HU231064B1 - Anti-ErbB2 antitestek adagolási sémái és alkalmazásuk rákos betegségek kezelésére - Google Patents

Description

Anti~EzbB2 antitestek adagolási, sárnál és alkalmazásuk rákos betegségek kezelésére

15723 KB » X

monoklonális antitestet írtak le. Ez az ezzitest (7.16.4) a Bl04-1-1 sejteken f név proto-onkoqénnel transzfektált NIH3T3 sejtek; a pl-85 sejkőfelületi termelődésének gátlását eredményezi. Drebin és mtsai.: _:[Proc. Natl. Acad. Sci> USA 83, 9129 (1986)} kimutatták,· hogy a 7.16.4 antitest gátolja a csupasz (nude”) egerekbe ültetett - neü-onkogénnel transzformált - NIH~3T3~sejtek és a pat kányereő.etfí neuroblastoma-aejtek (amelyekből a n.eu-onkogént eredetileg izolálták) tumorogén szaporodását. Drebin és mtsai. [Oncogene 2, 387 (1988} ] patkányeredetű .nea-géntermék elleni antitestek előállítását írták le. Valamennyi antitestről kimutatták,· hogy ueu-onkogénnel transzformált, lágy agarban szuszpendált sejtekre oitoaztabikua hatást gyakoroltak. Az IgM, IgG2a és IgG2b izotípuaó antitestek - komplement jelenlétében - a neu-onkogénnel transzformált sejtek jelentős mértékű in vit.ro líziset közvetítették, miközben ugyanezen sejtek esetében, az. antitestek agyike sem közvetített nagymértékű antítest-depenőens celluláris eitotozici.tást (ADCC). Drebin és mtsai. (Oncogene 2, 387 (1988}j beszámoltak erről is, hogy a pl85-moleknla két külön régiójával reaktív antitestek elegye! a csupasz egerekbe implantált neu-onkogénnel transzformáit - NIH-3T3-sejtökre szinergikus tumorellenes hatást fejtettek ki. Az. anti-neu antitestek biológiai hatásainak áttekintését illetően ld. Myers és mtsai.; Meth. Enzym. 198, 277 (1991}; valamint, a WO

99/22478 számú nemzetközi közzétételi iratot.

hudziak és mtaai. [líol. Coll. Bioi. 9(3j _f 1165 (1989} j antl-ErbSÍ antitestek sorozatának létrehozását írták le, mely antitesteket az SK-BR-3 humán emlőtumor-sejtvonal alkalmazásával karakterizálták. Az SK-BR-3 sejtek - antitestekkel történő érint keztetés utáni - relatív pro.1 iterációját az egyrétegű, sejttenyészetek 72 óra elteltével végzett kristályibolya. festésével határozták meg. E vizsgálati eljárásban a maximális gátlást a 4D5-antitesttel kapták, amely a sejtek pro.1 iterációját 56 %-bari gátolta. A szóban forgó antitest-sorozat egyéb tagjai (pl. 7C2 és 7F.3) e vizsgálati eljárásban kisebb mértékben gátolták a sejtproli f©rációt. Megállapították továbbá, hogy a 4D5-antitest a pl85^erj>áz--t túlzott mértékben termelő emlőtumor·sejtvonalakat szenzitizálja a TNF citotoxikus hatásaira, [ld. még a WO 69/06692 számú nemzet közi közzétételi iratot]. A Hubaiak és másai, által leirt anti-ErbS2 antitestek további karakter!zálását illetően ld. Fendly és másai.: Canoer Research 50, 1550 (1990); Kotts és másai.: In Vitro 26(3), 59A (1990); Harap és másai.: Growth Regulátion 1, 72 (1991); Shepard. és másai. : J. Ölin. Immunoi. 11(3), 117 (1991); Kumar és másai.·: Mól. Oell. Bioi. 11(2)., 979 (1991); Lew.is és másai.: Canoer Immunoi. I-nmunotner. 37, 255 (.1993); Pietras és másai.: öncogene 9, 1029 (1994); Vitatta és másai.: Canoer Research 5 4 , 5301 (1994); Rliwkowski és másai.: J. Bioi. Cher,. 269(20) , 14661 (1994); Scoát és másai.: J. Bioi. Chem. 266., 14300 (1991); D^Soaza és másai..: Hroe. Natl. Bead. Sói. 91, 7202 (1994).

Tagliabue és másai. ÍJ. Canoer 47, 933 (1991)] két ErbB2-t túlzott mértékben termelő tüdő adenocarcinoma sejtvonalra (Calu-3) kifejtett reaktivitásuk alapján kiszelek>*

ant .1 testek

az N12~e.s, N29-es és N24-es antitest tumornövétedést gátló hatása összhangban volt az általuk indukált differenciáció inért ékével.

Xu és irtsál. [Int* J. Cancer 53, 401 (.1993)· 1 antiErbBz: antitesteket epitópkötö specifitásukra, valamint azon képességűkre teszteltek, hogy - külön-külön vagy kombinációban - gátolják-e az SKBR3-sejtek lehorgonyzás···független és iehorgonyzás-dependens szaporodását; módosítják-e a sejtbeIhleti ErbB2-termeIődést, és gátolják-e a ligandumstimulálta, lehorgonyzás-független sejtszaporodást [id* még a WO 94/00136' szárrá nemzetközi közzétételi iratot, valamint, az anti-ErbB2 antitestek kombinációit illetően: Kasprzyk és mtsai.: Cancer Research 52, 2771 (1992}]< Egyéb ant.i-ErbS2 antitestek leírását. Id. Hancock és mtsai.: Cancer Research. 51, 4 57'5 (1.991); Shawver és mtsaí.: Cancer Research 54, 1367 (1994); Arteaga és irtsál. : Cancer Research 54, 3758 (1994); Harwerth és mtsai.: J. Bioi* Chem.* 267, 15160 (1992)1 .

Az ErbB.2 elleni egéreredetű 4D5-antitest rekombináns humanizált változata (r huMAb HER2, HERCEPTlin vagy HERCEPUN* anti~ErbS2 antitest) klinikai tesztekben aktívnak bizonyult olyan metasztáelsős emlőrákos betegekben, akikben az ErbB2 túlzott mértékben termelődött, és akiket korábban rákellenes terápiával kezeltek [Baselga és mtsai.:: Ϊ. din. Oncol. 14< 737 (1996) j. A HERCSPTIN^ ajánlott kézdődózisa 90 perces infúzióban adagolva 4 mg/kg, ajánlott heti fenntartó dózisa pedig 2 mg/kg, amely abban az esetben, ha a páciens jól tolerálna a kezdő-dózist, 39 perces * ♦ » * * * 4« > « *»»4 « 4 Κ ♦ 8<

*« 4»»»χ

4 4 V X *♦* * »♦ 4 ♦ *♦»

4 Χ44 4ΧΧ4 ♦ 4«*β 4

Χ4 4 4 «»Χ XX 4 44*

vérsavo-koncentráció négy héten belüli, előnyösen három héten belüli, még előnyösebben két héten belüli, legelőeyö-

est 8 mg/kg-os kezdőd.ózi sát, majd heti egyszeri 8 «·♦ s ** ♦··*

4 ♦* ♦8 fl>

« *5ÍÍ 4 * 4 4 « 44 «4«« *44 »♦ ««»»»

rákok) kezelésére alkalmazható.. A találmány szerinti eljárás kemoterápiás hatóanyag (amely nem anthraciklin, pl. öoxorubicin vagy epirubicin) adagolását is magában, foglalhatja. Kemoterápiás hatóanyagként előnyösen tanaidét, például, taréit pl. ΤΑΧΟΐΛ’-t (paclitaxel) vagy TAXOL®származékot alkalmazunk.

A találmány szerinti megoldás értelmében előnyösen alkalmazható anti-E.rbB2 antitestek az ErbB'2-receptor eztracelluláris dóménjéhez (előnyösen az ErbB2 extracelluláris domén-szskvanciáján belüli 4D5- vagy 3H4epitöphoz) kötődnek. Még előnyösebben, antitestként 4D5antitestet, legelőnyösebben annak humanizált változatát alkalmazzuk. A találmány szerinti megoldás szempontjából előnyös, további, ErbBl-t megkötő antitestek közé tartoznak, többek között, a 7C2, 7F3 és 2C4 antitestek (előnyösen hu manizált alakban).

A találmány szerinti eljárás különösen alkalmas ErbSz-reoeptor túlzott mértékű termelődésével jellemezhető - emlőrák vagy petefészekrák kezelésére.

Szintén a találmány tárgyát képezi egy kezelési eljárás, melynek során egy anti-ErbB2 antitest ritka adagolási sémáját alkalmazzuk. Közelebbről, eljárást tárunk fel rák (pl. egy ErbBz-receptor túlzott mértékű termelődésével jellemezhető rák) emberben történő kezelésére, melynek során a páciensnek egy anti-ErbBz antitest első dózisát, majd legalább egy következő dózisát adjuk be, mely következe dózist az első dózis beadása után legalább két héttel (pl. kő. két hét és kb. két hónap közötti iöőkülönbséggel), és adott

XX*

ezpressziós piaamid citomegalovirus-promótert és erősítő-

L- Ο· sl.

tirozin kináz dómén; és C-termi.ná.lis s-zign.áldomén., amely több foszfor!látható tírozint tartalmaz. Az ErbB-receptor ”natív szekvenciája ErbB-receptor vagy annak funkcionális származéka (.pl. aminosav-szekvencía-változata) egyaránt lehet. Az ErbB-receptor előnyösen natív szekvenciája. humán ErbB-receptor.

Az ErbBl, epidémiái is növekedési faktor receptor”' és EGER” kifejezések - melyek egymás szinonimáiként alkalmazhatók ~ az EGFR-re vonatkoznak [melynek leírását ld. pl. Carpenter és mtsai.: Ann. Rév. Bicehem. 5 6, 881 (1987)], ideértve ezek természetben, előforduló mutáns alakjait [pl. delécíós EGFR-mutáns; ld. Humphrey és mtsai,: PNAS (USA) 87, 4207 (1990) ] , Az e.rbBl kifejezés az: EGFB-proteírit kódoló gént jelenti, .Az EGFR-hez kötődő antitestek példái közé tartoznak a következők MAb 579 (579-es monoklonális antitest; ld. AECC CRL HB 8506) ; MAb455 (ATCC URL HB8507); MAP255 (ATCC CRL 8508); MAh528 (ATCC CRL 8509; ld. 4 543 533 számú egyesült államokbeli, szabadalmi leírás) ; valamint ezek változatai, pl. a kimérikas 225-ös monoklonálls antitest (C225)^: és az újjáalakított humán 225Ös monoklonális antitest (11225; ld. WO 96/40210 számú nemzetközi közzétételi irat) ».

Az ^s'ErbB3 és HER3 kifejezés recept or---poli.peptid.re [ld. 5 183 884 és 5 480 958 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás, valamint Kraus és mtsai.: REAS (USA) 86, 9Í93 [1889)1, illetve ezek változataira vonatkozik. A HER3hoz kötődő antitestek példáinak leírását illetően l.d, 5 968 5.11 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírást (pl. 8D8~antitest, ATCC KB 12070; illetve humanizált változatai) .

Az ”ErbB4 és ^S’HER4” kifejezés receptor-polipeptidre vonatkozik [amelynek leírását Id. pl. az 5.9.9 274 számú európai szabadalmi. bejelentést; valamiét Plowman. és mtsai.: Proc. Kati. Acad. Bei. USA 90, 17-46 (1993); Plowman és mtsal.; Natúré 366, 473 (1993}), valamint izoa lakjaira vonatkozik (pl. a WO 9.9/19488 számú nemzetközi közzétételi iratban faliárt H£R4-izoalakok) .

A ”.ErbB2”, ”HER2” és o-Erb-Bx” kifejezések - melyeket egymás szinonimáiként alkalmazunk - humán HERá-preteinre vonatkoznak, míg az ’'eróB2^,!. c-arb-BS” és ^whAr2^w kifejezéseken a szóban forgó proteint kódoló humán gént értjük. A humán erbB2-gén és ErbB2-protein leírását illetően ld. pl. Sernc-a és mtsai. : PNAS (USA) 82, 64 97 (1985; és Y.amamoto és latsai..; Natúré 319, 230 (19800 . Az ErbBi négy domént (1-4. dóménak) tartalmaz..

A 4D5-epitóp az ErbBz extraeellniárie dóménjének azon, régiója, amelyhez a 4D5-antitest {ATCC URL 1.0463) kötődni képes. Ez az epitóp közei van az ErbBS transznismbrán doménjéhez. A 4D5-epl.t.óphoz kötődő antitestek azonosítása céljából szokványos keresztblckkolási tesztet végezhetünk [ló, pl. Harlow és Lane {szerk.r: '’Antibodies, A. Laboratory Manual, Cold Spring Házhoz Laboratory (1988)j. Más módon, apitóp-térképezést végezhetünk (ld. 1. ábra; annak meghatározása céljából, hogy az antitest kötődik-e az ErbB2 4D5epitópjához; például, az ErbB2-protein extraoelluláris dómén jében ia kb. 529. am inosavtöl.. pl. 561. aminoaavtöl a

XX

3z ErbB2 extracelluláris dóménje aminosav ara. no savai t Icaiad, ή a macába (ld. 1. ábra)

forgó sejt előnyösen tumorsajt, pl. emlőrák, petefészekrák, gyomorrák, endometriumrák,· nyálmirígyrák, tüdőrák, veserák, vastagbélrák, pajzsmirigyrák, hasnyálmirigyrák, prosztatarák vagy húgyhólyagrák-sejt. In vitro a sejt SK-BR-3, BT474, Calu3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 vagy SK0V3 sejt lehet. Az apoptózissal kapcsolatos celluláris események értékelésére különféle eljárások állnak rendelkezésre. Például, anaexin-kötéa alapján foszfatidil-szerin (PS) transzlokáció mérhető; DNS-lét rázás alapján DN3~fragmentáció; és hlpodlpicid sejtek számának növekedése alapján DNSfragmentáoióval együttes sejtmag/kromatin kondenzáció értékelhető. Az apoptőzist indukáló molekula előnyösen olyan molekula, amely BT474-sejtek alkalmazásával végzett annexin-kötési tesztben - a kezeletlen sejtekhez viszonyítva - kb. 2-50-szeres, előnyösen kb. 5-50-szeres, legelőnyösebben kb. 10-50-szeres annezin-índukciót eredményez.

Bizonyos esetekben a pro-apoptózisos antitest olyan molekula, amely gátolja az KrbB2/ErbB3~kovplex HRGközvetitette kötődését/aktiválását (pl. 7F3-antitest). Más esetekben az ilyen antitest nem blokkolja jelentős mértékben. az ErbB2/ErbB3-komplex HRG-közvetitette aktiválását (pl. ICz-antitest). Ezen túlmenően, az antitest anélkül is indukálhat apoptózist (mint pl. a 7C2-antitest;, hogy az Sfázisban lévő sejtek százalékos arányának nagyrartékú. csökkenését okozná (pl. az ilyen sejtek százalékos arányát a kontrolihoz képest csak 0-1Q %-kal csökkentő molekula} «

A szóban forgó antitest specifikusan kötődhet a humán ErbBz-hoz (mint pl. a 702-antítész), ugyanakkor, egyéb pro teinekkel (pl, a.z e.rbBl-, erbS3~ és/vagy er£>B4~gén. által kódolt proteinekkel} lényegében nem lép keresztreakciőba. Bizonyos esetekben, az antitest lényegében nem lép keressereakcióba a patkáuyeredetű neu-proteinnel [Id. pl, Schecter és mtsaí.: Natúré 312, 513 (1984); és Drebin és mtsaí.: Natúré 312, 545 (1984)]. Ilyen esetekben az antitest e proteinekhez történd kötődésének (pl. endogén, receptorhoz történő sejtielöléti kötődés) mértéke kisebb, mint a f luoreszcencia-aktiválásos: sej tosztályozási (FACS) analízissel vagy raőioímmunpreeipitációval (RIA) meghatározott érték kb. 10 %~a.

Ahogy itt használjuk, a heregulin' (HEG) kifejezés olyan, pepiidet jelent, amely aktiválja az ErbB.2-ErbB3 és ErbB2-ErbB4 komplexet (vagyis a komplexben lévő tirozinokhoz kötődve azok foszforlláoióját indukálja). a haragul in-gén kódol fid, 5 641 8 69 számú egyesült államokbeli szabadalmi .leírás vagy] . A különféle heregulinpclipeptldek leírását illetően ló. pl. Holmes és mtsaí.: Science 256, 12.05 (1992); WO 92/20793 számú nemzetközi, közzétételi irat; Ben és mtsaí.: Mól.. Cell. Bioi. 14(3), 1909 (1994); és Marohionul és másai.:: bátoré 362, 312 (1993)1.

A heregulin: kifejezés jelentése kiterjed a természetben előforduló HRG-polipoptld biológiailag aktív fragmenseire és/vagy aminosav-azekvoncia változataira is, pl... EGE-szerű dómén fragmensére {ERGÖfe·;; .

Az ^t!£rbB2~ErbB2 proteinkomplex” és ErbB2-ErbB4 proteinkompiex” kifejezésen az ErbB2-receptor ErbB2~, illetve ErbBí-receptorral - nem kovalens kötéssel kapcsolt *·* «Λ « * « * * * ♦«« ««X$ * * * «e « ««9Φ £»« «$«>«.

SXϊwKC'wsK1 ss ntt.sa·.: - : a , .B.t.q.í , CXístr. .-:.02 í .--::0} _f J.aun.L (1994)] -

ssá-sos konstans doicén követ, A. könnyű láncok egyik végén >* < ♦♦ * * «* * X » » » « « X « « « « « «

génhez történő kötődésében, azonban kölöníé antitestek papainc-s emésztése két rp '· Τ' » T'h'’-Ύ · TOt''.

ntlgénkötő helyet tartalmaz.. Ez a régió egy nehé

*** * ~ 31 ~

fa-it ne

diatest kifejezés olyan kis méretű, két

szóban forgó rendellenesség kialakulására. A találmány szerinti megoldás értelmében kezelhető rendellenességek példái közé tartoznak, többek között, a következők: jóindulatú és maligaána tumorok; leukózisok és malignán-s lymphoid betegségek; valamint egyéb rendellenességek, mint pl. idegsejt, gliasejt-, asttxooita~, hipotalamusz-, mirigy-, makrofág-, epithelsej t~, stroma-, blasztocöl-, gyulladásos, angiogén és immunológiai rendellenességek

A “'terápiás szempontból hatásos mennyiség” kifejezésen egy hatóanyag azon mennyiségét értjük, proliterációt gátló hatás kifejtésére képes. A terápiás szempontból hatásos mennyiség előnyösen -apoptózist indukáló aktivitású, és sejthalált - előnyösen jóindulatú. vagy malignáns tumorsejtek pusztulását - képes indukálni. A hatékonyság, a kezelni kívánt állapottól függően, szokványos módszerekkel mérhető:. Rákterápia esetében a hatékonyság, például, a betegség progresszión idejének (TTP) mérésével és/vagy a reakció ráta (R'R) mérésével határozható meg (ld. 1. példa). A terápiás szempontból hatásos mennyiség cél-vérsavókoncentrációt (pl< maradék vérsavó-koncentrációt) is jelent, amely bizonyos ideig fennmaradva hatásosnak bizonyult a betegség tüneteinek enyhítésére.

A rák' és rákos” kifejezések emlősök olyan fiziológiai állapotára vonatkoznak, amelyek szabályozatlan sejtszaporodással jellemezhetők. A rákok példái közé tartoznak, többek között, a oarcinomák, limfomák, blastomák, sarcomák, leukémiák, valamint a leokózisok és a limfoid malignáns betegségek. A rákok konkrét példái közé tartozik pikkelysej tes rák, kis sejtes és nem kis sejtes tüdőrák, gastrointestinalis rák, hasnyáimírigy-rák, glíobla.s torna., méhny aknák, petefészekrák, máj rák, húgyhólyagrák, h.epatoma, emlőrák, vastagbélrák, vastag- és végbél. rák, endometrium-carcinoma., nyálrd.rigy-carcinoma, veserák, májrák, prosztatarák, szeméremtest-rák, pajzsmírigyrák, májcarcinoma, valamint, különféle típusú fej- és nyakrákok.

Ahogy a leírásban használjuk, a citotoxikas hatóanyag” kifejezésen olyan anyagot értünk, amely gátolja a sejtek működését és/vagy azok elpusztítását. eredményezi. A citotozíkus hatóanyagok közé tartoznak a radioaktív izotópok (pl. I~^2s, y^&ű és ,Re^13fe); a kemoterápiás hatóanyagok; valamint a tox.in.ok, pl. a kis molekulájú tozinok és az enzimatikusan aktív toxínok, melyek bakteriális, gomba-, növényi vagy állati eredetűek lehetnek (ideértve az ilyen toxínok fragmenseít is).

A “kemoterápiás hatóanyag kifejezésen rák kezelésére alkalmas vegyületet értünk. A kemoterápiás hatóanyagok példái közé tartoznak a következők: alkílezőszerek, pl. thioiepa és oiklofoszfamld íClíOXAlod ; alkilszulfonátok, pl. buszulfán, improszulfen és piposzulfán; Szíriáinak, pl. benzodopa, o.arboguon, meturedopa és uredopa; etilén Iminek, és metílamelamínok, pl. altretamin, trietilénmeiamin, triet 11 én fo^zfc-r amid, trietilén-tiofoszforamíd és trimetiiolomelamin; ni írónén-mustárok, pl. klórambuoil, klórnafazin, oholofoszfamld, esztramusztiu , itoszfamid.

meklőrétamin, meklórétamín-oxid-hidroklorid, melphalan, novembichín,· phenesterin,· prednimusztin, trofoszfamid, uracil-mustár; nitrosuroák, pl. carmustin, chlorozotocin, fotemustin, lomusrin, nimustin, ranimustin; antibiotikumok, pl. aclacinomicinek, actinomicín, authramicin, azaszsrin, bleomicinek, cactinomícin, calicheamicin, caxabicin, c a rm i n omi c i.n., a a r z 1 a o f i 1 i n, réz omom lei ne k, d a c t i οn i m lei n, aunor ubi c in, de t o r ub ic in, 6- di a z o - 5 - oxo - L-πor 1 a u cin, doxorubicin, epirubícin., esorubicin, idarubicin, marcellomicin, mitömicinek, mikofenclsav, nogalamicin, olivomicinek, peplomicin, potf i róni cin., puromicin, quelamicin, rodorubicin, streptonigrin, atreptozocin, tubercidin, ubenimex, zinostatin, zorubicin; antimetabolitok, pl. methofcrexát és 5-fluoruracil (5-FU); fölsav-analógek, pl., denopterin, metbotrexát, pteropterin, trimetrexát; purin-analógok, pl. fludarabin, 6~ merkaptopurin, tiandprin, tioguanin;· pirimidin-analógok, pl. a ne 11 a b I n... a-zacitidin, 6~a zsűri din, carmofur, c y t a r a b i a _f d i de z οχ 1 u r i d i n de x .1 f 1 u r i dl n e ne c 11 ab i n, floxuridin, .5-Fü; androgének, pl. calusteron, dr unióstanolon-propienát, epitíostanol, napitiostán_f testolakton; mellékvese-hormon elleni hatóanyagok, pl. amlnoglntatimid, mátokén, trilostan; fólsav-kiegészitők, pl. frolinsav; aceglator; aldofoszfamid-glikozid; aminoievulinsav; ansacrin; bestrabucil; bisantren; edatraxát; defofamin; demecolcín; diazlgoon; elfornitin; elliptinuxn-acetát; etoglucid; gallium-nitrát; hidroxikarbamid; leainan; lonidam 1 n; mi toguazon; m.itoxantrou; mopidamol; ni t ráéri n; pentostat in; phonamet; pirarubicin; podo.f illinsav; 2etilhidrazid; prokarbazin; FSK; razozán; sizofiran;

spirogarmániam; tenoazonsav; triazignon; 2,2/,2''-triklórtrietilamin; uretán; víndezin; dacarbazin; mannomustin; mitobronitol; mitola.ctol; pipobromán; gaci.toz.in; arabínozid (Ara-C); oikiofoszfamid; tiotepa; taxoidok, pl. paclítaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb On. col egy, árinceton, NJ, USA; és doxataxel (TAXOTERE®, Résre-Poulene Rsrer, An.to.ny, Franciaország) ; chlorambuo.il; gemoitabin; 6-tíoguani.n; markaptopurin; methotrexát; platina-analógok, pl. cisplatin és carboplatin; vinblasztin; platina; etopcsid (VP-16) ; ifoszfamid; mitomicin-C; mitoxantron; víricristin; vinorelbin; neveiéin; novantron; teníposíd; daunomicín; aminopterin; xeloda; ibandronát; CPT-11; topoizomeráz inhibitor RÉS 2-0.00; di.fluor~met Hornit, in (DMEO); retinasav; esperaraicinek; capecitabin; valamint a felsorolt vegyületek gyógyászati szempontból elfogadható sói, savai és származékai. A kemoterápiás hatóanyagok közé tartoznak az antihormonális hatóanyagok, amelyek a hormonok tumorokra kifejtett hatását szabályozzák vagy gátolják; ilyenek pl·, az anti-ösztrogének, pl. a tamoxifen, ralóxifen, aromatázgátló 4 (5) “ímidazolok,· t-hidroxitamoxifen, tríoxifén, keoxifén, .LYH7018, onapriston és to.re.mifén (Faroston); és antr-androgének, pl. flutamid, nilutamid, bicalutamid, lenproltd és goserelih; valamint a .felsoroltak gyógyászati szempontból· elfogadható sói, savai és származékai.

Ahogy itt használjuk, a sejtszaporodást gátló hatóanyag kifejezés olyan, vegyületre vagy készítményre vonatkozik, amely .in vatro vagy in vivő gátolja egy sejt - elsősorban ErbBi-receptort termelő ráksejt - szaporodását.

Ilyenformán, a szaporodást gátló hatóanyag jelentős mértékben csökkentheti az S~fázisban lévő ErbB2-termelő sejtek százalékos arányát, A szaporodást gátló hatóanyagok jellemző példái közé tartoznak a sejtciklus előrehaladását (az Sfázistól, eltérő ponton) blokkoló hatóanyagok, példán!, a Gl-fázisban vagy az M-fázísban történő megrekedést indukáló anyagok, A klasszikus M-fázis. blokkolók közé tartoznak a vlnca-vegyületek (pl. vincristin és viublastin), a taxánok és topo-II-inhibitorok, pl. doxorubicin, epirubicln., daunorubicin, etoposió és bleomycia. A G1-fázist feltartóztató hatóanyagok S-fázisban történő blokkolásba is átnyúlhatnak, mint pl. a. DNS-alkilezó szerek (pl. tamoxifern, prednison, dacarbazin, mechlorethamin, cisplatln, methotrexat, 5-fluoruracll és ara-C. További részleteket illetően Id. The Molecular Basis of Cancer”, szerk.: Memáesohn és Israel, 1. fejezed, Murakami és mtsai.: ”Cell c.ycle. regulát ion, oncogenes, and andineoplastic drugs (AB Sauuders; Philadelphia, 1995;, különös tekintettel a 13. oldalra. Erre a célra a éDo-antitsst (és funkcionális megfelelői) szintén alkalmazhatok.

A ”dozorsbicin’^!' egy anthraoiklin típusú antibiotikum, amelynek teljes kémiai neve a következő: (SS-cisz):-10- [ (3amino~2,3, 6-tridezozi-0i.-I.-l ixo-hezopiranozil) -oxi 1 3, 3,9,lQ-tetrahidro-6,3,1l-trihidrozi-8-(hidroxi-acetii)-1matozi-5,12-naftaoénoíon.

A citokin” kifejezés egy adott sejtpopuláció^ által kiválasztott - interes! luláris msdiátorkéni z;.ás sejtekre ható - proteinek általános elnevezése. Az ilyen oltóéinak i ho.raonök, mint pl. a. humán növekedési hormon, a humán övekedé s i aousofi h~me orom 1~ s zarmazé ke., ss a s sérv a smarha

Ahogy a találmány leírásában· használjuk, a '”pro~drog” kifejezésen egy gyógyászatilag aktív vegyölet prekurzorát vagy származékát értjük, amely a tumorsejtekre az eredeti hatóanyagnál .(drognál) kevésbé citotoxikus, és enzimatikusan a nagyobb aktivitású eredeti alakká aktiválható, illetve alakítható íld. pl. Wilman: Biochemical Society Transactíons 14, 375 (19:86); és Stella és másai.: Prodrugs: A Chemical Approach to Target ed Drug Delívery', a Directed .Drug Delívery'* című kiadvány (szerk. : Porchardt és mtsai., Humana Press} 247-267, oldalain (1985}]. A találmány szerinti pro-drogok közé tartoznak, többek között, a következők: foszfáttartalmú pro-drogok, tiofoszfáttartalmú pro-drogok, szulfáttartalmú pro-drogok, peptidtartalmú pro-drogok, D-aminosavval modifikált prodrogok, glikozilált pro-drogok, β-lakrám-tartalmű. prodrogok, adott esetben szabsztituált fanoxi-aceramidtartalmú pro-drogok, adott esetben szubsztituált fenilacefamid-tartalmü pro-drogok, 5-fluorcitozin és egyéb 5fluoruridin pro-drogok, amelyek nagyobb aktivitású, szabad citotoxikus drogokká alakíthatók. Λ találmány szerinti felhasználás céljából pro-drog alakká derivat 1 zálható citotoxikus drogok példái közé tartoznak, többek között, a fentebb említett kemoterápiás hatóanyagok.

A szilárd fázis” kifejezésen olyan nem vizes közeget értünk, amelyhez a találmány szerinti megoldás értelmében alkalmazott antitestek kötődni képesek. Az ilyen szilárd fázisok példái közé tartoznak a részben vagy egészben üvegből (pl. szabályozott pőrusméretű üvegből}, poliszáéba ridokból (pl. agarózból) , poliakrilamidokból, poliszt.Íróiból, polívinilalkoholból vagy szilikonokból készített szilárd fázisok. A találmány bizonyos megvalósítási módjaiban, a szövegösszefüggéstől függően, a szilárd fázis egy vizsgálati tálca űrege, más esetekben tisztító-oszlop (pl. affinitás- -kromatográfás oszlop) lehet. A szilárd fázis jelentése kiterjed a különálló részecskékből álló, nem .folytonos szilárd fázisokra is (ld. pl. 4 275 14.9 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírási.

A liposzőma*-’ kifejezésen kisméretű vezikulát értünk, amely különféle típusú lipidekbői,· foszfolipíde.kből és/vagy felületaktív anyagokból áll, és hatóanyagok (pl., találmány szerinti antí-£rb82 antitestek és, adott esetben, kemoterápiás hatóanyag) emlősnek történő adagolására alkalmazhatók. A liposzórna komponensei rendszerint kettős réteg formátumban vannak elrendeződve (hasonlóan a biológiai membránok iipidelrendeződéséhez).

A 'betegtájékoztató” kifejezésen gyógyászati termékekhez általánosan mellékelt, útmutatót értünk, amely a gyógyászati termék alkalmazására vonatkozó indikációkat, a gyógyszer doni rozását, adagolási módját, ellenjavallata.it és/vagy figyelmeztetéseket tartalmaz.

A vérsavó-koncentráció, ”vérsavó hatóanyagkoncén t ráció vagy vérsavó HERCEPTIN^ anti-ErbB2 antitestkoncentráció'” kifejezéseken egy hatóanyag (pl. RERCEPTld® anti-ErbB2 antitest; - a hatóanyaggal kezelt állat vagy ember vérsavójában mért -· koncentrációját értjük. A HERCERTIN® anti-ErbB2 antitest versevó-koncentráciéj át elő nyösen immunteszttel (például, a leírásban ismertetett módon végrehajtott ELISA-teszttel} határozzuk meg.

A csúcs vérsavó-koncentráció” kifejezés a hatóanyag állatnak vagy embernek történő beadása után rövid idővel (miután a hatóanyag a. vérkeringésben már eloszlott, de a szövetekben eloszlása, métábólizmusa vagy kiválasztása még nem. követezőtt be) mérhető maximális vérsavó hatóanyagkοn cent rác i ór a von a t ko z i 1:.

A maradék vérsavó-koncentráció kifejezésen azt a vérsavó hatóanyag-koncentrációt értjük, amely több dózis adagolása esetén egy előző dózis beadása után, és közvetlenül a következő dózis beadása előtt mérhető. A maradék vérsavó- koncentráció általában a sorozatos hatóanyag-adagolás során tapasztalható minimális fennmaradó hatásos hatóanyagkoncentráciőnak felel meg. A maradék vérsavó-koncentrációt gyakran. - a hatékonyság szempont jóból -· minimális vérsavó·koncentrációként célozzuk meg., mivel azt a vérsavókoncentrációt reprezentálja., amelynél (a kezelési séma részeként) egy következő hatóanyag-dózis kerül beadásra. Ha a hatóanyagot intravénásén adagoljuk, a maradék vérsavókonceurráció legelőnyösebben a kezdeti lökésdözisós hatóanyag-beadástól egy napon belül érjük el. Szubkután adagolás esetén a csúcs vérsavó-· koncentrációt, előnyösen három: nap alatt vagy még rövidebb idő alatt érjük el. A találmány szerinti megoldás értelmében a maradék vérsavókoncent rációt - az említett hat ó-anyag-adagolási módszerek bármelyikének alkalmazása esetén - előnyösen négy vagy kevesebb hét alatt, előnyösen hárem vagy kevesebb hét alatt.

ember bőre alá történő - előnyösen kb. 15 percnél rövidebb, még előnyösebben 5 percnél rövidebb, legelőnyösebben 60 másodpercnél rövidebb ideig tartó - adagolását értjük. Az adagolást előnyösen a bőr és a.z alatta lévő szövet közötti zsebbe végezzük, amely a bőr összecsipésével és az alatta levő szövetről történő felemelésével hozható létre.

A hatóanyag-adagolás vonatkozásában a kezdőlökés dózis vagy lökésterápia (front loading) kifejezésen azt értjük, hogy egy kezdeti nagyobb dózis beadása után, meghatározott időközönként, azonos vagy kisebb dózisokat adagolunk. A kezdeti nagyobb dózis vagy dózisok azt eredményezik, hogy az állatban vagy emberben a vérsavó hatóanyagkoncentrációja korábban éri el a hatékony cél-vérsavókoncentrációt. A találmány szerinti megoldás értelmében a lökésterápiát ágy hajtjuk végre, hogy az állatnak vagy páciensnek olyan kezdődózist vagy kezdődózis-serozatot adagolunk (három, héten át vagy rövidebb ideig) , miáltal a hatóanyag koncentrációja meghatározott maradék cél-vérsavőkoncentrációra áll be. A kezdeti -feltöltési dózist vagy dózissorozatot két hét vagy rövidebb idő alatt, előnyösebben egy hét vagy rövidebb idő alatt (pl. egy nap alatt vagy még rövidebb idő alatt) adjuk be. Amennyiben kezdődózisként dózissorozatot adagolunk, az egyes dózisok beadása között legalább hárem órának, de legfeljebb három hétnek, előnyösen legfeljebb két hétnek, még előnyösebben legalább agy hétnek, legelőnyösebben legfeljebb egy napnak kell eltelnie. Az antitest-hatóanyag (pl. anti-ErbB2 antitest, pl. HERCEPTIN^ anti-ErbB2 antitest) elleni zavaró immunreakció vonat ,fc cd “ ox.0Bz_an.t i r..os ca κ a 1 oa ,L.1.11.as a.

antigénként, például _f az ErbBz axtracellijláris dómén, óénak ve; PoiikEonaEis anEitsstsk

A ρο.ι iKioDSiis sülxtiösteket eionvosen a.i E-stoKban

- 4 9 juk. Egy hónap elteltével a.z állatoknak - több helyre adott szubkután injekcióval - a geptld vagy konjugátum eredeti mennyiségének. Ι/5-l./iO-ével ( Freund-féle komplett adjutánsban) esd.ékeztetőoltást adunk. 7-14 nappal később az állatokból vért veszönk, és a vérsavóban meghatározzuk az anritest-titert. Az emlékeztetőoltásókat addig ismételjük, míg az antítest-titer platót nem ér el. Az állatoknak az emlékeztotöoltást előnyösen azonos antigén (de eltérő proteinnel és/vagy eltérő keresztkőtő reagenssel képzett) konjugáturnéval végezzük. A kcnjugátumck rekombináns sejttenyészetben, fúziós proteinekként is előállihhatók. Az immunreakció serkentésére aggregációt elősegítő hatóanyagok (pl. alumínium-hidrcvíd, ”alum”) is alkalmazhatók.

(i i} Mg no klonális antitestek

A mcnoklonálls antitestek lényegében homogén antitestek populációjából származnak, vagyis a populációt alkotó egyes antitestek egymással azonosak (a minimális mennyiségben esetlegesen előforduló terme szet.es mutációktól eltekintve). ilyenformán, a monoklonálisⁿ jelző az antitestek azon tulajdonságára vonatkozik, hogy nem különböző antitestek elegyeként léteznek.

A monoklcnális antitestek az elsőként Kohler és mhsai. [Natúré 2.56, 495 (1975)1 által leírt hibridóma~eljárással, valamint rekombinárs DNS-technlkák (1 816 567 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás) alkalmazásával állítha-

*♦

1.

Ο' ?!

a ?

egy .n j

aev t >a >!

sq ff

3“ a:

* X «

Sif

rendelkezik a megfelelő bíepeclfikon szerkezettel.

χ} .1.

A bíspecifikus antitestek közé tartósnak a keresztkötéses vagy teterokonjugált antitestek is·. Például, a határokon j ugatom. egyik antitest-komponense avidinkoz, a másik biofcinhoz lehet konjugálva.. .Az ilyen antitestek, például, as immunrendszer nemkívánatos sejtek ellen történő irányítására (Id. 4 676 9B0 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás), illetve HIV-fartŐzés kezelésére alkalmazhatók fid. ^:WO 91/00360 és WO 92/200373 számú nemzetközi közzétételi irat, valamint ΞΡ 03089· számú európai szabadalmi leírás). A hetetekenjugáit antitestek tetszőleges keresztkötési eljárással állíthatók elő. Az alkalmas keresztkötésképző reagensek szakember számára jól ismertek (ld. a 4 676 98Ό .számú egyesült államokbeli szabadalmi leírást, amelyben több keresztkötési technikát is feltártak).

A bíspecifikus antitestek antitest-fragmensekből történő előállításának technikái a szakirodalomból szintén jól ismertek. Például, a bíspecifikus antitestek előállíthatok kémiai kapcsolás alkalmazásával. Brennan és mtsai. [Science. 229, 81 (1985}j eljárásában az intakt antitesteket proteolit.í kusan emésztve Ffab^# ) r-fragmenseket hoznak létre, majd ezeket a fragmenseket - a vicinális ditiolok stabilizálása és az i.ntsrmol.ekulá.ris díszül.fid-képződés megakadályozása érdekében dítiol komplezáló ágens (nátrium-arzenit) jelenlétében redukálják. Az így kapott Fab^f-fragmenseket tio-ní t robenzoát. (TNB) származékokká alakítják, majd az: Fab^f-TNB származékok egyikét merkapto-ot ilam.inn.al végzett redukcióval visszalakítjak Fab^f-tiollá, és azt a másik Fab^f-TBB származék ekvimoláris mennyiségével elegyítik, mi-

Acad. Sci. USA 9C, 6441 (1993)j által feltárt diatest technika a bispeoifíkus antitest-fragmensek előállításának alternatív mechanizmusát reprezentálja. Az ilyen fragmensek egy nehéz lánc variábilis dómért (V_i;) egy könnyű lánc variábilis doménhez (Vlj kapcsolva tartalmaznak, olyan kapcsolószekvencián keresztül, amely túl rövid ahhoz, hogy az ugyanazon láncon lévő két dómén között párosodés következzen be. Ennek megfelelően, az egyik fragmens V_K~ és V_Ldoménje kényszerítve van, hogy a másik fragmensen lévő komplementer V_L- és V_K-dcménnel alkosson párt, miáltal két antigénkötő hely képződik. A bispecifikus antitestfragmensek előállításának egy másik, egyláncú Fv-dimerek alkalmazásán alapuló módszerét Gruber és mtsal. tárták fel ÍJ. Imurxol. 152# 5363 (1994) j.

A találmány szerinti, megoldás értelmében kettőnél több értékű antitestek is alkalmazhatok.. Például, előállíthatok trispecifikus antitestek is kid. Tutt és mtsaiJ. Immunoi. 147, 60 (1991)1.

Jvi) Kívánt tulajdonságú antitestek szelektálása

Az antitestek előállítási módszereit a fentiekben tárgyaltuk. A. létrehozott antitesteket az alábbi tulajdonságokra szelektálhatjuk.

A. sejthalált indukáld antitestek szelektálása céljából a sejtmembrán épségének csökkenését - propídi.um-jodid (Pl), trypan-kék vagy 7 AAD felvétele alapján - kontroll sejtekéhez viszonyítva értékeljük. Előnyösen BT474-sejtek alkalma-

zu

Az apoptózist indukáló antitestek szelektálása céljából - BT 4.7 4-sejtek alkalmazásával · annezin-kötési tesztet végezhetünk. A BT474-sejtekét az előző bekezdésben leírtak szerint tenyésztjük és oltjuk csészékbe. A tápközeqet ezután eltávolítjuk, majd friss tápközeggel vagy a megfelelő monoklonális antitest 10 gg/xnl-ét tartalmazó tápkozeggel helyettesítjük. Három tapos ínkubálás után az egyrétegű sejttenyészeteket foszfátpufterelt sóoldattal (BBS) mossuk és tripszines kezeléssel leválasztjuk a csészék faláról. Ezt követően a sejteket centrifugáljuk, Ca^-kötő pufferben ujraszuszpendáljuk, és a fentebb leírtak szerint kémcsövekbe szortírozzuk. A kémcsövekbe ezután jelölt annexint (pl. annexin v-FTTC; 1 pg/núp adunk. A mintákat EACSCAN áramlási citométer és FACSCONVERT CellQuest. szoftver (Becton Dick.in.son) alkalmazásával vizsgáljuk. A kontrolihoz képest statisztikailag szignifikáns szintű annexín-kötődést indukáló antitesteket apoptózist indukáló antitestekként azonosítjuk.

az annexin-kötési teszten kívül BT474-sejtek alkalmazásával végzett DbS-festési teszteket is végezhetünk. E teszthez az előző két bekezdésben leírtak szerint a kérdéses antitesttel kezelt 31 '474-sejtehet 9 ug/ml HOECBET 33342-vel 37 °C~cn két óra hosszat kezeltük, majd EEIC'S ELI TE áramlási citométerrel (Coulter Corporation), MÓDÉIT LT szoftver (Verity Software House) alkalmazásával analizáltuk. E teszt alkalmazásával az apoptózisos sejtek százalékos arányában - a kezeletlen sejtekhez képest - kétszeres vagy nagyobb (előnyösen háromszoros vagy nagyobb; változást »*χ

A találmány szerinti antitestet eflektor-funkciója vonatkozásában is módosíthatjuk, például, az antitest rákkezelésben kifejtett hatékonyságának növelése céljából. Például, antitest Fc-régiójába cisztáin(eke)t építhetünk be, ami e régióban lehetővé teszi a láncok közötti diszulfidhíd-képzödést. Az így létrehozott homodimer antitest javított internalizácíós képességű és/vagy fokozott mértékű komplement-közvetitétte sejtpusztltást és antitestdependens cellulárís citotoxicitásr (ADCC) fejt ki [Id. Cáron és mtsaí.c J. Exp. Me-d. 176, '1191 (1992); és Shopes: J. Immunoi. láng 2918 (1992)1 . Wolff és mtsai. [Cancer Research 53, 2560 (1993)j leírása szerint, heterodífnnkelés kérésztkötésképzők alkalmazásával, megnövelt tumorellenes aktivitású homodimer antitestek is előállíthatók. Más módon, kifejleszthetünk olyan antitestet, amely két Fc-régiöt tartalmaz, ezáltal fokozott mértékű komplement lízist és: ADCC-aktivitást mutat [ld. Stévénsón és mtsai.: Anti-Cancer Drng Design 3, 219 (1989)1.

(vili) Immunkenj ugá t umok

A találmány szerinti megoldás értelmében az antitestek immunkonjogétornai is alkalmazhatók, amelyekben az antiteat oitotoxíkss hatóanyaghoz, pl. kemoterápiás hatóanyaghoz, toxinhez (pl. kis molekulájú toxín vagy enzimatikus aktivításó toxín, amely lehet bakteriális, gombaeredetű, növényi vagy állati eredetű, ideértve az ilyen toxinok fragmenseit és/vagy változatait is) vagy radioaktív izotópokhoz vannak jug ^:r kő erű • .1 prc in cer

* * * ta.i ké bői,

3.

:a at

(x) Antitest-dependens enzimközvetítette pro-drog terápia φ « * alkalmazásával, kovalens kötéssel kapcsolhatók az antl~ ErbBl antitestekhez. Más módon, szakember számára jól ismert rekombináns DMS-tech.nikák alkalmazásával olyan fúziós proteinek hozhatók létre, amelyek egy találmány szerinti antitestnek legalább az antigénkötő régióját egy találmány szerinti enzim legalább egy funkcionálisan aktív részéhez kapcsolva tartalmazzák [Id. pl. Neuberger és mtsai.: Natúré 312, 60« (1984):.

(zi) Antitest/mentőreceptor (salvage receptor} kötő epitőp fúziók

A. találmány bizonyos megvalósítási módjai szerint {például, tumor-penetráció fokozása céljából) a teljes antitest helyett antitest-fragmens alkalmazása lehet kívánatos. Ilyen esetekben szükség lehet az antitest-fragmens vérsavóban mérhető felezési Idejének növelése érdekében történő - módosítására. Ennek érdekében az antitestfra-gmensbe, például, mentőreceptor kötő epítópot. foglalunk (pl. az antitest-fragmens megfeleld régiójának métagenezisével vagy oly módon, hogy az epitopot egy peptidbe foglaljuk, amelyet azután az antitest-fragmens N- vagy Cterminálisára (vagy közepére; fuzionálhatunk (pl. DNS- vagy peptid-szintézissol j

A fokozott fa vívó felezési ideje antitest-változat előállításának szisztematikus eljárása több lépésből áll. Az első lépésben azonosítjuk egy IgŐ-molekula Fc~réglőja mentő:?receptor kötő epltópjának szekvenciáját és konformácí* *

S Κ'Ο.ΙΊ.ΐ.O?KÍ3C.l·OJ S V. V. 3 tV.' a .ί.ίΒ2Ζ Z8 . A szsKvsncl.S

?ζίi) Az anti~ErbB2 antitestet tisztítása vagy közvetlenül a táyközegbe kiválás ’λ!

.1 azaz ke

A⁵ króm ne tálcán végzett kötési aktivitási tesztje

Λ «'

« *

» > n

dacból történd Xiofilízálással, a nedvességtartalom szabályozásával [megfelelő adalékok alkalmazásával), és specifikus po.límer-ágya zóanyag készítmények kifejlesztésével való sítható meg.

V; Anti-ErbBz antitestekkel végzett kézelés

A találmány szerinti megoldás értelmében az anti-ErbBz antitestek az ErbBi-receptor túlzott mértékű termelődésével és/vagy aktiválásával jellemezhető állapotok kezelésére alkalmaztatok, melyek jellemző példái közé tartoznak a következők: jőindulahú és malígnáns tumorok [pl. veserák, májrák, húgyhólyagnak, emlőrák, gyomorrák, petefészfskrák, vastag- és vágóéira?, prosztatarák, tüdőrák, szeméremtestrák, pajzsmirigyrák, máí-carcinomák, sarcomák, glioblastomák, és különféle faj- és nyaktumorok); leukózisok és limzoid malígnáns betegségek; valamint egyéb rendellenességek, mint pl. ideg.se jt-, gliasejt-, asztrocita-, hlpotalamusz-, mirigy-, makrefág-, epíthelsejt-, stroma-, blasztocőlgyulladásos, angiegén és immunológiái rendellenességek.

A találmány szerinti antitesteket ismert módszerekkel, pezoaui, intravénás >pí. öoms injekcióval vagy folyamatos: infúzióval}, Intramuszkuláris, intraperltoneálís, intracerebrosplna11s, sznbkután, intraarticularis, intrasynovialis, íntratheoalls, orális, topikus vagy znhalácícs adagolással adjuk be a pácienseknek, mely adagolási módok közül az Intravénás és a szubkután adagolást részesítjük

Az. anti-ErhBz antitesteket előnyös lehet egyéb tumorasszociált antigének elleni antitestekkel ípi. EGFR-hez, ErbB3-hoz, ErbBt-hez vagy VEGF-hez kötődő antitestekkel) együttesen adagolni. Más módonvagy ezen túlmenően, a páciensnek két vagy több anti-ErbBB antitestet is adagolhatunk, Bizonyos esetekben előnyös egy vagy több eltokin adagolása is. Az anti-ErbBŐ antitestet sejtszaporodást gátló hatóanyaggal együtt is adagolhatjuk, Például, először a sejtszaporodást gátló hatóanyagot, majd az anti-ErbB2 antitestet adjuk be, de a kettőt beadhatjuk egyidejűleg is, vagy más módon, elsőként az auti~ErbB2 antitestet adagoljuk. A sejtszaporodást gátló hatóanyag dózisait a. gyógyászati gyakorlatban jelenleg alkalmazott dózisoknak megfelelően állapítjuk meg, illetve, az adott hatóanyag és az anti-ErbBz antitest kombinált (szinergíkus) hatásának függvényében csökkentett dózisokat alkalmazhatunk.

A fenti terápiás sémák mellett a pácienst - a rákos sejtek eltávolítása érdekében - sebészeti beavatkozásnak és/vagy sugárkezelésnek is alávethetjük.

Egy betegség megelőzése vagy kezelése céljából az antitest megfelelő adagolása a kezelni kivárt betegség típusától, a betegség súlyosságától vagy lefolyásának menetétől, a kezelés profHektikus vagy terápiás természetétől, a korábban végzett gyógykezelésektől, a páciens klinikai történetétől és antitestre adott reakciójától, valamint a kezelőorvos saját megítélésétől függően, határozható meg. Az antitestet, alkalmas módon, egy alkalommal vagy kezeléssorozat részeként adagoljuk, amennyiben kezeléssorozatről van ng/kg-ns kezdődőülsát₍ azt követően pedig -

testet öt napon keresztül naponta egyszer adagoljuk. Ezt az * X ♦♦

Cultuxe Col lest i.on-néi (ATCC; 10801 University Boulevard, Manassas, CA 20110-2209, USA} helyeztük letétbe:

Antitest elnevezése ATCC nyilv. szám Letétbe helyezés dátuma

7C2	ATCC	HB-12215	1996. okt.	17.
7F3	ATCC	EB-12216	1996. okt.	17.
4D5	ATCC	CRL 10463	1990. mágus	24.
2C4	ATCC	HB-12697	1999. ápr.	8.

A találmány szerinti megoldást a következekben kísér leti példák bemutatásán keresztül szemléltetjük.

1. példa

A HERCEPTTiF anti~£rbB2 antitest előállítása és hatékonysá gának vizsgálata

Anti~ErbB2 monoklonális antitest

Az ErbB2 extracellulárís dóménje elleni egér-eredetű 4U5 -(IgGi ,k| monoklonális antitestet a Fendly és mtsai. ÍCanoer Research. 50, 1550 í 1990)1 által leirt. eljárással (UO 89/06692 számú nemzetközi közzétételi irat) állítottuk elő. Röviden összefoglalva: Hudziak és misei. [Froc. Uatl. Acad. Col. USA 84, 7158 01987)] által leírt módon előállított NlH-3T3/HER-2-34y_S sejteket- (melyek sejtenként hozzávetőleg 1 x 10° ErbBS-moi.ekulát termelnek! 25 mő EDTA-t tar talmazó foszfátpufferelt sóoldatban (BBS) összegyűjtöttünk és az így kapott sejtszuszpenziőva1 BALB/o-egereket immunizáltunk. A.z egereknek a öt., 2., 5. és 7, héten intraperitoneális {i . p. ) injektálással 0,5 ml BBS-ben 10* sejtet adagoltunk. A. '^,2P-izotóppal jelölt ErbB2-receptort immunprecipitáló antiszérumot termelő egereket a 9. és 13. héten intraperitoneálisan -· bűzacsira-aggiutinín/Sepharose: (WGA) gyantán tisztított - ErbB2 membrán ki vonattal. oltottuk. Ezt követően az egereknek Intravénásán 0,1 ml ErbB2készítményt adtunk be, és a lépsejteket (szplenocitákat) egéreredetű Xó3-AgS.653 myeloma-sejtvonallal fuzionálhattűk. A. hibridómák felülúszóját ELISA-toszttol és rádióimmunprscipitáoiőval ErbBz-kötddésre teszteltük. Izotipusazonos kontrollként MOPC-21-at flgGl; Cappell, Durham, NC) alkalmaztunk.

A kezelést az egéreredetű 4D5-antitest humanizált változatával (HERCEPTIE^ anti-ErbB2' antitest) végeztük. A humanizált antitest létrehozásához az egéreredetű 415antítest komplementaritást meghatározó régióit konszenzus humán IgGi antitest-vázába inszertá.ltűk [Carter és mtsai.: Proo. Kati. Acao. Eci. USA 89, ^285 (1992;j. A létrehozott, humanizált antí~ErbB2 .monoklónál is antitest nagy affinitást mutat a pl re ([KA - 0,1 nmol/L; , továbbá - In vitro és humán xenograftokban - jelentős mértékben gátolja a pl.85^í:Si'^z-t nagy mennyiségben termelő emlőrák-sejtek szaporodását; antitest-dependens celluláris citotoxicitást (ADCC; indukál; és önállóan alkalmazott hatóanyagként kllnikailag aktívnak bizonyult az ErbB2 túlzott mértékű termelődésével jellemezhető - előzetesen intenzív terápiával kezelt : :·% ··: :

**<* .»»· »* *.«· metasztázisos emlőrák kezelésére. A HERCEFTIN^ anti~ErbB2 .antitestet nagy mennyiségben tenyésztett, génsebészeti lég manipulált CHC—sejtvonalla.1 termeltettük,· amely az antitestet a tenyésztő tápközegbe választja ki. Az antitestet a CHO-sejtek tenyésztő tápközegéből standard kromatográfiával és szűréssel tisztíthatjuk. Az e kísérletben alkalmazott antitest-tételek mindegyikét azonosságukra, tisztaságukra és hatékonyságukra, valamint arra teszteltük, hogy megfelelnek-e a Food and Drog Admiuistration sterilitásra és biztonságra vonatkozó követelményeinek.·

Alkalmassági kritériumok

A kísérletben való részvételhez a pácienseknek meg kell, felelniük a következő követelményeknek:

- Mutasstárásos emlőrákban szenvednek;

ErbB2 (HER2) onkogén túlzott mértékű erpressziója [immunhisztokémiai vagy fluoreszcens in alfa hibridizációval (FISH) meghatározva 2é vagy 3+ szinten] . Az: ErbB2 tumorban történő termelődése - a páciensek paraffinba ágyazott tijmordarabjaiból készített vékonymetszet-sorozatok immunhisztokémiai vizsgálatával, fiamon és másai. leírása szerint (1987 és 1939; Id. fentebb) határozható meg. Elsődleges detektáló antitestként egéroredetű 4D5 monoklonális antitestet alkalmaztunk, amely a kezeléshez alkalmazott humanizált antitestével azonos komplementaritást meghatáröző régiókat fCBRa tartalmaz. A tumorokat akkor tekintettük ErbBz-t túlzott mértékben termelőnek, na: a tumorsejáek lég«» Φ ΦΦ Μ*Φ

V S ® * * Φ «* Φ

Φ « ΦΛΦ ΦΦ»&

Φ « β ♦ ««·

Φ«6Φ «ΦΦ φτ« X* φφ«τ

Kizáró okok •r * •ct választottuk ki >n

Át

X*

Stabil betegség: a mérhető léziók méretében 25 $-n.ál nagyobb változás nem tapasztalható. Új leniek nem jelenhetnek meg.

A betegség progressziójáig eltelt időt (TTP) a terápia elkezdésétől a progresszióig számítottuk. A reakció-ráták konfidenciahatárait a Fleiss által leírt egzakt módszerrel számítottuk ki [ld. Fleiss: Statistical fór Rates and Proportions’¹, z. kiadás, 13-17. old., Wiley & Sons, New York, NY ¢1981)7.

Eredmények

10,5 hónapos átlagos megfigyelési idő alatt a betegség progressziójának (TTP, hónapokban) és a reakció-ráta (RR) mérésével a HERCEPTIN^ anti-ErbSz antitest kemoterápiás hatásának jelentős mértékű fokozódását állapítottuk meg, anélkül, hogy a súlyos zavaró események (ZE) előfordulási aránya növekedett volna.

1. táblázat .¾. HERCEPTIN^’ anti-E<rbB2 antitest hatékonysága

	Páciensek száma	TTP (hónap)	RR (%J	EE (í)
CRx	234	ifi	36,2	66
CRxaH	235	8,6*	62,00*	69
AC	145	6, 5	42,1	71
ACoH	14 6	9,0	64,9	68
T	89	4,2	25,0	59
TéH	89	7,1	57,3	70

* p<0,001 (log-rank” teszttel); ** p<‘0,01. (kh.i-négyzet teszttel); CRz: kemoterápia; AC: a.nthraciklin./ciklofoszfamid kezelés; E: HERCEPTIN® anti-ErbB2 antitest; T: TAXQI®

Az anthraciklinnel és HERCEPTIN^' anti-ErbB2 antitesttel végzett kombinált kezelés gyakrabban eredményezett a csak anthracik.lin.nel végzett kezelés által okozotthoz hasonló szívizom-rendellenességet (18 %; 3/4 súlyosságé), mint a csak anhraciklinnal (3 %), TAXOlA-lal (0 %) vagy TAKöL^-lal és EERCEPTIN^-nel együttesen. végzett kezelés (2 3 ) ..

Ezek az adatok azt jelzik, hogy az anti-ErbBÍ antitesttel végzett kezelés kemoterápiával történő kombinálása jelentős mértékben fokozza a jótékony klinikai hatást (amit a reakció-ráta és a betegség progressziójának vizsgálata alapján). Mindazonáltal - a dorornbícin és epirubicin szívre gyakorolt mellékhatásai miatt ·· az anthraciklinek antí2. példa asr (f

IN® í íiai λ:

is HEF koncentrációját (gg/ml, átlag ± szórás) az idő függvényében ábrázoltuk (a 2. héttől a 36. hétig terjedő időszakban; Id. 3. ábra, sötét körök;. A páciensek száma meglehetősen állandó volt, mivel a kísérletből a oeuegség gyors progresz— s-ziója miatt kizárt páciensek adatait kihagytuk az analízisből. A maradék vérsavó-koncen.tráció a 12. hétig emelkedett, majd platózott.

A_ HERCEPTIN® anti-ErbB2 antitest...........maradék vérsavó^ΟΙΙΟ'θΠ’ι I’SCl ó”; SL 3 kGS pJ-éS J-ö o Π.θ Ϊ..Θ .Ϊ.Όθΐ)

2. táblázat

A HERCEPTIN'* ant.i~E.rbB2 antitest maradék és csúcs vérsavóp koncentrációja ípg/ml· a kezelés első 8 hetében.

	Dózis	n	Átlag	Szórás	Minimum	Maximum
Í/SUCS	1.	195	100,3	35, 2	30,7	z ? 4,6
Maradék		195	25, 0	12,7	0,16	60, 7
Csúcs		1.90	74,3	31,3	20,8	307, 9
Maradék		167	30, 4	16,0	0,2	7 4,4
l o ω i Ο-· C; “ i !	3.	167	7 5,3	26,8	16,1	1:94,8
Maradék		17 9	33,7	17,9	0,2	98,2
Csúcs	4 .	175	80,2	26, 9	22,2	167
Maradék		132	38, 6	20,1	0,2	89,4
Csúcs	3.	m i CO ;	85,9	29, 2	2 7,8	185, 8
Maradék		141	42, 1	24,8	0,2	148,7
Csúcs	fe.	1.37	87, 2	32,2	28,9	218,1
Maradék		115	4 3,2	24,0	0,2	109, 9
Csúcs	7	HM	89,7	32,5	16, 3	1.87,8
Maradék		137	48,8	24,9	0,2	105,2
Csúcs	8.	133	95, b	35, 9	11,4	295,6

A 2. táblázatban, bemutatott adatok azt mutatják, hogy a maradék vérsavó-koncentráoiő az idő előrehaladásával fokozódik. A számos vizsgált páciens közül 13 volt olyan, akikben a maradék vérsavő-koncentráció - a 2. héttől 8. hétig terjedő időszakban ~ nem haladta meg a 20 pg/ml-t. E kísérletekben ~ korábbi, állatokban végzett zarmakclőgiaí vizsgálatok és klinikai kísérletekben végzett prőbavizsgálatok alapján - névlegesen a HERCEPTIJT^8, anti-ErbBz antitest

ö’>

3. példa

A HERCEPTXN'*’ anti~ErbB2 antitest intravénás bolus és e cf e .ne kben

ozmotikus minipumpa (Alza Corp., Pala Alto, CA) alkalmazó-

te ίξ>

.__táblázat

-. .. „_SIT. ® . , a j..;.h anti-Ern-áz annxtest s.c..

·'*>- ^;-^J Κ··9 RezQGOOzi.s es· íng/kg/ü/í *χ·.

a;

örb

4. példa

a.

bkután belus adagolás mind a páciens, mind

Az e példában leírt kísérlet eredménye kísérletet a 3, példában, az intravénás bolus

5. táblázat

6.táblázat

A HERCEPTIIST* anti~E'rbB2 antitest társavó~koncentrációja

7._táblázat

A HERCEPTIN^K anti-ErbBz antitest turaortérfoqat változá.

alapján meghatározott, hatékonysága intravénás bolus é

- 110 Ν lö (minden adatpontra); ΤΜ =^;-- tumorméret; i.v. =- intravénás; s.e. - szubkután; FD fenntartó dózis;

* a 17. napot - mérési hiba miatt - kihagytuk; a görbe alatti, terület a tumoxtérfogat vs. idő görbe alatti terület;

A tumornövekedési sebességet a 21.-31, napokra számítottuk ki; log(TMal).

A 4/A. és 4/3 ábrán a tumor téri,ogat idő függvényében, történő változásának grafikonjait mutatjuk be, mely adatok közül néhányat a 7. táblázatban is feltüntettünk. A 4/A ábrán a tömörtérfogat idő függvényében készített lineáris grafikonja, a 4/B ábrán pedig ugyanezen adatok féllogaritmikus- grafikonja látható (amelyen, a tumor térfogat változása jobban nyomon követhető) . A 7. táblázatban, illetve a 4/A. és 4/B ábrán szemléltetett adatok azt jelzik, hogy - bár a HERCEETIN^ anti-ErbB2 antitesttel kezelt csoportok között dózisfüggő reakciót nem figyeltünk meg - a szubkután bolus adagolás ugyanolyan hatásos, mint az intravénás bolus adagolás, és hasonló maradék vérsavó-koccantráció elérését eredményezi.

5. példa.

An.ti-.urbB2: antitest intravénás és szubkután adagolási sémái

A találmány szerinti megoldás értelmében az anti-EroB2 antitest (pl. HERCEBTItTj adagolási sémája szerint a hatóanyag nagyobb kezdőlökés dózisát alkalmazzuk,, ami a célvérsavó-koncentráció kő. 4 hét vagy még rövidebh idő alatt

ErbB2 antitest találmány szerinti - nagyobb kezdőlökést eredményező ~ adagolási sémájának. A megadott specifikus, adagolási sémák a találmány szerinti megoldásra jellemzők; de nem jelentik a találmány oltalmi, körének korlátozását,

Az első kísérletben a HERCEPT1N® anti.~ErbB2 antitest β mg/kg-os_f 8 mg/kg-os vagy 12 mg/kz-cs kezdődózisát intravénás vagy szubkután injekcióval adtuk be a pácienseknek. A kezdődózisokat (feltöltő dózisok) intravénás infúzióval vagy bolus: injekcióval; előnyösen szubkután bölcs injekcióval ástuk be. A HERCEPTIíA anti-ErbB2 antitest 10-20 pg/mles cél maradék vérsavó-koncentrációját értük el (a kezelési csoport összes tagjára számított átlag); és ezt a kezdődózissal azonos vagy annál nagyobb dózisé anti-ErbB2 antitest adagolásával tartottuk fenn. Az egyik módszer szerint a cél maradék vérsavó-koccant rációt - elérése után - a BÉRCÉ BT IN® an.ti-Erb32 antitest heti egyszeri 2 mg/kg-os dózisának legalább nyolc héten át intravénásán vagy szubkután történő adagolásával tartottuk fenn. Kas módom, a fenti vagy bármely·; találmány szerinti adagolási séma esetén, a fenntartó dózisok folyamatos szubkután infúzióval vagy szubkután pumpa alkalmazásával is adagolhatok.

Egy következő eljárás szerint intravénás injekcióval (infúzió vagy bolus injekció) vagy szubkután bolus injekcióval a HERCEPTTN^' auti-ErbBz antitest 8 mg/kg-os kezcőlökés dózisát adagoljuk. Ezt kővetően - a teljes kezelési csoportra átlagosan kb. 10-20 pg/ml maradék vérsavóköucentráció fenntartása céljából - három hetente egyszer, intravénás bolus injekcióval;

intravénás infúzióval_f

fenntartó dózisokat intravénás infúzióval vagy bölcs iujeksióval, vagy ~ előnyösen ~ szubkctán infúzióval vagy szcbkután bölcs injekcióval adagoljuk.

Egy kővetkező eljárásban a iökésterápiát öt egymást követő napon, naponta legalább 1 mg/kg, előnyösen 4 mg/kg dózisé intravénás infúzióval végezzük, majd ezt az adagolási ciklust a betegség tüneteinek enyhítéséhez szükséges ismétléssel folytatjuk. A kezdődózis vagy -dózisok beadása után a következő dózisokat szubkctán infúzióval vagy bölcs injekcióval íha a páciens jól tolerálja; adagoljuk. A szubkután adagolás mind a páciens, mind az egészségügyi dolgozók számára kényelmes és költségtakarékos módszer.

Egy másik eljárás szerint a HEECEETIN^ antl-ErbBz antitestet kezdetben három hétig, hetente legalább két intravénás infúzióval adagoljuk, és e ciklust a HEBCEPTId'*· antiErbBz antitest hatásos maradék vérsavő-koncentráoiójónak fenntartását eredményező ismétléssel folytatjuk. Az antitestet legalább 4 mg./kg, előnyösen legalább 5 mg/kg dózissal adagoljuk. A fenntartó dózisokat intravénásán vagy a z ub k u t án adj u k be.

ámeunyiben. a páciens (állat vagy ember) a kezdődózis adagolása során és azt követően jól tolerálja az antitestei, a későbbi dózisokat szubkután adagolhatjuk, ami a páciens és az egészségügy1 dolgozók számára egyaránt nagyobb kényelmet és költségtakarékosságot biztosit.

Állat kísérletekben a 4 mg/kg-nál nagyobb (előnyösen 5 mg/kg-nál nagyobb), intravénás vagy szubkután injekcióval beadott kezdődózis után, hetente kétszer (három napos idő-

116 epirubicínj adagolásával kombináljuk. Adott esetben anthraciklin-származék alkalmazása esetén ~ a páciensnek kazdioprotektánst is adagolunk (pl. három hetente 606 mg/m² ciklofoszfamidó . Egy másik kombinált terápia során az antíErbBl antitestet 4 mg/kg-nál nagyobb, előnyösen 5 mg/kg-nál nagyobb, még előnyösebben legalább 3 mg/kg fel töltő dózisban adagoljuk, és a feltöltő dózis után hetente legalább 2 mg/kg-os, előnyösen három hetente 6 mg/kg-os fenntartó dózist adagolunk. A kombinált terápia során az anti-BrbBz antitesttel végzett kezelés során taxoídot adagolunk. A találmány egyik megvalósítási módja értelmében tevőidként paclítazolt alkalmazunk, amelyet hetente 70-100 mg/m² dózisban adagoljuk. A találmány egy következő megvalósítási módja értelmében taxoídként dooetaxelt adagolunk (30-70 mg/mf/hét dózisban) .

S. példa

HERC EPTÍN^ három hetenkénti intravéná s adag olása pác Üt a xe 11 a 1 koxnb i n á 1 va

Jelenleg a HERCEPTIN'⁴' ajánlott dózisa hetente egyszer 2 mg/kg. A pácienseknek a heti -egyszeri adagolás helyett a HERCEPTltó anti-ErbBz antitestet három hetenként, paciI.taxellel (három hetente 175 mg/m²) együtt adagolhatjuk. Ez ajánlati kezelési séma szimulációja arra enged következtetni, hogy a maradék vérsavó-koncentráoiő 17 meg/ml lesz, ami a üERCEPTIN^ korábbi intravénás klinikai kísérleteiben elért maradék cél-vérsavó-koncon-ráció tartományába .1 ’C 3 .·; 3 Ι.ΪΙί3 II V 3 3 I. 3 II .'I SÍIítíX c 31?- 3 C T.. Κ’ΟΓι K l' G I..

Val

Alá Ser Pro Gla Thr His- L-eu Asp Me.t Leu Arg Hís Les Tyr Gin.

<21 ü> 3 <211> 11 <2.12 > PRT <2 l· 3 > ti e.x'S écres

<,γ·

Claims (11)

1. Szabadalmi igénypontok

   Anti—ErbB'2 huMáb 4 Db—6 antitest femasznaiá-sa oj.yuii

   páciens kezelésére szolgál, ahol a kezelés során a páciensnek az anti~ErbB2 huMAb 4D5-8 antitest 8 mg/kg testtömeg kezdeti dózisát adjuk be intravénásán, majd több későbbi 6 mg/kg testtömeg dózist adagolunk az antitestből mtravena san a páciensnek, -és a későbbi dózisok. beadása között .s net időkülönbséget tartunk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti felhasználás, ahol a kezdeti dózist három hét múlva követi az első későbbi aozís.
3. 3. A 2. igénypont szerinti feinasználas, ahol, az int ravénás beadást intravénás intűzrovar vegezzu-K.

   bi dózisok az anti-E.rbB2 huMAb
4. 4Do~« antitest i0 ug/mi értékű vagy ezt meghaladó: maradék vérsavo-koncentraciojat tartják fenn.

   bi dózisok az anti-ErbB2 huMAb 4D
5. 5-8 antitest 20 pg/ml értékű vagv ezt meghaladó maradék vérsavö-koncenttaciöját tartják fenn.
6. 6. A 2, igénypont szerinti felhasználás, ahol a. későbbi dózisok az a.nti-ErbB2 huMAb 400-8 antitest lw gg/mr er

   15723 KB

   21tékü vagy ezt meghaladó maradék vérsavó-konoentrációját tartják fenn.

   ?. A 2. igénypont szerinti felhasználás, ahol a későbbi dózisok az antí-ErbB2 hnMAb 4D5-8 antitest 20 pg/ml értékű vagy ezt meghaladó maradék vérsavó-koncentrációját tartják fenn.
7. 8. Az 1. igénypont szerinti felhasználás, ahol az intravénás beadást intravénás infúzióval végezzük.
8. 9. A 8. igénypont szerinti felhasználás, ahol a későbbi dózisok az an.ti-ErbB-2 huMAb 4D5-S antitest 10 pg/ml értékű vagy ezt meghaladó maradék véreavó-koncentrációját tartják fenn.
9. 10. A 8. igénypont szerinti felhasználás, ahol a későbbi dózisok az anti-ErbB2 huMAb 4D5-8 antitest 20 pg/ml értékű vagy ezt meghaladó maradék vérsavó-koncentrációját tartják fenn.
10. 11. Az 1. igénypont szerinti felhasználás, ahol a későbbi dózisok az anti-ErbBŰ hnMAb 4D5-8 antitest 10 pg/m.L értékű vagy ezt meghaladó maradék vérsavó-koncentrációját tartják fenn.
11. 12. Az 1. igénypont szerinti felhasználás, ahol a későbbi dózisok az anti-Erböz nufeAb 4D5-8 antitest 20 pg/ml értékű vagy ezt meghaladó maradék vérsavó-koncentrációját tartják fenn.

    adjuk.

    felhasználás, ahol kemo terápiás szerként paklitazelt vagy docetaxeix aixalmazanK.

    A meah-atalmazot .Λ ......