HUP0400663A2

HUP0400663A2 - Specifikus tumorantigének azonosítása cDNS-könyvtárak szérumokkal történő szelekciójával, és az antigének alkalmazása diagnosztikai képalkotó rendszerekben

Info

Publication number: HUP0400663A2
Application number: HU0400663A
Authority: HU
Inventors: Franco Felici; Olga Minenkova
Original assignee: Kenton S.R.L.
Priority date: 2001-07-26
Filing date: 2002-07-25
Publication date: 2005-01-28
Also published as: US20050084857A1; JP2005508616A; CA2454784A1; MXPA04000648A; KR20040035687A; EP1409537A2; WO2003010199A2; PL367619A1; WO2003010198A1; WO2003010199A3

Abstract

A találmány tárgya eljárás specifikus tumorantigének azonosításáracDNS-könyvtárak szérumokkal történő szelekciójával, amely szerint aszelekciót fágprezentációs módszerrel végzik, közelebbről a szelekcióta SEREX módszer (<serological analysis of autologous tumour antigensthrough expression of recombinant cDNA<) alkalmazásával végzik. Atalálmány szerinti eljárásban előnyösen kombinálják a SEREXmegközelítési módot a fent definiált fágprezentációs módszerhatékonyságával, és ugyanakkor elkerülik a SEREX módszer hátrányostulajdonságait. Ó

Description

ρο 4 0 0 6 6 3

100017-8932-LT

KÖZZÉTÉTELI

PÉLDÁNY

Specifikus tumorantigének azonosítása cDNS-könyvtárak szérumokkal történő szelekciójával, és az antigének alkalmazása diagnosztikai képalkotó rendszerekben

Az ismertetett találmány tárgya eljárás specifikus tumorantigének azonosítására 5 daganatoktól szenvedő alanyokból származó cDNS-könyvtárak szérumokkal történő szelekciójával, és különösen daganatok diagnózisára.

Az ismertetett találmány tárgya állati vagy emberi testen nem közvetlenül alkalmazott diagnosztikai segédeszközök előállítása.

Az ismertetett találmány tárgyát képezik vegyületek, eljárások azok előállítására, 10 eljárások azok alkalmazására, és az azokat tartalmazó készítmények, amelyek alkalmasak a gyógyászat területén történő ipari alkalmazásra.

Az ismertetett találmány tárgyát képezik a gyógyászati diagnosztika területén alkalmazható vegyületek, készítmények és eljárások, mint például képalkotó módszerek szervek és szövetek patológiás abnormalitásainak detektálására és diagnózisára.

Közelebbről, bár nem kizárólag, az ismertetett találmány tárgyköre a daganatdiagnosztika területére esik.

A korai diagnózis fontos és nagyon kívánatos cél a gyógyászat minden területén, különösen mert észrevehető javulást tesz lehetővé a páciensek életminőségében, valamint ezzel együtt járnak a nemzeti egészségügyi rendszer és magának a páciensnek a 20 megtakarításai.

A rendelkezésre álló diagnosztikai módszerek között napjainkban előnyben részesítik az úgynevezett nem invazív módszereket, és ezek között a különféle képalkotó módszereket, amelyek módot adnak arra, hogy lehetséges patológiás abnormalitások jelenlétét megállapítsuk anélkül, hogy a pácienst komplex, és néha fájdalmas vagy veszélyes 25 diagnosztikai vizsgálatoknak vetnénk alá, mint például amelyek minták és biopsziák vételét tartalmazzák.

A leggyakrabban alkalmazott képalkotó módszerek között megemlíthetjük a számítógépes tomográfiát (TC), mágneses rezonanciát (MR), ultrahangos vizsgálatokat (US) és szcintigráfiát (SC).

Ezek a képalkotó módszerek egyre hatékonyabb kontrasztanyagok alkalmazását teszik szükségessé. Azonban ezek fejlesztése egyedül a képek fokozott érzékenysége által megengedett anatómiai jellemzés javítását célozza, anélkül, hogy mindeddig sikerült volna a szöveti jellemzésre szolgáló jelspecifitás kifejlesztése. Habár manapság lehetséges akár

-2rendkívül kisméretű anatómiai sérülések láthatóvá tétele is, a megfigyelt sérülések természetének a meghatározása még mindig invazív típusú vizsgálatokat igényel.

Ezen probléma egy megoldása olyan kontrasztanyag kifejlesztése, amely képes szelektíven és specifikusan növelni a kontraszt mértékét a képen az egészséges szövet és a patológiás sérülések között.

Az ismert technológiák egy példája monoklonális ellenanyagok alkalmazása kontrasztanyagok hordozójaként, és ilyen irányú próbálkozások történtek az SC és MR területén. Míg az SC módszerekkel pozitív eredményeket értek el — amelyek azonban további javítást igényelnek —, az MR eredményei még mindig nem kielégítőek. Hasonlóképpen elvárható az US eredmények javításának a szükségessége.

Tumorantigének azonosítása új és jobb reagenseket biztosíthat célspecifikus kontrasztanyag („target-specific contrast media”, TSCM) előállításában. Ismertek többékevésbé specifikus tumorantigének, amelyeket daganatsejtek antigén-immunogénként történő alkalmazásával állítottak elő, ellenanyag stimulálásával laboratóriumi állatokban. Számos olyan tumorantigén is ismert, amely stimulálja maguknak a pácienseknek az ellenanyagtermelését (például p53, HER-2/neu). Az ilyen típusú antigének elvileg kiváló jelöltek egészséges és daganatos szövetek megkülönböztetésére szolgáló markerekként. Az azonosításuk azonban nehéz hagyományos eljárások alkalmazásával.

A cDNS-könyvtárak különféle típusú daganatoktól szenvedő páciensekből származó szérumokkal történő elemzésére (szkrínelésére) szolgáló eljárás, a SEREX [„serological analysis of autologous tumour antigens through the expression of recombinant cDNA”, lásd Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11810. old. (1995)] nemrégiben történt kifejlesztése nagyszámú tumorantigén azonosításához vezetett.

A SEREX technológia kétségtelenül hasznos új tumorantigének azonosítására, de számos hátránnyal is jár, a könyvtárak szkrínelésének nagyon munkaigényes természete, a háttérzaj magas szintje és a szükséges nagy mennyiségű anyag miatt.

1993 óta, amikor az első tumorantigént (szénsav-anhidráz) jellemezték, több mint 600 különböző, specifikusan daganatokban expresszálódó fehérjét azonosítottak, amely ellen immunválasz alakul ki (M. Pfreundschuch és mtsai., „Cancer Vaccine Week, International Symposium”, 1998. október 5-9., S03) , és ez a szám várhatóan tovább fog emelkedni [mindeddig a SEREX adatbázis 1695 publikus szekvenciát tartalmaz (www.licr.org/SEREX.html)]. Érdemes megjegyezni, hogy az izolált szekvenciák 20-30%-a még mindig ismeretlen géntermék.

- 3 További kutatások szükségesek azonban ahhoz, hogy javítsuk a daganatok diagnózisára és kezelésére alkalmas specifikus tumorantigének azonosítására szolgáló módszereket.

Azt találtuk, hogy a SEREX módszer és a fágprezentáció — amely egy olyan stratégia, amely olyan könyvtárak szelekcióján alapul, amelyekben kis fehérjedoméneket prezentálunk bakteriofágok felszínén, amelyekben benne található a hozzájuk tartozó genetikai információ — kombinációja cDNS-könyvtárak szérumokkal történő szelekcióján alapuló, specifikus tumorantigének azonosításra szolgáló eljárást eredményez. Ezen eljárás alkalmazása lehetővé teszi antigének azonosítását nagyon nagy könyvtárakból (azaz amelyek nagyszámú különböző szekvenciát expresszálnak). Az így azonosított antigének alkalmazhatók kontrasztanyag előállítására, vagy kontrasztanyag előállítására alkalmazható specifikus ligandumok előállítására.

Tehát az ismertetett találmány célja eljárás specifikus tumorantigének azonosítására cDNS-könyvtárak szérumokkal történő szelekciójával, amely eljárás szerint a szelekciót fágprezentációs módszerrel hajtjuk végre.

Az ismertetett találmány célja eljárás biztosítása daganatos sérülések diagnosztikájában alkalmazható kontrasztanyag előállítására használható tumorantigének azonosítására, valamint az így kapott kontrasztanyag.

A kontrasztanyagot a szakterületen jól ismert szokásos eljárásokkal állíthatjuk elő, amihez nincs szükség további magyarázatra.

Az ismertetett találmány magában foglalja cDNS-könyvtárak előállítását (előnyösen friss) biopsziákból és tenyésztett daganatos sejtvonalakból nyert daganatsejtekből, az ilyen könyvtárak szelekcióját (szkrínelését) autológ vagy heterológ páciens-szérumokkal tumorantigének, beleértve új tumorantigének azonosítása végett, az antigének jellemzését, specifikus ligandumok létrehozását a tumorantigénekre (például ellenanyagokat, mint például rekombináns humán ellenanyagokat vagy humanizált rekombináns egér ellenanyagokat), és a létrehozott ligandumokat tartalmazó célspecifikus kontrasztanyagok előállítását.

A találmány szerinti eljárásban előnyösen kombináljuk a SEREX megközelítési módot a fent definiált fágprezentációs módszer hatékonyságával, és ugyanakkor elkerüljük a SEREX módszer fent ismertetett hátrányos tulajdonságait.

A „fágprezentáció” kifejezés alatt a szakember számára ismert módszert értjük, amely egy olyan stratégia, amely olyan könyvtárak szelekcióján alapul, amelyekben kis

-4fehérjedoméneket prezentálunk bakteriofágok felszínén, amelyekben benne található a hozzájuk tartozó genetikai információ.

A találmány szerint megvalósított eljárás elsőként biztosít új és előnyös elemzési lehetőségeket:

— kisebb mennyiségű szérum alkalmazása tumorantigének azonosítására, daganatoktól szenvedő páciensekből származó könyvtár szkrínelés előtti szelekciójával, oly módon, hogy csökkentsük a komplexitásukat, dúsítva azokat a kiónokat, amelyek a specifikus antigéneket expresszálják;

— a technikai nehézségek miatt a cDNS-könyvtárak közvetlen szkrínelése — amint azt a technika állása szerinti módszerrel megvalósítják — nem teszi lehetővé nagyszámú (megközelítőleg több mint egymillió) klón elemzését, és ily módon alkalmatlan a rekombináns DNS technológia teljes potenciáljának a kihasználására. A találmány szerinti eljárással valójában lehetséges a SEREX-ben hagyományosan alkalmazottaknál 10-100-szor nagyobb könyvtárak előállítása és elemzése, ily módon növelve azoknak az antigéneknek az azonosítási valószínűségét is, amelyek korlátozott mértékben vannak jelen;

— végezetül további szelekciós ciklusok alkalmazásának a lehetősége különböző páciensek szérumának vagy szérumok keverékének az alkalmazásával elősegíti keresztreaktív tumorantigének azonosítását, amely az ismertetett találmány fő célkitűzését képviselik.

Egy nem irányított módon klónozott cDNS-könyvtárban az várható, hogy a termelt fehérjék megközelítőleg egyhatoda (16,7%-a) lesz korrekt. Az ilyen típusú könyvtár valódi transzlációs termékekre történő dúsítása az expressziós/prezentációs könyvtárak fő feladata. Az ismertetett találmány tárgya továbbá egy új vektor cDNS expresszáltatására és a fehérjék fúziós fehérjeként történő prezentálására a lambda bakteriofág D-fehérjéjének (pD) aminnoterminális részletével fuzionáltatva, a nem fázisban lévő fehérjék expressziójának korlátozásával. A vektor szerkesztése szerint a fág csak akkor prezentálja a fehérjét a felszínén, ha az ORF-ja (’’nyílt leolvasási fázis”) megegyezik a pD-ével. A könyvtárainkba klónozott DNS fragmenseinek az átlagos mérete 100-600 b.p. (bázispár), és statisztikai okok miatt a legtöbb nem fázisban lévő szekvencia nem teszi lehetővé a pD transzlációját és a fág felszínén történő prezentációját. Ebben az esetben a vad típusú gpD lambda genomban található másolata lehetővé teszi a kapszid összeállítódását. A cDNS-könyvtárak expresszáltatására szolgáló új expressziós/prezentációs vektor (λΚΜ4) annyiban különbözik a SEREX kísérletekben alkalmazottaktól (Xgtll), hogy a cDNS-fragmens által kódolt rekombináns fehérje a bakteriofág egy fehérjéjével fuzionáltatva expresszálódik, és ily módon prezentálódik a kapszidon.

- 5 Az egyes könyvtárak esetében megfelelő számú sejt, például 10⁷ sejt hírvivő RNS-ét tisztítjuk meg kereskedelmi forgalomban kapható eszközökkel, amelyekből a megfelelő cDNS-t előállítottuk. Az utóbbit azután a λΚΜ4 expressziós/prezentációs vektorba klónozzuk. A könyvtárak amplifíkációját a szakember számára a szakterületen ismert szokásos módszerekkel hajtjuk végre, például szélesztéssel, tenyésztéssel, elúcióval, tisztítással és koncentrálással.

A könyvtárakat azután a szelekcióhoz, szkríneléshez és az azonosított szekvenciák jellemzéséhez szükséges körülmények megállapítására alkalmazzuk.

A humán sejtekből származó cDNS alkalmazásával előállított fágprezentációs típusú könyvtár lehetővé teszi az affinitási szelekció kihasználását, amely specifikus szérumoknak olyan bakteriofágok gyűjteményeivel való inkubálásán alapszik, amelyek humán fehérjék (általában daganatokban expresszált fehérjék) részleteit expresszálják a kapszidjukon, és amelyek tartalmazzák az azokhoz tartozó genetikai információt. Azok a bakteriofágok, amelyek specifikusan kötik a szérumban található ellenanyagokat, könnyen visszanyerhetek, mivel kötve maradnak (az ellenanyagok révén) a szilárd hordozóhoz; másrészről a nem specifikusak lemosódnak.

Az egyedi fágklónok egy adott szérumban található ellenanyagokhoz való kötőképességének a „szkrínelését”, azaz közvetlen elemzését csak egy későbbi szakaszban hajtjuk végre, amikor a könyvtár komplexitása (azaz a különböző szekvenciák száma) lényegesen lecsökkent a szelekció eredményeképpen.

A szelekciós stratégiák alkalmazása lehetővé teszi nagyszámú különböző fehérjeszekvencia gyorsabb elemzését, azoknak az azonosítása céljából, amelyek egy adott tulajdonsággal rendelkeznek, például specifikus kölcsönhatásba lépnek daganatos páciensek szérumában jelen lévő ellenanyagokkal.

Az affinitási szelekció specifikus szérumok szelekcióján alapszik olyan bakteriofágok gyűjteményével, amelyek humán fehérjék (általában daganatokban expresszált fehérjék) részleteit expresszálják a kapszidjukon, és amelyek tartalmazzák az azokhoz tartozó genetikai információt. Azok a bakteriofágok, amelyek specifikusan kötik a szérumban található ellenanyagokat, könnyen visszanyerhetek, mivel kötve maradnak (az ellenanyagok révén) a szilárd hordozóhoz; másrészről a nem specifikusak lemosódnak.

-6Ez lehetővé teszi a munkaterhelés csökkentését, és — mindenekfelett — kisebb mennyiségű szérum alkalmazását az egyes elemzésekben.

A klasszikus cDNS-könyvtár közvetlen „szkrínelése” valójában nagy mennyiségű szérum alkalmazásával jár együtt, amelyet nem mindig könnyű megszerezni. A megközelítőleg 10⁶ független kiónt tartalmazó könyvtár elemzéséhez az előre kiszelektált (autológ) szérumot számos szűrővel inkubálhatjuk, amelyek összesen legalább 10⁶ darab, a fertőzött baktériumokat tartalmazó petri-csészékről átvitt fág-tarfoltot tartalmaznak. Ugyanennek a könyvtárnak egy másik szérummal történő elemzése csak akkor lehetséges, ha az amplifikált könyvtárat alkalmazzuk, ami 10⁶ kiónt elemzését, az eredeti könyvtár komplexitásának az elvesztését, vagy a szkrínelést 10-100-szoros kiteijesztését, és 10⁷-10⁸klón tesztelését jelenti.

Ezenfelül ez a stratégia nem teszi lehetővé olyan antigének azonosítását, amelyek a könyvtárnak csak kis részében vannak jelen, vagy amelyeket alacsony koncentrációban jelen lévő ellenanyagok ismernek fel, és nem teszi lehetővé több elemzés végrehajtását különböző szérumokkal.

Ezzel szemben a fágprezentációs típusú könyvtár alkalmazása lehetővé teszi a kis térfogatban (0,1-1 ml) végrehajtott affinitás! szelekciót a közvetlen szkrínelést megelőzően, összesen az amplifikált könyvár 10¹⁰-10ⁿ fágrészecskéjéből és korlátozott mennyiségű, mint például 10 μΐ szérumból kiindulva. Ily módon kényelmesen dolgozhatunk a klasszikus könyvtárnál 10-100-szor nagyobb komplexitású könyvtárral, ennek következtében növelhetjük a nehéznek tekintett antigének azonosításának a valószínűségét. Például amikor két szelekciós ciklust és egy szkrínelést hajtunk végre 82 mm-es szűrőkön, a teljes szérumfelhasználás összesen csupán 40 μΐ lehet.

Ezenfelül fontos megjegyezni, hogy a fágprezentációs típusú könyvtár elemzését potenciálisan nagyszámú különböző szérummal elvégezhetjük. Ily módon lehetséges olyan szelekciós stratégiák alkalmazása, amelyek előnyben részesítik azoknak az antigéneknek az azonosítását, amelyek azonos típusú daganatot hordozó különböző páciensek szérumában jelen lévő ellenanyagokkal lépnek kölcsönhatásba (keresztereagáló antigének).

Különféle protokollokat adaptálhatunk különböző szilárd hordozók alkalmazása függvényében. Ezek a protokollok ismertek a területen járatos szakember számára.

Különféle protokollokat alkalmazhatunk különböző szilárd hordozók alkalmazása függvényében, mint például:

— Sepharose·, a fágokhoz kötődött szérum-ellenanyagok protein-A-val bevont Sepharose gyantához kapcsolódnak, amely specifikusan felismeri az immunglobulinokat. Ezt a gyantát rövid centrifugálásokkal moshatjuk a nem specifikus komponensek eltávolítására;

— mágneses gyöngyök: a szérum-ellenanyagokat a kötődött fágokkal olyan mágneses gyöngyök alkalmazásával nyerhetjük vissza, amelyek humán anti-IgC poliklonális ellenanyagokkal van bevonva. Ezeket a gyöngyöket mossuk, és a kémcső falához kapcsoljuk azokat mágnes alkalmazásával;

— petri-csészék: a szérum-ellenanyagokot a kötődött fágokkal olyan petri-csészéhez kapcsoljuk, amelyet előzőleg protein-A-val vontunk be. A csészét egyszerűen a mosóoldat leszívásával mossuk.

A találmányt ezután részletesebben illusztráljuk példák és ábrák alkalmazásával. Az 1. ábrán a λΚΜ4 vektor térképét mutatjuk be.

Példa

Fágok és plazmidok:

A pGEX-SN plazmidot a K108 5’-GATCCTTACTAGTTTTAGTAGCGGCCGCGGG-3’ és KI09 5’-AATTCCCGCGGCCGCTACTAAAACTAGTAAG-3’ szintetikus oligonukleotidok hibridizálásából származó DNS-fragmensnek a pGEX-3X plazmid BamHI és EcoRI helyeire történő beklónozásával állítottuk elő [Smith, D. B. és Johnson, K. S., Gene 67, 31-40. old. (1988)].

A pKM4-6H plazmidot a KI 06 5’-GACCGCGTTTGCCGGAACGGCAATCAGCATCGTTCACCACCACCACCACCACTAATAGG-3’ és KI07 5’-AATTCCTATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAACGATGCTGATTGCCGTTCCGGCAAACGCG-3’ szintetikus oligonukleotidok hibridizálásából származó DNS-fragmensnek a pKM4 plazmid RsrII és EcoRI helyeire történő beklónozásával állítottuk elő.

Affinitási szelekció

Falcon csészéket (6 cm, Falcon 1007) vontunk be éjszakán keresztül 4 C-on 3 ml 1 pg/ml protein-A-val (Pierce, #21184) NaHCO₃ pufferben (50 mM, pH 9,6). A bevonó oldat eldobása után a csészéket 10 ml blokkoló oldattal (5% tejpor lx PBS pufferben, 0,05% Tween 20) inkubáltuk 2 órán keresztül 37 °C-on. 10 pl humán szérumot előinkubáltunk 30 percen keresztül 37 °C-on óvatos rázatás mellett 10 pl BB4 bakteriális extraktummal és 10 μΐ 1 M MgSO₄-el 1 ml blokkoló oldatban. Megközelítőleg a könyvtár 10¹⁰ fágrészecskéjét adtuk a szérumoldathoz további 1 órán keresztül 37 °C-on óvatos rázatás mellett. Az inkubációs keveréket protein-A-val bevont csészékre szélesztettük, és 30 percen keresztül

-8szobahőmérsékleten hagytuk. A csészéket többször leöblítettük 10 ml mosóoldattal (lx PBS, 1% Triton, 10 mM MgSO4). A kötődött fágokat közvetlenül a csészére adott BB4 sejtek megfertőzésével nyertük vissza (600 μΐ csészénként). 10 ml megolvasztott NZY-Top Agar-t (48-50 °C) adtunk a fertőzött sejtekhez, és azonnal NZY csészékre (15 cm) öntöttük. A következő napon a fágokat összegyűjtöttük a csészéknek 15 ml SM pufferrel történő rázatásával 4 órán keresztül 4 °C-on. A fágokat PEG és NaCl kicsapással megtisztítottuk, és az SM tápközeg eredeti térfogatának egytizedében tároltuk 0,05% nátrium-aziddal 4 °C-on. Immunológiai szkrínelés

A bakteriális tápközeg fág-tarfoltjait átvittük száraz nitrocellulóz szűrőkre (Schleicher & Schuell) 1 órán keresztül 4°C-on. A szűrőket 1 órán keresztül blokkoltuk szobahőmérsékleten blokkoló pufferben (5% tejpor Ix PBS pufferben, 0,05% Tween 20). 20 μΐ humán szérumot előinkubáltunk 20 μΐ BB4 bakteriális extraktummal, 10⁹/ml vad típusú lambda fággal 4 ml blokkoló pufferben. A blokkoló oldat eldobása után a szűrőket szérumoldatokkal inkubáltuk 2 órán keresztül szobahőmérsékleten rázatás mellett. A szűrőket többször megmostuk Ix PBS, 0,05% Tween 20 pufferrel, és alkalikus foszfatázzal konjugált humán anti-IgG másodlagos ellenanyagokkal (Sigma A 2064) inkubáltuk 1:5000 arányban hígítva. Azután a szűrőket mostuk mint fent, és röviden leöblítettük szubsztrát pufferrel (100 mM Tris-HCl, pH 9,6, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂). Mindegyik szűrőt 10 ml szubsztrát pufferrel inkubáltunk, amely 330 mg/ml nitro-kék-tetrazóliumot és 165 mg/ml 5-bromo-4kloro-3-indolilfoszfátot tartalmazott. A reakciót vizes mosással állítottuk le.

Lambda fág nagy mennyiségben történő előállítása (lizogén sejtekből)

A BB4 sejteket OD₆₀₀ = 1,0 értékig felnövesztettük 0,2% maltózt tartalmazó LB tápközegben rázatás mellett, centrifugálással visszanyertük és újra felszuszpendáltuk SM pufferben OD₆₀o = 0,2 értékre. 100 μΐ sejtet megfertőztünk kis mennyiségű fertőző egységgel („multiplicity of infection”), 20 percen keresztül inkubáltuk szobahőmérsékleten, ampicillint tartalmazó LB-agarra szélesztettük, és 18-20 órán keresztül inkubáltuk 32 °C-on. A következő napon egyetlen kolóniát inkubáltunk 10 ml, ampicillint tartalmazó LB tápközegben egy éjszakán keresztül 32 °C-on rázatás mellett. 500 ml, ampicillint és 10 mM MgSO₄-et tartalmazó friss LB tápközeget beoltottunk az éjszakán keresztüli tenyészet 5 ml-ével egy nagy lombikban, és 32 °C-on ODőoo = 0,6 értékig növesztettük erőteljes rázatás mellett. A lombikot 15 percen keresztül inkubáltuk vízfürdőben 45 °C-on, majd 37 °C-on inkubáltuk rázógépben 3 órán keresztül. 10 ml kloroformot adtunk a tenyészethez a sejtlízis elvégzésére, és a keveréket további 15 percen keresztül inkubáltuk rázógépben 37 °C-on. A fágot a lizált tenyészetből szokásos eljárások szerint tisztítottuk meg [Sambrook, J., Fritsch, E. F. és

-9Maniatis, T., „Molecular Cloning”, kiad.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989)].

Az ELISA-hoz szükséges fáglizátumokat hasonló eljárással állítottuk elő a lizogén sejtekből, csak kloroform hozzáadása nélkül. NaCl és PEG kicsapás után a bakteriofágcsapadékot újra felszuszpendáltuk az SM puffer/nátrium-azid (0,05%) kiindulási térfogatának egytizedében , és 4 °C-on tároltuk.

Lambda ELISA

Mikrotiterlemezeket (Immunoplate Maxisorb, Nunc) vontunk be éjszakán keresztül 4 °C-on 100 μΐ/mérőhely anti-lambda poliklonális ellenanyagokkal 0,7 μg/ml koncentrációban NaHCO₃ 50 mM, pH 9,6 pufferben. A bevonó oldat eldobása után a lemezeket 250 μΐ blokkoló oldattal (5% tejpor lx PBS pufferben, 0,05% Tween 20) inkubáltuk. A lemezeket azután kétszer megmostuk mosópufferrel (lx PBS, Tween 20). Blokkoló puffer és fáglizátum keverékének (1:1) 100 μΐ-ét adtuk a mérőhelyekhez, és 1 órán keresztül inkubáltuk 37 °C-on. 1 μΐ humán szérumot inkubáltunk 30 percen keresztül szobahőmérsékleten 10⁹ tarfolt-alkotó egységnyi (pfu) λΚΜ4 fággal, 1 pl nyúlszérummal, 1 μΐ BB4 extraktummal, 1 μΐ FBS-sel 100 μΐ blokkoló pufferben. A lemezeket a fáglizátummal történő inkubálás után megmostuk, és 60 percen keresztül inkubáltuk a szérumoldattal 37 °C-on. Aután a lemezeket megmostuk, és HRP-vel konjugált kecske anti-humán ellenanyagot (Jackson ImmunoResearch Laboratories) adtunk a mérőhelyekhez 1:20000 hígításban blokkoló puffer/másodlagos ellenanyag keverékben (1:40 nyúlszérum blokkoló oldatban). 30 perc inkubálás után a lemezeket megmostuk, és megmértük a peroxidáz aktivitást 100 μΐ folyadék TMB szubsztrát rendszer (Sigma) hozzáadásával. 15 perc előhívás után a reakciót 25 μΐ 2 M H₂SO₄ hozzáadásával állítottuk le. A lemezeket leolvastuk automata ELISA mikrotiterlemez-leolvasóval, és az eredményeket A = Aisonm - A6₂onm értékként fejeztük ki. Az ELISA adatokat két független mérés átlagértékeként mértük.

A 1KM4 előállítása

A pNS3785 plazmidot (Hoess, 1995) inverz PCR-rel amplifikáltuk az Xbal és AvrII helyeket (aláhúzva) hordozó KT1 5’-TTTATCTAGACCCAGCCCTAGGAAGCTTCTCCTGAGTAGGACAAATCC-3’ és Xbal helyet hordozó KT2 5 ’-GGGTCTAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTC-3 ’ oligonukleotid-szekvenciákkal a lambda fágba történő azt követő klónozás céljából. Az inverz PCR-ben Taq-polimeráz és Pfu DNSpolimeráz keverékét alkalmaztuk a DNS-szintézis pontosságának a növelése érdekében. 25 amplifikációs ciklust hajtottunk végre (95 °C — 30 mp, 55 °C — 30 mp, 72 °C — 20 perc). Az Xbal enzimmel előzőleg megemésztett PCR-termék saját magával való ligálása a pKM3

- 10plazmidot eredményezte. A lambda pD gént PCR-rel amplifíkáltuk a pNS3785 plazmidból az Ncol, Spel, Notl restrikciós helyeket (aláhúzva) tartalmazó K51 5’-CCGCCTTCCATGGGTACTAGTTTTAAATGCGGCCGCACGAGCAAAGAAACCTTTAC-3’ és K86 5’-CTCTCATCCGCCAAAACAGCC-3’ láncindítók alkalmazásával. A PCR-terméket megtisztítottuk, megemésztettük Ncol és EcoRI restrikciós endonukleázokkal, és újra klónoztuk a pKM3 plazmid Ncol és EcoRI helyeire, ami a pKM4 plazmidot eredményezte, amely csak az Spel és Not I restrikciós helyeket tartalmazza a gpD 5’ végén. A plazmidot megemésztettük Xbal enzimmel, és a ZDaml5imm21nin5 lambda fág (Hoess, 1995) Xbal helyére klónoztuk (1. ábra).

cDNS-könyvtár előállítása mRNS-t izoláltunk 10⁷ MCF-7 sejtből (TI könyvtár) vagy 0,1 g tömör daganat mintából (T4 könyvtár), a QuickPrep Micro mRNA Purification Kit (Amersham Pharmacia Biotech) alkalmazásával, a gyártó utasításait követve. Kétszálú cDNS-t szintetizáltunk 5 pg poli(A)+ RNS-ből a TimeSaver cDNA Synthesis Kit (Amersham Pharmacia Biotech) alkalmazásával. A véletlenszerűen címkézett láncindítást korábban ismertetett módon hajtottuk végre (Santini, 1986). 500 ng kétszálú cDNS-ből a cDNS első szálát az 5’GCGGCCGCTGG(N)₉-3’ véletlenszerűen címkézett láncindítóval szintetizáltuk meg, és a cDNS második szálát az 5’-GGCGGCCAAC(N)₉-3’ láncindító alkalmazásával. A végső cDNS-teméket három különböző olvasási fázisban Spel helyet és Notl helyet hordozó oligonukleotidok alkalmazásával amplifíkáltuk fel a λΚΜ4 lambda vektorba történő klónozás elősegítésére (5’-GCACTAGTGGCCGGCCAAC-3’, 5’-GCACTAGTCGGCCGGCCAAC3’, 5’-GCACTAGTCGGGCCGGCCAAC-3’ és 5’-GGAGGCTCGAGCGGCCGCTGG-3’). A PCR-termékeket megtisztítottuk Qiaquick oszlopokon (Quiagen) és átszűrtük Microcon 100 oszlopon (Amicon), hogy elimináljuk a kis DNS-fragmenseket, megemésztettük Spel és Notl restrikciós enzimekkel, és fenolos extrahálás után megint átszűrtük Microcon 100 oszlopon.

A λΚΜ4 vektort megemésztettük Spel/NotI enzimekkel és defoszforiláltuk, és 8 ligációs elegyet állítottunk elő az egyes könyvtárakhoz, amelyek mindegyike 0,5 mg vektort és megközelítőleg 3 ng inzertet tartalmazott. Éjszakán keresztül 4 °C-on történő inkubálás után a ligációs elegyeket in vitro lambda pakoló reagenskészletbe pakoltuk (Ready-To-GoTM Lambda Packaging Kit, Amersham Pharmacia Biotech), és 100 darab 15 cm-es NZY csészére szélesztettük fedőagarban. Éjszakán keresztül történő inkubálás után a fágokat a csészékről SM pufferrel eluáltuk, megtisztítottuk, betöményítettük, és -80 °C-on tároltuk 7% DMSO SM pufferben.

- 11 A két könyvtár komplexitását az inzertet tartalmazó összes független klón számaként számítottuk, ami 10⁸ volt a TI könyvtár esetében és 3,6 x 10⁷ volt a T4 könyvtár esetében.

Affinitási szelekció

Specifikus tumorantigének azonosítása érdekében két különböző affinitási szelekciós eljárást alkalmaztunk. Az első két pásztázási („panning”) ciklust tartalmazott pozitív szérummal (azaz daganatos kórképben szenvedő pácienstől származó szérummal), majd immunológiai szkrínelő eljárás végrehajtása következett ugyanazzal a szérummal, vagy más megoldásképpen kiválasztott fágok keverékéből véletlenszerűen vett kiónok elemzésével. Egy második eljárásban különböző szelekcióra alkalmazott páciensekből származó szérumok keverékét alkalmaztuk a pásztázásra és szkrínelésre is, a keresztreagáló ellenanyagok szelekciója hatékonyságának a növelésére.

ATI könyvtárat 10 pozitív szérummal (B9, Bll, B13, B14, B15, B16, B17, B18, B19 és B20) szelektáltuk, egyetlen szelekciós ciklus után előállítva a megfelelő p9*, pl l¹, pl3*, plá¹, pl5\ pló¹, pl?¹, pl8¹, pl9^r és p20^! készleteket. Azután mindegyik készletet egy második affinitási szelekciónak vetettük alá ugyanazzal a szérummal, a fent említett első stratégia szerint, létrehozva készletek egy második sorozatát (amelyeket p9ⁿ, pllⁿ, pl3ⁿ, pl4ⁿ, p!5ⁿ, pl6ⁿ, pl7ⁿ, pl8ⁿ, pl9ⁿ és p20ⁿ néven nevezünk). Az ELISA-ban tesztelt készletek némelyike megnövekedett reaktivitást mutatott a megfelelő szérummal, megerősítve a könyvtár- és affinitási szelekciós eljárás hatékonyságát. A megnövekedett reaktivitású egyedi készletekből (p9ⁿ, pl3ⁿ, pl5ⁿ, p!9ⁿ, p20ⁿ) származó kiónokat izoláltunk a szelekcióra alkalmazott szérumokat alkalmazó immunológiai szkríneléssel.

A fent említett második eljárást a pl3ⁿ készletre alkalmaztuk, amelyet egy harmadik szelekciós menetnek vetettünk alá szérumok keverékével, amely nem tartalmazta a B13-at (Bll, B14, B15, B16, B17, B18, B19 és B20), és ily módon keresztreaktív kiónokat szelektáltunk ki. A kapott készletet (pl3ⁱⁿ) megvizsgáltuk ELISA-val a pásztázáshoz alkalmazott szérumkeverékkel. A készletből származó egyedi kiónokat ΔΒ13 keverékkel (Bll, B14, B15, B16, B17, B18, B19 és B20) történő immunológiai szkríneléssel izoláltuk, ami lehetővé tette további pozitív kiónok izolálását.

Az affinitási szelekciós kísérleteket elvégeztük a T4 könyvtárral is (és a TI könyvtárral különböző szérumok alkalmazásával) az itt ismertetett módszer alkalmazásával. Többszörös immunológiai elemzés („pick-blot” elemzés.)

Az immunológiai szkrínelésben pozitív egyedi fágklónokat izoláltuk, és az eluált fágokat 15 cm-es csészékben található baktériumpázsiton tenyésztettük rácsba rendezve leoltva. A tarfoltokat átvittük nitrocellulóz membránokra és különböző pozitív és negatív

- 12szérumokkal elemeztük. Az eljárás erőteljesebbé és reprodukálhatóvá tétele céljából Genesys Tékán robotrendszert alkalmaztunk a fágok lemezekre való kiszedésére, ami maximum 396 egyedi klón elemzését tette lehetővé 11 x 7,5 cm-es membránon, vagy kevesebb kiónt ismételve szedtünk ki ugyanarra a lemezre a membrán kisebb darabokra történő 5 feldarabolásával, mielőtt inkubáltuk a szérumokkal.

A pozitív kiónok jellemzése

Megszekvenáltuk azokat a kiónokat, amelyek többféle reaktivitást vagy nagyobb specifitást mutattak a daganatos páciensek szérumával szemben egészséges donorokéval összehasonlítva, és összehasonlítottuk jelenleg hozzáférhető szekvenciák különböző 10 adatbázisaival (’Non-Redundant Genbank CDS’, ’Non-Redundant Database of Genbank Est Division’, ’Non-Redundant Gen-bank+EMBL+DDBJ+PDB Sequences’).

A kapott szekvenciákat hat csoportba lehet sorolni:

— ismert emlődaganat antigének epitópjait kódoló szekvenciák;

— ismert szekvenciák, amely emlődaganattól különböző tumorantigének epitópjait 15 kódolják;

— autoantigéneket kódoló szekvenciák;

— olyan ismert fehérjéket kódoló szekvenciák, amelyekről nem volt ismert, hogy kapcsolatban állnak daganatokkal vagy autoimmun betegségekkel;

— ismeretlen fehérjéket kódoló szekvenciák (például EST);

— új szekvenciák, amelyek nem találhatók meg az adatbázisokban.

különböző szekvenciát azonosítottuk a TI könyvtárból (TI-1-től Tl-115-ig), amelyek 13%-a ismeretlen fehérje volt, és 16%-a nem volt megtalálható az adatbázisokban. 21 különböző szekvenciát azonosítottuk a T4 könyvtárból (T4-l-től T4-38-ig), amelyek 40%a nem volt megtalálható az adatbázisokban. Az alábbi táblázatban szemléltetésként a 25 kiszelektált kiónok némelyikének a szekvenciáját mutatjuk be:

Klón neve	Szekvencia	Azonosító	Osztályozás
Tl-2	ATGGGTACTAGTCGGCCGGCCAACATC ACTCCCACCAATACAATGACTTCTATG AGAACTACAACCTATTGGCCCACAGCC ACAATGATGGAACCACCTTCATCCACT GTATCAACTACAGGCAGAGGTCAGACC	intesztinális mucin	tumorantigén

	ACCTTTCCAGCTCTACAGCCACATTCCC CAATACCAAACACCCCAGCGGCCGC
Tl-17	ATGGGTACTAGTCGGGCCGGCCAACTT GTTGAAGAACTGGATAAAGTGGAATCT CAAGAACGAGAAGATGTTCTGGCTGGA ATGTCTGGAAAATCCTCTTTCCAAAGAT CTGAAGGAGATTTTCTTTTAAGATCATT GACCAGCGGCCGC	DNStopoizomeráz-II béta	Tumorantigén — rosszindulatú mezotelióma
Tl-8	ATGGGTACTAGTGGCCGGCCAACAAGG CAGCTGGAAGAGGTTCTCAAATTAGAT CAAGAAATGCCTTTAACAGAAGTGAAG AGTGAACCTGAGGAAAATATCGATTCA AACAGTGAAAGTGAAAGAGAAGAGAT AGAATTAAAATCTCCGAGGGGACGAAG GAGAATTGCTCGAGATCCCAGCGGCCG C	RBP-1	Tumorantigén — emlőrák
Tl-6	ATGGGTACTAGTCGGGCCGGCCAACTT GAGGAGCTGCAGAAGAAATACCAGCA AAAGCTAGAGCAGGAGGAGAACCCTG GCAATGATAATGTAACAATTATGGAGC TACAGACACAGCTAGCACAGAAGACGA CTTTAATCAGTGATTCGAAATTGAAAG AGCAAGAGTTCAGAGAACAGATTCACA ATTTAGAAGACCGTTTGAAGAAATATG AAAAGAATGTATATGCAACAACTGTGG GGACACCTTACAAAGGTGGCAATTTGT ACCATACGGATGTCTCACTCTTTGGAG AACCTACCAGCGGCCGC	Golgin p245	Autoantigén
Tl-101	ATGGGTACTAGTCGGCCGGCCAACTTC GTGGAAATCAGTGAAGATAAAACTAAA ATCAGAAGGTCTCCAAGCAAACCCCTA CCTGAAGTGACTGATGAGTATAAAAAT GATGTAAAAAACAGATCTGTTTATATT	Humán lupusz Lafehérje	Autoantigén _

	AAAGGCTTCCCAACTGAAGCCAGCGGC CGC
Tl-52	GTGGCCGGCCAACGTTATCAGAGTAGA AGTGGGCATGATCAGAAGAATCATAGA AAGCATCATGGGAAGAAAAGAATGAA AAGTAAACGATCTACATCATTGTCATCT CCCAGAAACGGAACCAGCGGCCGC	p53 kötőfehérje	Ismeretlen tumorantigénként
Tl-35	ATGGGTACTAGTCGGGCCGGCCAACAA ATTAGGCAGATTGAGTGTGACAGTGAA GACATGAAGATGAGAGCTAAGCAGCTC CTGGTTGCCTGGCAAGATCAAGAGGGA GTTCATGCAACACCTGAGAATCTGATT AATGCACTGAATAAGTCTGGATTAAGT GACCTTGCAGAAAGTCCCAGCGGCCGC	Nukleáris mátrixprotein	Ismeretlen tumorantigénként
Tl-10	ATGGGTACTAGTGGCCGGCCAACGGCA GTAGTTCTGGAAAAGCCACTGGGGACG AGACAGGTGCTAAAGTTGAACGAGCTG ATGGAGCTTCATGGTGAAGGCAGTAGT TCTGGAAAAGCCACTGGGGACGAGACA GGTGCT AAAGTTGAACGAGCT GATGGA ATGACCCCCAGCGGCCGC	Riboszómális s3a fehérje	Ismeretlen tumorantigénként
Tl-39	ATGGGTACTAGTGGCCGGCCAACGAAT TATTCGAGTGCTATAGGCGCTTGTCAG GGAGGTAGCGATGAGAGTAATAGATAG GGCTCAGGCGTTTGTTGATGAGATATTT GGAGGTGGGG ATGATGC AC AT AATTTG AATCAACACAACTCCAGCGGCCGC	Nincs adat
Tl-12	ATGGGTACTAGTCGGGCCGGCCAACGT GGT ATT ATTT A AAAAT AGCT A AA AAGG TAAACAATCCAAATGCCATTAAACAGA GAATTTTAAAAAATGAGATACTACACA GCAACAAAAACCTATGAGCTAATGCTA GATGCAACAACACAGACCAGCGGCCGC	Nincs adat

Tl-32	ATGGGTACTAGTCGGGCCGGCCAACTA CACGCCTTTCCACTC CACTCTACTACACTCTACTACACTACAC CCAGCGGCCGC	Nincs adat
Tl-74	ATGGGTACTAGTCGGCCGGCCAACAGA GAAGCTAAGCAACTGCATCATCAGCCA CATTCAATCGAATTAATACAGTCCAGC GGCCGC	EST
T4-2	ATGGGTACTAGTCGGCCGGCCAACTCA GAGGTGTATAAGCCAACATTGCTCTAC TCCAGCGGCCGC	EST
T4-11	ATGGGTACTAGTGGCCGGCCAACGGTT GGTTTTACTCTAGATTTCACTGTCGACC CACCCAGC GGCCGC	EST
T4-19	ATGGGTACTAGTCGGGCCGGCCAACTA TACCGTACAACCCTAACATATACCAGC GGCCGC	Nincs adat
T5-8	ATGGGTACTAGTCGGGCCGGCCAACAG AGAGAGCAAGAAAAGAAAAGAAGCCC TCAAGATGTTGAAGTTCTCAAGACAAC TACTGAGCTATTTCATAGCAATGAAGA AAGTGGATTTTTTAATGAACTCGAGGC TCTTAGAGCTGAATCAGTGGCTACCAA AGCAGAACTTGCCAGTTATAAAGAAAA GGCTGAAAAACTTCAAGAAGAACTTTT GGTAAAAGAAACAAAT ATGACATCTCT TCAGAAAGACTTAAGCCAAGTTAGGGA TCACCAGGGCCGC	AKAP fehérje	Ismeretlen tumorantigénként
T5-13	ATGGGTACTAGTCGGGCCGGCCAACAG GCATTCGAGCAAATACCAAGTCGCCAG AAGAAAATTTTAGAAGAAGCTCATGAA TTGAGTGAAGATCACTATAAGAAATAT TTGGCAAAACTCAGGTCTATTAATCCA	S0S1 fehérje	Ismeretlen tumorantigénként

	CCATGTGTGCCTTTCTTTGGAATTTATC TCACTAATCTCTTGAAAACAGAAGAAG GCAACCCTGAGGTCCTAAAAAGACATG GAAAAGAGCTTATAAACTTTAGCAAAA GGAGGAAAGTAGCAGAAATAACAGGA GAGATCCAGCAGTACCAAAATCAGCCN TACTGTTTACGAGTAGAATCAGATATC AAAAGGTTCTTTGAAAACTTGAATCCG ATGGGAAATAGCATGGAGAAGGAATTT ACAGATTATCTTTTCAACAAATCCCTAG AAATAGAACCACGAAAACCCAGCGGCC GC
T5-15	ATGGGTACTAGTCGGGCCGGCCAACAG GAGAGGTCCTTGGCCCTCTGTGAACCA GGTGTCAATCCCGAGGAACAACTGATT ATAATCCAAAGTCGTCTGGATCAGAGT TTGGAGGAGAATCAGGACTTAAAGAAG GAACTGCTGAAATGTAAACAAGAAGCC AGAAACTTACAGGGGATAAAGGATGCC TTGCAGCAGAGATTGACTCAGCAGGAC ACATCTGTTCTTCAGCTCAAACAAGAG CTACTGAGGGCAAATATGGACAAAGAT GAGCTGCACAACCAGAATGTGGATCTG CAGAGGAAGCTAGATGAGAGGACCCA GCGGCCGC	EST, KIAA1735 fehérje
T5-18	ATGGGTACTAGTCGGGCCGGCCAACCG ATGTCTGGACATGGGAGTTTTCAAGAG GTGCCACGTCTCCACACATCAGCACAA CTACGCAGCGCCTCCCTCCACTCGGAA GGACTATCCTGCTGCCAAGAGGGTCAA GTTGGACAGTGTCAGAGTCCTGAGACA GATCAGCAACAACCGAAAATGCACCAA CCCAGCGGCCGC	mic onkogén, alternatív olvasási fázis	Ismeretlen tumorantigénként

T6-1	ACTAGTCGGGCCGGCCAACGTTATGAG AAGTCAGATAGTAGCGATAGTGAGTAT ATCAGTGATGATGAGCAGAAGTCTAAG AACGAGCCAGAAGACACAGAGGACAA AGAAGGTTGTCAGATGGACAAAGAGCC ATCTGCTGTTAAAAAAAAGCCCAAGCC TACAAACCCAGTGGAGATTAAAGAGGA GCTTAAAAGCACGCCACCAGCCAGCGG CCGC	protein-kináz-C kötöfehérje	bőrbeli T-sejtes limfóma tumorantigén
T6-2	ACTAGTCGGGCCGGCCAACTTGCCAGG ATTCCCTCAGTAACGGCGAGTGAACAG GGAAGAACCAGCGGCCGC	nem található meg
T6-6	ACTAGTGGGCCGGCCAACGCTGCTCCA CCCTCAGCAGATGATAATATCAAGACA CCTGCCGAGCGTCTGCGGGGGCCGCTT CCACCCTCAGCGGATGATAATCTCAAG ACACCTTCCGAGCGTCAGCTCACTCCCC TCCCCCCAGCGGCCGC	homológ a PI-3kinázzal rokon SMG-1 kinázzal	Ismeretlen tumorantigénként
T6-7	ACTAGTCGGGCCGGCCAACGGGAATTG GGAAGGACGGGCCTATATCCCTCCTAC AA AGTTCGAGAGAAGAT AGA A ACGGT C AAGTACCCCACATATCCTGAGGCTGAG AAATAAAGCTCAGATGGAAGAGATAA ACGACCAAACTCAGTTCGACCAAACTC AGTTCAAACCATTTGAGCCAAACTGTA GATGAAGAGGGCTCTGATCTAACAAAA TAAGGTTATATGAGTAGATACTCTCAG CACCAAGAGCAGCTGGGAACTGACATA GGCTTCAATTGGTGGAATTCCTCTTTAA CAAGGGCTGCAATGCCCTCATACCCAT GCACAGTACAATAATGTACTCACATAT AACATGCAAAGGTTGTTTTCTACTTTGC CCCTTTCAGTATGTCCCCATAAGACAA	Fukoziltranszferáz	Ismeretlen tumorantigénként

	ACACTACCAGCGGCCGC
T7-1	ACTAGTGTCCTGGAACCCACAAAAGTA ACCTTTTCTGTTTCACCGATTGAAGCGA CGGAGAAATGTAAGAAAGTGGAGAAG GGTAATCGAGGGCTTAAAAACATACCA GACTCGAAGGAGGCACCTGTGAACCTG TGTAAACCTAGTTTAGGAAAATCAACA ATCAAAACGAATACCCCAATAGGCTGC AAAGTT AGAAAAACTGAAATT AT AAGT TACCCAAGTACCAGCGGCCGC	EST, KIAA1288 fehérje	Ismeretlen tumorantig énként
T9-22	ATGGACTTAACAGCTGTTTACAGAACA TTCCACCCAACAATCACAGAATATACA TTCTATTTAACAGTGCATGGAACTTTTT CCAAGATAGACCATATGATAGGCCACA AAAC AAGTCTC AAT AAGTCT AAGAAAA CTGAAATTATATCAAGTACTCTCTCAGA CCACAGTGGAATAAAATTGGAAAGTAA TTCCAAAAGGAACCCCCAAATCCATGC CAGCGGCCGC	reverztranszkriptáz homológ, 50%-os azonosság
TI 1-5	ATGCCGATTGACGTTGTHACACClGGG TGAATGGCACAGATCTTGAACTACTGA AGGAACTACAGCAGGTCAGAGAACAG ATGGAGGAGGAGCAGAAAGCAATGAG AGAAATCCTTGGGAAAAACACAACGGA AC CT ACT A AG A AG AGGT C CT ACTTTGT GAATTTTCTAGCCGTGTCCAGCGGCCG C	EST, el nem nevezett transzmembrán fehérje
TI 1-6	ACTAGTGGCCGGCC AACGT ATAAAGTA AATATTTCTAAAGCAAAAACTGCTGTG ACGGAGCTCCCTTCTGCAAGGACAGAT ACAACACCAGTTATAACCAGTGTGATG TCATTGGCAAAAATACCTGCTACCTTAT CTAC AGGGAACACT AAC AGTGTTTTAA	258-as cinkujj fehérje	Ismeretlen tumorantigénként

	AAGGTGCAGTTACTAAAGAGGCAGCAA AGATCATTCAAGATGAAAGTACACAGG AAGATGCTATGAAATTTCCATCTTCCCA ATCTTCCCAGCCTTCCAGGCTTTTAAAG AACAAAGGCATATCATGCAAACCCGTC ACACATCCCAGCGGCCGC
Tll-9	ACTAGTCGGGCCGGCCAACTTCGATTT AGTGATCATGCCGTGTTGAAATCCTTGT CTCCTGTAGACCCAGTGGAACCCATAA GTAATTCAGAACCATCAATGAATTCAG ATATGGGAAAAGTCAGTAAAAATGATA CTGAAGAGGAAAGTAATAAATCCGCCA CAACAGACAATGAAATAAGTAGGACTG AGTATTTATGTGAAAACTCTCTAGAAG GTAAAAATAAAGATAATTCTTCAAATG AAGTCTTCCCCCAATATGCCAGCGGCC GC	EST, hipotetikus humán fehérje
Tll-3	ACTAGTCGGGCCGGCCAACGCAAGCAA AGTTTCCCAAATTCAGATCCTTTACATC AGTCTGATACTTCCAAAGCTCCAGGTTT TAGACCACCATTACAGAGACCTGCTCC AAGTCCCTCAGGTATTGTCAATATGGA CTCGCCATATGGTTCTGTAACACCTTCT TCAACACATTTGGGAAACTTTGCTTCAA AC ATTTC AGGAGGTC AGATGT ACGGAC CTGGGGCACCCCTTGGAGGAGCACCCA CCAGCGGCCGC	EST, KIAA0697 fehérje
T5-2	ATGGGTACTAGTCGGGCCGGCCAACCC ACTTCAGAAAACTATTTGGCAGTAACT ACT AAAACTAAAC AT AAGC AT AGCCTA CAACCCAGTAATGCCAGTATTTCACTCC TAGGTATATACCCAACCCCCAGCGGCC GC	humán genomiális DNS

T5-19

ACTAGTCGGGCCGGCCAACGTGACACA CAGACACATGCACATGTGAGTGTATGC GTGCACACACCCCACCACACCTACAAA TACCCCACCAGCGGCCGC

EST

A Tl-52 klón a p53 kótöfehérje fragmenseként ismert [Haluska, P. és mtsai., NAR 27, 2538-2544. old. (1999)], de sosem azonosították tumorantigénként. A klón szekvenciája VLVAGQRYQSRSGHDQKNHRKHHGKKRMKSKRSTSLSSPRNGTSGR, és tumorantigénként történő alkalmazása az ismertetett találmány tárgyát képezi.

A TI-17 klón DNA-topoizomeráz-II-béta fragmensként ismert, amelyet rosszindulatú mezotelióma tumorantigénként azonosítottak [Robinson, C., és mtsai., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 22, 550-556. old. (2000)]. Ezt a találmány szerint emlődaganat tumorantigénként azonosítottuk. A klón szekvenciája MGTSRAGQLVEELDKVESQEREDVLAGMSGKSSFQRSEGDFLLRSLTSGR, és emlődaganat tumorantigénként történő alkalmazása az ismertetett találmány tárgyát képezi.

A TI-32 klón — mindezidáig ismeretlen — szekvenciája MGTSRAGQLHAFPLHSTTLYYTTPSGR; ez egy tumorantigén, és ily módon az ismertetett találmány tárgyát képezi.

A TI-74 klón — mindezidáig ismeretlen — szekvenciája MGTSRPANREAKQLHHQPHSIELIQSSGR; ez egy tumorantigén, és ily módon az ismertetett találmány tárgyát képezi.

A T4-2 klón — mindezidáig ismeretlen — szekvenciája MGTSRPANSEVYKPTLLYSSGR; ez egy tumorantigén, és ily módon az ismertetett találmány tárgyát képezi.

A T4-11 klón — mindezidáig ismeretlen — szekvenciája MGTSGRPTVGFTLDFTVDPPSGR; ez egy tumorantigén, és ily módon az ismertetett találmány tárgyát képezi.

A T4-19 klón — mindezidáig ismeretlen — szekvenciája MGTSRAGQLYRTTLTYTSGR; ez egy tumorantigén, és ily módon az ismertetett találmány tárgyát képezi.

A Tl-12 klón — mindezidáig ismeretlen — szekvenciája MRYYTATKTYELMLDATTQTSGR; ez egy tumorantigén, és ily módon az ismertetett találmány tárgyát képezi.

A Tl-39 klón — mindezidáig ismeretlen — szekvenciája MRVIDRAQAFVDEIFGGGDDAHNLNQHNSSGR; ez egy tumorantigén, és ily módon az ismertetett találmány tárgyát képezi.

-21 A T5-8 klón az AKAP fehérje fragmenseként ismert, de sosem azonosították, mint tumorantigént. A klón szekvenciája MGTSRAGQQREQEKKRSPQDVEVLKTTTELFHSNEESGFFNELEALRAESVATKAELASYKEKAEKLQEELLVKETNMTSLQKDLSQVR DHQGRG, és tumorantigénként történő alkalmazása az ismertetett találmány tárgyát képezi.

A T5-13 klón a SOS1 fehérje fragmenseként ismert, de sosem azonosították, mint tumorantigént. A klón szekvenciája AGTSRAGQHAFEQIPSRQKKILEEAHELSEDHYKKYLAKLRSINPPCVPFFGIYLTNLLKTEEGNPEVLKRHGKELINFSKRRKVAEITGE IQQYQNQYCLRVESD1KRFFENLNPMGNSMEKEFTDYLFNKSLEIEPRKPSGR, és tumorantigénként történő alkalmazása az ismertetett találmány tárgyát képezi.

A T5-15 klón a KIAA1735 EST fehérje fragmenseként ismert, de sosem azonosították, mint tumorantigént. A klón szekvenciája MGTSRAGQQERSLALCEPGVNPEEQLIIIQSRLDQSLEENQDLKKELLKCKQEARNLQGIKDALQQRLTQQDTSVLQLK QELLRANMDKDELHNQNVDLQRKLDERTQRP, és tumorantigénként történő alkalmazása az ismertetett találmány tárgyát képezi.

A T5-18 klón a mic onkogén alternatív olvasási fázisának fragmenseként ismert, de sosem azonosították, mint tumorantigént. A klón szekvenciája MGTSRAGQPMSGHGSFQEVPRLHTSAQLRSASLHSEGLSCCQEGQVGQCQSPETDQQQPKMHQPSGR, és tumorantigénként történő alkalmazása az ismertetett találmány tárgyát képezi.

A T6-1 klón a protein-kináz-C-kötőfehérje fragmenseként ismert, amelyet bőrbeli T-sejtes limfóma tumorantigénként azonosítottak [Eichmuller, S. és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 629-634. old. (2001)]. Ezt a találmány szerint emlődaganat tumorantigénként azonosítottuk. A klón szekvenciája TSRAGQRYEKSDSSDSEYISDDEQKSKNEPEDTEDKEGCQMDKEPSAVKKKPKPTNPVEIKEELKSTPPA, és emlődaganat tumorantigénként történő alkalmazása az ismertetett találmány tárgyát képezi.

A T6-2 klón — mindezidáig ismeretlen — szekvenciája TSRAGQLARIPSVTASEQGRT; ez egy tumorantigén, és ily módon az ismertetett találmány tárgyát képezi.

A T6-6 klón a ΡΙ-3-kinázzal rokon SMG-l-kináz homológjának a fragmenseként ismert, de sosem azonosították tumorantigénként. A klón szekvenciája TSGPANAAPPSADDNIKTPAERLRGPLPPSADDNLKTPSERQLTPLPPAAAK; ez egy tumorantigén, és ily módon az ismertetett találmány tárgyát képezi.

A T6-7 klón a frikozil-transzferáz fragmenseként ismert, de sosem azonosították, mint tumorantigént. A klón szekvenciája AGQRELGRTGLYPSYKVREKIETVKYPTYPEAEK; ez egy tumorantigén, és ily módon az ismertetett találmány tárgyát képezi.

-22A T7-1 klón a KIAA1288 EST fehérje fragmenseként ismert, de sosem azonosították, mint tumorantigént. A klón szekvenciája TSVLEPTKVTFSVSPIEATEKCKKVEKGNRGLKNIPDSKEAPVNLCKPSLGKSTIKTNTPIGCKVRKTEIISYPSTSGR; ez egy tumorantigén, és ily módon az ismertetett találmány tárgyát képezi.

A T9-22 klón reverz-transzkriptáz homológjához hasonló fragmensként (50% azonosság) ismert, de sosem azonosították, mint tumorantigént. A klón szekvenciája MDLTAVYRTFHPTITEYTFYLTVHGTFSKIDHMIGHKTSLNKSKKTEIISSTLSDHSGIK LESNSKRNPQIHASGR; ez egy tumorantigén, és ily módon az ismertetett találmány tárgyát képezi.

A TI 1-5 klón egy el nem nevezett teoretikus transzmembrán fehérje fragmenseként ismert, de sosem azonosították mint tumorantigént. A klón szekvenciája MPIDVVYTWVNGTDLELLKELQQVREQMEEEQKAMREILGKNTTEPTKKRSYFVNFLAVSSGR; ez egy tumorantigén, és ily módon az ismertetett találmány tárgyát képezi.

A TI 1-6 klón a 258-as cinkujj fehérje fragmenseként ismert, de sosem azonosították mint tumorantigént. A klón szekvenciája TSGRPTYKVNISKAKTAVTELPSARTDTTPVITSVMSLAKIPATLSTGNTNSVLKGAVTKEAAKIIQDESTQEDAMKFPSSQSS QPSRLLKNKGISCKPVTHPSGR; ez egy tumorantigén, és ily módon az ismertetett találmány tárgyát képezi.

A TI 1-9 klón egy hipotetikus humán fehérje fragmenseként ismert, de sosem azonosították mint tumorantigént. A klón szekvenciája TSRAGQLRFSDHAVLKSLSPVDp VEPISNSEP SMN SDMGK V SKNDTEEE SNKS ATTDNEISRTE YLCEN SLEGKNKDN S S NEVFPQYASGR; ez egy tumorantigén, és ily módon az ismertetett találmány tárgyát képezi.

A TI 1-3 klón a KIAA0697 EST fehérje fragmenseként ismert, de sosem azonosították mint tumorantigént. A klón szekvenciája TSRAGQRKQSFPNSDPLHQSDTSKAPGFRPPLQRPAPSPSGIVNMDSPYGSVTPSSTHLGNFASNISGGQMYGPGAPLGGAPTSGR; ez egy tumorantigén, és ily módon az ismertetett találmány tárgyát képezi.

A T5-2 klón humán genomiális DNS fragmenseként ismert, de sosem azonosították mint tumorantigént. A klón szekvenciája MGTSRAGQPTSENYLAVTTKTKHKHSLQPSNASISLLGIYPTPSGR, ez egy tumorantigén, és ily módon az ismertetett találmány tárgyát képezi.

A T5-19 klón egy EST fehérje fragmenseként ismert, de sosem azonosították mint tumorantigént A klón szekvenciája TSRAGQRDTQTHAHVSVCVHTPHHTYKYPTSGR; ez egy tumorantigén, és ily módon az ismertetett találmány tárgyát képezi.

-23 Nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti azon szekvenciák, amelyek ismert fehérjék részét képezik, de ismeretlenek voltak, mint tumorantigének, a találmány célját képezik, mindaddig, amíg tumorantigénként történő alkalmazásukról van szó. Ugyanilyen módon a találmány egyik célja a szekvencia, vagy a szekvenciát kódoló gén terméke egészének vagy részének tumorantigénként történő alkalmazása.

Amplifikáltuk azokat a fágklónokat, amelyeket „pick-blot” elemzéssel jellemeztünk és a specifikus reaktivitásukat kimutattuk emlődaganatban szenvedő páciensek szérumaival, és azután pozitív és negatív szérumok nagy paneljával elemeztük azokat. Ezután az ELISA vizsgálat után a specifikus tumorantigéneknek megfelelő cDNS-klónokat megklónoztuk különféle bakteriális expressziós rendszerekben (protein-D és/vagy GST), azért, hogy jobban meghatározzuk a specifitásukat és szelektivitásukat. A fúziós fehérjék előállításához az összes kiónt amplifikáltuk egy egyedi tarfoltból PCR-rel az alábbi oligonukleotidok alkalmazásával: K84 5’-CGATTAAATAAGGAGGAATAAACC-3’ és K86 5’-CTCTCATCCGCCAAAACAGCC-3’. A kapott fragmenst azután megtisztítottuk QIAGEN Purification Kit alkalmazásával, megemésztettük Spel és NotI restrikciós enzimekkel és a pKM4-6H plazmidba klónoztuk, előállítva egy fúziós fehérjét a D-vel és 6-hisztidin farokkal, vagy pGEX-SN vektorba a GST-vel történő fúzió előállítására. A megfelelő rekombináns fehérjéket azután szokásos protokollok alkalmazásával állítottuk elő és tisztítottuk meg [Sambrook, I, Fritsch, E. F. és Maniatis, T., „Molecular Cloning”, kiad.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989)].

Az alábbi táblázatban szemléltetésként megadjuk néhány kiszelektált klón negatív és pozitív kiónokkal való reaktivitását, fág vagy fúziós fehérje készítményekben vizsgálva:

Klón neve	Lambda fág reaktivitása pozitív szérummal (pozitívok száma/összes mért)	Lambda fág reaktivitása negatív szérummal	Protein-D fúziós fehérje reaktivitása pozitív szérumokkal (* GST fúzió)	Protein-D fúziós fehérje reaktivitása negatív szérumokkal (* GST fúzió)
Tl-2	1/20	0/9
Tl-17	1/10	0/0	* 2/16	* 0/15
Tl-8	1/10	0/0	1/13	0/15
Tl-6	1/10	0/0
Tl-101	/20	0/1

Tl-52	7/41	0/20	3/53	3/24
Tl-35	4/10	14/21
Tl-10	1/10	0/0
Tl-39	11/34	0/26	Nem reagál
Tl-12	23/72	0/31	Nem reagál
Tl-32	17/72	0/31	* 10/72	* 1/31
TI-74	29/72	2/27	* 21/72	* 4/32
T4-2	11/18	0/17	9/28	1/31
T4-11	4/21	0/26	8/70	0/30
T4-19	5/20	0/26	12/70	0/30

A kiszelektált tumorantigének daganatsejtek felismerésére és ily módon patológiás abnormalitások detektálására és diagnózisára való hatékonyságának demonstrálása céljából egereket immunizáltunk néhány kiszelektált klón elleni ellenanyag-válasz indukálása végett.

Az egereket az antigénnek két hónapon keresztül hét alkalommal történő beadásával immunizáltuk, immunogénként a Dl-52, D4-11 és D4-19 fúziós fehérjéket alkalmazva, amelyek megfelelnek a Tl-52, T4-11 és T4-19 kiónok szekvenciáinak Protein-D-vel alkotott fúzióinak. Minden alkalommal 20 pg fehérjét injektáltunk (intraperitoneálisan vagy szubkután) mindegyik egérbe mindhárom fehérjéből CFA-ban, 20 pg-ot IFA-ban, 10 pg-ot PBS-ben és négyszer 5 pg-ot PBS-ben. A tumorantigén szekvenciái elleni immunizálás hatékonyságának ellenőrzése céljából az immunizált állatok szérumait megvizsgáltuk különböző környezetben klónozott azonos peptidszekvenciákkal szemben annak érdekében, hogy kizárjuk a protein-D elleni reaktivitást.

A Dl-52 esetében az immunizált egerek szérumait GST-vel (GST1-52) való fúziókkal vizsgáltuk, míg a D4-11 és D4-19 esetében a megfelelő peptidszekvenciákat pC89 vektorba klónoztuk [Felici és mtsai., J. Mól. Bioi. 222, 301-310. old. (1991)], és azután újra teszteltük pVIII-cal (a fonalas bakteriofágok fő burokfehérjéje) alkotott fúziókkal. Az immunizált állatok szérumaival végzett ELISA eredményei azt mutatták, hogy hatékony immunizálást érhetünk el Dl-52 és D4-11 esetében, és ily módon a megfelelő szérumokat megvizsgáltuk daganatsejteket felismerő képességükre. Ebből a célból az MCF7 sejtvonalat alkalmaztuk, és FACS elemzéssel demonstráltuk, hogy a mindkét szérumban jelen lévő ellenanyagok (antiDl-52 és anti-D4-ll) képesek specifikusan felismerni az MCF7 emlődaganat sejteket, és

- 25 például nem ismerik fel a petefészek daganatsejteket, és ez a felismerő képesség nincs jelen az ugyanazokból az egerekből származó immunizálás előtti szérumokban.

A szekvencialistában található szabad szövegek fordítása < 210> 1 < 223> Szintetikus oligonukleotid a pGEX-SN plazmid előállításához < 210> 2 < 223> Szintetikus oligonukleotid a pGEX-SN plazmid előállításához < 210> 3 < 223> Szintetikus oligonukleotid a pKM4-6H plazmid előállításához < 210> 4 <223> Szintetikus oligonukleotid a pKM4-6H plazmid előállításához <210> 5 < 223> Oligonukleotid a pNS3785 plazmid amplifikálásához < 210> 6 < 223> Oligonukleotid a pNS3785 plazmid amplifikálásához < 210> 7 < 223> Láncindító a lambda pD gén amplifikálásához < 210> 8 < 223> Láncindító a pD gén amplifikálásához < 210> 9 < 223> Véletlenszerűen címkézett láncindító < 223> kilenc oldallánc < 210> 10 <223> Láncindító <223> kilenc oldallánc <210> 11 < 223> Amplifikáló láncindító <210> 12 < 223> Amplifikáló láncindító <210> 13 < 223> Amplifikáló láncindító < 210> 14 < 223> Amplifikáló láncindító <210> 31 <223>

< 223> különböző oldallánc <210> 71 < 223> Amplifikáló láncindító < 210> 72 < 223> Amplifikáló láncindító

Claims

·^ ·

Szabadalmi igénypontok

1. Eljárás specifikus tumorantigének azonosítására cDNS-könyvtárak szérumokkal történő szelekciójával, azzal jellemezve, hogy a szelekciót fágprezentációs módszerrel végezzük.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szelekciót SEREX módszer („serological analysis of autologous tumour antigens through expression of recombinant cDNA”) alkalmazásával végezzük.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szelekciót affinitási szelekciós módszer alkalmazásával végezzük.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy daganatbiopsziákból származó könyvtárakat szkrínelünk.
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tenyésztett daganatos sejtvonalakból származó könyvtárakat szkrínelünk.
6. Tumorantigének, amelyek az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárással állíthatók elő.
7. A 6. igénypont szerinti antigén, amely az alábbiak bármelyike:

— MGTSRPANREAKQLHHQPHSIELIQSSGR;

— MGTSRPANSEVYKPTLLYSSGR;

— MGTSGRPTVGFTLDFTVDPPSGR;

— MGTSRAGQLYRTTLTYTSGR;

— MGTSRAGQLHAFPLHSTTLYYTTPSGR;

— MRYYTATKTYELMLDATTQTSGR;

— MRVIDRAQAFVDEIFGGGDDAHNLNQHNSSGR.
8. Az alábbi szekvenciák bármelyikének vagy a szekvenciát kódoló gén terméke szekvenciája egészének vagy részének alkalmazása tumorantigénként.

— VLVAGQRYQSRSGHDQKNHRKHHGKKRMKSKRSTSLSSPRNGTSGR;

— mgtsragqqreqekkrspqdvevlktttelfhsneesgffnelealraesvatkaELASYKEKAEKLQEELLVKETNMTSLQKDLSQVRDHQGRG;

— AGTSRAGQHAFEQIPSRQKKILEEAHELSEDHYKKYLAKLRSINPPCVPFFGIYLTNLLKTEEGNPEVLKRHGKELINFSKRRKVAEITGEIQQYQNQYCLRVESDIKRFFENENPMGNSMEKEFTDYLFNKSLEIEPRKPSGR;

— MGTSRAGQQERSLALCEPGVNPEEQLIIIQSRLDQSLEENQDLKKELLKCKQEARnlqgikdalqqrltqqdtsvlqlkqellranmdkdelhnqnvdlqrkldertqrp,

-28— MGTSRAGQPMSGHGSFQEVPRLHTSAQLRSASLHSEGLSCCQEGQVGQCQSPETDQQQPKMHQPSGR;

— TSRAGQLARIPSVTASEQGRT;

— TSGPANAAPPSADDNIKTPAERLRGPLPPSADDNLKTPSERQLTPLPPAAAK;

— TSRAGQRELGRTGLYPSYKVREKIETVKYPTYPEAEK;

— TSVLEPTKVTFSVSPIEATEKCKKVEKGNRGLKNIPDSKEAPVNLCKPSLGKSTIKTNTPIGCKVRKTEIISYPSTSGR;

— MDLTAVYRTFHPTITEYTFYLTVHGTFSKIDHMIGHKTSLNKSKKTEIISSTLSDHSGIKLESNSKRNPQIHASGR;

— MPIDVVYTWVNGTDLELLKELQQVREQMEEEQKAMREILGKNTTEPTKKRSYFVNFLAVSSGR;

— TSGRPTYKVNISKAKTAVTELPSARTDTTPVITSVMSLAKIPATLSTGNTNSVLKGAVTKEAAKIIQDESTQEDAMKFPSSQSSQPSRLLKNKGISCKPVTHPSGR;

— TSRAGQLRFSDHAVLKSLSPVDPVEPISNSEPSMNSDMGKVSKNDTEEESNKSATTDNEISRTEYLCENSLEGKNKDNSSNEVFPQYASGR;

— TSRAGQRKQSFPNSDPLHQSDTSKAPGFRPPLQRPAPSPSGIVNMDSPYGSVTPSSTHLGNFASNISGGQMYGPGAPLGGAPTSGR;

— MGTSRAGQPTSENYLAVTTKTKHKHSLQPSNASISLLGIYPTPSGR;

— TSRAGQRDTQTHAHVSVCVHTPHHTYKYPTSGR.
9. Az alábbi szekvenciák bármelyikének vagy a szekvenciát kódoló gén terméke szekvenciája egészének vagy részének alkalmazása emlőrákos daganatantigénként:

— TSRAGQRYEKSDSSDSEYISDDEQKSKNEPEDTEDKEGCQMDKEPSAVKKKPKPTNPVEIKEELKSTPPA;

— MGTSRAGQLVEELDKVESQEREDVLAGMSGKSSFQRSEGDFLLRSLTSGR.
10. A 6-9. igénypontok bármelyike szerinti antigén alkalmazása daganatos sérülések diagnosztikai leképezésére szolgáló kontrasztanyag előállítására alkalmas hatóanyagként.
11. A 9. igénypont szerinti antigén alkalmazása emlődaganatos sérülések diagnosztikai leképezésére szolgáló kontrasztanyag előállítására alkalmas hatóanyagként.
12. Specifikus ligandum a 6-9. igénypontok bármelyike szerinti antigén ellen.
13. Ellenanyag a 6-9. igénypontok bármelyike szerinti antigén ellen.
14. A 12. igénypont szerinti ligandum vagy 13. igénypont szerinti ellenanyag alkalmazása célspecifikus kontrasztanyag előállítására.
15. A 14. igénypont szerinti alkalmazás daganatdiagnosztikára.
16. Célspecifikus kontrasztanyag, amely legalább egy 6-9. igénypontok bármelyike szerinti antigént és/vagy legalább egy 12. igénypont szerinti specifikus ligandumot és/vagy 13. igénypont szerinti ellenanyagot tartalmaz.
17. Emlőrákra specifikus kontrasztanyag, amely legalább a 9. igénypont szerinti 5 antigén és/vagy legalább egy 12. igénypont szerinti ligandumot és/vagy 13. igénypont szerinti specifikus ellenanyagot tartalmaz.
18. Expressziós/prezentációs vektor (λΚΜ4) cDNS-könyvtár számára.
19. A 18. igénypont szerinti vektor alkalmazása az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárásban.

A meghatal s

i^Védj Iroda Kft. gyei Zsolt ' Ügyvivőjelölt