses variancia-analízissel (ANOVA-val) és egyszempontos ANOVA-val, valamint nemparametrikus tesztekkel (MannWhitney teszttel) végeztük. Szükség esetén a későbbiekben Dunnett-féle tesztet is alkalmaztunk. A szignifikanciaszintet p < 0,05-nek határoztuk meg. Az eredményeket átlag ± az átlag standard hibája (SEM) alakban adtuk meg.

Eredmények

A műtéti úton végzett idegzúzást mindegyik állat túlélte. Egy egér (idegzúzás/2. vivőanyag) a 7. napon, két egér (szimulált műtéten átesett/vivöanyagot kapott 3. és 6. számú állat) a 14. napon az EMG értékeléshez alkalmazott altatás közben pusztult el.

Testtömeg-meghatározás

Amint az a 17. ábrán is látható, a kísérlet során a testtömegek alakulásában szignifikáns mértékű csoportok közötti különbség volt megfigyelhető [F(6, 132) = 1,93 és p < 0,001; ismételt méréses ANOVA].

A vizsgálat során a csoportok mindegyikében a testtömeg növekedését tapasztaltuk.

Elektrofíziológiai mérések

Az összetett izom akciós potenciál amplitúdója (18. ábra)

A kísérlet során a CMAP amplitúdójának alakulásában szignifikáns mértékű csoportok közötti különbség volt megfigyelhető [F(6, 18) = 49,185 és p < 0,001; ismételt méréses ANOVA] (19. ábra).

Az idegsérülést követően az összes műtött állatban a látszólag műtött állatokhoz képest a CMAP amplitúdójának szignifikáns mértékű csökkenése volt megfigyelhető (p < 0,001; Dunnett-teszt).

Emellett a 7. és a 14. napon a 100 pg/kg oszteopontinnal vagy 10 pg/kg 4-metilkatekollal kezelt egerekben a CMAp amplitúdója lényegesen magasabb volt, mint az idegzúzás után vivőanyag kezelést kapott állatok esetében (p < 0,05; Dunnett-teszt).

Az idegzúzás után vivőanyag kezelést kapott, valamint az idegzúzás után D-oszteopontin kezelésben részesült egércsoportok értékei között nem lehetett lényeges mértékű különbséget kimutatni.

Az összetett izom akciós potenciál látenciája (19. ábra)

A kísérlet során a CMAP látenciájának alakulásában szignifikáns mértékű csoportok közötti különbség volt megfigyelhető [F(6, 18) = 2,521 és p < 0,001; ismételt méréses ANOVA]. A kísérlet 21. napján a műtéti idegzúzást szenvedett állatokban a látszólag műtött állatokhoz képest a CMAP látenciájának növekedése volt megfigyelhető (p < 0,001; Dunnett- • ·!♦ {«·· * *« £ **i

-84teszt). Emellett a 10 pg/kg és a 100 pg/kg oszteopontin kezelés szignifikáns hatású volt, mivel az e csoportokba tartozó állatok látenciája lényegesen kisebb volt, mint az idegzúzás után vivőanyag kezelést kapott állatok esetében (p = 0,017; Dunnett-teszt).

Az idegzúzás után vivőanyag kezelest kapott, valamint az idegzuzas után D-oszteopontin kezelésben részesült egércsoportok értékei között nem lehetett lenyeges mértékű különbséget kimutatni.

Az összetett izom akciós potenciál időtartama (20. ábra)

A kísérlet során a CMAP időtartamának alakulásában szignifikáns mértékű csoportok közötti különbség volt megfigyelhető [F(6, 18) = 25,15 és p < 0,001; ismételt méréses ANOVA] (20. ábra).

A kísérlet 7. napjától kezdődően a műtéti idegzúzást szenvedett állatokban a látszólag műtött állatokhoz képest a CMAP időtartamának lényeges mértékű növekedése volt megfigyelhető (p < 0,001; Dunnett-teszt). Emellett a 7. napon az idegzúzás után 100 pg/kg oszteopontin kezelésben részesült csoportban a CMAP időtartama lényegesen rövidebb volt, mint az idegzúzás után vivőanyag kezelést kapott állatok esetében (p < 0,001, Dunnett-teszt).

Az idegzúzás után vivőanyag kezelést kapott csoporthoz kepest a kísérlet 14. es 21. napján a következő három csoportnál lehetett szignifikáns mértékben csökkent CMAP időtartamot mérni: (a) idegzúzás/oszteopontin 10 pg/kg; (b) idegzúzas/oszteopontin 100 pg/kg, (c) idegzúzás/4-metilkatekol 10 pg/kg.

Az idegzúzás után vivőanyag kezelést kapott, valamint az idegzuzás után D-oszteopontin kezelésben részesült egércsoportok értekei között nem lehetett lenyeges mértékű különbséget kimutatni.

Morfometriai elemzés

A degenerált rostok százalékos aránya (21. ábra)

A kísérleti eredmények alapján a degenerált rostok látómezőnkénti százalékos aranyában szignifikáns mértékű csoportok közötti különbség volt megfigyelhető (p < 0,001; egyszempontos ANOVA) (22. ábra). A műtéti idegzúzást szenvedett állatok csoportjaiban szignifikánsan nagyobb arányban lehetett degenerált idegrostokat megfigyelni (p < 0,001, Dunnettteszt). Emellett a 7. napon az idegzúzás után kezelésben részesült csoportokban lényegesen alacsonyabb arányban voltak jelen degenerált idegrostok, mint az idegzúzás után vivőanyag „kezelést” kapott állatokban (p < 0,001; Dunnett-teszt). A (100 pg/kg) D-oszteopontinnal kezelt csoportban az oszteopontin-kezelésben részesült csoportokhoz képest nagyobb számban fordultak elő degenerált idegrostok (p < 0,001; Dunnett-teszt).

-85Összes idegrost mennyiség (22. ábra)

A metszeteket fénymikroszkóppal vizsgáltuk, a morfometriai vizsgálatot Visiolab 2000 szoftver (Biocom, Párizs, Franciaország) segítségével végeztük. Állatonként két metszetet és metszetenként két látóteret vizsgáltunk. A számítógépben kizárólag a működőképes mielinizált rostokat regisztráltuk, a (mielinhüvely degenerációját mutató) degenerált idegrostokat nem számoltuk.

Következtetések

Az idegzúzásos modell a perifériás neuropátia igen kifejezett károsodással járó modellje. Az ideg összezúzását követően a mechanikai sérülés következtében a nagyobb átmérőjű idegrostok túlnyomó többsége elpusztul, ami a CMAP amplitúdójának erőteljes csökkenését idézi elő. A sérülésnek a CMAP látenciájára gyakorolt hatása nem azonnal jelentkezik, hanem az csak 21 nap múlva mutat növekedést a kis átmérőjű rostok másodlagos, (makrofágok, granulociták kiváltotta) immun-közvetített degenerációjának köszönhetően. A CMAP időtartama a 7. napra meghosszabbodik, a 14. napon éri el a csúcsát, majd a 21. napra visszatér a 7. napon mért értékek közelébe. Mindez annak köszönhető, hogy a 21 napos zúzódásos sérülések esetében megindul a regeneráció, ami a neuropátiás állapotok esetében szintén érdeklődésre számot tartó folyamat. Az említett axonsaijadzás és -regeneráció a három hetes időpontban a kontroll csoportokban is jelen volt.

Az oszteopontin az egér idegzúzódás modelljében védő hatást fejtett ki. Az érző-mozgató funkciók a sérülést követő 7., 14. és 21. napokon dózisfüggő módon lényeges mértékben helyreálltak, a sérülést követő 21. napon elvégzett morfológiai vizsgálatokkal pedig a degenerálódó idegrostok százalékos arányának lényeges mértékű csökkenése, valamint az összes idegrost számának emelkedése volt megfigyelhető. Az oszteopontin a kísérletben alkalmazott kontroll molekulával, a 4-metilkatekollal egyenértékű hatást fejtett ki, a hővel inaktivált, degenerált ONP protein pedig nem fejtett ki lényeges mértékű hatást sem a funkcionális, sem a kórszövettani paraméterekre. Az OPN-nek a funkcionális és a kórszövettanilag megállapított gyógyulásra kifejtett hatása a következők eredménye lehet:

• az idegrostok közvetlen védelme a másodlagos, immun-közvetített degenerációval szemben, • az axonok fokozott remielinizációja és axonvédelem, • a sérült axonok fokozott remielinizációja és saijadzása, • a mielintörmelék makrofágok általi eltakarításának fokozása.

Claims (20)

1. -86SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Oszteopontin vagy oszteopontinaktivitás-agonista alkalmazása neurológiai megbetegedés gyógykezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló gyógyszer előállítására.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, traumás idegsérülés, stroke, központi- vagy körzeti idegrendszeri demielinizációs megbetegedés, neuropátia vagy neurodegeneratív megbetegedés gyógykezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló gyógyszer előállítására.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti alkalmazás, veleszületett metabolikus zavar gyógykezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló gyógyszer előállítására.
4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, perifériás neuropátia gyógykezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló gyógyszer előállítására.
5. 5. A 4. igénypont szerinti alkalmazás, diabetikus neuropátia gyógykezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló gyógyszer előállítására.
6. 6. A 2. igénypont szerinti alkalmazás, demielinizációs megbetegedésként szklerózis multiplex (MS) gyógykezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló gyógyszer előállítására.
7. 7. A 2. igénypont szerinti alkalmazás, neurodegeneratív megbetegedésként Alzheimerkór, Parkinson-kór, Huntington-kór vagy miatrófíás laterális szklerózis (ALS) gyógykezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló gyógyszer előállítására.
8. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amely alkalmazás szerint oszteopontinként a következők bármelyikét alkalmazzuk:

   (a) az 1. azonosítószámú szekvenciát tartalmazó polipeptid;

   (b) az 1. azonosítószámú szekvencia 1-168. vagy 1-170. aminosavait tartalmazó polipeptid;

   (c) az 1. azonosítószámú szekvencia 1-16. és 170-314. aminosavait tartalmazó polipeptid;

   (d) az 1. azonosítószámú szekvencia 170-314. aminosavait tartalmazó polipeptid;

   (e) a 2. azonosító számú szekvenciát tartalmazó polipeptid;

   (I) a 3. azonosítószámú szekvenciát tartalmazó polipeptid;

   (g) az (a) - (f) pontokban felsorolt polipeptidek bármelyikének muteinje, amelynek aminosav-szekvenciája az (a) - (f) pontbeli szekvenciák legalább egyikével legalább 40%-os, vagy 50%-os, vagy 60%-os, vagy 70%-os, vagy 80%-os, vagy 90%-os azonosságot mutat;

   (h) az (a) - (f) pontokban felsorolt polipeptidek bármelyikének muteinje, amelyet az (a) - (!) pontokban felsorolt polipeptidek bármelyikét kódoló natív DNS-szekvencia

   - 87komplementerével mérsékelten sztringens vagy nagymértékben sztringens körülmények között hibridizálni képes DNS-szekvencia kódol;

   (i) az (a) - (f) pontokban felsorolt polipeptidek bármelyikének muteinje, amelynek aminosav-szekvenciájában az (a) - (f) pontbeli szekvenciákhoz képest bekövetkezett változások konzervatív aminosav szubsztitúciók; vagy (j) az (a) - (f) pontbeli polipeptidek bármelyikének sója, izoalakja, fúziós proteinje, funkcionális származéka, aktív frakciója vagy cirkulárisán permutált származéka.
9. 9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amely szerint az oszteopontint hordozómolekulához, a vér-agy gát átlépését elősegítő pepiidhez vagy proteinhez füzionáltan alkalmazzuk.
10. 10. A 8. vagy 9. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint az oszteopontint PEGizáltan alkalmazzuk.
11. 11. A 8-10. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amely szerint az oszteopontint immunglobulin (lg) fúziót tartalmazó fúziós proteinhez füzionáltan alkalmazzuk.
12. 12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, egyidejű, egymás utáni vagy elkülönült beadásra alkalmasan kiszerelt interferont is tartalmazó gyógyszer előállítására.
13. 13. A 12. igénypont szerinti alkalmazás, interferonként interferon-fi-t tartalmazó gyógyszer előállítására.
14. 14. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, amely szerint az oszteopontint mintegy 0,001-100 mg/testtömeg kg, vagy mintegy 1-10 mg/testtömeg kg, vagy mintegy 5 mg/testtömeg kg mennyiségben alkalmazzuk.
15. 15. Nukleinsav-molekula alkalmazása neurológiai megbetegedés gyógykezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló gyógyszer előállítására, amely alkalmazás szerint a nukleinsav-molekula a következők bármelyikének megfelelő aminosav-szekvenciát tartalmazó polipeptidet kódoló nukleinsav-szekvenciát foglal magában:

    (k) az 1. azonosítószámú szekvenciát tartalmazó polipeptid;

    (1) az 1. azonosítószámú szekvencia 1-168. vagy 1-170. aminosavait tartalmazó polipeptid;

    (m) az 1. azonosítószámú szekvencia 1-16. és 170-314. aminosavait tartalmazó polipeptid;

    (n) az 1. azonosítószámú szekvencia 170-314. aminosavait tartalmazó polipeptid;

    (o) a 2. azonosítószámú szekvenciát tartalmazó polipeptid;

    (p) a 3. azonosítószámú szekvenciát tartalmazó polipeptid;

    :.:

    (q) a (k) - (p) pontokban felsorolt polipeptidek bármelyikének muteinje, amelynek aminosav-szekvenciája a (k) - (p) pontbeli szekvenciák legalább egyikével legalább 40%-os, vagy 50%-os, vagy 60%-os, vagy 70%-os, vagy 80%-os, vagy 90%-os azonosságot mutat;

    (r) a (k) - (p) pontokban felsorolt polipeptidek bármelyikének muteinje, amelyet a (k) - (p) pontokban felsorolt polipeptidek bármelyikét kódoló natív DNS-szekvencia komplementerével mérsékelten sztringens vagy nagymértékben sztringens körülmények között hibridizálni képes DNS-szekvencia kódol;

    (s) a (k) - (p) pontokban felsorolt polipeptidek bármelyikének muteinje, amelynek aminosav-szekvenciájában az (k) - (p) pontbeli szekvenciákhoz képest bekövetkezett változások konzervatív aminosav szubsztitúciók; vagy (t) a (k) - (p) pontbeli polipeptidek bármelyikének sója, izoalakja, fúziós proteinje, funkcionális származéka, aktív frakciója vagy cirkulárisán permutált származéka.
16. 16. A 15. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint nukleinsav-molekulaként expressziós vektor szekvenciát is tartalmazó nukleinsav-molekulát alkalmazunk.
17. 17. Oszteopontin endogén termelését, vagy oszteopontin aktivitás agonista vegyületét sejten belül indukáló és/vagy fokozó vektor alkalmazása neurológiai megbetegedés gyógykezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló gyógyszer előállítására.
18. 18. A 15-17. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás génterápiásán alkalmazható gyógyszer előállítására.
19. 19. Oszteopontin vagy oszteopontinaktivitás-agonista termelésére genetikailag módosított sejt alkalmazása neurológiai rendellenességek gyógykezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló gyógyszer előállítására.
20. 20. Neurológiai megbetegedés megelőzésére és/vagy gyógykezelésére szolgáló gyógyászati készítmény, amely oszteopontint vagy oszteopontinaktivitás-agonistát és egy interferont, valamint adott esetben egy vagy több gyógyászati szempontból elfogadható kötőanyagot tartalmaz.

    A meghatalmazott:

    DANUBIA

    Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft.

    Dr.lPemo Árpád szabadalmi ügyvivő