HU231571B1

HU231571B1 - Lactiplantibacillus Plantarum SNI3 mikroorganizmus törzs

Info

Publication number: HU231571B1
Application number: HUP2100212A
Authority: HU
Inventors: Kukolya József 1/6 dr.; Ferenczi Szilamér Imre 1/4 Dr.; Dr. Vidács Ildikó 1/6 Batáné; Kovács Krisztina 1/4 dr.; Nagy István 1/6 Dr.
Original assignee: ZYMBIOSYS Kutató és Fejlesztő Korlátolt Felelősségű Társaság 50%; Hun-Ren Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézet 18%; Dr. Ferenczi Szilamér Imre 16%; dr. Kovács Krisztina 16%
Priority date: 2021-06-04
Filing date: 2021-06-04
Publication date: 2024-12-28
Also published as: EP4347789A1; HUP2100212A1; CN118202035A; JP2024527241A; EP4347789A4; US20240245737A1; WO2022254230A1; KR20240017929A

Description

Lactiplantibacillus Plantarum SNI3 mikroorganizmus törzs

A találmány tárgya:

Találmányunk az általunk izolált, NCAIM (P) B 001482 szám alatt deponált Lactiplantibacillus plantarum SNI3 baktérium törzs, az SNI3 törzs alapú készítmény, a készítmény alkalmazása hím gerinces állatok, tenyészállatok és humán férfiak viselkedésének, sovány testtömeg arányának kedvező megváltoztatására, testzsír tartalom csökkentésére, reprodukciós képességének, spermium számának és tesztoszteron szintjének növelésére vonatkozik.

A találmányunk szerinti mikroba törzs és az abból készített készítmény a spermiumszám és a szérum tesztoszteron szint növelése mellett csökkenti, minimalizálja az agresszív viselkedésre és a szorongásra utaló jellemzőket.

Lactiplantibacillus plantarum SNI3 baktériumtörzset tartalmazó takarmány és étrend kiegészítő kompozíció, amely szinergisztikus hatást fejt ki a fent említett testfelépítési-, élettani - és viselkedési paraméterekre.

Az ismertetett módon előállított és kívánt esetben hővel vagy ultrahanggal előkezelt Lactiplantibacillus plantarum SNI3 baktériumot a gyógyszertechnológiában szokásosan alkalmazott vivő- és segédanyagokkal és/vagy prebiotikus anyagok hozzáadásával takarmány és étrend kiegészítő készítménnyé alakítjuk.

A találmány fő alkalmazási területei: hím gerinces állatok, tenyészállatok és férfiak a termékenységi zavarainak csökkentése, az egészséges termékenyítő képesség fenntartása. Az öregedés, a különböző környezeti toxikus hatások, a hibás és/vagy elégtelen takarmányozás, az egészségtelen táplálkozás, valamint a túlzott stressz miatt kialakuló alacsony spermiumszám növelése és a leromlott spermium minőség javítása/helyreállítása. Andropauzában a csökkenő tesztoszteron szint helyreállítása. Hím tenyészállatok agresszív viselkedésének nyugodt, békés szorongás-mentes irányba történő befolyásolása. Elhízás csökkentése, izomtömeg fokozása emberben és gerinces állatokban.

A találmányunk alkalmazási területébe sorolható még a találmányunk szerinti készítmény alkalmazása:

- az ideális testösszetétel kialakítására, a sovány testtömeg arány fokozásával és a testzsír csökkentésével,

- az egészséges termékenyítő képesség fenntartására hím állatokban és férfiakban,

- a hím termékenységi zavarok csökkentésére,

- az öregedés, a különböző környezeti toxikus hatások, a hibás, elégtelen- takarmányozás/ egészségtelen táplálkozás, valamint a túlzott stressz miatt kialakuló csökkent spermiumszám helyreállítására és leromlott spermium minőség javítására,

- az andropauzában a csökkenő tesztoszteron szint helyreállítására,

- hímekben a szorongás és az agresszivitás csökkentésére.

A leírás során használt kifejezések definíciók, meghatározások elnevezések körülírása:

1. Baktériumtörzs: egy baktérium genetikai variánsa vagy altípusa, pl. egy Lactobacillus törzs a tejsavbaktériumoknak egy meghatározott, csak rá jellemző genetikai információval rendelkező típusa.

A Lactiplantibacillus plantarum SNI3 baktérium törzset 1993-ban Sajóbábonyban egy fedezőkan székletéből izoláltuk. A törzs a Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményébe került szabadalmi letétként elhelyezésre (Lactiplantibacillus plantarum SNI3 NCAIM (P) B 001482).

2. CFU: Colony-forming unit. Az adott mikroorganizmus életképes, telepképző egységeinek száma. A mikroorganizmus koncentrációját folyadék esetében CFU/ml, szilárd halmazállapotú termék esetében CFU/ g mértékegységben adják meg.

3. Tesztoszteron: A here által termelt legfontosabb hím nemi hormon, melynek kiemelkedő jelentősége van a hím másodlagos nemi jellegek kialakításában (hímekre jellemző csontozat és vázizomzat, testszőrzet, magatartás).

4. A találmány során említett fajok csoportosítása:

4.1. Humán: Rendszertani szempontból az emberi nem az állatok országába, a főemlősök rendjébe, a hominidák (Hominidae), a ma élő emberek a Homo sapiens („értelmes ember) faja közé tartozik. Az ember biológiai neme szerint nő vagy férfi, ivarérettsége (illetve tenyészérettsége vagy életkora) szerint gyermek (lány és fiú) vagy felnőtt.

4.2.. Gazdasági állatok: gazdaságban tartott haszonállatok, amelyeknek a tenyésztése szorosan kapcsolódik a földműveléshez, a mezőgazdasághoz. A háziasítás vagy domesztikáció során az emberek a vadon élő állatfaj egyes állományait mesterségesen szabályozott tenyésztésbe vonták, és eközben mesterséges szelekcióval új fajtákat hoznak létre.

4.2.1. Haszonállatok: gazdasági előnyökért tenyésztett és nemesített állatokat haszonállatnak nevezik: olyan gerincesek, melyek közül a teljesség igénye nélkül a következőket soroljuk fel: sertés, szarvasmarha, juh, kecske, nyúl, ló, madarak: kakas, pulyka, lúd, kacsa, strucc, emu, halak).

4.2.2. Tenyészállatok: tovább-tenyésztésre kijelölt hím vagy nőivarú állatok, amelyeket rendszerint hatékony tenyésztői munkával hozunk létre. Ennélfogva teljesítményük, genetikai értékük kimagasló. A tenyészállatok megkülönböztetésére (az átlagot meghaladó tenyészértékük és a tenyésztésben elfoglalt különleges helyük alapján) a kifejlett, adott ivarú állat neve elé bizonyos jelzőket (törzs, tenyész stb.) szoktunk használni (pl. törzskanca, törzsmén, tenyészkan, tenyészkoca, tenyészbika, bikanevelő tehén stb.).

4.3. Hobbi állatok: Kedvtelésből tartott állatok vagy társállatok gyakran a lakásban élő állatok, amelyekről az ember gondoskodik, és amelyekhez társként ragaszkodik. Ilyen lehet pl. kutya, macska, ló, egyes rágcsálók, halak, kétéltűek, hüllők és madarak is.

4.4. Vadon élő gerinces állatok: Természetes környezetben, természetes élőhelyükön élő gerinces állatok.

4.5. Kihaló félben lévő és egzotikus állatok: Súlyosan veszélyeztetett élőlényeknek azokat az élőlényfajokat nevezzük, amelyek kihalási esélye természetes élőhelyén kimagaslóan nagy, azonnali beavatkozás nélkül nagy valószínűséggel vad állományaik kihalnak (Status iucn CR icon.svg). Az ilyen fajokat, alfajokat a Természetvédelmi Világszövetség Vörös Listája a Súlyosan veszélyeztetett (Critically Endangered) kategóriába sorolja, rövidítése CR. Ez a Vörös Listán használt legsúlyosabb fenyegetettséget jelölő státusz a még élő, eredeti élőhelyükön előforduló fajokat tekintve (vagyis a Kihalt és a Vadon kihalt státuszokat leszámítva). A Vörös Lista 2010-es változata szerint 1859 állatfaj van kihalófélben.

4.6. Laborállatok: Kísérleti céllal tenyésztett állatok, amelyeket különböző feladatokra, így például gyógyszerek tesztelésére, biológiai, genetikai, biotechnológiai vizsgálatokra használnak. Ilyen állat lehet az egér, a patkány, a nyúl, a sertés, a kutya, az ecetmuslica és számos más állatfaj.

5. Reprodukciós képesség: az élőlények önmaguk megsokszorosítására való képessége. A hím gerincesek reprodukciós képessége függ a hím ivarsejtek, azaz a spermiumok számától és azok élettani sajátosságaitól, elsősorban mozgékonyságuktól és megtermékenyítő képességüktől.

6. Viselkedés: Reakciók, válaszok vagy mozgások összessége, amelyeket egy ember vagy más élőlény tanúsít egy adott helyzetben. Forrásai az ösztönök és a tanult magatartási minták.

6.1. Agresszió: Az agresszió energikus viselkedésforma, amely:

negatív szándékkal célja másnak testi sérelmet vagy kárt okozni pozitív szándékkal célratörés, alkotás, önmegvalósítás

Agressziónak nevezzük azt a viselkedésformát is, amikor fajtársak megpróbálják egymást valamilyen erőforrás közeléből eltávolítani, illetve megakadályozni, hogy a másik egyed a forrást elfogyassza. Típusai: támadás a zsákmány megszerzéséért, versengés a dominanciáért, félelem/ veszély leküzdése; frusztráció okozta támadás; területvédelem; utódok védelme; célorientált támadás; létfenntartással összefüggő egyéb támadás; tulajdon- és birtokvédelmi agresszió. Az agresszív viselkedés kimutatására pl. a szociális interakció teszt szolgálhat.

6.2. Szorongás: nyugtalanság, félelem. Valós vagy vélt fenyegetettséggel kapcsolatos készenléti állapot. A rágcsálók pl. kerülik a nyílt tereket, vagy a ragadozóik által kibocsátott szagokat. Embereknél egy kellemetlennek tartott esemény, a nyilvános szerepléstől való félelem, vagy egy korábban átélt trauma esetleges megismétlődése válthat ki szorongást.

6.3. OCD viselkedés: Az obszesszív-kompulziv rendellenesség (OCD), azaz kényszerbetegség, olyan mentális rendellenesség, amelyben a vizsgált élőlény szükségét érzi bizonyos rutinok (ún. kényszerek) ismételt, a szorongással arányos mértékben való végrehajtásának, amelyet a környezet/kiváltó körülmény generál.

7. Marble burying („márvány temetés) teszt: A Marble burying teszt egy olyan állatmodellviselkedés mérésére irányuló teszt, amelyet a tudományos kutatás során a szorongás vagy a kényszeres rendellenesség (OCD) viselkedés ábrázolására használnak: megfigyelték, hogy a patkányok és egerek ártalmas vagy ártalmatlan tárgyakat temetnek az alomba. Például ha rágcsálókat márványgolyókat tartalmazó ketrecbe teszik, idővel a rágcsálók a golyókat az alomanyagba eltemetik. Ezt a viselkedést szorongásos vagy OCD viselkedésnek tekintik. Amikor a rágcsálókat szorongáscsökkentőkkel vagy OCD kezelésére használt gyógyszerekkel injektálják, az eltemetett golyók mennyisége csökken.

A találmány alkalmazási területe:

Termékenységi zavarok csökkentése, az egészséges termékenyítő képesség fenntartása hím gerincesekben és férfiakban. Az öregedés, a különböző környezeti toxikus hatások, a hibás, elégtelen takarmányozás/egészségtelen táplálkozás, valamint a túlzott stressz miatt kialakuló csökkent spermiumszám és leromlott sperma minőség helyreállítása. Andropauzában a csökkenő tesztoszteron szint helyreállítása. Hím tenyészállatok agresszív viselkedésének nyugodt, békés irányba történő befolyásolása. A szorongás csökkentése. Elhízás csökkentése, izomtömeg fokozása emberben és gerinces állatokban.

A találmány biológiai háttere

A hím gerincesek reprodukciós képessége függ a hím ivarsejtek, azaz a spermiumok számától és azok élettani sajátosságaitól, elsősorban mozgékonyságuktól és termékenyítő képességüktől. A hím ivarsejtek a herében, a herecsatomákban, a Sertoli sejtek támogatásával fejlődnek, kb. 5-8 hét alatt. A spermiumok aktivitását a járulékos ivarmirigyek váladékai segítik. Az ondó mennyisége és benne a spermiumok száma fajtól függően változik: egér: 9,5 millió db/ml; patkány: 48 millió db/ml; sertés kan: 154-500 ml, (100 000db/ml); mén: 30-200ml, (100 000db/ml); kakas: 0,3-0,8 ml (2-3,5 millió db/ml); pulyka 0,3-0,5 ml (3-6 millió db/ ml). Egészséges fiatal férfi: 1,5-2 ml, (3336 millió db/ml. Az öregedő állatoknál és férfiaknál a fiatal populációhoz képest az idő előrehaladtával megnő a spermiumszám csökkenésének esélye.

Kutatások szerint a férfi termékenységi zavarok egyik leggyakoribb oka, hogy az utóbbi 50 évben felére csökkent a férfiak spermiumszáma. Bár ilyen drasztikus csökkenés nem következett be a tenyésztett haszonállatok között, de az állattenyésztésben is fontos a mesterséges megtermékenyítésben használt donor apaállatok spermájának minősége és mennyisége. A spermiumszám és minőség fokozásával csökkenethető a spermadonorok száma, és ezáltal a tartási és takarmányozási költségek. A hobbi célból tartott állatok tenyésztésénél is hasonlóképpen fontos szempont a termékenyítő képesség megtartása és fokozása. Kihaló félben lévő állatfajok megmentésében is lényeges a spermiumszám és a reprodukciós képesség fokozása a megfelelő utódszám elérése céljából.

Tesztoszteron szint (vér plazma/szérum): A legfontosabb hím nemi hormont, a tesztoszteront, a here Leydig sejtjei szintetizálják. A tesztoszteron a here Sertoli sejtjeire hatva segíti a spermatogoniumokból a normális spermiumok differenciálódást, valamint részt vesz a hímekre jellemző viselkedés szabályozásában. Laboratóriumi rágcsálók esetében a tesztoszteron plazmaszintje: egér: 1-2 ng/ml; patkány: 2-2,5 ng/ml. További specieszekben: sertés kan: 4,5-8 ng/ ml, mén: 1,9-2,1 ng/ ml, egészséges fiatal férfi: 2,5-8,6 ng/ ml, öregedő férfi: 1,9-7,3 ng/ ml. Az egészséges tesztoszteron szint fenntartása az öregedő szervezetben a reprodukció mellett fontos a kardiovaszkuláris és a metabolikus egészség fenntartása érdekében is.

A tesztoszteronnak hatása van - a központi idegrendszeren keresztül - a magatartásra és a viselkedésre. Általában igaz, hogy a tesztoszteron a dominancia hormonja, embernél és állatoknál egyaránt. Közösségben élő fajoknál a pro-szociális magatartási (egymást segítő, támogató) és az anti-szociális, agresszivitásra utaló és tesztoszteron-függő magatartásformák egyaránt megfigyelhetők.

A humán és az állati termékenység fokozására a spermiumok számának, életképességének és termékenyítő-képességének javítására mind a humán-, mind az állatgyógyászatban különböző vitaminkészítményeket (A, B, C, D, E vitaminok), antioxidánsokat (ferulasav, CoenzimQ, karnitin, zöld tea), mikro-és makroelemeket (Fe, Zn, Se, Cu, Mn, Cr) használnak. A gyógynövények közül a királydinnyét (Tnbulus terrestris), az aswagandhát (Withania somnifera) és a görögszénát (Trigonella foenum-graecum) javasolják. Noha egyes készítmények több komponenst is tartalmaznak a felsoroltak közül, sajnálatos módon az ilyen kezelések nem eléggé specifikusak és nem eléggé hatékonyak.

A találmány kidolgozása során azt találtuk, hogy a Lactiplantibacillus plantarum SNI3 kompozíciói hatásosak hímek reproduktív képességének javítására.

A technika állása:

Az US2021023147 (Al) amerikai egyesült államokbeli közzétételi dokumentum vércukorszintcsökkentő és antioxidáns hatású Lactobacillus törzset ismertet.

A CA3105723 (Al) kanadai közzétételi dokumentum reutericiklin vagy annak analógjának alkalmazása súlygyarapodás csökkentésére vagy súlyvesztés kiváltására.

A WO2017223364 (Al) nemzetközi közzétételi dokumentum szerinti találmány kutya nyálából izolált Lactobacillus reuteri baktériumoknak az alany testtömegét módosító alkalmazására vonatkozik.

A Probio24 (Nutraceutics Ltd.) elnevezésű étrend-kiegészítő (https://probio24.nutraceutics.hu/) kereskedelmi forgalomban kapható probiotikum, egy 11 probiotikus törzset tartalmazó komplexum, amely a Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium lactis, Lactobacillus rhamnosus, Bifidobacterium breve, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, és Lactococcus lactis fajok törzseit tartalmazza.

A Bio-Kult elnevezésű étrendkiegészítő (https://bio-kult.hu/) (forgalmazza a Vitaminkosár Kft.) kapszula az élő baktériumflóra 14-féle törzsét tartalmazza (Lactobacillus paracasei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus, Bacillus subtilis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus lactis, Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus helveticus, és Lactobacillus salivarius).

A Bőrre és munkatársai és Codagnone és munkatársai által közölt cikkek szerint a magasabb rendű szervezetekkel együtt élő egysejtű pro- és eukarióta szervezetek összessége a mikrobiom, mely jelentős hatást gyakorol a gazdaszervezet működésére [1, 2].

Palleja és munkatársai szerint a mikrobiom a test-környezet határterületeit népesíti be, fajszáma különböző becslések alapján több ezer. A mikrobiom legjobban tanulmányozott része a bél mikrobiális közössége [3].

A Ghosh és munkatársai, valamint Saeedi és munkatársai által közölt cikkek szerint a tejsavbaktériumok ugyan a bél mikrobiomnak csak kis hányadát alkotják, funkcionális jelentőségük azonban túlmutat mennyiségi előfordulásukon [4, 5].

A Poutahidis és munkatársai, Warda és munkatársai, Thomas és munkatársai, valamint Prete és munkatársai által közölt cikkek szerint a gazdaszervezet számára előnyös tulajdonságokat közvetítő probiotikumok többsége a tejsavbaktériumok rendszertani kategóriából kerül ki. A tejsavbaktériumok jótékony hatást gyakorolnak a gazdaszervezet bélműködésére a kórokozó baktériumok kiszorításával, serkentik az immunrendszer működését, a mukozális immunitást, elhízást csökkentő irányba változtatják a gazdaszervezet anyagcseréjét, valamint gyulladáscsökkentő és antioxidáns hatású metabolitokat termelnek [6-9],

A Poutahidis és munkatársai, Fáddá és munkatársai, Sheikh és munkatársai és Varian és munkatársai által közölt cikkek szerint az elmúlt években néhány olyan tanulmány is megjelent, ami arra utal, hogy egyes tejsavbaktériumok a hím reprodukciós működést is kedvezően befolyásolhatják [10-13],

Felismerés

A találmány kidolgozása során végzett kísérleteinkben azt találtuk, hogy a kutatásunk során, az általunk izolált - NCAIM (P) B 001482 szám alatt letétként deponált Lactiplantibacillus plantarum SNI3:

- pro-reprodukciós (spermiumszám és tesztoszteron szint növelő), agresszivitást és szorongást csökkentő (pszichobiotikus hatás),

- valamint testzsír csökkentő hatással rendelkezik. Ezt az új, összetett, több előnyös testi és magatartásbeli változást okozó hatást teszteltük laboratóriumi rágcsálók modelljében.

Általános megoldás ismertetése összhangban a főigényponttal

Találmányunk az általunk izolált - és a NCAIM (P) B 001482 szám alatt letétként deponált Lactiplantibacillus plantarum SNI3 baktérium törzsre, a Lactiplantibacillus plantarum SNI3 baktérium törzset tartalmazó készítményekre, a készítmények hím gerinces állatok, tenyészállatok és humán férfiak viselkedésének, magatartásának, sovány testtömeg arányának kedvező megváltoztatására, testzsír csökkentésére, reprodukciós képességének, spermiumszámának és tesztoszteron szintjének növelésére vonatkozó alkalmazására terjed ki.

Az SNI3 baktérium törzset tartalmazó készítmény táplálék-kiegészítőre, ivóvízre, ivólére, tápanyagra, táplálékra, takarmányra és/vagy étrend kiegészítő vonatkoztatva grammonként vagy milliliterenként W-IO CFU-nak megfelelő mennyiségben tartalmazza a Lactiplantibacillus plantarum SNI3 baktérium törzset.

A készítmény előnyösen az élő baktérium törzset, hővel elölt baktériumot, a baktérium lizátumát, a baktérium bármely alkotórészét és/vagy annak metabolitját tartalmazza.

A találmányunk még az SNI3 baktérium törzset tartalmazó készítmény alkalmazására is vonatkozik. Az alkalmazás hím gerinces állatok és humán férfiak reprodukciós állapotának javítására, spermiumszám növelésére, az agresszivitás és a szorongás csökkentésére vonatkozik.

A készítmény gyógynövényeket, mannózt vagy manno-oligoszacharidokat is tartalmazhat.

A találmányunk szerinti készítményt valamely takarmány vagy táplálékkiegészítő por, oldat, szirup, tejtermék, kapszula, tabletta vagy rágótabletta tartalmazza.

A találmányra az jellemző, hogy az ismert módon előállított és kívánt esetben hővel vagy ultrahanggal előkezelt Lactiplantibacillus plantarum SNI3 baktériumot a gyógyszertechnológiában szokásosan alkalmazott vivő- és segédanyagokkal gyógyszerkészítménnyé vagy táplálék kiegészítő készítménnyé alakítjuk.

Vizsgálatainkat 2018-2021 között felnőtt, C57B16 törzsbe tartozó hím egereken és Wistar patkányokon végeztük. Az állatokat standard laboratóriumi körülmények között tartottuk, az ELKH-Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézet „minimál disease-MD állatházában, 21 ±1 °C hőmérsékleten, 50% páratartalom mellett, 12 h sötét/ 12 h világos fényperiódusban. Az állatok rágcsáló tápot ad libitum kaptak.

A Lactiplantibacillus plantarum SNI3 törzset folyékony MRS táptalajban növesztettük 37 °C hőmérsékleten, zárt edényben, 48 órán keresztül, majd a baktériumokat többszöri centrifugálásmosás után ultraszűrt itatóvízben szuszpendáltuk. A Lactiplantibacillus plantarum SNI3 szuszpenzióval az állatokat 4 héten keresztül itattuk, az itatófolyadékot minden nap cseréltük. A Lactiplantibacillus plantarum SNI3 mennyisége ~l-5xl0⁶ CFU/ ml volt az itatóüvegekben. A kontroll állatok ultraszűrt itatóvizet kaptak.

Egyes esetekben a Lactiplantibacillus plantarum SNI3 tenyészet sejtmentes felülúszóját itattuk az állatokkal 4 héten keresztül, ebben az esetben kontrollként az MRS tápoldat szolgált.

Más esetekben a Lactiplantibacillus plantarum SNI3 sejteket a tenyésztés végén fiziológiás sóoldatban szuszpendáltuk és 1 órán keresztül 80 °C hőmérsékleten hőkezeltük. Az így nyert hőkezelt sejteket itatóvízbe keverve 4 héten keresztül itattuk az állatokkal.

Megint más esetben a Lactiplantibacillus plantarum SNI3 sejteket a tenyésztés végén fiziológiás sóoldatban szuszpendáltuk és ultrahanggal kezeltük. A lizátumot 0,2 μηι filteren átszűrve adagoltuk az állatok itatóvizébe. Ebben az esetben is 4 héten keresztül történt a kezelés.

Az állatok testtömegét hetente mértük, testösszetételüket az itatás kezdete előtt és a kísérlet végén EchoMRI™ készülékkel analizáltuk.

A vizsgálat végén az egereken szociális interakció, és marble burying viselkedés teszteket végeztünk.

Az állatokat dekapitáltuk, a vért centrifugáltuk, a szérumból tesztoszteron szintet mértünk ELISA módszerrel. A mellékheréből izoláltuk a spermiumokat és Bürker kamra segítségével megszámoltuk a sejtek számát. Mértük a csecsemőmirigy, a mellékvesék, a lép és a herék tömegét, eltávolítottuk és folyékony N2-ben fagyasztottuk a bal oldali májlebenyt, a vastagbelet és az egyik oldali herét. A vastagbéltartalomból mintát vettünk és szárazjégen fagyasztottuk. A másik oldali herét formaiinban fixáltuk, paraffinba ágyaztuk hematoxylin-eozin festés utáni szövettani vizsgálatra.

A hatóanyag alkalmazását az alábbi példákkal illetve a példákhoz kapcsolódó ábrák segítségével mutatjuk be.

Ábrák ismertetése:

1. ábra: A Lactiplantibacillus plantarum SNI3 élő baktérium kezelés hatása egerek testzsír %-ára.

2. ábra: Lactiplantibacillus plantarum SNI3 kezelés hatása az agresszív magatartás elemek gyakoriságára.

3. ábra: A Marble burying teszt eredménye.

4. ábra: A relatív heretömeg alakulása a vizsgált és a kontroll csoportban.

5. ábra: A vizsgált és a kontroll-csoport-béli egerek heréjének hematoxylin-eozin festés utáni mikroszkópos képe.

6. ábra: A herecsatornák területe a vizsgált és a kontroll-csoport-béli egereknél.

7. ábra: A csírahám megvastagodása a vizsgált és a kontroll-csoport-béli egereknél.

8. ábra: Az egér epididimisből (mellékhere) izolált spermium-szám alakulása.

9. ábra: A tesztoszteron szint változása a vérszérumban.

10. ábra: A Lactiplantibacillus plantarum SNI3 különböző formáinak hatása az egerek here tömegére.

11. ábra: A Lactiplantibacillus plantarum SNI3 különböző formáinak hatása az egerek spermium számára.

12. ábra: A patkány epididimisből izolált spermiumok száma a vizsgált és a kontroll csoportban.

13. ábra: Különböző (prebiotikus) szénhidrátok hatása a Lactiplantibacillus plantarum SNI3 sejtkoncentrációjára

Az 1. ábrán Lactiplantibacillus plantarum SNI3 élő baktérium kezelés testzsírra gyakorolt hatása látható. Az ábrán jól látható, hogy a testtömegre vetített zsírtartalom csökken: a test-tömegre vonatkoztatott EchoMRI-vel mért értékek. Átlag + SEM. Nem párosított t-teszt, p=0,014.

A 2. ábrán a Lactiplantibacillus plantarum SNI3 itatás hatása látható az agresszív magatartás elemek (fenyegetés, támadás, harapás) gyakoriságára egy úgy nevezett szociális interakció tesztben. Átlag + SEM. Nem párosított t-teszt, p=0,050. Jól látható, hogy a vizsgálati állatok agresszív magatartás elemek gyakorisága a nullához közelít a kontroll állatok viselkedéséhez (3-as érték) képest.

A 3. ábrán a kísérleti állatokon elvégzett „Marble burying teszt eredménye látható. A vizsgálat a szorongás mértékét vizsgálja. Az egerek a ketrecükbe helyezett golyókat eltemetik, az eltemetett golyók száma arányos a szorongás mértékével. Az ábrán a kontroll (csapvízzel itatott), illetve a Lactiplantibacillus plantarum SNI3-mal 4 héten keresztül itatott egerek által eltemetett golyók számát ábrázoltuk. Átlag + SEM. Nem párosított t-teszt, p=0,0011.

A 4. ábrán látható a Lactiplantibacillus plantarum SNI3 élő baktérium 4 hétig tartó itatásának hatása a testtömegre vonatkoztatott here tömegre (here tömege mg-ban/ testtömeg g-ban). Átlag + SEM. Nem párosított t-teszt, p= 0,0114.

Az 5. ábrán látható a vizsgálati egerek heréjének hematoxylin-eozin festés utáni mikroszkópos képe. A kontroll (csapvízzel itatott) csoporthoz viszonyítva a Lactiplantibacillus plantarum SNI3 baktériummal itatott egerek csoportjában látható a herecsatornácskák mértének, a csírahámnak, valamint az intersticiális sejtek területének megnövekedése.

A 6. ábrán a kísérletben részt vevő egerek herecsatornáinak területének méretváltozása látható.

A kontroll (csapvízzel itatott) egerek esetében mért érték (16500 pm²) a 4 héten keresztül itatott Lactiplantibacillus plantarum SNI3 baktériummal itatott egereknél 17500 pm² re növekedett, azaz 6%-os területnövekedés volt tapasztalható. Átlag + SEM. Nem párosított t-teszt p<0,05.

A 7. ábrán jól látható a csírahám megvastagodása Lactiplantibacillus plantarum SNI3 baktérium itatása után 4 héttel hím egerek hereszövetében a kontroll (csapvízzel itatott) egerek értékeihez viszonyítva. Átlag + SEM. Nem párosított t-teszt, p=0,0002.

A 8. ábrán jól látható az epididimisből izolált spermiumok számának alakulása a vizsgált és a kontroll-csoport-béli egereknél. A kezelt csoportban a spermium szám 3-szorosra nőtt.

A 9. ábrán látható a tesztoszteron szint változása a vérszérumban kontroll (csapvízzel itatott) és Lactiplantibacillus plantarum SNI3 kompozícióval történő 4 hetes kezelés után. A kezelt csoportban a tesztoszteron szint 8-szorosára emelkedett. ELISA méréssel nyert adatok, átlag + SEM értékek. Nem párosított t-teszt p=0,003.

A 10. ábrán látható a Lactiplantibacillus plantarum SNI3 különböző formáinak** hatása a here tömegre egerekben.

* *(élő baktérium, az élő baktérium tenyészet felülúszója, baktérium lizátum, illetve a hőinaktivált baktérium).

A 11. ábrán jól látható az epididimisből izolált spermiumok száma kontroll (csapvízzel itatott)

- Lactiplantibacillus plantarum SNI3 élő kompozícióval,

- az élő SNI3 baktériumok tenyészetének felülúszójával,

- az SNI3baktériumok lizátumával, illetve

- a hőinaktivált Lactiplantibacillus plantarum SNI3-mal itatott egereknél.

Átlag + SEM. Nem párosított t-teszt, ***p= 0,0024; *p= 0,0154.

A legnagyobb spermiumszámot az élő Lactiplantibacillus plantarum SNI3 kompozícióval itatott egereknél kapjuk (2.6-szoros emelkedés a kontroll csoporthoz képest).

A 12. ábra a patkány epididimisből izolált spermiumok számának változását mutatja be

- kontroll és

- Lactiplantibacillus plantarum SNI3 kompozícióval itatott Wistar patkányoknál. Megállapíthatjuk, hogy a vizsgált csoportban a spermium szám 1,3-szorosára emelkedett a kezeletlen kontroll csoporthoz viszonyítva.

Átlag + SEM. Nem párosított t-teszt, p= 0,0402.

A 13. ábrán látható Lactiplantibacillus plantarum SNI3 tenyészetéhez 2%-koncentrációban hozzáadott szénhidrátok hatása baktérium sejtkoncentrációjára/ tenyészetének optikai denzitására 37 °C-on, 48 óra alatt, szénhidrátmentes MRS táplevesben (MRS-G: szénhidrátmentes MRS tápleves, G: glükóz, L: laktóz, X: xilooligoszacharidok, M: mannóz, MO: mannooligoszacharidok). Az ábrán jól látható, hogy a mannóz illetve a mannooligoszacharidok hozzáadása a legmegfelelőbb a Lactiplantibacillus plantarum SNI3 növekedéséhez.

Példák ismertetése:

1. példa: A Lactiplantibacillus plantarum SNI3 kompozíció hatása hím egereken (C57B16)

A Lactiplantibacillus plantarum SNI3 baktérium potenciális terápiás hatásának vizsgálatához felnőtt hím egereket két csoportba osztottunk.

Az egyik csoport - a kontroll (csapvízzel itatott) csoport - szűrt ivóvizet kapott.

A másik csoport - a Lactiplantibacillus plantarum SNI3 baktérium élő szuszpenzióját - SNI3 kompozíciót kapott szűrt ivóvízbe keverve, ahol az alkalmazott dózis: 1-5x10⁶ CFU/ ml, négy héten keresztül.

la) Az egereket 4 héten keresztül szűrt csap vízzel itattuk.

lb) Az egereket 4 héten keresztül Lactiplantibacillus plantarum SNI3 kompozícióval itattuk.

A Lactiplantibacillus plantarum SNI3 kompozíció hatása az egerek testösszetételre: a 4 hetes vizsgálat végén a Lactiplantibacillus plantarum SNI3 kompozícióval kezelt állatok testtömegre vonatkoztatott testzsír százaléka 8%-ról 5%-ra csökkent. EchoMRI-vel mért értékek. Átlag + SEM. Nem párosított t-teszt, p=0,014.

Az 1. ábrán bemutatjuk az egerek teljes test tömegéhez viszonyított testzsír arányt:

a) csapvízzel itatott (kontroll csoport) illetve

b) Lactiplantibacillus plantarum SNI3 baktérium kompozícióval itatott állatok esetében.

2. példa: Ugyanúgy jártunk el, mint az első példa esetében, csak ebben az esetben az agresszív viselkedést (fenyegetés, támadás és harapás) mértük, szociális interakció tesztben.

A Lactiplantibacillus plantarum SNI3 kompozíció hatása a szociális (agresszív) viselkedésre, amint az a 2. ábrán látható. Az ábrán bemutatjuk, hogy az egereket:

a) szűrt ivóvízzel itatva az agresszív magatartási elemek gyakorisága megközelíti a 3-at, míg a b) Lactiplantibacillus plantarum SNI3 kompozíciót tartalmazó folyadékkal (vízzel) négy hétig itatva, annak hatására, az agresszív magatartás-elemek gyakorisága szinte nullára csökken.

Átlag + SEM. Nem párosított t-teszt, p=0,050.)

3. példa: A Lactiplantibacillus plantarum SNI3 kompozíció hatása az egerek szorongásos viselkedésére. Ugyanúgy jártunk el, mint az első példa esetében, csak ebben az esetben a kezelt és kontroll (csapvízzel itatott) egereken elvégeztük a „Marble burying tesztet. Ez a viselkedési teszt a szorongásos és a kényszeres magatartást mutatja. Minél kevésbé szoronganak a kísérleti állatok, annál kevesebb golyót temetnek el az alomra helyezett golyók közül. Ez a viselkedési teszt azt jelezte, hogy a szorongás mértéke szignifikánsan kisebb a Lactiplantibacillus plantarum SNI3-mal kezelt egereknél a kontroll (csapvízzel itatott) csoporthoz viszonyítva (3. ábra).

A 3. ábrán bemutatjuk, hogy a 4 hetes Lactiplantibacillus plantarum SNI3 kompozícióval történő itatás csökkentette az állatok szorongását. A „Marble burying teszt eredménye: az eltemetett golyók száma kevesebb volt a Lactiplantibacillus plantarum SNI3 kompozícióval itatott egerek esetében, mint a csapvízzel itatott kontroll egerek esetében. A 3. ábrán a kontroll (csapvízzel itatott), illetve az SNI3-mal 4 héten keresztül itatott egerek által eltemetett golyók számát ábrázoltuk. Átlag + SEM. Nem párosított t-teszt, p=0.0011.

4. példa: A Lactiplantibacillus plantarum SNI3 kompozíció hatása az egerek heretömegére. Ugyanúgy jártunk el, mint az első példa esetében. Az állatokat a vizsgálat végén felboncoltuk és megmértük a here tömegét. A mérések eredményei azt mutatták, hogy a here tömege mind abszolút mértékben, mind a testtömegre vonatkoztatva nőtt az élő Lactiplantibacillus plantarum SNI3 baktériummal itatott egerekben a csapvízzel itatott kontroll csoporthoz viszonyítva. A mérés eredménye a 4. ábrán látható, a Lactiplantibacillus plantarum SNI3 kompozícióval itatott egerek esetében az egerek heretömegében szignifikáns növekedés tapasztalható a csapvízzel itatott kontroll csoporthoz képest. A Lactiplantibacillus plantarum SNI3-mal itatott egerek heretömege 1,11 szeresére nőtt a kontrolihoz viszonyítva.

A 4. ábrán bemutatjuk a here testtömegre viszonyított tömegének emelkedését a kompozíció alkalmazása után. A Lactiplantibacillus plantarum SNI3 élő baktérium 4 hétig tartó itatásának hatása a testtömegre vonatkoztatott here tömegre (here tömege mg-ban/ testtömeg g-ban). Átlag + SEM. Nem párosított t-teszt, p= 0,0114.

Ezzel párhuzamosan mikroszkóppal megvizsgáltuk a hereszövetet is.

Az 5. ábrán bemutatjuk a here mikroszkópos szerkezetét, a 6. ábrán a herecsatornák területének változását, a 7. ábrán pedig a csírahám megvastagodását.

5. példa: A Lactiplantibacillus plantarum SNI3 kompozíció hatása az egerek spermiumszámára. Ugyanúgy jártunk el, mint az első példa esetében. Az itatási kísérlet végén Bürker kamrában megszámoltuk az állatok epididimiséből (mellékhere) preparált spermiumok számát. Lactiplantibacillus plantarum SNI3 kompozíciót ivó egerek mellékheréjében a spermiumok száma 3x-ra emelkedett a csapvízzel itatott egerek spermiumszámához képest.

A 8. ábrán bemutatjuk a mellékheréből izolált spermiumok számát Lactiplantibacillus plantarum SNI3 kompozícióval, illetve csap vízzel itatott (kontroll) egerek esetében. Átlag spermium db/ μηι²+ SEM. Nem párosított t-teszt, p<0,001.

6. példa: A Lactiplantibacillus plantarum SNI3 kompozíció hatása az egerek szérum tesztoszteron szintjére. Ugyanúgy jártunk el, mint az első példa esetében. Az itatási kísérlet végén az állatok szérumában ELISA módszerrel megmértük a tesztoszteron szintet. A mérés eredménye szerint a Lactiplantibacillus plantarum SNI3 kompozícióval itatott állatok tesztoszteron szintje 1,46 ± 0,54 ng/ml-ről 11,9 ± 3,46 ng/ml-re emelkedett (8.15-szeres emelkedés).

A 9. ábrán bemutatjuk a Lactiplantibacillus plantarum SNI3-mal itatott egerek szérum tesztoszteron szintjét a csapvízzel itatott kontroll egerek tesztoszteron szintjéhez képest. Átlag + SEM értékek. Nem párosított t-teszt p= 0,003.

7. példa: Lactiplantibacillus plantarum SNI3 élő baktérium, az élő baktérium tápfolyadékának sejtmentes frakciója, a Lactiplantibacillus plantarum SNI3 hővel inaktívált, valamint ultrahanggal lizált változatainak összehasonlítása. Annak eldöntésére, hogy a Lactiplantibacillus plantarum SNI3 élő baktériumhoz képest mennyire hatásos a Lactiplantibacillus plantarum SNI3 baktérium tenyészet felülúszója, hővel inaktivált, illetve ultrahanggal bontott (lizált) formája, a felnőtt hím C57B16 egereket 5 csoportba osztottuk:

Az első csoport - a kontroll (csapvízzel itatott) csoport - szűrt ivóvizet kapott.

A második csoport - a Lactiplantibacillus plantarum SNI3 baktérium élő szuszpenzióját - SNI3 kompozíciót kapott szűrt ivóvízbe keverve, ahol az alkalmazott dózis: 1-5x10⁶ CFU/ ml volt.

A harmadik csoport - a Lactiplantibacillus plantarum SNI3 baktérium 48 órás élő tenyészetének felülúszó, sejtmentes tápfolyadékát itta.

A negyedik csoport - a Lactiplantibacillus plantarum SNI3 baktérium (l-5xl0⁶ CFU/ ml) ultrahanggal lizált szuszpenzióját kapta szűrt ivóvízbe keverve. [A lizátum készítése: a baktérium pellet lizozimmel történő kezelése (4 h, 37 °C) után szonikálás 25x1 perc, 20 kHz, a szuszpenzió szűrése 20 μηι filteren keresztül].

Az ötödik csoport - a Lactiplantibacillus plantarum SNI3 baktérium (l-5xlO⁶CFU/ ml) hőinaktivált (80 °C, 1 h) formáját itta.

Minden kezelési csoportot 4 héten keresztül itattunk.

A 10. ábrán bemutatjuk az itatási kísérlet hatását az egerek here tömegére. Az ábrán látható, hogy a legnagyobb herenövelő hatást az élő Lactiplantibacillus plantarum SNI3 baktériummal értük el, de a hőinaktivált Lactiplantibacillus plantarum SNI3 is szignifikáns here tömeg növekedést okozott a kontroll csoporthoz képest.

A 11. ábrán bemutatjuk az itatási kísérlet hatását az egerek spermium számára. A kísérlet végén a mellékheréből preparáltuk a spermiumokat és Bürker kamrában megszámoltuk. Az ábrán látható, hogy a spermium szám a legnagyobb mértékben az élő Lactiplantibacillus plantarum SNI3mal itatott egereken mutatkozott. Kisebb mértékű, de szignifikáns emelkedést tapasztaltunk a baktérium tenyészet sejtmentes felülúszójával történt itatás után is.

8. példa: A Lactiplantibacillus plantarum SNI3 kompozíció hatása patkányok spermiumszámára.

A vizsgálatban adult hím Wistar patkányokat 2 csoportba osztottuk:

A másik csoport - a Lactiplantibacillus plantarum SNI3 baktérium élő szuszpenzióját - SNI3 kompozíciót kapott szűrt ivóvízbe keverve, ahol az alkalmazott dózis: 1-5x10⁶ CFU/ ml volt.

Mindkét csoportot 4 héten keresztük itattuk. A kísérlet végén az epididimisből (mellékhere) izoláltuk a spermiumokat és Bürker kamrában megszámoltuk. A 12. ábrán bemutatjuk az itatási kísérlet hatását a patkányok spermium számára. A 12. ábrán látható, hogy a Lactiplantibacillus plantarum SNI3 élő baktérium készítmény patkányokon is mintegy 30%-kal növelte a spermiumok számát.

9. példa: Prebiotikumok hatása a Lactiplantibacillus plantarum SNI3 baktérium szaporodására

A Lactiplantibacillus plantarum SNI3 pozitív hatásainak kifejtésében prebiotikumok alkalmazásával támogatható. A prebiotikumok olyan anyagok, melyek elősegítik a jótékony hatású baktériumok/mikroorganizmusok szaporodását, leggyakrabban azzal, hogy specifikus tápanyagként szolgálnak nekik. A törzset esetlegesen támogató prebiotikus anyagok közül a következő szénhidrátok hatását vizsgáltuk meg: laktóz, xilóz, mannóz, xilooligoszacharidok és mannooligoszacharidok. A hatásukat minden esetben a baktériumok által előszeretettel hasznosított glükózhoz viszonyítva határoztuk meg. Optikai denzitás mérésével 595 nm-en Filtermax Multimode Reader készülék segítségével vizsgáltuk a baktérium szaporodását különböző szénhidrátok jelenlétében. A mért adatokra Baranyi modellt illesztve meghatároztuk 37 °C-on a szaporodást jellemző paramétereket (szaporodási sebességet, lagfázist és maximális sejttömeget jellemző mennyiségeket). Negatív kontrolként szénhidrátot nem tartalmazó MRS táplevest alkalmaztuk, ehhez 0,2%-ban adtuk hozzá a szénhidrátokat.

A 13. ábrán bemutatjuk a különböző szénhidrátok hatását a Lactiplantibacillus plantarum SNI3 sejtkoncentrációjára. Az ábrán látható, hogy prebiotikumként a Lactiplantibacillus plantarum SNI3 baktérium szaporodásának támogatására mannóz, illetve mannooligoszacharid megfelelő. Ezeket a szénhidrátokat az Aloe vera tartalmazza nagy mennyiségben.

A találmányunk szerinti megoldás alkalmazásával elért előnyök ismertetése:

A Lactiplantibacillus plantarum SNI3 törzs NCAIM (P) B 001482 szám alatt szabadalmi letétként deponált mikroba alapú készítmény, eddig nem ismert módon, egyszerre, kombináltan mutatja az alábbi pozitív élettani és mentális hatásokat:

- testzsír százalék csökkenése (több mint 30%-os);

- szorongás oldó hatás (anxiolizis);

- here relatív tömegének és a herecsatornák területének növekedése, a csírahám megvastagodása (<10 %-os)

- spermiumszám növekedése (< 1,5- szeres);

io - a tesztoszteron szint emelkedése (5-8-szoros) _ - a tesztoszteron szint növekedés nem társul az egyébként feltételezett agresszív magatartással, sőt az agresszivitás mért értéke gyakorlatilag nulla.

Irodalom

[1] Bőrre YE, Moloney RD, Clarke G, Dinan TG, Cryan JF. The impact of microbiota on brain and behavior: mechanisms & therapeutic potential. Adv Exp Med Biol. 2014;817:373-403.

[2] Codagnone MG, Spichak S, OMahony SM, O'Leary OF, Clarke G, Stanton C, et al. Programming Bugs: Microbiota and the Developmental Origins of Brain Health and Disease. Biol Psychiatry. 2019;85(2):150-63.

[3] Palleja A, Mikkelsen KH, Forslund SK, Kashani A, Allin KH, Nielsen T, et al. Recovery of gut microbiota of healthy adults following antibiotic exposure. Nat Microbiol. 2018;3(ll):1255-65.

[4] Ghosh TS, Arnoux J, O'Toole PW. Metagenomic analysis reveals distinct patterns of gut lactobacillus prevalence, abundance, and geographical variation in health and disease. Gut Microbes. 2020;12(l):l-19.

[5] Saeedi BJ, Liu KH, Owens JA, Hunter-Chang S, Camacho MC, Eboka RU, et al. Gut-Resident Lactobacilli Activate Hepatic Nrf2 and Protect Against Oxidative Liver Injury. Cell Metab. 2020;31 (5):956-68 e5.

[6] Poutahidis T, Kearney SM, Levkovich T, Qi P, Varian BJ, Lakritz JR, et al. Microbial symbionts accelerate wound healing via the neuropeptide hormone oxytocin. PLoS One. 2013;8(10):e78898.

[7] Warda AK, Rea K, Fitzgerald P, Hueston C, Gonzalez-Tortuero E, Dinan TG, et al. Heat-killed lactobacilli alter both microbiota composition and behaviour. Behav Brain Res. 2019;362:213-23.

[8] Thomas CM, Hong T, van Pijkeren JP, Hemarajata P, Trinh DV, Hu W, et al. Histamine derived from probiotic Lactobacillus reuteri suppresses TNF via modulation of PKA and ERK signaling. PLoS One. 2012;7(2):e31951.

[9] Prete R, Long SL, Gallardo AL, Gahan CG, Corsetti A, Joyce SA. Beneficial bile acid metabolism from Lactobacillus plantarum of food origin. Sci Rep. 2020;10(l):1165.

[10] Poutahidis T, Springer A, Levkovich T, Qi P, Varian BJ, Lakritz JR, et al. Probiotic microbes sustain youthful serum testosterone levels and testicular size in aging mice. PLoS One. 2014; 9(l):e84877.

[11] Fadda LM, Alhusaini AM, Al-Qahtani QH, Ali HM, Hasan IH. Role of alpha-tocopherol and Lactobacillus plantarum in the alleviation of mercuric chloride-induced testicular atrophy in rat's model: Implication of molecular mechanisms. J BiochemMol Toxicol. 2020;34(6):e22481.

[12] Sheikh Hosseini S, Gol A, Khaleghi M. The effects of the Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 on the oxidative stress of reproductive system in diabetic male rats. Int J Reprod Biomed. 2019;17(7):493-502.

[13] Varian BJ, Poutahidis T, DiBenedictis BT, Levkovich T, Ibrahim Y, Didyk E, et al. Microbial lysate upregulates host oxytocin. Brain Behav Immun. 2017;61:36-49.

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Az NCAIM (P) B 001482 szám alatt letétként deponált Lactíplantibacillus plantarum SNI3 baktériumtörzs.
2. Készítmény, amely grammonként vagy milliliterenként 101-10^{10 11} CFU-nak megfelelő mennyiségű 1. igénypont szerinti baktériumtörzset tartalmaz.
3. A 2. igénypont szerinti készítmény, amely grammonként vagy milliliterenként 1-5 x 10⁸ CFUnak megfelelő mennyiségű 1. igénypont szerinti baktériumtörzset tartalmaz.
4. A 2. vagy 3. igénypont szerinti készítmény, amely táplálék-kiegészítő, ivóvíz, ivólé, tápanyag, táplálék, takarmány és/vagy étrend kiegészítő.
5. A 2-4. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely por, oldat, szirup, tejtermék, kapszula, tabletta vagy rágótabletta.
6. A 2-5. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely élő Lactíplantibacillus plantarum SNI3 baktériumtörzset, elölt, előnyösen hővel elölt Lactíplantibacillus plantarum SNI3 baktériumtörzset, vagy

Lactíplantibacillus plantarum SNI3 baktériumtörzs-lizátumot tartalmaz.
7. A 2-6. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely gyógynövényeket, mannózt vagy manno-oligoszacharidokat is tartalmaz.
8. Az 1. igénypont szerinti baktériumtörzs vagy a 2-7. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, hím gerinces élőlények reprodukciós állapotának javításában történő alkalmazásra.
9. A 8. igénypont szerinti baktériumtörzs vagy készítmény alkalmazásra, ahol a hím gerinces élőlény ember.