HUP0400697A2

HUP0400697A2 - Elcsendesített anti-CD28 ellenanyagok és használatuk

Info

Publication number: HUP0400697A2
Application number: HU0400697A
Authority: HU
Inventors: Yasuyuki Higashi; Paul Hinton; Nobuo Seki; Kouichi Tamura; J. Yun Tso; Hirotsugu Ueda; Maximiliano Vasquez
Original assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2000-12-14
Filing date: 2001-12-14
Publication date: 2004-06-28
Also published as: MXPA03005327A; JP2004515243A; AR031924A1; RU2261723C2; NZ526569A; CA2432736A1; RU2003121231A; NO20032542D0; CN1489473A; HUP0400697A3; WO2002047721A1; NO20032542L; EP1341553A1; KR20040020866A; BR0116686A; AU2002226086B2; EP1341553A4; IL156262A0; CN1272345C; AU2608602A

Abstract

A találmány tárgyát a mitogén aktivitásukban defektív antiCD-28ellenanyagok (elcsendesített anti-CD28 ellenanyagok) képezik, valamintezek előállítási módszerei, az ellenanyagot tartalmazó készítmények ésaz immunszuppresszió módszerei, Tsejt tolerancia indukálása és szerv-és/vagy szöveti transzplantáció kilökődések kezelése képezik. Ó

Description

PO 4 0 0 6 9 7 . 76.906/SZE

PEI ; - ’ % Y s \.

SziteWnn ; Iroda H-1062 Iwdap^L Aadoosv út Π3 Telelőn: 4614000, fax: 46’4099

Elcsendesített anti-CD28 ellenanyagok és használatuk

A jelen találmány tárgyát a mitogén aktivitásukban detektív anti-CD-28 ellenanyagok és azok használata képezi.

A immunreakciókat, különösen a szervátültetések kilökődéseit a T-limfociták aktiválásának tulajdonítják. A T-sejteknek ezt az aktiválását az antigént prezentáló sejtekből (APC) származó szignál indukálja. Az APC-ből származó szignál magában foglal egy első szignált a T-sejt receptorokon (TCR) keresztül, és egy második szignált (ko-stimuláló szignál) a ko-stimuláló molekulákon keresztül. Az első szignál a peptid antigén fő hisztokompatibilitási antigén komplexéből (MHC) származik, aholis az APC prezentálja az APC-t, a TCR-en keresztül.A második szignált számos ko-stimuláló molekula hajtja végre, amik közé tartozik például a B7 (B-7-1 (CD80) és B7-2 (CD86)), amik az APC és CD28, CTLA-4, stb. oldalon ligandumokként ismertek, mint receptorok a T-sejt oldalon. A B7 ligandum egy glikoprotein, ami az immunglobulin szupercsaládhoz tartozik, és a B-sejtekben, stb. expresszálódik, ami az antigént prezentáló sejtcsoportbá tartozik. Mind a CD28, mind a CTLA-4, amik a B7-et közös ligandumukként ismerik fel, az immunglobulin szupercsaládba tartozó transzmembrán glikoproteinek. Tehát a T-sejtek aktiválását az első és a második szignál együttműködő transzdukciója szabályozza, az első a TCR-en keresztül, a második szignál például a B7-ből és a CD28/CTLA-4-ből. A B7-ből a CD28-ba való irányuló szignálról ismert, hogy elősegíti, míg a B7-ből a CTLA-4-be irányuló szignál gátolja a T-sejtek aktiválását [Waterhouse és mtsai: Science 270 985-988 (1995)].

Eddig, az immunszuppresszió vagy tolerancia indukálására kísérleteket tettek a B7-CD28 szignál blokkolására, CTLA-4Ig, anti-B7-l ellenanyag/anti-B7-2 ellenanyag, anti-CD28 ellenanyag vagy hasonlók beadásával. A CTLA-4Ig például a B7-hez kötődik, ezzel zavarva a B7 és a CD28 közötti reakciót, és ennek következtében blokkolja a CD28-ból származó szignált, hogy immunszuppresszív aktivitást fejtsen ki. Azonban, mivel a B7 és a CTLA-4 közötti is gátlódik ezzel egyidőben, a CTLA-4-nek a Tsejtek aktiválására negatívan ható szignálja is el van nyomva, ezért a kívánt tolerancia nem indukálódik [Kirk és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 94, 87898794 (1997)]. Egy anti-B7 ellenanyagot is előállítottak, és leírták róla, hogy elnyomta a T-sejtek aktiválását, de ugyanúgy, mint a CTLA-4Ig esetében, a CTLA4 szignált is elnyomta. Egy anti-CD28 ellenanyagról, egy in vitro kísérletben, kiderült, hogy mitogén hatása van a T-sejtekre, és ha a stimulálást ezzel az ellenanyaggal és egy anti-CD3 ellenanyaggal kombinálták, akkor ez elősegítette a T-sejtek növekedését és aktiválódását, valamint fokozta a citokinek termelődését [WO 90/05541; Eur. J. Immunoi. 16, 1289-1296 (1986); stb.]. Emellett a CD28 receptor mitogénnek a T-sejten egy anti-CD28 ellenanyaggal való stimulálása in vivo egy T-sejt aktiválási szignál generálását eredményezte, ami hasonló volt a B7-ből a CD28-ba irányuló második szignálhoz [Yin és mtsai: J. of Immunoi. 163, 4328-4334 (1999)]. Ezek a T-sejt aktiváló funkciók azt sugallták, hogy egy anti-CD28 ellenanyag használható immunpotenciátorként a rák és az AIDS terápiájában (WO 90/05541).

A hagyományos módszerekkel készített anti-CD28 ellenanyagok mitogén hatást fejt ki a T-sejtekre. Bár ennek a mitogén aktivitásnak az okai nem teljesen ismertek, az anti-CD28 Fc régiónak antigént bemutató sejt Fc receptorához való kötődéséről azt gondolják, hogy valószínűleg ez az ok [Cole és mtsai: J. of Immunoi. 36, 159 (1997)). Ennek következtében génsebészeti technikák alkalmazásával az anti-CD28 ellenanyagnak az Fc receptorhoz kötódő részébe mutációkat vittünk be, hogy ügy módosítsuk az ellenanyagot, hogy többé ne legyen mitogén aktivitása. A jelen találmány szerzői által generált egyik ilyen ellenanyag a TN228 IgG2M3, amiben az IgG2M3 két aminosav helyettesítéssel rendelkezik az IgG génben. Továbbá, azt is demonstráltuk, hogy a kapott, elcsendesített anti-CD-28 ellenanyagnak nincs mitogén aktivitása, ami nagyon jól használható a T-sejt tolerancia indukádasában.

Tehát a jelen találmány tárgyát olyan anti-CD28 ellenanyagok kepezik, amiknek nincs mitogén aktivitásuk (a továbbiakban ezeket elcsendesített anti-CD28 ellenanyagoknak nevezzük) és az immunreakciókat, főleg a transzplantátum kilökődéseket elnyomó módszerek, valamint immuntolerancia indukálása az említett ellenanyagok használatával.

A jelen találmány egyik tárgya egy elcsendesített anti-CD28 ellenanyag, amely anti-CD28 ellenanyag lehet kunéra ellenanyag es/vagy egy humanizált ellenanyag. Az anti-CD28 ellenanyagok variábilis régiói tartalmazhatják a 2., 4., 6. és 8. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosav szekvenciákat, valamint az ezeket az aminosavakat kódoló polinukleotidok. Ilyen polinukleotid például az 1„ 3., 5. és 7. számú szekvenciavázlaton bemutatott szekvencia.

A jelen találmány tárgyát képezik továbbá a vektorok, és a gazdasejtek, amik az anti-CD28 ellenanyagokat kódolják.

A jelen találmány tárgyát képezik továbbá azok a módszerek, amikkel az elcsendesitett anti-CD28 ellenanyagokat elő lehet állítani, az anti-CD28 ellenanyagokat kódoló polinukleotidokat tartalmazó sejteket olyan körülmények között tenyésztve, amik lehetővé teszik a polinukleotid expressziőját, majd a keletkezett géntermékeket összegyűjtjük.

A jelen találmány tárgya továbbá egy gyógyászati készítmény, ami az elcsendesített anti-CD28 ellenanyagokból egyet vagy többet tartalmaz, előnyösen egy vagy több gyógyászatilag elfogadható adalékanyaggal összekeverve.

Az elcsendesitett anti-CD28 ellenanyagok jól használhatók T-sejt tolerancia indukálására, immunszuppresszióra, valamint profdaktikus/terápiás gyógyszerként, szerv- és szövet trans.plantátum kilökődés esetében. Ennek megfelelően, a jelen találmány tárgyát T-sejt tolerancia, immunszuppressziő indukálására szolgáló eljárások képezik, valamint profilaktikus vagy kezelési terápia képezi egy szerv- vagy szövet transzplantáció kilökődése eseteben, az elcsendesített anti-CD28 ellenanyagokból egynek vagy többnek egy emlősnek való beadásával. Az ilyen elcsendesített anti-CD28 ellenanyagokat egy gyógyászati készítményben adjuk be, az itt ismertetett módon, és tartalmazhatnak további gyogyszereket/hatóanyagokat, ahol ez szükséges.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékelt ábrák leirását.

1. abra Plazmid konstrukciók a ChTN228 ellenanyag expresszálására. A rágcsáló TN228 V_L-t és V_H-t mini-exonokként alhtjuk elő, amiket Xbal hasítási helyek határolnak. A V_L szék- venciát a pVk expressziós vektorba építjük be, a V_H szekvenciát a pVg2M3 expressziós vektorba építjük be.

2. ábra A ChTN228 könnyű lánca nukleotid szekvenciája és kikövetkeztetett aminosav szekvenciája a mini-exonokban. A szignálpeptideket dőlt betűkkel ábrázoljuk. A CDR-eket aláhúzzuk. Az érett könnyű lánc aszparaginsav csoporttal kezdődik (vastagított betűk). A nem-transzlálódó és intron szekvenciákat kisbetűkkel írtuk (1. és 2. számú szekvencia).

3. ábra A ChTN228 nehéz lánca variábilis régióinak nukleotid szekvenciája és kikövetkeztetett aminosav szekvenciája a mmi-exonokban. A szignálpeptideket dőlt betűkkel ábrázoljuk. A CDR-eket aláhúzzuk. Az érett könnyű lánc glutamin csoporttal kezdődik (vastagított betűk). A nem-transzlálódó és intron szekvenciákat kisbetűkkel írtuk (3. és 4. számú szekvencia).

4. ábra Kompetíciós kísérlet. P815/CD28+ sejteket inkubálunk 25 ng MuTN228-FITC-vel és a ChTN228 vagy MuTN228 kétszeres sorozathigításaival, az ismertetett módon. A P18/CD28+ sejteket csak MuTN228-FITC-vel is inkubáljuk, kompetítor nélkül. Minden egyes mintánál az átlagos csatorna fluoreszcenciát a kompetítor koncentrációjával szemben ábrázoljuk.

5. ábra A TN228-IgG2m3 gátlási hatása a humán primer MLR(l)-re. A négy egyedből származó primer MLR százalékos gátlását külön mutatjuk be.

6. ábra A TN228-IgG2m3 gátlási hatása a humán primer MLR(2)-re. A négy egyedből származó primer MLR százalékos gátlását külön mutatjuk be.

7. ábra A TN228-IgG2m3 hatása a szekunder MLR-re.

Ά két önkéntesből származó adatokat külön-külön mutatjuk.

8. abra Plazmid konstrukciók a HuTN228 ellenanyag expressziójához.

9. abra A HuTN228 nehéz lánc variábilis régiók nukleotid szekvenciái és kikövetkeztetett aminosav szekvenciái a mini exonokban. A szignálpeptideket dőlt betűkkel ábrázoljuk. A CDReket aláhúzzuk. Az érett könnyű lánc glutamin csoporttal kezdődik (vastagított betűk). (5. és 6. számú szekvencia).

10. ábra A HuTN228 könnyű lánc variábilis régiók nukleotid szekvenciái és kikövetkeztetett aminosav szekvenciái a mim exonokban. A szignálpeptideket dőlt betűkkel ábrázoljuk. A CDR-eket aláhúzzuk. Az érett könnyű lánc glutamin csoporttal kezdődik (vastagított betűk). (7. és 8. számú szekvencia).

11. abra FACS kompetíciós esszé. Az FITC-vel jelzett MUTN228 kötődését vizsgáljuk P815/CD28* sejtekhez különböző mennyiségű kompetítor MuTN228 vagy HuTN228 ellenanyag jelenlétében áramlási citometriás kompetíciós kísérletekben, a példákban ismertetett módon.

12. ábra ELISA kompetíciós esszé. A biotinilezett MuTN228-nak az sCD28-Fc-hez való kötődését vizsgáljuk különböző mennyiségű kompetítor MuTN228 vagy HuTN228 ellenaⁿyag jelenlétében, a példákban ismertetett módon.

13. ábra 1-125 kompetíciós esszé. A i2si__vei jelzett MuTN228-nak a P815/CD28· sejtekhez való kötődését vizsgáljuk különböző mennyiségű kompetítor MuTN228 vagy HÚTN228 el lenanyag jelenlétében, .«I-vel jelzett ellenanyag kompetíciós kisérletben, a példákban ismertetett módon.

14. abra Plazmid konstrukciók a PVl-IgG3 ellenanyag expresszálására. A PV1 Vet és V_H-t mini-exonok formájában álhtjuk elő, amiket Xbal restrikciós hasítási helyek határolnak. A

Vl szekvenciát a pMVk.rg.dE expressziós vektorba építjük be, a V_H szekvenciát pedig a pMVg3.D.Tt expressziós vektorba. A két plazmidot azután rekombináljuk, egyetlen plazmid előállítására, hogy ko-expresszáljuk a PVl-IgG3 nehéz- és könnyű láncát.

15A . ábra A könnyű lánc és nehéz lánc cDNS és kikövetkeztetett aminosav szekvenciái a mini-exonokban. A CDR-eket aláhúztuk. Az érett könnyű lánc aszparaginsavval kezdődik (kétszeresen aláhúzva) a 20-as pozícióban (9. és 10. számú szekvencia).

15B. ábra A PV1 variábilis régió cDNS és kikövetkeztetett aminosav szekvenciái a mini-exonokban. A CDR-eket aláhúztuk. Az érett könnyű lánc glutaminnal kezdődik (kétszeresen aláhúzva) a 20-as pozícióban (11. és 12. számú szekvencia)

16. ábra A PV-l-IgG3 elemzése méretkizárásos kromatográfiával, HPLC-t alkalmazva, a Módszerekben ismertetett módon. A fehérjét a 280 nm-et mért elnyelés alapján követjük.

17. ábra Az egér IgG3 izotípus kontroll (1-es sáv), a PV1 (2-es sáv), és a PVl-IgG3 (3-as sáv) SDS-PAGE elemzése. Az A panelben levő fehérjéket nem-redukáló körülmények között futtatjuk, a B panelben levő fehérjéket redukáló körülmények között. A MW jelentése molekulasúly marker. A számok jelentése molekulasúly kDa-ban.

18. ábra PVl-gyel (A), 37.51-gyel (B) vagy PVl-IgG3-mal (C) festett EL4 sejtek, áramlási citometriával elemezve. A használt szekunder ellenanyagok a következők: FITC-vel konjugált szamár anti-Armenian hörcsög IgG (H+L) a PVl-hez, FITC-vel konjugált szamár anti-szíriai hörcsög IgG a 37.51-hez, és FITCvel konjugált kecske anti-egér kappa a PVl-IgG3-hoz. A folyamatos vonal profilok csak szekunder ellenanyagokkal festett sejteket jelentenek. A szaggatott vonal profilok mind a primer, mind a szekunder ellenanyagokkal festett ellenanyagokat jelentenek, a Módszerek-ben ismertetett módon. Az egér IgG3 kontroll egyáltalán nem festette az EL4 sejteket (nem közölt adatok).

19. ábra (A) A fölöslegben levő PV1, vagy PVl-IgG3 verseng az R-PE-vel konjugált PVl-gyel az EL4 sejtekhez való kötődésért. Az áramlási citometna hisztogrammon a vastag folyamatos (fekete) vonal az egyáltalán nem festődött sejteket reprezentálja, a vastag folyamatos (sötétkék) vonal a csak R-PEPVl-gyel festődő sejteket reprezentálja, a vékony szaggatott (ibolyaszínű) vonal az R-PE-PVl-gyel és fölöslegben levő nemkonjugált PVl-gyel festődött sejteket reprezentálja, és a vékony kettős szaggatott (világoskék) vonal az R-PE-PVl-gyel és fölöslegben levő, nem-konjugált PVl-IgG3-mal festődött sejteket reprezentálja. A fölöslegben levő egér IgG3 izotípus kontrollnak nincs hatása az R-PE-PV1 EL4 sejtekhez való kötődésére (nem közölt adatok).

(B) A fölöslegben levő 145.2C11 vagy 145.2Cll-IgG3 verseng az R-PE-vel konjugált 145.2Cll-gyel az EL4-hez való kötődésért. A vastag folyamatos (fekete) vonal az egyáltalán nem festődött sejteket reprezentálja, a vastag folyamatos (sötétkék) vonal a csak R-PE-145.2Cll-gyel festődő sejteket reprezentálja, a vékony szaggatott (ibolyaszínü) vonal az R-PE-PVl-gyel és fölöslegben levő nem-konjugált 145.2CU-gyel festődött sejteket reprezentálja, és a vékony kettős szaggatott (világoskék) vonal az R-PE-145.2011-gyel és fölöslegben levő, nem-konjugált 145.2Cll-IgG3-mal festődött sejteket reprezentálja.

(0) A fölöslegben levő PV1 verseng a PVl-IgG3-mal az EL4 sejtekhez való kötődésért. Az EL4 sejteket PVl-IgG3-mal festettük, fölöslegben levő PVl-gyel, vagy anélkül. A sejteket mostuk és egér IgG3-specifikus FITC-vel konjugált szamár antiegér IgG-vel (H+L) festettük. A vastag folyamatos (fekete) vonal a csak szekunder ellenanyagokkal festődött sejteket reprezentálja, a vastag folyamatos (sötétkék) vonal a PVl-IgG3-mal és a szekunder ellenanyagokkal festődött sejteket reprezentálja, és a vékony szaggatott (ibolyaszínú) vonal a PVl-IgG3-mal, a fölöslegben levő PVl-gyel, és a szekunder ellenanyagokkal festődött sejteket reprezentálja.

20. ábra PVl-IgG3-mal és 145.2Cll-gyel festődött egér lépsejtek. A sejteket egér IgG3 izotípus kontrollal (A) vagy PV1IgG3-mal (B) festjük, R-PE-vel konjugált kecske anti-egér IgG3malFITC-vel konjugált 145.2Cll-gyel ellenfestjük, majd kétszínű áramlási citometriával elemezzük, az Anyagok és Módszerek részben ismertetett módon. Csak a limfocita kapuban levő sejteket elemeztük. A PVl-IgG3-pozitív sejtek a felső kvadránsokban vannak, a CD3-pozitív sejtek a jobb alsó kvadránsokban vannak. Az egyes kvadránsokban levő számok az adott kvadránsban levő sejtek százalékát reprezentálja.

A jelen találmány szövegösszefüggésében az „elcsendesített anti-CD28 ellenanyag” szakkifejezés jelentése olyan anti-CD28 ellenanyag, aminek nincsen mitogén aktivitása. Pontosabban, ez egy olyan ellenanyag, ami specifikusan kötődik a CD28 receptor antigénhez a T-sejt felszínén, és nem segíti elő a T-sejtek növekedését vagy aktiválását egy anti-CD3 ellenanyaggal végzett kombinált stimulálással.

ΙΟ

Egy elcsendesített anti-CD28 ellenanyagot egy anti-CD28 ellenanyag, vagy egy anti-CD28 ellenanyagot termelő hibridóma alapján lehet előállítani, egy agonista anti-CD28 ellenanyagot génsebészeti technikákkal vagy kémiai módszerekkel mutáltatva vagy módosítva. A génsebészeti technikák használatát példának véve, egy Fc receptor elleni anti-CD28 ellenanyagnak az Fc receptorokhoz való kötési affinitását csökkenteni vagy eliminálni lehet, ha az ellenanyag Fc doménjének aminosav szekvenciájába egy mutációt viszünk be. Például egy elcsendesített anti-CD28 ellenanyagot úgy kaphatunk meg, hogy cDNS-t izolálunk egy olyan hibridóma sejtből, ami képes egy anti-CD28 monoklonális ellenanyag termelésére, és az Fc doménnek megfelelő régió szekvenciájába mutációkat viszünk be, ami fontos szerepet játszik az Fc receptorhoz való kötődésben (WO 88/07089). A mutáció helye nincs különösen korlátozva, mindaddig, amíg az Fc receptor kötődését gátolja. így az IgG ellenanyag-osztály esetében például a H-lánc aminosav csoportokat, azaz a 234, 235, 236,237, 318, 320 és 322-es csoportokat részesítjük előnyben, és egy elcsendesített anti-CD28 ellenanyagot úgy állíthatunk elő, hogy ezeknek az aminosavaknak legalább egy részét egy másik aminosawal helyettesítjük.

Az ilyen elcsendesített anti-CD28 ellenanyag forrását annak a megcélzott állatnak megfelelően lehet kiválasztani, amiben az ellenanyagot használjuk. Például a nem-humán ellenanyagok olyan aminosav szekvenciákat tartalmaznak, amik meglehetősen széles tartományban antigenicitást mutatnak az emberekben. Számos vizsgálat kimutatta, hogy egy betegnek egy ellenanyag injekció után egy idegen ellenanyagra adott immunválasza meglepő módon intenzív, és magának az ellenanyagnak a bea dása súlyos helyzetbe hozhatja a betegeget, vagy eltávolítja a terápiás hasznossága ellenanyagot. Ezért azt javasoljuk, hogy az Fc régiót úgy kell helyettesíteni, hogy az ellenanyag viszonylag homológabb legyen a terápiára kiválasztott állattal, helyettesíteni kell a variábilis régió keretrégióját, vagy az abból a transzgenikus állatból kapott ellenanyagot kell használni, amiben a megcélzott állat ellenanyagát használni akarjuk. Ha az ellenanyagot például egy embernek akarjuk beadni, akkor egy kiméra ellenanyagot (EP125023), ami az Fc régió helyettesítésével kapható meg, egy humanizált ellenanyagot, helyettesített keretrégió résszel (EP0239400, EP045126), vagy egy humán ellenanyagot (EP546073, WO 97/07671), amit olyan transzgenikus állathói kaptunk, amibe bevittük a humán ellenanyag génjét bevittük, használunk. Ha ezekbe az ellenanyagokba génsebészeti módszerekkel, például azokkal, amiket az előzőkben említettünk, vagy kémiai módosítással, mutációkat viszünk be, akkor az ellenanyagok mitogén aktivitás csökkenthető vagy eliminálható.

Egy anti-CD28 ellenanyag, amiben az Fc régió el van csendesítve, specifikus példájaként nem csak az itt, a Példákban ismertetett ellenanyagokat említhetjük, hanem azokat az ellenanyagokat is, amiket szintetikusan állítottunk elő, felhasználva a terápiára kiválasztott állat konstans régió génjét és a variábilis régió polinukleotidokat, a 2. és 4., vagy 6. és 8. számú szekvenciavázlatban bemutatott variábilis régiók aminosav szekvenciája alapján. Az ilyen polinukleotidok példáit az 1., 3., 5. és 7. számú szekvenciavázlaton mutatjuk be.

A jelen találmány specifikusabb példái a HÚTN228 és MÚTN228, valamint ezek fragmensei, F(ab')a fragmensei, ezek származékai, stb.

Amint az a szakterületen jártás szakember számár^ nyilvánvaló, a harmadik bázis degenerációja miatt majdnem mindegyik aminosavat egynél több triplett kodon reprezentál a kódoló nukleotid szekvenciában. Emellett minimális bázispár változások eredményezhetnek változásokat (konzervatív helyettesítés) a kódolt aminosav szekvenciában, ezektől nem várható, hogy megváltoztatják a géntermék biológiai aktivitását. Tehát egy itt ismertetett fehérjét vagy pepiidet kódoló nukleinsav szekvenciája enyhén megváltoztatható (azaz például egy nukleotidnak a triplett kodonba való helyettesítésével), és még így is ugyanazzal az aminosav szekvenciával rendelkező, megfelelő génterméket kódolja.

Az „expressziós vektor” szakkifejezés a további a Irha n olyan polinukleotidra vonatkozik, ami a jelen találmány szerinti pepiidet kódolja, és biztosítja az expresszióhoz szükséges szekvenciákat a kiválasztott gazdasejtben. Az expressziós vektorok általában tartalmaznak egy transzknpciós, transzlációs promotert és terminátort, vagy biztosítják egy endogén promoter mögé való beépülést. Az expressziós vektor általában egy plazmid, ami tartalmaz még egy replikációs origót és egy vagy több szelekciós markért. Azonban az expressziós vektorok lehetnek virális rekombinánsok, amiket a gazdaszervezet megfertőzésére terveztek, vagy integrálódó vektorok, amiket arra terveztek, hogy a gazdaszervezet genomjában egy előnyben részesített helyre integrálódjanak. Az expressziós vektorok példái megtalálhatók a laboratóriumi szakkönyvekben [Sambrook és mtsai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; 2. kiadás, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)].

Az elcsendesített anti-CD28 ellenanyagokat expresszáló megfelelő gazdasejtek közé tartoznak a prokarióták, az élesztő, az archaebaktériumok és más eukarióta sejtek. A bakteriális, gomba, élesztő és emlős celluláris gazdaszervezetekben használható megfelelő klónozó és expressziós vektorok jól ismertek a szakterületen [Pouwels és mtsai: Cloning Vectors: A Laboratory anual, Elsevier, New York (1985)]. A sejtek előnyösen emlős sejtek. A vektor lehet plazmid vektor, egy- vagy kétszálú fágvektor, egy- vagy kétszálú RNS vagy DNS virális vektor. Ezeket a vektorokat a sejtekbe polinukleotidokként, előnyösen DNS formájában juttathatjuk be a sejtekben, a DNS vagy RNS sejtekbe való juttatására jól ismert technikákkal. A vektorok, a fág- és virális vektorok esetében szintén előnyösen bejuttathatok a sejtekbe pakolt vagy kapszulázott vírus formájában a fertőzésre és transzdukcióra jól ismert technikák alkalmazásával a virális vektorok lehetnek replikáció kompetensek vagy replikáció defektívek. Az utóbbi esetben a virális szaporodás csak a komplementáló gazdasejtekben fordul elő. Sejtmentes transzlációs rendszerek is használhatók a fehérjék előállítására, a jelen találmány szerinti DNS konstrukcióból származó RNS-ek felhasználásával.

Az elcsendesített anti-CD28 ellenanyagok/fehérjék a fehérjék olyan izolálási/tisztítási módszereivel tisztíthatok, amik a fehérjekémia területén általánosan ismertek. Pontosabban, megemlíthetjük például az extrakciót, az átkristályosítást, az ammónium-szulfáttal, nátriumszulfáttal, stb. való kisózást, a centrifugálást, dialízist, ultraszúrést, adszorpciós kromatográfiát, ioncserélő kromatográfiát, hidrofób kromatográfiát, normál fázisú kromatográfiát, fordított fázisú kromatográfiát, gélszürési módszert, gélpermeációs kromatográfiai, affinitáskromatográfiát, elektroforézist, ellenáramú megoszlást, stb. és ezek kombinációját.

A jelen találmány szerint a tisztított ellenanyagok előállíthatok az előzőkben ismertetett rekombináns expressziós rendszerekkel. A módszer abból áll, hogy egy gazdasejtet, ami a fehérjét kódoló DNS szekvenciát tartalmazó expressziós vektorral van transzformálva, olyan körülmények között tenyésztjük, ami elég ahhoz, hogy elősegítse a fehérje expresszióját. A fehérjét azután a tenyésztő közegből vagy sejtkivonatból izoláljuk, a használt expressziós rendszertől függően. Amint az a szakterületen jártas szakember számára ismert, a rekombináns fehérjék tisztítási módszerei olyan faktoroktól függően változnak, mint például a használt gazdasejt típusa, és attól, hogy a rekombináns fehérje szekretálódik-e a tenyésztő közegbe.

Az elcsendesített anti-CD28 ellenanyag azután, ha egy gyógyászati készítményben szereljük ki, a következőkben használható: a) transzplantátum kilökődések, szervek vagy szövetek, azaz például szív, vese, máj, csontvelő, bőr, szaruhártya, hasnyálmirigy, vékonybél, izom, ideg, stb. átültetése után; b) graft-versushost reakciókban, csontvelő átültetése esetében; c) autoimmun betegségek, azaz például reumás arthritis, szisztémás lupus erythematosus, szklerózis multiplex, izomgyengeség, I-es típusú diabétesz, stb. esetében; és d) immunbetegségek, azaz például asztma, atopikus dermatítisz, stb. esetében.

Bár az elcsendesített anti-CD28 ellenanyagtól magától is várható, hogy elnyomja az immunreakciókat és transzplantátum kilökődéseket, és immuntoleranciát indukáljon, használható más gyógyszerekkel való kombinációban. Az ilyen, az elcsendesített anti-CD28 ellenanyaggal való kombinációban használható gyógy15 szerek közé tartoznak a különböző immunszuppresszánsok, azaz például a rapamicin, a dezoxispergaulin, az anti-CD40 ellenanyag, az anti-CD40L ellenanyag, a prograf, a ciklosporin A, az anti-mterleukin-2, anti-interleukin-2 receptor ellenanyag, az anti-interleukin-12 ellenanyag, az anti-interleukin-12 receptor ellenanyag és az MMF. A rapamicin különösen gátolja a T-sejtek növekedéséhez kapcsolódó szignál transzdukcióját, az interleukin-2 receptorból jövő szignálok közül, de nem gátolja az apoptózishoz kapcsolódó szignál transzdukcióját, így használata a CD28 szignál egy specifikus inhibitorával várhatóan hasznos.

A jelen találmány szerinti elcsendesített anti-CD28 ellenanyag előállítható oldat formájában, vagy liofilezett por formájában, és, ha szükséges, kiszerelhető különböző gyógyászatilag elfogadható adalékanyagokkal, azaz például egy töltőanyaggal, higítószerrel, stabilizálószerrel, izotonizáló ágenssel és pufferrel. Az előnyben részesített adalékanyagok közé tartoznak a cukrok, azaz például a maltóz, egy felületaktív anyag, azaz például a poliszorbát, egy aminosav, azaz például a glicin, egy fehérje, azaz például humán szérum-albumin, és egy sóoldat, azaz például a nátrium-klorid.

, Emellett az összes dózisforma, azaz például az injekeiózható készítmények (oldatok, szuszpenziők, emulziók, hasznaidkor feloldandó szilárd anyagok, stb.), tabletták, kapszulák, , granulátumok, porok, folyadékok, liposzóma inklúziók, kenőcsök, gelek, külső porok, permetek, inhalációs porok, szemcseppek, szemkenocsök, kúpok, pesszáriumok, és hasonlók szelektálhatok megfelelő módon, a beadás módjától függően, és a jelen találmány szerinti pepiid ennek megfelelően formáulázható. A formulálás általánosságban a Comprehensive Medicinal

Chemistry 5. kötet (szerk.: Hansch és mtsai: Pergamon Press (1990) 25.2-es fejezetében van leírva.

A jelen találmány szerinti gyógyászati készítmény dózisa függ a specifikus készítménytől, a betegség típusától, ami a terápia vagy profilaxis célpontja, a beadás módjától, a beteg korától és állapotától, valamint a kezelés időtartamától, más változók mellett. Azonban az intravénás, intramuszkuláris vagy szubkután beadás esetében 0,01-100 mg/kg, előnyösen 0,1-10 mg/kg per nap per felnőtt adható be.

Ha a jelen találmány szerinti elcsendesített anti-CD28 ellenanyagot használjuk a transzgenikus kilökődés, vagy immuntolerancia indukálását egy szerv vagy szövet átültetése esetében, a készítményt beadhatjuk a transzplantáció előtt, közvetlenül a transzplantáció után, és 3, 7, 12, 18, 25, 35, 45 és 60 nappal a transzplantáció után, körülbelül 1 mg/kg/nap dózisban, intravénás, intramuszkuláris vagy szubkután injekcióban. A beadás gyakorisága és a dózis növelhető vagy csökkenthető, a kilökődés folyamatát követve a transzplantáció után.

Míg a beadás intervalluma függ a beadás módjától és a beteg állapotától, más tényezők mellett, nemcsak a folyamatos beadás, hanem az intermittáló beadás is elfogadható. így, mivel az elcsendesített anti-CD-28 ellenanyag egy ellenanyag, fennmaradó hatást biztosít, ezért az intermittáló beadási mód biztosíthatja a várt hatékonyságot. Ami a kezelés időtartamát illeti, ha egyszer a tolerancia kialakult, akkor ez a tolerancia fenntartható, még akkor is, ha az elcsendesített anti-CD-28 ellenanyag használatát megszakítjuk. Ebből a szempontból ez az elcsendesített anti-CD28 ellenanyag kétség nélkül jobb, mint a többi immunszupp¹⁷ ·· ·· ·· * resszáns, amiknek az immunszuppresszív hatása a megszakítás után lecsökken.

PÉLDÁK

Miután a jelen találmányt általánosan ismertettük, a további érthetőség biztosítható, bizonyos specifikus példákra való hivatkozással, amiket az alábbiakban csak illusztrálás céljából adunk meg, és nem tekinthetők a jelen találmány oltalmi köre korlátozásának, hacsak külön nem jelezzük részletesen.

1. Példa

Az egér anti-humán CD28 ellenanyag aminosav szekvenálása

Az anti-humán CD28 ellenanyagot termelő hibridóma Dr. Yagita (Juntendo University School of Medicine, Japán) nagylelkű ajándéka. Körülbelül 0,2 mg tisztított anti-humán CD28 ellenanyagot (TN228) redukálunk 0,64 mol/1 guanidin-HCl, 0,28 mol/1 TRIS-HC1 pH=8,5, 0,055 mol/1 DT7 összetételű oldatban, 90 percig, 60 °C-on (argon alatt), karboximetilezzük jódecetsav hozzáadásával (0,13 mol/1, 45 perc, szobahőmérséklet, sötétben), majd 0,32 mol/1 DTr-t adunk hozzá (hogy leállítsuk a karboximetilezési reakciót), majd azonnal puffercserét hajtunk végre 0,1 mol/1 nátriumfoszfát, 0,002 mol/1 EDTA pH=8,0 összetételű pufferre, egy PD-10 oszlop segítségével(katalógus-szám: #17-085ΙΟΙ, Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala Svédország). Az eluátumban 0,005 mol/1 ditiotreitol, 0,02% glicerin koncentrációt állítunk be, majd az oldat egyharmadát (körülbelül 0,35 ml) egy külön csőbe visszük át, a nehéz lánc N-terminális deblokkolására. A mintát 24 óra hosszat 45 °C-on emésztjük 1800 μΕ piroglutamát aminopeptidázzal (katalógusszám #7334, Takara

Suzo Co., Ltd., Tokió, Japán). A könnyű lánc és a nehéz lánc Nterminális szekvenciáját a deblokkolt mintából 20 ciklusban határozzuk meg automatizált Edman degradációval és PTH elemzéssel egy Model 241 fehérje-szekvenátorral (Hewlett Packard, Palo Alto, CA). A PTH származékokat Hypersil ODS C18 oszlopon elemezzük. A szekvenálót és a HPLC-t a gyártó utasításai szerint működtetjük, a Hewlett Packard-tól kapott reagenseket, oldószereket és oszlopokat használva.

A piroglutamát aminopeptidázzal deblokkolt TN228 N-terminális szekvenálásának eredményeit az alábbi táblázatban mutatjuk be:

A csoport sorszáma	Aminosav	A csoport sorszáma	Aminosav	A csoport sorszáma	Aminosav	A csoport sorszáma	Amino sav
1	D, Q	6	Q, E	11	L	16	G,Q
2	1, v	7	s	12	A, V	17	Q, S
3	V, Q	8	p, G	13	V, A	18	R, L
4	L	9	A, P	14	S, P	19	A, S
⁵	T, K	10	S, G	15	L, S	20	T, I

2. Példa

A variábilis régió cDNS-ek klónozása

A TN228 nehéz láncai és könnyű láncai cDNS-ének V-régióját a hibridóma sejtekből klónozzuk, rögzített polimeráz láncreakcióval (PCR), Co és munkatársai leírása szerint [Co, M.S.N.M. Avadalovic, P.C. Caron, M.V. Avadalovic, D.A. Scheinberg és C. Queen: Chimeric and humanized antibodies with specificity for the CD33 antigen, J. of Immunol. 148, 114919

1154 (1992)]. Az amplifikálást cDNS-en hajtjuk végre, 3' primereket használva, amik az egér kappa és gamma lánc C-régiójához illeszkednek, valamint egy 5' prímért, ami a cDNS hozzáadott G-farkához illeszkedik. A VL PCR esetében a 3' primer szekvenciája a következő (13. számú szekvencia):

5' TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC 3' a 17-46-os csoportok az egér C_K régiójához hibridizálódnak. A VH polimeráz láncreakció esetében a 3 primerek degenerált szekvenciával rendelkeznek (14., 15. és 16. számú szekvencia):

A G T

5'TATAGAGCTCAAGCTTCCAGTGGATAGACCGATGGGGCTGTCG

T

TTTTGGC 3' a 17-50-es csoportok az egér IgG C_H 1-hez hibridizálódnak. A két primer készletben a nem-hibridizálódó szekvenciák a klónozáshoz használt restrikciós hasítási helyeket tartalmaznak. A VL és VH cDNS-eket egy TOPOII Blunt vektorba szubklónozzuk (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) a szekvenciák meghatározásához.

Számos könnyű és nehéz lánc kiónt szekvenáltunk két független polimeráz láncreakcióból. A könnyű lánc esetében két egyedi, az egér könnyű lánc variábilis régióval homológ szekvenciát azonosítottunk. Az egyik VL szekvencia nem volt működőképes, egy kereteltolási mutáció következtében, és nem-produktív alléiként azonosítottuk. A másik VL szekvencia egy tipikus funkcionális egér kappa lánc variábilis régió volt. A nehéz lánc esetében egy tipikus egér nehéz lánc variábilis régióval homológ egyedi szekvenciát azonosítottunk. A variábilis régiók nukleotid szekvenciáit és kikövetkeztetett aminosav szekvenciáit a 2. és 3. ábrán ismertetjük.

3. Példa

A kiméra TN228-IgG2M3 konstrukciója és expressziója

A TN228 Vl-í és Vh-í He és munkatársai leírása szerint polimeráz láncreakcióval mini-exon szegmensekké konvertáljuk, amiket Xbal hasítási helyek határolnak [He, X. Y., Z. Xu, J. Melrose, A. Mullowney, M. Vasquez, C. Queen, V. Vexler, C. Klingbeil, M.S. Co és E.L. Berg: Humanization and pharmacokinetics of a monoclonal antibody with specificity for both E- and P-selectin, J. of Immunol. 160, 1029-1035 (1998)], majd a könnyű lánc és nehéz lánc expressziós plazmidokba szubklónozzuk (1. ábra). Mindegyik mini-exon tartalmaz egy szignálpeptid szekvenciát, egy érett variábilis régió szekvenciát és egy illesztési donor szekvenciát, ami a leginkább homológ egér J lánc génből származik. Az ilyen illesztési donor szekvenciákat használjuk a V régió exonnak a humán ellenanyag konstans régiójába való illesztésére. Mindegyik mini-exont szekvenáljuk, miután a klónozó vektorba klónoztuk, hogy biztosítsuk, hogy a korrekt szekvenciát kaptuk meg, és nem keletkeztek hibák a polimeráz láncreakcióban. A könnyű lánc és nehéz lánc expressziós plazmidok nehéz lánca és könnyű lánca konstans régiójának exonjait is szekvenálással igazoljuk.

Ebben a specifikációban a ChTN228 jelentése egy kiméra ellenanyag, ami az egér TN228 V_L és V_H variábilis régiókat tartalmazza, valamint egy humán IgG3M3 konstans régiót a nehéz lánchoz, és egy humán kappa konstans régiót a könnyű lánchoz. A nehéz lánc konstans régiót módosították [Cole, M.S., C.

Anasetti és J. Y. Tso: Human IgG2 variants of chimeric anti-CD3 are nonmitogenic to T cells J. of Immunol. 159, 3613-3621 (1997)] a csíravonal humán 2 genomiális fragmensről, és a könnyű lánc a csíravonal humán K genomiális fragmensből származik. Mind a nehéz lánc, mind a könnyű lánc génjét a humán citomegalovírus fő közvetlen korai promoter és fokozó hajtja meg. A nehéz lánc gént a humán komplement C2 génből származó transzkripciós terminator követi [Ashfield, R., P. Enriquez-Harris és N.J. Proudfoot: Transcriptional termination between the closely linked human complement genes C2 and factor B: common termination factor for C2 and c-myc? EMBO Journal 20, 4197-4207 (1991)]. A könnyű lánc szelekciós marker gpt gént [Mulligan, R.C. és P. Berg: Selection for animal cells that express the Escherichia coli gene coding for xanthine-guanine phosphoribosyltransferase Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 78, 2072-2076 (1981)], és a nehéz lánc szelekciós marker dhrf gént [Simonsen, C.C. és A. D. Levinson: Isolation and expression of an altered mouse dihydrofolate reductase eDNS, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 80, 2495-2499 (1983) is az SV40 korai promotere hajtja meg. A kiméra TN228 expressziójához COS-7 sejtek (majom vesesejt vonal) lipofektaminnal végzett tranziens expresszióját használjuk (katalógusszám #10964-013, Gibco BRL). A tranziens transzfektánsokból származó használt közeget ELISAval elemezzük, hogy van-e benne humán IgG2M3 ellenanyag, kecske anti-humán gamma könnyű láncra specifikus ellenanyagot használva befogó reagensként, és HRP-vel konjugált kecske anti-humán kappa lánc ellenanyagot használva előhívó reagensként. A használt közeget arra is használjuk, hogy képes-e a ChTN228 kötődni a P815/CD28+ sejtekhez (CD28-cal P814-be (egér masztcitóma) stabilan transzfektált sejt), indirekt immunfluoreszcencia festéssel, majd áramlási citometriával elemezzük. A stabil sejtvonal előállításához a kiméra expressziós plazmidokat elektroporációval Sp2/0 rágcsáló mielóma sejtvonalba transzfektáljuk, majd a transzfektánsokat a gpt expresszió alapján szelektáljuk. A stabil transzfektánsokból származó kiürült táptalajt ELISA-val elemezzük, a tranziens expressziót keresve.

Eredmények

A klónozott Vl és Vh géneket polimeráz láncreakcióval miniexonokká konvertáljuk (2. és 3. ábra), majd az előzőkben ismertetett módon, és az 1. ábrán bemutatott módon a könnyű lánc és nehéz lánc expressziós vektorokba szubklónozzuk.

A COS-7 sejtek tranziens expressziója: a kiméra expressziós vektorokat tranziensen transzfektáljuk majom COS-7 vesesejt vonalba, a kiméra TN228+ ellenanyag előállítása céljából. A transzfektált sejtek használt közegét ELISA-val vizsgáljuk, hogy vannak-e bennük kiméra IgG2M3 ellenanyagok, valamint áramlási citometriával is vizsgáljuk, hogy kötődik-e a P815/CD28+ sejtekhez. A használt közeg mindkét esszében pozitívnak bizonyult. A tranziens expresszióból származó kiméra ellenanyag hozama körülbelül 0,9 pg/ml volt. A tranziens felülúszóból származó ChTN228 koncentráció-függő módon kötődik a P815/CD28+ sejtekhez (nem közölt adatok).

Az Sp2/0 sejtek stabil transzfekciója: a kiméra expressziós vektorokat Sp2/O sejtekbe transzfektáljuk stabil sejtvonal előállítása céljából. A különböző transzfektánsokból származó használt közegekben vizsgáljuk, hogy keletkezett-e TN228 ellenanyag, és kötődik-e a P815/CD28+ sejtekhez, mint ahogy a tranziens transzfektánsokat vizsgáltuk. A legtöbb transzfektáns pozitívnak bizonyult mindkét esszében. Az egyik transzfektánst a magasabb ellenanyag termelőképesség alapján választjuk ki, majd 5 liter térfogatban, szérummentes közegben szaporítjuk. A ChTN228-at 5 liter használt közegből tisztítjuk, affinitáskromatográfiával. A tisztított ellenanyag hozama körülbelül 25 mg.

4. Példa

A ChTN228 kiméra ellenanyag fehérjetisztítása

A stabil transzfekcióból származó, a ChTN228-at magas szinten expresszáló transzfektánsok közül az egyiket (7H klón) 5 liter GIBCO hibridóma szérummentes közegben (katalógusszám #12045-076) szaporítjuk. A használt tenyészet felülúszót akkor nyerjük ki, amikor a sejtek életképessége 10%, vagy az alatt van, 500 ml-re töményítjük, majd egy 5 ml-es protein-A Sepharose oszlopra töltjük, Pharmacia Pl szivattyú használatával (2-3 ml/perc). Az oszlopot foszfáttal puffereit sóoldattal mossuk, mielőtt az ellenanyagot 0,1 mol/1 glicin, 0,1 mol/1 nátrium-klorid pH—2,7 összetételű oldattal eluáljuk. Az eluált fehérjét háromszor két liter foszfáttal puffereit sóoldattal szemben dializáljuk, majd egy további 0,1 mol/1 nátrium-kloridot tartalmazó foszfáttal puffereit sóoldattal egy PD-10 oszlopra sómentesítjük. A sómentesített fehérje-oldatot egy 0,2 pm-es szűrőn bocsátjuk át, mielőtt 4 °C-re tesszük tárolni.

5. Példa

A tisztaság meghatározása méretkizárásos HPLC-vel és SDSPAGE-val

A méretkizárásos HPLC-t egy Perkin Elmer HPLC rendszerrel hajtjuk végre, ami egy PE ISS 200 Advanced LC Sample Processor, egy PE Series 410 Bio LC Pump, egy PE 235C Diode Array Detector és egy Nelson 600 Series LINK. A Perkin Elmer Turbochrom Navigator Version 4.1 szoftvert használjuk az automata mintavevő, a szivattyú és a detektor vezérléséhez, valamint az adatok begyűjtésére, tárolására és processzálására. Az elválasztást két TosoHaas TSK-GEL G3000SWXL méretkizárásos HPLC oszlopon hajtjuk végre, méretük 7,8 mm χ 300 mm, 5 pm részecskeméret, 250 Angstrom pórusméret (katalógusszám #08541, TosoHaas, Montgomeryville), sorbakötve. A mobil fázis 200 mmol/1 kálium-foszfát/150 mmol/1 nátrium-klorid, pH=6,9, áramlási sebesség 1,00 ml/perc. Az oszlop eluátumot spektrofotometriásán követjük, 220 és 280 nm-en. Az injekciózot térfogat 50 μΐ (50 pg) ChTN228 minta.

SDS-PAGE-t hajtunk végre standard eljárásoknak megfelelően, 4-20%-os gradiens gélen (katalógusszám: #EC6025, Novex, San Diego, CA).

Az izolált ChTN228 tisztaságát méretkizárásos HPLC-vel és SDS-PAGE-val elemezzük. Az elemzés alapján a fehérje 96,5%ban monomer, aminek a mobilitása megfelel a körülbelül 160 kDa molekulasúlyú fehérje mobilitásának. A MuTN228, a MuFd79 (egér IgGl) izotipus kontroll, a ChTN228 és a HuEP5C7 izotípus kontroll (humán IgG2M3) SDS-PAGE elemzése nemredukáló körülmények között szintén azt mutatta, hogy mind a négy ellenanyag molekulasúlya körülbelül 150-160 kDa. Ugyanennek a négy fehérjének redukáló körülmények között végzett elemzése azt mutatja, hogy mind a négy ellenanyag tartalmaz egy nehéz láncot, aminek a molekulasúlya körülbelül 50 kDa, és egy könnyű láncot, aminek a molekulasúlya körülbelül 25 kDa.

6. Példa

Kompetíciós kísérlet

Módszerek

Titrálásos kísérletet hajtunk végre a MuTN228-FITC ellenanyaggal, kétszeres sorozathigítást alkalmazva, 250 ng/teszt-nél kezdve. P815/CD28+ sejteket (5x105 sejt/teszt) inkubálunk FITC-vel jelzett ellenanyaggal, 1 óra hosszat, jégen, foszfáttal puffereit sóoldattal mossuk, majd áramlási citometriával elemezzük. A kompetíciós kísérletekhez 25 ng MuTN228-FITC-t használunk, valamint a versengő ChTN228 vagy MuTN228 ellenanyagokból kétszeres sorozathigítást alkalmazunk, 800 ng/teszt-nél kezdve, ezeket adjuk a P815/CD28+ sejtekhez (5x105 sejt/teszt. Kontrollként P815/CD28+ sejteket (5x105 sejt/teszt) inkubálunk csak 25 ng MuTN228-FITC-vel (azaz kompetítor nélkül). A HuEPC57 és MuFc79 izotípus kontroll ellenanyagokat (800 ng/teszt) is vizsgáljuk, mint kompetitorokat. A sejteket az ellenanyag eleggyel inkubáljuk 150 μΐ végtérfogatban, 1 óra hosszat, jégen, sötétben, majd mossuk és áramlási citometriával elemezzük.

Eredmények

A MuTN228 és ChTN228 ellenanyagok kötési specifitását hasonlítjuk össze áramlási citometriás kompetíciós kísérletben, a Módszer-ekben ismertetett módon. Különböző mennyiségű jelöletlen MuTN228-at vagy ChTN228-at keverünk össze 25 ng FITC-jelzett MÚTN228 ellenanyaggal, majd P815/CD28+ sejtekkel ²⁶ :. ·**·-'⁹*t· ‘4· .ί·' inkubáljuk. Mind az MuTN228, mind a ChTN228 koncentrációfüggő módon verseng az MuTN228-FITC-vel, jelezve, hogy mindkét ellenanyag kötődése a CD 28 antigénre specifikus (4. ábra). Az MuFc79 és HuEP5C7 izotípus kontroll ellenanyagok nem versengenek az MuTN228-FITC-vel, jelezve, hogy az MuTN228 és a ChTN228 ellenanyagok a CD28 antigént V-régióra specifikus kölcsönhatások révén ismerik fel.

7. Példa

Kiméra anti-humán CD28 ellenanyag, aminek csökkent affinitása van a humán F-hez R gátolja a primer kevert limfocita reakciót

A sejtek előállítása

Human perifériális vér mononukleáris sejteket készítünk normális egészséges önkéntesekből, sűrűség-gradiens centrifugálással, Ficoll-Plaque pluszt használva (Amersham Pharmacia Biotech, Tokió, Japán). Humán vért azonos térfogatú RPMI164nel hígítunk, majd Ficoll-Plaque pluszra rétegezzűk. 30 percig szobahőmérsékleten centrifugáljuk, majd a perifériális vér mononukleáris sejteket összegyűjtjük, és RPMI 1160-nal mossuk. Ezután a perifériális vér mononukleáris sejteket a közegben szuszpendáljuk (RPMI1160, ami 2,5% humán AB típusú szérumot, β-merkaptoetanolt és antibiotikumokat tartalmaz), majd nylonszál oszlopra visszük (Wako junyaku, Osaka, Japán). 1 óra hosszat 37 °C-on inkubáljuk, 5% COa-t tartalmazó atmoszférában, majd a T-sejteket meleg közeggel eluáljuk.

Humán B-sejt vonalakat (Raji és JY) használunk stimulátor sejtekként a kevert limfocita reakcióban. Ezeket a sejteket röntgen sugárral kezeljük (2000R) felhasználás előtt.

Primer kevert limfocita reakció (1. MLR)

Tisztított humán T-sejteket (IxlO⁵ sejt/luk) és besugárzott Raji sejteket (1x105 sejt/luk) szélesztünk 96-lukas laposfenekű mikrotiter lemezre. Az antibiotikumokat hozzáadjuk a közeghez, és a sejteket 7 napig inkubáljuk. Minden tenyészetet az utolsó hat órában 10 kBq/luk [³H]timidinnel jelölünk (Amersham Pharmacia Biotech). A sejteket összegyűjtjük, és a beépült radioaktivitást folyadék-szcintillációs számlálóval megmérjük.

A TN228-IgG2m3 (ChTN228) primer MLR-re gyakorolt hatását az 5. és 6. ábrán mutatjuk be. Az eredeti anti-humán CD28 ellenanyag, a TN228 (MuTN228) nem gátolta a primer MLR-t, azonban a TN228-IgG2m3 kiméra ellenanyag dózisfúggő módon gátolt. Ennek következtében, az anti-humán CD28 ellenanyag Fc régiójának a konverziója a humán Fc R-rel szemben csökkent affinitást mutató régióvá az ellenanyagot a T-sejt szaporodásra antagonisztikussá teszi.

A kiméra anti-humán CD28 ellenanyag, aminek csökkent az affinitása a humán Fc R iránt, csökkenti a T-sejt lassú válaszoló-képességét a szekunder kevert limfocita reakcióban.

Szekunder kevert limfocita reakció Í2. MLR)

Tisztított humán T-sejteket (1x105 sejt/luk) és besugárzott Raji sejteket (1x105 sejt/luk) szélesztünk 96-lukas laposfenekű mikrotiter lemezre. Az antibiotikumokat hozzáadjuk a közeghez, és a sejteket inkubáljuk. 5 nap elteltével a sejteket összegyűjtjük, majd friss táptalajjal mossuk. A sejteket friss táptalajban szuszpendáljuk, majd 8 napig szaporítjuk. A sejteket újra stimuláljuk besugárzott Raji vagy JY sejtekkel. További 7 nap te28 nyésztés után a sejteket 10 kBq/luk pH]timidinnel inkubáljuk 6 óra hosszat. A sejteket összegyűjtjük, majd a radioaktivitást folyadék-szcintillációs számlálóval meghatározzuk.

A TN228-IgG2m3 gátolta a primer MLR-t (5. és 6. ábra). Ezután vizsgáltuk ennek az ellenanyagnak a szekunder MLR-re gyakorolt hatását. Az ellenanyagot a primer MLR tenyészetre alkalmazzuk, majd az ellenanyagot eltávolítjuk a tenyészet felülúszóból. A közegben ellenanyagok nélkül való tenyésztés után a sejteket újra stimuláljuk ugyanazzal a stimulátor sejttel (Raji) vagy egy harmadik stimulátorral (JY). A primer MLR-en keresztül TN228-IgG2m3-mal kezelt sejtek szaporodását hasonlítjuk össze a kezeletlen sejtekével. Azonban mindkét sejt közel azonos mértékben szaporodott a harmadik stimulátorral (JY) (7. ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a humán Fc R-hez csökkent affinitást mutató anti-humán CD28 ellenanyag T-sejt energiát indukálhat, allo-antigén stimuláláson keresztül.

8. Példa

A humanizált TN228 variábilis régiók tervezése

Az MuTN228 V-régió szekvenciáit számítógépes modellezéssel elemezzük. A Kábát ellenanyag-szekvencia adatbázisban végzett homológja keresés alapján [8. Johnson, G. és T.T. Wu. Kábát database and its applications: 30 years after the first variability plot, Nucleic Acids Research 28, 214-218 (2000)] az IC4-et [Manheimmer-Loiy, A., J.B. Katz, M. Pillinger, C. Ghossein, A. Smith, B. Diamond: Molecular characteristics of antibodies bearing an anti-DNA-associated idiotype: J. Exp. Med. 174, 1639-1652 (1991)] választottuk ki, hogy biztosítsa a keretrégiót a humanizált TN228 nehéz lánc és könnyű lánc variábilis régiókhoz. A humanizált TN228 nehéz lánc variábilis régió doménjében a 85 keretrégió csoportból 65 olyan van, amik azonosak az egér TN228 nehéz lánc keretrégióval, vagy 76%-os szekvencia azonosságot mutatnak. A humanizált TN228 könnyű lánc variábilis doménben a 80 keretrégió csoportból 65 olyan van, ami azonos az egér TN228 könnyű lánc keretrégióval, vagy 70%-os szekvencia azonosságot mutatnak.

Az ABMOD és ENCAD számítógépes programokat [Levitt, M.: Molecular dynamics of native protein. I. Computer simulations of trajectories Journal of Molecular Biology 168, 595-620 (1983)] használjuk a TN228 variábilis dómén molekuláris modelljének megalkotására, amit arra használunk, hogy lokalizáljuk azokat az aminosavakat az egér TN228 keretrégióban, amik elég közel vannak a CDR-ekhez ahhoz, hogy potenciálisan kölcsönhatásba lépjenek velük. A humanizált TN228 nehéz lánc és könnyű lánc variábilis régiók tervezésére az egér TN228 nehéz lánc CDR-jeit graftoljuk a humán IC4 nehéz lánc keretrégióiba, és az egér TN228 könnyű lánc CDR-jeit graftoljuk a humán IC4 könnyű lánc keretrégióiba. Azokban a keretrégió pozíciókban, amikben a számítógépes modell szignifikáns kontaktust jelez a CDR-ekkel, az egér ellenanyag aminosavait az eredeti humán keretrégió aminosavakkal helyettesítjük. A humanizált TN228 esetében ezt a nehéz lánc 27-es, 29-es, 30-as, 48-as, 67-es, 71-es és 78-as csoportjaiban hajtjuk végre. A könnyű láncban nem hajtottunk végre helyettesítést (azaz, az MuTTN228 CDR-ek egyenes graftolását hajtjuk végre az IC4 keretrégióba). Emellett, azokat a keretrégió csoportokat, amik a humán ellenanyagok adatbázisában az adott pozícióban csak ritkán fordulnak elő, a humán konszenzus aminosavakkal helyettesítjük. A humanizált

TN228 esetében ezt a nehéz lánc 23-as, 40-es, 73-as, 83-as és 85-ös pozíciójában tettük meg, valamint a könnyű lánc 69-es és 77-as pozíciójában. A humanizált TN228 ellenanyag nehéz lánc és könnyű lánc variábilis régiók aminosav szekvenciáját a 9. és 10. ábrán mutatjuk be.

9. Példa

A humanizált TN228-IgG2M3 konstrukciója és expressziója Módszerek

Amikor a humanizált variábilis régió aminosav szekvenciákat az előzőkben ismertetett módon megterveztük, akkor ezeket kódoló kéneket konstruálunk, beleértve a szignálpeptideket, illesztési donor szignálokat és a megfelelő restrikciós enzim hasítási helyeket (8. ábra). A nehéz lánc és könnyű lánc variábilis régió géneket nyolc átlapoló oligonukleotid használatával állítjuk elő és amplifikáljuk, amiknek a hossza 65-80 bázis között változik [He, X. Y., Z. Xu, J. Melrose, A. Mullowney, M. Vasquez, C. Queen, V. Vexler, C. Klingbeil, M.S. Co és E.L. Berg: Humanization and pharmacokinetics of a monoclonal antibody with specificity for both E- and P-selectin, J. of Immunol. 160, 1029-1035 (1998)]. Az oligonukleotidokat párosával egymáshoz illesztjük, és a DNS polimeráz I Klenow fragmensével meghosszabbítjuk, így kapunk négy kétszálú fragmenst. A kapott fragmenseket denaturáljuk, páronként egymáshoz illesztjük, Klenow fragmenssel meghosszabbítjuk, így kapunk két fragmenst. Ezeket a fragmenseket denaturáljuk, páronként egymáshoz illesztjük, ismét meghosszabbítjuk, így kapunk egy teljes hosszúságú gént. A kapott terméket polimeráz láncreakcióval amplifikáljuk Taq polimerázt alkalmazva, gélen tisztítjuk, Xbal-gyel emésztjük, ismét gélen tisztítjuk, majd a nehéz lánc expresszálásához a pVg2M3 plazmid Xbal hasítási helyére klónozzuk, a könnyű lánc expresszálásához a pVk plazmidba klónozzuk. A humán gamma 2 nehéz lánc expresszióhoz használt pVg2M3 vektort [Cole, M.S., C. Anasetti és J.Y. Tso: Human IgG2 variants of chimeric anti-CD3 are nonmitogenic to T cells J. of Immunol. 159, 3613-3621 (1997)], és a humán kappa könnyű lánc expresszálásához használt pVk vektort [Co, M.S.N.M. Avadalovic, P.C. Caron, M.V. Avadalovic, D.A. Scheinberg és C. Queen: Chimeric and humanized antibodies with specificity for the CD33 antigen, J. of Immunol. 148, 11491154 (1992)] már korábban publikálták.

A nehéz lánc és könnyű lánc V-régió és konstans régió exonok végső plazmidjai szekvenciáját nukleotid szekvenálással igazoltuk. A végső plazmidok nagyobb léptékű szekvenciáját restrikciós térképezéssel igazoltuk. Minden DNS manipulálást standard módszerekkel hajtottunk végre.

Ebben a specifikációban a HuTN228 szakkifejezés egy humanizált ellenanyagra vonatkozik, ami a humanizált TN228 V_H és Vl variábilis régiókat tartalmazza, valamint a humán IgG2M3 konstans régiót a nehéz láncra, és egy humán kappa konstans régiót a könnyű láncra. A nehéz lánc konstans régiókat módosították [Cole, M.S., C. Anasetti és J. Y. Tso: Human IgG2 variants of chimeric anti-CD3 are nonmitogenic to T cells J. of Immunol. 159, 3613-3621 (1997)] a csíravonal humán 2 genomiális fragmensből, és a könnyű lánc a csíravonal humán K genomiális fragmensből származik. A humán citomegalovírus nagy közvetlen korai promotere és fokozója hajtja meg. A nehéz lánc gént a humán komplement C2 génből származó transzkripciós terminator követi [Ashfield, R., P. Enriquez-Harris és N.J. Proudfoot: Transcriptional termination between the closely linked human complement genes C2 and factor B: common termination factor for C2 and c-myc? EMBO Journal 10, 4197-4207 (1991)]. A könnyű lánc szelekciós marker gpt gént [Mulligan, R.C. és P. Berg: Selection for animal cells that express the Escherichia coli gene coding for xanthine-guanine phosphoribosyltransferase Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 78, 20722076 (1981)], és a nehéz lánc szelekciós marker dhrf gént [Simonsen, C.C. és A. D. Levinson: Isolation and expression of an altered mouse dihydrofolate reductase cDNA, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 80, 2495-2499 (1983)] is az SV40 korai promotere hajtja meg.

A Hu TN228 expressziójához COS-7 sejtekbe való (majomvese sejt) való tranziens transzfekciót használunk, Lipofectamine 2000 használatával (katalógusszám # 11668-027, Life

Technologies). A tranziens transzfektánsokból származó használt közeget ELISA-val elemezzük, hogy van-e benne humán IgG2M3 termelődés, ehhez kecske anti-humán IgG gamma lánc-specifikus ellenanyagot használva befogó reagensként, és HRP-vel konjugált kecske anti-humán kappa lánc ellenanyagot használva előhívó reagensként. A használt közeget abból a szempontból is elemezzük, hogy a HuTN228 képes-e a P815/CD28+ sejtekhez kötődni, ehhez immunfluoreszcenciát és áramlási citometriát használva (nem közölt adatok). A stabil sejtvonal előállításához a humanizált expressziós plazmidokat elektroporációval Sp2/0 rágcsáló mielóma sejtvonalba transzfektáljuk, majd a gpt expresszióhoz szelektáljuk a transzfektánsokat. A stabil transzfek33 tánsokból származó használt közeget ELISA-val elemezzük a tranziens expresszió szempontjából.

Eredmények

A humanizált V-régió aminosav szekvencia tervezése alapján a nehéz lánc és könnyű lánc V-géneket (9. és 10. ábra) a Módszer-ekben ismertetett módon állítjuk elő. A nehéz lánc és könnyű lánc V-géneket a pVg2M3 és pVk vektorokba klónozzuk, amint az a 8. ábrán látható. Számos kiónt elemzünk nukleotid szekvenálással, és a mind a nehéz lánc, mind a könnyű lánc korrekt expressziós vektorok kiónjait használjuk a transzfekcióhoz. Mind a nehéz lánc, mind a könnyű lánc expressziós vektorok konstans régióit szekvenálással igazoljuk.

10. Példa

A HuTN228 expressziója

A COS-7 sejtek tranziens transzfekciója. Az expressziós vektorokat tranziensen transzfektáljuk COS-7 majomvese sejtvonalba, hogy előállítsuk a HuTN228 ellenanyagot. A transzfektált sejtekből származó használt táptalokat ELISA-val teszteljük, hogy tartalmaz-e humanizált gG2M3 ellenanyagot, és áramlási citometriával elemezzük, hogy kötődik-e a P815/CD28⁺ sejtekhez (nem közölt adatok). A használt táptalaj mindkét szempontból pozitívnak bizonyult. A humanizált ellenanyag hozama a tranziens transzfekcióból körülbelül 3,7 ng/ml. A tranziens felülúszóból származó HÜTN228 ellenanyag a P815/CD28+ sejtekhez koncentrációfüggő módon kötődik (nem közölt adatok).

Az SP2/0 sejtek stabil transzfekciója: a humanizált expressziós vektorokat Sp2/0 sejtekbe transzfektáljuk, stabil sejtvo34 nal előállítása céljából. A különböző transzfektánsokból származó használt táptalajokban megvizsgáljuk, hogy termelődött-e bennük HuTN228 ellenanyag, ugyanúgy, mint tranziens transzfektánsok esetében. Az egyik transzfektánst (4-es klón) választjuk ki a magasabb ellenanyag-termelése miatt, és GIBCo hibridóma szérummentes közegben szaporítjuk. A HuTN228 ellenanyagot 57 ml használt közegből tisztítjuk, affinitáskromatográfiával. A tisztított ellenanyag hozama körülbelül 7 mg.

11. Példa

Fehérj etisztítás

A stabil transzfekcióból származó egyik transzfektánst, ami magas szinten expresszálja a HuTN228-at (4-es klón) 570 ml GIBCO hibridóma szérummentes közegben szaporítjuk (katalógusszám #12045076, Life Technologies). A használt tenyészet felülúszót összegyűjtjük, amikor a sejtek életképessége 10%-ot, vagy annál alacsonyabb értéket ér el, majd 2 ml protein-A Sepharose oszlopra visszük. Az oszlopot foszfáttal puffereit sóoldattal mossuk, mielőtt az ellenanyagot 0,1 mol/1 glicin, 0,1 mol/1 nátrium-klorid (pH=2,5) oldattal eluáljuk. Az eluált fehérjét 3* 2 liter foszfáttal puffereit sóoldattal szemben dializáljuk, majd egy PD10 oszlopon sómentesítjűk, amit 0,1 mol/1 nátrium-kloridot tartalmazó foszfáttal puffereit sóoldattal hoztunk egyensúlyba. A sómentesített fehérje-oldatot egy 0,2 pm-es szűrőn bocsátjuk át, mielőtt 4 °C-on tároljuk.

11. Példa

Tisztaság meghatározás méretkizárásos HPLC-vel és SDS-PAGEval

Módszerek

Méretkizárásos HPLC hajtunk végre egy Perkin Elmer HPLC rendszerrel, ami egy PE ISS 200 Advanced LC Sample Processort, egy PE Series 410 Bio LC Pump-ot, egy PE 235C Diode Array Detector-t, és egy PE Nelson 600 Series LINK-et tartalmaz. A Perkin Elmer Turbochrom Navigator Version 4.1 szoftvert használjuk az automata mintavevő, a pumpa és a detektor szabályozására, valamint az adatok begyűjtésére, tárolására és feldolgozására. A szabályozást két TosoHaas TSK-GEL G3000SWXL méretkizárásos HPLC oszlop érjük el (7,8 mm χ 300 mm, 5 pm-es részecskeméret, 250-es pórusméret, katalógusszáma #08541, TosoHaas, Montgomeryville, MD), sorbakötve. A mobil fázis 200 mmol/1 kálium-foszfát/150 mmol/1 nátrium-klorid, pH=6,9, áramlási sebesség 1,00 ml/perc. Az oszlop eluátumot spektrofotometriásán követjük, 220 és 280 nm-en. Az injekciózott térfogat 50 μΐ (50 pg) HuTN228 minta.

A tisztított ellenanyag izotípusát Human IgG Subclass Profile ELISA Kit (katalógusszám # 99-100, Zymed Laboratories, South San Francisco, CA) használatával igazoljuk, a gyártó utasításai szerint (Eredmények).

Az izolált HuTN228 tisztaságát méretkizárásos HPLC-vel és SDS-PAGE-val elemezzük. A HuTN228 HPLC elúciós profilját nem közöljük. Az elemzés alapján a fehérje 96,5%-ban monomer, aminek a mobilitása megfelel a körülbelül 160 kDa molekulasúlyú fehérje mobilitásának.

A MuTN228, a MuFd79 (egér IgGl) izotípus kontroll, a HuTN228 és a HuEP5C7 izotípus kontroll (humán IgG2M3) SDSPAGE elemzése nem-redukáló körülmények között szintén azt mutatta, hogy mind a négy ellenanyag molekulasúlya körülbelül 150-160 kDa. Ugyanennek a négy fehérjének redukáló körülmények között végzett elemzése azt mutatja, hogy mind a négy ellenanyag tartalmaz egy nehéz láncot, aminek a molekulasúlya körülbelül 50 kDa, és egy könnyű láncot, aminek a molekulasúlya körülbelül 25 kDa.

Az izotípus teszt azt mutatta, hogy a HuTN228 ellenanyag izotípusa összhangban van a várt IgG2 izotípussal (nem közölt adatok).

12. Példa

FACS kompetíciós kísérlet

Titrálásos kísérletet hajtunk végre a MuTN228-FITC ellenanyaggal, kétszeres sorozathigítást alkalmazva, 250 ng/teszt-nél kezdve. P815/CD28+ sejteket (5x105 sejt/teszt) inkubálunk FITC-vel jelzett ellenanyaggal, 1 óra hosszat, jégen, foszfáttal puffereit sóoldattal mossuk, majd áramlási citometriával elemezzük (nem közölt adatok).

A kompetíciós kísérletekhez 50 ng/teszt MuTN228-FITC-t használunk, valamint a versengő ChTN228 vagy MÚTN228 ellenanyagokból háromszeres sorozathigítást alkalmazunk, 200 ng/teszt-nél kezdve, ezeket adjuk a P815/CD28+ sejtekhez (3x105 sejt/teszt. Kontrollként P815/CD28+ sejteket (5χ10⁵sejt/teszt) inkubálunk csak 50 ng/teszt, 50 μΐ FSB-ben, MuTN228-FITC-vel. A HuEPC57 és MuFc79 izotípus kontroll ellenanyagokat (200 ng/teszt) is vizsgáljuk, mint aspecifikus kompetitorokat, 25 1 FSB-ben. A sejteket az ellenanyag eleggyel inkubáljuk 100 1 végtérfogatban, 1 óra hosszat, jégen, sötétben, majd mossuk és áramlási citometriával elemezzük. Ezt a kísérletet háromszor megismételjük.

Eredmények

A MuTN228 és HuTN228 ellenanyagok kötési specifitását hasonlítjuk össze áramlási citometriás kompetíciós kísérletben, a Módszer ekben ismertetett módon. A reprezentatív eredményeket az 5. ábrán mutatjuk be. Mind az MuTN228, mind a ChTN228 koncentrációfüggő módon verseng az MuTN228-FITC-vel, jelezve, hogy mindkét ellenanyag kötődése a CD 28 antigénre specifikus (4. ábra). A HuTN228 relatív kötődése néhányszor kisebb, mint a MuTN228-é. Az MuFd79 és HuEP5C7 izotípus kontroll ellenanyagok nem versengenek az MuTN228-FITC-vel, jelezve, hogy az MuTN228 és a HuTN228 ellenanyagok a CD28 antigént V-régióra specifikus kölcsönhatások révén ismerik fel.

13. Példa

ELISA kompetíciós kísérlet

Módszerek

Egy 96-lukas ELISA lemezt (Nunc-Immuno lemez, katalógusszám #439454, NalgeNunc, Naperville, IL) vonunk be 100 μΐ/luk sCD28-Fc-vel (0,5 pg/ml foszfáttal puffereit sóoldatban (az sCD28-Fc jelentése fuzionált fehérje, amiben a CD28 az extracelluláris doménjeit kombináljuk az IgGl CH2 és CH3 doménjeivel), éjszakán át, 4 °C-on. A lemezt 30 percig blokkoljuk 30 μΐ/luk Superblock Blocking Buffer-rel, foszfáttal puffereit sóoldatban (katalógusszám #37535, Pierce, Rockford, IL), majd 300 μΐ/luk

ELISA Wash Buffer-rel mossuk (EWB = PBS, 0,1% Tween-20). MuTN228-biotin (0,5 μg/ml, 100 μΐ ELISA Buffer-ben (EB=PBS, 1% BSA, 0,1% Tween-20)) és a HuTN228 vagy MuTN228 kompetitor ellenanyag (100 μg/ml-nél indulva), 100 μΐ EB-ben, háromszoros sorozathigítása elegyét adjuk három párhuzamosban 200 μΐ/luk mennyiségben. A HuEPC57 és MuFd79 izotípus kontroll ellenanyagokat 100 μΐ EB-ben, szintén teszteljük aspecifikus kompetítorokként. „Nem-kompetitor” kontrollként 100 μΐ EB-t adunk 100 μΐ MuTN228-biotinhoz (0,5 pg/ml). Vakként 200 μΐ EBt adunk a többi lukhoz (nem tartalmaz MuTN228biotint). A lemezt 1,5 óra hosszat rázatjuk szobahőmérsékleten. A lukakat négyszer mossuk 300 μΐ/luk EWB-vel, majd 100 μΐ/luk Sztreptavidin-HRP-t (1 pg/ml, katalógusszám #21124, Pierce) adunk a lukakhoz. A lemezeket 1 óra hosszat szobahőmérsékleten rázatjuk. A lukak előzőkben ismertetett mosása után 100 μΐ/luk ABTS szubsztrátot (katalógusszám #507602 & 506502, KPL, Gaithersburg, MD) adunk a lukakhoz. A lemezeket szobahőmérsékleten inkubáljuk 5-7 percig, majd 415 nm-en leolvassuk az optikai sűrűségüket. Ezt a kísérletet háromszor megismételjük.

Eredmények

Az MuTN228 és a HuTN228 relatív kötési affinitását hasonlítjuk össze 1251 jelzett kompetíciós kísérletben, a Módszer-ekben ismertetett módon. Egy reprezentatív eredményt mutatunk be a 12. ábrán. Mind az MuTN228, mind a HuTN228 koncentrációfüggő módon verseng a ¹²⁵I-vel jelzett MuTN228-cal. Az MuFd79 és HuEP5C7 izotípus kontroll ellenanyag nem mutat kompetíciót a i25i-vel jelzett MuTN228-cal, jelezve, hogy a HuTN228 ellenanyag a CD28 antigént V-régió specifikus kölcsönhatásokon keresztül ismeri fel. Az MuTN228 és HuTN228 IC50 értékeit mindhárom kísérletre, a 2. táblázatban mutatjuk be. A HÜTN228 relatív kötődése átlagosan 2,6-szor kisebb, mint az MuTN228-é.

2. Táblázat ELISA kompetíciós összefoglalás IC50 (pg/ml)

Kopmpetítor	1. kis.	2. kis.	3. kis.	Átlag	Std. dev.
MuTN228	0,21	0,20	0,15	0,19	0,03
HuTN228	0,37	0,64	0,48	0,50	0,14

14. Példa ¹²⁵I-vel jelzett ellenanyag kompetíciós kísérlet Módszerek

Az MuTN228 és HuTN228 ellenanyagok relatív kötési hatékonyságát Queen és munkatársai módszerével határozzuk meg [Queen, C., W.P. Schneider, H.E. Selick, P.W. Payne, N.F. Landolfi, J.F. Duncan, N.M. Avdalovic, M. Levitt, R.P. Junghans, T.A. Waldmann: A humanized antibody that binds to the interleukin 2 receptor, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 86, 10029-10033 (1989)]. Röviden, körülbelül 10 ng i25i-val jelzett MuTN228-at, 50 μΐ Binding Buffer-ben (BB=PBS, 2% FBS, 1 μg/ml egér IgG, 0,1% nátrium-azid) kombinálunk három párhuzamosban MuTN228 vagy HuTN228 kompetítor ellenanyag háromszoros sorozathigításából, három párhuzamosban (400 pg/ml-től), 50 μΐ BB-ben, azt adjuk 100 μΐ P815/CD28+ sejtekhez (2,5x105 sejt/teszt), inkubáló csövekben (Skatron Microwell Tube Strips, katalógusszám #15773,

Molecular Devices, Sunnyvale, CA), majd 90 percig 4 °C-on tartjuk, enyhe rázatás közben. A HuEP5C7 és MuFd79 izotípus kontroll ellenanyagokat (400 pg/ml) 50 μΐ BB-ben is levizsgáljuk, mint aspecifikus kompetitorokat. Az inkubálást követően a sejtellenanyag keveréket centrifuga csövekbe visszük át (Sarstedt Micro Tubes, katalógusszám #72.702, Sarstedt, Newton, NC), amik 80% dibutilftalát-20% olívaolajat tartalmaznál·^ majd az inkubáló csöveket egyszer mossuk 50 μΐ BB-vel, majd a kötött és szabad beütésszámokat az ismertetett módon centrifugálással szétválasztjuk [Kuziel, W.A., S.J. Morgan, T.C. Dawson, S. Griffin, O. Smithies, K. Ley, N. Maeda: Severe reduction in leukocyte adhesion and monocyte extravasation in mice deficient in CC chemokine receptor 2, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 94, 12053-12058 (1997)]. Ezt a kísérletet háromszor megismételjük.

Eredmények

Az MuTN228 és a HuTN228 relatív kötési affinitását hasonlítjuk össze ¹²⁵I jelzett kompetíciós kísérletben, a Módszer-ekben ismertetett módon. Egy reprezentatív eredményt mutatunk be a 13. ábrán. Mind az MuTN228, mind a HuTN228 koncentrációfüggő módon verseng a ¹²⁵I-vel jelzett MuTN228-cal. Az MuFd79 izotípus kontroll ellenanyag gyenge, de reprodukálható kompetíciót mutat nagy koncentrációban, de a HuEP5C7 izotípus kontroll ellenanyag nem mutat kompetíciót a ¹²⁵I-vel jelzett MuTN228-cal, jelezve, hogy a HuTN228 ellenanyag a CD28 antigént V-régió specifikus kölcsönhatásokon keresztül ismeri fel. Az MuTN228 és a HuTN228 IC₅o három kísérletben kapott értékeit a 3. táblázatban mutatjuk be. A HuTN228 látszólagos kötési affinitása körülbelül 2,4-szer kisebb, mint az MuTN228 ellenanyagé.

3. Táblázat ¹²⁵I kompetíciós esszé IC50 (gg/ml)

Kompetítor	1. kis.	2. kis.	3. kis.	Átlag	Std. dev.
MuTN228	0,93	1,05	1,02	1,00	0,06
HuTN228	2,65	2,43	2,13	2,40	0,26

15, Példa

Ajágcsáló anti-egér CD28 ellenanyag aminosav szekvenálása Módszer

Hibridóma és ellenanyagok

A PV1 Armenian hörcsög anti-rágcsáló CD28 hibridómát az ATCC-től szereztük be (ATCC HB-12352). A tisztított PVl-et, az R-íikoeritrinnel (R-PE) konjugált PVl-et a Southern Biotechnology-tói vásároltuk (Birmingham, AL). A szíriai aranyhörcsög 37.51 anti-CD28 ellenanyagot a PharMingen-től vásároltuk (San Diego, CA). A szekunder ellenanyagokat, azaz a íluoreszceinnel (FITC) konjugált szamár anti-Armenian hörcsög IgG-t (H+L), az FITC-vel konjugált szamár anti- szíriai aranyhörcsög IgGt (H+L), az FITC-vel konjugált szamár anti-egér IgG-t (H+L), az RPE-F(ab')₂ szamár anti-egér IgG-t (H+L) a Jackson ImmunoResearch-tól (West Grove, PA); és az FITC-vel konjugált kecske anti-egér kappát, R-PE-konjugált kecske anti-egér IgG3-at és a ló tormaperoxidázzal (HRP)-konjugált kecske anti-egér kappát a Southern Biotechnology-tól vásároltuk. A kecske anti-egér IgG3at és az egér IgG3 izotípus kontroll FLOPC 22-t a Sigma Chemicals r··. *··* **Χ· ··»· ··· tói (St. Louis, MO) vásároltuk. Az Armenian hörcsög anti-rágcsáló 145.2C11 CD3 ellenanyagot és ennek rágcsáló/egér kiméra 145.2Cll-IgG3 verzióját a laboratóriumunkban állítottuk elő. Az FITC-vel konjugált 145.2Cll-et a Boehringer Mannheim-től (Indianapolis, IN) vásároltuk.

A variábilis régió cDNS-ek klónozása

A PV1 nehéz lánc és könnyű lánc V-régió cDNS-ét hibridóma sejtekből klónozzuk, rögzített polimeráz láncreakcióval (PCR), Co és munkatársai leírása szerint [Co, M.S.N.M. Avadalovic, P.C. Caron, M.V. Avadalovic, D.A. Scheinberg és C. Queen: Chimeric and humanized antibodies with specificity for the CD33 antigen, J. of Immunol. 148, 1149-1154 (1992)]. Az amplifikálást cDNSen hajtjuk végre, 3' primereket használva, amik a hörcsög kappa és gamma lánc C-régiójához illeszkednek, valamint egy 5' prímért, ami a cDNS hozzáadott G-farkához illeszkedik. A Vl PCR esetében a 3' primer szekvenciája a következő: 5'TATAGAGCTCCACTTCCAGTGCCC (20. számú szekvencia) aminek a 11-24-es csoportja hibridizál a rágcsáló C_K régiójához. A Vh polimeráz láncreakcióhoz használt 3'primereknek degenerált a szekvenciájuk (17., 18. és 19. számú szekvencia):

A G T

5' TATAGAGCTCAAGCTTCCAGTGGATAGACCGATGGGGCTGTC

T

GTTTTGGC3' amiben a 19-50-es csoportok a legtöbb rágcsáló IgG C_Hl-gyel hibridizálódnak. A két primer-készletben a nem-hibridizálódó szekvenciák restrikciós hasítási helyeket tartalmaznak, amiket a klónozáshoz lehet használni. A Vl és V_H cDNS-eket pUC19 vek-

torba szubklónozzuk, a szekvencia meghatározásához. A polimeráz láncreakcióval generált hibák elkerüléséhez az egyes cDNSekből 5 független kiónt szekvenálunk, és csak azokat a kiónokat választjuk ki a kiméra PV1 expresszálására, amiknek a szekvenciája megegyzik a konszenzus szekvenciával.

Eredmények

A PV1 régió cDNS-ek klónozása

A PV1 könnyű lánc és nehéz lánc V régió cDNS-eket a hibridóma sejtekből klónozzuk, a Módszerek-ben ismertetett módon. A Vl polimeráz láncreakcióhoz csak a hörcsög C_y régiójának megfelelő 3' primer eredményezett V_L cDNS terméket a PV 1-ről. A hörcsög Cy régiójából származó 3'primer azonban nem eredményezett semmilyen polimeráz láncreakció terméket. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a hibridóma PV1 kappát használ a könnyű láncához. Számos könnyű lánc és nehéz lánc kiónt szekvenáltunk, és kiderült róluk, hogy a klónozott nehéz láncok és könnyű láncok nem rágcsáló eredetűek.

16. Példa

A kiméra PVl-IgG3 konstrukciója és expresszióia Módszer

A Vb-t és V_H-t az ismertetett módon polimeráz láncreakcióval mini-exon szegmensekké konvertáljuk, amiket Xbal hasítási helyek határolnak [He, X. Y., Z. Xu, J. Melrose, A. Mullowney, M. Vasquez, C. Queen, V. Vexler, C. Klingbeil, M.S. Co és E.L. Berg: Humanization and pharmacokinetics of a monoclonal antibody with specificity for both E- and P-selectin, J. of Immunol. 160, 1029-1035 (1998)], majd külön-külön a ,:.. ··:* .ν ..könnyú lánc és nehéz lánc expressziós plazmidokba szubklónozzuk (14. ábra). Mindegyik mini-exon tartalmaz egy szignálpeptid szekvenciát, egy érett variábilis régió szekvenciát és egy illesztési donor szekvenciát, ami a leginkább homológ egér J lánc génből származik. Az ilyen illesztési donor szekvenciákat használjuk a V régió exonnak a humán ellenanyag konstans régiójába való illesztésére. Mindegyik mini-exont szekvenáljuk, miután a klónozó vektorba klónoztuk, hogy biztosítsuk, hogy a korrekt szekvenciát kaptuk meg, és nem keletkeztek hibák a polimeráz láncreakcióban.

Vektort konstruáltunk, hogy a kiméra PVl-IgG3nak mind _akönnyű láncát, mind a nehéz láncát egyetlen plazmidról expresszáljuk. Ebben a leírásban a PVl-IgG3 jelentése egy kiméra ellenanyag, ami a hörcsög PV1 V_L és V_H variábilis régiókat tartalmazza, valamint az egér konstans IgG3 régiót a nehéz lánchoz és az egér kappa konstans régiót a könnyű lánchoz. A pVl.g3.g.dE expressziós vektort (14. ábra) kétlépéses klónozási eljárásban kapjuk meg, ami hasonlít ahhoz, amit Cole és munkatársai publikáltak [Cole, M.S., C. Anasetti és J.Y. Tso: J. of Immunoi. 159, 3613-3621 (1997)]. A nehéz lánc konstans régió az egér y3 genomiális fragmensből származik, míg a könnyű lánc a κ fragmensből. Mind a nehéz lánc, mind a könnyű lánc gént a humán citomegalovírus fő közvetlen korai promotere és fokozója hajtja meg, és a humán komplement C2 génből származó transzkripciós terminátor választja el [Ashfield, R., P. Enriquez-Harris és N.J. Proudfoot: Transcriptional termination between the closely linked human complement genes C2 and factor B: common termination factor for C2 and c-myc? EMBO Journal 10, 41974207 (1991)]. A gpt szelekciós marker gént [Mulligan, R.C. és P.

Berg: Selection for animal cells that express the Escherichia coli gene coding for xanthine-guanine phosphoribosyltransferase Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 78, 20722076 (1981)] az SV40 korai promotere hajtja meg. A kim éra PV1IgG3 gén expressziójához az egyetlen plazmid vektort rágcsáló mielóma NSO sejtvonalba transzfektáljuk, majd a transzfektánsokat szelektáljuk a gpt expresszió alapján. A transzfektánsokból származó használt közegekben ELISA-val mérjük az IgG3 ellenanyag termelődését, kecske anti-egér IgG3-at használva befogó reagensként, és HRP-vel konjugált kecske anti-egér kappa láncok használva előhívó reagensként. Az esszé az egér IgG3-ra specifikus; más egér IgG3 izotípus ebben ez elemzésben negatív.

Eredmények

A kiméra PVl-IgG3 expressziója

A klónozott Vp-t és Vh-í mini-exonokká alakítjuk át (15. ábra), majd egy expressziós vektorba juttatjuk be, az Anyagok és Módszerek részben, valamint a 15. ábrán ismertetett módon. Az expressziós vektort azután rágcsáló NS40 mielóma sejtekbe transzfektáljuk, a kiméra PVl-IgG3 előállítására. A különböző transzfektánsok használt közegeit ELISA-val átvizsgáljuk, hogy termelnek-e egér IgG3 ellenanyagokat, majd FACSCan-bel is átvizsgáljuk, hogy kötődnek-e az EL4 sejtekhez. A legtöbb transzformáns mindkét esszében pozitívnak bizonyult. A magas ellenanyag-termelő képessége miatt kiválasztjuk az egyik transzfektánst, majd 1 literes szérummentes táptalajban elszaporítjuk. A PVl-IgG3-at 1 liter használt táptalajból tisztítjuk, affinitáskromatográfiával. A hozam >10 mg/1.

17. Példa

A tisztított kiméra PVI-IgG3 jellemzése HPLC-vel és SDS-PAGEval

Módszerek

Fehérjetisztítás

Az egyik, IgG3-at magasan expresszáló transzfektánst (#1 klón) 1 liter Gibco szérummentes hibridóma táptalajban szaporítjuk. A használt tenyészet felülúszót azután összegyűjtjük, amikor a sejtek életképessége 30%, vagy az alatt van, 200 ml-re töményítjük, majd 5 ml-es protein-A Sepharose oszlopra visszük, Pharmacia Pl pumpa használatával (2-3 1/perc). Az oszlopot azután foszfáttal puffereit sóoldattal mossuk, ami 0,1 mol/1 nátrium-kloridot tartalmaz (a nátrium-klorid végkoncentrációja 0.25 mol/1), majd az ellenanyagot 3,5 mol/1 MgCl₂-vel eluáljuk. Az eluált fehérjét egy 0,1 mol/1 nátrium-kloridot tartalmazó foszfáttal puffereit sóoldattal egyensúlyba hozott PD10 oszlopon sómentesítjük. Tárolás előtt a sómentesített fehérje-oldatot egy 0,2 pmes szűrőn szűrjük át. Ugyanúgy, mint az összes egér IgG3, a PVl-IgG3 magas koncentrációkban (>1 mg/ml) a hidegben kicsapódik, de 37 °C-ra felmelegítve újra beoldódik. Az ellenanyag szobahőmérsékleten oldatban marad. Úgy tűnik, hogy a hidegben való ismételt kicsapás nem érinti az ellenanyag antigén-kötő aktivitását.

Tisztaság-meghatározás méretkizárásos HPLC-vel és SDS-PAGEval

A méretkizárásos HPLC-t egy Perkin Elmer HPLC rendszerrek hajtjuk végre, ami egy PE ISS 200 Advanced LC Sample

Processor!, egy PE Series 410 Bio LC pumpát, egy PE 235 diódasoros detektort és egy PE Nelson 600 Series LINK-et tártál máz. A Perkin Elmer Turbochrom Navigator Version 4.1 szoftvert használjuk az automata mintavevő, a szivattyú és a detektor vezérléséhez, valamint az adatok begyűjtésére, tárolására és processzálására. Az elválasztást két TosoHaas TSK-GEL G3000SWXL méretkizárásos HPLC oszlopon hajtjuk végre, méretük 7,8 mm χ 300 mm, 5 pm részecskeméret, 250 Angström pórusméret (katalógusszám #08541, TosoHaas, Montgomeryville), sorbakötve. A mobil fázis 200 mmol/1 kálium foszfát/150 mmol/1 nátrium-klorid, pH=6,9, áramlási sebesség 1,00 ml/perc. Az oszlop eluátumot spektrofotometriásán követjük, 220 és 280 nm-en. Az injekciózott térfogat 50 μΐ 63,5 Mg) higítatlan PVl-IgG3 minta. SDS-PAGE-t hajtunk végre a standard eljárásoknak megfelelően.

Az izolált PVl-IgG3 tisztaságát méretkizárásos HPLC-vei és SDS-PAGE-val elemezzük. A PVl-IgG3 HPLC elúciós profilját a 16. ábrán mutatjuk be. Az elemzés alapján a fehérje 99%-ban monomer, aminek a mobilitása megfelel a körülbelül 150 kDa molekulasúlyú fehérje mobilitásának. A PV1, PVl-IgG3 és az izotípus kontroll SDS-PAGE elemzése nem-redukáló körülmények között szintén azt mutatta, hogy mind a négy ellenanyag molekulasúlya körülbelül 150 kDa (17A. ábra). A 17A. ábrán látható kis csíkok műtermékek, amiket az okoz, hogy a mintákat SDS-ben forraljuk redukció nélkül. Ezek tükrözik a nem-komplett láncok közötti diszulfid hidak számát az ellenanyagokban. Ugyanennek a három fehérjének az elemzése redukáló körülmények között (17B. ábra) azonban azt mutatta, hogy a PV1 nehéz lánc molekulasúlya valamivel magasabb, mint az IgG-nél általában megfigyelt kDa, míg a PVl-IgG3-ra vagy az izotípus kontrollra ez nem igaz. A rágcsáló PV1 ellenanyag tehát vagy erősen glikozilezett a Ch3 Asn297-es pozícióban, vagy van egy extra glikozilezési helye a nehéz láncban máshol. Amint azt később tárgyaljuk, ez a szokatlan glikozilezési mintázat hozzájárulhat ahhoz, hogy a PV1 aspecifikusan kötődik az EL4 sejtekhez, feltehetőleg lektin/szénhidrát kölcsönhatás révén.

18. Példa

Módszerek

Áramlási citometria

Rágcsáló T-sejtvonal EL4 sejteket (2,5* 10⁵ sejt/0,2 ml) festünk 1 pg/ml PVl-gyel, 37.51.gyei vagy PVI-IgG3-mal 4 °C-on, 30 percig, 2 ml hideg foszfáttal puffereit sóoldattal mossuk, majd 20 μΐ specifikus fluorokrómmal konjugált szekunder ellenanyagokkal festjük (10 pg/ml). 20 percig sötétben inkubáljuk 4 °C-on, majd a sejteket foszfáttal puffereit sóoldattal mossuk, és FACScan-nel elemezzük (Becton Dickinson, Milpitas, CA).

A kompetíciós kísérletben EL4 sejteket (2,5^10⁵ sejt/0,2 ml) festünk 1 pg/ml R-PE-Vl-gyel és 25 pg/ml PVl-gyel, PV1IgG3-mal vagy izotípus kontrollal, 4 °C-on, 30 percig, sötétben, foszfáttal puffereit sóoldattal mossuk és FACScan-nel elemezzük. Hasonló kompetíciós kísérleteket végzünk, a 145.2C11 különböző verzióinak felhasználásával. A fordított kompetíciós kísérletben az EL4 sejteket (2,5* 10⁵ sejt/0,2 ml) 1 pg/ml PVl-IgG3mal és 25 pg/ml PVl-gyel festjük 4 °C-on, 30 percig, kétszer mossuk foszfáttal puffereit sóoldattal, FITC-vel konjugált szamár anti-egér IgG-vel (H+L) festjük, mossuk, majd FACSCan-nel elemezzük. A szekunder ellenanyagoknak a PV 1-hez való aspeci fikus kötődésének ellenőrzéséhez az EL4 sejteket fölöslegben levő PVl-gyel festjük, PVl-IgG3 nélkül, majd elemezzük.

Az egér T-sejt festéséhez BALB/c egér lépsejteket (2,5* 10⁵sejt/0,2 ml) festünk 1 pg/ml egér IgG3 izotípus kontrollal (FLOPC 21) vagy PVI-IgG3-mal, 4 °C-on, 30 percig, 2 ml hideg foszfáttal puffereit sóoldattal mossuk, majd 20 μΐ FITC-vel konjugált 145.2C11-gyel (10 pg/ml) és 20 μΐ R-PE-konjugált kecske anti-egér IgG3-mal (10 μg/ml) festjük. A húszperces inkubálás után (4 °C, sötétben) a sejteket foszfáttal puffereit sóoldattal mossuk, és FACSCan-nel elemezzük.

Eredmények

A PV1 és a PVl-IgG3 jellemzése áramlási citometriával

PVl-et használunk CD28-pozitív EL4 T-sejtek megfestésére, majd FACSCan-nel elemezzük. A festés mintázata azt rmjtatja, hogy a PV1 két különböző pontban kötődik az L4 sejtekhez (17A. ábra). Emellett, a PV1 és számos Armenian hörcsög an tirágcsáló T-sejt ellenanyag (145.2C11; anti-CD3; H57-597; antiTCR és UC10-4F10-11) szintén kötődik aspecifikusan az NSO CD28-negatív mielőma sejtvonalhoz (nem közölt adatok). A szíriai hörcsög 37.51 anti-CD28 ellenanyag viszont az EL4 sejteken csak egyetlen pontban kötődik specifikusan (17B. ábra). Úgy tűnik, hogy a CD29 kötődése mellett a PV1 más helyekhez is kötődik aspecifikusan, feltehetőleg a szénhidrát/lektin típusú kölcsönhatások révén. Amint az a 17C. ábrán látható, a kiméra PVl-IgG3 nem tartalmazza ezt az aspecifikus kötési aktivitást. Az ellenanyag a 37.51-hez hasonló mintázattal kötődik az EL4 sejtekhez, és nem kötődik a CD28-negatív NSO sejtekhez (nem közölt adatok). Tehát a PV1 aspecifikus kötődési képessége ennek az ellenanyagnak a konstans régiójában van, és a kimerizáció eliminálja.

Annak demonstrálására, hogy a PVl-IgG3 tartalmazza a CD28-specifikus kötési aktivitást, a FACScan kompetíciós esszét használjuk. Ezekben a kísérletekben az R-PE-konjugált PVl-gyet fölöslegben levő (25-szörös) jelzetlen PVl-gyel, PVl-IgG3-mal vagy egér IgG3 kontrollal keverjük össze,majd a keveréket használjuk EL4 sejtek festésére. Amint az a 18A. ábrán látható, mind a PV1, mind a PVl-IgG3 megakadályozza, hogy az R-PE-konjugált PV1 kötődjön az EL4 sejtekhez, de az izotípus kontroll ezt nem teszi meg. A PVl-IgG3 gátlási képessége kisebb, mint a PV1é, és mi ezeket az adatokat úgy interpretáljuk, hogy a PVl-IgG3 verseng az R-PE-vel konjugált PVl-gyel a CD28 helyekért, de nem verseng az aspecifikus helyekért. Hasonlóképpen, mind a 145.2C11 (Armenian hörcsög anti-rágcsáló CD3), mind a Iáméra 145.2C1 l-IgG3 megakadályozza, hogy az R-PE-vel konjugált 145.2C11 kötődjön az EL4 sejtekhez (18B. ábra), de a kim éra ellenanyag kevésbé hatékony, mivel nem képes eliminálni az R-PE145.2C11 aspecifikus kötődését a sejtekhez.

Végeztünk reverz kompetíciós kísérleteket is, fölöslegben levő (25-szörös) PVl-gyel, hogy a PVl-IgG3-mal versengjen az EL4 sejtekhez való kötődésért. Bár ebben az esetben a PVl-IgG3 nem volt jelezve, az FITC-konjugált szamár anti-egér ellenanyagok specifikusan felismerték. A 18C. ábrán bemutatott eredmények azt mutatják, hogy a PVl-IgG3 EL4 sejtekhez való kötődésének gátlása fölöslegben levő PVl-gyel majdnem teljes, demonstrálva, hogy a PV1 és a PVl-IgG3 ugyanahhoz az epitophoz kötődik.

Végezetül, a PVl-IgG3-at használjuk egérspecifikus lépsejtek festésére. A PVl-IgG3-mal bevont lépsejteket specifikusan felismeri az R-PE-hez konjugált kecske anti-egér IgG3 szekunder ellenanyag. Hasonlóképpen, az FITC-vel konjugált 145.2Cll-et is hozzáadjuk a lépsejtekhez, hogy jelezzük a CD3-pozitív sejteket. A két színt használó áramlási citometriai elemzésben a PVl-IgG3 specifikusan festi a CD3-pozitív sejteket, míg a CD3-negatív sejteket nem (19B. ábra). Az egér IgG3 izotípus kontroll viszont nem festi a CD3 pozitív sejteket (19A. ábra). Tehát a kiméra PV1IgG3 felismer egy antigént, ami a rágcsáló T-sejteken expresszálódik, egy antigén-kötő aktivitást, ami összhangban van egy anti-CD28 ellenanyaggal.

19. Példa

A kollagénnel indukált arthritis indukciója Módszerek

Az egereket intradermálisan immunizáljuk a farok tövében 125 pg szarvasmarha CII-vel (Collagen Gijutsu Kenkyukai, Japán). Az egereket tovább immunizáltuk 125 pg szarvasmarha CII komplett Freund féle adjuvánsban a 21. napon beadott injekciójával. Az egereket anti-CD28 ellenanyaggal (PVl-IgG3) kezeljük 1 mg/kg/nap dózisban, folyamatos infúzióval, ozmotikus pumpát használva, 7 napig, az induló immunizálás után. Az arthritis kifejlődését a négy mancs megfigyelésével ellenőriztük a második immunizálás után 11 nappal, és a négy mancs gyulladását 0 és 3 között értékeltük, a korábban ismertetett módon [Tada, Y., A. Ho, D.-R. Koh, T.W. Mak: J. of Immunoi. 156, 4520 (1996); Tada, Y., A. Ho, T. Matsuyama, T. W. Mak: J. Exp. Med. 185, 231 (1997)]. Mindegyik mancsot kiértékeltük, és a négy értéket összeadjuk, oly módon, hogy a maximális érték egerenként 12. Az arthritis indexet úgy számítjuk ki, hogy a kísérleti egér össz-értékét az egerek össz-számával osztjuk.

Eredmények

Az egereket szarvasmarha CII-vel immunizáltuk, majd megfigyeltük az arthritis kifejlődését. A második immunizálás után 11 nappal az arthritis index szignifikánsan lecsökkent az antiCD28 ellenanyaggal kezelt egerekben (0.63±0,50) (P<0,01) vs. kontroll (7,50±0,66).

20. Példa

Módszerek

Egerek; állatok

Nőstény BALB/c és C3H egereket vásárolunk a Charles River Japan Inc.-tői (Yokohama, Japán), az állatokat specifikus patogén-mentes környezetben tartjuk, mikroizolátor ketrecekben, megszűrt levegőt és tetszés szerinti ételt és vizet biztosítva. A kísérletek indításakor az összes egér 6-8 hetes volt.

Ellenanyagok;

Az anti-egér csendes CD28 (PVl-IgG3) a PV-1 klónnal azonos specifitással rendelkezik, de nincs erős agonista aktivitása in vitro (Fc -> IgG3). Az anti-egér CD154-et (TRAP1, IgGl) a BD Pharmingen-től vásároljuk (San Diego, CA). A CTLA4-Ig-t (CTLA-4/Fc kiméra) a Genzyme-től vásároltuk (Cambridge, MA)

Farokbőr transzplantáció;

A donor egerek (BALB/c:H-2d) farkából származó teljes vastagságú bőr graftokat transzplantálunk a befogadó egerek (C3H:H-2b) mellkasára, és 7 napra kötszerrel rögzítjük. A graft túlélését azutan napi szemrevételezéssel ellenőrizzük. A kilökődést úgy definiáljuk, mint az életképes epidermális graft szövet >80%-ának elvesztését. Statisztikai elemzéseket végzünk egy Dunnett Multiple Comparison teszttel. A <0,05 értékeket tekintjük szignifikánsnak.

Kezelési protokollok;

A bőrgraft recipienseket 10, 50, 250 pg anti-egér csendes CD28-cal,

250 mg anti-egér CD154-gyel és 100 pg CTLA4-Ig-vel kezeljük, amit intraperitoneálisan adunk be a transzplantáció napján (0. nap), valamint a műtét utáni 3. és 6. napon.

Eredmények;

A CD40 és CD28 T-sejtek ko-stimulációs bioszintézis út egyidejű blokádja anti-egér csendes CD28 és anti-egér CD 154 beadásával hatékonyan elősegíti a bőr allograft túlélését CH3 egerekben. A kontroll állatok graftjukat a 9. napon kilökték. Az anti-CD40L monoklonális ellenanyag önmagában közepesen meghosszabbította az allograft túlélését (MST 10 nap), de a túlélés drasztikus javulása volt megfigyelhető, ha a CD28-cal kombináltuk, az átlagos túlélési időt (MST) 33 nap fölé emelve. Ez a stratégia lényegesen kisebb hatékonyságú, ha a CTLA4-Ig-t és az anti-egér CD40L monoklonális ellenanyagot adjuk be, az átlagos MST 12 nap.

21. Példa

Egy anti-CD28 ellenanyag Fab és Fíab b frogmens előáll.*,.» Az anti-CD28 ellenanyag Fab fragmensének előállítása

Az anti-humán CD28 ellenanyagot (HÜTN228) immobüizált Ficin-nel (Pierce, USA) emésztjük. Az immobilizált fleint 50 mmol/1 TRIS-HC1 pH-6,8 pufferben aktiváljuk, ami 5 mmol/1 EDTA-t és 11,5 mmol/1 cisztein-HCl-talmaz, oszlopba töltve. Az ellenanyag oldatot hozzáadjuk az oszlophoz, majd 2-3 napig 37 °C-on inkubáljuk. Az oszlopot foszfáttal puffereit sóoldattal mossuk, majd az emésztett anyagot ultraszüréssel töményítjük. A töményített emésztett anyagot gélszürö oszlopra visszük (TSKgel-3000SWxl, Tosoh, Japán), majd a megfelelő frakciókat összegyűjtjük és ultraszüréssel töményítjük. A fehéije-koncentrációt a 280 nm-en mért abszorpcióval határozzuk meg (Abs280 1,4 1 mg/ml-re), és a fragmens méretét SDS-PAGE-val igazoljuk.

Az anti-CD28 ellenanyag Fíab'h fragmensének készítés

Az anti-humán CD28 ellenanyagot ugyanazzal a módszerrel állítjuk eló, mint a Fab fragmenst, azzal az eltéréssel, hogy más a cisztein koncentrációja (1,15 mmol/1) és más az inkubálás időtartama (éjszakán át).

A fenti kitanítás fényében a jelen találmányban természetesen számos módosítás és variáció tehető. Ezért nyilvánvalónak gondoljuk, hogy a csatolt igénypontok oltalmi körében a jelen találmány más gyakorlat szerint is megvalósítható, mint amit itt ismertettünk.

Minden publikációt, szabadalmi bejelentést, szabadalmat es más referenciát teljes egészében referenciának tekintjük.

Az alábbiakban részletesen ismertetjük a leírásban említett szekvenciákat, és számítógéppel olvasható formában is mellékeljük.

SZEKVENCIALISTA < 110> VASQUEZ, Maximiliano

HINTON, Paul

TAMURA, Kouichi

HIGASHI, Yauyuki

SEKI, Nobuo

UEDA, Hirotsugu

TSO, J. Yun <120> Elcsendesített anti-CD28 ellenanyagok és használatuk <130> 200071USOPROV <150> US 60/255,155 <151> 2000-12-14 <160> 21 <170> Patentin version 3.1 <210> 1 <211> 427 <212> DNS <213> hibrid <220>

<221> CDS <222> (12)..(404) <223>

<400> 1 tctagaccac c atg gag tea gac aca etc ctg eta tgg gtg ctg ctg etc 50 Met Glu Ser Asp Thr Leu Leu Leu Trp Vai Leu Leu Leu ¹ 5io ^99 9tt cca ggc tcc act ggt gac att gtg etc acc caa tet cca get98

Trp Vai Pro Gly Ser Thr Gly Asp He Vai Leu Thr Gin Ser ProAla

2025 tet ttg get gtg tet ctg ggg cag aga gee acc ate tec tgc aga gee146

Ser Leu Ala Vai Ser Leu Gly Gin Arg Ala Thr He Ser Cys ArgAla

35 4045 agt gaa agt gtt gaa tat tat gtc aca agt tta atg cag tgg tac caa194

Ser Glu Ser Vai Glu Tyr Tyr Vai Thr Ser Leu Met Gin Trp TyrGin

5560 cag aaa cca gga cag cca ccc aaa etc etc ate tat get gca tec aac242

Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu He Tyr Ala Ala SerAsn

7075 gta gat tet ggg gtc cct gee agg ttt agt ggc agt ggg tet ggg aca290

Vai Asp Ser Gly val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser GlyThr

85 gac ttc age etc aac ate cat cct gtg gag gag gat gat att gca atg338

Asp Phe Ser Leu Asn He His Pro Val Glu Glu Asp Asp He AlaMet ⁹⁵ 100105 tat ttc tgt cag caa agt agg aag gtt cca ttc acg ttc ggc teg ggg386

Tyr Phe Cys Gin Gin Ser Arg Lys Val Pro Phe Thr Phe Gly SerGly ¹¹⁰ 115 120125 aca aag ttg gaa ata aaa cgtaagtaga ettttgetet aga427

Thr Lys Leu Glu lie Lys

130 <210> 2 <211> 131 <212> Fehérje <213> hibrid <400> 2

Met Glu Ser Asp Thr Leu Leu Leu Trp Vai Leu Leu Leu Trp Vai Pro ¹ 5 io15

Gly Ser Thr Gly Asp He Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala 20 2530

Vai Ser Leu Gly Gin Arg Ala Thr He Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser ³⁵ 4045

Vai Glu Tyr Tyr Vai Thr Ser Leu Met Gin Trp Tyr Gin Gin Lys Pro 50 5560

Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu He Tyr Ala Ala Ser Asn Vai Asp Ser ⁶⁵ 70 75so

Gly Vai Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser 85 9095

Leu Asn He His Pro Vai Glu Glu Asp Asp He Ala Met Tyr Phe Cys 100 105no

Gin Gin Ser Arg Lys Vai Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu

115 120125

Glu lie Lys

130 <210> 3 <211> 877 <212> DNS <213> hibrid <220>

<221> CDS <222> (12)..(431) <223>

<400> 3 tctagaccac c atg gag tea gac aca etc ctg eta tgg gtg ctg ctg ctc50 Met Glu Ser Asp Thr Leu Leu Leu Trp Vai Leu Leu Leu 15io tgg gtt cca ggc tcc act ggt gac att gtg etc acc caa tet cca get98

Trp Vai Pro Gly Ser Thr Gly Asp lie Vai Leu Thr Gin Ser ProAla

2025 tet ttg get gtg tet ctg ggg cag aga gee acc ate tec tgc aga gee146

Ser Leu Ala Vai Ser Leu Gly.Gin Arg Ala Thr He Ser Cys ArgAla

35 4045 agt gaa agt gtt gaa tat tat gtc aca agt tta atg cag tgg tac caa194

Ser Glu Ser Vai Glu Tyr Tyr Vai Thr Ser Leu Met Gin Trp TyrGin

5560 cag aaa cca gga cag cca ccc aaa etc etc ate tat get gca tec aac242

Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu He Tyr Ala Ala SerAsn ⁶⁵ 7075 gta gat tet ggg gtc cct gee agg ttt agt ggc agt ggg tet ggg aca290

Vai Asp Ser Gly Vai Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser GlyThr

85go gac ttc age etc aac ate cat cct gtg gag gag gat gat att gca atg338

Asp Phe Ser Leu Asn He His Pro Vai Glu Glu Asp Asp He AlaMet

100105 tat ttc tgt cag caa agt agg aag gtt cca ttc acg ttc ggc teg ggg386

Tyr Phe Cys Gin Gin Ser Arg Lys Vai Pro Phe Thr Phe Gly SerGly ¹¹⁰ 115 120125 aca aag ttg gaa ata aaa cgt aag tag act ttt get eta gat eta 431

Thr Lys Leu Glu He Lys Arg Lys Thr Phe Ala Leu Asp Leu 130135 gaccaccatg gtcccaggtg catcacttgc gcctccagga taattegget ettaaaaatg ggcgtatggt ctcctcaggt gctgtcctgg cagctgaagg actgtctctg aagggtctgg ctcatgtcca aacactctgc aactacctct aagaatggee tgctgttcct agtcaggacc gattttcatt aatggctggg gactgagcat aaactgatga atgccatgga tetaga ctgcctggtt gcatttccaa gctgtgtcct491 tggcctggtg gcgccctcac agagcctgtc551 aaccagctat ggtgtacact gggttcgcca611 agtcatatgg cctggtggag gcacaaattt671 cagcgaagac aactccaaga gccaagtttt731 cacagccata tattattgtg ccagagatcg791 ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt851

877 <210> 4 <211> 133 <212> Fehérje <213> hibrid <400> 4

Met 1

Glu

Ser

Asp

Thr Leu Leu Leu Trp Vai Leu Leu

Leu

Trp

Vai 15

Pro

5

10

Gly

Ser

Thr

Gly

Asp

lie

Vai

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Ala

Ser

Leu

Ala

20

25

30

Vai

Ser

Leu

Gly

Gin

Arg

Ala

Thr

He

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Glu

Ser

35

40

45

Vai

Glu

Tyr

Vai

Thr

Ser

Leu

Met

Gin

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

50

55

60

Gly

Gin

Pro

Lys

Leu

He

Tyr

Ala

Ser

Asn

Vai

Asp

Ser

65

70

75

80

Gly

Vai

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Ser

85

90

95

Leu

Asn

He

His

Pro

Vai

Glu

Asp

He

Ala

Met

Tyr

Phe

Cys

100

105

1

L10

Gin

Ser

Arg

Lys

Vai

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Ser

Gly Thr

Lys

Leu

115

120

L25

Glu

He

Lys

Arg

Lys

130 <210> 5 <211> 6 <212> Fehérje <213> hibrid <400> 5

Thr Phe Ala Leu Asp Leu

5 <210> 6 <211> 450 <212> DNS <213> hibrid <220>

<221> CDS <222> (12)..(431) <223>

<400> 6 tctagaccac c atg get gtc ctg gtg ctg ttc etc tgc ctg gtt gca ttt 50 Met Ala Vai Leu Vai Leu Phe Leu Cys Leu Vai Ala Phe 1510 cca age tgt gtc ctg tcc cag gtg cag ctg cag gag tea gga cct ggc 98 Pro Ser Cys Vai Leu Ser Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly 15 2025 ctg gtg aag ccc tea gag ace ctg tcc etc act tgc get gtc tet gga146

Leu Vai Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Vai SerGly

35 4045 ttt tea tta ace age tat ggt gta cac tgg att ege cag cct cca gga194

Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Vai His Trp lie Arg Gin Pro ProGly

5560 aag ggt ctg gaa tgg ctg gga gtc ata tgg cct ggt gga ggc aca aat242

Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Vai lie Trp Pro Gly Gly Gly ThrAsn

7075 ttt aat teg get etc atg tcc aga ctg ace ate age gaa gac ace tcc290

Phe Asn Ser Ala Leu Met Ser Arg Leu Thr lie Ser Glu Asp ThrSer

8590 aag aac caa gtt tcc tta aaa ttg age tet gtg aca get get gac aca338

Lys Asn Gin Vai Ser Leu Lys Leu Ser Ser Vai Thr Ala Ala AspThr

100105 gcc gta tat tat tgt gee aga gat egg geg tat ggt aac tac etc tat386

Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Ala Tyr Gly Asn Tyr LeuTyr ^ηθ 115 120125 geg atg gac tac tgg ggt caa gga acc tta gtc ace gtc tcc tea431

Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 130 135140 ggtaagaatg gcctctaga

450 <210> 7 <211> 140 <212> Fehérje <213> hibrid <400> 7

Met Ala Vai Leu Vai Leu Phe Leu Cys Leu Vai Ala Phe Pro Ser Cys ¹ 5 1015

Vai Leu Ser Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys 20 2530

Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Vai Ser Gly Phe Ser Leu 35 4045

Thr Ser Tyr Gly Vai His Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu 50 5560

Glu Trp Leu Gly Vai He Trp Pro Gly Gly Gly Thr Asn Phe Asn Ser ⁶⁵ 70 7580

Ala Leu Met Ser Arg Leu Thr He Ser Glu Asp Thr Ser Lys Asn Gin 85 9095

Vai Ser Leu Lys Leu Ser Ser Vai Thr Ala Ala Asp Thr Ala Vai Tyr 100 105no

Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Ala Tyr Gly Asn Tyr Leu Tyr Ala Met Asp 115 120125

Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser

130 135140 <210> 8 <211> 427 <212> DNS <213> hibrid <220>

<221> CDS <222> (12)..(404) <223>

•Λ*

<400> 8 tctagaccac c atg gag tea gac aca etc ctg eta tgg gtg ctg ctg etc 50 Met Glu Ser Asp Thr Leu Leu Leu Trp Vai Leu Leu Leu ¹ 5io *-99 9^t cca ggc tec act ggt gac att cag atg acc caa tet cca tet98

Trp Vai Pro Gly Ser Thr Gly Asp He Gin Met Thr Gin Ser ProSer

2025 tet ttg tet geg tet gtg ggg gac agg gtc acc ate aca tgc aga gcc146

Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly Asp Arg Vai Thr He Thr Cys ArgAla ³⁰ 35 40 agt gaa agt gtt gaa tat tat gtc aca agt tta atg cag tgg tac caa194

Ser Glu Ser Vai Glu Tyr Tyr Vai Thr Ser Leu Met Gin Trp TyrGin

5560 cag aaa cca gga aag gca ccc aaa etc etc ate tat get gca tec aac242

Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ala Ala SerAsn

7075 gta gat tet ggg gtc cet tcc agg ttt agt ggc agt ggg tet ggg aca290

Vai Asp Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser GlyThr

85go gac ttc acc etc acc ate tet tet ctg cag ccg gag gat att gca acg338

Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp He AlaThr

100105 tat tac tgt cag caa agt agg aag gtt cca ttc acg ttc ggc ggg ggg386

Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Arg Lys Vai Pro Phe Thr Phe Gly GlyGly ¹¹⁰ 115 120125 aca aag gtg gaa ata aaa cgtaagtaga ettttgetet aga427

Thr Lys Vai Glu lie Lys

130 <210> 9 <211> 131 <212> Fehérje <213> hibrid <400>9

Met Glu Ser Asp Thr Leu Leu Leu Trp 1 5

Gly Ser Thr Gly Asp He Gin Met Thr

25

Vai Leu Leu Leu 10

Gin Ser Pro Ser

Trp Vai 15

Ser Leu 30

Pro

Ser

Ala

Ser

Val 35

Gly

Asp Arg

Val Thr 40

lie

Thr

Cys

Arg

Ala Ser 45

Glu

Ser

Val

Glu 50

Tyr

Val Thr

Ser Leu 55

Met

Gin

Trp

Tyr 60

Gin Gin

Lys

Pro

Gly 65

Lys

Ala

Pro

Lys Leu 70

Leu He

Tyr

Ala

Ala 75

Ser

Asn Val

Asp

Ser 80

Gly

Val

Pro

Ser

Arg Phe 85

Ser Gly

Ser

Gly 90

Ser

Gly

Thr Asp

Phe 95

Thr

Leu

Thr

lie

Ser 100

Ser Leu

Gin Pro

Glu 105

Asp

He

Ala

Thr Tyr 110

Tyr

Cys

Gin

Ser

Arg

Lys Val

Pro Phe

Thr

Phe

Gly

Gly Thr

Lys

Val

115 120 125

Glu He Lys 130 <210> 10 <211> 445 <212> DNS <213> hibrid <220>

<221> CDS <222> (21)..(419) <223>

<400> 10 tctagacagt ggggaacaat atg gat tea cag ate cag gtc etc atg tee ctg 53

Met Asp Ser Gin lie Gin Val Leu Met Ser Leu ¹ 5io etc etc tgg atg tet ggt gee tgt gga gat att gtg atg acc cag tet 101

Leu Leu Trp Met Ser Gly Ala Cys Gly Asp He Val Met Thr Gin Ser

2025 cca tat tee ctg get gtg tea gca gga gag aag gtc acc atg agt tgc149

Pro Tyr Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met SerCys

3540 agg tee agt cag age etc tat tac agt gga ate aaa aag aac etc ttg197

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Tyr Tyr Ser Gly He Lys Lys Asn Leu Leu

5055 gcc tgg tac cag cag aaa cca ggc cag tct ccg aaa ctg ctg ate tac245

Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu lieTyr

65 7075 ttt aca tct act egg tta cet ggg gta ccg gat ege ttc aca ggc agt293

Phe Thr Ser Thr Arg Leu Pro Gly Vai Pro Asp Arg Phe Thr GlySer

8590 gga tct ggg aca gat tac act etc ace ate ace agt gtc cag get gaa341

Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr lie Thr Ser Vai Gin AlaGlu

100105 gac atg ggg cat tat ttc tgt cag cag

Asp Met Gly His Tyr Phe Cys Gin Gin

110115 ttc ggt gat ggc acc aag ctg gagata

Phe Gly Asp Gly Thr Lys Leu Glulie

125130 tetaga <210> 11 <211> 133 <212> Fehérje <213> hibrid ggt ata age act ccg etc acg 389

Gly lie Ser Thr Pro Leu Thr

120 aga cgtaagtaga atccaaagtc 439

Arg

445 <400>

Met 1

Asp Ser Gin

He Gin 5

Vai

Leu Met

Ser 10

Leu

Leu Trp

Met 15

Ser

Gly

Ala

Cys

Gly 20

Asp

He

Vai

Met

Thr 25

Gin

Ser

Pro

Tyr

Ser 30

Leu

Ala

Vai

Ser

Ala 35

Gly

Glu

Lys

Vai

Thr 40

Met

Ser

Cys

Arg

Ser 45

Ser

Gin

Ser

Leu

Tyr 50

Tyr

Ser

Gly

He

Lys 55

Lys

Asn

Leu

Ala 60

Trp

Tyr

Gin

Lys 65

Pro

Gly

Gin

Ser

Pro 70

Lys

Leu

He

Tyr 75

Phe

Thr

Ser

Thr

Arg 80

Leu

Pro

Gly

Vai

Pro 85

Asp

Arg

Phe

Thr

Gly 90

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr 95

Asp

Tyr

Thr

Leu

Thr 100

He

Thr

Ser

Vai

Gin 105

Ala

Glu

Asp

Met

Gly HO

His

Tyr

Phe

Cys

Gin

Gly

He

Ser

Thr

Pro

Leu

Thr

Phe

Gly Asp

Gly

Thr

115 120 125

Lys Leu Glu lie Arg 130 <210> 12 <211> 467 <212> DNS <213> hibrid <220>

<221> CDS <222> (16)..(444) <223>

<400> 12 tctagagtct tcacc atg gta tgg ggc ttg ate ate ate ttc ctg gtc aca 51 Met Vai Trp Gly Leu lie lie He Phe Leu Vai Thr 15io gca get aca ggt gtc cac tcc cag gtc cag ttg aag cag tet ggg get99

Ala Ala Thr Gly Vai His Ser Gin Vai Gin Leu Lys Gin Ser GlyAla

2025

9^a9 ett gtg aag cct gga gcc tea gtg aag ata tec tgc aaa act tea147

Glu Leu Vai Lys Pro Gly Ala Ser Vai Lys He Ser Cys Lys ThrSer

3540 ggc tat ace ttc act gat ggc tac atg aac tgg gtt gag cag aag cct195

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Gly Tyr Met Asn Trp Vai Glu Gin LysPro ⁴⁵ 50 5560

999 cag ggc ett gag tgg att gga aga att gat cct gat agt ggt aat243

Gly Gin Gly Leu Glu Trp He Gly Arg He Asp Pro Asp Ser GlyAsn

7075 act egg tac aat cag aaa ttc cag ggc aag gcc aca ctg act aga gac291

Thr Arg Tyr Asn Gin Lys Phe Gin Gly Lys Ala Thr Leu Thr ArgAsp

85go aaa tcc tcc age aca gtc tac atg gac etc agg age ctg aca tet gag339

Lys Ser Ser Ser Thr Vai Tyr Met Asp Leu Arg Ser Leu Thr SerGlu

100105 gac tet get gtc tat tac tgt geg aga gat ggg acc ttc tac ggt acc 387

Asp Ser Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala 110 115 tac ggc tac tgg tac ttc gat ttc Tyr Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Phe 125 130 gtc tcc tea ggtgagtcct taaaacch Vai Ser Ser

Arg Asp Gly Thr Phe Tyr Gly Thr

120 tgg 99^{c ca}9 999 acc cag gtc ace 435 Trp Gly Gin Gly Thr Gin Vai Thr 135 140 t aga 467 <210> 13 <211> 143 <212> Fehérje <213> hibrid <400> 13

Met Vai Trp Gly Leu He lie lie 15

Vai His Ser Gin Vai Gin Leu Lys 20

Pro Gly Ala Ser Vai Lys He Ser 3540

Thr Asp Gly Tyr Met Asn Trp Vai 5055

Glu Trp lie Gly Arg He Asp Pro 6570

Gin Lys Phe Gin Gly Lys Ala Thr 85

Thr Vai Tyr Met Asp Leu Arg Ser 100

Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Thr 115120

Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gin Gly 130135

Phe Leu Vai Thr Ala Ala Thr Gly 1015

Gin Ser Gly Ala Glu Leu Vai Lys 2530

Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe 45

Glu Gin Lys Pro Gly Gin Gly Leu 60

Asp Ser Gly Asn Thr Arg Tyr Asn 7580

Leu Thr Arg Asp Lys Ser Ser Ser 9095

Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Vai 105no

Phe Tyr Gly Thr Tyr Gly Tyr Trp 125

Thr Gin Vai Thr Vai Ser Ser

140 <210> 14 <211> 46 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> szintetikus DNS <400> 14 tatagagctc aagcttggat ggtgggaaga tggatacagt tggtgc 46 <210> 15 <211> 50 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> szintetikus DNS <400> 67 tatagagctc aagcttccag tggatagacc gatggggctg tcgttttggc 50 <210> 16 <211> 50 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> szintetikus DNS <400> 16 tatagagctc aagcttccag tggatagaca gatgggggtg ttgttttggc 50 <210> 17 <211> 50 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> szintetikus DNS <400> 17 tatagagctc aagcttccag tggatagacc gatggggctg tcgttttggc 50 <210> 18 <211> 50 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> szintetikus DNS <400> 18 tatagagctc aagcttccag tggatagacc gatggggctg tcgttttggc 50 <210> 19 <211> 50 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> szintetikus DNS <400> 19 tatagagctc aagcttccag tggatagacc gatgggggtg ttgttttggc 50 <210> 20 <211> 50 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> szintetikus DNS <400> 20 tatagagctc aagcttccag tggatagtcc gatggggctg tcgttttggc 50 <210> 21 <211> 24 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> szintetikus DNS <400> 21 tatagagctc cacttccagt gccc

Claims

ΊΟ

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Elcsendesített anti-CD28 ellenanyag.
2. Az 1. igénypont szerinti ellenanyag, ami egy kiméra ellenanyag.
3. Az 1. igénypont szerinti ellenanyag, ami egy humanizált ellenanyag.
4. Az 1. igénypont szerinti ellenanyag, aminek a variábilis régiója tartalmazza a 2. számú szekvencia vagy a 4. számú szekvencia aminosav szekvenciáját.
5. Az 1. igénypont szerinti ellenanyag, aminek a variábilis régiója tartalmazza a 2. számú szekvencia és a 4. számú szekvencia aminosav szekvenciáját.
6. Az 1. igénypont szerinti ellenanyag, aminek a variábilis régiója tartalmazza a 6. számú szekvencia vagy a 8. számú szekvencia aminosav szekvenciáját.
7. Az 1. igénypont szerinti ellenanyag, aminek a variábilis régiója tartalmazza a 6. számú szekvencia és a 8. számú szekvencia aminosav szekvenciáját.
8. Polinukleotid, ami az 1. igénypont szerinti ellenanyagot kódolja.
9. A 8. igénypont szerinti polinukleotid, ami tartalmaz legalább egyet az alábbi csoportból: 1. számú szekvencia, 2. számú szekvencia, 3. számú szekvencia és 4. számú szekvencia.
10. Expressziós vektor, ami tartalmazza a 8. igénypont szerinti polinukleotidot.
11. Gazdasejt, ami tartalmazza a 8. igénypont szerinti polinukleotidot.
12. Gazdasejt, ami tartalmazza a 10. igénypont szerinti expressziós vektort.
13. Eljárás elcsendesített anti-CD28 ellenanyag előállítására, azzal jellemezve, hogy all. igénypont szerinti gazdasejtet olyan körülmények között tenyésztjük, amik alkalmasak az ellenanyag expresszálására, és az említett tenyészetből kinyerjük az expresszált ellenanyagot.
14. Eljárás elcsendesített anti-CD28 ellenanyag előállítására, azzal jellemezve, hogy a 12. igénypont szerinti gazdasejtet olyan körülmények között tenyésztjük, amik alkalmasak az ellenanyag expresszálására, és az említett tenyészetből kinyerjük az expresszált ellenanyagot.
15. Eljárás elcsendesített anti-CD28 ellenanyag előállítására, azzal jellemezve, hogy a 8. igénypont szerinti polinukleotidot bejuttatjuk egy gazdasejtbe;

a gazdasejtet olyan körülmények között tenyésztjük, amik alkalmasak az ellenanyag expresszálására; és az említett tenyészetből kinyerjük az expresszált ellenanyagot.
16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett polinukleotid tartalmaz legalább egyet az alábbi csoportból: 1. számú szekvencia, 2. számú szekvencia, 3. számú szekvencia és 4. számú szekvencia.
17. Eljárás elcsendesített anti-CD28 ellenanyag előállítására, azzal jellemezve, hogy a 10. igénypont szerinti polinukleotidot bejuttatjuk egy gazdasejtbe;

a gazdasejtet olyan körülmények között tenyésztjük, amik alkalmasak az ellenanyag expresszálására; és az említett tenyészetből kinyerjük az expresszált ellenanyagot.
18. Gyógyászati készítmény, ami tartalmazza az 1. igénypont szerinti elcsendesített anti-CD28 ellenanyagot, valamint tartalmaz egy gyógyászatilag elfogadható adalékanyagot.
19. Eljárás T-sejt tolerancia indukálására egy betegben, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti ellenanyagból hatékony mennyiséget juttatunk be egy betegnek, hogy a betegben T-sejt toleranciát indukáljunk.
20. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett beadás mellett más immunszuppresszánsokat is beadunk.
21. Eljárás immunszuppresszió biztosítására egy betegben, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti ellenanyagból hatékony mennyiséget adunk be, hogy immunszuppressziót biztosítsunk.
22. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett beadás mellett más immunszuppresszánsokat is beadunk.
23. Eljárás szerv- vagy szövet transzplantáció kezelésére egy betegben, azzal jellemezve, hogy az ellenanyagból hatékony mennyiséget adunk be, hogy az említett betegben kezeljük a szerv- vagy szövet-transzplantáció kilökődését.
24. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett beadás mellett más immunszuppresszánsokat is beadunk.
25. Ellenanyag, ami lehet HuTN228 és MuTN228, valamint ezek Fab fragmensei és F(ab')2 fragmens ei.

JppooOa

-ΓΛ λΛαΙ ifj. Szentpéteri Ádám «oljí xíío'ra— szabadalmi ügyvivő o az S.B.G. & K. Szabadalmi Ügyvivői Iroda ő _tagj_a

------------ H->‘ ír- Budapest, Andrássv út 113.

/OOfl 3 :: 461-1000 Fax: 46^{1 ,}