[go: up one dir, main page]

HU230964B1 - Pajzsmirigyhormon-hatás mérésére szolgáló transzgenikus indikátor egér és rekombináns DNS-konstrukció - Google Patents

Pajzsmirigyhormon-hatás mérésére szolgáló transzgenikus indikátor egér és rekombináns DNS-konstrukció Download PDF

Info

Publication number
HU230964B1
HU230964B1 HU1400563A HUP1400563A HU230964B1 HU 230964 B1 HU230964 B1 HU 230964B1 HU 1400563 A HU1400563 A HU 1400563A HU P1400563 A HUP1400563 A HU P1400563A HU 230964 B1 HU230964 B1 HU 230964B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
thyroid hormone
expression
dna construct
reporter
cell
Prior art date
Application number
HU1400563A
Other languages
English (en)
Inventor
Csaba 30% Fekete
Balázs 30% Gereben
Petra 30% Mohácsik
Ferenc 5% Erdélyi
Gábor 5% Szabó
Original Assignee
Magyar Tudományos Akadémia Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézet
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Magyar Tudományos Akadémia Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézet filed Critical Magyar Tudományos Akadémia Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézet
Priority to HU1400563A priority Critical patent/HU230964B1/hu
Priority to PCT/HU2015/050020 priority patent/WO2016083856A1/en
Priority to US15/531,100 priority patent/US10694724B2/en
Priority to EP15828366.3A priority patent/EP3223606B1/en
Publication of HUP1400563A2 publication Critical patent/HUP1400563A2/hu
Publication of HU230964B1 publication Critical patent/HU230964B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G01N33/78—Thyroid gland hormones, e.g. T3, T4, TBH, TBG or their receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A01K2217/052—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing gain of function
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/20—Animal model comprising regulated expression system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/20—Animal model comprising regulated expression system
    • A01K2217/203—Animal model comprising inducible/conditional expression system, e.g. hormones, tet
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0393—Animal model comprising a reporter system for screening tests
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C12N2015/8527—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic for producing animal models, e.g. for tests or diseases
    • C12N2015/859—Animal models comprising reporter system for screening tests
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/90—Vectors containing a transposable element
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)

Description

PAJZSMIRIGYHORMON-HATÁS MÉRÉSÉRE SZOLGÁLÓ TRANSZGEN1KUS INDIKÁTOR EGÉR ÉS REKOMBINÁNS DNS-KONSTRUKCIÓ
A TALÁLMÁNY TÁRGYKÖRE
A találmány szerinti megoldás pajzsmirigyhormon (TH) hatás in vivo és in vitro sejt- vagy szövetspecifiktts vizsgálatára vonatkozik. A találmány tárgya a pajzsmirigyhormon-hatás mérésére szolgáló íranszgenikus indikátor egér, amely lehetővé teszi a pajzsmirigyhormon-hatás in viva sejt- vagy' szövetspecifikus vizsgálatát.
A TALÁLMÁNY HÁTTERE
A pajzsmirigyhormon (TH) biológiai folyamatok széles körének kulcsfontosságú regulatora. A pajzsmirigyhormon alapvető fontosságú jelenségek széles körére fejti ki hatását, például a sejtproliferácíóra, az energia homeosztázisra, az agy fejlődésére és működésére. Szükséges a gyermekek és fiatal állatok normális növekedéséhez, amit a TH hiány esetén megfigyelt növekedési elmaradás is bizonyít. A TH növeli a szív frekvenciát, fokozza a szív kontraktilitását és a perctérfogatot. Elősegíti a vazodilatációt, amely fokozott vérbeáramlást eredményez számos szervben.
Mind a csökkent, mind a megnövekedett pajzsmirigyhormon-koncentráció a mentális állapot megváltozásához vezet.
A normál reprodukció viselkedési és fiziológiás aspektusa a lényegében normál mértékű pajzsmirigyhormon-szint függvénye. A hípotireózishoz különösen gyakran kapcsolódik terméketlenség.
A megnövekedett pajzsmirigyhormon-szint serkenti a zsír mobilizációját, ami a zsírsavak koncentrációjának megnövekedéséhez vezet a plazmában. A pajzsmirigyhorrnonok serkentő hatásúak a szénhidrát-metabo1 izmus csaknem minden szintjén, például fokozzák a glükóz inzulinfüggő sejtbejutását, a glűkoneogenezist és glikolízist. ezáltal szabad glükózt állítanak elő.
Az emberi pajzsmírigy főként T4-et, egy stabil prohormont szekretál, amelyet T3-má kell alakítani ahhoz, hogy kifejtse a magreceptorok által közvetített biológiai hatását (Larsen és Ingbar 1992). A pajzsmirigyhormon-szintek a plazmában viszonylag stabilak, míg a sejten belüli TH-koncentráció specifikus fiziológiás és patofiziológiás ingerek által előidézett turbulens és szigorúan szabályozott változásokon megy keresztül. Azaz a TH hatását a magreceptorokon sejt- és szövetspecifikus folyamatok váltják ki. A pajzsmirigyhorrnonok sejt- és szövetspecifikus működéséi a helyi, pajzsmirigyhonnom métábólizáló enzimek, transzporter molekulák, receptorok és koregulátorok irányítják (Fekete és Lechan 2014; Gereben, et al. 2008; Getting és Yen 2007; Visser, el al. 2008). A pajzsmirigyhorrnonok sejttípus-specifikus működését pajzsmirigybormon-transzporterek, dejodáz enzimek, pajzsmirigyhormon receptorok és koregulátorok szabályozzák a cirkuláló pajzsmirigyhonnon-színttöl viszonylag függetlenül.
A pajzsmirigyhorrnonok receptorai (TR) nukleáris DNS-kötő fehérjék, amelyek hormonreszponziv, ligandindukált transzkripciós faktorként működnek. Eddig különböző izotermáknak tekinthető TRa és ΤΚβ receptor altípusokat azonosítottak. Mind a TRa, mind a TRp ugyanazon pajzsmirigyhormon-reszponziv elemhez (TRE) kötődik, ami a pajzstnirigyhortnon-érzékeny gének szabályozó régiójában található (Lin, et al. 2013). A jellemző konszenzusos TRE félhely 4 nukleotiddal elválasztott AGGTCA, amelyet a második, AGGTC-A félhely követ (TRE DR-4) (Velasco, et al. 2007). A kevésbé tipikus TRE-ket fordított palindrom vagy palindrom félhelyek jellemzik (e.g. F2 vagy Pal) (Velasco et al. 2007).
Pl 40056
115062-43 57/KOH
SZTNH-100156246
A TR-ok altípusra jellemző hatást fejtenek ki az alapanyagcsere mértékének, a csontfejlődés és más folyamatok szabályozásában (Lín et al. 2013). A TRa fontos szerepet játszik a szívritmus és izomzat szabályozásában, míg a TRf májban kifejtett hatásokon keresztül modulálja a szérum koleszterin szintiét és a hipotalamusz-hipofízis-pajzsmirígy tengelyen keresztül a TH-terme!és vísszacsatolásos gátlását.
Emberek pajzsmirlgyhormonnal történő kezelése számos tünet, például obeziíás és hiperkoleszterinémia esetén is előnyös lehetne. E kezelés azonban nem kivitelezhető a pajzsmirigyhormon kedvezőtlen hatásai, például a íachikardiál eredményező kardíális hatás miatt.. Mivel az elhízás a 2-es típusú cukorbetegség kockázatának, a kardiovaszkuláris tünetek, az onkogenezis és a depresszió kockázatának megnövelésével pusztító egészségügyi problémává vált Európában és az USA-ban (Hedley, et al. 2004), a probléma megoldására tett erőfeszí10 tések intenzívek. Az USA-ban a népesség több, mint 65%-a túlsúlyos, 31%-a (több, mint 61 millió ember) elhízott (\vww.obesiiyreseareli.tiili.gov). és az ebből keletkező közvetlen és közvetett költségek meghaladják a 100 milliárd amerikai dollárt (Wolf és Coldilz 1998). Magyarországon a népesség 20%-a elhízott (BMl>30 kg/m j és további 42% túlsúlyos (BMl 25- 30 kg/nf) (Tóth és Nagy 2004). A hiperkoleszterinémia világszerte súlyos egészségügyi kockázatot jelent, mivel nagy populációkban növeli a koronáriabetegségek kockázatát (az USA15 ban a férfiak mintegy 42%-ánál, a nők 34%-ánál diagnosztizálnak hiperkoleszterinémiát) (Bates 1982).
Intenzív K-t-F tevékenység tárgya az adott szövetben a TH működését modulálni képes, ám más szövetekben a TH működésére nem ható, TR izoformára és/vagy szövetre specifikus vegyületek előállítása, amelyek a pajzsmirigyhormon jótékony hálásait anélkül váltják ki, hogy nemkívánatos tüneteket (például szívtüneteket) idéznének elő.
.20 Számos vizsgálatot végeztek a pajzsmirigyhonnonok és pajzsmirigy hormon-analógok hatásainak tanulmányozására, valamint a különböző TR-altipusok szerepének és a különböző szövetek TH-ra adott transzkripciós válaszának génspecifikus változatainak azonosítására.
Lin et al. a pajzsmirigyhormon receptor altípusok génspeciftkus működését vizsgálták exogén TR-ok sejtbe történő bevitelével, genetikailag módosított HepG2 és Méta sejtekben (Lin et al. 20)3.).
Az l 365 034 számú európai szabadalom a pajzsmirigyhormon gén transzkripciójának vizsgálatára alkalmas promóter assay-t ismertet. HepG2 sejteket transzformáltak timidin kinéz minimál promoter és a luciferáz gén előtt 8 bp mérető távtartóval elválasztott, kél, 12 bp hosszúságú fordított palindrontból álló TRE-et hordozó 2xlROluc vektorral. A konstrukció alkalmas sejtvonalakbatt, például HepG2 sejtekben a TH-működés in vitro meghatározására, de nem teszi lehetővé a TH-múködés in vivo vizsgálatát, mivel a rekombináns konstrukció 30 transzgenikus állatban nem működőképes.
Quignodon és munkatársai transzgenikus riporter egér előállításáról számolnak be, amellyel a pajzsmirigyhormon szignalizácíó spatio-temporáíis megoszlása elemezhető az egéragy fejlődése során (Quignodon, et al. 2004). A riporterrendszerben élesztő (?ű/4DNS-kötö doménböl és TRa ligandkötő dómén fúziós fehérjéből áiló kiméra receptort alkalmaznak a /«cZ-expresszió irányítására. A szerzők két, FINDT3A-nak és FINDT3B35 nek elnevezett transzgenikus vonalat állítottak elő, amelyek a transzgén integrációjának helyében és a kópiák számában különböznek. Λ FINDT3 transzgenikus riporterrendszer neuronális sejtekben a pajzsmirigyhormonra erősen reszponzívnak bizonyult. A íranszgén expressziója a T3.-tól függött, de a rendszer az endogén TR-tól függetlenül működött. Ezért a modell alkalmatlan bármely, endogén triódon expresszálódó pajzsmirigyhormon receptortól függő szabályozás kimutatására.
Quignodon és munkatársai megállapították, hogy a TR N-terminális doménjeiben létrejövő interakciók l í 5062-43 57/KOH
Pl 400563 és a TR izotermák expressziójának változásai a szabályozás olyan szintjét hozhatják létre, amelyet a FINDT3rendszer nem mutat ki. Ez alkalmatlanná teszi a modellt az izoforma-specifikus TH-analógok és aníagonisták hatásának tesztelésére. A szerzők azt is lehetségesnek ítélték, hogy a T3-szignalizácíó kezdete kissé korábbra tehető, mint amit a model trendszer kimutat, mivel a rekombináns DNS-kon strukc ió előállításához alkalmazott kiírtéra receptor szabályozza saját expresszióját, így a β-galaktozidáz akkumulációja önindukáló rendszerben késedelmet szenvedhet. Ebből következik, hogy a modell alkalmazása élő állatban időbeli lefutást célzó vizsgálatok esetén korlátozott.
Nucera és munkatársai TR.E szabályozása alatt álló LacZ riporter gént (amely β-galaktozidúzt kódol) expresszáló transzgenikus egérmodellt alakítottak ki az anyai TH transzkripciós aktivitásának specifikus követésére a korai és késői embrionális-magzati fejlődés során. A szerzőknek sikerült a modell segítségével embrionális szakaszokban vizsgálni a TH-möködést, a felnőtt állatokat illető információ nem elérhető. Ennek oka lehet mind a transzgén expresszié) útiak, mind a FH-na! kapcsolatos gének szabályozásának felnőtt állatokra jellemző komplexitása, amely gyakran eredményez nem működőképes (például csendesített) rekombináns konstrukciót felnőtt egyedben. Ezen kívül a 2xTRE β-gal modell nem teszi lehetővé a kimutatást élő állatban (Nucera, et al. 2010).
Nyilvánvalóan szükség van olyan komplex és megbízható in vivo és in vitro modellekre, amelyek lehetővé teszik a pajzsmirigyhormon-hatás vizsgálatát, valamint a gyógyszeripar által előállított TR agonisták vagy antagonisták, koregulátorok és pajzsmirigyhormon transzporterek modulátorainak vizsgálatát abból a célból, hogy kihasználhassuk a TH-möködés előnyös hatásait (pl. súlycsökkenés, koleszterinszint csökkenése) a TH veszélyes mellékhatásainak (pl. lipogenezis és tachikardia) kiváltása nélkül. A felfedező tudományos kutatások is nagyban profitálnának egy olyan modell létéből, amely lehetővé teszi a sejttípus-specifikus pajzsmírigyhormon-müködés jobb megismerését, amivel feltúrhatóak a sejtproliferáció, energia-homeosztázis és más, megváltozott pajzsmirigyhormon-háztartással összefüggő tünet/állapot (pl. alacsony T3 szindróma, pajzsmirigyhormon kombinációs terápia tesztelése) hátterében álló mechanizmusok.
A TALÁLMÁNY RÖVID ISMERTETÉSE
A találmány tárgya pajzsmirigyhormon (TH) hatás ín viva vizsgálatát lehetővé tévő transzgenikus egér. A találmány szerinti transzgenikus egér alkalmas a géntranszkripció TH által médiáit szabályozásának szövetspecifikus és/vagy sejttípus-specifikus mérésére, működése függ a TH-működésl biztosító endogén apparátustól, beleértve a ΊΉ receptor (TR) altípusok izoformáit és a TR koregulútorait. Egy bizonyos megvalósítási mód szerint egy riporterfehérje vagy az azt kódoló mRNS expressziójának mértéke képezi a modellben a mérhető kimenőjelet. A találmány szerinti transzgenikus egér lehetővé teszi a pajzsmirigyhonnon (TH) működésének vizsgálatát, amennyiben van jelen TR, vagy- akár a működés hiányának észlelését amennyiben akár TR, akár TH nincs jelen. A találmány szerinti transzgenikus egér lehetővé teszi bármely endogén módon expresszált TR altípus bármely izoformáját expresszáló sejtben és/vagy szövetben a szövet- és/vagy sejttípus-specifikus pajzsmirigyhormonmüködés (TI-1) szintjének vizsgálatát is.
A találmány egy szempontja szerint a találmány tárgya pajzsmirigyhormon működésének indikátoraként szolgáló transzgenikus egér, amely sejtjeinek genomjában stabilan integrálva pajzsmirigyhormon (TH) működésének vizsgálatára alkalmas rekombináns DNS-konstnikeiót tartalmaz ahol a rekombináns DNS-konstrukció 5’3' irányban legalább a következő elemeket tartalmazza:
pajzsmirigyhormoti-reszponz.lv szegmens, expressziós enlianszerhez működőképesen kapcsolt promóter,
115062-4357/KOH
P1400563 riportert kifejező kódolószekvencia, ahol
- a promoter irányítja a riporter expresszióját az egér egy vagy több szövetének sejtjeiben,
- amennyiben a sejtekben expresszáiódik pajzsmirigyhormon receptor (TR), az a konstrukciótól függetlenül expresszáiódik; vagy nem expresszáiódik TR a sejtekben,
- TR, amennyiben jelen van és TH, amennyiben jelen van, a sejtekben komplexet képez,
- a komplex, amennyiben jelen van, a pajzsmirígytiormon-reszponzív szegmensen keresztül fokozza a riporter expresszióját, ezáltal
- a riporter expressziójának szintje korrelál a komplex szintjével,
- a DNS-konstrukció mentes pajzsmirigyhormon receptort kódoló szekvenciától és az egér a rekombináns DNS-konstmkció egyetlen kópiáját tartalmazza haploid genotnjában.
Ezen megvalósítási mód szerint a promoter az. egér egy vagy több szövetének sejtjeiben irányítja a riporter expresszióját.
A pajzsmirigyhormon receptor (TR) a konstrukciótól függetlenül expresszáiódik, amennyiben expresszáiódik a sejtekben, azaz ugyanazon sejtekben, amelyekben a rekombináns DNS-konstrukció jelen van és működőképes. Másik lehetőségként a TR nem expresszáiódik a sejtekben.
Különösen, a rekombináns DNS-konstrukció mentes pajzsmirígybonnon receptort kódoló szekvenciától.
TR, amennyiben jelen van. és TH, amennyiben jelen van, komplexet képez. (TR-TH-kompíex) a sejtekben, ezen komplex, amennyiben jelen van, a pajzsmirigyhormon-reszponzív szegmensen keresztül fokozza a riporter expresszíóját, ezáltal a riporter expressziójának szintje korrelál, előnyösen pozitívan korrelál a komplex szintjével.
Ezáltal a riporter szabályozása pajzsmirigyhormon receptortól (TR) íllgg. A riporter szabályozása a receptor koregulátoraitól is függhet. A riporter szabályozása pajzsmirigyhormon receptortól függ, amely THkötődés esetén TRE-dependeus aktivátorként viselkedik, míg TH-kötödés hiányában TRE-dependens represszorként működik, ezáltal a pajzstnirigyhomwn transzkripciós hatásait a pajzsmirigyhormon-reszponzív szegmensen keresztül közvetíti.
Különösen, amennyiben a rekombináns DNS-konstrukciót tartalmazó sejtben TR-t és TH-t tartalmazó komplex képződik, a komplex aktiválja a promótert, és ezáltal a riportert kódoló szekvencia transzkripcióját. Az aktiváció és/vagy transzkripció szintje a ligandáít TR-komplex szintjétől függ és/vagy azzal korrelál.
A TR és a TH komplexe aktivátor.
Azaz a TRE a komplex kötődésével akiiválható.
Amennyiben kívánatos, a TR és/vagy a TR és TH komplexe egy vagy több, a konstrukciót tartalmazó sejtben jelenlévő, aTH-működés koregulátoaként működő további fehérjéhez is kötődik.
Egy megvalósítási mód szerint a találmány szerinti egér genotnjába integrált rekombináns DNSkonstrukció pajzsmirigyhormon-reszponzív szegmense TR-fuggö reszponzivitást vagy érzékenységet mutat !rijód -tíruBÍB irányában (Ί 3).
Egy megvalósítási ínód szerint a pajzsmirigyhormon-reszponziv szegmens pajzsmirigyhormonreszponzív elemei (TRE) tartalmaz, amely aktiválja a géntrauszkripciót és/vagy -expressziét, amennyiben a TR TH-val ligandáít.
A ligandot nem kötő TR-t kötő TRE géntranszkripció és/vagy -expresszió represszoraként működhet.
Egy másik megvalósítási mód szerint a találmány szerinti egér genotnjába integrált rekombináns DNS
IÍ5062-4357/KOH
P í40056:
konstrukció pajzsmirtgyhormon-reszponzfv szegmense egy vagy több kópia pajzsmirígyhormon-reszponzív elemet tartalmaz.
Egy előnyös megvalósítási mód szerint a TRE a diói gén, előnyösebben az emberi diói gén pajzsmirigybormon- vá lasze l eme.
Egy igen előnyös megvalósítási mód szerint a TRE olyan pajzsmírigyhormon-vála.szelem (TRE), melynek szekvenciamotivmna GGG ÍGA nnnn AGGTCA, igen előnyösen az emberi diói gén 5' szegélyező régiójának TRE-e, melynek szekvenciája GGGTC.A tctg AGGTCAíZhartg, et al. 1998).
Egy másik megvalósítási mód szerint a TRE egynél több kópiában van jelen, előnyösen l, 2, 3,4 vagy 5 kópiában, igen előnyösen 3 kópiában, különösen a diói gén TRE-ének 3 kópiájában.
Egy megvalósítási mód szerint a promoter ubikviter promoter.
Egy előnyös megvalósítási mód szerint a promóter minimál promoter, amely minimálisan reszponziv/nem reszponzlv az alap transzkripciós komplex képződéséhez szükséges transzkripciós faktorokon kívüli trtmszkripc iós faktorokra.
Egy előnyös megvalósítási mód szerint a promóter a timídín kínáz (TK.) minimál promóter.
Egy igen előnyös megvalósítási mód szerint a promóter a Herpes simplex virus timidin kínáz (TK) minimál promótere.
Egy előnyös megvalósítási mód szerint az cxpressziós enhanszer intron szekvenciákat tartalmaz.
Egy igen előnyős megvalósítási mód szerint az expressziós enhanszer expressziós enhanszer kazetta formájában van jelen, amely előnyösen nem tratiszláli leader szekvenciát tartalmaz, előnyösebben béta-globin 20 gén intron szekvenciájának nem transztól! leader szekvenciáját, igen előnyösen az NTC8681 vektor nem transziáit leader (exon l)-HTLV-l R-szintetikus nyúl β-gíobin-alapú 3’ intron-intron egység szekvenciáját.
Egy másik megvalósítási tnód szerint a riportert kódoló kódolószekvencía által kódolt riporter fehérje, amelynek sejtben történő expressziója esetén a sejt optikailag detektálható szignált biztosít, amely optikailag detektálható szignál előnyösen látható fény.
Bizonyos megvalósítási módok szerint a fehérje enzim, melynek aktivitása fényt emittáió szubsztrátot eredményez, igen előnyösen luciíéráz vagy színes szubsztrát, pl. íacZ.
Más megvalósítási módok szerint a fehérje fluoreszcens fehérje, amely előnyösen a GÉP, RFP, YFP, CFP, tdlömato közül választott.
Egy igen előnyös megvalósítási mód szerint a riporterfehérjét kódoló szekvencia kódonoptirnalízált és/vagy 30 tnetilációrezisztens szekvencia, előnyösen dCpG szekvencia, igen előnyösen dCpG luciférázt kódoló régió.
Egy másik megvalósítási mód szerint a riportert kódoló kódolószekvencia által kódok riporter fehérje, melynek mennyisége és/vagy aktivitása enzim assay-kkeí mérhető, amennyiben expresszálódik a sejtben.
Egy másik megvalósítási tnód szerint a rekombináns DNS-konstrukció rezisztencíamarkert kódoló szekvenciát is tartalmaz.
3S Egy másik megvalósítási mód szerint a riportert kódoló és a rezisztencíamarkert kódoló szekvenciák keretben egymáshoz fuzionáltak; ahol a rekombináns DNS-konstrukció a kódoló szekvenciáktól 3' irányban políadenílációs szegmens!: is tartalmaz.
Bizonyos megvalósítási módok szerint a reziszteticiarnarkér antibiotikum rezisztenciamarker, előnyösen antibiotikum-rezisztencia kazettában kódolt, amely előnyösen zeocin-rezisztencia kazetta, különösen ShBle 40 zeocin-rezisztencia kazetta.
115Ü62-4357/KOH
Pl 40056:
Egy másik megvalósítási mód szerint a rekombináns DNS-konstrukciót a DNS-konstrukciót a szomszédos genomi szekvenciák befolyásától megóvó inszulátor szekvenciák szegélyezik.
Egy igen előnyös megvalósítási mód szerint a DNS-konstrukció pWHERE vektorban van összeszerelve, és/vagy H19 inszulátorok, különösen ezen vektor Hl9 inszulátorai szegélyezik.
A rekombináns DNS-konstrukció bármely, £. co/i-ban növeszthető, alkalmas vektorban összeszerelhető (pl. pGemT, pUC, pCl-neo, pGL3-basic, pSPORT, pEYFP, D10).
Egy megvalósítási mód szerint a rekombináns DNS-konstrukció a találmány szerinti egér genomjába transzpozon alapú bevitellel van integrálva.
Igen előnyösen a Sleeping Beauty rendszert alkalmazzuk transzpozon alapú beviteli rendszerként.
Egy igen előnyös megvalósítási mód szerint a találmány szerinti transzgeníkus egér genomjában stabilan integráltan pajzsmirigyhormon működésének vizsgálatára alkalmas rekombináns DNS-konstrukciót tartalmaz, ahol a rekombináns DNS-konstrukció 5’ - 3' irányban legalább a következő elemeket tartalmazza:
pajzsmirígyhormon-reszponzív szegmens, amely előnyösen egy vagy több, GGGTCA nnnn AGGTCA szekvenciamotívumú TRE-et tartalmaz, előnyösen a diói gén, előnyösen az emberi diói gén 5’ szegélyező régiójának TRE-ét, expressziós enhanszerhez működőképesen kapcsok promoter, ahol a promoter előnyösen a timidín kináz minimál promoter, előnyösen a Herpes simplex vírus timidin kináz minimál promoters, az expressziós enhanszer előnyösen expressziós enhanszer kazetta formájában van jelen, amely előnyösen intron szekvenciát tartalmaz, pl, intron-íntron egységet és nem transziáit leader szekvenciát, különösen az NTC8681 vektor nem transziáit leader (exon 1)-HTLV-1 R-szintetikus nyúl β-globin-aíapú 3’ intron-intron egységét, riportert kódoló kódolószekvencia, ahol a kódolószekvencia előnyösen dCpG luciferázt kódoló régió, ahol az elemeket inszulátor szekvenciák, előnyösen Hi 9 inszulátorok szegélyezik.
Egy megvalósítási mód szerint a rekombináns DNS-konstrukciót a találmány szerinti egér genomjába a Sleeping Beauty transzpozon rendszerrel integráljuk.
Egy megvalósítási mód szerint az egér heterozigóta a DNS-konstrukció tekintetében.
Egy másik megvalósítási mód szerint az egér előnyösen a DNS-konstrukció egyetlen kópiáját tartalmazza (mindegyik) haploid genomjában.
Egy másik aspektus szerint a leírás tárgya rekombináns DNS-konstrukció, amely lehetővé teszi a pajzsmirigyhonnon-működés vizsgálatát.
A rekombináns konstrukció a kővetkező elemeket tartalmazza: pajzsmirigyhormon- reszponzív szegmens, amely pajzsmirigyhormon receptorokon keresztül pajzsmirigybormon-dependens működésre reszponzív; emlősszövetekben szövet független, ubikviter módon expresszálódó, az alap transzkripciós komplex képzéséhez szükséges transzkripciós faktorokon kívüli transzkripciós faktorokra minimálisan reszponzív/nem reszponzív minimál promoter; kódoló régió, amely riportergént kódol, melynek mennyisége érzékenyen detektálható élő állatban in vivő, szövetmintában ex vivo, és/vagy sejttenyészetben in vitro', expressziós enhanszer kazettát, amely elősegíti a minimál promoter által irányított transzkripciós egység aktivitását; inszulátorokat, melyek izolálják a pajzsmirígyhormon-reszponzív transzgeníkus kazettát a szomszédos kromoszómarégióktól.
A rekombináns DNS-konstrukció 5VF irányban legalább a következő elemeket tartalmazza: pajzsmirígyhormon-reszponzív szegmens,
15062-43 57/KOH
P1400563 expressziós enlianszerhez működőképesen kapcsok promoter, riportert kódoló kódolószekvencia, és a riporter szabályozása endogén módon expresszált pajzsmírigyhormon receptoroktól és koregulátoroklől flígg, melyek a pajzsinirigyhonnon-reszponzív szegmensen keresztül közvetítik a pajzsmírigyhormon iransz5 krípciós hatásait.
Ezen megvalósítási mód szerint a promoter képes a riporter expresszióját irányítani az állat: egy vagy több szövetének sejtjeiben. Előnyösen a promoter ubikviter promóter.
A konstrukciónak nem része pajzsmírigyhormon receptort kódoló szekvencia, azaz a rekombináns DNSkonstrukcíó mentes TR-t kódoló szekvenciától. Azaz TR, amennyiben jelen van, a konstrukciótól függetlenül 10 expresszálódik a sejtekben, azaz azokban a sejtekben, ahol a rekombináns DNS-konstrukeió jelen van és működőképes, Másik lehetőségként a TR nem expresszálódik a sejtekben.
TR, amennyiben jelen van. és Tik amennyiben jelen van, komplexet képez (TR-TH-komplex) a sejtekben, ezen komplex, amennyiben jelen van, a pajzsmirigyhormon-reszponzív szegmensen keresztül fokozza a riporter expresszióját, ezáltal a riporter expressziójának szintje korrelál, előnyösen pozitívan korrelál a komplex szintjével.
A rekombináns DNS-konstrukeió pajzsmirigyhormon-reszponzív szegmense TR-tuggö reszponzívítást vagy érzékenységet mutat trijód-tironin irányában (T3).
Egy megvalósítási mód szerint a pajzsmirigyhormon-reszponzív szegmens pajzsmirigyhormonreszponzív elemet tartalmaz, amely aktiválja a génexpressziót, amennyiben a TR TH-lígandot köt.
A rekombináns DNS-konstrukeió pajz»sntirigyhormon-reszponzív szegmense egyetlen vagy több kópia 20 pajzsmirigyhormon-reszponzív elemet tartalmaz.
Egy előnyös megvalósítási mód szerint a TRE a diai gén, előnyösebben az emberi diói gén pajzsmirigyhormon-válaszeleme.
Egy igen előnyös megvalósítási mód szerint a TRE olyan pajzsmirigyhormon-válaszelem (TRE), melynek szekvenciamotívuma GGGTCA nnnn AGGTCA, igen előnyösen az emberi diói gén 5’ szegélyező régiójá25 nak TRE-e, melynek szekvenciája GGGTCA. '.ctg AGGTCA.
Egy másik tnegvaiósitási mód szerint a TRE egy vagy egynél több kópiában, előnyösen 1-5 kópiában, előnyösen 3 kópiában van jelen.
Egy megvalósítási mód szerint a DNS-konstrukcióban lévő promóter ubikviter promoter.
Egy előnyös megvalósítási mód szerint a promóter minimál promóter, amely minimálisan reszpon30 zív/ncm reszponzív az alap transzkripciós komplex képződéséhez szükséges transzkripciós faktorokon kívüli transzkripciós faktorokra.
Egy előnyős megvalósítási mód szerint a promóter a timidin kináz minimál promóter.
Egy igen előnyös megvalósítási mód szerint a promóter a Herpes simplex vírus timidin kináz minimál promótere.
Egy előnyös megvalósítási mód szerint az expressziós enhanszer intron szek venciákat tartalmaz.
Egy igen előnyös megvalósítási mód szerint a rekombináns DNS-konstrukcióban lévő expressziós enhanszer expressziós enhanszer kazetta formájában van jelen, amely előnyösen nem transziáit leader szekvenciát tartalmaz, előnyösebben béta-globin gén intron szekvenciájának nem transziáit leader szekvenciáját, igen előnyösen az NTC8681 vektor nem transziáit leader (exon i)-HTLV-l R-szintetikus nyúl β-globtn-alapú 3’ 40 intron-íntron egységét.
1! 5062-4357ZKOH
Pl 400563
Egy másik megvalósítási mód szerint a riportert kódoló kódolószekvencia által kódolt riporter fehérje, amely sejtben történő expressziója esetén a sejt optikailag detektálható szignált biztosít, amely optikailag detektálható szignál előnyösen látható lény.
Bizonyos megvalósítási módok szerint a fehérje enzim, tnelynek aktivitása fényt emittáló szubsztrátot 5 eredményez, igen előnyösen hictferáz vagy színes szubsztrát, pl. lacZ.
Másik megvalósítási módok szerint a fehérje fluoreszcens fehérje, amely előnyösen a GFP, RFP, YFP, CFP, tdTömalo közül választott.
Egy igeit előnyös megvalósítási mód szerint a riporterfehérjét kódoló szekvencia kódonopíímalizált és/vagy metilációrezisztens szekvencia, előnyösen dCpG szekvencia, igen előnyösen dCpO lucíferázt kódoló régió.
Egy másik megvalósítási mód szerint a riportert kódoló kódolószekvencia által kódok riporter feliétje, melynek mennyisége és/vagy aktivitása enzim assay-kkel mérhető, amennyiben expresszálódik a sejtben.
Egy másik megvalósítási mód szerinti a rekombináns DNS-konstrukció rezisztenciarnarkeri kódoló szekvenciát is tartalmaz.
Egy másik megvalósítási mód szerint a riportert kódoló és a rezisztenciamarkert kódoló szekvenciák kelé retben egymáshoz fuzionáltak; ahol a rekombináns DNS-konstrukció a kódoló szekvenciáktól 3’ irányban poliadenilációs szegmenst is tartalmaz.
Bizonyos megvalósítási módok szerint a rezisztenciamarker antibiotikum rezisztenciamarker, előnyösen antibiotikum-rezisztencia kazettában kódolt, amely előnyösen zeocín-rezisztencia kazetta, különösen ShBle zeocín-rezíszíencia kazetta.
Egy tnásik megvalósítási mód szerint a rekombináns DNS-konstrukciót a DNS-konstrukciót a szomszédos szekvenciák befolyásától megóvó ínszulátor szekvenciák szegélyezik.
Egy igen előnyös megvalósítási mód szerint a DNS-konstrukció pWHERE vektorban van összeszerelve, és Hl 9 inszulátorok szegélyezik, különösen ezen vektor Hl9 inszulátorai.
Λ rekombináns DNS-konstrukció bármely, pl. £. eo//-ban növeszthető, alkalmas vektorban összeszerel25 hetö (pl. pGemT. pUC, pCI-neo, pGL3-basic, pSPORT, pEYFP, DIÓ),
A leírás tárgya pajzsmirigyhormon működésének vizsgálatára alkalmas rekombináns DNS-konstrukció, ahol a rekombináns DNS-konstrukció 5’-3’ irányban legalább a kővetkező elemeket tartalmazza:
pajzsmirigyhotroon-reszpotiziv szegmens, amely előnyösen egy vagy több, GGGTCA mnm AGGTCA szekvenciatnotivumú TRE-et tartalmaz, előnyösen r/iol gén, előnyösen az emberi <.7ío I gén 5’ szegélyező 30 régiójának TRE-ét, expressziós enhanszerbez működőképesen kapcsolt promoter, ahol a promóter előnyösen a timidin krnáz minimál promóter, előnyösen a Herpes simplex vírus timidin kinéz minimál promótere, az expressziós enhanszer előnyösen expressziós enhanszer kazetta tormájában van jelen, amely előnyösen intron szekvenciát, pl. intron-intron egységet és nem transzlált leader szekvenciát tartalmaz, különö35 sen az NTC8681 vektor nem transziáit leader (exon l)-HTl..V-l R-szintetikus nyúl β-globin-alapú 3’ intron-intron egységét, riportert kódoló kódolószekvencia, ahol a kódolószekvencia előnyösen dCpG lucíferázt kódoló régió, ahol az elemeket ínszulátor szekvenciák, előnyösen I í19 inszulátorok szegélyezik.
Ismertetünk a rekombináns DNS-konstrukcíónak a transzgenikus állat genomjába történő integrálására al40 kalmas targetáló expressziós vektort, ahol a targetáló konstrukció a rekombináns DNS-konstrukciót
115062-4357/KOH
Pl 400563 transzpozázfelismerö szekvenciák között tartalmazza.
Egy megvalósítási mód szerinti a ttunszpozázfelistnerö szekvenciák 1TR ttanszpozázfeíismeró szekvenciák.
Ezen megvalósítási mód szerint a transzpozon rendszer igen előnyösen a Sleeping Beauty transzpozon rendszer.
A találmány egy másik aspektusa szerint a találmány tárgya a DNS-konstrukciót tartalmazó egér sejtje, ahol a sejt a TH jelenlétében megemelkedett szintű riportert expresszál.
Egy másik megvalósítási mód szerint a sejt a transzgenikus egérből származó sejt.
Egy megvalósítási mód szerint a sejt a fent meghatározott DNS-konstrukcióval transzformált sejt.
Egy másik megvalósítási mód szerint a sejt sejtvonalból származik, előnyösen nem az egérből származó, 10 állandó sejtvonalból.
A leírás tárgya a találmány szerinti transzgenikus egér előállítására szolgáló eljárás.
Egy megvalósítási mód szerint a találmány szerinti transzgenikus egér előállítására szolgáló eljárás magában foglalja a kővetkező lépéseket:
a rekombináns DNS-targetáló konstrukció bevitele megtermékenyített oociták pronukleuszába,
- a „founder (alapitó) állatok azonosítása.
a „founder” állatok keresztezése vad típusú állatokkal, az Ft generáció beltenyésztése.
Egy másik megvalósítási mód szerint a találmány szerinti transzgenikus egér előállítására szolgáló eljárás magában foglalhat bármely genetikai módosításra szolgáló eljárást, amely alkalmas a rekombináns DNS20 konstrukciót tartalmazó transzgenikus egér előállítására, pl. DNS-mikromjekiáíást, őssejt közvetítette géntranszféri, knock-in technikákat, sib.
Egy bizonyos megvalósítási mód szerint a találmány szerinti íranszgemkus egér előállítására szolgáló eljárás magában foglalja a következő lépéseket:
megtermékenytett oociták pronukleuszának injektálása a targetáló kazettát és a Sleeping Beauty transzpozon t kódoló, ín vitro átírt mRNS-t tartalmazó keverékkel, a founder” állatok azonosítása íuciferáz próbával, TaqMan assay alkalmazásával.
A találmány egy másik szempontja szerint a leírás tárgya eljárás sejt transzformációjára a rekombináns DNS-konstrukcióval, ahol az eljárás magában foglalja a rekombináns DNS-konstrukcíó sejtbe történő bejuttatásának és a sejt tenyésztésének lépését.
A találmány egy másik szempontja szerint a találmány tárgya a találmány szerinti transzgenikus egér alkalmazása szövet- és/vagy sejttípus-specifikus TH-mükódés ín vívó vizsgálatára vagy monitorozására.
A találmány tárgya a találmány szerinti transzgenikus egérből származó sejt, szövet vagy szerv alkalmazása szövet- és/vagy sejttípüs-spectfikus i fi-működés ex vívó vizsgálatára vagy monitorozására.
A találmány tárgya továbbá a rekombináns DNS-konstrukcióval transzformált és/vagy a találmány sze35 rinti transzgenikus egérből származó sejt vagy sejtvönal alkalmazása a sejtben szövet- és/vagy sejttipusspecííikus TH-möködés in vitro vizsgálatára vagy monitorozására.
A találmány tárgya a találmány szerinti transzgenikus egér alkalmazása és/vagy az. egér sejtjének, szövetének vagy szervének alkalmazása és/vagy a DNS-konstrukciót tartalmazó sejt vagy sejtvonal alkalmazása pajzsmirigyhormon receptor agonistáinak vagy aniagonistámak, koregulátorok vagy pajzsmirigy hormon 40 transzporterek modulátorainak működésének vizsgálatára vagy monitorozására.
115062-4357/KOH
Pl 400563
DEFINÍCIÓK
A „íranszgenikus” állat kifejezés olyan genetikailag módosított állatot jelöl, amely genotnjában a természetben jelenlévő állati nukleinsav-szekvenciáktól különböző, expresszálható nukleínsav-szekvenciát tartalmaz.
A „genetikai módosítás” olyan eljárás, amely során egy élő szervezet genetikai anyaga úgy lelt megváltoztatva, ahogyan az természetesen például rekombináció és/vagy rekombináció és páro&odás útján nem történik meg.
A „pajzsmirigyhormon” kifejezés a leírásban utalhat a pajzsmirigyhormon bármely alakjára, elöalakjára vagy származékára, azaz a pajzsmirigyhormon kifejezés utalhat a trijód-tironin prohormon alakjára, amelyet szokásosan tiroxinnak. vagy T4-nek neveznek, és utalhat a trijód-tironinra (T3) is. Előnyösen, a leírásban a TI1 pajzsmirigyhormonra utal, amely amennyiben pajzsmirigyhormon receptorhoz kötött és/vagy komplexet képez pajzsmirigyhormon receptorral (TR), pajzsmirigyhormon-reszponz.lv elem által szabályozott gén transzkripciójának aktivátoraként viselkedik vagy működik. Még előnyösebben a pajzsmirigyhormon 3,5,3'- trijód-tironin (T3).
A „pajzsmirigyhormon-válaszszegmens”, „pajzsmirigyhormon-res-zponzlv szegmens” vagy „TREszegmens” kifejezések jelentése a leírásban olyan nukleinsav-szegmens, ahova a pajzsmirígyhormont megkötni képes magreceptorok (azaz pajzsmirigyhormon receptorok) kötődhetnek, és ezáltal a pajzsmirigyhormon működése által érintett gének transzkripcióját szabályozzák. A pajzsmirigyhormon-válaszszegmens tartalmazhatja egy vagy több gén egy vagy több pajzsmirigyhormon-válaszelemét.
A „pajzsmirigyhormon-válaszelem”, „pajzsmirigyhormon-reszponzív elem” vagy „TRE” kifejezés olyan nukleinsav-szekvenciát jelöl, amelyhez a pajzsmirigyhormont megkötni képes magreceptorok (azaz pajzsmirigyhormon receptorok) kötődhetnek, és ezáltal a pajzsmirigyhormon működése által érintett gének transzkripcióját szabályozzák. A konszenzusos TRE félhely 4 nukleotiddal tagolt AGGTCA, amelyet a második AGGTCA félhely követ ( TRE DR-4). Kevésbé tipikusak a fordított palindrom vagy palindrom félhellyel jellemzett TRE-k (pl. F2 vagy Pál), A DR-4 egyenlő mértékben potens mind TRa, mind TRP esetén, és a ligandkötöti TR leginkább jellemző alakját, a TR-RXR (Retinoid-X-Receptor-Receptor) heterodimert köti. A leírásban alkalmazott TRE kifejezés olyan nuklemsav-szekvenciára utal, amelyhez a pajzsmirigyhormon receptor kötődhet, és ezáltal a pajzsmirigyhormon működése által érintett gének transzkripcióját pozitív módon szabályozza, azaz a TRE „pozitív” TRE. TRE-et tartalmazó célgéneti a TH-kötés a represszált és aktivált állapot közötti kapcsolóként működik, amennyiben a gén által tartalmazott TRE „pozitív TR'E. A „negatív TRE”-ek ezzel szemben a TH negatív szabályozó hatását közvetíthetik. A „pozitív” TRE és „negatív TRE” értelmezhető Lazar leírásának megfelelően (Lazar 2003).
Az „emberi dio\ gén 5’ szegélyező régiója kifejezés az emberi dió} gén genomikus szabályozó régiójára utal, ami a transzkripciós start helytől 5’ irányban helyezkedik el.
A „promóter” olyan DNS-szegmens, amely megelőzi a transzkripció kezdőpontját, ahová az R.NSpolimeráz és a transzkripciós faktorok a transzkripció iniciálása végett kötődnek; a promóter képes egy gén, pl. transzgén expresszióját az organizmusban irányítani és szabályozni.
A „minimál promóter” (vagy „natív promóter”) olyan promóter, amelynek szekvenciája gén expressziójának irányításához szükséges és elegendő elemeket tartalmaz, előnyösen a minimál promóter nem tartalmaz válaszelemeket és enhanszer elemeket, igen előnyösen nem tartalmaz szövetspecifikus szabályozó elemeket, még inkább előnyösen nem tartalmaz, vagy lényegében nem tartalmaz szabályozó elemeket. Előnyösen a minimál promótereket az adott gén 5’ régiójából származó flagmens alkotja, és proniótermagot és természetes 5'UTR-ját tartalmazza. Egy megvalósítási mód szerint az 5’UTR intront tartalmazhat.
115062-4357/KOII
Pl 40056
Az „ubikviter promoter' olyan promoter, amely egynél több sejtben és szövetben, előnyösen sejtek és szövetek széles tartományában aktív.
A tímidin kinéz (TK) minimál promoter jelentése a leírásban a TK promoter egy része, amely szükséges és elégséges a promótertől 3’ irányban klónozott kazetta transzkripciójának futtatásához.
A Herpes simplex vírus (HSV) timídin kináz (TK) minimál promótere a vírusból származó TK promoter egy része, amely szükséges és elégséges a promótertől 3’ irányban klónozott kazetta transzkripciójának futtatásához.
Az „expressziós enhanszer” vagy „expressziós enhanszer elem olyan DNS-szekvencia, amely promóterrel együtt működik és/vagy működőképesen promóterhez kapcsolt, és elősegíti vagy fokozza a promoter í 0 kontrollja alatt álló géntermék expressziós szintjét.
A „származik (valamiből)” vagy „(valamiből) származó sejt a „(valamiből) szármázó” sejt vagy tárgy eredetét jelzi. A „(valamiből) származó sejt vagy tárgy különösen meghatározott forrásból van kivéve, előállítva, vagy eredete különösen a meghatározott forrás. Azaz a „transzgenikus állatból származó sejt jelenthet bármely, az állatból preparált, előállított vagy kivett sejtet, valamint ilyen sejt tenyésztésével előállított sejteket.
Amennyiben másként nem jelezzük, az “egy” jelentése “legalább egy” vagy “egy vagy több”. A főnevek egyes számú alakja, pl. “TRE” a többes számú alakot is jelenthetik.
AZ ÁBRÁK RÖVID ISMERTETÉSE
1. ábra A rekontblnáns DNS-kimstrukciú (A) A targetáló konstrukció sematikus ábrázolása. TK promóter: tímidin kináz minimál promóter; TRE pajzsmírigybormon-reszponzív elemek, EEC: expressziós etihan- szer kazetta; lucíferáz/zeocin rezisztencia fúziós fehérjét kódoló Luc riporter-zeocin szekvenciák. (B) A pt2-BH vektorban előállított targetáló konstrukció szerkezete. A kódoló szekvencia ShBle-hez (14 kDa) fuzionált luciferázt (62 kDa) kódol, lehetővé téve a zeocin-rezisztencíán alapuló szelekciót,
2. ábra A transzgenikus állat lucíferáz aktivitása közvetlenül függ a kópiaszámtól A 4-es vonal egereinek T3-at adtunk be (l pg/ttg, ép.), majd a lucíferáz aktivitását mértük luciferáz assay-vel a barna zsírszövet- ben, négy különböző időpontban. A homozigóták kétszer nagyobb lucíferáz aktivitást mutattak, mint a heterozigóták (csoportonként két állat átlaga).
3. ábra A lucíferáz aktivitás fokozódik hitlegstressznek kitett transzgenikus állatok barna zsírszövetében A luciferáz-aktivitás a BAT-ben emelkedő tendenciát mutat 9 óra 4°C-os kitettség után, és szignifikánsan megemelkedett 24 órás hidegstressz után. **P<(i,01; egyszempontos ANOVA, Newtnan-Keuls poszt-teszt.
Az adatokat átlag .t. SEM-ként adtuk meg (n -5).
4. ábra A transzgenikus állatok hidegindukálta barna zsírszövetének luciferáz-aktívítása függ a szimpatikus beidegzéstől (A) A Juciferáz-aktivitás az intakt oldalon szignifikánsan növekedett 9h-nál a kontrolihoz képest és 9h-nál 4h-hoz. képest a 4°C -os hideghatás hatására. Az aktivitás az intakt oldalon 9h kezelés után szignifikánsan maga35 sabb, mint a denervált oldalon. CB) A 2-es típusú dejodáz T3 képzésének csökkenése a BAT-ben megelőzi a lijeiferáz-aktivitás (A) ábrán bemutatott változását. A denervált oldalon a D2-aktivitás károsodott a 4h-ás hidegstressz alatt. A D2-aktivitás rohamosan emelkedik az idővel az intakt oldalon. Mind a hideghatás időtartama, mind a derierváció szignifikánsan befolyásolja a luciieráz-aktivitási (A) és a D2-aktivítást (B). A hideghatás időtartama és a derierváció együttesen szignifikáns módon hat a luciferáz-aktivitásra (A). P<0,000l; **P<0,001;
*P<0,05, ismétléses ANOVA, Newman-Keuls poszt-teszt. Az adatokat átlag i SEM-ként adtuk meg (N -5).
115062-4357/KOH
P1400563
5. ábra A htciferáz mRNS termelése fokozódik a T3-mal kezelt transzgeníkus egerek agyalapi mirigyében
A 23-as THAlM-egérvonalban nagymértékben növekedett az agyalapi mirigyben a kiciféráz mRNS színije ϊ'3-kezelés hatására. Az expressziét TaqMan assay-vel vizsgáltuk, a luciteráz expresszié szintjének kontrolljaként a GAPDH háztartási gén expresszióját alkalmaztuk. Átlag ± SEM (n:::5) p<0,000l t-teszt.
6. ábra A transzgeníkus egérmodeli képes a T3 pajzsmirigyhormon receptor izotermára specifikus működésének kimutatására. A TR|i agomsta GC-24 (i.p. 1,53 nM/ttg) 24 óra után szignifikánsan emelte a lucíferázaktivilást a májban, ahol a TR^-izoforma dominál, míg a TRa-izoforma dominálta szívben a ludféráz-akiiviiás nem változott. Átlag t SEM ín 5) ** p<0,01, t-teszt.
7. ábra A transzgeníkus egérmodeli lehetővé teszi a TH-működés kimutatását élő állatban
1. p. luciferin beadását követően in vivo bíolumíneszcens megjelenítést végeztünk a T3 4-es THAIMegérvonal BAT-ében és belében játszott szerepének vizsgálatára. Λ kontroll (.A, [>) és ί'3-mal kezelt (B, E) egerek jellemző képe. A BAT és a vékonybél (C, F) icnyiníenzitásának diagramja. Átlag a. SEM (n~4) ** p<0,01 **p<ü,000l, t-teszt.
8. ábra A THAiC targetáló konstrukció reszponzív T3-ra a HEK293 sejtvonalban
A TALÁLMÁNY RÉSZLETES LEÍRÁSA
A pajzsntirigyhormon-hatás vizsgálatát akár in vivo is lehetővé tévő transzgeníkus állat, valamint sejtek és szövetek előállításához olyan, rekombináns DNS-elemek kombinációját tartalmazó konstrukciót hoztunk létre, ami lehetővé teszi a pajzsmirigyhormon (TH) működésének rendkívül érzékenyen mérését transzgeníkus állatban és tenyésztett sejtekben (L ábra).
A TH-hatás akár in vivo vizsgálatát Is lehetővé tévő rekombináns konstrukció a következőkkel jellemezhető: a konstrukció tartalmaz pajzsmirígyhormon-reszponzív szegmetisí. amely pajzsmirigyhormon receptorokon keresztül kiváltódó, pajzsmirigyhormon által létrehozott hatásra érzékeny; minimál promótert, melynek expressziója emlősszővetben szövet független, ubikvíter, és amely minimálisan reszponzív/nem reszponzív az alap transzkripciós komplex képződéséhez szükséges transzkripciós faktorokon kívüli transzkripciós faktorokra; kódoló régiót, amely riporter gént kódol, melynek mennyisége élő állatban in vivo, szövetmintában ex rréo és sejttenyészetben in vitro érzékenyen kimutatható; expressziós enhanszer kazettát, amely a minimál promoter által irányított transzkripciós egység aktivitását segíti; inszulátorokat, amelyek izolálják a pajzsmirígyhormonreszponzív transzgeníkus kazettát a szomszédos kromoszómarégióktól.
Egy megvalósítási mód szerint a TR, amennyiben nem kötődik hozzá TH, korepresszor molekulákkal képez komplexet, és a géntranszkrípció TRE-ftiggó represszoraként működik, miután a TRE-hez kötődik. Amennyiben jelen van TH, a ligandkötöti TR. koaktiválor fehérjékkel képez komplexet. A TRE-hez kötött TRTH-koaktiválor komplex a pajzsmirigyhormon-resz-ponziv szegmensen keresztül közvetíti a pajzsmirigyhormon transzkripciós hatásait. Előnyösen a TR-TH-koaktivátor komplex kötődése a TRE-hez fokozza a promóter működését és általa a promóter által irányított gén expresszíóját. A találmány szerinti megoldásban a promóter előnyösen minimál promóter és/vagy előnyösen ubikvíter promóter. Egy előnyös megvalósítási mód szerinti a promóter működőképesen kötött fent vagy itt ismertetett enhanszer szekvenciához.
A TH-t a TH-mílködés in vivo vagy ex vívó vagy in viiro mérése vagy vizsgálata közben adjuk hozzá. A TH-szint konstans értéken vagy adott tartományban tartásával a sejtben expresszált TR hatása vizsgálható azokban a sejtekben, ahol a konstrukció jelen van és működik. Ezen megvalósítási mód szerint a TH-transzport, TH115062-4357/KOH
Pl 400563 métából izmus és TH-közvetített események eredményeként megjelenő TH-müködés mutatható ki.
Amikor a TH-szint ín vivo vagy ex vivo vagy in vitro változása nem eredményezi a kontroliban mért alap expresszíós szint változását, az arra utal, hogy a riportert expresszáló sejt nem expresszál TR-t. Ezen megvalósítási mód szerint meghatározható egy sejtben a TR-expresszíó megléte vagy hiánya. Amennyiben a sejtben nem expresszálódik TR és/vagy nincs jelen TH, nem képződik TR-T H-koaktivátor komplex, így a riporter alap expresszíós szintje mutatható ki.
A TR-expresszió lehet endogén TR-expresszió.
Egy további, hasonló megvalósítási mód szerint a vizsgálati eljárás alkalmas tenyésztett sejtvonal, pl. TR-t, pi. TR magas szintjét termelő emlős sejtvonalban TR-expresszíó monitorozására preparativ vagy terápiás célra. Ezen megvalósítási mód szerint a sejtekben expresszíós konstrució biztosítja a TR expresszióját. Elméletileg a TR expresszióját lehetővé tevő bármely eszköz alkalmazható a tanulmány szerinti megoldásban.
Amennyiben a TR-expresszió szintje ismert, a mérési eredmény közvetlenül a TH-mőködésére vonatkoztatható. A TR-TH komplex szintje mindenképpen meghatározza a riporter expressziójának szintjét.
Ezen elrendezésekben lényeges, hogy a TR expressziója független a riporter expressziójától.
A TH-müködés in vivo képi megjelenítése megvalósítható in vívó képalkotó rendszer alkalmazásával, amely ismételt méréseket, időbeli vizsgálatokat vagy különböző TH-analógok vagy ugyanazon származék különböző dózisai hatásának -meghatározását teszi lehetővé különböző szövetekben, például barna zsírszövetben, bélben, bőrben és nyálmirigyben. Alkalmazható <·»· vivo szerveken vagy szövetszeleten is.
Az alábbiakban bemutatjuk a konstrukció elemeit és funkcióikat.
Pajzsmírigyhormon^vátósselem (TRE)
A pajzsmirígyhprmonra adott magas szintű válaszkészség biztosítása végett egy vagy több pajzsmírigyhormon válaszelemet (TRE) alkalmazunk, amelylek) elegendő mértékben érzékenyek ahhoz, hogy TR-t és TH-t tartalmazó komplex kötődése esetén a riporter expressziójának megfelelő szintű pajzstnirigyhormon-dependens szabályozását biztosítsa (biztosítsák). Egy adott megvalósítási mód szerint a TRE-et írípiikátumként alkalmazzuk.
A konszenzusos TRE félhely 4 nukleotíddaí tagolt AGGTCA, amelyet második AGGTCA fölhely követ (TRE DR-4) (Velasco et al. 2007). A kevésbé tipikus TRE-ket fordított palindrotn vagy palíndrom fölhelyek jellemzik (e.g. F2 vagy Pal). A DR-4 egyformán potens mind TRa, mind TRfi esetén, és köti a leginkább típusos ligandkötött TR-t, a TR-RXR (Retinoid-X-Receptor-Receptor) heterodimert. Ezzel szemben az F2 típusó TRE főként TRp homodimerekkel működik, és a Pál csak nagyon gyengén kötődik a TR/RXR-hez (Velasco el al. 2007).. Azaz a DR-4 előnyös választás riporter gén potens és TR-dependens, de nem TR izoforma szelektív, pajzsmírigyhormon-válasz alá helyezésére. Elméletileg bármilyen TRE alkalmazható a találmány szerinti megoldásban, de bizonyos TRE-eket különösen alkalmazunk,
A konstrukción belül egy vagy több TRE-et és adott esetben a konstrukció egy részéből szegélyező, szeparátor vagy kötő szekvenciákat a leírásban pajzsmirigyhomton-válaszszegmensaek nevezünk. A szegmens funkciója az, hogy a riporter expresszióját TR-t és TH-t tartalmazó komplex kötődésére érzékennyé tegye, és, amennyiben szükséges vagy kívánatos, egyéb koreguiátor fehérjékre is, amelyek lehetnek a komplex részei vagy kötődhetnek a komplexhez. Az ilyen TRE TH hatására pozitív szabályozást biztosit. A negatívan szabályozott TRE adott esetben vagy előnyösen nem képezi a találmány szerinti megoldás részét, TIT kötődésének hiányában a TR és, amennyiben szükséges vagy kívánatos, egyéb koreguiátor fehérjék represszorként műkődnek a TRE-en. Adott esetben amennyiben a TR és/vagy TRE bármely más módon működik, nem képezi a ta115062-4.357/KOH
Pl 400563 lálmány szerinti megoldás részét.
Promóterek
A konstrukcióban lévő promóter működőképesen a psjzsmirigyhormon-válaszszegmenshez, különösen az egy vagy több TRE-hez kapcsolt. A promóter irányítja a riporter transzkripcióját és/vagy expresszióját, és 5 ezáltal funkcionális kapcsolatot biztosít a TRE és a riporter között. Ily módon a promóter aktivitását a pajzsmirigyhormon aktivált alakja, a T3 csak azokban a sejtekben szabályozza, amelyek endogén módon vagy tranziens módon/stabilan fokozottan expresszálják a TR-t. A TH-működés hiánya vagy amennyiben nem mérhető THmüködés a sejtben, a sejtben a TR hiányára ittál vagy utalhat.
A promótemek megfelelően erősnek kell lennie ahhoz, hogy a riporteren keresztül szignált biztosítson. 10 Ezért a promóter (előnyösen) enhanszerhez kötött, amely jellemzően a promótertől 3’ irányban helyezkedik el.
A promóter előnyösen számos emlősszövetben vagy valamennyi emlősszövetben képes vezérelni az expressziót, azaz ubíkviter promóter. A promóter például olyan promóter, amely minden olyan emiösszövetben működőképes, ahol expresszáiódik. A megfelelő promóter kiválasztása a leírásban szereplő kitanitás és ismeretei alapján a szakember köteles tudásához tartozik. Hasznos útmutatást nyújt a következő szakkönyv: “A IS promoter-level mammalian expression atlas The FANTOM Consortium and the R1KEN PMl and CLST (DGT) (FANTOM Consorfiyin. 20.(4)Előnyös promóter a timidin kináz (TK) minimál promóter, pl. a Herpes simplex virus timidin kínáz minimál promótere, amely' képes bármely emlős sejttípusban ubíkviter módot) megindítani a transzkripciót.
Entiamzerek
Az enhanszerek képesen az in cis elhelyezkedő célgének expresszióját aktiválni. A konstrukcióban egy enhanszer része a konstrukciónak, és funkcionálisan szigorúan a promóterhez kötött. Az expressziós enhanszerek jellemzően a transzkripciót fokozó és az mRN'S-metabolizmus legtöbb lépését elősegítő intron szekvenciákat tartalmaznak (Le Hir, et al. .2003). A rekombináns kazetta létrehozására alkalmas enhanszerek képesek optimalizálni a heíeroíóg mRNS-i, ezáltal megvédeni attól, hogy a gazdasejt eliminálja. Például a 25 3xTRE-TK promóter egységtől 3’ irányban az NTC8681 vektor (Nature Technology Corporations) nem transzlálódó (exon l)-HTLV-l R-színtetikus nyúl β-globin-alapú 3’ intron-intron egységét tartalmazó expressziós enhanszer kazetta van. Ahhoz, hogy teszteljük más enhanszer alkalmasságát a TRE-TK vezérelte luciferáz in vivo expressziójának elősegítésére, új transzgenikus vonalakat kell előállítani a tesztelendő enhanszert tartalmazó, új targetáló kazettával. Előzetes adatokat nyerhetünk az új targetáló konstrukció tranzi30 ens transzlekciójával sejttenyészetben, ám csak új transzgenikus állat-vonalakon mutatható meg, hogyan fog működni a kromoszóma adott, régiójába beágyazott enhanszer.
Riporterek
Az alkalmazót·: luciferáz riporteren kívül fluoreszcens fehérjék is alkalmazhatók mind ur vívó, mind in vivo. Elő állatban mind a luciferazt, mind a fluoreszcens riportereket ki lehet mutatni. A biolumineszcencia 35 kimutatását érzékenyebbnek tekintik, mint a fluoreszcenciáét. Fluoreszcencia kimutatásához. az állatot specifikus hullámhosszú fénynek kell kitenni, és a riporternek felületes szövetekben kell elhelyezkednie. A mélyebben beágyazott szövetekben tomográfiával kimutathatók specifikus, injektált fluorokrómok, amennyiben emissziójuk a távoli infravörös tartományba esik, mivel ezen fénytípus abszorpciója kevésbé hatékony a szövetekben. A távoli infravörös tartományban gerjeszteti és emiitáíó, új fluoreszcens fehérjék felfedezése és fejlesztése nagy40 ban emelné a fluoreszcens riporter fehérjék kimutathatóságát a mélyen fekvő szövetekben.
115062-43 S7/K.OH
Pl 400563
A színes termékek képződésén alapuló fehérje riporterek, amelyek fénymikroszkóppal kimutathatók (pl. béta-Gal) nem alkalmazhatók élő állatban in vivo kimutatásra.
Rezisztenciafnarkerek
Egy másik megvalósítási mód szerinti a rekombináns DNS-konstrukció rezisztencíamarkert, előnyösen pozitív rezisztencíamarkert kódoló szekvenciát is tartalmaz, így biztosítja a sejtek vagy állatok sikeres transzformációját a konstrukcióval.
Egy előnyös megvalósítási mód szerint a riportert és a rezisztencíamarkert kódoló szekvenciák működőképesen kapcsoltak, pl. keretben egymáshoz fuzionáltak. Előnyősén a rekombináns DNS-konstrukció a kódoló 10 szekvenciáktól 3’ irányban poliadenilációs szegmenst is tartalmaz. Ezen megvalósítási mód előnye, hogy a riporter expressziója a rezisztenciamarker expressziójához kapcsolt, ami további biztosítékot jelent a rekombináns konstrukciót tartalmazó sejtek szelekciójára és/vagy fenntartására olyan anyag jelenlétében, amellyek szemben a rezisztenciamarker rezisztenciát biztosit.
Bizonyos megvalósítási módok szerint a rezisztenciamarker antibiotikum rezisztenciamarker, pl. széles 15 spektrumú antibiotikum, amely a legtöbb baktérium, fonalas gomba, élesztő, növény és állati sejt ellen hatékony, vagy szűk spektrumú antibiotikum, amely azon sejttípus ellen hatékony, amelyben a riporter expresszálódík.
Egy megvalósítási mód szerint az antibiotikum glikopeptid típusú antibiotikum. Egy különösen előnyös megvalósítási mód szerint a glikopeptid típusú antibiotikum az antibiotikumok bíeomicin családjába tartozik, 20 igen előnyösen zeocin rezisztencia, különösen ShBle zeocin rezisztencia antibiotikum.
Egy előnyös megvalósítási tnód szerint az antibiotikumot antibiotikum-rezisztencia kazetta kódolja, amely igen előnyösen zeocin-rezisztencia kazetta, különösen ShBle zeocin-rezisztencia kazetta.
ínszuláior szekvenciák
A fent ismertetett konstrukciót inszulátor szekvenciák szegélyezik.
““ínszulátomak” nevezzük a DNS-szekvenciaeíemek azon osztályát, amelybe tartozó elemek közös tulajdonsága, hogy képesek megvédeni a géneket az őket körülvevő környezetből származó, nem megfelelő szignáloktól. Az inszulátorok hathatnak disztális enhanszer promóterre ható működésének blokkolásával, amennyiben az inszulátor elválasztja a promótert a disztális enhanszertöl. Más módon, az inszulátorok a közelben lévő, különben az expresszió csendesítését okozható, kondenzált kromatin hatását “gátként” működve védhetik a géneket. Egyes inszulátorok képesek enhanszer blokkolóként és gátként is működni (West, et al. 2002).
A találmány szerinti megoldásban az inszulátorok mindkét szerepe előnyős, különösen a barrier funkció.
Disztális enhanszer blokkolása, amely befolyásolná a riporter expresszíóját a találmány szerinti megoldásban, szintén előnyös lehet. A kazetta előnyösen ubikviter expressziét tesz lehetővé emlőssejtekben, sejttípustól függetlenül.
Az impriniált gének vagy az anyai vagy az apai alléiról expresszálódnak. Ennek biztosítása érdekében az imprínlált génkészletekéi inszulátor szekvenciák szegélyezik, amelyek elősegítik izolálásukat a szegélyező régiók transzkripciós aktivitásától. A jelenség példája az Igí2/Hí9 lókusz, amelyről ismert, hogy inszulátorkent működik (Edwards and Ferguson-Smith 2007).
Az így előállított rekombináns DNS-konstrukció a konstrukciót a sejtbejuttató megfelelő eszköz alkal40 mazásával alkalmas transzgenikus állatok létrehozásában való alkalmazásra. A konstrukció komplex szerkezete
115062-4357/KOH
Pl400563 és a konstrukció elemet közötti interakció a genomba történő sikeres integráció! eredményez és biztosítja, hogy a konstrukció működőképes marad, amikor integrálódott.
Bár lehetséges, hogy korábban már beszámoltak TR.E-t tartalmazó rekombináns konstrukció tranziens expressziójáról sejtvonalban, riporter TH-reszponziv expresszióját és ezáltal TH-müködés vizsgálatát ténylege5 sen biztosító konstrukció stabil integrációja a gettómba, összetettebb megközelítést kíván meg, ha működőképes megoldást kívánunk elérni.
Transzgén integrációjának és expressziója szabályozásának komplexitása felnőtt transzgenikus állatban szemléltethető a találmány megalkotóinak több sikertelen, pajzsmirigyhormon-működés indikátoraként szolgáló transzgenikus állat előállítására irányuló próbálkozásával. Különböző transzgenikus egérvonalak sikeres 10 genoniikus integrációja ellenére a kazetta vagy csendes maradt minden szövetben, vagy szövetre korlátozott expressziót mutatott (pl. az izomban vagy az agy talamíkus régiójában), pajzsmirigyhormonra adott válasz nélkül. Az 1. táblázat korábbi konstrukciókat mutat be.
I. táblázat Működésképtelen konstrukciók példái
i TRE i promóter 1 riporter l inszulátor
1 3.x I RT ί TK i <!EYFP(destabilizált EYFP)
| 3xTRE 1 R.osa26 dEYFP 1
1 · 1 3xTRE i TK Luc (Promega pGI..3-basic vektorból ) 1 Hl 9
j 3xÍRÉ í TK | Luc (Promega pGL3-basic vektorból) 1 csirke lizozím mszulátorok
A találmány szerinti megoldást példaként szolgáló megvalósítási módok útján tovább ismertetjük
A pajzsmirigyhormon működését in vivo lehetővé tévő transzgenikus állat létrehozásához először rekombináns DNS-elemek egyedi kombinációját hoztunk létre, ami a TH-müködés transzgenikus állatban és tenyésztett sejtekben történő vizsgálatának rendkívül érzékeny eszköze (l. ábra).
A pajzsmirigyhormonra adott magas szintű válaszkészség biztosítása végett az emberi diói gén 5' szegé20 lyezö régiójának l)R4 pajzsmírigyhormon-reszponzív elemét (TRE) -amelyről feltételezik, hogy a pajzsmirigyhormon közvetítette indukcióra leginkább érzékeny válaszelem - triplikátuniként elhelyeztük a Herpes simplex vírus titnidin kináz. (TK) minimál promóterétöl amely képes ubikviter transzkripcióra bármely emlőssejtben 5’ irányban. A 3xTRE-TK promóter egységtől 3* irányban az NTC8681 vektor (Nature Technology Corporations) nem transzíáít leader (exon l)-HTLV-l R-szintetikus nyúl β-globín-alapó 3’ intron-intron egységét tar25 talmazó komplex expressziós enhanszer kazettát inszertáltunk. A kazettától 3’ irányban az emlőssejtekben optimális teljesítményt lehetővé tévő, kodonoptimalízált és metílációrezisztens dCpG lucíferázt kódoló régiót inszertáltunk, amely zeoeinnal szemben rezisztenciát biztosító ShBle-hez volt fuzionálva (a pMOD Luc-ShS v02 plazmidból (Invivogen) származott), amelyet EFl pAn poliadeniíációs kazetta követ. A kazettát pWHERE vektorban (Invivogen) szereltük össze, és a vektor H19 ínszulátorai szegélyezték. A targetáló kazettát Hindlli30 (bhmt)-Noíl fragmensként a pt2-BH expressziós vektor 1TR transzpozázfelismerő szekvenciái közé szubklónoztak (1. ábra).
.A kazetta ubikviter expressziót tesz lehetővé emlőssejtekben, sejttípustól függetlenül. A promóter aktivitását a pajzsmirigyhonnon aktivált alakja, a T3 csak azokban a sejtekben szabályozza, amelyek endogén módon expresszálnak TR-t.
A Sleeping Beauty rendszerrel transzporon alapú bejuttatást alkalmaztunk, hogy a rekombináns DNS115062-4357/KOH
Pl 400563 konstrukcióval transzgenikus egeret állítsunk elő (Ivies, et al. 2014). A Sleeping Beauty rendszer különösen alkalmas stabil transzgenikus állatvonalak létrehozására, mivel csak tranziens módon van jelen a rekombináns kazetta integrálódásakor. Ez biztosítja, hogy a kazetta pozíciója később ne változzon, és a transzgenikus állatvonalak stabilak maradjanak a tenyésztés során. Más piazmid rendszerek és virális vektorok is alkalmazhatók a rekombináns DNS-konstrukció bejuttatására, különösen, amennyiben nem szükséges a stabil integráció. A transzgenikus “founder” állatok előállításához a targetáló kazettát (1 ng/μί) tartalmazó plazmidot és a Sleeping Beuty transzpozont kódoló, ifi vitro átírt mRNS-t (5 ng/ul) tartalmazó keverék pikoiiteres mennyiségét injektáltuk megtermékenyített oocitákba.
A ''founder” állatokat TaqMan assay-vel, luciferáz próbával azonosítottuk, és vad típusú FVB/N egerekkel kereszteztük, majd az FI generációt beltenyésztettük. Az F2 generációt használtuk a luciferáz assay-hez. A valamennyi vonalban elvégzett, TaqMan assay-vel támogatott transzgéndózis-meghatározás megmutatta, hogy a transzgenikus kazetta egyetlen kópiában épük be. Az egérmodell már a negyedik generációban stabil.
Λ 4-es, 18-as és 23-as vonalak karakterizálása pajzsmirigyhormon (5pg T4 fnap/egér 3 napig) indukálta luciferáz-expresszió indukálást azonosított a homozigóta hímek különböző szöveteiben. .A 4-es vonal különböző agyi régiókban és különböző perifériás szövetekben (vázizomzat, csont, bél, máj és szív) mutatott indukciót, köztük a zsírszövetben látható feltűnő választ. A 23-as vonal az agyalapi mirigyben és a hipotalamuszban mutatott intenzív választ, míg a 18-as vonal magas alapszintű, expressziót mutatott és intenzív választ az agyalapi mirigyben.
Ennek megfelelően a 4-es vonal megfelelő általános alkalmazásra és különösen erős expressziói mutat a BAT-ben. A 23-as vonal igen alkalmas a TH-válasz tanulmányozására a hipotalamuszban és az agyalapi mirigyben. A 18-as vonal használható agyi vizsgálatokra, amikor magasabb alapaktivitás kívánatos.
A rekombináns DNS-konstrukció alkalmazhatóságának további vizsgálatára a konstrukciót a humán HEK293 sejtvonalba is bevittiik, így stabilan transzfekíált ?« vitro rendszert hoztunk létre a TH-míiködés tanulmányozására.
A létrehozott transzgenikus egérmodell alkalmas a pajzsmirigyhormon működésének in vivo szövet- és sejtspeeifikus, szemlkvantitativ vizsgálatára a feláldozott állatok szöveteiben vagy élő állatban, a luciferáz riporter pajzsmirigyhormontól függő expressziója alapján, ahol a riporter transzkripciója teljes mértékben az endogén módon expresszált, intakt, vad típusú TR-ek és a TH-möködés koregulátoros rendszerének függvénye. A pajzsin irigyhormon-működés a feláldozott állatok szöveteiben a transziáit luciferáz-Shöle fúziós fehérje luciferáz assay-vel vagy citokémiai vizsgálatával mérhető. A riporter mRNS transzkripciója kvantitatív PCR-ral vagy in sitii hibridizációval vizsgálható.
A létrehozott transzgenikus állatmodell az első állatmodell, amely lehetővé teszi az in vivo TH-möködés vizsgálatát,
A TH-möködés in vivo megjelenítése élő állatban elvégezhető in vivo képalkotó rendszer alkalmazásával, amely ismételt méréseket, időbeli vizsgálatokat vagy különböző TH-analógok vagy ugyanazon származék különböző dózisai hatásának meghatározását teszi lehetővé különböző szövetekben, például barna zsírszövetben, bélben, bőrben és nyálmirigyben. Alkalmazható szerveken vagy szövetszeleten ex vivő is.
A transzgenikus állatmodell ideális forrást biztosit különböző szövetekből származó, T3-reszponziv, luciferázt expresszáló primer tenyészetek és sejtvonalak előállítására. Zeocín alkalmazásával biztosíthatjuk, hogy a. TH-reszponzív, luciferáz kazetta a tenyésztés és új tenyésztőedénybe történő áttétel során megmaradjon.
1i 5062-4357/KOII
Pl400563
A transzgenikus állatmodell alkalmazható a gyógyszeriparban TR agonisták vagy antagonisták, koregufátorok vagy pajzsmirigyhormon transzporterek modulátorainak in vivo vizsgálatára, a TH-működés előnyős hatásait (pl. súlycsökkenés, koleszterinszint csökkenése) a TH kockázatos mellékhatásai (pl. lipogenezis és tachikardia) nélkül kihasználva. A modell lehetővé teszi a TR-ok altípusra vagy szövetre szelek5 tív agonistáinak vagy antagonistáinak gyors és hatékony tesztelését.
A transzgenikus állatmodell hathatós eszközt biztosit a TH-míiködés megértéséhez a BAT-ben, Az energiaelosztás fő helyeként ez a szövet az elhízáskutaiás intenzíven vizsgált célpontja, Azaz a transzgenikus állatmodell az elhízás kutatásának értékes eszköze lehet.
A transzgenikus állatvonalak keresztezhetek pajzsmirigyhormon receptorok vagy TH-metabolizáló 10 dejodáz enzimek, TH-iranszporterek vagy bármely, a TH-háztartással kapcsolatban lévő egyéb gén különböző, deléeiótt, mutációit vagy Cre-rekombmázzal targetelhető floxolt verzióit tartalmazó transzgenikus egérrel. A keresztezésből származó transzgenikus vonalak lehetővé teszik a módosított génműködés TH-mfiködésre gyakorolt hatásának vizsgálatát. A TR-speciftkus mutánsokkal történő keresztezés még tovább segítheti a transzgenikus egerek alkalmazását receptor szttbtípusra specifikus agonisták és antagonisták tesztelésében.
A transzgenikus állatmodell igen előnyős lehet a felfedező jellegű kutatásokban, a pajzsmirigyhormon sejttípus-specifikus működésének megértésében, a sejtproliferáció, energia hotneosztázis és bármely egyéb, megváltozott pajzsmirigybormon-háztartással öszefüggö tünet/állapot (pl. alacsony T3 szindróma, pajzsmirigyhormon kombinációs terápia tesztelése) szabályozó mechanizmusainak felderítésében,
A ITIAIC DNS-konstrukció alkalmas Ί’Η-működés vizsgálatára a targetáló kazettát stabilan expresszáló sejteket tartalmazó transzgenikus állatok és sejtvonalak létrehozására. Sejtek izolálhatók a transzgenikus állatból is, és a TH-tnűködés modulátorai in vitro, tenyészetben is tanulmányozhatók.
A találmány szerinti megoldást a következő példák útján tovább ismertetjük.
PÉLDÁK
l. példa
Exogén 73 itatása a luciferáz működésére- in viva
A 4-es vonal hím állatainak i. p. adott I pg/ttg T3 a luciferáz aktivitásának folyamatos növekedését eredményezte, amit a barna zsírszövetben 4 időpontban 8 óráig végzett luciferáz assay-vel történt mérés igazolt. Az aktivitás egyértelműen függött a transzgén kópiaszámától, mivel a homozigóták mintegy kétszer nagyobb aktivitást mutattak, mint a heterozigóták (2. ábra).
2, példa
Hideg indukálta 7'3-képződés a barna zsírszövetben
A hidegindukció a barna zsírszövetben a T3 képződésének bevett módszere (Silva and Larsen 1983). A korábban beállított és leírt protokollt alkalmazva váltottunk ki hidegstresszt egerekben (Curcio-Morelli, et al. 2003) hogy tanulmányozzuk, hogy a lokális T3-hozzáferhetŐség fiziológiás emelkedése eredményezheti-e a 35 barna zsírszövetben pajmtrigyhormon-reszponziv 4-es vonalban a luciferáz expressziójának emelkedését (2. táblázat).
i 15062-4357/KOH
P140056'
2. táblázat A pajzsmirigy hormon-hatása a lueiferáz aktivitására a transzgeníkus egerek különböző szöveteiben
2A táblázat
4-es vonal
Szövet alapszint (RLU/mg fehérje) indukált
Agyai, mir.
MBH
0,206 i HC
0.060
HT
0.242
CTX (RLU/mg fehérje)
..................ÖJi7
0,368
0,116
0,400
0,359 növekedés | (átlag ± SEM ) i
1,8 ±0,20
1,7 ± 0,43 i ,9 ± 0,30
0,158 *0,013
0,0001
0,624 *0,035
CER
0,938
2,162
2,3-.1.0,41 *0,019
máj 0,003 0,006 2,0 ±- 0,54 0,161 |
szív 1 0,021 0,168 1,8 ±0,30 0,171 |
BAT 0,028 1,820 64,6 ± 8,1 %Ö002 Π
csont ! 0,0.31 0,066 2,2 ±0,18 ”o,oöi5 1
izom 1 0,010 0,073 7,4 ± 4,25 0,184
MSG 0,052 0,399 7,6 ± 2,60 *0.044 í
1,5 ± 0,07 ♦0,002
pajzsmirigy 0,115 0,176
here 4876 4086
bél 4,571 9,480
0,8±0,06
0,108
2A táblázat (folytatás)
Szövet
23-as vonal
Agyai, mír.
MBH
HC
HT
CTX
CER máj
SZÍV
BAT csont izom alapszint (RLU/mg fehérje) ''ϊ'932 (RLU/mg fehérje) ___
0,059
0,035
0,012
0,008
0,005
0,010
0,004
0,003 indukált növekedés (átlag ± SEM)
0,584
0,040
0,065
0,023
0,004
0,003
0,038
8.8 ± 0.62
0,756
0,338
0,103
1,9 ± 0,28 ♦0,045
0,793
1,0 ±0,47 ♦0,007
0,9 ± 0,56
0,7 ±0,18 ♦0,0001
115062-4357/KO11
Pl 400563
2A táblázat (folytatás)
| szövet 18-as vonal
alapszint (RLU/ing fehérje) indukált (RLU/mg fehérje) 1 növekedés 1 (átlag ± SEM) i P
i Agyai, mir. 0,066 0,540 | 8,2 ± 0,36 i »0,0001
j MBH 0,372 0,602 | 2,2 á: 0,25 í *0.005
j HC 2,304 3,756 i 2,1 t- 0,25 ΐ *0,013
1 HT 0,755 1,589 | 2.8-0.35 | *0,004
i C TX 1,617 | 2,586 i 1,9-«.1,18 i *0,005
CER 0,045 i 0,063 j 1,8 ± 0,31 | 0,073
máj szív
BAT csont pajzs mingy here nincs expresszió tzom
MSG bél
Λ íuciferáz aktivitás alapszintje pajzsmirigyhomtonnal indukált szintje és növekedése (indukálfc'aíap) a feláldozott állatok szöveteiben (átlag t- SEM, n~4). A t-teszt (alap vs indukált) p-értékeit adtuk meg: a *-gal jelölt értékek statisztikailag szignifikánsak. (A) T4-kezelés (5pg/egér/nap 3 napig; i.p.) a 4-es, 18-as és 23-as egérvonalban. Az alapszintű aktivitás a 18-as vonalban magasabb, mint a másik két vonalban. MSG: állkapocs alatti nyáímtrtgy (B) T3-kezelés (1 pg/egér/nap 3 napig; í.p.) a 4-es vonalban, a perifériás szervekre kifejtett hatás. A T3 hatása a íuciferáz expressziójára kifejezettebb, mint a T4-é (átlag ± SEM, n-4),) Valamennyi kísérletet homozigóta hímeken végeztük.
A hidegindukció a vizsgált időszakban folyamatosan, 24 órán keresztül emelte a Íuciferáz aktivitását, ezzel bizonyítva, hogy a beépült transzgenikus kazetta reszponzív a helyt T3 koncentrációjának fiziológiás változásaira (3. ábra), A hatás a barna zsírszövet egyoldali szimpatikus denerválásával javítható, az adtenerg stimuláld» hiányában bekövetkező, 2-es típusú dejodáz működésének csökkent aktiválása okozta T3 koncentrációnövekedés csökkenése által (4. ábra). A BAT szimpatikus idegeinek egyoldali denerválását (Vaughan, et al.
2014) szerint végeztük. A 2-es típusú dejodáz aktivitását az American Thyroid Association a pajzsmirígyhormon-háztartás és -működés rágcsáló- és sejtmodellekhen történő vizsgálatára vonatkozó útmutatója szerint
115062-4357/K.OH
Pl400561 mértük (Bianco, et al. 2014). 4-es vonalú THAÍM egereket a BAT-et beidegző szimpatikus idegek egyoldali denervációjának vetettük alá. A luctferáz aktivitás mérése beállított, szövetre módosított protokollunk szerint történt (Zeold, et al. 2006). A luctferáz aktivitás 4 ’’C-os hideghatás hatására szignifikánsan növekedem az intakt oldalon a kontroll állatokhoz képest 9h-íiál és 9h-nél 4h-hoz képest. Az aktivitás az intakt oldalon szignifikán5 san magasabb 9 órás kezelés után, mint a denervált oldalon. A 2-es típusú deiodáz. T3 képzésének károsodása a.
BAT-ben megelőzi a lucíferáz-aktivitás (A) ábrán bemutatott változását. A denervált oldalon a D2-aktívítás károsodott a 4h-ás Irídegstressz alatt, míg a D2-aktívitás rohamosan nö az idővel az intakt oldalon.
Az eredmény arra utal, hogy a modell alkalmas a BAT-ben az adrenerg stimulus indukálta Tll-működés vizsgálatára.
3. példa
A luciferáz rnRNS, a TH-működésre vonatkozó adat kimutatása
Vizsgáltuk, bogy a luciferáz rnRNS-ének kimutatása alkalmas-e a létrehozott transzgenikus modellben a TH-müködésre vonatkozó adatként történő detektálásra. I pg/ttg T3 í.p. injektálása a 23-as vonalba a luciferáz mRNS-ének mintegy 50-szeres indukcióját eredményezte az agyalapi mirigyben, TaqMan próbával. A TaqMan 15 qPCR-t a gyártó utasításainak megfelelően VtíA 7 Real-Time PCR rendszeren (Life Technologies) végeztük. Röviden, reverz transzkripciót végeztünk High Capacity cDNA Reverse Transcriptase készlettel (Applied Biosystems, Life Technologies), és a eDNS koncentrációját Qubit 2.0 fluorométerrel, Qubit ssDNA Assay készlettel (Life Technologies) határoztuk meg. Egyedi luciferázt kódoló próbát alkalmaztunk kereskedelmi forgalomban kapható, gliceraldehid-3-foszfát-dehídrogenáz (GAPDH) próbával; a GAPDH-t később háztartási gén20 ként alkalmaztuk.
Kimutattuk, hogy a qPCR alkalmas a TH-müködés vizsgálatára a modellünkben, és a T3-működés által kiváltott transzkripciós változások közvetlen detekcióját biztosítja anélkül, hogy ki kellene várni a riporter gén transzlációját (5. ábra).
4. példa
77? izoformára specifikus agonisták tesztelése
A 4-es vonalban az ivóvízbe adagolt metitnazollal és perkloráttai (0,1% metimazol, 0,5 % perklorát) csökkentettük az endogén pajzsmirigyhormon szintjét, majd TRp-specifikus agonistát, 1,53 nM.'ttg GC-24-et adtunk be i.p. injekcióban (Borttgraeber, et al. 2003). A luciferázaktivitás mérése beállított, szövetre módosított protokollunk szerint történt (Zeold et al. 2006) amely magában foglalta az egérszövet folyékony nitrogénnel 30 történő kezeléséi majd szonikálását. Az ín vivo luciferáz megjelenítés IMS Lumina 11 in vivo képalkotó rendszerrel (PerkinElmer Waltham, MA, USA) segítségével történt, a gyártó útmutatója szerint. A májban, ahol a domináns izoforma a TRp, a luciferáz aktivitása a kezelés után 24 órával mintegy háromszorosra növekedett, míg a szívben, ahol a TRa-expresszió van túlsúlyban, nem mutattunk ki szignifikáns változást a luciferáz aktivitásában, míg a T3 beadása mindkét szövetben a luciferáz aktivitásának szignifikáns növekedését indukálta (6.
ábra). Az eredmény megmutatja, hogy a modell igen érzékeny in vivo környezetet biztosit, amely lehetővé teszi a TR izoformára vagy szövetre specifikus vegyületek tesztelését, ami elősegítheti a pajzsmirigyhormon-kezelés előnyös hatásait előidéző vegyületek előállítására és forgalmazására irányuló ipari törekvéseket.
5. példa /í hiciferáz in vivo kimutatása
Vizsgáltuk azt is, hogy a TH-mfiködés változásai kímutathatók-e élő állatban is a luciferáz in vivo detek
115062-4357/KOH
P1400563 tálasával, ami lehetővé tenné az ismételt vagy időbeli méréseket. A 4-es vonalba 1 gg/ttg T3-at injektáltunk i.p., majd 24 órával később hiciferint, ami a lucíferáz szubsztráija. 15 perccel később az állatokat ketamtnnal elaltattuk, majd az /I'IS Lutnina U in vivo képalkotó rendszer (PerkmElmer Waltham, MA, USA) segítségével detektáltunk, A 13 a BAT-ben és a bélben a riporter aktivitásának igen intenzív fokozódását indukálta. A riporter 5 aktivitása fokozódott az állkapocs alatti nyál mirigyben (MSG) és a farok és a talppámák bőrében is (7, ábra), bizonyítva, hogy a modell alkalmas a TH-működés kimutatására élő állatban.
6. példa .4 rekombináns DNS-konstrukcióval transzfektáh sejtvonalak
A humán HEK293 sejteket transzfektáltuk a THAIC-konstrukcióval, pCMV(CAT)T7-SB 100 Sleeping
Beauty íranszpozon expresszíós vektorr al és egér TR«-t kódoló plazmiddai. A HIiK293-sejtek tenyésztését és a transzfekciót beállított protokolhmk szerint végeztük (Egri and Gereben 2014).
A lucíferáz promóter assay-vel mérve 100 nM T3 a lucíferáz expresszió mintegy négyszeres indukcióját váltotta ki (8. ábra). Szelekciót végeztünk zeocinnal, és a lucíferázt stabilan expresszáló tenyészeteket állítottunk elő. A THAlC-konsinikció alkalmas tenyésztett sejtekben, például humán eredetű sejtekben a TH-műkődés 15 monitorozására alkalmas sejtvonalak előállításra is.
HIVATKOZÁSOK JEGYZÉKE
Bates HM 1982 Pr evalence of hyperl ipidemia in a large sample population. J Cardiovasc Pharmacol 4 Suppl 2 SI 96-200.
Bianco AC, Anderson G„ Forrest D, Gallon VA, Gereben B, Kim BW, Kopp PA, Liao XH, Obregon MJ, Peeters RP, et al. 2014 American thyroid association guide to investigating thyroid hormone economy and action in rodent and cell models. Thyroid 24 88-168.
Bomgraeber S, Budny MJ, Chiellini G, Cunha-Lima ST, Togashi M, Webb P, Baxter JI), Scanlan TS & Fletterick RJ 2003 Ligand selectivity by seeking hydrophobicity in thyroid hormone receptor. Proc Nall Acad Set 25 U S .A 100 15358-15363.
FANTOM Consortium and the R1KEN PM1 and CLST (DGT) (2014) A promoter-level mammalian expression atlas. Nature 507, 462-470
Curcio-Morelli C, Zavacki AM, Christofollete M< Gereben B, de Freitas BC, Harney JW, Li Z, Wu G & Bianco AC 2003 Deubiquitination of type 2 iodothyronine deiodinase by von HippeLLindau protein-interacting 30 deubiquit mating enzymes regulates thyroid hormone activation. J Clin Invest 112 189-196.
Edwards CA & Ferguson-Smith AC 2007 Mechanisms regulating imprinted genes in clusters. Curr Opin Cell Biol 19 281-289.
Egri P & Gereben B 2014 Minimal requirements for ubiquitination-niediated regulation of thyroid hormone activation. J Mol Endocrinol 53 217-226,
Fekete C & Lechan RM 2014 Central regulation of hypothalamic-pituitary-thyroid axis under physiological and pathophysiological conditions. Endocr Rev 35 159-194.
Gereben B, Zavacki AM, Ribich S, Kim BW, Huang SA, Simonides WS, Zeold A & Bianco AC 2008 Cellular and molecular basis of deiodinase-regulated thyroid hormone signaling. Endocr Rev 29 898-938.
Hedley A A, Ogden CL, Johnson Cl,, Carroll Ml), Curtin LR & Flegal KM 2004 Prevalence of overweight 40 and obesity among US children, adolescents, and adults, 1999-2002. JAMA 291 2847-2850.
! 15062-4357/KOH
P! 400563
Ivies Z, Mates L, Yau ΊΎ, Landa V, Zidek V, Bashir S, Hoffmann OI. Hiripi L, Garrels W, Kues WA, et al. 2.014 Gemiline transgenesis in rodents by pronuclear microinjection of Sleeping Beauty transposons. Nat Protoc 9 773-793.
Larsen PR & Ingbar S 1992 The Thyroid, in Textbook of Endocrinology, edn 8, pp 357-487. Eds Wilson & 5 Foster. Philadelphia: W.B. Saunders, Go.
Lazar MA 2003 Thyroid hormone action: a binding coniraet. J Clin Invest 112 497-499.
Le Hír H, Nott A & Moore MJ 2003 How introns influence and enhance eukaryotic gene expression. Trends BiochemSci 28 215-220.
Lin JZ, SieglafTDH, Yuan C, Su .1, Arumanayagam AS, Firouzbakht S, Cantu Pompa JJ, Reynolds FD, Zhou 10 X, Cvoro A, et al. 2013 Gene spec ific actions of thyroid hormone receptor subtypes. PLoS One 8 e52407.
Nucera C, Muzzi P, Tiveron C, Farsetti A, La Regina F, Foglio Ö, Shih SC, Moretti F, Della Pietra L, Mancini F, et al. 2010 Maternal thyroid hormones are transcriptionally active during embryo-foetal development: results from a novel transgenic mouse model. J Cel! Mol Med 14 2417-2435.
Getting A & Yen PM 2007 New insights into thyroid hormone action. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 15 21 193-208.
Quignodon L, Legrand C, Allioli N, Guadano-Ferraz A, Bernal J, Samarut J & Fiamarti F 2004 Thyroid hormone signaling is highly heterogeneous during pre- and postnatal brain development. J Mol Endocrinol 33 467476.
Silva JE & Larsen PR 1983 Adrenergic activation of triiodothyronine production in brown adipose tissue, 20 Nature 305 712-713.
Tóth E &Nagy B 2004 Az elhízás egészséggazdaságtani megközelítése. Egészségügyi Gazdasági Szemle (4) 41-48.
Toyoda N, Zavacki AM, Maia AL, Harney JW & Larsen PR 1995 A novel retinoid X receptor-independent thyroid hormone response element is present in the human type 1 deiodinase gene. Mol Cell Biol 15 5100-5112.
Vaughan CH, Zarebidaki E, Ehlen JC & Bartness TJ 2014 Analysis and measurement of the sympathetic and sensory innervation of white and brown adipose tissue. Methods Enzymol 537 199-225.
Velasco IT, Togashi M, Walfish PG, Pessanha RP, Moura FN, Barra GB, Nguyen P, Rebong R, Yuan C, Simeont LA, et al. 2007 Thyroid hormone response element organization dictates the composition of active receptor. J Biol Chem 282 12458-12466.
Visser WE, Friesema EC, Jansen J & Visser TJ 2008 Thyroid hormone transport in and out of cells. Trends Endocrinol Metab 19 50-56.
West AG, Gaszner M & Felsenf'eld G 2002 Insulators: many functions, many mechanisms. Genes Dev 16 271-288.
Wolf AM & Colditz GA 1998 Current estimates of the economic cost of obesity in the United States. Obes 35 Res 6 97-106.
Zeold .A, Doleschall M, Haffner MC, Capelo LP, Menyhért J, Liposits Z, da Silva WS, Bianco AC, Kacskovics I, Fekete C, et al. 2006 Characterization of the nuclear factor-kappa B responsiveness of the human dio2 gene. Endocrinology 147 4419-4429.
Zhang C, Kim S, Harney JW & Larsen PR 1998 Further characterization of thyroid hormone response 40 elements in the human type 1 iodothyronine deiodinase gene. Endocrinology 139 1156-1163.

Claims (14)

SZABADALMI IGÉNYPONTOK
1. Pajzsmirigyhonnon-hatás indikációjára szolgáló transzgeníkus egér, amely genomjába stabilan integráltan pajzsmirigyhormon (TH) működésének vizsgálatára alkalmas rekombináns DNS-konstrukciót tartalmaz, ahol a rekombináns DNS-konstrukció 5' - 3’ irányban legalább a következő elemeket tartalmazza:
pajzsmirigyhormon-reszponziv szegmens, expresszíós enhanszerhez működőképesen kapcsolt promoter, riportert kódoló kódoíószekvencia, ahol
- a promoter irányítja a riporter expresszióját az egér egy vagy több szövetének sejtjeiben,
- amennyiben a sejtekben expresszálódik pajzsmirigyhormon receptor (TR), az a konstrukciótól függetlenül expresszálódik; vagy nem expresszálódik TR a sejtekben,
- TR, amennyiben jelen van és TH, amennyiben jelen van, a sejtekben komplexet képez,
- a komplex, amennyiben jelen van, a pajzsmirigyhormon-reszponziv szegmensen keresztül fokozza a riporter expresszióját, ezáltal
- a riporter expressziójának szintje korrelál a komplex szintjével,
- a DNS-konstTukció mentes pajzsmirigyhormon receptort kódoló szekvenciától és az egér a rekombináns DNS-konstrukció egyetlen kópiáját tartalmazza haploid genomjában.
2. Az 1. igénypont szerinti transzgenikus egér, ahol a rekombináns D'NS-konstrukcíót inszulátor szek-
20 venciák szegélyezik, amelyek védik a DNS-konstrukciót a szomszédos szekvenciák hatásától.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti transzgeníkus egér, ahol a pajzsmirigyhormon-reszponziv szegmens pajzsmirigyhormon-reszponziv elem (TRE) egyetlen vagy több kópiáját tartalmazza, ahol a TRE előnyösen a tliol gén TRE-e, előnyösebben az emberi dirA géné.
4. A 3. igénypont szerinti transzgeníkus egér, ahol a TRE 1 -5 kópiában, előnyösen 3 kópiában van jelen.
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti transzgeníkus egér, ahol a riporter riporterfehérje, amelynek sejtben történő expressziója esetén a sejt optikailag detektálható jelet ad, és amelynek mennyisége biolumineszcencia vagy fluoreszcencia alapján élő egérben ín vivő kimutatható.
6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti transzgeníkus egér, ahol a konstrukció rezisztenciamarkert is tartalmaz, ahol előnyösen
30 a rezisztenciamarker pozitív rezisztenciamarker és/vagy a rezisztenciamarker expressziója a riporter expressziójával működőképesen kapcsolt.
7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti transzgeníkus egér, ahol a rekombináns DNS-konstrukció integrálása az egér genomjába transzpozon alapú bevitellel történik.
8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti transzgeníkus egér, ahol a promoter ubíkviter promoter.
115062-4357/KOH
Pl400563
9. Transzgenikus egérsejt, amely 1-8. igénypontok bármelyikében meghatározott DNS-konstrakciót tartalmaz, ahol a sejt a TH jelenlétében megemelkedett szintű riporterfehérjét expresszál, és ahol a DNSkonstrukció a sejt haploid genomjában egyetlen kópiában van jelen.
10. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti transzgenikus egér alkalmazása TH-működés in vivo vizsgá5 latára vagy monitorozására.
11. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti transzgenikus egérből származó sejt, szövet vagy szerv alkalmazása TH-működés ex vivo vizsgálatára.
12. A 9. igénypont szerinti sejt alkalmazása a sejtben a TH-működés in vitro vizsgálatára vagy monitorozására.
10
13. A 10-12. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás pajzsmirigyhormon receptor agonisták vagy antagonisták, koregulátorok vagy pajzsmirigyhormon transzporterek modulátorai működésének vizsgálatára vagy monitorozására.
14. Az 1-6. és 8. igénypontok bármelyikében meghatározott rekombináns DNS-konstrukció alkalmazása transzgenikus egér létrehozására, ahol a DNS-konstrukció egyetlen kópiáját stabilan integráljuk a létrehozott 15 transzgenikus egér haploid genomjába.
HU1400563A 2014-11-28 2014-11-28 Pajzsmirigyhormon-hatás mérésére szolgáló transzgenikus indikátor egér és rekombináns DNS-konstrukció HU230964B1 (hu)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU1400563A HU230964B1 (hu) 2014-11-28 2014-11-28 Pajzsmirigyhormon-hatás mérésére szolgáló transzgenikus indikátor egér és rekombináns DNS-konstrukció
PCT/HU2015/050020 WO2016083856A1 (en) 2014-11-28 2015-11-30 Transgenic mouse for the assessment of thyroid hormone (th) action
US15/531,100 US10694724B2 (en) 2014-11-28 2015-11-30 Transgenic mouse for the assessment of thyroid hormone (TH) action
EP15828366.3A EP3223606B1 (en) 2014-11-28 2015-11-30 Transgenic mouse for the assessment of thyroid hormone (th) action

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU1400563A HU230964B1 (hu) 2014-11-28 2014-11-28 Pajzsmirigyhormon-hatás mérésére szolgáló transzgenikus indikátor egér és rekombináns DNS-konstrukció

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUP1400563A2 HUP1400563A2 (hu) 2016-06-28
HU230964B1 true HU230964B1 (hu) 2019-06-28

Family

ID=89991658

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU1400563A HU230964B1 (hu) 2014-11-28 2014-11-28 Pajzsmirigyhormon-hatás mérésére szolgáló transzgenikus indikátor egér és rekombináns DNS-konstrukció

Country Status (4)

Country Link
US (1) US10694724B2 (hu)
EP (1) EP3223606B1 (hu)
HU (1) HU230964B1 (hu)
WO (1) WO2016083856A1 (hu)

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1318608B1 (it) * 2000-07-04 2003-08-27 Univ Degli Studi Milano Topo transgenico per lo screening e per studi di farmacodinamica efarmacocinetica di ligandi attivi sul recettore degli estrogeni e sui
CA2357181A1 (en) * 2001-08-31 2003-02-28 Procyon Biopharma Inc. Generation of transgenic mouse models for the development of prostate cancer using regulatory regions of the psp94 gene
EP1365034A3 (en) 2002-05-21 2004-02-18 Bayer HealthCare AG Methods and compositions for the prediction, diagnosis, prognosis, prevention and treatment of malignant neoplasia
US20110130444A1 (en) * 2007-05-04 2011-06-02 Stefan Moisyadi Methods and compositions for targeted delivery of gene therapeutic vectors
AU2009289964A1 (en) * 2008-09-05 2010-03-11 Aarhus Universitet Nuclear receptor sensor system in transgenic animal
EP2516634A1 (en) 2009-12-21 2012-10-31 Sanofi Transgenic non-human animal and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
EP3223606B1 (en) 2019-05-01
US20170325429A1 (en) 2017-11-16
US10694724B2 (en) 2020-06-30
HUP1400563A2 (hu) 2016-06-28
EP3223606A1 (en) 2017-10-04
WO2016083856A1 (en) 2016-06-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhang et al. Mechanically activated piezo channels mediate touch and suppress acute mechanical pain response in mice
Lao et al. MASTR: a technique for mosaic mutant analysis with spatial and temporal control of recombination using conditional floxed alleles in mice
Kim et al. Transgenic mice expressing a ligand-inducible cre recombinase in osteoblasts and odontoblasts: a new tool to examine physiology and disease of postnatal bone and tooth
Dedic et al. Chronic CRH depletion from GABAergic, long-range projection neurons in the extended amygdala reduces dopamine release and increases anxiety
Sun et al. Mosaic mutant analysis identifies PDGFRα/PDGFRβ as negative regulators of adipogenesis
Crone et al. Genetic ablation of V2a ipsilateral interneurons disrupts left-right locomotor coordination in mammalian spinal cord
Plagge et al. The imprinted signaling protein XLαs is required for postnatal adaptation to feeding
Riccomagno et al. The RacGAP β2-Chimaerin selectively mediates axonal pruning in the hippocampus
Madisen et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain
Tomida et al. Usp46 is a quantitative trait gene regulating mouse immobile behavior in the tail suspension and forced swimming tests
Ramachandran et al. Conditional gene expression and lineage tracing of tuba1a expressing cells during zebrafish development and retina regeneration
Wang et al. Genetic approaches to studying norepinephrine function: knockout of the mouse norepinephrine transporter gene
Lu et al. CPEB2 activates GRASP1 mRNA translation and promotes AMPA receptor surface expression, long-term potentiation, and memory
Kusumakshi et al. A binary genetic approach to characterize TRPM5 cells in mice
CN105555132A (zh) Mrap2敲除
Montana et al. Transcriptional regulation of neural retina leucine zipper (Nrl), a photoreceptor cell fate determinant
Iezaki et al. The transcriptional modulator interferon‐related developmental regulator 1 in osteoblasts suppresses bone formation and promotes bone resorption
Igarashi et al. Targeted expression of step-function opsins in transgenic rats for optogenetic studies
Eulenburg et al. GlyT1 determines the glycinergic phenotype of amacrine cells in the mouse retina
Metzger et al. Targeted conditional somatic mutagenesis in the mouse: temporally-controlled knock out of retinoid receptors in epidermal keratinocytes
Gill et al. The gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neuronal population is normal in size and distribution in GnRH-deficient and GnRH receptor-mutant hypogonadal mice
Cyphert et al. Allergic inflammation induces a persistent mechanistic switch in thromboxane-mediated airway constriction in the mouse
An et al. The transmembrane channel-like 6 (TMC6) in primary sensory neurons involving thermal sensation via modulating M channels
Bougerol et al. Generation of BAC transgenic tadpoles enabling live imaging of motoneurons by using the urotensin II-related peptide (ust2b) gene as a driver
US20110203008A1 (en) Transgenic mouse for screening and for studies of the pharmacodynamics and pharmacokinetics of ligands acting on the oestrogen receptor and its intracellular receptors, and method for the preparation thereof