HU223208B1 - Zeaxantin tiszta 3R-3'R sztereoizomer alkalmazása gyógyszer vagy táplálékkiegészítő előállítására makuláris degeneráció emberben való kezelésére - Google Patents

Abstract

A találmány a zeaxantinnak nevezett karotinoid 3R,3'R-sztereoizomerjének tiszta formában való előállítására és gyógyszerkéntvagy tápanyag-kiegészítőként emberben a retina károsodását okozómakuláris degeneráció kezelésére való alkalmazására vonatkozik. Azelőállítás fermentációval történik, az alkalmazáshoz tisztított ésrészlegesen tisztított zeaxantin is használható. ŕ

Description

A leírás terjedelme 22 oldal (ezen belül 2 lap ábra)

HU 223 208 B1

HU 223 208 Bl

A jelen találmány a biokémia területére tartozik, és egy sárga pigmentnek, a zeaxantinnak (rövidítése ZX) bizonyos sztereoizomerjére vonatkozik. Ha embernek gyógyszerként vagy vitaminként adjuk, ez a pigment egy makuláris degenerációnak nevezett, a retinát károsító és akár vakságot is okozó betegségnek a kezelésére vagy megelőzésére alkalmazható.

A retina olyan szövet, amely a szemgolyó hátsó oldalát vonja be. Bonyolult, és egy tucat megkülönböztethető rétegből áll. Számos orvosi könyvben, így Gittinger (1988) és Vaughn és Asbury (1992) könyvében is leírják és szemléltetik (a teljes hivatkozást a későbbiekben adjuk meg).

Egy speciális kör alakú terület, amelyet makulának neveznek, kb. 1-1,5 milliméter átmérőjű az emberben, a retina közepén helyezkedik el. A makulának két jellemzője van, amely megkülönbözteti a retina többi részétől. Először, a makula aránylag kevés pálcikát tartalmaz; a fotoreceptorok legtöbbje kúp alakú (a foveában, a makula közepén egyáltalán nincsenek pálcikák). És másodszor, a makulának megkülönböztető sárga színe van, amelyet két pigment, a lutein és a zeaxantin okoz. Mindkettő a karotinoidoknak nevezett molekulák csoportjába tartozik. Ezen karotinoidpigmentek kémiáját a makuláris degeneráció ismertetése után részletezzük.

A „makuláris degeneráció” minden olyan állapotra utal, amely a retina sejtjeinek vagy a fotoreceptorkúpoknak a retina sárga makuláris régiójában progresszív károsodást okoz. Ezt több közleményben és kézikönyvben például Taylor (1993), Gittinger (1988), valamint Vaughan és Asbury (1992) leírja és bemutatja.

A makuláris degenerációnak több típusa van. A legismertebb típus a „korral kapcsolatos makuláris degeneráció”, amit általában AMD-ként vagy néhány cikkben ARMD-ként rövidítenek. Az AMD a gyenge látásveszteségtől a teljes vakságig terjedő mértékben károsítja a látást.

Az AMD-nek két formája van, amelyre nedves és száraz formaként utalnak. A nedves forma kapillárisok és más vérerek retinába való aggresszív növekedését foglalja magában, addig a pontig, ahol már a vérerek megszakítják és tönkreteszik a retinarétegek tökéletes szervezettségét. Noha az AMD ezen formája esetenként lézer alkalmazásával, az újonnan képződő vérerek kialakulásának kizárásával késleltethető, a lézeres kezelés azonban csak egy ideig késlelteti a vérerek növekedését, és általában nem tudja megakadályozni a majdnem teljes vakság bekövetkezését; a nedves AMD szinte mindig lényegében teljes vagy majdnem teljes vaksághoz vezet. A nedves forma az AMD-ben szenvedő betegek csak kb. 5-10%-ánál fordul elő.

A másik AMD-formát száraz AMD-nek nevezik. Mivel az esetek legalább 90%-ában fordul elő, gyakran csak AMD-ként utalnak rá. Noha az AMD ezen formája általában nem okoz teljes vakságot, a beteg látását súlyosan károsíthatja, és a beteget képtelenné teszi az olvasásra vagy jól ismert tárgyak, így barátok vagy rokonok arcának felismerésére. Ily módon gyakran funkcionális vaksághoz vezet, az emberek képtelenek vezetni vagy biztonságosan járkálni, és képtelenek normális tevékenység végzésére.

Különféle betegségek léteznek, amelyek a makuláris degenerációt tünetként foglalják magukban, ilyen a Stargardt-féle betegség, a Best-féle betegség, a Battan-féle betegség, a Sjögren-Larsson-szindróma, a kúp-pálcika disztrófiája és a birka-ceroidlipofúscinosis. Az ezeket leíró cikkekre Dorey és munkatársai (1993) közleményükben hivatkoznak. Emellett más betegségek, amelyek lizoszomális raktározási problémákat foglalnak magukban (mint például a Tay-Sach-féle betegség), vagy progresszív idegsejt-degenerációval járnak (például az Alzheimer-betegség), szintén összefüggenek a makuláris degenerációval.

Ezen betegségek közül számosnak van genetikai komponense, amit az örökölhetőség bizonyít; a betegséget okozó gének közül néhányat már elkülönítettek, és genetikai szűrővizsgálatokkal ki lehet mutatni, hogy egy személynek van-e ilyen hibás génje. Bárkinek, akinek van vagy feltehetően van ilyen génje, genetikai vizsgálat alapján vagy a család kortörténete szerint, fokozott a rizikója a makuláris degenerációnak. Ha az ember lassan megdörzsöli a szemét, az AMD borzasztó fájdalmat okoz. Dollárbilliókba kerül minden évben a munkaképesség csökkenése és a családtagokra, biztosítókra, szociális szervezetekre és másokra háruló nagy teher, akiknek a gyógykezelést biztosítaniuk vagy a költségekbe besegíteniük és más segítséget kell nyújtaniuk a vakságtól vagy súlyos látáskárosodástól szenvedő embereknek.

Az AMD által okozott problémák miatt természettudósok és orvosok évtizedek óta keresik a makuláris degeneráció által okozott vakság és más látáscsökkenés kezelésének vagy megelőzésének módjait. Azonban a több mint fél évszázados erőfeszítések ellenére sem létezik hatásos kezelési mód.

A makuláris degenerációt általában a retináról készült speciális fényképfelvétel segítségével diagnosztizálják. A diagnosztikai eljárások egyik típusában az orvos fluoreszcens anyagot injektál a betegbe, időt hagy arra, hogy az anyag a betegben keringjen, és azután a retináról nagyított fényképfelvételt készít, amit angiogramnak neveznek. Az orvos ezután analizálja a felvételt, hogy meghatározza a celluláris törmelék egyik vagy mindkét típusának a jelenlétét és koncentrációját.

A celluláris törmelék egyik típusát, amelyet már néhány évtizede ismernek és vizsgálnak, drusennek nevezik. Két megkülönböztethető formában létezik. Kemény drusen (63 mikrométernél kisebb átmérőjű részecske) kis mennyiségben általában jelen van bárkinek a szemében 40 év felett. Hacsak nem abnormális mértékben van jelen, a kemény drusen nem károsítja a retinát.

Ezzel szemben a nagyobb, lágy drusen (nedves drusennek is nevezett) lerakódások jelentős mennyisége arra utal, hogy retinakárosodás történt vagy történik, mivel a lágy drusen nagy cseppjei tönkretehetik és megbonthatják a retinarétegek szervezettségét, és megakadályozhatják, hogy a retinasejtek a vérből megfelelő tápanyagot kapjanak. Az olyan beteg, akinek a retinája

HU 223 208 Bl jelentős mennyiségű lágy drusent tartalmaz, általában makuláris degenerációban szenvedőnek számít.

A retinatörmelék másik típusát, amely általában a makuláris degenerációban szenvedő betegekben jelen van, lipofuscinnak nevezik. Az összefüggés a lipofúscin és az AMD között az utóbbi időben vált világossá (például ld. Weiter és munkatársai, 1988, és Dorey és munkatársai, 1993).

A „karotinoidok” a molekulák nagy csoportját alkotják, a természetben több mint 600 karotinoidot azonosítottak. Ezeknek a molekuláknak több közös jellemzője van, többek között:

1. A karotinoidok úgy jönnek létre, hogy izoprén molekulák, 5 szénatomos molekulák összekapcsolódnak. Mivel az építőkövek 5 szénatomot tartalmaznak, a legtöbb karotínoidban az alkotó szénatomok száma ötnek a többszöröse.

2. A karotinoidok több telítetlen kötést tartalmaznak. Ez lehetővé teszi, hogy nagy energiájú fényhullámokat nyeljenek el a spektrum kék és közeli ultraibolya régióiban.

3. Mivel a karotinoidok a spektrum kék és közeli ultraibolya régiójában nyelnek el fényt a hosszabb hullámhosszú fény elnyelése nélkül, a karotinoidok általában sárga, narancsszínű, barna vagy vörös színűek. A ,Jkarotinoid” név a répából származik; az első ismert karotinoidot a répa narancsszínét adó pigmentként azonosították. A karotinoidok által okozott szín oldatban különböző tényezőktől, így a koncentrációtól és más kémiai anyagok jelenlététől függ.

4. A karotinoidok „konjugált” kettős kötéseket tartalmaznak. Ez azt jelenti, hogy a kettős kötések egyes kötésekkel váltakoznak, úgyhogy minden szénatom a láncban kettős kötéssel kapcsolódik egy másik szénatomhoz, de nincs olyan szénatom, amely két másikhoz kapcsolódna kettős kötéssel. Ez az elrendeződés az 1. ábra alapján megérthető, amely a β-karotin, a ZX és a lutein szerkezetét mutatja.

A különböző karotinoidok konjugációs szintje különböző, és általában a többszörösen konjugált molekulajobb védelmet nyújt a nagy energiájú fénysugárzás által okozott „fototoxikus” károsodással szemben. Például az 1. ábrán látható három karotínoidban a lényegében egyenes láncban az egyes és kettős kötések váltakoznak. A β-karotinban és a ZX-ben a konjugáció kiterjed a lánc két végén levő gyűrűre is. Ezzel szemben a lutein eggyel alacsonyabb konjugációs szintű, mivel a kettős kötés az egyik láncvégi gyűrűjében a teljes konjugációhoz nem megfelelő módon helyezkedik el. Az egyetlen különbség a ZX és a lutein között az egyik (de nem mindkét) láncvégi gyűrűben levő kettős kötés helyzetében van.

Mivel a karotinoidok alkalmasak és kiválasztódtak (a fejlődés során) a kék és közeli ultraibolya fény potenciálisan veszélyes energiájának elnyelésére, ezeket a természetben védőpigmentekként alkalmazzák. A növényekben széles körben megtalálhatók, mivel a növények egyik fő célja a lehető legtöbb napfény elnyelése, ugyanakkor a kék, ultraibolya és közeli ultraibolya sugárzás által okozott sejtkárosodás minimumra csökkentése. Az ultraibolya sugárzás által a növényeknek okozott kár fontos probléma, és a karotinoidok segítenek ennek a minimalizálásában.

Mivel a karotinoidok nagyon alkalmasak a fototoxikus károsodás elleni védelemre, az állatok szintén elsajátítottak (a fejlődés során) különböző módokat a karotinoidok fényvédő pigmentekként való alkalmazására. Az állatok maguk nem tudnak testükben karotinoidokat szintetizálni, ezért növényi forrásokból kell karotinoidokat (vagy karotinoidprekurzorokat) fogyasztaniuk. Egyik példa a β-karotin; az emlősök növényekből vagy húsból kaphatják. Miután a β-karotin bekerült az emlős testébe, az emlős ott átalakítja más molekulaformákká, ezen belül A-vitaminná (retinollá), amely úgy képződik, hogy a β-karotin két részre hasad.

A karotinoidokat két fő csoportba osztják, a karotinok és a xantofilok csoportjára. A karotinok nem tartalmaznak oxigént; ezek valódi szénhidrogének, amelyek szénből és hidrogénből épülnek fel. Ezzel szemben a xantofilek (ilyen a ZX és a lutein) oxigént is tartalmaznak.

Az 1. ábra megmutatja a ZX bal és jobb láncvégi gyűrűjének a számozását. Megegyezés alapján a bal láncvégi gyűrű szénatomjait 1-től 6-ig számozzuk, míg a jobb láncvégi gyűrű szénatomjainak számát vesszővel látjuk el, ilyen például a 3’-szénatom. Mivel a ZX teljesen szimmetrikus a jobb és bal végét illetően, a „bal” és Jobb” meghatározás pusztán egyezményes megnevezés a tárgyalás megkönnyítésére. Azonban meg kell jegyeznünk, hogy a lutein nem szimmetrikus; a kettős kötés a „bal” gyűrűben nem ugyanazon a helyen van, mint a Jobb” gyűrűben.

Mivel a ZX úgy keletkezik, hogy a β-karotinhoz két hidroxilcsoportot adunk a két végén levő 3-as szénatomhoz, a vegyület kémiai neve 3,3’-<ϋ1ιί<ΐΓθχϊ-β,βkarotin; néhány kémikus karotin-diolként utal a vegyületre. Ezt a molekulát zeaxantinnak nevezték el, mivel először azon pigmentként azonosították, amely a kukorica sárga színét adja, és a kukorica tudományos neve Zea mays.

Amint fentebb említettük, több mint 600 karotinoidot azonosítottak a természetben. Több tucat közülük fontos szerepet játszik a biokémiában és a kereskedelemben. A ZX és a lutein különösen fontos a jelen találmány szempontjából, mivel az emlősök és a legtöbb más állat retinájában előfordulnak.

A lutein kereskedelmi szempontból is fontos, mivel széles körben adják (növényi extraktumok, főként a körömvirág extraktuma formájában) csirkéknek, hogy a bőrük és a tojásuk szikje sárgább színű legyen, ami a vásárlókat és fogyasztókat vonzza.

A ZX ugyanolyan hatású és hatékonyabb, mint a lutein, azonban a ZX-források nagyon költségesek a szárnyasok takarmányozására való alkalmazáshoz. A Gierhart számára engedélyezett és az Applied Food Biotechnology Inc. cég (a jelen találmány tulajdonosa és bejelentője) tulajdonában levő 5 308 759 és az 5 427 783 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás tárgya az állatok takarmányozására túl drága ZX problémájának a megoldása. Ezek a szabadalmi leírások baktériu3

HU 223 208 Bl mokra vonatkoznak, amelyek segítségével ipari méretekben lehet ZX-et előállítani, úgyhogy szárnyasokkal és halakkal lehet etetni.

A növények mellett néhány karotinoidot bizonyos baktériumok szintetizálnak. Ezek a baktériumok olyan helyeken fejlődtek ki, amelyek közvetlen napfénynek vannak kitéve, és a karotinoidjaik ugyanolyan fényvédő szerepet játszanak, mint a növényekben. A baktériumokból származó karotinoidokat többek között McDermott és munkatársai (1972), az 5 429 939 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Misawa és munkatársai, 1995) és más, az előzőekben hivatkozott cikkek írják le.

Az 5 429 939 számú (Misawa és munkatársai, 1995) amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban felsorolják számos olyan gén DNS-szekvenciáját, amely a különféle karotinoidok, ezen belül a ZX bioszintézisében részt vevő enzimeket kódolja. Leírják mindegyik major génnek (ezen belül a crtE, crtB, crtl, crtY és crtZ génnek) a ZX kialakításában játszott szerepét is. A fenti géneket magukban foglaló plazmidokat tartalmazó sejteket az American Type Culture Collection gyűjteményben (Erwinia uredovora ATCC 19 231 és Erwinia herbicola ATCC 39 368 néven és számon) és Japánban a Fermentation Research Institute gyűjteményében (például E. coli FERM BP-2377 azonosítási számon) letétbe helyezték.

A karotinoidkémiában fontos szerepet játszanak a „sztereokémia” és a „sztereoizomerek”. Ezt a témát mindegyik szerves kémiai tárgyú egyetemi tankönyv ismerteti. Amikor egy szerves molekulában olyan szénatom van, amelyhez négy különböző típusú atom vagy a molekula részét képező csoport kapcsolódik, a szénatomot „királis” szénatomnak nevezik. Ha a királis szénatom egy szerves molekulában jelen van, a négy különböző csoportot, amely a királis szénatomhoz kapcsolódik, két eltérő módon rendezhetjük el. Ezt a két elrendeződést sztereoizomereknek nevezzük. A sztereoizomerek egyike a polarizált fényt .jobbra”, míg a másik sztereoizomer a polarizált fényt „balra” forgatja. A jobbra forgató izomert Rsztereoizomemek (vagy D-sztereoizomemek) nevezik. Az az izomer, amely balra forgást okoz, az S-sztereoizomer (vagy más néven L-sztereoizomer).

Mivel mind a 3-as, mind a 3 ’-szénatom a ZX-ben királis, ezért a vegyületnek négy lehetséges sztereoizomeije van. A 3R,3’R-izomerben a 3-as és a 3'-szénatomok mindegyike R-konfigurációjú. A 3S,3’S-izomerben a 3-as és a 3’-szénatomok mindegyike L-konftgurációjú. Az egyszerűség kedvéért erre a két sztereoizomerre a leírásban R,R- és S,S-izomerként utalunk.

A harmadik és a negyedik izomer a két vegyes vagy mező- (egy R és egy S) izomer: a 3R,3’S-izomer és a 3S,3’R-izomer. Mivel a ZX teljesen szimmetrikus a középpontjára nézve, ez a két izomer minden szempontból azonos; ha a 3R,3’S-izomert egy papírra lerajzoljuk, a papírt elforgatjuk, átmegy a 3S,3’R-izomerbe. Valójában egyetlen „mezo”-izomert képez mind az S,R-, mind az R,S-izomer.

Ha standard kémiai szintézismódszereket alkalmazunk a ZX előállítására, a négy lehetséges izomer az összes izomer kb. 25%-ában lesz jelen. Azonban, mivel az S,R- és az R,S-izomerek valójában azonosak, a „mezo’-izomerek a teljes mennyiség 50%-át alkotják, míg az R,R- és az S,S-izomerek mindegyike kb. 25%-ban lesz jelen. A három sztereoizomer elegyét „rácéin” elegynek nevezik.

Azonban a retina szövetében levő karotinoidok sejtés enzimspecifitása rendkívül pontos, és a különböző izomerek és sztereoizomerek nem cserélhetők fel. A luteint és a ZX-et a retinasejtek teljesen különböző és megkülönböztethető molekulaként kezeli, jóllehet a hagyományos kémiai terminológia szerint ezek egymás sztereoizomeqeinek tekinthetők (mivel azonos számú szénatomot, hidrogénatomot és oxigénatomot tartalmaznak).

A biológiai tényezők miatt az itt releváns izomerek csak a sztereoizomerek. Bármilyen utalás a jelen leírásban a zeaxantinizomerre vonatkozóan a ZX adott sztereoizomeqére utal, és nem foglalja magában a luteint. A luteint és a ZX-et teljesen különböző karotinoidnak tekintjük.

A karotinoidokban mutatkozó sztereokémiái különbségek bármilyen kicsik, finomak és jelentéktelenek, valójában rendkívül fontosak, amikor a retinaszövet kerül szóba. Láthatóan a humán retinasejtek a ZX-sztereoizomerek közül csak az R,R-izomert (a 3R,3’R-sztereoizomert) veszik fel és használják teljes mértékben.

Több közleményben beszámoltak arról, hogy a retinaszövetben nyomokban megtalálták a ZX mező- (R,S) izomeqét. Azonban ezek a nyomnyi mennyiségek feltehetően olyan molekuláris átalakulásokra vezethetők vissza, amelyek bizonyos körülmények között spontán mennek végbe, és a luteinprekurzorokból mezo-zeaxantin képződéséhez vezetnek (Boné és munkatársai, 1993 és 1994).

Laboratóriumban a ZX sztereoizomeijeit például királis oszlopkromatográfiás módszerrel (Boné és munkatársai, 1993) vagy cirkuláris dikroizmusanalízissel (Britton, 1994) különböztethetjük meg.

1970-re a karotinoidoknak a növények fototoxikus károsodásával szembeni védelmében játszott szerepe jól ismert volt. Azt is tudták, hogy a karotinoidok jelen vannak az állati szövetekben, és hogy a karotinoidok az állatokban eredetileg növényekből származnak, mivel az állatok nem képesek karotinoidokat szintetizálni. Ezen információ alapján számos cikkben rámutattak az állatokban és növényekben levő karotinoidok hasonlóságára, és arra következtettek, hogy a karotinoidok az állatokat védik a fototoxikus károsodástól.

Miután a karotinoidok fényvédő szerepét felismerték, a kutatók tanulmányozni kezdték a retinában levő karotinoidok kémiáját és szerepét. A kísérletek egyrészt olyan laboratóriumi állatokkal folytak, amelyeket karotinoidokat nem tartalmazó őrleményekből vagy magokból (például milomagokból) készült táppal etettek. Az eredmények arra utaltak, hogy azok az állatok, amelyektől a karotinoidot megvonták, nem fejlesztettek ki sárga makuláris területeket, és ezek a retinák abnormálisán sok lágy drusent tartalmaztak, ami a retina károsodását jelezte (Malinow és munkatársai, 1980, Kierschfeld 1982, Ham és munkatársai, 1984, és Snodderly és munkatársai, 1984). Ezen megállapítások tükrében a ku4

HU 223 208 Bl tatók feltételezték, hogy az egészséges retina szempontjából a karotinoidok létfontosságúak. Ezek a kutatók molekuláris bizonyítékot gyűjtöttek össze azon régi bölcsesség alátámasztására, hogy a répa és a leveleszöldfőzelékek jó hatással vannak a szemre. Azonban a tudósok még nem tudták, hogy a makulában levő sárga pigmenteket végső formában kell-e fogyasztani, vagy ezek az állatokban más prekurzorok, így β-karotin vagy likopén felhasználásával szintetizálhatok.

A luteint 1949-ben azonosították a makulában levő sárga pigmentek egyikeként (Wald 1949). A ZX-et csak sok évvel később azonosították a másik makuláris pigmentként (Boné és munkatársai, 1985). Az 1980-as évek közepén vagy végén a makuláris pigmentekkel kapcsolatos ismereteket Handelman és Dratz (1986), Wemer és munkatársai (1987), Pease és munkatársai (1987), Haegerstrom-Portnoy (1988) és Handelman és munkatársai (1988) írták le cikkeikben. Ezek a cikkek többek között azt állapították meg, hogy a ZX (amely teljesen konjugált, és ezért a luteinnél valamivel jobb védőhatást nyújt a fényenergia által okozott károsodásokkal szemben) az uralkodó pigment a foveában, amely a makula legközepén elhelyezkedő kis terület. A ZX mennyisége fokozatosan csökken, és a lutein mennyisége nő, ahogy a foveától koncentrikusan távolodunk a makula külső széle felé, úgyhogy a makula külső perifériájában már a lutein a domináns sárga pigment. Az utóbbi időben megjelentek olyan cikkek, amelyek a retina öregedésének és károsodásának különböző sajátságaival foglalkoznak, és amelyek speciálisan a karotinoidokra, mint a retina védőszereire irányulnak, ilyenek többek között Sperduto és munkatársainak (1990), Gerster (1991), Schalch (1992) és Seddon és munkatársainak (1994) közleményei.

Összefoglalva tehát több mint 10 éve ismeretes, hogy a lutein és a ZX a makulában levő két pigment, és a tudósok több mint egy évtizedig azon spekuláltak, hogy ezek a pigmentek megvédhetik a makulát a fototoxikus károsodással szemben.

Azonban azon tény ellenére, hogy ezek a felfedezések és feltételezések már 10 évvel ezelőtt történtek, eddig senki sem fejlesztett ki semmilyen hatóanyagot, táplálkozási vagy étkezési kiegészítőt, vagy a kezelés más formáját, amely ismert módon hatékony a makuláris degeneráció fokozatos kialakulásának jelentős mértékű megelőzésében vagy késleltetésében (visszafordításában).

Az előző mondatot valamelyest minősíteni kell, mivel a β-karotinról, az A-vitaminról és az E-vitaminról ismert, hogy valamilyen szinten jótékony hatást gyakorol a retinaszövet védésének megsegítésében (ld. például az 5 310 764 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást, Baranowitz és munkatársai (1994), és a későbbiekben hivatkozott két cikket az Eye Disease Case Control Study Grouptól). Ezek a szabadalmi leírások és cikkek azt állítják vagy ajánlják, hogy a β-karotin, az A-vitamin és az E-vitamin kimutatható hatást gyakorolhat a makuláris degenerációval kapcsolatos károsodás megelőzésében vagy csökkentésében.

Az ilyen állítások igazak lehetnek a karotinoidok, az A-vitamin és az E-vitamin általános antioxidáns szerepének köszönhetően. Azonban sajnos az is igaz, hogy a β-karotin, az A-vitamin és az E-vitamin által biztosított jótékony hatás nagyon csekély a retinában, és nem emelkedik a hatékony kezelés szintjére. Gyakorlati szempontból a makuláris degeneráció meg nem előzhető, meg nem állítható és vissza nem fordítható. Bármelyik széles spektrumú antioxidáns (mint a β-karotin, az A-vitamin és az E-vitamin) alkalmazása pusztán tüneti kezelést jelent. Mivel valójában semmi nem volt hozzáférhető, ezeket a vitaminokat használták (nagyon korlátozott és ki nem elégítő sikerrel), hogy megpróbálják a makuláris degeneráció által okozott könyörtelen károsodást lelassítani.

Ami a technika állását illeti, azt is meg kell jegyeznünk, hogy számos egészséges élelmiszert árusító üzletben kaphatók karotinoidkészítmények, amelyekre rá van írva, hogy a szemre és a látásra jótékony hatást gyakorol. A karotinoidkeverékeken levő fenti szöveg érthető lehet, mivel (amint már utaltunk rá) a β-karotin és az A-vitamin jól ismert általános antioxidáns. Azonban a kereskedelemben kapható egyik karotinoidkeverék sem tartalmaz többet, mint kis, nyomnyi mennyiségű ZX-et. A karotinoidok nagy része a karotinoidkeverékekben, amelyek az ilyen egészséges élelmiszert árusító boltokban kaphatók, nem zeaxantin-karotinoid (hanem főként β-karotin és A-vitamin).

Néhány fontos kormányszervnek és kutatási konzorciumnak az állásfoglalása és kutatási célja szintén figyelemre méltó. Az Amerikai Egyesült Államokban a National Institutes of Health (amely a National Eye Councilon és a National Advisory Eye Councilon keresztül működik) nemrégiben két beszámolót adott ki, amelyek címe: „Vision Research: A National Plán 1994-1998” NIH Publication No. 93-3186; (1994, ld. különösen az 55-65. oldalak), és „Age-related eye disease study” NIH Publication 93-2910 (1993). Mindkét közlemény és a kutatás, amit leírnak, a β-karotinra koncentrál (inkább, mint a ZX-re), mint olyan vegyületre, amely az AMD kezelése szempontjából a legígéretesebb. A legjobb tudomásunk és hitünk szerint a NEI hivatalnokaival folytatott tárgyalások után sem a NEI, sem semmilyen másik szervezet, amely a National Institutes of Health irányítása alá tartozik, nem hajlandó támogatni, vagy az utóbbi időben nem támogatott semmilyen kutatást a zeaxantinra, mint az AMD kezelésére potenciálisan alkalmas szerre vonatkozóan. Ehelyett a NIH és más, adóból támogatott szervezetek dollárok millióit helyezik ki a β-karotinnal, mint az AMD kezelésére vagy megelőzésére alkalmas legígéretesebb szerrel kapcsolatos kutatásokra.

Más prominens kutatók, akik szintén megkülönböztetett figyelmet érdemelnek, az „Eye Disease Case Control Study Group”-hoz tartoznak. Ez a csoport nemrégiben két cikket közölt, amelyek címe: „Antioxidant status and neovascular age-related macular degeneration”, Arch. Ophthalmol. 77.104-109 (1993), és a „Risk factors fór neovascular age-related macular degeneration” Arch. Ophthalmol. 10:1701-1708 (1992). A hivatalos NIH-beszámolókhoz hasonlóan ezen cikkek egyike sem ismerteti vagy ajánlja zeaxantinnak, mint az AMD keze5

HU 223 208 Bl lésére használható szemek az alkalmazását, és ez a konzorcium sem hajlott rá, vagy visszautasította a ZX-szel, mint az AMD kezelésére vagy megelőzésére alkalmas szerrel kapcsolatos bármilyen kutatás támogatását.

Azt is meg kell jegyeznünk, hogy nagy érdeklődés mutatkozik a karotinoidok iránt a rák kezelése vagy megelőzése (kezdve Pető és munkatársaival, 1981), és a koleszterin képződésének megakadályozása, valamint az artériákban a lerakódások csökkentése (Jialal és munkatársai, 1991) területén. Hihetetlen méretű tudományos irodalom létezik, amely a karotinoidok különféle hatásával foglalkozik, és nagy volt az érdeklődés a karotinoidok, ezen belül a lutein és a ZX kémiai szintézisével kapcsolatban is. Azonban az elmúlt évtizedek alatt a karotinoidkutatásra és -szintézisre irányuló minden erőfeszítés ellenére senki sem számolt be a makuláris degeneráció kezelésére vagy megelőzésére alkalmas egyetlen hatásos módszerről sem. A roppant nagy kiadások és a szenvedés fényében, amelyet a makuláris degeneráció az áldozatokra és a társadalomra ró, ez olyan nagy probléma, amellyel foglalkozni kell.

Következésképpen a találmány tárgya egy potenciálisan fontos áttörést ajánl egy (1) egyaránt biztonságos és hatékony szer rendelkezésre bocsátásával makuláris degenerációtól szenvedő betegek kezelésére, és (2) táplálékkiegészítő rendelkezésre bocsátásával, amely a vitamintablettákhoz hasonlítható, és amelyet bárki bevehet, ha csökkenteni akarja annak a veszélyét, hogy a középkor elérése vagy elmúlása után makuláris degenerációtól szenvedjen.

A technika állásához tartozó különböző cikkek ismertetnek eljárásokat ZX előállítására. Ezek a cikkek két kategóriába sorolhatók: fermentációs eljárások, ahol a gyártási eljárásban mikrobák játszanak kulcsszerepet; és nem fermentációs szintézismódszerek, amelyekben tiszta kémiai reakciókat alkalmaznak. Az irodalomban szereplő legtöbb cikk azt ajánlja, hogy a ZX-et ismert célokra, így a szárnyasok vagy halak tápjának kiegészítésére, a hús színének sötétítésére és még vonzóbbá tételére használják. Nyilvánvalóan a fenti törekvések egyike sem eredményezte a ZX kereskedelmi méretekben történő termelését vagy forgalmazását.

1995 októberétől a tisztított formában vagy félig koncentrált formában levő ZX, amely a ZX-et kb. 5 tömeg%-nál nagyobb mennyiségben tartalmazza, beszerzésének egyetlen módja, hogy milligram mennyiségű ZX-et kell venni specialitásokat forgalmazó kémiai cégektől, így az Atomergic Chemicals Corporation (Farmingdale, NY) vagy a Spectrum Chemical Manufacturing Company (Gardena, CA) cégtől. A tisztított ZX ára 1995-ben ezeknél a specialitásokat előállító cégeknél a szintetikus racém elegyben, amely a nem kívánt

S,S- és S,R-izomereket is tartalmazta, kb. 90 és kb. 125 dollár között változott mg-ként. Ez átszámolva kb. 100 000 US-dollár a racém elegyben levő ZX egy grammjára vonatkoztatva. Természetesen ezek a készítmények nem rendelkeztek annak a reális lehetőségével, hogy gyógyszerként vagy táplálkozási kiegészítőként kerüljenek alkalmazásra, egyrészt az áruk, másrészt amiatt, hogy nagy mennyiségben tartalmazzák a nem kívánt és elképzelhetően veszélyes S,S- és mezoizomereket. A jelen találmány megalkotása előtt a tisztított vagy félig tisztított R,R-zeaxantin a köz számára egyszerűen semmilyen formában nem volt hozzáférhető.

Azok a korábbi cikkek, amelyek a ZX mikrobiális fermentációjával való előállítását írják le, többek között a következők:

(1) Courington és Goodwin 1955, a legkorábbi ismert utalás, amely a ZX-termelést egy Flavobacter nemzetséghez tartozó baktériummal írja le.

(2) 3 891 504 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Schocher and Wiss, 1975, Hoffinan LaRoche) szintén Flavobacter sejtekkel írja le a ZX termelését. Ezeket a ZX-et tartalmazó sejteket csirkékkel megetették, és azokban megfelelő színeződést okoztak.

(3) A 3 841 967 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Dasek és munkatársai, 1974) és a 3 951 743 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Shepherd és munkatársai, 1976) egyaránt a Nestlé tulajdona. Ezek olyan eljárásokat és tápanyagokat írnak le, amelyek a baktérium által termelt ZX mennyiségének növelésére használhatók.

(4) Két további, újabb amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (az 5 308 759 és az 5 427 783 számú, mindkettő feltalálója Gierhart) az Applied Food Biotechnology Inc. tulajdona, ez a cég a jelen bejelentés tulajdonosa is. Ezekben a szabadalmi leírásokban egy, a Missouri vízlevezető csatornájából elkülönített baktériumtörzset (Flavobacterium multivorum) ismertetnek. Felfedezték, hogy ezek a baktériumok ZX-et termelnek anélkül, hogy jelentős mennyiségben más karotinoidokat is előállítanának. Ez fontos volt a szárnyas- és haltáppal kapcsolatban, a hús és a tojássárga színének mélyítése szempontjából, mivel a karotinoidok azután, hogy az állat megette őket, a véráramba kerülésért egymással versengenek. Ennek megfelelően a Gierhart által azonosított F. multivorum törzs más karotinoidok távollétében több, az állati szövet számára hozzáférhető ZX-et termelhet, és ezért növeli annak potenciáját és hatását.

Az 5 308 759 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban olyan szárnyas- és haltáp számára történő ZX-előállítási eljárást igényelnek, amelyhez AFB-féle F. multivorum baktériumokat használnak. Az 5 427 783 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, egy megosztott bejelentésre adott szabadalom, a takarmánykeverékeket igényli. Mindkét szabadalmi leírás a ZX szárnyas- vagy haltápban való alkalmazására korlátozódik, és egyik sem ajánl semmit a ZX emberek kezelésére való alkalmazására.

A Gierhart szabadalmi leírások egyike sem mond semmit a ZX specifikus sztereoizomeijeiről két ok miatt: (1) az AFB-féle F. multivorum sejtek által generált ZXsztereoizomerek státusa 1989-ben még nem volt ismert, amikor a bejelentést benyújtották, és (2) mivel a szabadalmi leírások csupán a szárnyas- vagy haltápban való alkalmazásra készült ZX-re vonatkoztak, nem volt ok arra, hogy a különböző sztereoizomerekkel foglalkozzanak.

Az AFB-féle vad típusú F. multivorum törzset az ATCC-gyűjteményben deponálták, azonosítási száma 55 238. Letétbe helyezés ideje: 1991. október 14. Mi6

HU 223 208 Bl vei ezek a baktériumok bizonyos típusú lipideket, szfingolipideket generálnak, az ATCC újraosztályozta ezeket a baktériumokat, és Sphingobacterium multivorumnak nevezték el, és ezeket a sejteket a katalógusokban ezen a néven említik. A Sphingobacterium név, amely az ATCC-katalógusban szerepel, még egyetlen olyan referenciamunkában sem jelent meg, amely a mikrobiális taxonómia hivatalos útmutatója: Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, amelyet kiegészített és naprakész állapotba hozott az International Journal of Systematic Bacteriology.

A ZX standard kémiai (mikrobák nélküli) szintézisére az elmúlt 25 év alatt tett erőfeszítésekről az utóbbi években több helyen, például a 4 153 615 (Saucy 1979), a 4 952 716 számú (Lukac és munkatársai, 1990) és az 5 227 507 számú (Lukac és munkatársai, 1993) amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban számolnak be. Azonban ezek az eljárások igen komoly hátrányokkal rendelkeztek. Jellemzően számos reakciólépésből állnak, és mindegyik lépés 100%-nál kisebb hozamot eredményez, így a soklépéses eljárás végén a ZX hozama aránylag rossz. Emellett a kémiai szintézis során általában nem kívánt S,S- és S,R-ZX-sztereoizomerek, valamint különféle átalakulási vagy bomlástermékek, így oxidált zeaxantin és olyan zeaxantinmolekulák képződnek, amelyek az egyenes részben és/vagy a láncvégi gyűrűkben egy vagy több kettős kötéssel kevesebbet tartalmaznak.

Összefoglalva tehát a jelen találmány előtt az emberi fogyasztásra vagy tápanyag-kiegészítőként alkalmazható tisztított R,R-zeaxantinnak nem volt ismert forrása.

Ennek megfelelően a jelen találmány egyik tárgya annak közrebocsátása, hogy az AFB-féle F. multivorum törzs (ATCC azonosítási száma 55 238) és mutagenizált utódai a ZX R,R-sztereoizomeqét egyetlen kimutatható izomerként termelik a nemkívánatos S,S- vagy S,R-sztereoizomerek ki nem mutatható mennyiségei mellett.

A találmány másik tárgya eljárás az AFB-féle F. multivorum törzsből (ATCC azonosítási száma 55 238) származó sejtek alkalmazásával gyógyszer előállítására, olyan betegek kezelésére, akikről megállapították, hogy makuláris degenerációtól, különösen korral kapcsolatos makuláris degenerációtól szenvednek.

A jelen találmány egy további tárgya egy eljárás AFB-féle F. multivorum törzsből (ATCC azonosítási száma 55 238) származó sejtek alkalmazásával tápanyagkiegészítő előállítására emberek számára a vitamintablettákhoz hasonló formában vagy élelmiszer-, például margarinadalékként a makuláris degeneráció veszélyének az élet későbbi szakaszában való csökkentésére.

A jelen találmány harmadik tárgya olyan zeaxantinkészítmény rendelkezésre bocsátása, amely az R,Rsztereoizomert önmagában vagy erősen domináns izomerként tartalmazza olyan készítményekben, amelyek ember általi orális fogyasztásra vagy retinabetegségek vagy degeneráció kezelésére, vagy tápanyag-kiegészítőként a látáselvesztés veszélyének csökkentésére alkalmasak az idősebbek körében.

A találmány ezen és további tárgyai a következő összefoglalásból és a találmány leírásából nyilvánvalóak lesznek.

A találmány eljárást bocsát rendelkezésre zeaxantin előállítására, amely a zeaxantin 3R,3’R-sztereoizomerjét (amelyre R,R-izomerként vagy R,R-zeaxantinként is utalunk) egyedüli kimutatható vagy erősen domináns izomerként tartalmazza, gyógyszerként vagy tápanyagkiegészítőként való alkalmazásra, emberi fogyasztásra. A ZX egy sárga pigment a humán retina makuláris sejtjeiben, a kék és a közeli ultraibolya fénysugarakat elnyeli, ezáltal megvédi a retinát a fototoxikus károsodástól. A ZX-készítmények, amelyek csak a kívánt R,Rizomert tartalmazzák, a Flavobacterium multivorum törzs sejtjeivel (ATCC azonosítási szám 55 238) állítjuk elő. Ezek a baktériumok nem hoznak létre nem kívánt S,S- vagy S,R-sztereoizomereket kimutatható mennyiségben, és nem szintetizálnak más karotinoidokat, így β-karotint vagy luteint jelentős mennyiségben, amelyek versenghetnének a ZX-szel az orális fogyasztást követően a tápanyaggal történő felvételért. Ezen baktériumok alkalmazásával előállított ZX-et különböző módszerekkel, például oldószeres extrakcióval tisztíthatjuk, és orálisan beadhatjuk vagy gyógyhatású szerként makuláris degenerációtól szenvedő betegeknek vagy tápanyag-kiegészítőként bárkinek, aki csökkenteni akarja a korral járó makuláris degeneráció fellépésének veszélyét, amely az emberekben kb. 50-60 éves kor után széles körben elteqedt. Kényelmesen fogyasztható készítményeket is rendelkezésre bocsátunk, (1) vízálló kapszulák formájában, amelyek R,R-zeaxantint hordozóval, például növényi olajjal együtt tartalmaznak; (2) különböző élelmiszerek (így margarin, tejtermékek, szirup, tészták és olyan húskészítmények alakjában, amelyek nem lesznek kitéve erőteljes főzésnek), és amelyek R,R-zeaxantint adalékként tartalmaznak; és (3) granulált készítmények formájában, amelyek levesekhez, salátákhoz, italokhoz vagy más élelmiszerhez adhatók.

Az 1. ábrán a β-karotin, a lutein és a zeaxantin molekulaszerkezete, valamint a gyűrűk számozási rendszere látható. Ezek a szerkezetek a technika állása szerint ismertek.

A 2. ábra olyan mikrobákkal végzett fermentálás és az előállított ZX tisztításának lépéseit leíró folyamatábra, amely mikrobák sztereokémiailag tiszta 3R,3’Rzeaxantint szintetizálnak.

A találmány eljárást bocsát rendelkezésre embernek adagolható gyógyszer- vagy tápanyagkészítmény előállítására makuláris degeneráció megelőzésére vagy csökkentésére, amely a látást károsító beteg állapot, és vakságot okozhat. Az embereknek adagolandó zeaxantinkészítményeknek a zeaxantin 3R,3’R-izomeijét (amelyet az egyszerűség kedvéért R,R-izomemek vagy R,Rzeaxantinnak is nevezünk) erősen domináló izomerként kell tartalmazniuk. Az „erősen domináló izomer” azt jelenti, hogy a készítmény legalább 90%-a vagy nagyobb része R,R-izomer, és a nemkívánatos S,S- vagy S,Rizomerek a készítményben levő zeaxantinnak kevesebb mint 10%-át teszik ki. Előnyösen bármely humán célra szánt készítménynek a ZX R,R-izomert az egyetlen ki7

HU 223 208 Bl mutatható izomerként kell tartalmaznia a nemkívánatos

5.5- vagy S,R-izomerek kimutatható mennyiségei nélkül. A jelen bejelentésben ilyen készítményeket ismertetünk.

Nemrégiben királis oszlopkromatográfiás analízis segítségével (amint azt Boné és munkatársai 1993-an leírták) megállapítást nyert, hogy az F. multivorum baktérium törzs (ATCC azonosítási száma 55 238), amelyet az Applied Food Biotechnology (AFB) izolált, a példákban leírt módon végzett fermentálás során az R,Rizomert, mint egyetlen kimutatható ZX-izomert termeli. Amint azt a 4. példában ismertetjük, a Landrum professzor által végzett analízis arra utalt, hogy ezzel az F. multivorum törzsből származó sejttel végzett fermentálással kapott ZX-készítmények nem tartalmaztak sem

5.5- izomert, sem R,S-mezoizomert kimutatható mennyiségben.

Az R,R-, R,S- vagy S,S-izomerek közötti különbség nagyon fontos, ha a ZX-készítményeket embernek gyógyszerként vagy tápanyag-kiegészítőként adagoljuk, mivel a humán retinában egyedül jelen levő természetes ZX-izomer az R,R-izomer. Úgy gondoljuk, hogy az R,S- és S,S-izomerek jelentős mennyiségben történő adagolása rendkívüli módon nem kívánatos és veszélyes lenne orvosi szempontból, mivel (1) az R,S- és

5.5- izomerek a humán retinában természetes körülmények között nem fordulnak elő, kivéve rendkívül kis, nyomnyi mennyiségeket, amelyek melléktermékként képződhetnek, amikor a retinasejtekben a lutein lebomlik, és (2) az R,S- és S,S-izomerek kompetitív módon helyettesíthetik a kívánatos R,R-izomert a retinaszövetben, ami feltehetően komoly, hosszú távú celluláris károsodáshoz és orvosi komplikációkhoz vezethet.

Az F. multivorum törzzsel az itt leírt módon végzett fermentálással előállított ZX-készítmények sztereoizomertisztasága rendkívül értékes, mivel nagyon bonyolult és költséges a kémiai szintézissel előállított ZX sztereoizomeqeinek az elválasztása. Noha a sztereoizomerek elválasztása kis mennyiségekben a laboratóriumban lehetséges, ipari méretekben megengedhetetlenül drága.

A jelen találmány egyik vonatkozása szerint az itt leírt R,R-zeaxantin-készítmény gyógyszerként formulálható és adagolható, azaz olyan gyógyszerként, amelyet az orvos ír fel olyan beteg kezelésére, aki a diagnózis szerint makuláris degenerációtól vagy olyan betegségben szenved, amely makuláris degenerációt okozhat tünetként vagy valójában, ilyen a Stargardt-féle betegség, a Best-féle betegség, a Batten-féle betegség, a Sjögren-Larsson-szindróma, a kúp-pálcika disztrófia, a birka-ceroidlipofúscinosis vagy a lizoszomális tárolási betegség, például a Tay-Sach-féle betegség.

Amikor ilyen kezelésre használjuk, a ZX-készítménynek a ZX R,R-izomeijét elegendő mennyiségben kell tartalmaznia ahhoz, hogy terápiás szerként megfeleljen, olyan hordozóanyagban vagy formában (például kapszulaként), amely alkalmas az embereknek való beadásra, amint azt a későbbiekben leírjuk. Egy előnyös megvalósítási mód szerint a gyógykezelésre szánt ZX-et egységdózis formában, így kapszulaként vagy tablettaként csomagoljuk. Mindegyik dózis előnyösen legalább 1 mg R,R-zeaxantint tartalmaz, de tartalmazhat kb. 3 és kb. 10 mg közötti zeaxantint is, ha a jobb terápiás hatékonyság eléréséhez ez kívánatos.

A jelen találmány második vonatkozása szerint az itt ismertetett R,R-zeaxantin-készítményt megelőző gyógyszerként formulálhatjuk és adagolhatjuk olyan betegeknek, akiknél megállapították a makuláris degenerációra való érzékenységet a család kortörténete alapján, vagy bármilyen fentebb említett betegség genetikai diagnózisa miatt. Az ilyen, az AMD tekintetében fokozottan veszélyeztetett, de a betegségben még nem szenvedő betegeknek adagolandó egységdózisok kisebb mennyiségeket, így például kb. 0,1 mg-kb. 2 mg hatóanyagot tartalmazhatnak dózisonként.

Ezen dózisok bármelyike kereskedelmileg elfogadható áron bocsátható rendelkezésre az itt nyilvánosságra hozott ismeretek felhasználásával. 25 mg-ot (vagy bármilyen kisebb mennyiséget) tartalmazó kapszulák olajos hordozóban gazdaságosan állíthatók elő mikroorganizmussal végzett fermentációval és azt követő oldószeres extrakciós lépéssel. A még nagyobb mennyiségeket (dózisonként például 100 mg-ot vagy többet) tartalmazó por alakú készítmények szintén előállíthatok, ha még további tisztítást végzünk például a 4. példában leírt módszereket alkalmazva.

A jelen találmány harmadik vonatkozásában a ZX-et vitamin vagy táplálkozási kiegészítő, vagy élelmiszer-adalék formájában is előállíthatjuk és csomagolhatjuk olyan emberek számára, akik jelenleg nem szenvednek makuláris degenerációban, azonban akik csökkenteni akarják az élet későbbi szakaszában a makuláris degeneráció fellépésének veszélyét. Amikor a készítményt ilyen célra állítjuk elő, a megfelelő dózisoknak lényegesen magasabbaknak kell lenniük a ma az egészséges élelmiszert árusító boltokban forgalmazott porokban található nyomnyi mennyiségeknél, de sokkal kisebbeknek azoknál, amelyeket terápiás célra állítunk elő azon emberek számára, akik esetében az AMD-t már diagnosztizálták. Az ilyen dózisok feltehetően kb. 0,05 mg és kb. 5 mg között vannak a naponta fogyasztandó dózisokban. Például egy 0,05 és 1,0 mg közötti dózis megfelelő abban az esetben, amikor az R,R-zeaxantin egyike annak a tucat vagy több szemek, amelyet egy multivitamin-kapszula vagy -tabletta magában foglal, míg 1-5 mg-os dózis is hozzáférhetővé tehető azon emberek számára, akik nagyobb dózisokat akarnak.

Tekintet nélkül arra, hogy humán célra, terápiás szerként vagy tápanyag-kiegészítőként használjuk, a ZXkészítménynek a ZX R,R-izomeqét egyetlen vagy erősen domináns sztereoizomerként kell tartalmaznia. Az „erősen domináns ZX-sztereoizomer” olyan ZX-készítményre utal, amelyben a kívánt ZX R,R-izomer a keverékben levő összes ZX legalább mintegy 90%-át alkotja, és a nem kívánt S,S- vagy S,R-izomerek kevesebb mint kb. 10% mennyiségben vannak jelen.

Előnyösen az R,R-izomemek kell lennie az egyetlen kimutatható ZX-izomemek bármilyen humán célra előállított készítményben. Ez ipari méretekben és elfogadható költség mellett gazdaságosan megvalósítható a

HU 223 208 Bl jelen találmány szerint, mivel az F. multivorum baktériumvonal, amelyet leírunk, az R,R-izomert az egyetlen kimutatható ZX-sztereoizomerként termeli. Ha az S,Svagy S,R-izomerekből valamennyi jelen is van a fermentációs elegyekben a tisztítás után, azok mennyisége túl kicsi ahhoz, hogy a 4. példában leírt módszerekkel kimutatható legyen.

Emellett a legtöbb baktériumtörzstől eltérően az F. multivorum sejtek nem állítanak elő karotinoidkeveréket; ezek a sejtek R,R-zeaxantint termelnek egyedül kimutatható karotinoidként. Mivel a ZX-nek versengenie kell a többi karotinoiddal a tápanyaggal való felvételért és a szövetbe kerülésért, ez hasznos lehet a ZX felvételének és a retinába jutásának fokozása szempontjából az orális adagolást követően, különösen azokban az esetekben, amikor a ZX-et diagnosztizált makuláris degeneráció kezelésére alkalmas gyógyszerként használjuk.

A szakember által ismert, hogy a baktériummal laboratóriumi méretekben végzett fermentációs eljárásokat nagyon költséges és bonyolult kézben tartani, amikor ipari méretű gyártási eljárássá alakítják. Ennek megfelelően a jelen feltalálók javított tápanyagokat és eljárásokat fejlesztettek ki az F. multivorum ipari méretekben való alkalmazásához. A javított tápanyagokkal és eljárásokkal sokkal egyszerűbb dolgozni, és a termelt ZX egy grammja sokkal olcsóbb, mint az 5 308 759 és az 5 427 783 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban ismertetett táptalajokkal és körülmények között előállított. Az előnyös tápanyagokat és körülményeket az 1. példában írjuk le.

A fermentálás után egy vagy több stabilizálóvegyületet kell adni a sejtekhez, hogy megakadályozzuk a ZX-nek a tisztítás során bekövetkező lebomlását. A stabilizátorok hozzáadása akkor történhet, amikor a sejtek még a fermentációs edényben, pasztőrözés vagy más feldolgozási eljárás megkezdése előtt vannak. Különböző stabilizátorjelölteket próbáltunk ki. A legjobb eredményt ez ideig a 2. példában felsorolt stabilizátorok kombinációjával kaptuk.

Miután a stabilizátorok hozzáadása megtörtént, a baktériumokat 55 °C-on 25 percig pasztőrözhetjük a baktériumok elpusztítására, a ZX károsodása nélkül. A tenyészetet azután szobahőmérsékletre hűtjük, és a sejtekről a folyadékot mechanikai eszközökkel, például ellenáramú mikroszűréssel eltávolíthatjuk. Ez a sejtek és szilárd anyagok koncentrációját a kezdeti kb. 10%ról egy szűrés utáni kb. 60-80%-ra növelheti. így jön létre a sejtpaszta.

Elképzelhető, hogy az F. multivorum sejtek érintetlenül és feltehetően életképes állapotban is alkalmasak embereknek való közvetlen adagolásra más élelmiszerekhez (sajt, joghurt, sör stb.) hasonlóan, amelyek életképes vagy elpusztított, de érintetlen mikroorganizmussejteket tartalmaznak. Nem ismeretes F. multivorum sejtekkel társuló patogenitás. Ezeket hideg vízlevezető csatornából izolálták, és mivel a hideg vízben való élethez alkalmazkodtak, nem maradhatnak életben vagy nem szaporodhatnak jól az emberi testben levő hőmérsékleten. Emellett ezeknek a sejteknek nincs semmilyen ismert toxikus összetevője; ezek Gram-negatív baktériumok, és nem rendelkeznek olyan sejtfalszerkezetekkel, amelyek a Gram-pozitív baktériumokra jellemzők. Amikor közvetlenül madarak vagy halak etetésére használjuk sejtpaszta formájában, a baktériumsejtek igen alkalmas leadóhordozónak látszanak. Az ZX felszabadult, amikor a sejteket az állatok emésztették, és a ZX a véráramba felszívódott, és különböző sejtekben (ezen belül a retinában) alkalmas helyen lerakodott.

Ennek megfelelően az érintetlen, R,R-zeaxantint tartalmazó F. multivorum sejtek is alkalmasak lehetnek közvetlen emberi fogyasztásra, kívánt esetben a következő három formában: (1) érintetlen életképes formában; (2) érintetlen elpusztított formában pasztőrözés után; vagy (3) olyan készítmény formájában, amelyben a baktériumsejtek elpusztított állapotban és membránjaik szétszakított állapotban vannak a sejtek felnyitására és a ZX jobb hozzáférhetőségének biztosítására. Ezt szonikálással (nagyfrekvenciájú hanghullámok alkalmazásával), nagy nyomással vagy aprítással érhetjük el. Más esetben ezt a lépést kihagyhatjuk, ha az oldószeres extrakcióhoz olyan oldószert használunk, amely szétroncsolja a sejtmembránokat.

Kívánt esetben a ZX előállítása sejtöblítő lépést is magában foglalhat, amelyben a fermentáció után a megmaradt tápanyagokat és a hulladék metabolitokat távolítjuk el, oly módon, hogy kívánt komponenseket, például stabilizárotokat, tartósítószereket, ízesítőanyagokat tartalmazó oldatot fúvatunk át a sejteken.

Kívánt esetben a sejtpasztát (akár érintetlen, akár szétroncsolt sejtekkel) megszáríthatjuk a szárított anyagban a sejtek és a ZX koncentrációjának további növelésére. Ezt mechanikai eszközökkel, például permetező szárítással (hő alkalmazásával) vagy liofilizálással (vákuumban történő fagyasztva szárítással) végezhetjük. Ha szárítást alkalmazunk, a kapott szilárd maradékot általában szárított biomasszának nevezzük; ez általában kb. 1-10 tömeg% ZX-et tartalmaz más, sejtből származó szilárd anyagokkal, a fermentációs közegből származó maradék szilárd anyagokkal és a fentebb leírt stabilizátorokkal együtt.

A roncsolás vagy szárítás előtt vagy után (vagy helyett) egy extrakciós lépést végezhetünk a ZX koncentrációjának növelésére, amely főként a sejtmembránokban akkumulálódik. Az extrakcióra alkalmas oldószerek többek között a poláris szerves oldószerek. A jelenleg legjobbként ismert oldószer a tetrahidrofurán, amely aggresszíven támadja meg a sejteket, és feleslegessé teszi egy külön membránroncsoló lépés elvégzését. Noha keverésre nem volt szükség, amikor laboratóriumi méretekben tetrahidrofuránt alkalmaztunk, az ipari méretekben történő előállításnál azonban az oldószer-bekeverési lépés alatt bizonyosan szükségessé válik.

Más oldószereket is kipróbáltunk, és folytatni fogjuk az oldószerek vizsgálatát és értékelését, de ez ideig nem találtunk a tetrahidrofuránnál megfelelőbbet. A kipróbált nem gyűrűs szerves oldószerek (például az aceton és a dietil-éter) kevésbé oldja a ZX-et, míg más oldószerekben, így a metanolban, az etanolban és a hexánban még kisebb a ZX oldhatósága.

HU 223 208 Bl

Az oldószert egy sejtpasztával vagy szárított biomasszával keverjük olyan körülmények között, amely lehetővé teszi, hogy az oldószer a lehető legtöbb ZX-et oldjon fel. Az oldott anyagot tartalmazó folyadékffakciókat azután a szilárd anyagtól például centrifugálással vagy szűréssel elválasztjuk. A szilárd anyagokat eldobhatjuk, vagy más eljárási lépéshez (például kívánt esetben ismételt oldószeres extrakciós ciklushoz) töltőanyagként felhasználhatjuk. A folyadékfrakcióból az oldószert általában lepárlással távolítjuk el. Ekkor az R,R-zeaxantint az oldószer által a sejtpasztából kivont más oldható komponensekkel együtt tartalmazó viszkózus olaj marad vissza. Amikor az 1-3 tömeg% ZX-et tartalmazó sejtek egyetlen lépéses extrakciójához tetrahidrofuránt alkalmazunk, és amikor a tetrahidrofuránt bepárlással eltávolítjuk, kb. 5-20 tömeg% ZX-et tartalmazó folyékony anyag marad vissza.

Az oldószeres extrakció egy másik, jó előzetes eredményeket mutató típusa egy szuperkritikus folyadékot (azaz olyan vegyületet, amely atmoszferikus nyomáson gáz-halmazállapotú, de magasabb nyomáson folyadékká válik és oldószerként hat) alkalmaz. A szén-dioxid a legszélesebb körben használt szuperkritikus extrakciós oldószer, és ipari méretű szén-dioxid extrakciós rendszerek hozzáférhetőek. Ilyen rendszerekben a folyékony szén-dioxidot a sejtpasztával vagy szárított biomasszával egy nagynyomású reakcióedényben összekeverjük. A folyadékot azután egy sor kamrán vezetjük keresztül, amelyekben a nyomás fokozatosan csökken. A ZX az oldatból már egy meglehetősen nagy nyomáson kiválik, úgyhogy egy korai nyomáscsökkentő lépésben összegyűjthetjük, míg a szennyezések nagy többsége a szén-dioxidban oldva marad, és továbbhalad a többi nyomáscsökkentő kamrába. A szuperkritikus oldószeres extrakció hatékonysága vivőszerek (például etanol, propilénglikol vagy etil-acetát) alkalmazásával tovább növelhető. Ezen vivőszerek közül néhányat már előzetesen kipróbáltunk, és megmutatkozott, hogy lényegesen növelik a ZX oldhatóságát a szuperkritikus szén-dioxidban.

Noha a szén-dioxidot széles körben alkalmazzák szuperkritikus extrakcióhoz, más (többek között a nitrogént vagy klór-fluor-szén) vegyületeket szintén használnak. Bármelyik ilyen oldószer, amely a nyomás függvényében gáz- és folyadékfázisokban létezik, megvizsgálható, hogy alkalmas-e ZX baktériumból való tisztítására a fentebb leírt módon.

Kívánt esetben a ZX-et tartalmazó olajos folyadékot, amelyet oldószerrel vagy szuperkritikus extrakcióval kaptunk, hordozóanyaggal, például növényi olajjal keverhetjük, és emberi fogyasztásra készült kapszulába zárhatjuk anélkül, hogy a ZX-et tovább tisztítanánk. Ez egy gazdaságos módja az ember számára hozzáférhető R,R-zeaxantin félig tiszta, fogyasztható formájának makuláris degenerációban szenvedő emberek számára gyógyszerként, vagy olyan emberek számára, akik csökkenteni kívánják a makuláris degeneráció rizikóját életük későbbi szakaszában, tápanyag-kiegészítőként való előállítására.

Más esetben az R,R-zeaxantin félig tiszta olajos folyadékban tovább tisztítható a ZX koncentrációjának növelésére és a szennyezések eltávolítására. Ezt több módon, így például (1) két oldószerből álló rendszerek alkalmazásával, amelyek két kiválasztott oldószer kombinációját tartalmazzák; (2) olyan szubsztráton (például szőtt szűrőágyon) való adszorpcióval, amely elősegíti a ZX kristályosodását; vagy (3) ellenáramú kromatográfiás eljárással. A ZX tisztítására egy olyan kromatográfiás eljárást, amely kb. 98%-os tisztaságot eredményez, a 4. példában írunk le.

Más karotinoidok tisztítására alkalmas módszereket az 5 382 714 számú (Khachik, 1995) és a 4 851 339 számú (Hills, 1989) amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetnek. A kémiai hasonlóságuk miatt a β-karotin vagy a lutein tisztítására használható bármelyik eljárás feltehetően jó eredményt ad a ZX tisztítása esetében is.

A ZX embernek a retina védése céljából történő adagolásának előnyös módja az orális adagolás, naponta vagy hetente bevett kapszulák formájában, vagy ZXszel kiegészített élelmiszer vagy élelmiszer-adalékok alkalmazásával, amint azt a későbbiekben leírjuk. A kezelés nem teszi szükségessé a meghatározott időközönkénti rendszeres bevételt (például a naponta vagy hetente adagolandó tablettákat), hanem esetenkénti, időszakos bevételre utal, hogy elfogadhatóan hosszú idő (például egy vagy több nap, előnyösen kevesebb mint egy hét) maradjon a dózisok között, hogy a ZX kis mennyiségeinek ideje legyen a fokozatos lerakódásra a makuláris szövetben. Mint bármely vitaminkiegészítő esetében, egyetlen dózis is jótékony hatású lehet, de egyetlen dózis nem lesz olyan jótékony hatású éveken át, mint a rendszeres kis dózisok. Az emlősökben a karotinoidfelvétel vizsgálata arra utal, hogy a napi bevétel előnyösebb, mint a heti vagy más szórványos bevétel a „töltő” tényezők miatt, amelyek a vérkoncentrációban nyilvánulnak meg.

Mivel a karotinoidok orális bevétel utáni felvétele aránylag alacsony, a súlyos makuláris degenerációban szenvedő betegek számára kívánatosak lehetnek más adagolási formák, így például az intramuszkuláris vagy intravénás injekciók alkalmazása, vagy lassú hatóanyagleadású eszköz beültetése. Az injektálható hordozókészítmények vizet, pufferezőszert és sok hidroxilcsoporttal rendelkező szerves vegyületet, így például propilénglikolt, dextránt vagy ciklodextrinvegyületeket foglalhatnak magukban.

Az orálisan adagolandó készítmény csomagolására különféle módok használhatók, mindaddig, amíg védik a ZX-et az oxidációtól, és számításba veszik a ZX olajos természetét. Orális adagolásra alkalmas készítmények például a következők:

(a) emészthető vízhatlan kapszula és benne folyadék, ahol a kapszula és a folyadék mérete akkora, hogy érintetlenül lenyelhető, és gyógyászatilag elfogadható, és amelyben a folyadék az R,R-zeaxantint megfelelő hordozóval vagy hígítóanyaggal, például növényi olajjal együtt tartalmazza. Kívánt esetben a fluidizált ZX-et mikrokapszulába foglalhatjuk vagy micellákba zárhatjuk, amint azt a 9. vagy 10. példában leírjuk, hogy megvédjük a ZX-et a gyomorban történő lebomlással szem10

HU 223 208 Bl ben. Az ilyen kapszulákat aránylag merev, kemény anyagból vagy olyan rugalmas anyagból készíthetjük, amelyet az E-vitamin-kapszulák esetében általánosan használnak. Ha a kapszula olyan anyagból készül, amely ellenáll a gyomor savasságának, és a bélben levő enzimek által emészthető, a ZX megvédhető a gyomorban történő lebomlástól, és a ZX biológiai hozzáférhetősége növelhető. Azonban ismert, hogy a ZX legalább egy része a megrágott zöldségmassza komponenseként a gyomorba jut, és sértetlenül megy át rajta; ezért nem lényeges a ZX-et a gyomor savasságával szemben védeni, és a kapszula anyagának megválasztásánál inkább a gazdasági előnyt, mint a tudományos szükségszerűséget vesszük figyelembe;

(b) tabletta ember számára orális bevételre, ahol a tabletta R,R-zeaxantint és egy préselhető kötőanyagot tartalmaz, amely a zeaxantinnal kompatibilis, és amely a tabletta megfelelő nyomáson történő préselés utáni alakjának megtartását okozza, és ahol a tabletta gyógyászatilag elfogadható, és olyan méretű, amely intakt formában lenyelhető. Kívánt esetben a tabletta bevonattal látható el, amely elősegíti a ZX védelmét a gyomor savasságával szemben;

(c) készítmény, amely emberi fogyasztásra alkalmas tápanyagot tartalmaz, amely táplálkozás szempontjából elfogadható és kellemes ízű, amely a zeaxantin számára megfelelő hordozó, és amely R,R-zeaxantint adalékként tartalmaz. A ZX egy sárgásnarancs színű pigment ugyanazon általános hidrofób tulajdonságokkal, mint a növényi olaj, a főzőmargarin és a csirkezsír; hasonlít más karotinoid-élelmiszer-színezékekhez, így a β-karotinhoz is. Következésképpen tápláló színezőanyagként különböző élelmiszeranyagokhoz, így margarinhoz, tejtermékekhez, sziruphoz, sült élelmiszerekhez, tésztához, pirított vajöntethez, húskészítményekhez, amelyeket nem kell erőteljes főzésnek alávetni, és levesösszetevőként adható. Más megfelelő élelmiszeranyagok szemcsés formában, például sózott vagy fűszerezett ízesítőkeverékként levesek, saláták, sütemények adalékaként tartalmazhatják. A szemcsés készítmények kívánt esetben védőbevonattal rendelkezhetnek a ZX gyomorsav általi lebontásának csökkentésére. Számos cikk számol be a β-karotin és más karotinoidok élelmiszer-színezékként és tápanyagadalékként való alkalmazásáról; példaként a következőket említjük: Klaui és munkatársai, 1970; Klaui és Bauemfeind 1981; Colombo és Gerber 1991, és a 4,522 743 számú (Horn és munkatársai 1985), az 5 180 747 számú (Matsuda és munkatársai, 1993), az 5 350 773 számú (Schweikert és munkatársai, 1994), valamint az 5 356 636 (Schneider és munkatársai, 1994) számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások. A kémiai hasonlóságuk miatt bármely, a β-karotin vagy lutein ember számára készült élelmiszerhez való adagolási módszer szintén feltehetően közvetlenül alkalmazható az R,R-zeaxantinra is;

(d) készítmény, amely emberek által orálisan fogyasztható élelmiszerből áll, ahol az élelmiszer mikroorganizmussejteket tartalmaz, amelyek emberekre nézve veszélytelenek, és amelyek a zeaxantin R,R-izomerjét tartalmazzák. Ilyen élelmiszereket a sajt, a joghurt, a tej és a sör közül választhatunk. A mikrobasejtek kívánt esetben lehetnek életképesek, vagy azokat pasztőrözéssel vagy fragmentációval elpusztíthatjuk.

A csomagolás más módjai szintén alkalmazhatók, és különböző alkalmazások esetében előnyösek lehetnek.

A ZX-et, amelyet az ATCC 55 238 vonalból származó F. multivorum sejtek alkalmazásával állítottunk elő, madárfajban, így Cotumix cotumix japonicában, amelyet japán fuijnek is neveznek, vizsgáltuk a retina védése szempontjából. Ez a faj használható állatmodell az emberi makuláris degeneráció számára számos tényező miatt.

(1) A japán füij retinája emlékeztet az emberi makulára számos fontos vonatkozásban. Például a fürjretina ZX-et és luteint is tartalmaz, és a humán makulához hasonlóan inkább fotoreceptorkúpban gazdag, mint -pálcikákban.

(2) A japánfüq-retina néhány ugyanolyan patológiás indikátort mutat, mint a humán retina. Például a japán fürj retinája lágy drusent és lipofúscint akkumulál, ami szoros kapcsolatban van emberben az AMD fellépésével.

(3) Noha a fürj retinája sokkal kisebb, mint az emberé, maga a fürjretina sárga színű a ZX és a lutein jelenléte következtében. így a fúrj retinája a humán retina középpontjában levő kis makuláris régió modelljeként szolgálhat, és az analízist és a megfigyelést sokkal könnyebbé teszi.

(4) A japán fürj retinája érmentes, és szerkezete a humán retina foveális régiójához hasonló.

(5) A japán fürj élettartama durván 1-1,5 év a tojók, és 3-4 év a hímek esetében. Ez lehetővé teszi az öregedési folyamatok tanulmányozását, ami nagyon bonyolult lenne más, tovább élő fajok esetében.

Ezek a tényezők részletesebben le vannak írva az irodalomban (Fite és munkatársai, 1991, és Fite és munkatársai, 1993).

A vizsgálatokat az 5-8. példákban ismertetjük. Az eredmények kiválóak, és világosan mutatják, hogy az F. multivorum sejtek által termelt R,R-zeaxantin (1) tökéletesen lerakódik a makulában orális adagolást követően, és (2) nagyon hatékonyan védi a retinasejteket a fototoxikus károsodással szemben.

Emellett, amint a 8. példában tárgyaljuk, az előzetes eredmények arra utalnak, hogy az R,R-zeaxantin sokkal hatékonyabb és hatásosabb, mint a β-karotin a retina fototoxikus károsodással szembeni védelmében. Amikor az állatoknak β-karotint adtunk nagy mennyiségben, a β-karotin által kifejtett minor védőhatás még a statisztikai szignifikancia szintjét sem érte el. Ezzel szemben, amikor R,R-zeaxantint adtunk az állatoknak ugyanolyan dózisban, teljesen blokkolta és megelőzte a retinakárosodás mért indikátorát.

A Flavobacterium multivorum sejtek, amint már leírtuk, az ATCC-gyűjteményben deponálásra kerültek (ATCC azonosítási szám 55 238; amint az előzőekben említettük, ezekre az ATCC-katalógusban Sphingobacterium multivorumként utalnak, de a nevüket a Bergey’s Manualben nem változtatták meg). Ez a sejtvonal a szak11

HU 223 208 Bl emberek számára az izomertiszta R,R-zeaxantin mikrobiális szintézisére több lehetőséget biztosít.

Először, ezen sejtek közvetlen és nem módosított leszármazottai R,R-zeaxantin más, nemkívánatos sztereoizomerek ki nem mutatható mennyiségei melletti szintézisére használhatók. Az ezen sejtek által generált karotinoidok teljes mennyisége 90%-nál nagyobb részben ZX-ből, a kívánt karotinoidból áll.

Másodszor, az ATCC 55 238 azonosítási számú törzs leszármazottai azután használhatók, miután oly módon kerültek módosításra, amely növeli az ZX R,Rizomerjének termelését. Mutáns vagy más megváltoztatott sejtvonalak hozhatók létre különféle módszerekkel, így (1) az ATCC 55 238 törzs vad típusa leszármazottainak mutagén szerekkel, így ultraibolya vagy röntgensugarakkal, vagy ismert kémiai mutagénekkel, így N-metil-N’-nitro-N-nitrozo-guanidinnel való kezelésével; (2) szexuális kombinációk generálásával, az F. multivorum sejtek más baktériumtípusokkal való keverésével, amelyek aktívan elősegítik a DNS konjugációját és a baktériumsejtek közötti kicserélődését; vagy (3) az F. multivorum sejtek bakteriális transzpozonokkal vagy vírusokkal való kezelésével, amelyek a DNS aránylag nagymértékű átrendeződését okozhatják. Ezek a módszerek véletlenszerű változásokat hoznak létre az utódsejtekben, és az utódokat screenelési vizsgálatokkal analizáljuk a nagyobb mennyiségű ZX-et termelő utódsejtek azonosítása és elkülönítése céljából.

A screenelési vizsgálatokat olyan kémszerek (így például difenil-amin, nikotin vagy lovasztatin) alkalmazása segítik elő, amelyek egy vagy több, a ZX bioszintézisében részt vevő enzimet visszaszorítanak. A Layman-féle megfogalmazásban ezek a szupresszor szerek gátakat vagy akadályokat képeznek, amelyeken csak olyan mutáns sejtek tudnak túljutni, amelyek abnormálisán nagy mennyiségű ZX-et termelnek. Szerencsére a jól termelő mutánsok vagy variánsok azonosítására használható vizsgálatok egyszerűek, gyorsak és könnyűek. Mivel a ZX sárga pigment, a tenyészlemez egyszerű vizuális megfigyelésével is azonosítani lehet azokat a mutáns kolóniákat, amelyek a kívánt jellemzőkkel, (1) jó sejtnövekedési sebességgel, és (2) abnormálisán nagy mennyiségű sárga pigment előállítási képességgel rendelkeznek. Kívánt esetben automatizált készüléket (például automata lemezleolvasókat vagy sejtválogató eszközöket, amelyek átfolyó citométerekhez vannak kapcsolva) szintén alkalmazhatunk a mutagénnel való kezelést követő screenelési vizsgálatokban.

Ezek a mutagén és screenelési technikák hagyományosak és jól ismertek a szakterületen. Minden sejtet, amely közvetlenül az ATCC 55 238 vad típusú törzsből származik, ezen sejtek leszármazottjának tekintünk, még ha módosítva, mutagenizálva vagy szexuálisan más sejtvonalakkal kombinálva lettek is a fentebb felsorolt bármelyik módon.

Egy harmadik alternatív megközelítés szerint nem leszármazott mikrobiális sejteket hozhatunk létre, amelyek az ATCC 55 238 sejtvonalból elkülönített vagy abból származó géneket tartalmaznak, amelyek az R,Rzeaxantin szintézisét elősegítő enzimeket expresszálnak. Ilyen géneket ismert módszerekkel lehet elkülöníteni és azonosítani. Például az 5 429 939 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban (Misawa és munkatársai, 1995, az előzőekben már említettük) felsorolt karotinoidtermelő „crt” génekből DNS-szekvenciákat alkalmazhatunk hibridizációs mintaként homológ DNS-szekvenciákat tartalmazó karotinoidtermelő gének kutatására az ATCC 55 238 sejtvonal genomjában. Az ezekből a sejtekből elkülönített karotinoidtermelő géneket azután plazmidokba, kozmidokba, fágokba vagy más alkalmas vektorba illeszthetjük, és ilyen formában bármely kívánt gazdasejttípus, így E. coli sejtek, élesztősejtek, rovarsejtek vagy emlőssejtek genetikai transzformálására használhatjuk. A kézben tartható genetikai manipuláció ezen típusa lehetővé teszi, hogy a transzformált sejtek R,R-zeaxantint termeljenek az ATCC 55 238 sejtekből kapott gének felhasználásával.

Emellett az ATCC 55 238 sejtekből kapott ZXtermelő gének fehétjekódoló részei (azaz a gének azon részei, amelyek messenger RNS-be való transzkripció után a ZX-et szintetizáló enzimbe vannak átírva) nagy energiájú és/vagy indukálható génpromoterek ellenőrzése alá helyezhetők. Ilyen „kimérás” gének, amelyek különböző génektől kapott génpromotereket tartalmaznak, különböző célokra használhatók, így (1) a ZX termelésének visszaszorítására, amíg a sejtek növekednek és szaporodnak, és azután a ZX-nek a sejtek általi nagymértékű termelésére a fermentáció alatt; és (2) a gén új típusú gazdasejtekbe való illesztésére, amely sejtek az ipari alkalmazás szempontjából előnyösek, ilyenek az E. coli sejtek vagy az élesztősejtek, amelyek esetében jól ismert és nagymértékben optimalizált fermentációs, kezelési és tisztítási módszerek alkalmazhatók.

Az ATCC 55 238 sejtvonalból elkülönített ZXtermelő gének szintén fokozhatok más jól ismert módszerekkel. Példaként említjük, hogy bakteriális gének gyakran alkalmaznak „nem előnyös” kodonokat, amelyek csökkentik és szabályozzák a gén által létrehozott fehérje mennyiségét. Ennek a korlátozó mechanizmusnak a feloldására egy ZX-et szintetizáló génben a nem preferált kodonokat preferált kodonokkal lehet helyettesíteni, amely növelheti az ATCC 55 238 sejtvonalból származó ZX-termelő enzim expresszálását egy kiválasztott gazdasejtben.

Egy másik példa, hogy a ciszteinmaradékok gátolják egy enzim aktivitását vagy stabilitását azáltal, hogy nem kívánt diszulfidkötéseket hoznak létre ugyanazon vagy másik fehérjemolekulában levő más ciszteinmaradékokkal. Következésképpen egy enzim aktivitása vagy stabilitása néha növelhető egy vagy több ciszteinmaradéknak más aminosavmaradékkal való helyettesítésével (például 4 737 462 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, Mark). Emellett egy fehérje expresszálása gyakran növelhető közönséges aminosavak, így glicin kodonjainak beillesztésével metionint és triptofánt kódoló kodonok helyére, amelyek kevésbé gyakoriak, és amelyek lelassítják vagy csökkentik a fehérje expresszióját. Miután létrehoztuk a szintetikus gént, amely az ilyen természetű aminosavhelyettesítést okozza, a módosított fehérjét megvizsgálhatjuk

HU 223 208 Bl annak meghatározására, hogy megtartja-e a kívánt enzimatikus aktivitást, miközben nagyobb mennyiségben vagy stabilabb formában expresszálódik.

Ezek ismert génsebészeti módszerek, amelyek az ATCC 55 238 sejtvonalból elkülönített ZX-termelő géneken értékelhetők annak meghatározására, hogy bármely ilyen módosítás fokozza-e az F. multivorum sejtek vagy más típusú gazdasejtek ZX-termelését.

Az igénypontban az a szövegrész, hogy „olyan sejtek, amelyek génsebészeti beavatkozást követően legalább egy zeaxantinszintézis-gént tartalmaznak, amely gén egy Flavobacterium multivorum törzsből kapott DNS-szekvenciát foglal magában, amely törzsnek az azonosítási száma ATCC 55 238”, olyan sejtekre utal, amelyek kémiailag szintetizált DNS-szekvenciájú géneket tartalmaznak, és a szintézishez az ATCC 55 238 sejtvonalnak vagy leszármazottjának analízisével meghatározott szekvenciájú DNS- vagy mRNS-szekvenciát használtak. Automata DNS-szintetizáló gépek jól ismertek, és bármilyen ismert génszekvencia duplikálására alkalmazhatók anélkül, hogy az eredeti gazdasejt replikációjára szükség lenne. A „zeaxantinszintézis-gén” bármely olyan gént magában foglal, amely egy olyan enzimet vagy más fehéijét expresszál, amely részt vesz a ZX bioszintézisében, és amely alkalmas gazdasejtbe illesztve a ZX termelésének növelésére használható, tekintet nélkül arra, hogy a ZX bioszintézise során melyik speciális enzimet kódolja a gén.

1. példa

Ipari méretű fermentáció

Az általunk a Flavobacterium multivorum kis méretben végzett laboratóriumi vizsgálatánál előnyben részesített táptalaj az 5 308 759 (Gierhart, 1994) és az

427 783 (Gierhart, 1995) számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás 3. példájában E)-vel jelölt táptalaj volt. Ez a táptalaj több olyan összetevőt tartalmazott, amely drága és nehéz dolgozni vele. A költségek és a kellemetlenségek csökkentésére jelentős kutatást végeztünk egy ipari méretben jobban használható táptalaj kialakítására a fenti szabadalmi bejelentések benyújtási napját követően. A jelenleg a nagyüzemi fermentálásnál előnyben részesített táptalajokból elhagytuk a kukoricalisztet és néhány más összetevőt. Ezek az előnyös táptalajok vagy nagy maltóztartalmú keményítőszirupot vagy répacukormelaszt tartalmaznak 1-10 tömeg/térfogat% koncentrációban 0,5-4 tömeg/térfogat% kukoricalekvár; 0,5 tömeg/térfogat% ammónium-szulfát-heptahidrát; 0,5 tömeg/térfogat% nátrium-klorid; 0,1 tömeg/térfogat% magnézium-szulfát-heptahidrát; 0,1 tömeg/térfogat% nátrium-acetát; 0,001 tömeg/térfogat% vas(II)-szulfát-heptahidrát; 0,2 tömeg/térfogat% élesztőkivonat; 0,01 tömeg/térfogat% tiamin-HCl; 1 és tömeg/térfogat% közötti mennyiségű hidrolizált kazein (például NZ Amin HD, forgalomba hozza: Sheffield Products, Division of Quest International, Norwich, NY); és 1 térfogat% növényi olaj mellett.

Miután ezeket a komponenseket összekevertük, a keverékhez a 6,5-es pH eléréséig nátrium-hidroxidot adunk; ezzel szemben, amikor az 5 308 759 és az

427 783 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerinti laborméretű kísérletekhez leírt táptalajnak a pH-ját 7,5-re állítottuk, túl sok szilárd anyag vált ki a kukoricalekvárból.

A táptalajt 121 °C-on autoklávozással sterilizáljuk 30 percig, majd 27 °C-ra hűtjük, és 5-10 térfogat% folyékony előtenyészettel inokuláljuk, amely olyan F. multivorum törzset tartalmaz, amely R,R-zeaxantint termel az S,S- vagy S,R-sztereoizomerek termelése nélkül.

A sejteket, amelyeket folyékony előtenyészet előállítására használunk, ferde agaron tartjuk fenn. Ezeket a ferde tenyészeteket az ATCC azonosítási számon az ATCC-gyűjteményben deponált törzsből származó F. multivorum klonális telepeivel inokuláljuk. 48 órás 28 °C-on történő inkubálás után a törzstenyészeteket 4 °C-on hűtjük a folyékony közegekhez inokulumként való felhasználásukig. Az életképes sejteket is le lehet hűteni a szokásos hűtőanyagokkal, szárazjéggel vagy folyékony nitrogénnel hosszabb ideig történő tárolás céljára.

A ferde agartenyészetből vett sejtek felhasználásával egy folyékony előtenyészetet készítünk 30 ml fenti módon előállított folyékony közeg beoltására egy 300 ml-es terelőlapátos lombikban. A növesztési körülmények; 28 °C, pH 7,2 és 7,6 között, 250 fordulatszámmal történő levegőztetés és 24 órán át történő tenyésztés. Az inkubálás első 24 órája után az egy vagy több 30 ml-es előtenyésztő lombikokban levő sejteket használjuk egy tízszeres mennyiségű táptalaj inokulálására egy megfelelő méretű fermentációs edényben. A sejteket 48-72 órán át inkubáljuk 28 °C-on. A pH-t nátrium-hidroxiddal és/vagy foszforsavval 6,8 és 7,20 között tartjuk. Az oldott oxigénszintet 30-40%-os telítettség között tartjuk szűrt levegőnek az edényen egy térfogat levegő/1 térfogat folyadék/perc sebességei történő átbuborékoltatásával, miközben az edény tartalmát 400-1000 fordulatszámmal keverjük. Rendszeres mintavétellel és nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás vizsgálattal megállapítottuk, hogy a ZX maximális mennyiségben általában kb. 72 óra alatt képződik a fenti körülmények között végezve a fermentálást.

2. példa

Stabilizálószerek hozzáadása

Az 1. példa szerinti fermentációs eljárásokkal termelt ZX-et stabilizálni kell a tisztítás és a formálás elősegítése és a tisztaság biztosítása céljából. Az F. multivorum sejtekhez (vagy a ZX-et tartalmazó sejtextraktumhoz) az előállítási vagy tisztítási eljárás során bármikor adhatunk stabilizálóvegyületeket; általában egy vagy több kezdeti stabilizálószert kell adni a sejtekhez még akkor, amikor azok a fermentációs edényben vannak.

Különböző stabilizálójelölteket vizsgáltunk meg. A legjobb eredményeket ez ideig stabilizálószerek olyan kombinációjával kaptuk, amelyeket megfelelő oldószer kis mennyiségeivel (például 20 literes fermentor esetében kb. 2 ml etanollal) kevertünk össze, mielőtt a sejtekhez adtunk. Az előnyös stabilizátorkeverék tercbutil-hidrokinont [rövidítve TBHQ; más néven 2-(1,1dimetil-etil)-l,4-benzol-diol] olyan mennyiségben tartalmaz, amely 250 pg/l (mikrogram per liter)-től

HU 223 208 Bl mg/literig változó végkoncentrációt eredményez a sejtekkel való összekeverés után; az etoxikint keverés utáni kb. 250 pg/liter és kb. 250 mg/liter közötti koncentrációban; α-tokoferolt kb. 250 pg/liter és kb. 250 mg/liter koncentrációban; és EDTA-t (etilén-diamin-tetraecetsavat) kb. 500 pg/liter és kb. 500 mg/liter közötti koncentrációban foglal magában. A megfelelő koncentrációk tág határok között változhatnak, és különböző tényezőktől, például a tisztítási lépések számától és a csomagolás és adagolás módjától függenek. Ezen stabilizárotok előnyös koncentrációi egyetlen tetrahidrofurános extrakció, azt követő növényi olajjal történő keverés és vízhatlan kapszulázás és vitamin típusú tabletták esetén kb. 25-50 mg/1 TBHQ; 250-500 pg/liter etoxikin; 250-500 pg/liter α-tokoferol; és 500-1000 pg/liter EDTA.

A stabilizátorok hozzáadása után a sejttenyészetet 55 °C-on 25-50 percig végzett melegítéssel pasztőrözzük. Ez elöli a baktériumokat anélkül, hogy a termelt ZX-et károsítaná. A tenyészetet ezután szobahőmérsékletre hűtjük, és a ZX-et tartalmazó sejteket és más, a fermentlében levő szilárd anyagokat átfolyó mikroszűrőrendszeren a folyadékfázistól elválasztjuk, így a sejtek/szilárd anyagok koncentrációja a kiindulási kb. 10-15%-ról kb. 60-80 térfogat%-os szűrt koncentrációra nő meg. Ez az eljárás sejtpasztát eredményez, amely a táptalajból is tartalmaz maradék szilárd anyagokat.

Az olyan ZX-készítmények előállítására, amelyeket a japán fűljek táplálására használtunk a retinával kapcsolatos vizsgálatokhoz az 5-7. példákban leírt módon, a sejtpasztát -70 °C-ra hűtöttük, majd teljes vákuumban liofilizálással 25 °C-on szárítottuk, így kb. 1-10 tömeg% ZX-et tartalmazó szárított biomasszát kaptunk. A régebbi vizsgálatokban a ZX mennyiségét minden egyes sarzs esetében egyenként megmértük, és a különböző koncentrációjú sarasokat összekevertük, hogy a japán fiirjekkel végzett vizsgálatokhoz az állandó koncentrációt biztosítsuk.

A humán bevételre szánt ZX esetében oldószeres extrakciót végzünk, ily módon viszkózus olajos folyadékot kapunk, amint azt a 3. példában leírjuk.

3. példa

Olajos folyadékká történő részleges tisztítás

A 2. példában leírtak szerint előállított sejtpasztát különféle módon tisztíthatjuk. Amint azt az előzőekben említettük, a sejtmembránokat kívánt esetben szétroncsolhatjuk a sejtek felnyitására és ezzel a ZX még hozzáférhetőbbé tételére, ezt például szonikálással (nagyfrekvenciájú hanghullámokkal), nagy nyomással vagy őrléssel végezhetjük, miközben a sejtek hőmérsékletét kb. 30 °C alatt tartjuk az oxidáció megakadályozására. Azonban erre a lépésre nincs szükség, ha egy oldószeres extrakciós lépésben tetrahidrofúránt használunk, mivel a tetrahidrofurán nagyon hatékonyan roncsolja szét a sejtmembránokat mechanikai segítség nélkül. Keverésre nincs szükség, amikor a tetrahidrofúránt laborméretű műveletekben használjuk; azonban az ipari méretű gyártási folyamatokban feltehetően jótékony hatású a keverés az oldószerrel történő elegyítés során.

Az eddig végzett vizsgálatokban a tetrahidrofúrános extrakcióhoz 8-20 térfogat tisztított, szűrt tetrahidrofúránt elegyítettünk egy térfogat 60-80% szilárd anyagot tartalmazó sejtpasztával 25 °C alatti hőmérsékleten, és az elegyet 2-24 órán át állni hagytuk. A tetrahidrofúrán agresszíven támadja a sejteket, és egy folyadék képződik, ami flokkulens szilárd anyagok szuszpenziója. Néhány perces, legfeljebb 20 000xg-n végzett centrifúgálás után a tetrahidrofúrán legnagyobb része dekantálással eltávolítható. A maradék tetrahidrofúránt vákuumban le lehet párolni, így viszkózus olaj marad vissza. Ha 1-3% ZX-et tartalmazó sejtpasztát egyetlen lépésben tetrahidrofúránnal extrahálunk, a kapott olaj általában 5-20 tömeg% ZX-et tartalmaz.

4. példa

Nagyon tiszta zeaxantin előállítása száraz porított formában, 100%-osan tiszta R,R-izomerrel

Nagyon tiszta ZX-készítményt száraz porított formában a 3. példában tetrahidrofúránnal extrahált olajos folyadék folyadékkromatográfiás feldolgozásával állítunk elő az alábbiak szerint. A ZX-et tartalmazó olajos folyadékot hexánban oldjuk, majd semleges alumínium-oxid-port tartalmazó oszlopon engedjük át. Két oszloptérfogatnyi hexánnal mossuk az oszlopot a karotinoidszennyezések, így a β-karotin és a likopin, valamint a lipidek és más szennyezők eltávolítására. Ezután hexán és aceton 80:20 térfogatarányú elegyét engedjük át az oszlopon a ZX felszabadítására. A ZX-tartalmú oldatot vákuumban szárítjuk. A kromatográfiás analízis azt mutatja, hogy legalább 98%-os tisztaságú a ZX; bármilyen szennyezésnek csak nyomnyi mennyiségei voltak kimutathatók.

Az aránylag nem védett állapotban (általában normálhűtés mellett, közepes gyakorisággal mintavétel céljából történő kivétel, és antioxidáns és az atmoszferikus oxigénnel való érintkezés ellen való óvintézkedés nélkül) kb. hat hónapig tárolt ZX-készítménynek egy mintáját sztereoizomeranalízisre John Landrum professzornak küldtük el Miamiba (Florida International University, Miami, Florida). A professzor királis oszlopkromatográfiás eljárással és dikarbamátszármazékkal végzett analízise azt mutatta, hogy a hat hónapos, nem védett készítmény 92% ZX-et tartalmazott. A szennyezések főként ketokarotinoidok voltak, amelyek a ZX előtt eluálódtak; a ketokarotinoidok valahol a karotinoidhoz kapcsolódva egy extra oxigénatomot tartalmaznak, és ezek szokásos melléktermékek, amelyek az oxidációval szemben nem védett karotinoidok tárolása során keletkeznek. Landrum professzor királis analízise megmutatta, hogy a készítményben levő ZX 100%-os mennyiségben a kívánt R,Rizomer volt. A ZX nemkívánatos S,S- vagy S,R-sztereoizomeijei nem voltak jelen kimutatható mennyiségben.

Felismertük, hogy a fentebb leírt kromatográfiás tisztítás valójában alkalmas és nagyon hatékony, de nem ideális nagyon tiszta ZX kereskedelmi méretekben történő előállítására. Egy másik eljárás, amelyet lutein tisztítására fejlesztettek ki, és az 5 382 714 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetnek (Khachik, 1995; és Khachik és munkatársai, 1991),

HU 223 208 Bl amely hideg etanol-víz elegyet egy két oldószeres extrakciós rendszerben, majd liofilizálást alkalmaz, jó jelölt az ipari méretű termelésben való kipróbálásra.

5. példa

Zeaxantin vizsgálata japán fürjön

Különböző étrendű csoportok alkalmazása

Minden vizsgálatot, ezen belül a japán fiiijek vizsgálatát a Harvard Medical School Schepens Eye Research Institute-ban (Boston, Massachusetts), az Applied Food Biotechnology Inc. céggel (a jelen bejelentés tulajdonosával) kötött szerződés keretében végeztünk. Minden kezelt vagy kontrollcsoport statisztikusan szignifikáns számú madarat tartalmazott. A legtöbb esetben a kontrollés a kezelt csoportok azonos méretűek voltak.

A karotinoidhiányos madártápot a Purina Mills (St. Louis, Missuori) cégtől kaptuk. Ezeket a madártápokat csak kísérleti célra árusítják, és olyan gabonából (például milomagokból) kapják, amelyek természetesen karotinoidokat nem tartalmaznak.

Mindegyik ZX-készítmény, amivel a japán fügékét etettük, szárított biomassza formában volt, és úgy készült, hogy az F. multivorum sejteket fermentáltuk, a 2. példában leírt szerekkel stabilizáltuk, a sejtek elpusztítására pasztőröztük, és liofilezéssel szárítottuk. Ezeket a fermentáló és preparatív lépéseket az Applied Food Biotechnology Inc, cég végezte az O’Fallon-i (Missuori) telephelyén.

Az összes kísérleti madarat karotinoidhiányos tojásokból keltettük. Ezeket úgy hoztuk létre, hogy az előző generációt (a Pl madarakat) éretté válásuk után csak karotinoidhiányos táppal etettük. A tojásokat feltörtük, és addig analizáltuk, amíg már karotinoidhiányosokat találtunk. A karotinoidmentes madaraktól származó tojásokból kikelt madarak szolgáltak vizsgálati és kontrollmadárként.

A vizsgálati és kontrollmadarakat 4 fő csoportba osztottuk, amelyek különböző tápot kaptak. Ezek a csoportok a C+, C-, a BC+, a ZX(+5) és a ZX(+50) csoport voltak attól függően, hogy melyik karotinoidot kapták.

A C+ csoportba tartozó madarak standard kereskedelmi tápot kaptak, amely néhány karotinoidot, és adalékként szintetikus tokoferolt (E-vitamint) tartalmazott.

A C- csoportba tartozó madarak tápjából lényegében minden karotinoid hiányzott, amint fentebb leírtuk. Azonban ez a táp minden más esszenciális tápanyagot magában foglalt, és adalékként szintetikus A- és Evitamint tartalmazott.

A BC+ madárcsoport tápjából minden karotinoid hiányzott, kivéve a β-karotinadalékot, amely ugyanolyan dózisban volt jelen, mint a nagy dózisú ZX-csoportban a ZX (azaz 50 mg β-karotint adtunk a táp 1 kg-jához). A BC+ csoport madarai esetében a fénnyel való károsítás megkezdése előtt 7 nappal áttértünk a β-karotint tartalmazó tápra. Ez a csoport lehetővé tette a β-karotinnal és a ZX-szel kiegészített tápot fogyasztó csoport egyik alcsoportjának az összehasonlítását, amely madarak esetében hét nappal a fénykárosítás előtt a hiányos tápról áttértünk a ZX-szel kiegészített tápra. Amint azt a 8. példában leírjuk, ez a közvetlen összehasonlítás azt mutatta, hogy a ZX nagyon hatékony a fototoxikus károsodás megelőzésében, míg a β-karotin védőhatása olyan gyenge volt, hogy nem érte el a statisztikus szignifikancia szintjét.

A ZX+ csoportban a madarak minden más karotinoidtól mentes, azonban az AFB-féle F. multivorum sejtekből előállított, R,R-zeaxantint tartalmazó szárított biomasszát magában foglaló tápot kaptak. A ZX-et két különböző dózisban adtuk a madaraknak, hogy dózis-hatás viszonyt és a retinakárosodás különböző indikátoraival való összefüggést állapítsunk meg. A ZX(5+) csoportban a madarak aránylag kis mennyiségű ZX-et, átlagosan kilogrammonként 5 mg ZX-et tartalmazó tápot kaptak. Mivel a japán fúrj kb. 25-35 g tápot fogyaszt naponta, a kis dózisú csoportban egy madár napi kb. 0,125-0,175 mg ZXhez jutott. A ZX(+50) csoportban tízszeres mennyiségű (50 mg ZX/kg táp) ZX-et kaptak, így ezek a madarak átlagosan 1,25-1,75 mg ZX-et fogyasztottak naponta.

A kontroll-, a hiányos és a ZX+ tápok karotinoidkoncentrációját nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás eljárással (HPLC) határoztuk meg Stacewicz-Sapuntzakis és munkatársai (1993) módszerével. Az eredmények az 1. táblázatban láthatók.

1. táblázat

Táp	Karotinoidkoncentrációk (pg/g)
ZX	Lutein	β-Krip	β-Karotin	Kanthax	Likopin
Kontroll (C+)	0,59	1,55*	0,11	0,24	0,00	0,00
Hiányos (C-)	0,26	0,59*	0,00	0,00	0,00	0,00
Zeaxantin (ZX+50)	67,60	0,59*	1,90	3,00	0,00	0,00
Zeaxantin	6,74	0,06*	0,20	0,28	0,00	0,27

Jelmagyarázat:

ZX=3R,3’R-zeaxantin β-Krip=β-kriptoxantin

Kanthax=kantaxantin

Likop=likopin *=kísérleti azonosítás; zeaxantin cisz-transz izomer is lehet.

HU 223 208 Bl

Minden madarat normál költőkalitkában neveltünk és tartottunk. A későbbiekben említett kivételektől eltekintve normális széles spektrumú fény hatásának tettünk ki napi 10-14 órán át.

6. példa

Orálisan fogyasztott zeaxantin lerakódása a retinában

Kémiai analízist végeztünk annak meghatározására, hogy a ZX (és más karotinoidok) milyen koncentráció- 10 bán rakódtak le a madarak retinájában az 5. példában leírt, különböző táppal etetett csoportokban.

Ezen analízisek elvégzéséhez a karotinoidhiányos tojásokból kikelt és a megfelelő tápon legalább 6 hónapig nevelt madarakat lefejezéssel megöltük. A kihámozott 15 szemből a retinaszövetet kimetszettük, egyetlen retinából származó szövetet 250 pl desztillált ionmentes vízben üveg- vagy politetrafluor-etilén (TEFLON™) pisztullussal közel homogénné aprítottunk. A homogenizátumból 10 μΐ-t kivettünk, és a homogenizátum fe- 20 héqeanalízisére használtunk annak érdekében, hogy a különböző retinaminták eredményeit normalizáljuk. A megmaradó 240 μΐ retinaszövet-szuszpenzióhoz 2 tömeg/térfogat% pirogallolt és 50 μΐ 60 tömeg/térfogat%-os kálium-hidroxid-oldatot tartalmazó 250 μΐ metanolos oldatot adtunk. Az elegyet egy órán át 70 °C-on vízfürdőben melegítettük, majd 500 μΐ 50 térfogat%-os etanolt és 2 ml hexánt adtunk hozzá. Az elegyet az alapos keverés érdekében vortexeltük, azután 5 °C-on állni hagytuk, amíg az ülepedés megtörtént. Az epifázist, azaz a 5 könnyebb fázist, amelyik a megmaradó folyadék felszínén úszott, és hexánt és extrahált karotinoidokat, tokoferolt és retinolt tartalmazott, eltávolítottuk. További 2 ml hexánt adtunk a szövethomogenizátumhoz, az elegyet vortexeltük, és ismét ülepedni hagytuk. Ezt az epifázist eltávolítottuk, és az elsővel egyesítettük. Ezt az eljárást még egy alkalommal megismételtük egy harmadik extrakciós ciklusban, hogy biztosítsuk a karotinoidok, tokoferolok és retinoidok teljes extrakcióját.

Az egyesített hexános extraktumokat ezután 1 ml vízzel mostuk a kálium-hidroxid maradékának eltávolítására. A hexán-víz elegyhez további 1 ml hexánt adtunk, majd a hexános réteget (epifázist) pipettával gondosan eltávolítottuk. A hexánt állandó nitrogénáramban lepároltuk. A maradék karotinoidokat, tokoferolt, retinolokat és más nem azonosított, hexánnal extrahálható vegyületeket tartalmazott. Ezt a maradékot azután oldószerben (metanol:kloroform:trietil-amin) oldottuk és HPLC eljárással analizáltuk.

Az eredményeket a 2. táblázatban foglaltuk össze, 25 amely a nagy intenzitású fény hatására bekövetkezett károsodás szintjeit is tartalmazza.

2. táblázat

A táp típusa	Átlagértékek (n=6)
Rctinakarotinoid (ng/mg fehéije)	A központi retinában az apoptózisos kúpok száma (400-szoros nagyítás mellett)
Zeaxantin	Lutein	Nem fénykárositott	Fénykárosított
Kontroll (C+)	30,18	10,41	0	60
Hiányos (C—)	10,29	8,03	0	120
β-Karotin (+50)	10,01	7,83	0	109
| Zeaxantin (ZX+5)	31,00	3,64	0	15
1 Zeaxantin (ZX+50)	104,17	ND	0	0

ND=nem volt kimutatható ezekben a mintákban. Egy luteinszerű vegyületet mutattunk ki, de az nem volt lutein, a HPLC-s retenciós idő és a kérdéses csúcs fotodiódás szkennelése alapján.

Meg kell jegyeznünk, hogy a leírt tápokkal etetett madarak egyikének retinájában sem mutattunk ki βkarotint.

A 2. táblázatban feltüntetett retinakoncentrációk arra utalnak, hogy az orálisan fogyasztott R,R-zeaxantin, amelyet Flavobacterium multivorum (ATCC azonosítási szám 55 238) törzsből származó sejtek fermentálásával állítottunk elő, valóban lerakodott azoknak a kísérleti állatoknak a retinájában, amelyek R,R-zeaxan- 55 tint kaptak tápadalék formájában. Ezek fontos adatok, mivel a ZX-et normális módon kell fogyasztani, a ZXnek keresztül kell jutnia a bélben levő barrieren, be kell kerülnie a véráramba, és a madarak szemében a retinasejteknek a ZX-et elegendő mennyiségben fel kell ven- 60 niük ahhoz, hogy megvédjék a retinaszövetet a fototoxikus károsodással szemben. Mindezen akadályokat leküzdötték az itt leírt, bakteriálisán fermentált R,R50 zeaxantin-készítmények.

7. példa

A retina védése R,R-zeaxantinnal

A különböző táppal etetett csoportok mindegyikéből néhány madarat nagy, 2000-3000 lux intenzitású látható fény hatásának tettünk ki 28 órán át, ehhez 1 órás megvilágításból, majd ezt követően 2 órás majdnem teljes sötétségből álló ciklusokat alkalmaztunk. A váltakozó megvilágítás után a madarakat 14 órára majdnem teljes sötétségbe helyeztük, majd leöltük. Ennek a nagy intenzitású

HU 223 208 Bl fényhatásnak a mennyiségét előkísérletekben határoztuk meg, hogy egyformán súlyos károsodást hozzunk létre a karotinoidhiányos madárcsoportban, közepeset a normáltápon tartott kontrollállatokban. Előkísérletekkel azt is meghatároztuk, hogy 14 órás időszakra van szükség a megvilágítás után ahhoz, hogy az apoptotózisos kúpmagok maximális számát mérjük a nem védett (karotinoidhiányos) madarakban.

A kontrolltáppal etetett madarak mutatták a maximális apoptózist kb. 24 órával a fényhatás után, míg a ZX-szel kiegészített táppal etetett madarak 24 óránál sokkal hosszabb idő után mutatták a maximális apoptózist. A károsodás előtti idő mérhető meghosszabbodása önmagában is erős indikátora a ZX védőhatásának.

Ezekből a madarakból a retinákat mikroboncolással különítettük el, xilolban fixáltuk, és paraplasztba (Oxford, 56 °C) merítés előtt etanolban vízmentesítettük. A paraplasztban levő retinaszövetekből metszeteket készítettünk, és Gallyas (1990) módszerével vagy propídium-jodiddal festettük a piknózisos mag láthatóvá tételére, amely az apoptózisra jellemző. Megszámoltuk az egyetlen mikroszkopikus területen 400-szoros (lineáris) nagyítás mellett látható piknózisos magokat. A magok számlálását legalább 6-8 különböző helyen végeztük mindegyik kezelt csoport esetében, és az értékeket átlagoltuk.

A 2. táblázatban látható eredmények világosan mutatják, hogy a retinasejt-elhalás és -károsodás (1) nagymértékben csökkent és/vagy késett a bakteriálisán szintetizált R,R-zeaxantin hatására, még a kis ZX(+5)-dózisszinten is, a normálkontrolltáppal etetett madarakhoz viszonyítva; (2) és még jobban csökkent a nagyobb ZX(+50)-dózis hatására. A ZX(+50) csoportokból származó retinákból a piknózisos magok teljes hiánya lenyűgöző bizonyítéka annak, hogy az F. multivorum sejtvonallal (ATCC azonosítási szám 55 238) kapott R,Rzeaxantin drámai és rendkívüli áttörést jelent a retinasejtek fototoxikus károsodással szembeni védelmében. Legjobb tudásunk és hitünk szerint az eddig valaha is kipróbált anyagok között nincs olyan, amely ezt a védelmi szintet elérni vagy akár megközelíteni képes lenne.

8. példa

Az R,R-zeaxantin és a fi-karotin közvetlen összehasonlítása a retinaszövet védelme tekintetében

Amint azt az előzőekben említettük, a BC+ táppal etetett csoportban levő madarak (50 mg/kg táp) β-karotint kaptak, amely megfelelt a ZX(+50) csoport által kapott ZX-dózisnak. Ez lehetővé tette a β-karotin és a ZX közvetlen összehasonlítását a retinasejtek fototoxikus károsodással szembeni védelme tekintetében.

Az eredmények azt mutatják, hogy a BC+ csoportban a károsodás csak nagyon kis mértékben (kb. átlagosan 10%-ban vagy kisebb mértékben) csökkent. A kontrollcsoportban levő standard eltérésekhez viszonyítva ez a csökkenés statisztikusan nem szignifikáns; annak a valószínűsége, hogy a kis csökkenések pusztán a random fluktuációnak tulajdoníthatók, 0,12-0,14 volt.

Az a tény, hogy a β-karotin nem nyújtott jobb védelmet a retinaszövet fototoxikus károsodásával szemben, míg az R,R-zeaxantin ugyanolyan dózisban 100%-osan csökkentette a sejtkárosodás és -elhalás ugyanazon indikátorát, határozottan szemlélteti ennek a felfedezésnek a fontosságát. A mikrobiális fermentációval szintetizált R,R-zeaxantin nagy áttörést jelent, bármely korábban ismert szert messze felülmúl.

9. példa

Elnyelésfokozók kialakítása

Zeaxantint tartalmazó micellákat, amelyek 1 mikronnál kisebb átmérőjűek, a biomassza oldószeres extraktumából vagy a 3. példa szerinti olajos folyadékból nyerhetünk bizonyos típusú epesavsók felhasználásával, amint azt Olson (1994) leírta. Egy R,R-zeaxantint tartalmazó olajos folyadékot megfelelő epesavsóval, például gliko- vagy taurokolát-foszfátsókkal, amelyek a Marcor Development Company of Hackensack (New Jersey) cégtől vásárolhatók, vagy epesavsókat tartalmazó epehólyag-extraktumokkal keverhetünk, amelyek a Salzman Corporation of Davenport (Iowa) cégtől szerezhetők be. Ezek az epesavanyagok az oldószeres extraktummal vagy az olajos masszával, és bizonyos más sókkal, így nátrium-kloriddal, kalcium-kloriddal vagy kálium-kloriddal keverhetők. Ezt a keveréket azután mechanikus homogenizátorban, amely keverőeszközökkel, így forgólapátokkal van ellátva, rutinkísérletekkel optimalizálható forgási sebességgel és ideig keverhetjük, miközben a különböző lapátméretek és -formák, forgási sebesség és időtartam különböző kombinációjával létrehozott micella-mérettartományokat analízisnek vetjük alá. A kapott micellákat szükséges esetben oldószermentesre szárítjuk, majd bármely kívánt koncentrációra hígítjuk hordozó- vagy hígítófolyadék, például növényi olaj alkalmazásával. Ezt az elegyet azután kapszulába vagy más olyan eszközbe zárhatjuk, amely elősegíti a kapott micellák lenyelését és a gyomorsav által okozott lebomlással szembeni védelmét.

Más emulgeátorok és lipidek is használhatók a kisméretű részecskéket tartalmazó emulzió kialakítására. Nemionos detergensek, így Tweenek és Spanek is, amint azt Olson (1994) leírja, valamint lipidanyagok, így foszfolipidek és szfmgolipidek is alkalmazhatók, amelyek kis, 1 mikronnál kisebb méretű lipidvezikulumokat hoznak létre.

10. példa

Mikrokapszulázott zeaxantin

Ebben a példában a zeaxantin mikrokapszulázott formában történő előállítását írjuk le. A mikrokapszulák 10 és 1000 pm közötti méretű szilárd részecskék, amelyek egy maganyagból, például R,R-zeaxantinból állnak, amelyet egy bevonóanyag vagy héj foglal magában, ezeket különböző anyagokból, így zselatinból, arabmézgából, keményítőből, zeinből (kukoricából származó fehéije) és hasonlókból készíthetjük. A héjanyag előállítása során más vegyületek is használhatók az alak, a textúra, a stabilitás vagy más, az előállított készítmény kívánt tulajdonságai fenntartásának elősegítésére. Ilyen vegyületek többek között az emulgeátorok, a szorbit, az antioxidánsok, például a TBHQ vagy 217

HU 223 208 Bl (l,l-dimetil-etil)-l,4-benzol-diol vagy a zselatinálószerek, például a karragenin.

A tiszta vagy részlegesen tisztított zeaxantint megfelelő oldószerben, így etanolban, acetonban vagy tetrahidrofuránban oldjuk. Oldódás után 10 mikronnál kisebb átmérőjű mikrokristályokat képezünk, ha a feloldódott zeaxantint vízhez adjuk. Ez az eljárás javul, ha az adagolás alatt a vizet, a zeaxantinkristályokat oldószerben, emulgeálószerek, így Tween 80 jelenlétében nagy frekvencián szonikáljuk.

A mikrokristályok kialakulása után a héjanyagot adjuk a víz, zeaxantin és oldószer elegyéhez. Olyan héjanyagok esetében, mint a zselatin, az elegyet 60 °C-on szükséges tartani legfeljebb 2 órán át. Amikor a héjanyag teljesen feloldódott, az egész elegyet szonikátorba helyezzük 5-10 percre, hogy a kristályokat újra emulgeáljuk.

A mikrokapszulák előállítását a mag és héjanyag elegyének szárításával fejezzük be, amihez bármely alkalmas szárítási módszert, így permetezve szárítást vagy forgó korongos módszert használhatunk, amelyet Sparks és munkatársai írtak le a 4 675 140 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban. A permetezve szárítást széles körben alkalmazzák az élelmiszeriparban. A forgó korong olyan eszköz, amely egy kb. 10,16 cm átmérőjű korongból áll, és bizonyos hőmérsékleten szabályozott körülmények között tartható. 1000 és 10 000 fordulat/perc közötti sebességgel működtethető. A mag és a héj anyag keverékét a korong közepére adagoljuk, miközben az például 4000 fordulat/perc sebességgel forog. A mikrokapszulák akkor képződnek, amikor a folyadék a fűtött forgó koronggal érintkezésbe kerül. A mikrokapszulák a korong közepéről a centrifugális erő hatására szétszóródnak, és sima felületen kerülnek összegyűjtésre, amelyet előzőleg „gyűjtő”- vagy „megfogó”-szerrel, így hidrofób keményítővel vagy dextrinnel bevontunk. A mikrokapszulákat azután a megfogószertől méret szerinti szitálással elkülönítjük. A mikrokapszulákat a fénytől és levegőtől való védelem céljából tartályokba helyezzük, és hűtött körülmények között tároljuk az orális bevételre alkalmas kapszulákba való kimérésig.

Ily módon megmutattunk és leírtunk egy új és értékes módot olyan gyógyszerek előállítására, amelyek mikrobiális úton szintetizált R,R-zeaxantint tartalmaznak, és amelyek makuláris degeneráció megelőzésére vagy kezelésére használhatók. Noha a jelen találmányt a bemutatás céljából ismertettük, példaszerűen és bizonyos speciális megvalósítási módokra hivatkozva írtuk le, a szakember számára nyilvánvaló, hogy különböző módosítások, változtatások és a bemutatott példákkal egyenértékű megoldások lehetségesek. Bármely ilyen változtatást, amely az itt adott kitanításokból levezethető, és amely nem távolodik el a találmány szellemétől és körétől, a jelen találmány szerinti megoldásnak tekintünk.

Irodalomjegyzék

Bauemfeind J. C. (ed.) Carotenoids as Colorants and Vitamin A Precursors: Technological and Nutritional Applications (Academic Press, New York, 1981)

Boné R. A., „The role of the macular pigment in the detection of polarized light” Vision Research 20;213-220 (1980)

Boné R. A. et al., „Preliminary Identification of the humán macular pigment” Vision Rés. 25; 1531-1535 (1985)

Boné R. A. et al., „Analysis of the macular pigment by HPLC: retinái distribution and age study” InvesL Ophthalmol. Vis. Sci. 29: 843-849 (1988)

Boné R. A. et al., „Stereochemistry of the macular carotenoids”, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34. 2033-2040 (1993)

Boné R. A. et al., „Distribution of macular pigment stereomers in individual eyes, including those with age-related macular degeneration (AMD)” ARVO Abstracts: Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 35; 1502 (1994) di Mascio P. et al., „Lycopene as the most efficient biological carotenoid singlet oxygen quencher” Archives of Biochemistry and Biophysics 274:532-538 (1989)

Dorey C. K. et al., „Lipofúscin in aged and AMD eyes” in Retinái Degeneration (Hollyfield et al, editors, Plenum Press, New York, 1993)

Eye Disease Case Control Study Group, „Antioxidant status and neovascular age-related macular degeneration”, Arch. Ophthalmol. 11.104-109 (1993)

Eye Disease Case Control Study Group, „Risk factors fór neovascular age-related macular degeneration”, Arch. Ophthalmol. 10: 1701-1709 (1992)

Foote C. S. et al., „Chemistry of singlet oxygen. XI. Cis-Trans isomerization of carotenoids by singlet oxygen and a probable quenching mechanism”, J. Amer. Chem. Soc. 92;5218-5219 (1970)

Foote C. S. et al., „Chemistry of singlet oxygen. X. Carotenoid quenching parallels biological protection” J. Amer. Chem. Soc. 92:5216-5218 (1970)

Gallyas F., Acta Neuropathologica 79:620 (1990) Gerster H., „Review: antioxidant protection of the ageing macula”, Age and Aging 20: 60-69 (1991)

Gittinger J. W., Manual of Clinical and Problem Ophthalmology (Little-Brown, Boston, 1988)

Haegersrom-Portnoy G., „Short-wawelength-sensitivecone sensitivity loss with aging: a protective role fór macular pigment?”, J. Opt. Soc. Am. A5: 2140-2144 (1988)

Ham W. T, Jr. et al., „Basic mechanisms underlying the production of photochemical lesions in the mammalian retina”. Current Eye Research 3.165-174 (1984)

Handelman G. J. and Dratz E. A., „The role of antioxidants in the retina and retinái pigment epithelim and the natúré of prooxidant-induced damage”, Adv. in Free Radical Biology & Medicine 2; 1-89 (1986)

Handelman G. J. et al., „Carotenoids in the humán macula and whole retina”, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 29;850-855 (1988)

Jialal I. et al., „β-Carotene inhibits the oxidative modification of low-densitiy lipoprotein”, Biochimica et Biophysica Acta 1086: 134-138 (1991)

Khachik F. et al., „Separation, identification and quantification of carotenoids in fruits, vegetables and humán plasma by high performance liquid chromato18

HU 223 208 Bl graphy”, Pure and Applied Chemistry 63/71-80 (1991)

Kirschfeld K., „Carotenoid pigments: their possible role in protecting against photooxidation in eyes and photoreceptor cells”, Proc. R. Soc. Lond. B 216: 71-85 (1982)

Malinow M. R. et al., „Diet-related macular anomalies in monkeys” Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 79/857-863 (1980)

Pease P. L. et al., „Optical density of humán macular pigment”, Vision Rés. 27: 705-710 (1987)

Pető R. et al., „Can dietary beta-carotene materially reduce humán cancer rates?” Natúré 290: 201-208 (1981)

Schalch W., „Carotenoids in the retina - a review of their possible role in preventing or limiting damage caused by light and oxygen” EXS 62 : 280-298 (1992)

Seddon J. M. et al., „Dietary carotenoids, vitamins A, C and E and advanced age-related macular degeneration” JAMA 272: 1413-1420 (1994)

Snodderly D. M. et al., „The macular pigment. I. Absorbance spectra, localization, and discrimination from other yellow pigments in primate retinas” Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 25: 660-673 (1984)

Sperduto R. D. et al., „Do we have a nutritional treatment fór age-related cataract or macular degeneration?” Arch. Ophthalmol. 108: 1403-1405 (1990)

Taylor A. et al., „Oxidation and aging: impact on vision” Journal of Toxicology and Industrial Health 9: 349-371 (1993)

Vaughn D. and Asbury T., General Ophthalmology, 13th ed. (Appleton and Lángé, Norwalk, CT, 1992)

Wald G., „The photochemistry of vision”, Doc. Ophthalmol. 3 : 94 (1949)

Weiter J. J. et al., „Central sparing in annular macular degeneration”, Am. J. Ophthalmol. 106: 286-292 (1988)

Wemer J. S. et al.,,Aging and humán macular pigment density” Vision Rés. 27/257-268 (1987)

Claims (26)

1. A zeaxantin 3R,3’R-sztereoizomeijének alkalmazása gyógyszer vagy táplálékkiegészítő előállítására emberekben makuláris degeneráció kezelésére vagy megelőzésére, ahol a gyógyszerben vagy táplálékkiegészítőben levő összes zeaxantinmolekulának legalább 90%a a zeaxantin 3R,3’R-sztereoizomeqe, és ahol a gyógyszert vagy táplálékkiegészítőt egységdózis formában állítjuk elő, amely legalább mintegy 0,1 mg 3R,3’Rzeaxantin-sztereoizomert tartalmaz.

2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer vagy a táplálékkiegészítő makuláris degeneráció kezelésére vagy megelőzésére alkalmas olyan betegben, aki Stargardt-betegségben, Best-betegségben, Batten-betegségben, Sjögren-Larsson-szindrómától, kúp-pálcika disztrófiától, birka-ceroidlipofuscinosisban, lizoszomális tárolási problémákat magában foglaló betegségben szenved, vagy akinek a makuláris degenerációra fokozott a genetikai fogékonysága.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszert vagy táplálékkiegészítőt egységdózis formában állítjuk elő, amely legalább mintegy 0,5 mg 3R,3’R-zeaxantint tartalmaz.

4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás gyógyszer egységdózis formában való előállítására, amely elegendő mennyiségű zeaxantint tartalmaz egy makuláris degenerációtól szenvedő vagy a makuláris degeneráció veszélyének fokozott mértékben kitett humán betegben a terápiás hatás kifejtéséhez naponta egy dózis bevétele esetén, és amely fiziológiásán elfogadható segéd-, hígító- vagy hordozóanyagot is magában foglal.

5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az egységdózisforma legalább mintegy 1 mg zeaxantin 3R,3’R-sztereoizomert tartalmaz.

6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a zeaxantint olyan módszerrel állítjuk elő, amely folyékony közegben, a zeaxantin szintézisét elősegítő körülmények között olyan sejtek tenyésztését foglalja magában, amelyek 3R,3’R-zeaxantin-sztereoizomert szintetizálnak a sejtek által szintetizált összes karotinoidmolekula legalább 90%-ának megfelelő szinten.

7. A 6. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a sejtek más zeaxantinsztereoizomerek kimutatható mennyiségének szintézise nélkül szintetizálják a 3R,3’R-zeaxantin-sztereoizomert.

8. A 6. vagy 7. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a sejtek az ATCC 55 238 azonosítási számú Flavobacterium multivorum törzsből származó baktériumsejtek.

9. A 6. vagy 7. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a sejtek génsebészeti úton készültek úgy, hogy az ATCC 55 238 azonosítási számú Flavobacterium multivorum törzsből származó sejtekből kapott DNS-szekvenciát tartalmazó legalább egy zeaxantinszintézisgént foglaljanak magukban.

10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a zexantin 3R,3’R-sztereoizomerje a gyógyszerben vagy táplálékkiegészítőben az összes karotinoid legalább mintegy 90%-át alkotja.

11. Készítmény egységdózis formában emberekben gyógyszerként való alkalmazásra, amely 3R,3’R-zeaxantin-sztereoizomert és fiziológiásán elfogadható hordozóanyagot tartalmaz, ahol a 3R,3’R-zeaxantin a készítményben jelen levő összes zeaxantin legalább mintegy 90%-át alkotja, és az egységdózis legalább mintegy 3R,3’R-zeaxantin-sztereoizomert foglal magában.

12. Készítmény egységdózis formában emberekben gyógyszerként való alkalmazásra, amely 3R,3’R-zeaxantin-sztereoizomert és fiziológiásán elfogadható hordozóanyagot tartalmaz, ahol a 3R,3’R-zeaxantin-sztereoizomer a készítményben jelen levő összes zeaxantinmolekula legalább mintegy 90%-át alkotja, és az egységdózis legalább mintegy 2 mg 3R,3’R-zeaxantin-sztereoizomert foglal magában.

13. A 12. igénypont szerinti készítmény, ahol az egységdózis legalább mintegy 3 mg zeaxantin 3R,3’Rsztereoizomert foglal magában.

HU 223 208 Bl

14. A 11-13. igénypontok bármelyike szerinti készítmény makuláris degeneráció kezelésében vagy megelőzésében való alkalmazásra.

15. A zeaxantin 3R,3’R-sztereoizomeqének alkalmazása emberek kezelésére használható gyógyszer vagy táplálékkiegészítő előállítására, ahol a gyógyszert vagy táplálékkiegészítőt egységdózis formában állítjuk elő, amely embereknek való orális adagolásra alkalmas, és amely a 3R,3’R-zeaxantint elegendő mennyiségben tartalmazza ahhoz, hogy a retinaszövetben további, kimutatható mennyiségű zeaxantin lerakódását okozza naponta egy egységdózis bevétele esetén, és ahol a 3R,3’R-zeaxantin-sztereoizomer a gyógyszerben vagy táplálékkiegészítőben jelen levő összes zeaxantin legalább mintegy 90%-át, míg a 3S,3’S- és 3S,3’R-sztereoizomer együtt a gyógyszerben vagy táplálékkiegészítőben jelen levő összes zeaxantin kevesebb, mint mintegy 10%-át alkotja.

16. Gyógyszer vagy táplálékkiegészítő, amely a zeaxantin 3R,3’R-sztereoizomeijét emberi bevételre alkalmas emészthető egységdózis formában tartalmazza, ahol az egységdózis elegendő mennyiségű 3R,3’Rzeaxantint tartalmaz ahhoz, hogy a retinaszövetben további, kimutatható mennyiségű zeaxantin lerakódását okozza naponta egy egységdózis bevétele esetén, és ahol a 3R,3’R-zeaxantin-sztereoizomer az egységdózisban jelen levő összes zeaxantin legalább mintegy 90%-át, míg a 3S,3’S- és a 3S,3’R-sztereoizomer együtt az egységdózisban jelen levő összes zeaxantin kevesebb, mint mintegy 10%-át alkotja.

17. Gyógyszer vagy táplálékkiegészítő, amely a zeaxantin 3R,3’R-sztereoizomeijét emberi bevételre alkalmas emészthető egységdózis formában tartalmazza, ahol az egységdózis elegendő mennyiségű 3R,3’Rzeaxantint tartalmaz ahhoz, hogy a retinaszövetben a zeaxantinkoncentráció kimutatható mértékű növekedését okozza naponta egy egységdózis bevétele esetén, és ahol a 3R,3’R-zeaxantin-sztereoizomer az egységdózisban jelen levő összes zeaxantin legalább mintegy 90%-át, míg a 3S,3’S- és a 3S,3’R-sztereoizomer együtt az egységdózisban jelen levő összes zeaxantin kevesebb mint mintegy 10%-át alkotja.

18. Készítmény egységdózis formában emberekben való gyógyászati alkalmazásra, amely 3R,3’R-zeaxantin-sztereoizomert és fiziológiásán elfogadható hordozóanyagot tartalmaz, ahol az egységdózis legalább mintegy 1 mg 3R,3’R-zeaxantin-sztereoizomert foglal magában.

19. A 18. igénypont szerinti készítmény, ahol az egységdózis legalább mintegy 3 mg 3R,3’R-zeaxantinsztereoizomert foglal magában.

20. A 18. vagy 19. igénypont szerinti készítmény, ahol a 3R,3’R-zeaxantin-sztereoizomer a készítményben levő összes zeaxantin legalább mintegy 90%-át alkotja.

21. A 18. vagy 19. igénypont szerinti készítmény, ahol a 3R,3’R-zeaxantin-sztereoizomer a készítményben levő összes karotinoid legalább mintegy 90%-át alkotja.

22. Gyógyszer vagy táplálékkiegészítő egységdózis formában emberekben való alkalmazásra, amely 3R,3’R-zeaxantin-sztereoizomert és fiziológiásán elfogadható hordozóanyagot tartalmaz, ahol az egységdózis legalább mintegy 1 mg 3R,3’R-zeaxantin-sztereoizomert foglal magában.

23. A 22. igénypont szerinti gyógyszer vagy táplálékkiegészítő, ahol az egységdózis legalább mintegy 3 mg 3R,3’R-zeaxantin-sztereoizomert foglal magában.

24. Gyógyszer vagy táplálékkiegészítő egységdózis formában emberekben való alkalmazásra, amely 3R,3’R-zeaxantin-sztereoizomert és fiziológiásán elfogadható hordozóanyagot tartalmaz, ahol az egységdózis elegendő mennyiségű 3R,3’R-zeaxantint foglal magában ahhoz, hogy a retinaszövetben további, kimutatható mennyiségű 3R,3’R-zeaxantin lerakódását okozza naponta egy egységdózis bevétele esetén.

25. Gyógyszer vagy táplálékkiegészítő egységdózis formában emberekben való alkalmazásra, amely 3R,3’R-zeaxantin-sztereoizomert és fiziológiásán elfogadható hordozóanyagot tartalmaz, ahol az egységdózis elegendő mennyiségű 3R,3’R-zeaxantint foglal magában ahhoz, hogy a retinaszövetben a zeaxantin koncentrációjának kimutatható növekedését okozza naponta egy egységdózis bevétele esetén.

26. A 22-25. igénypontok bármelyike szerinti gyógyszer vagy táplálékkiegészítő egységdózis formában, ahol a 3R,3’R-zeaxantin-sztereoizomer a gyógyszerben vagy táplálékkiegészítőben jelen levő összes karotinoid legalább mintegy 90%-át alkotja.